Механизмы регуляции длины теломер и дистанционных регуляторных взаимодействий у Drosophila melanogaster

Мельникова, Лариса Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы регуляции длины теломер и дистанционных регуляторных взаимодействий у Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции длины теломер и дистанционных регуляторных взаимодействий у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 575.22:595.773.4

Мельникова Лариса Сергеевна

Механизмы регуляции длины теломер и дистанционных регуляторных взаимодействий у Пто$арМ1а тс1апоца81ет

03.01.07 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

г 8 ФЕВ 2№

Москва 2013

005050124

Работа выполнена в Лаборатории регуляции генетических процессов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН)

Научный консультант:

академик РАН, профессор Георгиев Павел Георгиевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Любомирская Наталия Вениаминовна

доктор биологических наук Набнрочкина Елена Николаевна

доктор биологических наук Шпаковский Георгий Вячеславович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИМКБ СО РАН)

Защита диссертации состоится «12» марта 2013 года в «12 » часов на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, г.Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан < » февраля 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических наук

Грабовская Л.С.

Общая характеристика работы

Актуальность работы.

Теломеры — это специализированные ДНК-белковые комплексы, находящиеся на концах линейных хромосом. Теломеры предохраняют концы хромосом от слипания, деградации, узнавания системой репарации ДНК. Таким образом, основной функцией теломер является обеспечение стабильности эукариотического генома. В настоящее время доказано, что поддержание строго определенного размера теломер критично для жизнедеятельности организма. Изменение длины теломер тесно связано с опухолеобразованием и старением клетки. У большинства высших эукариот теломеры состоят из простых повторов G-богатой последовательности, а их удлинение обеспечивается специальным ферментом - теломеразой. У Drosophila melanogasler теломеры состоят из мобильных элементов типа LINE, ориентированных «голова к хвосту» - НеТ-А, TART и TAHRE. В результате проведенных в нашей лаборатории исследований было показано, что удлинение теломер дрозофилы может происходить по трем механизмам: с помощью транспозиции мобильных элементов на конец хромосомы; с помощью генной конверсии и с помощью рекомбинации между теломерными повторами. Основными структурными единицами нормальной теломеры являются: 1) терминальный комплекс - это белковый комплекс, формирующийся на конце хромосомы и защищающий его от ферментов репарации; 2)теломерный хроматин, который формируется на последовательностях теломерной ДНК. Данные структуры играют основную роль в процессе регуляции длины и стабильности теломер. Важной особенностью дрозофилы, является то, что у нее теломерный хроматин может формироваться на любой неспецифичной последовательности ДНК, в то время как у теломеразозависимых организмов теломерная структура формируется только при наличии строго определенных последовательностей, которые представляют собой сайты связывания для белков, формирующих теломерный хроматин. Необходимо отметить, что несмотря на различия в структуре теломер, у теломеразозавимых организмов и у дрозофилы существуют общие механизмы, обеспечивающие поддержание стабильного размера теломер. Во-первых, эксперименты, проведенные на дрожжах и млекопитающих, доказали, что при инактивации теломеразы у данных организмов индуцируется альтернативный механизм удлинения теломер, связанный с процессами конверсии\рекомбинации. В том числе, альтернативные механизмы удлинения теломер часто реализуются в раковых клетках. Во-вторых, в последнее время было найдено, что некоторые консервативные белки, участвующие в репарации ДНК, также принимают участие в формировании терминального комплекса, как у дрожжей и млекопитающих, так и у дрозофилы. Поэтому данные, полученные при изучении теломер дрозофилы помогут понять

закономерности процесса регуляции длины теломер у различных эукариотических организмов и выявить основные белки, формирующие теломерный комплекс.

Также, актуальным направлением исследований современной молекулярной генетики является изучение функциональных взаимодействий между регуляторными элементами генома, расположенными на большом расстоянии друг от друга, и роли таких взаимодействий в регуляции транскрипции. Точная временная и тканеспецифичная транскрипция генов высших эукариот обеспечивается с помощью ряда регуляторных элементов. В настоящее время наиболее изучены различные типы энхансеров, усиливающих транскрипцию, сайленсеров, ослабляющих транскрипцию, и промоторов, обеспечивающих базовый уровень транскрипции. Часто регуляторные элементы находятся на очень больших расстояниях от промоторов и могут отделяться от них другими генами. Существует несколько моделей, объясняющих механизм дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами. Наиболее популярна модель «выпетливания». Эта модель предполагает, что активация транскрипции происходит в результате прямого взаимодействия между транскрипционными факторами, связанными с энхансером и промотором, при этом ДНК между ними выпетливается. В образованной хроматиновой петле находятся не активные на данном этапе развития гены. Таким образом, модель «выпетливания» поднимает актуальный вопрос: как потенциально разнородные регуляторные элементы, входящие в состав с^-регуляторной области, игнорируют близкие к ним промоторы и взаимодействуют с промотором только своего гена-мишени? На энхансер-промоторные взаимодействия может влиять еще один тип регуляторных элементов, названных инсуляторами. Классическим свойством инсуляторов является их способность, располагаясь между энхансером и промотором, блокировать взаимодействие между ними. Но уже неоднократно, в том числе и в данной работе, показано, что взаимодействуя между собой, инсуляторы способны реорганизовывать пространственную структуру ДНК. Таким образом, они могут модулировать взаимодействия между энхансерами и промоторами и даже способствовать взаимодействию между регуляторными элементами, расположенными на расстоянии друг от друга.

Представленная работа посвящена выявлению молекулярно-генетических факторов, участвующих в регуляции длины теломер дрозофилы, исследованию свойств теломерного хроматина, а также изучению регуляторных последовательностей и белков, участвующих в организации и в поддержании дистанционных взаимодействий, влияющих на транскрипцию.

Цели и задачи исследования:

Основными целями работы были выявление и описание функций белков, участвующих в регуляции удлинения и в стабилизации теломер дрозофилы; описание свойств теломерного

хроматина; функциональная характеристика регуляторных последовательностей и белков, обеспечивающих взаимодействие между регуляторными элементами генома, расположенными на большом расстоянии друг от друга. Для достижения целей работы ставились следующие задачи:

1. Провести функциональное сравнение двух мутаций, Tel и E(tc), влияющих на удлинение теломер дрозофилы.

2. Выяснить, какую роль белки НР1, Ки70 и Ки80 играют в регуляции удлинения теломер у Drosophila melanogaster.

3. Изучить влияние теломерного хроматина на:

- Ро1усотЬ-зависимуто репрессию,

- частоту транспозиций ^-элемента,

- дистанционные взаимодействия в регуляторной системе гена yellow.

4. Детально исследовать структуру предпромоторной области гена yellow и выявить коммуникаторные элементы, обеспечивающие дистанционное взаимодействие между энхансером и промотором.

5. Изучить зависимость функционального взаимодействия между Su(Hw) инсуляторами от их взаимного расположения и расстояния между ними.

6. Изучить влияние инсулятора Su(Hw) на частоту транспозиций Р-элемента.

7. Выяснить, способны ли сайты связывания GAF обеспечивать коммуникацию между регуляторными элементами, расположенными на большом расстоянии друг от друга.

8. Изучить взаимодействие между GAGA фактором и белком Mod(mdg4) в модельных системах in vitro и in vivo.

9. Выяснить, участвует ли белок Zeste в обеспечении дистанционных взаимодействий между энхансером и промотором гена white.

Научная новизна и практическая ценность работы:

Большинство генов, контролирующих длину теломер, в настоящее время неизвестны. В представленной работе впервые показано, что несмотря на весьма близкую генетическую локализацию, два доминантных генетических фактора, Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)), являются разными мутациями, но при этом влияют на один и тот же механизм удлинения теломер - терминальную конверсию. Обе мутации тестировались в модельной системе, основой которой являются X хромосомы дрозофилы с терминальными обрывами в регуляторной области гена yellow. Эта модельная система использовалась практически во всех экспериментах по изучению структуры и свойств теломерного хроматина. Результаты экспериментов свидетельствуют, что данная система может служить хорошим

инструментом in vivo анализа происходящих на конце хромосомы событий и тестирования различных факторов, участвующих в поддержании определенной структуры и размера теломер. Кроме того, точное описание функциональных свойств мутаций Tel и E(tc) позволяет использовать их для быстрой модификации модельной системы и получения линий дрозофил, несущих на конце хромосом заранее заданные последовательности ДНК. Накопленный в ходе выполнения работы методический и фактический материал в дальнейшем может быть использован научными коллективами, ведущими сходные по тематике исследования.

Ранее было найдено и изучено лишь несколько отдельных белков, входящих в состав теломерного комплекса дрозофилы: это НР1 (основной компонент гетерохроматина), НОАР (белок, взаимодействующий с НР1), Mrel 1/Rad50 (белки систем репарации и рекомбинации). В представленной работе впервые в различных модельных системах подробно изучалось влияние мутаций гена Su(var)2-5, кодирующего белок НР1, и делеций генов, кодирующих Ки80 и Ки70, на частоту терминальных генных конверсий и присоединений к концу хромосомы HeT-A/TART элементов. Показано, что частота терминальных генных конверсий на фоне уменьшения количества белка НР1 значительно возрастает, если на конце хромосомы присутствуют тандемные копии гомологичных последовательностей. В прочих модельных системах мутации Su(var)2-5 значительно увеличивают частоту присоединений HeT-A/TART транспозонов к концам терминально делегированных хромосом. Уменьшение концентрации белков Ки70 и Ки80 так же значительно увеличивает частоту присоединений HeT-A/TART элементов и частоту элонгации терминальной ДНК путем генной конверсии. Эффект Df Ku80 более выражен, чем эффект Df Ku70. Однако снижение концентрации Ки70 приводит к дестабилизации концов терминально делетированных хромосом. Кроме того, белки Ки70 и Ки80 не влияют на транскрипцию НеТ-А элементов. Таким образом, гетеродимер Ku70/Ku80 играет важную роль в защите концов хромосом у Drosophila, тогда как белок НР1 преимущественно регулирует транскрипцию НеТ-А элементов.

С помощью различных модельных систем были исследованы свойства теломерного хроматина, формирующегося на концах терминально делетированных хромосом. На основании полученных результатов сделано заключение, что размер теломерного хроматина составляет 45 т.п.н. и эта структура способна блокировать взаимодействия между различными регуляторными белковыми комплексами.

Обобщенный анализ изложенных выше результатов и относящихся к теме исследования данных из литературных источников позволил сформулировать новую модель механизма регуляции длины теломер дрозофилы, основанную на антагонизме между теломерным и субтеломерным хроматином и предполагающую наличие Т-петли на концах хромосом дрозофилы.

В предпромоторной области гена yellow впервые была локализована последовательность, необходимая для поддержания дистанционных взаимодействий между промотором yellow и либо стимулирующими транскрипцию энхансерами, либо репрессирующим транскрипцию инсулятором.

Было изучено взаимодействие между инсуляторами, находящимися на различном расстоянии друг от друга и влияние такого взаимодействия на энхансер-промоторную коммуникацию. Показано, что энхансер-блокирующая активность инсуляторов зависит от их взаимного расположения и от расстояния между ними. Кроме того, белковый комплекс Su(Hw) инсулятора препятствует связыванию транспозазы с концами Р-элемента, если инсулятор присутствует в составе транспозона. Эти данные являются еще одним свидетельством многообразия регуляторных функций инсуляторов в процессе жизнедеятельности эукариотической клетки.

В ходе работы подробно изучалось функциональное взаимодействие между сайтами связывания белков GAF и Zeste, которые, как предполагалось, играют важную роль в организации дистанционных взаимодействий в геноме, а также взаимодействие между этими белками и Su(Hw) инсулятором. Продемонстрировано, что в дрозофиле сайты связывания GAF не могут обеспечить дистанционные взаимодействия между промотором модельного гена и активатором транскрипции. Однако взаимодействие между белком GAF и компонентом Su(Hw) инсулятора, белком Mod(mdg4)-67.2, позволяет энхансерам преодолеть блокирующее действие инсулятора. Эти данные помогают по-новому взглянуть на роль ВТВ-содержащих белков в организации дистанционных регуляторных взаимодействий.

Также, было показано, что белок Zeste не нужен для базовой активности промотора гена white, как предполагалось в нескольких выполненных ранее работах. Доказано, что белок Zeste, обеспечивает дистанционное взаимодействие между энхансером и промотором гена white. Кроме того, так же как белок GAF, в модельной системе гена white Zeste помогает преодолеть Su(Hw) зависимую инсуляцию.

Таким образом, представленная работа имеет болыцое значение для развития фундаментального направления современной молекулярной генетики. Кроме того, изучение регуляторных элементов эукариотического генома и механизмов взаимодействия между ними имеет большое практическое значение. В настоящее время искусственно созданные векторы, экспрессирующие заданные гены под контролем определенного набора регуляторных элементов, широко применяются в биотехнологии и в фармацевтике. Поэтому представленные результаты могут быть использованы при создании конструкций с определенным сочетанием регуляторных элементов, обеспечивающих эффективную и стабильную экспрессию трансгена, не зависящую от геномного окружения.

Апробация работы:

Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: Annual Drosophila Research Conference - Ежегодная конференция по исследованиям на дрозофиле (США, 2004, 2005, 2006); конференции «Advances in Molecular Cell Biology» (Москва, 2004); на 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006); на международной конференции молодых ученых Young Scientist Forum (Вена, 2007); на 32-ой конференции FEBS (Вена, 2007); на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007); на международной студенческой биологической конференции (Ереван, 2009); на 13-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2009); на отчетных конференциях по программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (Москва, 2005, 2007, 2009); на межинститутском семинаре «Хромосома» (Москва, 2007,2012).

Публикации:

По результатам диссертации опубликовано 17 научных статей, из которых 11 статей в рецензируемых международных и 6 в российских научных журналах; 2 из перечисленных статей являются обзорными публикациями.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 279 страницах и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, цели и задачи исследования, результаты исследования и их обсуждение, выводы и список литературы. Диссертация содержит 64 рисунка и 10 таблиц. Библиография включает 353 литературных источника.

Содержание работы

1. Изучение структуры теломерного хроматина и механизма регуляции длины телом ер у

Drosophila melanogaster. 1.1 Функциональное сравнение генетических факторов Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc■)).

Ранее в нашей лаборатории было показано, что у дрозофилы удлинение теломер может происходить по трем механизмам: с помощью транспозиции мобильных элементов на конец хромосомы, с помощью генной конверсии и с помощью рекомбинации между теломерными повторами (Kahn et al., 2000). В 2002 году у Drosophila melanogaster были найдены два

доминантных генетических фактора, влияющие на удлинение теломер — это Telomere elongation (Tel) (Siriaco et al., 2002) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)) (Melnikova and Georgiev, 2002). Мутация Tel, выделенная из природной линии Gaiano, существенно увеличивает количество мобильных элементов НеТ-А и TART в теломерных районах хромосом. Мутация Tel была идентифицирована при помощи in situ гибридизации политенных хромосом линии Oregon, несущей хромосому 3 из линии Gaiano, с фрагментами ДНК НеТ-А и TART элементов. Поэтому неизвестно, какой именно механизм - присоединение новых ретротранспозонов или конверсия/рекомбинация между гомологичными последовательностями мобильных элементов - привел к увеличению количества НеТ-А и (Siriaco et al., 2002).

В отличие от Tel, мутация E(tc), обнаруженная в лабораторной линии у w, практически не влияет на присоединение НеТ-А и TART элементов, но значительно повышает частоту терминальной генной конверсии. Функциональная роль E(tc) изучалась при помощи линий с терминально делетированной X хромосомой, в которых терминальный обрыв находился в регуляторной области тема, yellow (yTD') (Melnikova and Georgiev, 2002).

С помощью генетической рекомбинации оба фактора, Tel и E(tc), были локализованы в районе 91-93 хромосомы 3R. Этот район включает более 320 т.п.н. и 27 описанных на настоящий момент генов. Возникает вопрос: являются ли Tel и E(tc) одной и той же мутацией или это мутации в различных генах?

Чтобы выяснить, может ли Tel так же как E(tc) вызывать увеличение частоты терминальных генных конверсии, мы решили протестировать мутацию Tel в обычно используемой нами модельной системе. Для этого аутосомы в выбранных для работы линиях yTD'/y' w заменили на хромосому 2(G2/G2) или 3(G3/G3) из линии Gaiano. С помощью генетических скрещиваний были получены контрольные линии yTD'/y'w,CyO/If; TM6,Tb/MKRS,Sb , в которых все аутосомы являлись балансерными хромосомами, т.е. не несли какие-либо факторы, влияющие на изменение длины теломер; линии yTD'/y'w;G2/G2; TM6,Tb/MKRS,Sb , которые несли хромосому II из линии Gaiano и линииyTD'/y'w,CyO/If; G3/G3, которые несли хромосому III из линии Gaiano.

Обычно для изучения структуры и функций теломерных последовательностей используются линии Drosophila melanogaster, несущие терминальные делеции. В таких линиях концевые последовательности ДНК, формирующие нормальную теломеру, отсутствуют, и концы X хромосом находятся в регуляторной или кодирующей областях гена yellow. Локус yellow определяет пигментацию кутикулы, при этом степень пигментации прямо кореллирует с уровнем транскрипции, что позволяет визуально тестировать экспрессию гена. Ген yellow находится на дистальном конце X хромосомы. Гемизиготные самцы или гомозиготные по yTD хромосоме самки не выживают, т.к. между геном yellow и теломерой находятся несколько жизненно важных генов.

Поэтому для поддержания терминально делегированных хромосом используют различные балансерные линии.

Изначально были выбраны 3 линии, в которых концы терминально делегированных хромосом находились на расстоянии -80 п.н■(у™'*0), -100 п.н.(у70'100), -140 п.н.(yTD~'40) от сайта инициации транскрипции гена yellow (Рис.1). В исходных линиях yTD отсутствовали энхансеры, отвечающие за пигментацию тела и крыльев, терминальный обрыв хромосомы находился в непосредственной близости от промотора yellow, но в интроне гена присутствовал энхансер, отвечающий за окраску щетинок, поэтому мухи имели неокрашенные тело и крылья и вариабельно окрашенные щетинки — фенотип yv. В таких линиях присоединение содержащего промотор НеТ-А элемента к концам терминально делегированных хромосом приводит к появлению мух, у которых все щетинки становятся полностью окрашенными - фенотип у2 (Kahn et al., 2000). В используемых линиях хромосома у7®* была сбалансирована хромосомой у w. Аллель у w не мешает фенотипическому анализу, т.к. вследствие замены нуклеотида в ATG кодоне ген yellow не экспрессируется. Однако в линии yTD'/у w хромосома, несущая аллель у w, может служить матрицей для терминальной генной конверсии (Mikhailovsky et al., 1999).

77}* ~

Поэтому удлинение хромосомы у может происходить как с помощью присоединении мобильных элементов, так и с помощью терминальных конверсий. Появление в результате конверсии перед промотором гена yellow последовательности размером до 1700 п.н. также

5 TD—80 TD-100 TD-140

приводит к возникновению у фенотипа. После введения в линии у , у и у аутосом из линии Gaiano и балансерных хромосом в потомстве были отобраны отдельные самки, имеющие фенотип у2. Необходимо отметить, что такие самки появились только в линиях yTD /у w; CyO/If; G3/G3. Отобранные самки были индивидуально скрещены с самцами у ас w, у которых на X хромосоме отсутствовали последовательности гена yellow. Структура терминально делегированных хромосом в потомстве этих скрещиваний была изучена с помощью Саузерн-блот анализа и ПЦР-анализа с использованием праймеров из промоторной области гена yellow и из 5' нетранслируемой области НеТ-А. Выяснилось, что генетический фактор Tel, находящийся в линии Gaiano на хромосоме 3 вызывает два типа событий. Было установлено, что в одних производных линиях удлинение хромосомы произошло вследствие присоединения НеТ-А элемента, в других же при помощи терминальной генной конверсии.

Чтобы понять, как в присутствии Tel соотносятся частота конверсионных событий и частота присоединений мобильных элементов к концу хромосомы, мы использовали две производные линии, в которых мухи имели фенотип у2 и неокрашенные аристы, а терминальный обрыв хромосомы находился на расстоянии -900 п.н.( -у7®"900) и -1100 п.н.( у™"00), т.е. в непосредственной близости отэнхансеров тела и крыльев yellow (Рис.1).

-У'(А+)

У'(А-)

Кр

HeT-A(TART)-

уУ-У

У'(А-)

yellow ^

У!(А-)

пр|

cTG(+171bp)

■»(А),

JD-80 TV-100 TD-UO

,у .у

HeT-A(TART)-У<

У'(А-) -

>У (А+

>и

HeT-A(TART).

У'(А-)

► у'(А+)

■»(А).

TD-1100

Рис. 1 Схематичное изображение структуры линий использованных в работе. Положение терминальных обрывов указано по отношению к балансерной хромосоме yw; черными стрелками изображены возможные присоединения мобильных элементов, а пунктирной стрелкой - терминальная генная конверсия; указаны исходные и производные фенотипы. Обозначения: направление транскрипции гена yellow показано горизонтальной стрелкой над осью координат, энхансеры тела (Т) и крыльев (К) - овалами. Отрезки над осью координат - фрагменты гена yellow, использованные для гибридизации с ДНК производных линий. Точками показан район, «зачитывание» которого при конверсии не приводит к изменению фенотипа Окрашенные аристы - А+, неокрашенные аристы -А-. Обозначения рестриктных сайтов: В-ВатИ\\ R-EcoRl, S-Sa/I; Н-Hindlll

Ранее бьио показано, что при присоединении НеТ-А или TART элемента к концам терминально делегированных хромосом, расположенным в этой области, окраска тела и крыльев не изменяется, но полностью восстанавливается окраска арист. Также было показано, что при появлении на конце терминально делетированной хромосомы энхансеров тела и крыльев, мухи становятся более темными. Уровень пигментации кутикулы прямо кореллирует с размером зачитанной при конверсии последовательности - чем больше расстояние от энхансеров до конца хромосомы, тем темнее тело и крылья — фенотипы / и у+ (Рис.1). Таким образом, мы можем фенотипически различать, какой именно механизм привел к удлинению хромосомы в потомстве выбранных линий. В линии уTD~900 и у70'"00 были введены хромосомы 2 и 3 из линии Gaiano, а также балансерные хромосомы. Затем из производных каждой линии были отобраны по 3 самки, которые имели только вторую (G2/G2) или TpeTbio(G3/G3) хромосому из линии Gaiano или же полностью стабилизированные аутосомы (CyO/If; TM6,Tb/MKRS,Sb). Далее был проведен фенотипический анализ потомства этих самок. Все мухи, имеющие темную окраску тела и крыльев или окрашенные аристы были отобраны. ПЦР-анализ с использованием праймеров из различных участков тепа yellow и из 5' нетранслируемой области НеТ-А элемента подтвердил, что различные обнаруженные в потомстве фенотипы соответствуют разным механизмами удлинения терминально делетированной хромосомы. Потомство каждой линии с неизмененным фенотипом (у2, неокрашенные аристы) было размножено и в следующем поколении был проведен количественный анализ частоты присоединений НеТ-А элементов и

терминальных генных конверсии. Среди потомства контрольных линий ут /у w;CyO/If; TM6,Tb/MKRS,Sb мы обнаружили только 3 самки с темными аристами (0,1%). Саузерн-блот анализ выявил, что в контрольных линиях происходила постепенная деградация конца

TD*

хромосомы. Этот результат подтверждает, что модельная хромосома у не содержит какие-либо мутации, влияющие на изменение длины теломер. В двух линиях уТГ> /у w;G2/G2; TM6,Tb/MKRS,Sb также были найдены только 2 самки, у которых к концу терминально делегированной хромосомы присоединился НеТ-А элемент (0,1%). Однако в остальных четырех линиях, несущих хромосому 2 из линии Gaiano, наблюдалось небольшое увеличение частоты транспозиций мобильных элементов к концам хромосом (0,7-4,1%). Полученный результат позволяет предположить, что вторая хромосома из линии Gaiano содержит слабый, возможно рецессивный, генетический фактор, участвующий в контроле длины теломер. Этот фактор не был найден одновременно с Tel, т.к. модельная система, в которой ранее тестировалась хромосома G2, была менее чувствительной по сравнению с используемой нами (Siriaco et al., 2002). Во всех линиях yrD'/y w;CyO/If;G3/G3 удлинение терминально делегированных хромосом происходило с высокой частотой при помощи обоих механизмов - присоединений НеТ-А элементов (2,7-26,2%) и терминальных генных конверсий (0,5-9,1%) - что было подтверждено молекулярными методами анализа. Также было установлено, что длина терминально делегированных хромосом у мух с неизмененным фенотипом различна. В линиях yTD'/y w;CyO/If;G3/G3 происходили как длинные терминальные конверсии, приводившие к появлению мух с фенотипом / или у+, так и короткие конверсии размером до 500-700 п.н., которые не приводили к изменению фенотипа. Поэтому подсчитанная частота терминальных конверсий, возможно, несколько ниже реальной. Кроме того, был проведен анализ потомства нескольких отобранных во втором поколении самок G3/G3, имевших темную окраску тела и крыльев. Было обнаружено, что в нескольких производных линиях к концам удлиненных в результате конверсии хромосом присоединились НеТ-А элементы.

Таким образом, введение мутации Tel в yTD' линии не приводит к предпочтению какого-либо одного механизма удлинения хромосом. Механизм элонгации терминальной ДНК посредством конверсии/рекомбинации между гомологичными последовательностями мобильных элементов мог играть не менее важную роль в образовании теломер в линии Gaiano, чем присоединение новых HeT-A/TART ретротранспозонов. Возможно, именно конверсия/рекомбинация является основным механизмом контроля длины теломер у дрозофилы. Суммируя полученные данные, можно утверждать, что Tel и E(tc) - это не одна и та же мутация. Возможно, хромосома 3 из линии Gaiano содержит оба генетических фактора, которые находятся в районе 91-93, а хромосома 3 из лабораторной линии у w - только E(tc).

Также можно предположить, что Tel и E(tc) являются аллельными вариантами одного и того же гена.

1.2 Белок НР1 (Heterochromatin Protein 1) участвует в регуляции удлинения теломер у Drosophila melanogaster.

Белок HP1 - это первый белок, который был идентифицирован как компонент теломерного комплекса у Drosophila melanogaster (Fanti et al., 1998). Предварительно в модельной системе гена yellow было показано, что мутации в гене Su(var)2-5, кодирующем белок НР1, даже в гетерозиготном состоянии увеличивают частоту присоединений мобильных элементов HeT-AJTART к концу терминально делетированной хромосомы более чем в 100 раз (Savitsky et al, 2002).

Чтобы выяснить, влияет ли белок НР1 на частоту терминальной конверсии, мы ввели мутации Su(var)2-f" и Su(var)2-5°s в 2 линии дрозофил, несущие терминальные делеции в локусе yellow. В выбранных линиях обрыв хромосомы находился на расстоянии -550 п.н. (ут~ 550) и -1100 п.н.( yTD-"°°) от сайта инициации транскрипции гена yellow. Матрицей для конверсии являлся аллель у. Фенотипический анализ частоты событий, приведших к удлинению хромосомы (присоединение НеТ-А и TART элементов или терминальная генная конверсия), так же как и в предыдущих экспериментах, был основан на мониторинге изменения окраски кутикулярных структур в потомстве мух из линий с терминальными делециями. Схема получения линий yTD/y 'w; Su(var)2-5°4 /СуО и yTD/y 'w; Su(var)2-S°5/CyO приведена в тексте диссертации. Фенотипический анализ потомства проводился на протяжении трех последующих поколений.

Результатом генной конверсии было появление мух с фенотипом -f — частичное восстановление окраски тела и крыльев, тогда как присоединение мобильных элементов к концу хромосомы приводило к возникновению фенотипа y*(A+) - восстановление окраски арист. В первом поколении (Fl) в контрольной линии и в линиях, несущих Su(var)2-5 мутации частота возникновения терминальных генных конверсии и НеТ-А/ TART присоединений была практически одинаковой. Однако в следующих двух поколениях частота HeT-A/TART присоединений в мутантных линиях возросла примерно в 100 раз, тогда как частота удлинения терминально делетированных хромосом по механизму генной конверсии осталась неизменной. Чтобы подтвердить способность выбранной модельной системы разделять терминальную генную конверсию и присоединения мобильных элементов к концу терминально делетированной хромосомы, из индивидуально отобранных самок у11'/у' w;Su(var)2-5/CyO были выведены стабильные линии. Из потомства производных линий с новым фенотипом была выделена ДНК, структура которой была изучена с помощью Саузерн-блот анализа. Во всех протестированных производных линиях, имевших близкий к у2 фенотип и окрашенные аристы

было обнаружено присоединение новой, не гомологичной гену yellow последовательности ДНК к концу хромосомы. В то же время, все / аллели имели на конце терминально делегированных хромосом последовательность энхансеров yellow. Присоединения НеТ-А элементов были подтверждены с помощью ПЦР-амплификации районов присоединения между НеТ-А и yellow в пяти у2(А+) производных линиях и последующего секвенирования продуктов ПЦР (Рис.2). Хотя полученные результаты свидетельствовали, что мутации Su(var)2-5 увеличивают только частоту присоединений HeT-A/TART элементов, оставалась возможность, что в результате конверсий присоединялась очень короткая последовательность ДНК и поэтому происходившие конверсии не фиксировались в выбранной модельной системе.

—С En-w En-b J—!-f—f-"1—L-i-*/t

В s к

»bp

ASAXAAAA. CTO yf

Mcccqg&L XTO y*8*3

минимальным определимый размер конверсии

.TD+250

JtL__________ . . " ^_ yTDSSO

yt ____> £ _ yTD-1100

"ts 35

Рис. 2 Модельная система для изучения элонгации терминальной ДНК путем генной конверсии на фоне мутаций Su(var)2-5 в присутствии матрицы для конверсии на гомологичной хромосоме. Схематичное изображение терминальных делеций, ассоциированных с различными аллелями yeüow. Показаны молекулярная структура у""" и

У. En-w и En-b - энхансеры крыльев и тела гена yellow. Концы терминально делегированных хромосом в у аллелях показаны сплошными горизонтальными линиями. Фрагмент BamHl-EcoRi размером ЗД т.п.н., использовавшийся как проба для Саузерн-блот анализа обозначен прерванной толстой горизонтальной линией в верхней правой части рисунка. Точки присоединений НеТ-А элементов к терминальным обрывам хромосом указаны маленькими вертикальными стрелками под горизонтальными линиями. Цифры рядом с ними обозначают место присоединения НеТ-А по отношению к сайту инициации транскрипции гена yellow в соответствии с результатами секвенирования.

Для проверки этого предположения была разработана специальная модельная система, позволявшая обнаруживать конверсии, длина которых варьирует от 100 до 200 п.н. (Рис.2). Была выбрана линия _уго>25", в которой терминальный обрыв произошел в кодирующей области гена yellow. Хромосома yTD+21° была сбалансирована хромосомой у""", в составе которой TATA промотор гена yellow (ТАТААА) был замещен последовательностью CCCGGG (Morris et al., 1998). Мухи с фенотипом yata имеют желтые щетинки. Ранее было показано, что НеТ-А промотор может активировать транскрипцию гена yellow. Химерная HeT-A-yellow мРНК продуцирует функциональный белок, если не смещен ATG кодон (Kahn et al., 2000). Таким образом, присоединение НеТ-А элемента к концу хромосомы в линии уТГ)>250/ у)"'" может

восстанавливать пигментацию в щетинках только в том случае, если предварительно ATG кодон гена yellow был «зачитан» в результате короткой конверсии.

Были получены 6 независимых ут*250/ уии w; Su(var)2-5 /СуО линий, несущих мутации Su(var)2-3°4 и Su(var)2-505 (Рис. 2). Согласно данным Саузерн-блот анализа, в первом поколении во всех линиях терминальный обрыв располагался в районе около +250 п.н., т.е. во всех линиях отсутствовал ATG кодон yellow (+171). Линии уТГ>/ уша поддерживались в течение трех поколений. Затем в каждой из 6 линий было фенотипически проанализировано от 600 до 1500 мух (всего около 5000 мух). В результате были найдены только 2 мухи, имевшие фенотип близкий к у3 (Рис. 2). Место присоединения НеТ-А к гену yellow было амплифицировано и секвенировано. В обоих случаях НеТ-А элемент присоединился за ATG кодоном yellow. Полученный результат подтверждает, что на фоне мутаций Su(var)2-5 элонгация теломерной ДНК путем присоединения мобильных элементов носит преобладающий характер.

Чтобы протестировать частоту присоединений терминальной ДНК путем генной конверсии, потомство F2 от индивидуальных самок yrDf2J0/ y/ala w. Su(var)2-5 /СуО было взято для Саузерн-блот анализа. В 5 из 21 полученной линии, т.е. приблизительно в 24% случаев, терминально делетированные хромосомы содержали на конце новую, не гомологичную yellow, последовательность ДНК. В нескольких отдельных линиях наблюдалось появление слабых полос большего размера, следовательно, присоединения новой ДНК имели место в части потомства индивидуально отобранных самок.

Суммируя полученные результаты можно утверждать, что мутации Su(var)2-5 значительно увеличивают частоту присоединений HeT-A/TART транспозонов к концам терминально делегированных хромосом, но не влияют на генную конверсию, если матрица для конверсии находится на гомологичной хромосоме.

Далее было выяснено, как мутации Su(var)2-5 влияют на частоту генной конверсии, если матрица дтя конверсии расположена на самой терминально делегированной хромосоме.

Для этого были использованы производные линии yTD2h2, Линия y mh2 содержит терминально делегированную X хромосому с дуплицированной последовательностью гена yellow (дупликация начинается от +875 п. н. относительно сайта инициации транскрипции yellow). В дополнение к дупликации, ретротранспозон МДГ4 (gypsy) встроен между энхансерами и промотором yellow в положении -700 п.н. Мухи yTD2h2 имеют фенотип подобный у2, т.к. gypsy блокирует взаимодействия между энхансерами тела и крыльев и промотором гена (Gause etal., 1998; Geyer et al., 1986).

Ранее было показано, что расположенный выше энхансеров yellow второй gypsy инсулятор нейтрализует энхансер-блокирующее действие первого (Gause et al., 1998). В результате, появление на конце терминально делегированной хромосомы второго gypsy инсулятора

Т"

тг

приводит к восстановлению экспрессии yellow в теле и крыльях (уг). В линии ут2Н2 последовательность gypsy на конце терминально делегированной хромосомы может быть дуплицирована при помощи генной конверсии. В этом случае матрицей для конверсии будут служить гомологичные последовательности yellow и gypsy, присутствующие на самой терминально делегированной хромосоме (Рис.3).

Рис. 3 Модельная система для изучения элонгации терминальной ДНК по механизму генной конверсии на фоне мутаций Su(var)2-5 в присутствии матрицы для конверсии на самой терминально делегированной хромосоме. Схематичное изображение аллеля yw!h! и его производных, ассоциированных с различными фенотипами. Обозначения: d-pr -дистапьный yellow промотор; р-рт — проксимальный yellow промотор; d-Su(Hw) -дистальный gypsy инсулятор; p-Su(Hw)-проксимальный gypsy инсулятор; d- gypsy -дистальный gypsy

ретротраиспозон; р- gypsy - проксимальный gypsy регротранспозон. Ферменты рестрикции: В - BamHI, К - Kpnl, Н - Hindlll, N - Ncol, G - Bglll, X - Xhol. Геномный фрагмент Hirtdlll-BamHI, использованный как проба при Саузерн-блот анализе, обозначен толстой горизонтальной линией. Точки присоединений НеТ-А элементов обозначены маленькими вертикальными стрелками с указанием координат присоединения относительно сайта инициации транскрипции гена yellow. Остальные обозначения как на предыдущих рисунках.

Таким образом, частота внутрихромосомных генных конверсии может быть подсчитана на основании фенотипического анализа частоты появления мух с более темной, чем у мух у2 окраской тела и крыльев (фенотип у1).

С помощью Саузерн-блот анализа были выбраны две линии yTD2h2lyac с концами хромосом в положении -500 и -600 п.н.. В данном случае, чтобы активировать экспрессию yellow в теле и крыльях, минимальный размер элонгации терминальной ДНК по механизму генной конверсии должен составлять 700-800 п.н.. Для изучения роли НР1 были использованы мутации Su(var)2-502 и Su(var)2-5°s. Линии ym2h2/yac; Su(var)2-5/CyO были получены в соответствии с приведенной в тексте диссертации схемой.

Как и в экспериментах, описанных выше, в первом поколении не было обнаружено какой-либо разницы между мутантными и контрольными линиями (Табл.1). Однако в последующих поколениях мухи с фенотипом / появлялись среди ^-подобных мух с частотой около 23%. Чтобы подтвердить, что возникновение фенотипа У является результатом генной конверсии, потомство индивидуально выбранных самок / было взято для Саузерн-блот анализа. Саузерн-

блот анализ показал точную корелляцию между у-фенотипом и размером элонгации терминальной ДНК у производных у*.

Таблица 1. Частота элонгации терминальных последовательностей в производных линиях

Т02Ь2

поколение мутации всего события % О всего события % О

F, Su(varj2-5"- 1.400 2 0.14 54 1 2

Su(var)2-5™ 1.650 3 0.18 № 0 <2

Su(var)2-51 1,200 -у 0.16 41 0 <3

1Д50 186 15 46 3 <15

Sufvar)2-5<" 1,900 445 23 72 1 2.8

Su(var)2-S* 2.100 7 0J3 86 0 <2

F, Su(var)2-5°- 900 153 7.9 36 2 5.6

1,400 302 21.5 44 2 4.6

Su{var)2-5' 1,600 4 0.25 55 1 2

Safmra-5® 750 59 20.1 М 1 3

Su(var)2-?" 16S 18Л 48 2 2.1

Su(var)2-5- 1.450 4 0.28 44 0 <3

Sut.-arfl-S генная конверсия присоединения ДНК Пояснения: события - количество

самок с новым фенотипом, возникшим в результате элонгации терминальной ДНК путем генной конверсии либо присоединений мобильных элементов; Q - средняя частота визуально фиксируемых событий, рассчитанная как соотношение между мухами с новым фенотипом и общим количеством просмотренных мух (%).

Чтобы выяснить, с какой частотой в выбранной модельной системе

происходили транспозиции HeT-A/TART элементов на концы терминально делегированных хромосом, молекулярными методами были протестированы все производные линии, в потомстве которых не были обнаружены мухи с у* фенотипом. Частота присоединений в них составляла в среднем 4,1%, что значительно ниже, чем в экспериментах на других модельных системах. В трех случаях район присоединения между геном yellow и НеТ-А элементом был клонирован, а затем секвенирован, чтобы подтвердить присоединение НеТ-А элемента (Рис.3). Полученные результаты показывают, что присутствие на конце терминально делегированной хромосомы тандемных копий гомологичных последовательностей yellow существенно снижает частоту присоединений новых последовательностей ДНК на фоне мутаций Su(var)2-5.

1.3 Белки Ки70 и Ки80 участвуют в регуляции удлинения теломер у Drosophila melanogaster.

Два белка Ки70 и Ки80, найденные у всех эукариот от дрожжей до млекопитающих, являются высококонсервативными. Гетеродимер Ku70/Ku80 - это основной компонент белкового комплекса, осуществляющего репарацию двуцепочечных разрывов ДНК. Неожиданно, у дрожжей Ku-белки были найдены на концах хромосом, затем было доказано, что данные белки играют важную роль в метаболизме дрожжевых теломер, а недавно было показано, что Ки комплекс участвует в регуляции длины теломер у млекопитающих и у растений. У всех перечисленных организмов отсутствие Ки белков вызывало либо удлинение, либо укорочение теломер, а также слипание концов хромосом.

Мы предположили, что у дрозофилы белки Ки70 и Ки80 могут выполнять аналогичные

функции. Связывание Ки белков с ДНК не требует специфических сайтов. Поэтому данные

белки потенциально способны входить в терминальный комплекс дрозофилы. Для проверки

выдвинутой гипотезы использовались описанные выше модельные системы.

1т.п.нг

/рНтл/ 1>ис' ^ Схематичное

-2То-70ОТ«> изображение хромосом ут~"

- У (с

-i-(bri>— ■> (аристы ■

и у с делегированными l'l q ' дистальными энхансерами

проба! тела и крыльев. (+1) - сайт

инициации транскрипции транспозиции гена^/W; направление

к концу транскрипции yellow указано

yellow

горизонтальной стрелкой; овал «bri» обозначает энхансер щетинок в интроне гена yellow.

ИеТ-А или TARTWjb \ \-(аристы+)

н в

проба1

Для частичной

инактивации белка Ки70 были использованы две делеции, одна из которых, Df(3R)Ku7C/hoR', удаляет только ген Ки70 (Irbp), а другая, Df(3R)M-KxI, захватывает и другие гены расположенные близко к нему, в частности ген, кодирующий хеликазу, которая по некоторым предварительным данным также важна для функционирования теломерного комплекса (Kusano et al., 2001). Также, были использованы две делеции, перекрывающие область гена Ки80 -Df(2L)r' и Df(2L)TE35BC-24 Во всех экспериментах использовались гетерозиготные линии, поэтому концентрация соответствующих белков была понижена менее чем в 2 раза.

Чтобы выяснить, какое влияние Ки70 и Ки80 оказывают на присоединение мобильных элементов к концу хромосомы, линии, несущие терминальные делеции в регуляторной области гена yellow, были сбалансированы линией у-ас-, в которой последовательности гена yellow отсутствуют, но сохраняется нормальная теломера (Рис.4). В данном случае удлинение хромосомы может происходить только с помощью присоединения мобильных элементов. Ранее было установлено, что деградация терминальной последовательности ДНК в течение одного поколения составляет приблизительно 70 п.н.. Для терминальных делеций в локусе yellow были получены аналогичные результаты. Мутация Ки70 вызывала ускоренную деградацию концевой ДНК и снижала выживаемость мух, что говорит об участии белка Ки70 в защите конца хромосомы. Понижение концентрации белка Ки80 не приводило к подобному эффекту. Одновременно, частичное отсутствие Ки80 и, в меньшей степени, отсутствие Ки70 приводило к резкому увеличению частоты присоединений НеТ-А и TART к концу хромосомы (Табл. 2).

Далее, планировалось выяснить, влияют ли Ки белки на терминальную генную конверсию, если матрица для удлинения находится на гомологичной хромосоме.

Таблица 2. Частота НеТ-А/ГАЯТ присоединений в линиях утв/у ас гетерозиготных по делециям К и 70 (1гЬр) или КиНО.

_у мутанты_

генотип тестируемых у

линий Г, f. F, F, Fi Q (F,J (%)

2" 1340 J/2«2 Z' 19« З'ЧШ 4/tm 0.13

DfKuSOyCjfO //953 mm 07/11И №> Н12 и« 12.7

rXXiiSOVOr« Z'TM WW Ш/ И 02 iwm tnnm 14. Я

DfKiiSOVcjtt ИКчШ! NT) ND «Л 786 3/1543 3/IM4 0.21'

mmiKiis 1/670 1/Ш 7/1509 0/2« 0.»

DfKu70VTMS em 0/78 3/1 л mw ND 1.9

ОГКш0«>/7№ 1/959 2/863 J2'5BS 72.-797 4.5

Пояснения: N0 - не тестировались. Наклонный шрифт - число мух с новым фенотипом. Следующее число обозначает общее количество просмотренных мух. Колонка (2 (Р2-5) обозначает среднюю частоту визуально определяемых событий в поколениях 2-5, выраженную в процентах. В случае комбинации ОЖи802/СуО; Р{Ки80+) О была подсчитана в поколениях 4-5.

В этом случае в качестве балансерной хромосомы для тех же терминальных делеций использовалась X хромосома, несущая аллель у w. В данной ситуации на гомологичной хромосоме присутствуют последовательности гена yellow, которые могут служить матрицей для терминальной генной конверсии. Поэтому удлинение хромосомы может происходить как с помощью транспозиций мобильных элементов к концу хромосомы, так и с помощью терминальных конверсий.

Мутация в гене Ки80 вызывала резкое усиление терминальной генной конверсии. При этом частота транспозиций снижалась (проанализировано 6300 самок; 13%-конверсии; 1,2%-транспозиции). Аналогичные, но менее выраженные, результаты наблюдались и при введении в линии мутаций Ки70 (проанализировано 3990 самок; 3,8%-конверсии; 0,4%-транспозиции). Таким образом, можно сделать вывод, что в норме оба белка негативно регулируют терминальную генную конверсию (Рис.5).

. 1Т.П.Н.

+1 yellow

схема у ■ гена на гомологичной хромосоме

| ШАшЛШШ^

фенотип у2 аристы +

У ревертанты восстановление окраски тела

Рис. 5. Элонгация терминальной ДНК при помощи генной конверсии в присутствии матрицы для конверсии на гомологичной хромосоме. В верхней части показана структура аллеляУ. Энхансеры крыльев (w), тела (bod) и щетинок (bri) обозначены овалами. Мутированный старт-кодон обозначен как X. Пробы 1 и 2 -это геномные фрагменты Hindlll-BamHl (Н-В) и Hindlll- Eco47III (Н-Е), использованные при Саузерн-блот анализе. В нижней части показана структура аллелей yTD-700 и yTDsoo^ а также структура

производных, возникающих в результате генной конверсии либо присоединения мобильных элементов к концу хромосомы.

Наконец, третья модельная система воспроизводила ситуацию наиболее близкую к нормальной, когда на конце хромосомы находятся повторяющиеся последовательности мобильных элементов. В нашей системе на конце хромосомы находились несколько повторяющихся последовательностей мобильного элемента МДГ4 и регуляторной области гена yellow, а на балансерной хромосоме не было гомологичных последовательностей (Рис.6). Мутации в генах, кодирующих Ки70 и Ки80 не влияли на рекомбинацию между терминальными повторами. Среди 4920 просмотренных самок уг, несущих DfKu802/Cy<3 было обнаружено 6 самок с фенотипом у2 (0,12%). В потомстве линии yrDrh'22OO/yac;DiKu70Kl/TM6 , в которой обрыв хромосомы произошел в области дистального gypsy элемента, среди просмотренных 1860 самок нашлось 27 производных с фенотипом у2 (1,5%). Однако Саузерн-блот анализ показал, что производные с фенотипом у2, скорее всего, возникли в результате быстрой деградации концевой ДНК, индуцированной DfKu70, а не при помощи рекомбинации между повторами gypsy. В двух других производных линиях у /уас ,'DfKu70 /7М<5 с концами хромосом в положениях -3400 п.н. и -5100 п.н. было обнаружено всего 5 (0,17%) производных у2 среди 2935 самок уг.

yellow yellow

-<ъЩ hobo twXbocp-1 p-gypsy 1 ¿ ^ y^2j

TD2h2-900/1100

терминальная

генная

конверсия

Vfílln

уревертанты восстановление окраски тела

Iрекомбинация между _

yellow

у2- подобные

<.........«BÜS......--<ЙР— производные

Рис. 6 Терминальная элонгация с помощью генной конверсии в присутствии матрицы на самой терминально делегированной хромосоме. Схематичное изображение хромосом ут и yTD~" ° и их производных, ассоциированных с различными фенотипами. Инсулятор gypsy обозначен черным кругом. Энхансеры крыльев (w), тела (bod) и щетинок (bri) обозначены овалами. Пробы 1 и 2 - это геномные фрагменты Hindlll- BamHl (Н-В) и BamHl- EcoRl (B-R), использованные в Саузерн-блот анализе.

Частота терминальной генной конверсии одновременно резко возрастала. Среди 2464 самок yTD2l,2lyac ; DfKu802/СуО, просмотренных в течение поколений F2-5 было обнаружено 563 у1- подобные самки (23%), что практически в 230 раз выше контрольного уровня. В случае

DfKu70R1, 94 самки yr (3,8%) были найдены среди 2445 yTD2h2lyac ;DfKu70RI/7M> самок из поколений F3-5, что превышает уровень контроля в 38 раз.

Поскольку мутации в гене Su(var)2-5, кодирующем белок НР1, активируют транскрипцию НеТ-А (Savitsky et al., 2002; Perrini et al., 2004), было решено выяснить, будет ли снижение концентрации Ки белков так же влиять на транскрипцию НеТ-А. В DfKu70R1, DfKu80\ DfKu802 линиях транскрипция НеТ-А оставалась такой же, как в контрольных линиях, тогда как в линии Su(var)2-505 ее уровень был, примерно, в 10 раз выше (Рис.7). Поэтому, в отличие от эффекта мутаций Su(var)2-5, падение концентрации белков Ки70 и Ки80 не влияет на транскрипцию НеТ-А элементов (Рис.7).

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что Ки белки связываются с концами теломер дрозофилы и участвуют в формировании терминального теломерного комплекса.

^ 0 0 а

& оР jjf' Рис. 7. Анализ НеТ-А транскриптов в линиях, несущих DfKu70 и

^ ^ с. ^ DfKu80. Для Нозерн-блот анализа была использована тотальная

■V V ^ ^ S ^ О4 ^ РНК, выделенная из потомства линий, названия которых указаны

■ сверху. Двуцепочечная проба из открытой рамки считывания НеТ-

А гибридизовалась с РНК размером около 6 т.п.н. Проба из гена ras2, гибридизовавшаяся с транскриптом 1,6 т.п.н. служила контролем равного количества взятой для анализа РНК.

НеТ-А

1.4 Антогонизм между теломерным и щЛгаэ! Ро'усошЬ - зависимым хроматином на конце терминально делетированных хромосом у Drosophila melanogaster.

Ген polyhomeotic - один из генов группы Polycomb (PcG), которая включает около 30 локусов, играющих важную роль в процессе нормального развития дрозофилы и действующих как репрессоры гомеозисных генов (Jürgens, 1985). Известно, что PcG гены кодируют белки, которые влияют на компактизацию хроматина (Pirrotta & Rastelli, 1994) и связываются с особыми сайтами, названными Polycomb group Response Elements (PREs), найденными в регуляторных областях гомеозисных генов (Simon eta!., 1993).

Несколько лет назад было показано, что в результате встраивания /'-элемента в ген polyhomeotic возникает новый аллель phf' (Belenkaya et al., 1998). Аллель рИ" кодирует химерный белок P-Polyhomeotic (P-Ph), состоящий из ДНК-связывающего домена транспозазы Р-элемента и белка Polyhomeotic, у которого на N-конце отсутствуют 12 аминокислот. Белок Р-Ph связывается с последовательностью /'-элемента и рекрутирует другие PcG белки, что приводит к образованию функционального репрессионного комплекса, т.е. в этом случае концевые последовательности /"-элемента выступают в роли PRE. Таким образом, если Р-

элемент встраивается перед промотором гена yellow, в присутствии мутации plf' наблюдается репрессия транскрипции этого гена. При рй^-зависимой репрессии тело и крылья дрозофилы становятся более светлыми, а щетинки приобретают вариабельную окраску (часть щетинок окрашена, а часть не окрашена). Сильная степень репрессии выражается в полном отсутствии окраски кутикулярных структур - тело, крылья и щетинки у мух светло-желтые.

Чтобы выяснить, влияет ли теломерный хроматин на степень р/г^'-зависимой репрессии, мы, как и в предыдущих экспериментах, использовали линии Drosophila melanogaster, с обрывами X хромосом в кодирующей или регуляторной области гена yellow (линии ут). Нами была выбрана линия yTD'w"/y ас w. Мухи линии у11"/у ас w имели неокрашенные (светло-желтые) тело, крылья и щетинки, что говорит об отсутствии транскрипции гена yellow. С помощью Саузерн-блот анализ показал, что в описываемой линии отсутствует вся регуляторная область гена yellow, включая промотор. Терминально делегированная хромосома может удлиняться при помощи генной конверсии, что позволяет получить измененные последовательности ДНК в нативном положении гена yellow. В качестве матрицы для конверсии мы использовали линию дрозофилы у21'^', в которой Р-элемент размером 1200 п.н. встроился перед промотором гена yellow в положение — 69 п.н.. Описанные линии были скрещены между собой. Целью скрещивания являлось получение производных линий, в которых Р-элемент, встроенный в предпромоторную область гена yellow, будет находиться на разном расстоянии от конца терминально делегированных хромосом. Для повышения вероятности конверсионных событий в исходные линии дополнительно вводилась мутация En(tc), которая увеличивает частоту терминальной генной конверсии в десятки раз.

Полученные гетерозиготные самки yrDwa/у2''4™ были скрещены с самцами -/s,4w. Линия yTD'wVy*'4w поддерживалась на протяжении трех поколений, в течение которых происходили конверсионные события. Затем самки yTD1w"/ y?sl4w' были скрещены с самцами ywplf1. В потомстве этого скрещивания были получены мухи с разной степенью plf1 -зависимой репрессии. Самки yTD,wa/ ywplf' с полностью окрашенными или вариабельными щетинками были отобраны и индивидуально скрещены с самцами у ac w. Саузерн-блот анализ полученных производных линий выявил прямую корелляцию между эффектом, который мутация plf' оказывала на окраску щетинок и расстоянием от Р-элемента до конца терминально делегированной хромосомы. Полученные результаты позволили разделить производные линии на 4 класса.

У сачок yTD'Awa/ ywplf', с фенотипом у2, терминальный обрыв находился на расстоянии 100 - 500 п.н. от сайта встраивания Р-элемента в аллеле у2*'4 (Рис.8, класс А). Однако несмотря на присутствие Р-элемента в предпромоторной области гена yellow, в отобранных линиях

класса А рЛ^-зависимая репрессия отсутствовала. Возможно, в данном случае на последовательностях ^-элемента не собирался репрессионный комплекс.

Чтобы проверить данное предположение, мы попытались воспроизвести известный феномен кооперативной репрессии, который выражается в усилении активности слабого PRE при наличие сильного PRE на гомологичной хромосоме. Для этого был использован аллель у2'", содержащий две копии Я-элемента перед промотором гена yellow в положении - 69 п.н.. В присутствии мутации phP' Pc-G комплекс, который собирается на двух /"-элементах, вызывает полную репрессию транскрипции гена yellow. Поэтому последовательности /"-элементов в аллсле у2'" выступают в роли эффективного PRE. У гетерозиготных самок у2*14/ у pif' тело и крылья слабо окрашены, а окраска щетинок сильно вариабельная, тогда как гетерозиготные самки y2s'4/^s"pH'1 имеют фенотип у1 (неокрашенные тело, крылья и щетинки). Наблюдаемое в этом случае усиление репрессии in trans обусловлено взаимодействием PCG комплексов, собирающихся на Я-элементах гомологичных хромосом.

/то Het-A

В H нк H

-J-1_11 I

нк -1—1— 1? Ï,

<Щ>—"

Рис. 8 Схематичное изображение линий с терминально делегированной X хромосомой, использованных в работе. Обозначения: направление транскрипции гена yellow показано горизонтальной стрелкой над осью координат. Экзоны гена обозначены черными горизонтальными прямоугольниками. Энхансеры тела (Т), крыльев (Кр) и щетинок (Щ) обозначены серыми овалами. Огрезками под осью координат указаны фрагменты гена yellow и Р-элемента использованные для гибридизации с ДНК полученных производных линий. Ориентация /"-элемента указана стрелкой внутри обозначающего его треугольника. Место присоединения НеТ-А элемента в аллелеУ™ показано вертикальной стрелкой над осью координат. НеТ-А элемент обозначен черной горизонтальной стрелкой. Белые горизонтальные стрелки, подписанные hi, Ъ2, yl, обозначают использованные для ПЦР праймеры. Пунктирными отрезками обозначены районы, в которых были картированы терминальные обрывы в соответствующих классах производных линий. Рестриктные сайты обозначены следующими аббревиатурами: В-BamHl\ K-EcoRl] K-Kpnl, Н-ЯшоШ; X-Xhol.

Однако в гетерозиготных линиях yTD~A/ у2'"phf' щетинки у мух оставались полностью окрашенными. Следовательно, даже мощный репрессионный комплекс на гомологичной хромосоме не усиливает репрессию в линиях, где P-Ph ассоциированный белковый комплекс, вероятно, не может связаться с последовательностью Р-элемента, расположенного близко к концу хромосомы.

У гетерозиготных самок yTD~Bw"/ywphpl, отнесенных к классу В, в окраске щетинок наблюдалась слабая вариабельность, а терминальный обрыв находился на расстоянии 2 - 3,5 т.п.н. от места встраивания /"-элемента. Однако аллель у21"plf1 не усиливал репрессию in-trans (Рис.8, класс В).

В линиях класса С расстояние между концом хромосомы и /"-элементом составляло около 5 т.п.н. В этом случае у гетерозиготных самок ynu:wa/ywphP' часть щетинок была не окрашена (средняя степень вариабельности), т.е. наблюдалась частичная р/^'-зависимая

TD-C

репрессия. Однако эта репрессия не усиливалась, даже если линии у скрещивались с аллелемУ1"рЛр' (Рис.8, класс С).

Для полного восстановления р/^'-зависимой репрессии требуется, чтобы расстояние между Р-элементом и местом терминального обрыва хромосомы составляло не менее 8 т.п.н.. В линиях у™ размер последовательности, «зачитанной» с помощью терминальной генной конверсии составлял от 8 до 12 т.п.н. В этом случае энхансеры гена yellow, так же как и Р-элемент, находились на большом расстоянии от конца хромосомы. Поэтому окраска тела, крыльев и щетинок у мух была сравнима с диким типом. У гетерозиготных самок у70' wa/ ywphf' тело и крылья светлели, а щетинки становились сильно вариабельными в той же степени, как в контрольной линии y2sl4/ywphpl. Если же в положении in-trans присутствовала хромосома у2'"pif' (у™/ y>s"plf'\ мухи имели фенотип у1 (рис.8, класс D). Следовательно, в данном случае на последовательности Р-элемента собирался функциональный репрессионный комплекс. Вероятно, PC-G комплекс в присутствии мутации pW' может стабильно связываться с последовательностью Я-элемента и взаимодействовать с таким же комплексом, находящимся на гомологичной хромосоме, только если расстояние между ним и теломерным комплексом, который формируется на конце хромосомы достаточно велико.

В одной из производных линий с максимальной степенью р/^'-зависимой репрессии к последовательности гена yellow, «зачитанной» при терминальной конверсии, присоединился НеТ-А элемент, поэтому линия получила название /т (Рис.8). Отсутствие разницы в степени р/^'-зависимой репрессии в линиях ут'" и /т позволяет сделать вывод, что степень phf'-зависимой репрессии в ут линиях напрямую зависит от расстояния до конца хромосомы и не зависит от природы концевой последовательности ДНК.

Полученные данные позволяют утверждать, что теломерный хроматин негативно влияет на связывание или функционирование репрессионного Pc-G комплекса. В то же время, ранее было показано, что экспрессия трансгена, встроенного в теломер-ассоциированные последовательности (TAS), подавляется, что связано с присутствием в субтеломерных районах белков группы Polycomb (Mason et al., 2003). Следовательно, теломерный хроматин отличается от субтеломерного хроматина и перицентрического гетерохроматина, которые репрессируют транскрипцию эухроматиновых генов. Суммируя полученные результаты можно предположить, что между теломерным и субтеломерным (Pc-G-зависимым) хроматином существует антагонизм.

1.5 Влияние терминального хроматина на частоту вырезаний Р-элемента.

Для изучения частоты транспозиций Р-элемента были использованы ут линии, полученные так же, как в предыдущем эксперименте (Рис.9). Транспозиции Р-элемента осуществляются в результате связывания с его концами транспозазы, которая делает разрывы в цепях ДНК, после чего Р-элемент перемещается, а разорванные концы ДНК репарируются, обычно с использованием гомологичной сестринской хроматиды или хромосомы. Нужно отметить, что в нашем случае встроенная вблизи промотора гена yellow укороченная копия Р-элемента размером 1,2т.п.н. не кодировала функциональную транспозазу.

В зависимости от положения терминального обрыва и в соответствии с полученными ранее результатами, аллели yTD были сгруппированы в три фенотипических класса. У дрозофил из линий с фенотипом у2 дистанция между концом хромосомы и Р-элементом составляла от 0,5 до 1,4 т.п.н.; у /-подобных производных это расстояние варьировало от 1,6 до 6,5 т.п.н. и, наконец, у производных с фенотипом у+ (пигментация тела и крыльев на уровне дикого типа) терминальный обрыв был удален от Р-элемента более, чем на 6,5 т.п.н. (Рис.9).

Транспозаза Р—элемента, экспрессируемая находящимся на 3 хромосоме геном, вводилась в линии в результате генетического скрещивания (Рис.10). Затем проводился фенотипический анализ самок у70/ у ас pff' w. Доминантная мутация plf' частично репрессирует экспрессию yellow в щетинках, когда Р-элемент находится вблизи конца хромосомы. Таким образом, вырезания Р-элемента можно фиксировать по восстановлению окраски щетинок. Если вырезание приводит к терминальной делеции, то возникают производные с фенотипами у2

(отсутствие энхансеров тела и крыльев) и у1 (повреждение/отсутствие

_1_

—1

_4 У ,У . У промотора) (Рис.10).

Г'У) НеМ

нк н

Г L

~W V.B

нк

ГЭ6-1 yTDS-f ■MD5-?

'ТОМ /,ГОЯ

у™"

да

у<Цоч>

в к

улх-г * rmj

,rm-r JD4-3

Рис. 9 Схематичное изображение терминально делегированных хромосом, ассоциированных с различными фенотипами. Координаты (т.п.н.) указаны относительно сайта встраивания Р-элемента. Позиции концов хромосом в у™ аллелях указаны стрелками. Для Саузерн-блот анализа

использовались фрагменты Hindlll-BamHI (Н-В), Kpnl(K-K), HindlH-Xhol (Н-Х). Остальные обозначения, как на предыдущих рисунках.

Чтобы продемонстрировать, что используемый Р-элемент способен правильно вырезаться, были выбраны 3 аллеля у~* (у"4', у*142, у*'43) с таким же встраиванием Р-элемента, как в линиях ут, но с нормальными теломерами (Рис. 9). Вырезания Р-элемента в этих у*

аллелях приводили к образованию терминальных делений с частотой ниже, чем 2x10 (подсчитывалось количество у1 и у2 производных), тогда как полные вырезания Р-элемента с сохранением теломеры, приводящие к появлению производных с фенотипом у+ не чувствительных к р/т"'-опосредованной репрессии, происходили с частотой от 2,1 до 4,3%. Однако при анализе вырезаний Р-элемента из различных yTD хромосом были обнаружены производные с фенотипом у2 не чувствительные к р/^'-репрессии. Такие производные появлялись вследствие вырезания /"-элемента и последующего ре-лигирования маленького концевого фрагмента ДНК гена yellow.

Интересно, что при анализе вырезаний (детектировались по отсутствию phf' — опосредованной репрессии в щетинках) ни разу не было зафиксировано простое вырезние Р— элемента. Во всех случаях терялся конец хромосомы. Таким образом, 10-20 т.п.н гомологичных друг другу не достаточно для того, чтобы концевые последовательности ДНК удерживались вместе и происходила репарация двуцепочечного разрыва.

A F,» ™6'ть х ау£Л£Ж- Sb> -2-3

w ++ v ar. w I j . J.

(

F. 9

£_■ S6/2-3

yacw ' тмв.ТЬ

W . в

x cK*

у •

у ас ptf' w

у*_

^ ^ у ас рН" w анализ пигментации

yellow

Р элемент

^2-3

Рис. 10 Активация транспозиций Р-элемента и схематичное изображение полученных производных. А) Генетические скрещивания, использованные для активации транспозиций Р-элемента. Б) Вырезания Р-элемента из ут линий.

у* или у*

г b/w br + -

(рЬр1-репрессия)

- W ■ в

у* или/

b/w Ьг + +

(php -не чувствительные) yellow

■-•—Br-

полное вырезание

b/w Ьг

У*

b/w br

(рЬр1-нс чувствительные) (рЬр'-не чувствительные)

yellow ye//ow >

. «он—рсмяР элемент1

•Br-

терминальная делеция

терминальная „,HBenrMH делеция и к°нвеР™я

В потомстве самок у , у которых расстояние от Р-элемента до конца хромосомы изначально составляло более 4,5 т.п.н. (фенотип у2 или /), после вырезания Р-элемента были найдены 2 типа производных - с фенотипами у2 и у1. Саузерн-блот анализ показал, что в аллелях у' концы хромосом находились вблизи yellow промотора, что и являлось причиной полной инактивации гена. У производных у2 концы хромосом были расположены вблизи последовательности Р-элемента или дистальнее нее. Во многих случаях Саузерн-блот анализ

ДНК потомства отдельной у2 самки выявлял множественные терминальные фрагменты разного размера, что предполагает независимые события элонгации ДНК на конце хромосомы. Появление производных с фенотипом у2 предполагает, что элонгация ДНК происходила с помощью генной конверсии, а в качестве матрицы использовалась сестринская хроматида. Размер зачитанной последовательности, в основном, не превышал 500 п.н. (данные Саузерн-блот анализа 100 самок фенотипа у2), хотя ранее было показано, что при возникновении двуцепочечных разрывов с помощью генной конверсии может зачитываться последовательность ДНК размером от 1 до 8 т.п.н. (Gloor at al., 1991; Nassif at al., 1994). Относительно короткий размер обнаруженных в данном эксперименте терминальных конверсии позволяет предположить, что на конце хромосомы существует специальная структура хроматина, супрессирующая репликацию терминальной ДНК. Это согласуется с наблюдением, что при вырезании /"-элемента из ут линий, в которых концы хромосом находились на расстоянии от 4,5 до 1,8 т.п.н. от /"-элемента, все возникшие производные имели фенотип у1.

Далее в ут линиях была подсчитана частота вырезаний /"-элемента, /"-элемент вырезался с высокой частотой (1,5-16%) только если расстояние от него до конца хромосомы составляло более 4 т.п.н.. Если же дистанция сокращалась до 1,8-4 т.п.н., то частота вырезаний была крайне низкой (падала до 0,5%). /"-элемент, находящийся от конца хромосомы на расстоянии менее 1,2 т.п.н. вообще не вырезался.

В линиях у™ дистанция между /"-элементом и концом хромосомы составляла 3,3 т.п.н., а частота вырезаний варьировала в пределах 0,1-0,5%. Однако в случае аллеля У1™'"', когда к терминальному обрыву в той же позиции присоединился НеТ-А элемент и конец хромосомы отдалился на несколько т.п.н., частота вырезаний /"-элемента снова возросла почти до 9%. Т.е. именно дистанция до конца хромосомы, а не природа терминальной ДНК является определяющим фактором наблюдаемой репрессии вырезаний /"-элемента.

Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод, что на концевых последовательностях ДНК длиной 4-5 т.п.н. формируется особый теломерный хроматин, который влияет на активность транспозазы /"-элемента, а также супрессирует генную конверсию, которая потенциально возможна при возникновении терминальной делеции.

1.6 Подавление дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами на конце терминально делегированной хромосомы.

Ранее было показано, что расположенный на конце терминально делегированной X хромосомы промотор гена yellow успешно стимулирует экспрессию yellow в щетинках (Kahn et al., 2000; Savitsky et al., 2002). В то же время, для эффективного взаимодействия между

энхансерами и промотором гена yellow на конце хромосомы требуется около 4 т.п.н. дополнительных последовательностей ДНК (Mikhailоvsky et al., 1999). Исхода из этого, можно сделать 2 предположения: либо экспрессия в теле и крыльях вообще невозможна, когда расстояние между промотором гена и концом хромосомы менее 4 т.п.н., и теломерный хроматин напрямую репрессирует транскрипцию, либо теломерный хроматин препятствует взаимодействию между энхансером и находящимся от него на расстоянии промотором.

у2

~' W • В

gypsy 5 зЭ

'V уецон,

НК |в.......к

,Ь1

Stalker-

[и46)|»Ьр)16Ьр|(-е2) GGCCAATG (-69)... (-136)|l6bpHjbp|(-69l CATTGGCC (-62)J

(-146) CATGATGAAATAAC'ATGTTATTTCATCATG (-62) GGCCAATG (-69) aaaatgaaaacgaaggcgcgcghccaaettcggtggttttagtgattcgggtggttcagtgttcgggt..

(-136) CATGATGAAATAACAT/GTTATTTCATCATG (-69)CATIGGCC(-62)

r 100 П.Н.

у* —X... y2 yellow ........ —-

Рис. 11 Структура У® производных аллеля уА) Схема аллеля у*'1. МДГ4 (gypsy) встроился в положение -700 п.н. относительно сайта инициации транскрипции в аллель у1. Прямоугольники со стрелками внутри обозначают LTR и их ориентацию. В нижней части рисунка изображены изменения в промоторной области yellow в аллелеу*'. В скобках указана дистанция относительно сайта начала транскрипции гена yellow. Показаны 8 дуплицированных нуклеотидов из yellow. Внутри квадратов (14bp/16bp и 16bp/14bp) указано число п.н. из /"-элемента, оставшихся на концах. Остальные обозначения, как на предыдущих рисунках. Б) Последовательность Р' фрагмента, отвечающего за активацию yellow. Большими буквами внутри квадратов обозначены последовательности из Р~ элемента, а подчеркнутые буквы -дуплицированные последовательности yellow. Маленькие буквы обозначают инвертированную последовательность yellow. В) Схема терминально делегированных хромосом, найденных в потомстве отдельных самок у10/у ас.

В первой серии экспериментов использовали аллель у*'2, который был получен вследствие встраивания /"-элемента в аллель у2. Аллель у*'2 интересен тем, что несмотря на присутствие МДГ4, мухи имеют окраску тела и крыльев дикого типа. Молекулярный анализ позволил выяснить, что в предпромоторную область yellow встроен фрагмент ДНК следующей структуры: он содержит две последовательностей из концов /"-элемента размером по 30 п.н. в положениях -169 и -146 п.н. (Рис.11). Кроме того, последовательность ДНК между этими инсерциями находится в инвертированном положении. Восемь нуклеотидов от-69 до -62 (CATTGGCC) дуплицированы, а девять нуклеотидов от -137 до -145 (CACCTGATT) делегированы. Мы предположили, что именно эта последовательность (Р' элемент) отвечает за полную активацию yellow в теле и крыльях и поэтому может выступать как аналог энхансеров. С помощью терминальной генной конверсии Р' элемент рекрутировали на конец хромосомы. Мухи приобретали окраску тела и крыльев сравнимую с диким типом практически сразу после того, как Р' элемент зачитывался полностью. Таким образом, ген yellow активен в теле и

крыльях дрозофилы, даже если находится на конце терминально делегированной хромосомы, а, значит, у Drosophila теломерный хроматин не репрессирует транскрипцию.

Можно предположить, что теломерный хроматин блокирует энхансер-промоторную коммуникацию, т.к. оказывает влияние непосредственно на коровью элементы yellow промотора. Чтобы решить эту проблему, на конец хромосомы при помощи генной конверсии рекрутировали промоторы генов w, eve и hsp70. Эти промоторы различаются по составу коровых элементов. Замена в гене yellow в каждом случае составляла 193 п.н. и содержала одну и ту же последовательность ДНК (Рис.12).

yellowQ

(+1)

< 31> CCAG 1Г <+29>

ТАТААА 73—GAGG

ггата1 ШЫ ШЛ 1

white\

(+1)

t™£(+g>vag

_ВДВ

Рис. 12 Коровые элементы

промоторов _vo//ovr, w, eve и hsp70. Обозначены

описанные (темные квадраты) и предсказанные

(белые квадраты) последовательности ТАТА-бокса

(TATA), инициатора (Inr), TFIIB связывающего

элемента (BRE), и downstream promoter element

(DPE).

(-42)

(-31)

(+1)

GAGCGCA ТАТААА

eve| | BRE I iTATAl ~

CACTg

(-42) (31)

GAGCGCA ТАТААА

hsp70\ I'breI |ТАТаГ

(+1)

caatt^(«9)tcg

UVJM

Бьи получен ряд аллелей с терминальными делециями в различных участках гена yellow, содержащих все типы гетерологичных промоторов (Рис.13). Наличие гетерологичного промотора и размер терминально делегированной хромосомы определялись с помощью Саузерн-блот анализа.

6 5 4 3 2 10

5.45Т.П.Н.

Рис. 13 Структура у производных аллелей

Обозначения, как на О.Эт.п.н. предыдущих рисунках.

НСН

V Л

♦TDeve У+TDhsp У+TDw

rTDeve YrTDhsp YrTDw

проба1

yellow v

I...........] pr.

проба2

2TDhsp

2TDw[w]

Полученные результаты были полностью аналогичны ситуации, когда терминально делегированная хромосома имеет нативный промотор гена yellow. Т.е. нормальная экспрессия yellow восстанавливалась, когда между промотором гена и концом хромосомы было около 10 т.п.н. Эти данные позволяют утверждать, что энхансеры, находящиеся на конце хромосомы не

способны эффективно стимулировать гетерологичные промоторы, а значит специфическая комбинация коровых элементов промотора не критична для проявления позиционного эффекта на конце хромосомы.

Чтобы проверить, насколько комбинация коровых промоторных элементов важна для транс-взаимодейстия между энхансерами и промотором, на конец терминально делетированных хромосом, несущих гетерологичные промоторы были рекрутированы последовательности ретротранспозона МДГ4 (Рис.14).

LTR

Т ▼▼▼ т

gypsy

й'

^ LTR

H_LL!LÍ.

SSSSJ yellow ?

н ОГв с

_L_Ol_I_

R _L

fea

Рис. 14 Структура хромосом с терминальными обрывами в последовательности gypsy. Стрелками указано место терминального обрыва для каждого производного аллеля. Остальные обозначения, как на предыдущих рисунках.

Все полученные аллелели имели фенотип у2. Для анализа межхромосомного взаимодействия был использован аллель ут, в котором присутствуют энхансеры тела и крыльев, но делегирован промотор гена yellow. Выяснилось, что уровень трансвекции не зависел от типа промотора, но, как и в случае нативного промотора yellow, прямо кореллировал с расстоянием до конца хромосомы. В линиях ут', с концами терминальных обрывов в положении между - 1200 и - 2500 п.н. гетерозиготные самки ут'/ у'"8 имели фенотип у1, т.е. комплиментация между аллелями не наблюдалась. В 6 производных аллелях концы хромосом находились между -3500 и -5300 п.н. У самок в этих линиях тело было окрашено на 2-3 балла и крылья на 3 балла. Следовательно, для транс-активации расстояние между промотором и концом хромосомы должно было составлять около 4000 п.н.. В 8 ут линиях мухи имели максимальный уровень пигментации тела и крыльев, сравнимый с окраской в линии уVy!"s. В этих линиях терминальные обрывы находились на расстоянии более 5000 п.н. от промотора. Т.е для проявления максимальной степени трансвекции, расстояние от конца хромосомы до промотора должно было составлять не менее 5,5 т.п.н.

В следующей серии экспериментов в полученные линии, содержащие гетерологичные промоторы и Su(Hw) инсулятор, ввели мутацию mod(mdg4). Эта мутация превращает инсулятор в прямой репрессор гена yellow. Уровень репресии можно тестировать визуально по изменению окраски щетинок у мух. Во всех случаях уровень репрессии не зависел от типа промотора. Полученные результаты доказывают, что эффект трансвекции может быть воспроизведен на

конце терминально делетированнои хромосомы и все гетерологичные промоторы, eve, w и hsp70, способны взаимодействовать с энхансерами yellow in trans. Однако способность гетерологичных промоторов транс-активироваться энхансерами прямо зависит от расстояния до конца хромосомы. Ни количество коровых элементов, ни их структура не критичны для специфичного дистанционного взаимодействия между энхансерами yellow и промотором.

Интересно, что во всех случаях мы обнаружили полную корелляцию между уровнем экспрессии yellow при трансвекции и уровнем модификатор-зависимой репрессии. Эти результаты позволяют высказать предположение, что столь разные регуляторные элементы, как энхансеры и инсулятор, действуют на активность yellow промотора по одному и тому же механизму. Ярко выраженная, прямая корелляция между транс-активацией промотора гена yellow и Mod(mdg4)-3aBHCHMofl репрессией позволяет предположить, что дистанционные взаимодействия между промотором yellow и полностью различными регуляторными элементами, yellow энхансерами и gypsy инсулятором, супрессирует теломерный хроматин.

1.7 Механизм удлинения хромосом и контроля их длины у Drosophila melanogaster.

У большинства организмов длина теломер поддерживается в строгих пределах, что предполагает существование механизмов регуляции длины теломер. Основную роль в защите и регуляции длины теломеры играет теломерный хроматин, который может индуцировать формирование специфической конфигурации, названной теломерной петлей или Т-петлей (de Lange, 2004) (Рис.15). Размер Т-петли может сильно варьировать. Он не важен для функционирования теломер.

Как и у других организмов, у дрозофилы формирование Т-петли может являться эффективным механизмом защиты 3' конца теломеры и регуляции транспозиций ретротранспозонов.

Рис. 15 Модель организации теломер на последовательностях HeT-A/TART/TAHRE у Drosophila. А) Структура Т-петли предотвращает присоединение новых ретротранспозонов к теломере. Белки I-(tc), Ku70/Ku80 и НР1 предотвращают терминальную репликацию ДНК. Б) Частичная инактивация белков E(tc), Ku70/Ku80 или НР1 открывает путь для терминальной репликации, что приводит к удлинению ДНК.

Проводя аналогию со структурой теломер млекопитающих, можно предположить, что и у дрозофилы MR комплекс участвует в формировании Т-петли, а комплекс НР1-НОАР стабилизирует ее, связывая одноцепочечную ДНК в D-петле. Существование повторов в последовательностях мобильных элементов HeT-A/TART/TAHRE может способствовать

ведущая нить

созданию на теломерах структуры Т-петли (Рис.15).Однако терминально делегированные хромосомы имеют на конце уникальные последовательности ДНК, что затрудняет, либо даже блокирует формирование стабильной Т-петли. Так как концы терминально делегированных хромосом ведут себя как стабильные теломеры, а их удлинение за счет транспозиции ретротранспозонов в норме подавлено, то формирование Т-петли, вероятно, не является обязательным условием стабильности теломер дрозофилы.

Определенная длина хромосом у Drosophila может поддерживаться путем транспозиции ретротранспозонов (Biessmann et al., 1990; Biessmann et al., 1992b; Sheen & Levis, 1994; Kahn et al., 2000). Поэтому ингибирование транскрипции мобильных элементов на теломерах является одним из очевидных механизмов контроля длины теломер дрозофилы. Белок НР1 является негативным регулятором длины теломер. Уменьшение активной концентрации белка НР1 приводит, примерно, к стократному увеличению частоты транспозиций НеТ-А и TART па конец терминально делегированных хромосом (Savitsky et al., 2002). Высокую степень зависимости частоты транспозиций ретротранспозонов от концентрации белка НР1 можно объяснить тем, что белок НР1 является, с одной стороны, ключевым компонентом терминального кэппингового комплекса, а с другой, НР1 участвует в репрессии транскрипции ретротранспозонов по механизму РНК-интерференции. Частичная инактивация белков Ки70 и Ки80 тоже приводит к значительному повышению частоты транспозиций ретротранспозонов, но не влияет на экспрессию НеТ-А. Это говорит об участии Ки белков в образовании и функционировании терминального кэппирующего комплекса и теломерного хроматина, но не в репрессии, опосредованной РНК-интерференцией (Melnikova et al., 2005). Интересно, что влияние мутаций в генах, кодирующих белки НР1 и Ки, на механизм удлинения

последовательностей на конце у хромосом кардинально меняется, если на конце присутствуют повторяющиеся последовательности ДНК, позволяющие формировать стабильную Т-петлю (Рис.15). В этом случае частичная инактивация белков НР1, Ки70 или Ки80 приводит к резкому увеличению частоты терминальной генной конверсии, но не транспозиций мобильных элементов на конец повтора (Savitsky et al., 2002; Melnikova et al., 2005). Можно предположить, что конфигурация Т-петли, которая может формироваться на терминальном повторе, супрессирует транспозиции ретротранспозонов, даже при частичной инактивации компонентов теломерного кэппингового комплекса. С другой стороны, нарушение в структуре кэппингового комплекса может приводить к дерепрессии репликации терминальной ДНК. Таким образом, одной из функций белков НР1-НОАР и Ки должна быть супрессия неконтролируемой репликации теломерных повторов, так как 3'-конец, находящийся в гетеродуплексе Т-петли, может удлиняться за счет репликации ДНК. Кроме того, в супрессии терминальной репликации ДНК принимает участие фактор, который кодируется пока не

идентифицированным геном Enhancer of terminal gene conversion, E(tc) (Melnikova & Georgiev, 2002). Линии дрозофилы, содержащие мутацию E(tc), имеют намного более длиные теломеры, состоящие из ретротранспозонов, что можно объяснить увеличением количества повторов в результате терминальной репликации ДНК.

Недавно была предложена модель, объясняющая регуляцию экспресси ретротранспозонов НеТ-А и TART конкуренцией между репрессивными эффектами TAS и стимулирующими эффектами промоторов HeT-A/TART массивов (Mason et al., 2003). Развивая эту идею, можно предложить модель действия механизма контроля длины теломер, основанную на антагонизме между двумя типами хроматина, формируемого на теломерах и TAS (Рис.16). Белковые комплексы, возможно включающие PcG белки, собираются на последовательностях TAS и могут распространяться на последовательности ближайших ретротранспозонов. Если теломерные последовательности HeT-A/TART/TAHRE слишком коротки, то хроматин,

формирующийся на TAS, влияет на

TAS формирование нормального теломерного

па rnmiln* _________________тгг г г

хроматина и на возможность формирования Т-петли.

Рис. 16 Модель регуляции длины теломеры Ога.^орИНа.

silencing complex

■A! ЛвШ«

HeT-A/TART/TAHRE транспозиции

U-A/TART/TAHRE тра( < ü

Б tas ж А) Доступность концов теломеры для транспозиции

TAS

возрастает, когда последовательность ■А 'ЯЬа К■ЖШ^- HeTA/TART/TAHRE слишком короткая. Б) Удлинение »•'—"£ термийшьный последовательности HeTA/TART/TAHRE приводит к

кэпирующий подавлению ретротранспозиций. комплекс

Отсутствие Т-петли приводит к высокой доступности конца хромосомы для транспозиций мобильных элементов. И, наоборот, если теломерная последовательность HeT-A/TART/TAHRE достаточно длинна, формирующийся на TAS хроматин не влияет на стабильность теломерного хроматина и кэпирующего комплекса, которые защищают конец хромосомы путем формирования Т-петли и предотвращают дальнейшее удлинение теломеры.

2. Изучение взаимодействий между регуляторными элементами генома, находящимися на большом расстоянии друг от друга.

2.1 Энхансеры гена yellow и gypsy инсулятор влияют на активность промотора гена yellow через одни и те же регуляторные элементы.

Т.к. энхансеры yellow эффективно стимулировали гетерологичные промоторы, было выдвинуто предположение, что специфичная коммуникация между энхансером и промотором обусловлена элементами, находящимися вне последовательности -69 - + 130 п.н., которая была заменена в yw, ует и )/lsp аллелях (Рис. 17).

(-ii8)ccgaatcactaaaacca_

|ccgaagttggcgcgcgccttcgttttcatttt|

cattggcctgtcttcgtcttcKgagaaaaaa

aacttcATATAAacgcggccgacata

ttatggccACCAGTcgttaccgcgcca

ggtccacagaagaggattaaaaaaatat

cacacagccgaaggctagagaagaacc

ccctatagctgaacatatataaacaaatat

atttttttttattgccaacacactttggcttaag

tgttaagagtgattgtcagcttagagcta

agtgcaATG(+i73)

Рис. 17 Последовательность промоторной области yellow. TATA промотор, инициатор и сайт инициации трансляции (Kutsch and Kadonaga, 2000) обозначены заглавными буквами. Наклонными буквами обозначена последовательность размером 198 п.н., которая была заменена в мутантных аллелях ул, уeve и У'7'. Сайт инициации транскрипции обозначен звездочкой. Частично дуплицированные последовательности (возможные коммуникаторные элементы) перед TATA - подчеркнуты. Последовательность, удаленная из генов dwY и deveY, заключена в прямоугольник.

Ранее было показано (Savitsky et al., 2003), что для эффективной трансвекции необходима последовательность размером 150 п.н., расположенная перед промотором гена yellow. В предпромоторной области гена yellow присутствует частично дуплицированная последовательность (Рис.17). Один из повторов, между -94 и -79 п.н. присутствовал в аллелях yTDw и yTDeve . Этот повтор содержит GC богатую последовательность, которая встречается в проксимальной области многих эукариотических помоторов.

Чтобы выяснить, какую роль данная последовательность играет в активации промотора, мы создали ряд трансгенных конструкций, в которых промотор yellow был заменен на гетерологичный, а тестируемая последовательность либо присутствовала, либо была делетирована (Рис.18). В большинстве случаев в присутствии тестируемой последовательности окраска тела и крыльев у мух в трансгенных линиях была близка к дикому типу и активация зависела от присутствия энхансеров тела и крыльев. В отсутствии же этой последовательности практически во всех линиях тело и крылья у мух не были окрашены.

трансгенные линии

Шкала yellow пигментации

Alj wlB^---"-^ уеЧо^тг-^Ша-

(Ey)wY 14 9-

ДЕу 14 — - -

_ 111 — Irl

b>|\v в J "

I yellow Br -

13/14

—N-«

(Ey)eveY ДЕу

,'Г,

26 24/24

(Ey)dwY 27 -(Ey)deveY 33 2 -

EyAdwY 2 6 7-

^ H>hite-

WBr

EyÄdeveY —

15 10

Рис. 18 Схематичные изображения конструкций и результаты тестирования трансгенных линий на способность энхансеров yellow стимулировать гетерологичные промоторы. Сайты для Flp рекомбиназы (frt) обозначены направленными вниз стрелками. В названиях конструкций эти сайты обозначены скобками. Фенотип yellow в трансгенных линиях (Р) определялся у гетерозиготных по конструкциям самцов (Я/+). В таблице указано число линий, соответствующих определенному уровню пигментации yellow (шкалаyellow пигментации) в абдоминальных сегментах брюшка (соответствует активности энхансера тела). В большинстве линий уровень пигментации в крыльях (соответствует активности энхансера крыльев) кореллировал с окраской тела. N - число линий, в которых после вырезания энхансеров мухи приобрели новый фенотип. Г-тотальное число линий, протестированных для каждой конструкции. Остальные обозначения как на предыдущих рисунках.

Полученные результаты позволяли предположить, что последовательность -100 - -69 п.н. содержит регуляторные элементы, 34

которые необходимы либо для проявления базовой активности промоторов в теле и крыльях, либо для специфической коммуникации между энхансерами и находящимся на расстоянии промотором.

Чтобы выбрать из двух предположений правильное, было проверено, нужна ли последовательность -100 - -69 п.н. для стимуляции экспрессии yellow в теле и крыльях, если энхансеры находятся в непосредственной близости от промотора. В конструкциях EyAdeveY и EyAdwY последовательность между энхансерами и промоторами dw и deve была удалена (Рис. 18). В 13 трансгенных линиях EyAdwY кутикула тела и крылья у мух были частично пигментированы, а в 10 линиях EyAdeveY уровень пигментации был сопоставим с диким типом. Поэтому последовательность -100 - -69 п.н. критична для стимуляции yellow промотора только тогда, когда энхансеры находятся на большом расстоянии от промотора.

Далее была изучена роль последовательности -100 - -69 п.н. в осуществлении стимуляции промотора не специфичным активатором. В работе был использован дрожжевой активатор GAL4, который связывается с upstream activating sequences (UASs; Ptashne and Gann.,2002). Известно, что при индукции экспрессии GAL4, этот активатор способен неспецифично стимулировать расположенные рядом промоторы. Были созданы конструкции, в которых энхансеры гена yellow заменили на дрожжевой активатор GAL4 в положении - 893 п.н.

относительно сайта инициации транскрипции гена yellow (Рис.19).

Рис. 19 Схематичное изображение конструкций и результаты тестирования трансгенных линий на способность GAL4 стимулировать гетерологичные промоторы. N - число линий, в которых после скрещивания с экспрессирующей GAL4 линией мухи приобрели новый фенотип. Т— тотапьное число линий, протестированных для каждой конструкции. Остальные обозначения, как на предыдущих рисунках.

Оказалось, что GAL4 одинаково активирует гетерологичные промоторы как в присутствии, так и в отсутствии тестируемой предпромоторной последовательности. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что изучаемая последовательность от -69 до -100 п.н. не нужна для активации транскрипции yellow в теле и крыльях. Вероятно, она необходима именно для

трансгенные Шкала yellow линии пигментации

А ►—ЕШЙ-у yito*................¡¡ж............................»••

G4Y 16 - - - 16

+GAL4 1 2 4 9 15/16

Б ►—ВШИ—( д У у у<«°~................>ЦШШ --------------1

G4dY 7 7

+GAL4 --25 7/7

В►-ВШИ-¿ve. .У/Ат-..............>Н..... »К

G4eveY 12 - - - 12

+GAL4 2 _ 2 8 10/12

Г ►—ЮЗОВ—гл 1'гПич-................Htbwhitu »Н

G4deveY 11 - - - 11

+GAL4 1 2 3 5 10/11

д ►—гады— —\ Н> yellow- ► f- tvhitL > •}

G4wY 15 - - - 15

+GAL4 2 2 11 - 13/15

E ►—lВИД—(A >»i>"//._____

G4dwY 12 — - - 12

+GAL4 1 3 8 - 11/12

специфичной коммуникации между энхансером и находящимся от него на расстоянии промотором.

И наконец, чтобы проверить, как потенциальные коммуникаторные элементы влияют на 8и(Н\у)-зависимую репрессию, мы создали ряд конструкций, в которых между энхансерами и промоторами был помещен инсулятор. Найденная коммуникаторная последовательность так же либо присутствовала, либо была удалена (Рис.20). Для каждой конструкции на фоне мутации mod(mdg4)'', суммарно протестировали 20-40 трансгенных линий. В присутствии коммуникаторной последовательности репресия наблюдалась в большинстве трансгенных линий, независимо от типа промотора. А в случае делеции коммуникаторных элементов —

Рис. 20 Схематичное изображение конструкций и результаты тестирования трансгенных линий на способность 5и(Н\у) инсулятора репрессировать гетерологичные промоторы на фоне мутации тос!(тс1§4)и1. Фенотип в трансгенных линиях определялся у гетерозиготных по конструкциям самцов. В таблице указано число линий с определенным уровнем тос1(тс1^4)<11 - зависимой репрессии в щетинках (эффект mod(mdg4)uI). Оценивалась пигментация щетинок на голове и на груди: 1-полное отсутствие пигментации во всех головных и грудных щетинках; уаг — вариабельная пигментация щетинок; 5 - пигментация всех щетинок, как у мух дикого типа. Показано отношение линий, подверженных влиянию тос^(т^4)"' (%) к общему количеству проанализированных линий. число линий, в которых мухи приобрели новый фенотип на фоне мутации тос!(тс1%4}и!. Г-тотальное число линий, протестированных для каждой конструкции. Остальные обозначения, как на предыдущих рисунках.

Исходя из результатов всех проведенных экспериментов, можно сделать следующий вывод: в предпромоторной области гена yellow находятся комуникаторные элементы, обеспечивающие как коммуникацию между энхансером и промотором, так и gypsy (Su(Hw)) -зависимую репрессию. Репрессия гетерологичных промоторов Su(Hw) инсулятором только в присутствии последовательности -69 - -100 п.н., свидетельствует, что gypsy-HHcyimjop взаимодействует с yellow промотором с помощью тех же самых механизмов, что и энхансеры yellow.

Способность инсулятора дистанционно модулировать (стимулировать/репрессировать) активность yellow промотора, зависящая от присутствия белка Mod(mdg4)-67.2, говорит о возможности прямого взаимодействия между белками, связывающимися с yellow промотором и gvpi^-инсулятором.

только в небольшом проценте линий.

трансгенные эффект %

линии_тос!(тЬд4)"_репрессии

1 Уаг 5 N/1

А>- \у н -ф-.г ;■■-/"» Вг .............................>н

ЕуБУ 11 17 9 28/37 76%

Б ► V в .ф н-: >га-н иг • >Н

ЕуЗигУ 3 18 9 21/30 70%

ВЬ>'"в Шт,■■•№.»■ Вг-»-и*,-»г >;<

EySeveY 7 11 з 18/21 86%

)И ~....... > X

EySdwY 2 2 38 4/42 10% Д> \\ в ф<

■гЯ

EySdeveY 4 4 53 8/61 13%

2.2 Функциональное взаимодействие между Su(Hw) инсуляторами, находящимися на большом расстоянии друг от друга, может регулировать энхансер-промоторные взаимодействия у Drosophila melanogaster.

В следующей части работы с помощью модельной системы гена yellow изучалось влияние расстояния между инсуляторами и их взаимного расположения на 8и(Н\у)-зависимую инсуляцию. Известно, что одиночная копия Su(Hw) полностью блокирует энхансеры тела и крыльев в составе трансгенной конструкции, если находится между этими энхансерами и промотором гена yellow. Фенотип трансгенных мух - у2, то есть светлые тело и крылья, темные щетинки. Однако ранее было показано (Muravyova et al., 2001), что две копии инсулятора в положении между промотором и энхансерами теряют способность блокировать взаимодействие между ними и позволяют энхансерам активировать промотор.

Рис. 21 Схематичное изображение конструкций, созданных для изучения взаимодействия между инсуляторами Su(Hw), находящимися на различных дистанциях и в различных положениях относительно друг друга. Еу - энхансеры крыльев и тела. I внутри черного круга - инсулятор Su(Hw). Треугольники вокруг инсулятора обозначают сайты распознавания рекомбиназ. Черными прямоугольниками обозначены спейсеры - gypsy (Sg) и /.., указанные в названиях конструкций. Su(HwY обозначает введение в линии мутаций Su(Hw)VSu(Hw/. N - число линий, в которых мухи приобрели новый фенотип на фоне мутаций, инактивирующих белок Su(Hw). Т -тотальное число линий, протестированных для каждой конструкции. Остальные обозначения, как на предыдущих рисунках.

Кроме того, было показано, что 2 Su(Hw) инсулятора способны взаимодействовать и нейтрализовывать инсуляторную активность друг друга, даже когда между ними находится энхансер или промотор (Savitskaya et al., 2006). С другой стороны, когда два Su(Hw) инсулятора окружают энхансеры гена yellow, они полностью блокируют взаимодействие энхансеров с промотором, находящимся вне домена, образуемого инсуляторами.

Предположительно, блокирование активности энхансеров происходит в результате стерической изоляции энхансеров от промотора, возникающей вследствие взаимодействия между белковыми комплексами, связанными с 8и(Н\у) инсуляторами. Была выдвинута

шкала yellow N/T трансгенные пигментации линии ?....... -1 д ......г

.1-^-1 бтпн

EySgJYfl) 30 30

Д1 28 0/28

su(HwJ 1 14 16/7

бтпн л |----v.....,

REy%lY 1 3 3

su(Hwf 1 4 2 5П

„.«.1-emit-in Ртпн I—К

D-EySglY(I) 12 10 - - 22

Al 3 8 8 2 14/21

П ,Л1-8тпн бтлн л |-п-s—,,

RAEySglY 17 17

бтпн ,-TJ-*—

EyBjjYffl 13 1 - - 14

Д1 14 1/14

su(Hv) 2 3 1 6/6

17 -бтнг-рп л. бтлн .-„-

REylSgY 17 1 18

su(Hwf 1 2 5 1 8/9

гипотеза, что при увеличении расстояния между взаимодействующими инсуляторами может происходить восстановление активности энхансеров. Для проверки этой гипотезы был создан ряд трансгенных конструкций (Рис.21), в которых присутствовал спейсер длиной 6 т.п.н. В качестве спейсера использовался фрагмент, кодирующей последовательности ретротранспозона МДГ4. В конструкциях Su(Hw)A (EySglY(I)) и Su(Hw)B (REySglY) он располагался между энхансерами тела и крыльев и инсулятором Su(Hw), находящимся в позиции -893 п.н.. В конструкции Su(Hw)A вторая копия инсулятора, окруженная fox сайтами для вырезания in vivo, находилась за геном yellow. Таким образом, расстояние между двумя копиями Su(Hw) составляло 6 т.п.н.. Было получено 30 линий, несущих конструкцию Su(Hw)A. Во всех линиях мухи имели у2 фенотип, что свидетельствует о полном блокировании энхансеров тела и крыльев. В 7 линий была введена мутация по белку Su(Hw), необходимому для проявления инсуляторной активности. В 6 из них произошло восстановление экспрессии yellow в теле и крыльях. Следовательно, энхансеры тела и крыльев сохраняют способность активировать промотор yellow в большинстве мест генома, даже если находятся от него на расстоянии 7 т.п.н. Вырезание второй копии инсулятора не изменяло фенотип мух в 28 из 30 линий. Таким образом, одиночная копия Su(Hw) способна эффективно блокировать энхансеры, находящиеся на расстоянии 7 т.п.н. В конструкции Su(Hw)B вторая копия инсулятора была помещена на расстоянии 1.8 т.п.н. ().) перед энхансерами тела и крыльев. Инсуляторы окружали энхансеры и находились друг от друга на расстоянии 10 т.п.н. В 6 из 7 полученных линий наблюдалась промежуточная пигментация тела и крыльев. После введения мутации по белку Su(Hw), в 5 линиях тело и крылья у мух становились темнее. Следовательно, в данном случае активность энхансеров, окруженных двумя инсуляторами находящимися на большом расстоянии, только частично заблокирована.

Чтобы выяснить, происходит ли активация экспрессии yellow в линиях, несущих конструкцию Su(Hw)B, за счет энхансеров тела и крыльев, либо за счет взаимодействия между двумя копиями инсулятора, в контрольной конструкции Su(Hw)D (IAAEySglY ) энхансеры были вырезаны. Все 17 трансгенных линий, несущих конструкцию D, имели фенотип у2. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что частичное взаимодействие между энхансерами и промотором становится возможным вопреки инсулятору Su(Hw), находящемуся между ними, если присутствует второй вышележащий инсулятор, находящийся от первого на расстоянии 10 т.п.н.

Далее было решено объединить элементы конструкции Su(Hw)A и Su(Hw)B в составе конструкции Su(Hw)C (I?.EySgIY(I)), несущей 3 копии инсулятора, расположенные на большом расстоянии друг от друга, и проанализировать вклад третьей копии в эффект инсуляции. В 22

линиях, трансгенных по конструкции Su(Hw)C, мухи имели у2 или близкий к нему фенотип.

Вырезание инсулятора, расположенного за геном yellow, приводило к усилению пигментации в 14 линиях, что соответствует данным, полученным при работе с конструкцией Su(Hw)B. Следовательно, именно третья нижележащая копия Su(Hw) оказывает значительное влияние на взаимодействие двух вышележащих копий инсулятора, окружающих энхансеры, в результате чего инсуляция полностью восстанавливается. Возможно несколько объяснений наблюдаемого эффекта, включая стимулирующее воздействие на транскрипцию взаимодействия между тремя копиями инсулятора или других стерических эффектов от взаимодействия инсуляторов вокруг энхансера и вокруг гена. Но наиболее простой кажется идея, что внешние инсуляторы взаимодействуют, нейтрализуя друг друга и виртуально восстанавливают классическое сочетание энхансер/инсулятор/промотор внутри конструкции.

Комбинация регуляторных элементов, аналогичная присутствующей в конструкции Su(Hw)A, была воспроизведена в конструкции Su(Hw)E (EylSgY(I)), однако расстояние между двумя копиями инсулятора, окружающими ген yellow, было увеличено до 12 т.п.н.. Предполагалось, что, как и в конструкции Su(Hw)B, увеличение расстояния между инсуляторами может привести к частичной нейтрализации эффекта инсуляции. Однако фенотипический анализ мух, несущих эту конструкцию, не выявил различий в сравнении с конструкцией Su(Hw)A (мухи имели фенотип у2). Полученные данные позволяют предположить, что в данном случае последовательность гена yellow, расположенная между двумя копиями инсулятора влияет на их взаимодействие. Для завершения серии конструкций, несущих несколько копий 5и(Н\у)-инсулятора, расположенных на различных расстояниях по отношению друг к другу и к регуляторным элементам гена yellow, была сделана конструкция Su(Hw)F (IXEylSgY). В отличие от конструкции Su(Hw)B, расстояние между инсуляторами, окружающими энхансеры гена yellow, было сокращено до 4 т.п.н.. Во всех 18 полученных линиях Su(Hw)F мухи имели фенотип у2 , что говорит о полном блокировании энхансеров yellow в отличие от частичной инсуляции, наблюдаемой в конструкции Su(Hw)B.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что расстояние между инсуляторами Su(Hw), окружающими энхансеры тела и крыльев, влияет на способность инсуляторов блокировать взаимодействие между этими энхансерами и промотором гена yellow. Когда расстояние между взаимодействующими инсуляторами достаточно мало, энхансеры, расположенные между ними, не могут взаимодействовать с изолированным промотором в результате стерических/топологических проблем, созданных взаимодействующими инсуляторами. При увеличении расстояния между инсуляторами роль стерических/топологических препятствий уменьшается, что приводит к восстановлению взаимодействия между энхансерами и промотором (Рис.22).

Полученные данные не могут полностью объяснить механизм 5и(Н\у)-зависимой инсуляции,

но, основываясь на них, можно утверждать, что инеуляторы являются не только барьерами,

препятствующими взаимодействиям между другими элементами генома, но, скорее, выступают как разносторонние агенты, которые широко вовлечены в регуляцию экспрессии комплексных генетических локусов.

2.3 Компонент Su(Hw) инсуляторного комплекса белок Mod(mdg4) может репрессировать транспозиции /"-элемента у Drosophila melanogaster.

/^элемент дрозофилы является одним из наиболее полно охарактеризованных транспозонов эукариот. Полноразмерный Р-элемент (2,9 т.п.н.) кодирует белок транспозазы размером 87 kD (O'Hare and Rubin, 1983). Для транспозиций Р-элемента необходимо присутствие последовательностей размером около 150 п.н. на обоих его концах (Kaufman et а!., 1989). Эти последовательности включают 31 п.н. концевые инвертированные повторы, внутренний сайт связывания транспозазы и внутренние 11 п.н. инвертированные повторы (Kaufman et al., 1989; Mullins et al., 1989). Во время транспозиций /'-элемента, транспозаза катализирует расщепление и перемещение нитей ДНК (Kaufman and Rio, 1992; Bell and Rio, 1997). Для эффективного связывания транспозазы и последующего вырезания необходимы оба конца /'-элемента, 5' и 3', что предполагает необходимость формирования перед перемещеним /"-элемента синаптического комплекса на его концах (Beall and Rio, 1997, 1998). В следующей части работы выяснялось, какое влияние на частоту вырезаний Р-элемента может оказывать присутствие в составе /Мранспозона одной или двух копий инсулятора Su(Hw).

В первой серии экспериментов были использованы описанные ранее трансгенные линии, несущие /'-транспозоны, содержащие маркерные гены yellow и white или только ген white (Рис. 24). Вырезания /'-элемента были активированы в трех линиях ESY, в четырех линиях ES(-

Рис. 22 Схематичные изображения возможных взаимодействий между элементами, регулирующими транскрипцию, основанные на литературных данных и результатах представленной работы. En, Рг и Ins обозначают нуклеопротеиновые комплексы энхансера, промотора и инсулятора соответственно. Толстая стрелка обозначает, что промотор стимулируется энхансером и обеспечивает транскрипцию. Тонкая перечеркнутая стрелка обозначает отсутствие стимуляции (блокирование взаимодействий между энхансером и промотором).

A) Базовая модель. Отдельный инсулятор между энхансером и промотором полностью блокирует взаимодействие между ними по механизму «ловушки». Б) Еще одна базовая модель, при осуществлении которой парные взаимодействующие инеуляторы между энхансером и промотором не препятствуют энхансер-промоторной коммуникации. Инсуляция частично преодолевается.

B) Спаривание двух инсуляторов вокруг энхансера замыкает его в петлю и топологически изолирует от промотора. Г) Взаимодействие находящихся на большом расстоянии друг от друга инсуляторов, окружающих энхансер, позволяет энхансерам достаточно свободно взаимодействовать с находящимся вне петли промотором.

Ins Pi

893)YS и в двух WS линиях, где транспозон был встроен в X хромосому. В результате в 7 трансгенных линиях, несущих в составе транспозона гены yellow и white, частота транспозиций Я-элемента с X хромосомы на аутосомы варьировала в промежутке 0,8-1,3 %. Две трансгенные линии WS, содержащие в составе транспозона только последовательность гена white, так же демонстрировали низкую частоту транспозиций — от 0,05 до 0,4 %.

Рис. 23 Схематичное изображение конструкций, использованных для тестирования частоты транспозиций /'-элемента. En-w и Еп-Ь обозначают энхансеры крыльев и тела соответственно. Треугольниками обозначены lox сайты. Остальные обозначения, как на предыдущих рисунках.

Поскольку белок

Mod(mdg4)67.2 является важным компонентом

инсулятора Su(Hw), частота транспозиций в трансгенных линиях была протестирована на фоне мутации mod(mdg4)"', делающей белок Mod(mdg4)-67.2 не функциональным. На фоне мутации mod(mdg4)"' частота транспозиций возрастала в 3-7 раз в большинстве трансгенных линий. Полученные результаты свидетельствуют, что присутствие в составе транспозона одной или двух копий Su(Hw) снижает частоту транспозиций, тогда как инактивация компонента 8и(Н\у)-зависимого инсуляторного комплекса, белка Mod(mdg4)-67.2, снова их активирует.

Чтобы выявить другие компоненты, кроме Mod(mdg4)-67.2, которые могут требоваться для блокирования транспозиций /'-элемента, была протестирована частота вырезаний транспозона в одном и том же месте генома в линиях E(S)YW, EY(S)W и в их производных, полученных при вырезании Su(Hw), в присутствии и в отсутствии (мутация mod(mdg4)ul) белка Mod(mdg4)-67.2 (Рис. 23). Вырезания Su(Hw) инсулятора существенно увеличивали частоту транспозиций только в присутствии Mod(mdg4)-67.2. Сравнимая частота транспозиций /"-элемента на фоне мутации mod(mdg4)"' и после вырезания Su(Hw) инсулятора позволяет предположить, что именно Mod(mdg4)-67.2 необходим для супрессии /"-транспозиций.

В начале данной серии экспериментов было показано, что встраивание одной или двух копий Su(Hw) в /"-транспозон одинаково влияло на частоту транспозиций. Т.к. спаривание между двумя инсуляторами нейтрализует их энхансер-блокирующую активность ( Gause el al.,

En-w En-to W(Hw)

СЩ—■—

yellow

En-wEn-b *u(Hw)

►-Ш ■

yellow

►-co-

yellow

En-w En-to $u{Hw)

КГЫ-

yellow

-i ESY

-A ES(-893)ES

-i WS

E(S)YW

-i EY(S)W -< (S)WS

-i ESY(S)W

1998; Cai and Shen, 2001; Muravyova et al, 2001; Melnikova et al., 2002; Kuhn et al., 2003), можно представить, что отсутствие существенной разницы в частоте транспозиций транспозонов с одним или с двумя Su(Hw) инсуляторами связано с локализацией ESY и ES(-893)YS в разных районах X хромосомы.

Чтобы ответить на вопрос: может ли спаривание Su(Hw) инсуляторов подавлять репрессию Р-транспозиций, один из инсуляторов Su(Hw) в конструкциях (S)WS и ESY(S)W был окружен /од: сайтами (Рис.23). Две линии (S)WS и три линии ESY(S)W были протестированы до и после вырезания Su(Hw) инсулятора. Только в одной линии (S)WS частота транспозиций существенно снижалась после вырезания Su(Hw). В четырех других трансгенных линиях частота транспозиций была приблизительно одинаковой в присутствии одной или двух копий Su(Hw) инсулятора (подробнее см. текст диссертации). Как и в предыдущих экспериментах, частота транспозиций существенно повышалась на фоне мутации mod(mdg4)"', подтверждая, что инсулятор Su(Hw) отвечает за репрессию транспозиций во всех протестированных трансгенных линиях. Таким образом, взаимодействие между двумя Su(Hw) инсуляторами, помещенными между концами /"-элемента не оказывает ощутимого воздействия на частоту его транспозиций.

Полученные результаты показывают, что инсулятор Su(Hw) влияет на транспозиции Р-элемента в половых клетках. Весьма вероятно, что Su(Hw) инсулятор мешает взаимодействию между белковыми комплексами, связывающимися с концами Р-транспозона.

2.4 Изучение функционального взаимодействия между GAGA-содержащими участками из промоторных районов генов теплового шока hsp26 и hsp70 в модельной системе гена white у Drosophila melanogaster.

У дрозофилы сайты связывания для GAGA фактора (GAF), который получил название благодаря способности связываться с GAGAG последовательностью, были найдены рядом с промоторами многих генов, в частности, в промоторной области генов теплового шока hsp26 и hsp70 (Lu et al., 1993; Lee et al., 1992). Экспериментальные данные, полученные в гетерологичных модельных системах, показали, что GAF может играть роль как в активации транскрипции, так и в энхансер-промоторном взаимодействии. В культуре клеток человека было показано, что GAF может усиливать взаимодействие между энхансером и дистанцированным промотором, причем эти регуляторные элементы могут находиться как в положении in cis, так и в положении in trans (Mahmoudi et al., 2002). В дрожжах взаимодействие между GAF белками может обеспечивать дистанционную активацию промоторов активатором GAL4, который обычно работает только если расположен рядом с промотором (Petrascheck et al., 2005). Однако способность GAGA белков под держивать дистанционные взаимодействия в целостном живом организме до сих пор не была изучена.

Для исследования дистанционных взаимодействий между GAF сайтами была использована модельная система, которая основана на неспособности дрожжевого активатора GAL4 активировать промотор гена white, когда между GAL4 сайтами и промотором находится ген yellow (Kyrchanova et al., 2008). Фрагменты ДНК, связывающие GAF были взяты из промотора гена hsp26 (163 п.н., 6 GAGA сайтов) и промотора гена hsp70 (72 п.н., 5 GAGA сайтов). С этими участками ДНК GAF эффективно связывается во всех клетках дрозофилы (Lu et al., 1993; Lee el al., 1992).

В конструкции G(hsp26)Y(hsp26)W (Рис.24) один из фрагментов hsp26, был помещен рядом с 10 сайтами связывания дрожжевого активатора GAL4 в положение -893 п.н. относительно промотора гена yellow. Другой фрагмент hsp26 был встроен в 3' конец гена yellow перед промотором гена white. Было получено 15 трансгенных линий. В отстутствии GAL4 активации, окраска глаз у дрозофил варьировала от светло-желтой до темно-желтой, что соответствует базовой активации гена white. Вырезание фрагментов hsp26 не влияло на окраску глаз дрозофил в производных линиях (Рис. 25). G(hsp26)Y(hsp26)W

hsp26 hsp26 Рис. 24 Схематичное изображение использованных в

kJ-1 um г и"» 5J.nH- I Ulll 1 mm * .\j Работе конструкций. Обозначения: направление

►jGAMnrjfflrrli " 4 ЦЩ |~и 'I* транскрипции генов yellow, white и lacZ указано

" ' стрелками внутри соответствующих прямоугольников; у

- промотор гена yellow, w - промотор гена white,y-reg -G(hsp7fl)Y(hsp70)W регуляторная область гена yellow, содержащая промотор

hsp70 5 тпн hsp70 и энхансеры тела и крыльев этого гена; hsp26 или 70 -

■ ГГТГПГ UUIIIÜI ~гч Т".".-Til ЦШЦШ 3 рч -.l¡,: " -., минимальная активирующая последовательность из

диды^. flfllUlfl (mL¿-IS тН'пП у""——-~ промотора гена теплового шока. Белые вертикальные

стрелки обозначают сайты связывания для FIp П/ь 7(L iVíb 7п_ \w рекомбиназы, серые - для Сте рекомбиназы. Серый

' P'ü~mJ4n Р ' прямоугольник обозначает 10 сайтов связывания белка

hsp70-mut hsp70-mut GAL4. Сайты связывания белка GAF обозначены

Mr-Г< чеРными овалами. Серые овалы в составе конструкции

Jtaí®^:_^ G(hsp70-mut)Y(hsp70-mut), обозначенные буквой ш-

' ■ " * mm новые GAGA сайты, появившиеся в результате

G(hsp70)Y(bsp70)lacZ hsp70 7 тпн bsp70

мутирования фрагмента hsp70 с помощью ПЦР.

Для активации GAL4 проводили скрещивание У """""• ' трансгенной линии с линией,

экспрессирующей GAL4 под контролем тубулинового промотора. GAL-активация не меняла пигментацию глаз в большинстве трансгенных линий (Рис.25) . Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что в нативной модельной системе GAF не способен поддерживать дистанционные взаимодействия между регуляторными элементами, которые находятся на расстоянии 5 т.п.н. друг от друга.

В следующих экспериментах мы использовали фрагмент из промотора гена hsp70 (Рис. 24). Для увеличения количества сайтов связывания GAF этот фрагмент был дуплицирован.

окраска глаз

. и. ф. +GAL4 и. ф. +GAL4 и. ф. +GAL4

красный

коричнево-красный а

коричневый

темно-оранжевый а в @

оранжевый а а а a а 1 _!

темно-желтый :в а и 1 а в В в ~6 6

желтый .0 т 10 а в в @ а 10 10

светло-желтый .а а а 3 а а В в 4 4

белый

G<!isp26)Y(hsp2«)W G<hsp70)Y(hsp70)W G(hsp70-m)Y(hsp70-m)W

Рис. 25 Экспрессия гена и'/п/е в исследованных трансгенных линиях.

Обозначения: и.ф. - исходный фенотип; +вАЬ4 - фенотип после активации САГА По оси ординат указана степень пигментации глаз, по оси абсцисс - названия трансгенных линий. В квадратах указано количество линий, имевших данную окраску глаз.

В конструкции G(hsp70)Y(hsp70)W, как и в предшествущем эксперименте, в 14 полученных трансгенных линиях окраска глаз у дрозофил соответствовала базовому уровню экспрессии гена white. Однако после активации GAL4, во всех исходных линиях наблюдалось заметное увеличение пигментации глаз, что свидетельствует о способности GAL4 активировать экспрессию white (Рис. 25). Для выяснения роли GAGA-содержащих фрагментов в стимуляции экспрессии white, были получены производные 6 трансгенных линий с желтым цветом глаз, в которых были удалены оба hsp70 фрагмента. После удаления hsp70 фрагментов пигментация глаз не менялась, следовательно, GAF не являлся активатором транскрипции. В производных линиях GAL4 не индуцировал транскрипцию гена white. Таким образом, стимуляция дистанцированного промотора гена white активатором GAL4 обеспечивается при помощи взаимодействия между hsp70 фрагментами.

Полученные результаты позволяют предположить, что в исследуемом фрагменте hsp70 присутствуют сайты связывания для не идентифицированного в настоящее время белка, который может под держивать дистанционные взаимодействия. Действительно, между сайтами связывания GAF находятся последовательности, на которые могут рекрутироваться транскрипционные факторы. Для проверки выдвинутого предположения в конструкции G(hsp70-m)Y(hsp70-m)W (Рис.24) мы мутировали часть последовательностей, расположенных между сайтами связывания GAF в составе фрагмента hsp70. Цвет глаз у дрозофил в полученных трансгенных линиях и в производных линиях с вырезанными последовательностями hsp70-mut, как и в предыдущих экспериментах, варьировал от светло-желтого до светло-оранжевого. После активации GAL4 ни в одной из тестируемых линий интенсивность окраски глаз не изменилась, т.е. ген white не был активирован (Рис.25). Таким образом, дистанционное взаимодействие между hsp70 фрагментами поддерживается неизвестным транскрипционным фактором. Сайты связывания GAF в составе последовательности из промотора гена hsp70, так же как и в составе последовательности из промотора гена hsp26, не поддерживают

функциональное взаимодействие между находящимися на расстоянии регуляторными элементами.

Кроме того, мы использовали модельную систему, которая позволяла выявить взаимодействие между GAF-связывающими последовательностями с помощью измерения уровня экспрессии гена lacZ в совокупности клеток дрозофилы (Scott et al., 1999). Были получены 8 трансгенных линий, несущих конструкцию G(hsp70)Y(hsp70)lacZ (Рис.24) и их производные с вырезанными hsp70. При измерении активности ß-гадактозидазы (продукта гена lacZ ) было установлено, что уровень экспрессии гена lacZ не зависит от присутствия в конструкции Ь5р70-фрагментов. После активации GAL4 активность ß-галактозидазы не увеличивалась как в исходных, так и в производных линиях, что еще раз свидетельствует об отсутствии взаимодействия между сайтами связывания GAF в нативной модельной системе.

Суммируя все полученные результаты можно утверждать, что способность GAF обеспечивать коммуникацию между регуляторными элементами, расположенными на большом расстоянии друг от друга, наблюдается только в гетерологичных модельных системах. Можно предположить, что в дрозофиле GAF взаимодействует с белками-партнерами, которые блокируют его способность к стягиванию удаленных участков генома. В клетках млекопитающих или дрожжах GAF не имеет подобных белков-партнеров, что облегчает его участие в дистанционных взаимодействиях.

2.5 Взаимодействие между GAGA фактором и белком Mod(mdg4) позволяет преодолеть инсуляцию у Drosophila melanogaster.

В первую очередь, с помощью коиммунопреципитации из ядерного экстракта, выделенного из клеточной линии дрозофилы SL-2, было выяснено, как GAF и белок Mod(mdg4) взаимодействуют в системе in vivo. Результаты, приведенные на Рис. 26 показывают, что изоформы Mod(mdg4) иммунопреципитируются с aHra-Mod(mdg4) сывороткой и коиммунопреципитируются с анти-GAF сывороткой, но не с анти-Polyhomeotic или преиммунной сывороткой. Эти результаты свидетельствовали, что GAF и Mod(mdg4) могут присутствовать в одном комплексе in vivo и затем были подтверждены в обратном эксперименте: aHTH-Mod(mdg4) сыворотка коиммунопреципитировалась со всеми изоформами GAF (Рис.26). Ранее было показано присутствие белковой изоформы Mod(mdg4)-67.2 во фракции ядерного матрикса, которая опредеялась экспериментально по устойчивости к экстракции 2М NaCl (Byrd and Corees, 2003). Было решено выяснить, присутствует ли GAF в той же самой фракции, что и Mod(mdg4). Рис. 26 показывает, что большее количество фракции GAF устойчиво к экстракции 2М NaCl и присутствует в финальной фракции, как и положительный контроль — ламин (Byrd and Corees, 2003). То же самое еще более выражено для изоформ белка Mod(mdg4), которые сильно сконцентрированы во фракции ламина.

V/ ¿ //v V/v л* /v

HUI i

Mod(mdg4)

GAF

шш -

Mod(mdg4)

ill

umn UM

Рис. 26 GAF и Mod(mdg4) коиммунопреципитируются и присутствуют в ядерном матриксе. А и Б) Эксперименты по коиммунопреципитадии. Сыворотка, использованная в работе, указана над соответствующими колонками. PI - преиммунная сыворотка. Вестерн-блот был сгибридизован с анти-Mod(mdg4) сывороткой (А) и с анти- GAF сывороткой (Б). В) Анализ ядерного матрикса. Разные фракции, соответствующие шагам экстракции ядерного матрикса, указаны согласно оригинальному протоколу (Fisher et а!., 1983): N - ядра; DN - ядра, обработанные ДНКазоМ и РНКазой A; NS - нуклеазный супернатант (надосадочная жидкость); TXS - супернатант после обработки реагентом Triton Х-100; SS1 - супернатант первой соли; SS2 - супернатант второй соли; DSNF-I - Drosophila субъядерная фракция I, содержащая ядерный ламин, поровый комплекс и ядерный матрикс. Указаны антитела к белкам GAF, Mod(mdg4), ламину и Ubx, использованные для гибридизации различных фракций.

И напротив, транскрипционный фактор Ubx высвобождается из хроматина вследствие проведенных процедур. Все полученные результаты наглядно показывают, что GAF и Mod(mdg4) взаимодействуют друг с другом и с компонентом ядерного ламина in vivo.

Чтобы выяснить, является ли взаимодействие между GAF и Mod(mdg4) прямым, было изучено их взаимодействие в условиях in vitro (Рис.27). Для этого эксперимента использовались преобладающая изоформа GAF, GAF-519 (Soeller el al., 1993), и изоформа Mod(mdg4)-67.2, которая является не только преобладающей изоформой белка Mod(mdg4), но и взаимодействуя с белком Su(Hw), отвечает за энхансер-блокирующую активность Su(Hw)

инсулятора (Gause et al., 2001; Ghosh et al., 2001).

Рис. 27 GAF и Mod(mdg4) напрямую взаимодействуют in vitro и в дрожжевой двугибридной системе. Указаны соответствующие домены белков. А) Взаимодействие между меченым гистидином GAF и транслированным in vitro Mod(mdg4)-67.2. Люцифераза является негативным контролем. Б) Результаты эксперимента GST pulldown с использованием Mod(mdg4)-67.2 меченого GST, ВТВ домена Mod(mdg4) и GST в качестве негативного контроля. Различные производные GAF были получены с помощью in vitro трансляции. В) Дрожжевая двугибридная система. -, +, + + и + + + обозначают отсутствие, слабое, среднее и сильное взаимодействие соответственно.

Motí(m<}g4}<i7 2

В GAF (1-518 WW.«* (1-413 аа)

Mod(rndg4}-67.2 (1-609 аа)

Моа(гтмд4Ц8Тв (107-6!» еа) - -

МофидДОТВЛО-кИ (234-605 аа) - -

Modi/iKtj4f'-"«-» (1-119GAF/10?-€ö9Mod)

Было установлено, что

экспрессировавшийся в бактериях ОАР способен напрямую взаимодействовать с

транслированным in vitro Mod(mdg4) (Рис.27). Для определения участвующих во взаимодействии доменов, полноразмерный белок Mod(mdg4)-67.2 был проэкспрессирован в общей рамке с GST и использовались различные домены GAF , транслированные in vitro (Рис.27). Было выявлено сильное взаимодействие белка GST-Mod(mdg4) с GAF. Это взаимодействие слегка ослабевало при удалении С-концевого глютамин-богатого (Q-rich) домена GAF и значительно ослабевало при удалении ВТВ домена. При одновременном удалении глютамин-богатого домена и домена ВТВ взаимодействие не наблюдалось. Одиночный ВТВ домен GAF был способен взаимодействовать с Mod(mdg4).

Полученные результаты показывают, что и ВТВ домен, и глютамин-богатый домен GAF необходимы для взаимодействия с Mod(mdg4). Выявленные взаимодействия были подтверждены результатами экспериментов в дрожжевой двугибридной системе (Рис.27).

Как упоминалось выше, встраивание второго Su(Hw) инсулятора между энхансером и промотором восстанавливает энхансер-промоторную коммуникацию (Muravyova et al., 2001; Cai et al., 2001). Следующей задачей являлась идентификация других последовательностей, способствующих нейтрализации Su(Hw) зависимой инсуляции. На основании данных о взаимодействии между GAF-519 и Mod(mdg4)-67.2 было выдвинуто предположение, что сайты связывания GAF могут содержать такую последовательность.

Для проверки этого предположения была использована модельная система, включающая ген miniwhite, отвечающий за пигментацию глаз дрозофилы, в качестве репортерного гена, и его специфический энхансер (Ее). Ранее было показано, что одна копия Su(Hw) инсулятора эффективно блокирует коммуникацию между Ее и miniwhite (Roseman et al., 1993). Этот результат подтверждался в линиях, несущих трансген (Ee)Y(S)W, который содержал энхансер Ее, отделенный от miniwhite (W) маркерным геном yellow (Y) и Su(Hw) инсулятором (S) (Рис.28). Было получено 11 независимых трансгенных линий, в которых окраска глаз у мух варьировала от светло-желтой до коричневой. Вырезание Su(Hw) инсулятора увеличивало экспрессию miniwhite во всех трансгенных линиях, доказывая, что инсулятор действительно блокирует Ее энхансер. Инсулятор Su(Hw) проявлял сильную блокирующую активность, т.к. вырезания Ее из трансгенов не приводили к ослаблению пигментации глаз, если инсулятор не был вырезан из конструкции и, наоборот, в отсутствии инсулятора, значительно снижали экспрессию miniwhite.

Затем были изучены последствия встраивания между Ее и Su(Hw) сайтов связывания GAF. Сайты связывания GAF были получены путем дупликации фрагмента из промотора гена hsp70, включающего 4 сайта, связывающих GAF in vivo (O'Brien et al., 1995; Tsukiyama et al., 1994). Для этого был создан трансген Ee(G)Y(S)W (Рис.28). Были получены 12 независимых

трансгенных линий и их производные с вырезанными сайтами связывания САБ, с вырезанным инсулятором 8и(Н\¥) и с вырезаниями обоих элементов.

Su(Hw)

p-Y Y d-Y Or d-Or Br Br-R R

<Ee)Y(S)W 1 2 3 2 2 1|

*Y(S)W ji 2 ......3.......2........2;

►(Ee)YW

Рис. 28 Сайты связывания GAF нейтрализуют активность инсулятора Su(Hw). На каждой панели представлены схемы трансгенов. Трансгенные линии распределены в соответствии с окраской глаз у мух. Экспрессии miniwhite на уровне дикого типа соответствует ярко-красная пигментация глаз (R), отсутствие экспрессии - белые глаза (W). Промежуточные уровни пигментации по мере возрастания экспрессии: p-Y - светло-желтый; Y -желтый; Or - оранжевый; dOr -темно-оранжевый; Вг - коричневый; Br -R-красно-коричневый. В каждой категории указано число линий. Результат анализа экспрессии miniwhite на фоне дикого типа, гетерозиготной мутации Trf85 и гомозиготной мутации mod(mdg4) обозначен как +, Tri и Mod соответственно. Число линий, в которых пигментация глаз у мух изменилась после вырезания какого-либо элемента или на мутантном фоне приведено в сравнении с общим числом линий (9/12, 0/12 и.т.д.). А) Структура трансгена (Ee)Y(S)W. Стрелки окружают вырезаемый элемент. Отображены полученные фенотипы глаз. Б) Структура трансгена Ee(G)Y(S)W и фенотипы глаз в трансгеных линиях и в их производных. В) Структура трансгена (Ee)(G)YW и фенотипы глаз в трансгеных линиях и в их производных.

Для каждой линии экспрессия miniwhite

тестировалась на фоне дикого типа и на фоне мутаций mod(mdg4)u' или mod(mdg4)T6. Мутация Trfs5 возникла как следствие делеции части гена Tri и считается ноль-аллелем (Farkas et al., 1994). Окраска глаз у мух в линиях Ee(G)Y(S)W варьировала от оранжевой до красной, что значительно темнее, чем в экспериментах с линиями (Ee)Y(S)W. Такой результат позволял предположить, что сайты связывания GAF нейтрализуют энхансер-блокирующую активность инсулятора Su(Hw). Действительно, вырезание сайтов связывания GAF приводило к значительному ослаблению экспрессии miniwhite, указывая, что это вырезание восстанавливает способность Su(Hw) инсулятора блокировать взаимодействие между энхансером и промотором miniwhite.

<рй frt frtlox

\\\Щ

lox

p-Y Y d-Y Or d-Ог Br Br-R R

(Ee)(G)YW fl' 2 2 3 4 2l 14

—►(Ee)YW It 2 2 4 .3 2 1/14

На фоне мутации mod(mdg4) экспрессия miniwhite возросла в 9 из 12 EeY(S)W линий, демонстрируя, что Su(Hw) инсулятор блокирует взаимодействие между энхансером Ее и промотором miniwhite за счет действия белка Mod(radg4). Интересно, что как на фоне мутации mod(mdg4), так и на фоне мутации Tri"83 в большинстве линий Ee(G)Y(S)W глаза у мух становились светлее (в10из12ив9из12 соответственно). Это доказывает, что оба белка, GAF и Mod(mdg4), вовлечены в преодоление Su(Hw)-3aBncnMoii инсуляции. Вырезание из конструкции инсулятора или сайтов связывания GAF делало линии не чувствительными к мутациям Tri или mod(mdg4) (Рис.28).

Можно предположить, что сайты связывания GAF стимулируют транскрипцию miniwhite по механизму, который не полностью блокируется Su(Hw) инсулятором. Для проверки такой возможности был создан трансген (Ee)(G)YW (Рис.28). Окраска глаз у мух тестировалась в 14 независимо полученных линиях. Было установлено, что вырезание сайтов связывания GAF не оказывает существенного влияния на окраску глаз, независимо от присутствия или отсутствия Ее в составе трансгена. Полученный результат демонстрирует, что простое присутствие сайтов связывания GAF в составе трансгена не стимулирует экспрессию miniwhite. Более того, сами по себе сайты связывания GAF не обладают энхансер-блокирующей активностью, т.к. их вырезание не приводит к возрастанию уровня экспрессии miniwhite.

Суммируя все представленные выше результаты, можно сделать вывод, что встраивание GAF-связывающих сайтов между энхансерами Ее и Su(Hw) инсулятором позволяет преодолевать энхансер-блокирующую активность инсулятора и восстанавливает коммуникацию между Ее и геном miniwhite.

2.6 Белок Zeste может способствовать дистанционным взаимодействиям между энхансером и промотором и преодолению инсуляции у Drosophila melanogaster.

Одним из транскрипционных факторов, который, как предполагалось, играет роль в дистанционных взаимодействиях, является белок Zeste (Qian et al., 1992; Laney and Biggin, 1997; Dorsett, 1999). Ранее считалось, что связываясь со множественными сайтами и образуя компактную пространственную структуру, Zeste может сближать энхансер и промотор гена, выпетливая наружу расположенную между ними ДНК (Pirrotta, 1991; Qian et al., 1992; Laney and Biggin, 1997). Однако это предположение не было доказано. Экспериментальные данные показали, что белок Zeste может быть необходим для стимуляции экспрессии генов, содержащих Zeste-сайты (Hur et al., 2002; Dejardin and Cavalli, 2004; Kal et al., 2000; Dejardin and Cavalli,2004; Pirrotta, 1999). Тем не менее, в одной из наших предыдущих работ было показано, что мутации в локусе zeste влияют на экспрессию некоторых мутантных cut аллелей и, возможно, Zeste участвует в организации дистанционных взаимодействий, влияющих на транскрипцию локуса cut (Melnikova et al., 1993).

Чтобы выяснить, действительно ли белок Zeste способствует взаимодействию между энхансерами и специфичными промоторами, расположенными на дальних расстояниях, мы использовали модельную систему, основой которой является регуляторная область гена white. Экспрессия white в глазах регулируется единственным энхансером, который расположен на расстоянии около 1.1 т.п.н. от промотора гена и содержит пять сайтов связывания для белка Zeste. Два сайта связывания были обнаружены в предпромоторной области гена white в положении от -120 до -140 п.н. относительно сайта начала транскрипции.

Рис. 29 Исследование роли Zeste в стимуляции white, когда энхансер глаз расположен рядом с промотором. Упрошенные схемы трансгенных конструкций и результаты анализа экспрессии white в трансгенных линиях. Ген white (W) изображен как стрелка, показывающая направление транскрипции. Энхансер глаз (Ее) изображен как белый овал с вертикальными полосками, обозначающими Zeste-связывающие сайты. Стрелками, направленными вниз, обозначены сайты узнавания для рекомбиназы Сге (iox)\ те же сайты в названии конструкции обозначены скобками. Колонка «white» показывает число трансгенных линий с различными уровнями пигментации глаз. Экспрессия white обозначена как на предыдущих рисунках. N - число линий, в которых мухи приобрели новый фенотип после вырезания (Д) элемента конструкции. Т - итоговое число линий, протестированных для каждой конкретной конструкции. Стрелки рядом с колонкой N/T показывают последовательность, в которой величины были подсчитаны.

В первую очередь, мы проверили нужен ли белок Zeste для активации гена white, когда энхансер глаз находится рядом с промотором. Была создана генетическая конструкция (Ee)W (Рис.29) и получено 16 трансгенных линий, в которых окраска глаз у мух была близка к дикому типу, т.е. энхансер глаз эффективно стимулировал транскрипцию гена white. Когда в линии ввели мутацию z71h , приводящую к полной инактивации белка Zeste, окраска глаз у мух не изменилась. Следовательно, белок Zeste не является необходимым для активации энхансера глаз. Инактивация Zeste так же не влияла на пигментацию глаз в линиях с вырезанным энхансером (AEe)W. Это означает, что белок Zeste не существенен для стимуляции промотора гена white в отсутствии энхансера глаз. В следующей конструкции (Ee)AzW (Рис.29) мы удалили Zeste-связывающие сайты из предпромоторной области гена white. Несмотря на это, мухи в трансгенных линиях имели окраску глаз практически дикого типа. Это означает, что сайты Zeste в предпромоторной области не нужны для стимуляции white в глазах как таковой.

Ее

42S Ьр

R Вг-R Br dOr Of dY Y pY W N/T (Ee)W [¡s] 16

г™ [Те] 0/16 A

ЛЕв I 6 101 16/16^

Гб ïôl o/i 6 J

JE«!"11

white

fit m

R Вг-R Br dOr Or dY Y pY W N/T

(Ee)AzW и 20 -|

Z"™ [Ц 0/20 A

дЕе I 3 17 I 20/20^

дЕе+Z»™ I 3 17 I 0/20

Мутация z77h, так же как и в предыдущей конструкции, не влияла на окраску глаз ни до, ни после удаления энхансера. Полученные данные подтверждают, что белок Zeste, не участвует в активации транскрипции гена white и не нужен для нормального функционирования его энхансера или промотора.

Далее было решено выяснить, нужен ли белок Zeste для поддержания дистанционных взаимодействий между энхансером и промотором. В следующей конструкции, (Ee)S3000W, расстояние между энхансером и промотором было увеличено до 3000 т.п.н. В конструкции (Ee)S3000W фрагмент ДНК фага X был встроен между промотором гена white и окруженным сайтами frt энхансером глаз (Рис.30). В этом случае энхансер глаз эффективно стимулировал ген white, т.к. в исходных линиях окраска глаз у мух была близка к дикому типу, а при вырезании энхансера значительно снижалась. Инактивация Zeste с помощью мутации zv77h приводила к ослаблению окраски глаз более чем в половине трансгенных линий.

Ее

white

- г-» .

Рис. 30 Исследование роли Zeste в

«so ьр стимуляции white, когда дистанция м ежду

энхансером и промотором составляла более 3 т.п.н. Трансген (Ee)SW и результаты анализа экспрессии white в трансгенных линиях и их (Ee)SW 124 3 I 27 -| производных на фоне дикого типа и на фоне

frt frt

R Br-R Br dOr Or dY Y pY W NTT

Z'm 115 -I 5 3 1 12/27

.2/27 M im*

AEe [ 3 22 2 1 27/27'

iEe*z"m I 3 22 21 am' Однако, в большинстве линий

снижение окраски глаз после удаления энхансера было сильнее, чем у мутантов z'77h , следовательно, энхансер продолжал активировать промотор white в отсутствии белка Zeste. Также было показано, что мутация z77h не влияла на экспрессию white в линиях (Ee)S3000W с вырезанным энхансером. Эти результаты позволяют говорить, что при увеличении расстояния между энхансером и промотором, белок Zeste становится нужным для энхансер-промоторного взаимодействия, но по-прежнему не требуется для базовой активности промотора.

В следующей серии экспериментов с помощью гена yellow мы увеличили расстояние между энхансером и промотором гена white до 6500 п.н. В конструкции (Ee)YW (Рис. 31 А) мухи имели коричнево-красную окраску глаз, что в среднем слабее, чем в трансгенных линиях, где дистанция между энхансером глаз и промотором была короче. В большинстве линий удаление энхансера глаз вызывало ослабление окраски в той же степени, что и мутация z77h. Также, мутация г"77Л не меняла пигментацию глаз в линиях с вырезанным энхансером. Таким образом, наличие белка Zeste является критичным для осуществления взаимодействия на дальних расстояниях между энхансером глаз и промотором гена white. Для выяснения, значимости Zeste-связывающих сайтов в промоторной области, мы удалили их из конструкции

(Ee)YAzW (Рис. 31 Б), т.е. белок Zeste мог связываться с последовательностью энхансера, но не с предпромоторной областью гена. В исходных трансгенных линиях и в линиях с вырезанным энхансером окраска глаз была практически одинаковой, следовательно, в данной конструкции энхансер глаз не был активен.

tri nt

К Bf-R Вг dOr Or dY Y pY W N/T

(Ee)YW ¿Ев

1 3 i 19 10 3|

1 6 21 10 3

1 « 21 10 3

41 . 38/41 -41/41-W41-"

Рис. 31 Исследование роли Zeste в стимуляции white, когда ген yellow встроен между энхансером глаз и промотором. A) (Ee)YW и Б) (Ee)YAzW трансгены и результаты анализа экспрессии white в трансгенных линиях и в их производных с вырезанным энхансером глаз на фоне дикого типа и на фоне мутации zv77\ Остальные обозначения как на Рис.29.

fit и

R Вг-ft Вг dOr Of dY Y pY W N/T

(Ee)YAzW

ЛЕв+Г77"

17 . 0/17 -

3 4 9 1

Мутация zv не влияла на пигментацию глаз ни в исходных линиях, ни в линиях с вырезанным энхансером. Таким образом, наличие Zeste-связывающих сайтов в промоторной области гена white необходимо для осуществления взаимодействия на дальних расстояниях между энхансером глаз и промотором white.

На следующем этапе работы мы выяснили, может ли белок Zeste способствовать активации транскрипции гена white энхансером глаз через инсулятор. Была создана конструкция (Ee)S50°(Gy)W, в которой энхансер, окруженный frt сайтами, был отделен от gypsy инсулятора последовательностью размером 500 п.н. (Рис. 32).

Ее

white Г-»

> (iv, lox lox

(EelS^GyJW

2*7711

л£е лЕе+г"7" sGy

AGy+z»7™ iGy+\Ee

R Вг-R Br dOf Or dY Y pY W N/T 12 2 I 2 4l Ш

(EeJS^IGylW su(Hw)~ |з~

2 3 4 2

1 2 3 4 21

su(Hw)-*rm jî_{J

12 12/12 ' 12/12 ' 0/12-3

Г ИЧ^

1/12 J 12/12

0/4-

Рис. 32 Исследование роли Zeste в коммуникации между энхансером глаз и white промотором через gypsy инсулятор. Обозначения как на Рис. 29.

В большинстве трансгенных линий наблюдался высокий уровень пигментации глаз, который уменьшался при вырезании энхансера. Таким образом, энхансер глаз способен активировать white, минуя gypsy инсулятор. Однако после вырезания инсулятора пигментация глаз становилась слабее. Это значит, что инсулятор все же способен частично блокировать активность энхансера глаз. Также, на фоне мутации

su(Hw)' была протестирована пигментация глаз в четырех линиях (Ee)S500(Gy)W, где трансген встроился во вторую хромосому. Инактивация белка Su(Hw) восстанавливала окраску глаз до того же уровня, что и удаление gypsy инсулятора. Мутация zllh снижала окраску глаз в линиях (Ee)S500(Gy)W до той же степени, что и удаление энхансера глаз. В то же время, инактивация Zeste не влияла на окраску глаз ни в производных линиях с вырезанным gypsy инсулятором, ни в линиях с инактивированным белком Su(Hw). Таким образом, белок Zeste способен преодолевать энхансер-блокирующую активность gypsy инсулятора.

Для дальнейшего изучения роли Zeste в преодолении негативного влияния инсулятора, использовался укороченный gypsy инсулятор, содержащий пять (с 8 по 12) Su(Hw)-

связывающих сайтов (GyA).

Рис. 33 Исследование роли Zeste в активации white энхансером глаз через укороченный gypsy инсулятор А) в присутствии или Б) в отсутствии сайтов связывания Zeste в промоторной области гена white. Обозначения как на Рис. 29.

Ранее было показано, что эта укороченная версия инсулятора имеет более слабую энхансер-блокирующую активность, по сравнению с полным инсулятором. В 11 линиях (Ee)(Gyi)W окраска глаз у мух варьировала от коричневой до красно-коричневой, что говорит об активации промотора white энхансером глаз через инсулятор Gy4. Вырезание инсулятора приводило к незначительному уменьшению

пигментации глаз в 6 из 11 линий, что означает наличие слабой энхансер-блокирующей активности инсулятора GyA. Введение мутации z71h снижало окраску глаз в линиях (Ee)(GyA)W в той же степени, что и удаление энхансера (Рис.ЗЗА). Когда инсулятор GyA или энхансер глаз были вырезаны, активация экспрессии white энхансером становилась зависимой от Zeste. Суммируя полученные результаты, можно сказать, что белок Zeste необходим для преодоления энхансером негативного влияния как полноценного, так и слабого инсулятора.

— wnrce

«тДз» ж" г-» .

ЮХ IOX

R Br-R Br dOr Or dY Y pY W N/T (EeJfGy^W 15 4 21 и -.

z"7» ш I» Я 11/11 -

•1С« Il 8 2] 11/11'

¿Ee+Z"™ _ Il 8 2| 0/11^

■iG/1 110 il .- 6/11

¿Gyl*Z*77h 11» il 0/11

iGy>+±Eo 11 g fi ^11/11

AGyi*SEa*zvT7h 11 8 fi 0/11-^

¿ftp

R Вг-R Br dOr Or dY Y

(EeKGy^AzW I 5 4 14 I 23

глп I 5 4 14 I 0/23 -

\Ee 15 4 14 I 0/23 ^

AEe+zv77" D

и 1 11/iJ ~

14 I 0/23*

JGr> [22_lj _ 23/23 '

AG/4-z"7" |22 1 I 0/23*

¿Gy^tlEe I 5 4 14 I ^-23/23,

àGy'+JiEe*!'771' I 5 4 14~l 0/23

Чтобы продемонстрировать роль Zeste-связывающих сайтов из промоторной области в преодолении негативного влияния инсулятора, эти сайты удалили из конструкции (Ee)(Gy^)AzW. В 23 трансгенных линиях (Ee)(GyA)AzW вырезание энхансера не изменяло пигментацию глаз. Следовательно, Gy1 полностью блокировал энхансер. Как и ожидалось, удаление GyA полностью восстановило активность энхансера. Введение мутации zv77h не влияло на окраску глаз ни в линиях (Ee)(GyA)AzW, ни в производных линиях с вырезанными энхансером или Gy1 (Рис.ЗЗБ). Это доказывает, что Zeste-связывающие сайты в промоторной области необходимы для преодоления энхансером негативного влияния инсулятора.

Проанализировав все приведенные выше данные, можно сделать вывод, что белок Zeste способен организовывать энхансер-промоторное взаимодействие на дальних расстояниях. Кроме того, белок Zeste способствует преодолению энхансером негативного влияния инсулятора, что предполагает возможное участие Zeste-подобных белков в преодолении инсуляторных элементов при дистанционном энхансер-промоторном взаимодействии в геноме.

ВЫВОДЫ

1. Проведено функциональное сравнение генетических факторов Tel и E(tc), влияющих на удлинение теломер. Установлено, что мутация Tel не приводит к предпочтению транспозиционного механизма удлинения теломер, как предполагалось ранее. В линиях с терминально делегированными хромосомами Tel увеличивает как частоту присоединений HeT/A/TARTэлементов к концу хромосомы, так и частоту терминальных генных конверсий.

2. Впервые показано, что белки НР1 (Heterochromatin Protein 1), Ku70 и Ku80 участвуют в негативной регуляции удлинения теломер у Drosophila melanogaster и играют важную роль в защите концов хромосом.

3. Показано, что на концевых последовательностях ДНК длиной 4-5 т.п.н. формируется особый теломерный хроматин, который негативно влияет на Ро1усотЬ-зависимую репрессию, активность транспозазы Р—элемента, а также подавляет генную конверсию, которая потенциально возможна при возникновении терминальной делеции. Продемонстрировано, что существует антагонизм между теломерным и субтеломерным (Pc-G-зависимым) хроматином.

4. Выявлено, что теломерный хроматин способен подавлять дистанционные взаимодействия между промотором yellow и полностью различными регуляторными элементами, такими как yellow энхансеры и gypsy инсулятор.

5. Предложена новая модель, описывающая механизм удлинения хромосом и контроля их длины у Drosophila melanogaster, предполагающая формирование Т-петли на конце хромосомы и основанная на антагонизме между двумя типами хроматина, формируемого на теломерах и TAS.

6. Впервые в предпромоторной области гена yellow обнаружены комуникаторные элементы, обеспечивающие как дистанционное взаимодействие между энхансером и промотором, так и gypsy (Su(Hw)) -зависимую репрессию.

7. В модельной системе гена yellow продемонстрировано, что расстояние между инсуляторами Su(Hw), окружающими энхансеры, влияет на способность инсуляторов блокировать взаимодействие между этими энхансерами и промотором. Когда расстояние между взаимодействующими инсуляторами достаточно мало, энхансеры, расположенные между ними, не могут взаимодействовать с изолированным промотором. При увеличении расстояния между инсуляторами взаимодействие между энхансерами и промотором восстанавливается.

8. Показано, что компонент Su(Hw) инсулятора белок Mod(mdg4)-67.2 негативно влияет на частоту Р-транспозиций, если Su(Hw) инсулятор входит в состав Р-транспозона.

9. Доказано, что в отличие от результатов, полученных в гетерологичных модельных системах (дрожжах и культуре клеток человека), в дрозофиле сайты связывания GAF из промоторов генов hsp26 и hsp70 не способны обеспечивать коммуникацию между регуляторными элементами, расположенными на большом расстоянии друг от друга.

10. Впервые показано, что взаимодействие между GAGA фактором и белком Mod(mdg4)-67.2 позволяет преодолеть активность Su(Hw) инсулятора у Drosophila melanogaster. Белки GAF и Mod(mdg4)-67.2 взаимодействуют in vitro и in vivo.

11. Доказано, что белок Zeste необходим для дистанционных взаимодействий между энхансером и промотором и преодоления энхансерами блокирующего действия инсуляторов в модельной системе гена white у Drosophila melanogaster.

Список публикаций по теме диссертации

1. Melnikova L. Kulikov A, Georgiev P.Interactions between cut wing mutations and mutations in zeste, and the enhancer of yellow and Polycomb group genes of Drosophila melanogaster. Mol Gen Genet. 1996. 252(3):230-6.

2. П.Г. Георгиев, JI.C. Мельникова. Т.Г. Кан, О.И. Кравчук, С.С. Михайловский, М.Ю. Савицкий. Различные механизмы регуляции длины теломер. Молекулярная биология. 2000. 34(5):743-752.

3. Savitsky M, Kravchuk О, Melnikova L. Georgiev P. Heterochromatin protein 1 is involved in control of telomere elongation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2002. 22(9):3204-18.

4. Зобачева П.Ю., Куллыев А.П., член-корр. РАН Георгиев П.Г., Мельникова JI.C. Изучение взаимодействия между Su(Hw) инсулятором и сайтами связывания для белка GAF на регуляторной системе гена yellow у Drosophila melanogaster. ДАН. 2003. 391(5):692-695.

5. Зобачева П.Ю., Куллыев А.П., член-корр. РАН Георгиев П.Г., Мельникова Л.С.

Взаимодействие между сайтами связывания для белка Zeste не блокирует активацию гена yellow изолированными энхансерами у Drosophila melanogaster.ДАН. 2003 391(6):825-827.

6. Melnikova L. Juge F, Gruzdeva N, Mazur A, Cavalli G, Georgiev P. Interaction between the GAGA factor and Mod(mdg4) proteins promotes insulator bypass in Drosophila. Proc Natl Acad Sci US A 2004. 101: 14806-14811.

7. Karakozova M, Savitskaya E, Melnikova L, Parshikov A, Georgiev P. The Mod(mdg4) component of the Su(Hw) insulator inserted in the P transposon can repress its mobility in Drosophila melanogaster. Genetics. 2004. 167:1275-1280.

8. Melnikova L. Biessmann H, Georgiev P. Excision of a P element is suppressed at the end of a terminally deficient chromosome in Drosophila melanogaster. Mol Genet Genomics. 2004. 272:512518.

9. Melnikova L. Biessmann H, Georgiev P. The Ku protein complex is involved in length regulation of Drosophila telomeres. Genetics. 2005. 170:221-35.

10. Melnikova L. Georgiev P. Drosophila telomeres: the non-telomerase alternative. Chromosome Res. 2005. 13(5):431-41. Review.

11. Savitskaya E., Melnikova L*.. Kostuchenko M., Kravchenko E., Pomerantseva E., Boikova Т., Chetverina D., Parshikov A., Zobacheva P., Gracheva E., Galkin A., and Georgiev P. Study of longdistance functional interactions between Su(Hw) insulators that can regulate enhancer-promoter communication in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2006.26(3):754-61.

12. Melnikova L. Biryukova I, Kan T, Georgiev P. Long-distance interactions between regulatory elements are suppressed at the end of a terminally deficient chromosome in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 2008. 117(l):41-50.

13. Melnikova L. Kostuchenko M, Silicheva M, Georgiev P.

Drosophila gypsy insulator and yellow enhancers regulate activity of yellow promoter through the same regulatory element. Chromosoma. 2008. 117(2): 137-45.

14. Проскуряков К.А., Мельникова Л.С. Антогонизм между теломерным и Polycomb — зависимым хроматином на конце терминально делегированных хромосом у Drosophila melanogaster. Генетика. 2008. 44(11):1562-1566.

15. Проскуряков К.А., Мельникова JI.C. Функциональное разделение генетических факторов Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)), участвующих в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster. ДАН. 2008. 421(3):406-410

16. Kostyuchenko М, Savitskaya Е, Koryagina Е, Melnikova L. Karakozova М, Georgiev P. Zeste can facilitate long-range enhancer-promoter communication and insulator bypass in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 2009. 118(5):665-74.

17. Мельникова Л.С.. Проскуряков К.А., академик Георгиев П.Г.Изучение функционального взаимодействия между GAGA-содержащими участками из промоторных районов генов теплового шока hsp26 и hsp70 в модельной системе гена white у Drosophila melanogaster. ДАН. 2010. 434 (4):553-557.

*Равное участие в работе на правах первого автора.

Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании, проведении и обсуждении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Исследования проводились при финансовой поддержке программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Российского Фонда Фундаментальных Исследований, Грантов Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых - кандидатов наук.

Автор выражает благодарность всем принимавшим участие и помогавшим в проведении исследований, обсуждении результатов и предоставившим уникальные реагенты для проведения экспериментов, а также оппонентам и рецензентам за внимательное прочтение диссертационной работы и ценные замечания.

Автор искренне благодарит за приобретенный профессиональный и жизненный опыт всех сотрудников и аспирантов лаборатории регуляции генетических процессов ИБГ РАН, вместе с которыми он работал и работает с 1992 года по настоящее время.

Отдельную благодарность за понимание и моральную поддержку автор выражает коллективу лаборатории молекулярной генетики дрозофилы ИБГ РАН, членом которого он является: Головнину Антону Клеменсовичу, Костюченко Маргарите Владимировне, Шапповалову Игорю Сергеевичу.

Особую благодарность автор выражает своему научному консультанту Георгиеву Павлу Георгиевичу, в тесном сотрудничестве с которым была выполнена представленная работа.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

БЛАГОДАРНОСТИ

Подписано в печать 30.01.2013 г. Формат 60x90/16. Заказ 1634. Тираж 100 экз. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Мельникова, Лариса Сергеевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

0520135-0538 Мельникова Лариса Сергеевна

Механизмы регуляции длины теломер и дистанционных регуляторных взаимодействий у ЭгоБоркИа melanogaster.

Специальность 03.01.07- молекулярная генетика

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант:

академик РАН,

доктор биологических наук,

профессор

Георгиев Павел Георгиевич

МОСКВА - 2013 год

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ...................................................................................................................................2

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................7

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................................................................. 10

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................................... 13

1. ТЕЛОМЕРЫ: СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ..........................................................................13

1.1 Теломеры, их типы и функции.............................................................................................. 13

1.2 Структура теломер Drosophila в сравнении с другими организмами................................ 16

1.3 Кэппинговый комплекс теломер........................................................................................... 19

1.4 Теломерный гетерохроматин...............................................................................................24

1.5 Теломер-ассоциированые последовательности (TAS).........................................................29

1.6 PcG белки и их роль в теломерном сайленсинге...................................................................33

1.7 Роль piPHK в гомеостазе теломер Drosophila.....................................................................34

1.8 Гипотезы об эволюционной связи между теломерами дрозофилы и теломерами, использующими теломеразу.......................................................................................................38

2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ РЕГУЛЯТОРНЫМИ ЭЛЕМЕНТАМИ ГЕНОМА........41

2.1 Промоторы: основные характеристики и типы.................................................................42

2.2 Энхансеры: функции, отличительные признаки и методы идентификации......................45

2.3 Взаимодействия между энхансером и промотором: возможные механизмы и влияющие факторы......................................................................................................................................51

2.4 Дистанционные взаимодействия, в которые вовлечены сайленсеры.................................60

2.5 Дистанционные взаимодействия с участием инсуляторов................................................61

2.6 Отличительные особенности инсуляторов у Drosophila и дрожжей................................65

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................................................................68

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................................................70

1. РЕАКТИВЫ................................................................................................................................70

2. ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ, БАЗЫ ДАННЫХ.............................................................70

3. СРЕДЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ БАКТЕРИЙ, ДРОЖЖЕЙ И КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК Drosophila melanogaster..................................................................................................................70

4. ЛИНИИ И МУТАЦИИ Drosophila melanogaster ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ..............72

5. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ......................................................................................................75

5.1 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий.......75

5.2 Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite.............................................75

в трансгенных линиях..................................................................................................................75

5.3 Поддержание хромосом с терминальными делециями в линиях дрозофил.........................76

5.4 Генетические скрещивания...................................................................................................77

6. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.................................................................................................81

Работа с ДНК..............................................................................................................................81

6.1 Выделение ДНК из дрозофилы.........................................................................................81

6.2 Саузерн-блот анализ..........................................................................................................81

6.3 Приготовление компетентных клеток для трансформации.плазмидной ДНК................82

6.4 Трансформация компетентных клеток плазмидами.........................................................83

6.5 Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса...............................................83

6.6 Полимеразная цепная реакция..........................................................................................84

6.7 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции..............................................................86

6.8 Лигирование ДНК..............................................................................................................86

6.9 Тупление выступающих концов ДНК..............................................................................87

6.10 Агарозный гель-электрофорез.........................................................................................87

6.11 Выделение фрагментов ДНК из геля и очистка ДНК от продуктов ферментативных реакций....................................................................................................................................87

6.12 Определение нуклеотидной последовательности...........................................................87

6.13 Создание рекомбинантных генетических конструкций для получения трансгенных линий Drosophila.....................................................................................................................88

6.14 Введение радиоактивной метки в ДНК-зонд..................................................................96

Работа с РНК..............................................................................................................................97

6.15 Выделение тотальной РНК..............................................................................................97

6.16 Нозерн блот анализ..........................................................................................................97

Работа с белками.......................................................................................................................98

6.17 Оценка уровня экспрессии (3-галактозидазы в трансгенных линиях Drosophila..........98

6.18 Синтез и выделение белков............................................................................................99

6.19 Электрофорез белков в денатурирующем 8% ПААГ....................................................100

6.20 Вестерн блот анализ.......................................................................................................100

6.21 Получение ядерного лизата из S2 клеток.......................................................................101

6.22 Иммунопреципитация и выделение ядерного матрикса................................................102

6.23 Тестирование взаимодействий между белками в системе in vitro................................103

Работа с дрожжами...................................................................................................................103

6.24 Культивирование дрожжей............................................................................................103

6.25 Трансформация дрожжевых клеток...............................................................................104

6.26 Анализ взаимодействий в дрожжевой двугибридной системе......................................104

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.......................................................105

1. ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ТЕЛОМЕРНОГО ХРОМАТИНА И МЕХАНИЗМА

РЕГУЛЯЦИИ ДЛИНЫ ТЕЛОМЕР У Drosophila melanogaster..............................................105

1.1 Функциональное разделение генетических факторов Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc))...........................................................................105

Выбор базовой модельной системы для сравнения свойств мутаций Telomere elongation (Тel) и

Enhancer of terminal gene conversion (E(tc))...............................................................................105

Получение линий дрозофилы, несущих терминально делегированные хромосомы и аутосомы

из линии Gaiano..........................................................................................................................106

Анализ природы производных линий, полученных на фоне мутации Tel...............................109

Анализ соотношения частоты терминальной генной конверсии и присоединений мобильных

элементов к концу хромосомы в созданной модельной системе..............................................111

Функциональное сравнение генетических факторов Tel и E(tc), участвующих в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster.................................................................................115

1.2 Белок НР1 (Heterochromatin Protein 1) участвует в регуляции удлинения теломер у

Drosophila melanogaster.............................................................................................................117

Мутации Su(var)2-5 не активируют терминальную генную конверсию, если матрица для

конверсии находится на гомологичной хромосоме..................................................................117

Мутации Su(var)2-5 значительно увеличивают частоту терминальной генной конверсии, если матрица для синтеза ДНК находится на той же самой хромосоме...........................................122

1.3 Белки Ки70 и Ки80 участвуют в регуляции удлинения теломер у Drosophila

melanogaster...............................................................................................................................126

Влияние Ku белков на присоединение НеТ-А и TART элементов к концам терминально

делегированных хромосом.........................................................................................................127

Влияние Ku белков на эрозию терминальных делеций...........................................................133

Влияние Ku белков на терминальную генную конверсию, когда матрица для конверсии

находится на гомологичной хромосоме....................................................................................134

Влияние Ku белков на терминальную генную конверсию, когда матрица для конверсии

находится на самой терминально делегированной хромосоме................................................137

Рекомбинация между прямыми повторами на конце терминально делегированной хромосомы.

....................................................................................................................................................138

Транскрипция НеТ-А элементов на фоне DfKu70 и DfKu80....................................................141

Роль белков НР1, Ku70 и Ки80 в элонгации теломер у Drosophila melanogaster....................142

1.4 Влияние терминального хроматина на Ро1усотЬ-зависимую репрессию..................146

Выбор базовой модельной системы для изучения свойств Polycomb-зависимого хроматина.

....................................................................................................................................................146

Получение терминально делегированных хромосом, содержащих Р-элемент в

предпромоторной области гена yellow......................................................................................148

Анализ рЬр1-зависимой репрессии в полученных производных линиях Drosophila

melanogaster................................................................................................................................150

Антогонизм между теломерным и Polycomb - зависимым хроматином на конце терминально делегированных хромосом у Drosophila melanogaster.............................................................154

1.5 Влияние терминального хроматина на частоту вырезаний .Р-элемента.....................157

Выбор модельной системы для изучения частоты вырезаний Р-элемента..............................157

Вырезания /'-элемента и стабильность концевой последовательности терминально делегированной хромосомы.......................................................................................................158

1.6 Подавление дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами на

конце терминально делетированной хромосомы.................................................................164

Теломерный хроматин не репрессирует транскрипцию гена yellow........................................164

Расположенные на конце хромосомы энхансеры гена yellow не способны активировать

промотор в положении in cis......................................................................................................168

Расположенные на конце хромосомы промоторы не способны активироваться энхансерами

гена yellow в положении ш trans................................................................................................170

Расположенный на конце хромосомы gypsy инсулятор не способен репрессировать транскрипцию yellow на фоне мутаций mod(mdg4)..................................................................175

1.7 Механизм удлинения хромосом и контроля их длины у Drosophila melanogaster......176

2. ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ МЕЖДУ РЕГУЛЯТОРНЫМИ ЭЛЕМЕНТАМИ ГЕНОМА, НАХОДЯЩИМИСЯ НА БОЛЬШОМ РАССТОЯНИИ ДРУГ ОТ ДРУГА.......181

2.1 Энхансеры гена yellow и gypsy инсулятор влияют на активность промотора гена

yellow через одни и те же регуляторные элементы...............................................................181

Последовательность от -69 до -100 п.н. необходима для стимуляции экспрессии yellow в теле

и крыльях....................................................................................................................................181

Последовательность от -69 до -100 п.н. не влияет на базовую активность промоторов, но она необходима для коммуникации между энхансером и находящимся от него на расстоянии

промотором................................................................................................................................183

Последовательность от -69 до -100 п.н. необходима для репрессии промотора yellow gypsy-

инсулятором на фоне мутации mod(mdg4)ul..............................................................................185

Роль последовательности -69 - -100 п.н. в энхансер-промоторных взаимодействиях............187

2.3 Компонент Su(Hw) инсуляторного комплекса белок Mod(mdg4) может

репрессировать активацию /'-элемента у Drosophila melanogaster.....................................195

Встраивание одной или двух копий Su(Hw) инсулятора в /'-транспозон супрессирует частоту

транспозиций..............................................................................................................................195

Белок Mod(mdg4)-67.2 необходим для 8и(Н\у)-зависимой супрессии транспозиций Р-

элемента......................................................................................................................................198

Спаривание между двумя Su(Hw) инсуляторами не способно нейтрализовать репрессию

транспозиций..............................................................................................................................199

Возможные механизмы репрессии транспозиций ^-элемента.................................................201

2.4 Изучение функционального взаимодействия между GAGA-содержащими участками

__из промоторных-районов генов теплового шока hsp26 и hsp70 в модельной системе гена

white у Drosophila melanogaster................................................................................................202

2.5 Взаимодействие между GAGA фактором и белком Mod(mdg4) позволяет преодолеть инсуляцию у Drosophila melanogaster.....................................................................................208

GAF и Mod(mdg4) взаимодействуют in vivo и in vitro..............................................................208

Сайты связывания GAF способствуют преодолению инсуляции.............................................212

Сайты связывания белка GAF усиливают репрессию гена yellow Su(Hw) инсулятором в

присутствии гомозиготной мутации mod(mdg4)uI.....................................................................217

Роль GAF фрагмента в восстановлении активности частично инактивированного промотора

гена yellow..................................................................................................................................219

Возможные механизмы взаимодействия между сайтами связывания GAF и Su(Hw) инсулятором...............................................................................................................................221

2.6 Белок Zeste может способствовать дистанционным взаимодействиям между

энхансером и промотором и преодолению инсуляции у Drosophila melanogaster.............225

Белок Zeste не нужен для стимуляции экспрессии гена white, если специфичный энхансер гена

находится в непосредственной близости от промотора............................................................225

Белок Zeste необходим для стимуляции экспрессии гена white, когда дистанция между

специфичным энхансером гена и его промотором составляет около 3 т.п.н...........................228

Белок Zeste необходим для стимуляции экспрессии гена white, когда между специфичным

энхансером гена и его промотором встроен ген yellow.............................................................232

Мультипликация Zeste сайтов не создает функциональный инсулятор в модельной системе

гена >>e//ow..................................................................................................................................233

Белок Zeste необходим для преодоления инсулятора специфичным энхансером гена white. .236

ВЫВОДЫ..........................................................................................................................................240

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................242

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА..........................................................................................................278

БЛАГОДАРНОСТИ.........................................................................................................................278

ВВЕДЕНИЕ ___________________

Теломеры - это специализированные ДНК-белковые комплексы, находящиеся на концах линейных хромосом. Теломеры предохраняют концы хромосом от слипания, деградации, узнавания системой репарации ДНК. Таким образом, основной функцией теломер является обеспечение стабильности эукариотического генома. В настоящее время доказано, что поддержание строго определенного размера теломер критично для жизнедеятельности организма. Изменение длины теломер тесно связано с опухолеобразованием и старением клетки. У большинства высших эукариот теломеры состоят из простых повторов G-богатой последовательности, а их удлинение обеспечивается специальным ферментом - теломеразой. У Drosophila melanogaster теломеры состоят из мобильных элементов типа LINE, ориентированных «голова к хвосту» - НеТ-А, TART и TAHRE. В результате проведенных в нашей лаборатории исследований было показано, что удлинение теломер дрозофилы может происходить по трем механизмам: с помощью транспозиции мобильных элементов на конец хромосомы; с помощью генной конверсии и с помощью рекомбинации между теломерными повторами. Основными структурными единицами нормальной теломеры являются: 1) терминальный комплекс - это белковый комплекс, формирующийся на конце хромосомы и защищающий его от ферментов репарации; 2)теломерный хроматин, который формируется на последовательностях теломерной ДНК. Данные структуры играют основную роль в процессе регуляции длины и стабильности теломер. Важной особенностью дрозофилы, является то, что у нее теломерный хроматин может формироваться на любой неспецифичной последовательности ДНК, в то время как у теломеразозависимых организмов теломерная структура формируется только при наличии строго определенных последовательностей, которые представляют собой сайты связывания для белков, формирующих теломерный хроматин. Необходимо отметить, что несмотря на различия в структур�

Информация о работе

Мельникова, Лариса Сергеевна
доктора биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.07

Диссертация

Механизмы регуляции длины теломер и дистанционных регуляторных взаимодействий у Drosophila melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы