Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль бeлкca НР1 в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль бeлкca НР1 в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 575.22:595.773.4.

САВИЦКИЙ МИХАИЛ ЮРЬЕВИЧ

Роль бел,ка НР1 в регуляции длины теломср у ВгоБорШЬ melanogaster

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Института биологии гена РАН

Научный руководитель:

Чл.-корр. РАН, профессор, доктор биологических наук П.Г. Георгиев

Официальные оппоненты:

профессор, доктор биологических наукА.И. Ким,

кандидат биологических наук В.Е. Алаторцев.

Ведущая организация:

Инстигуг биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита диссертации состоится "1о_" ноября 2003 года в (1 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгсльгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан "_' октября 2003 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета канд.фарм.наук

1ская Л.С.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Теломеры - это нуклеопротеиновый комплекс, который находится на концах линейных хромосом. Линейные хромосомы в результате неполной репликации постоянно укорачиваются, кроме того, их концы по сути являются двуцепочечными разрывами, которые в норме должны подвергаться репарации. Таким образом, ключевые функции теломер заключаются в специфическом узнавании и защите терминальной ДНК от системы репарации, а также поддержании длины теломерных последовательностей, что обеспечивает стабильность хромосом и, следовательно, поддерживает целостность генома.

В большинстве случаев, новые последовательности ДНК на конец хромосомы добавляются РНК-зависимым ферментом теломеразой, которая действует как обратная транскриптаза. Такие теломеры состоят из огромного числа коротких тандемно повторяющихся повторов. При нарушении функций теломеразы происходит укорачивание терминальных последовательностей хромосомы, нарушается работа теломерного комплекса, концы хромосом начинают узнаваться репарационной системой, появляется ряд других нарушений, что, в конечном счете, приводит к гибели клеток. В некоторых случаях клетки выживают благодаря включению альтернативного механизма удлинения теломер. В основе этого механизма лежат процессы рекомбинации и терминальной конверсии. Организмы, утерявшие по каким-либо причинам в процессе эволюции теломеразу, также используют рекомбинацию/конверсию для поддержания длины теломер. Теломеры этих организмов состоят из повторяющихся субьединиц, но в отличие от коротких теломеразных повторов они большего размера. Кроме того, они сильно отличаются в пределах систематически близких групп, и даже на разных хромосомах одного вида. Терминальные последовательности хромосом О. me!anogaster составляют повторы НеТ-Л и ТЛЯТ ретротранспозонов, которые перемещаются на конец хромосомы посредством обратной транскрипции, либо в результате рекомбинации или конверсии.

Строение теломерных комплексов у организмов, имеющих теломеразо-зависимую регуляцию длины теломер, уже изучено достаточно детально. В тоже

время известно только два белка, входящих в комплекс, кэпирующий концы хромосом D.melanogaster: НР1 (hetcrochromatin protein 1) и HOAP(HPl/ORC associated protein). Утверждение об их кэп-функции базируется па следующих фактах: эти белки находятся на концах хромосом, и мутации в генах, кодирующих белки НР1и НОАР, приводят к многочисленным спайкам между теломерами разных хромосом (Fanti et al, 1998; Cenci et al, 2003). Помимо этого, недавно были локализованы два фактора, находящиеся на третьей хромосоме и влияющие на длину теломер. Эти, пока еще неопределенные, гены получили названия Tel (Telomere elongation) (Siriaco et al, 2002) и E(tc) (Enchancer of telomere conversion) (Melnikova and Georgiev, 2002). Таким образом, до настоящего времени, не было известно ни одного белка, вовлеченного в регуляцию длины теломер у D.melanogaster.

Известно, что хромосомы D.melanogaster с делетироваными теломерными последовательностями, нормально передаются из поколения в поколение, если терминальная дслеция не затрагивает функционально значимые гены. Ранее нами была разработана генетическая система, позволяющая оценивать частоту присоединений НеТ-А и TART элементов к концу хромосомы с терминальной делецией (Kahn et al, 2000). В основе этой системы лежит использование хромосомы с обрывом в гене yellow. Использование этой системы позволило прояснить роль белка НР1 в контроле длины теломер у D.melanogaster.

Цель и задачи исследования.

Основная цель данной работы состояла в изучении роли белка НР1 в регуляции длины теломер у D.melanogaster.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Создать генетическую систему на основе локуса yellow для определения

коротких конверсионных трактов.

2. Определить влияние мутаций Su(var)2-5, гена кодирующего НР1, на частоту

присоединений к концу хромосомы с терминальной делецией, и на частоту

генных конверсий.

3. Изучить полученные присоединения НеТ-А и TART элементов с целью

установления природы их происхождения.

4. Определить влияние мутаций Зи(уаг)2-5 на транскрипцию НеТ-А элементов.

5. Оценить длину теломер в линиях П.те1апо§а51ег, несущих мутантные аллели

5и(уаг)2-5.

Научная новизна и практическое значение работы

В данной работе впервые показано, что ген 5и(уаг)2-5 вовлечен в регуляцию длины теломеры. Различные мутации этого гена в гетерозиготе увеличивают частоту присоединений НеТ-А и ТАЯТ элементов к концам терминальных делений более чем в 100 раз. Присоединения в данном случае происходят в результате транспозиций или рекомбинации. Роль белка НР1 в регуляции длины теломер подтверждается также тем, что линии с мутациями в гене 5и(уаг)2-5, поддерживаемые в течение ряда поколений несут длинные теломеры. Таким образом, НР1 играет существенную роль в поддержании длины теломер у О. melanogaster.

Методы и подходы, используемые в данной работе, позволяют адекватно оценивать изменения, происходящие на тсломерах, что открывает возможности их применения для тестирования факторов, которые предположительно могут быть функционально значимыми для поддержания функций теломер.

Апробация работы. Основные научные результаты диссертационной работы были представлены на 41-й и 43-й ежегодных конференциях по исследованию на дрозофиле (Питсбург, 2000 г., Сан Диего, 2002 г.); на международной конференции "Молекулярная генетика эукариот" в Москве (2003), на межлабораторном семинаре ИБГ РАН, Москва, 2003 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на ¡2$ страницах, включает Ч таблиц и20рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Библиография включает в себя 2 источников.

Результаты

На фоне мутаций Su(var)2-S возрастает частота присоединений НеТ-А и TART элементов к концу хромосомы с терминальной делецией. Белок НР1 является вероятным кандидатом на участие в контроле длины теломер у Drosophila melanogaster, поскольку о» находится на теломерах, а мутации в гене Su(var)2-5, кодирующем НР1, нарушают нормальное поведение теломер, а именно: приводят к их слипанию "конец в конец" (Fanti et al., 1998). В лаборатории Пимпинелли (Pimpinelli) также было показано, что мутации Su(var)2-501, Su(var)2-504 и Su(var)2-50S нарушают взаимодействие НР1 с нативными теломерами, а также с хромосомами, несущими терминальные делеции.

Мы предположили, что уменьшив концентрацию функционального НР1 белка, путем введения Su(var)2-5 мутаций, возможно будет наблюдать за изменением длины теломер D.melanogaster, которые состоят из тандемно повторяющихся НеТ-А и TART ретротранспозонов. Нами было проверенно влияние Su(var)2-5 мутаций на частоту присоединений НгТ-А и TART элементов к концу хромосомы с терминальной делецией. Для этого вышеупомянутые Su(var)2-5 мутации были протестированы в описанной раннее (Mikhailovsky et al., 1999; Kahn et al., 2000), но несколько модифицированной, генетической системе. Для изучения частоты присоединений НеТ-А и TART элементов к нарушенному концу хромосомы мы использовали терминальные делеции Х-хромосомы с обрывом в гене yellow, обозначенные как yTD. Экспрессия гена yellow зависит от того, в каком месте гена находится обрыв. Присоединение последовательностей ДНК, будь то последовательности гена yellow (Mikhailovsky et al., 1999) или НеТ-А элемента (Kahn et al., 2000), закономерно изменяет характер его транскрипции. Поскольку ген yellow контролирует пигментацию в кутикуле, эти изменения легко наблюдать фенотипически, и таким образом учитывать частоту присоединений к терминальным последовательностям гена yellow.

Для экспериментов нами были отобраны пять линий с генотипом yTD/y ас, If/CyO, терминальные последовательности которых находились в районе от-700 до -300 пн от начала транскрипции гена yellow. Далее самки yTD/y ас, If/CyO были

скрещены с самцами у ас; Su(var)2-5/CyO. Из потомства были отобраны самки yTD/y ac;Su(var)2-5/CyO и скрещены с самцами у ас; Su(var)2-5/CyO. Также из этого же скрещивания были отобраны самки ути/у ас; If/CyO и самцы у ас; IJlCyO, линии, полученные в результате этого скрещивания, служили контролем. Мониторинг за появлением horux yellow фенотипов проводился в течение пяти-семи поколений. Поскольку частота терминальных присоединений была схожей для разных yTD линий результаты суммированы в Таблице 1.

Каждая из четырех Su(var)2-5 мутаций показала сильный доминантный эффект на частоту присоединений НеТ-А и TART элементов к гену yellow (Таблица 1). В первом поколении частота НеТ-А присоединений в линиях yTD/y ас; Su(var)2-5/CyO была сравнимой с таковой в контрольных линиях yTD/y ас; If/CyO. Однако, в последующих поколениях частота присоединений НеТ-А и TART элементов была в сто раз выше на фоне Sn(var)2-5 мутаций. Отсутствие присоединений в первом поколении можно объяснить сильно выраженным материнским эффектом. Приблизительно одинаковые частоты HeT-A/TART присоединений вызывают все протестированные в нашей генетической системе Su(var)2-5 мутации, включая Su(var)2-5"5, ноль аллель, и Su(var)2-502 , мутация, которая не препятствует связыванию НР1 с теломерами и не вызывает теломер-теломерных слипаний (Fanti ctal., 1998).

Используемые Su(var)2-5 мутации имеют различное происхождение, поэтому маловероятно, что наблюдаемый нами эффект зависит от какой-нибудь другой гипотетической мутации, случайно сцепленной в этих линиях с Su(var)2-5. Для исключения возможного влияния генотипа мы ввели в линии yTD/y ас; Sv(var)2-502/CyO и в ута/у ас; Su(var)2-5m/CyO дупликацию Dp(2;2)P90, перекрывающую ген Su(var)2-5. Dp(2;2)F90 несет функциональную копию Su(var)2-5 гена. В присутствии Dp(2;2)P90 частота присоединений IieT-A и TART элементов сильно уменьшается (Таблица 1), подтверждая роль мутаций гена Su(var)2-5 в активации присоединений НеТ-А и TART ретротраиспозонов. Полученные результаты показывают, что протестированные Su(var)2-5 мутации в гетерозиготе приводят, по крайней мере, к стократному повышению частоты

Таблица 1. Частота HeT-A/TARTприсоединений на фоне мутаций Su(var)2-5

Su(var) Поколение q(f2-f,),

мутации f, f 2 f, f4 f, f« f7 %

IF/CyO 1/ 2/ 0/ 1 / 0/ 2/ 1/ 0.06

1100 1320 1560 1820 1920 2440 1469

Su(var)2-5m 21 226/ 332/ 616/ 364/ 145/ 143/ 22

740 1253 1817 2211 1271 967 802

Su(var)2-502 61 140/ 303/ 171/ 108/ 43/ 62/ 20

800 983 1122 791 620 273 353

Su(var)2-504 0/ 181/ 130/ 96/ 18/ 21

525 733 515 584 146

Su(var)2-501 0/ 98/ 128/ 70/ 61/ 67/ 14

460 820 578 459 311 720

Su(var)2-5 - - - 80/ 9/ 2/ 4/ 0.35*

/Dp(2;2)P90 806 1457 1365 1417

Жирным шрифтом выделены цифры отражающие число мух с новым у фенотипом, обыкновенным шрифтом - общее число самок ут в каждом поколении. О, средняя частота видимых событий (в %). *В случае линий 5и(уаг)2-5 /йр(2:2)Р90 величина О подсчитывалась для поколений р5-р7.

присоединений НеТ-А и TART элементов к деградирующей последовательности rem yellow.

Скорость деградации концевых последовательностей не изменяется на фоне Su(var)2-5 мутаций. Хромосомы с терминальными делениями у D.melanogaster теряют в среднем около 70-75 пн за поколение в результате недорепликации концов хромосом при каждом клеточном делении (Biessmann and Maison, 1988; Biessmann et al., 1990, 1992). Для изучения скорости деградации концов хромосом в присутствии Su(var)2-5 мутаций, мы собирали мух в течение шести поколений из линий yTD/y ас; Su(var)2-5/CyO и контрольных линий yTD/y ас; If/CyO и выделили из них ДНК. Для каждого поколения посредством Саузерн-блот анализа был определен размер терминальных фрагментов (рис. 1В). В линиях с Su(var)2-5 мутациями, как и в контрольных, потеря терминальных последовательностей ДНК происходила с одинаковой скоростью; 70-80 пн за поколение. Таким образом, Su(var)2-5 мутации не оказывают видимого влияния на стабильность конца хромосомы.

Возможные механизмы НеТ-Л and TARТ присоединений к терминальным последовательностям гена yellow. Ранее нами было показано, что присоединение последовательностей НеТ-А к деградирующему концу хромосомы может осуществляться путем транспозиции, конверсии или в результате рекомбинации З'конца НеТ-А элемента с НеТ-А элементом на другой хромосоме (Kahn et al., 2000).

Чтобы определить природу HeT-A/TART присоединений, полученных на фоне Su(var)2-5 мутаций, мы поставили перед собой следующие задачи: определить длины новых ДНК присоединений, установить структуру мест стыка между геном yellow и новоприобретенными ДНК последовательностями.

Для определения длины присоединений мы использовали Саузерн-блот анализ (рис. 1С), В случаях присоединений длинных (более 7-10 тпн) ДНК последовательностей, было возможно определить только минимальный размер, поскольку присоединившиеся последовательности обычно имеют добавочные сайты узнавания для используемых рестрицирующих эндонуклеаз. Размер новых присоединений варьировал от 1.4 тпн до более 20 тпн (рис. 1С, 3).

Чтобы обнаружить новые присоединения, которые не могли быть отобраны по фенотипу (например: присоединения TART элементов к терминальной последовательности гена yellow, уже утерявшей промотор), мы также протестировали всех потомков (дочерей, несущих терминальную делению), полученных от 10 самок, Саузерн-блот анализом. Все самки в потомстве одной из десяти отобранных самок приобрели новые последовательности ДНК (рис. 1D). У некоторых из них эти новоприобретенные последовательности имели идентичные рестрикционные карты, указывающие на то, что эти события произошли в клетках полового пути на ранних премейотических стадиях. Однако в большинстве случаев рестрикционные карты различаются, что в свою очередь говорит о присоединениях, возникающих независимо на более поздних стадиях (рис. 1D). Таким образом, присоединения новых ДНК последовательностей на фоне Su(var)2-5 мутаций происходят на разных стадиях оогенеза.

Для определения точного места присоединений предполагаемые участки стыка между нуклеотидной последовательностью гена yellow и новыми

А

'(А-) -► У2(А+)

у'—>Г

т

-33 bp -25 bß

„г АТАТАААА

•140 V -70 ^

J--L-JI,

(tin bp

*ГТн h

jfy ATG

in—ГТГТ ., .... .,

Ш

i г

0 5U>

I-1

в / e s к мня I ! !

ЕЕ NE

i i _! i

В

SQfvyl^^/C.yû _____<1

kb Fs ^ F' Fj F=

f -

5(1 J .

45 S '*"* -Ç *

" fi4

С

eeeesesesnseeeessenes 23.1- -.-'..' . • : . ' ,'•

9 4- ; -6.6- •

2.32.0-

присоединившимися элементами были амплифицированы с помощью ПЦР и отсеквенированы. Таким образом были определенны последовательности мест стыка для 43 событий.

Анализ точек стыка показал, что присоединения НеТ-А и TART элементов к терминальным последовательностям гена yellow не являются сайтспецифическими и носят случайный характер. Только в одно место гена yellow , а именно в сайт АААА в районе промотора, было зарегистрировано четыре независимых присоединения (-28 а, Ь, с, d). Во всех случаях, кроме одного (+84а), между геном yellow и НеТ-А последовательностями были адениновые основания. Последовательность 3' конца НеТ-А элемента (5' CCAGCAAAGTT 3') была консервативной в половине случаев присоединений (19 из 38). В других НеТ-А присоединениях часто отсутствовал последний Т (15 случаев) или 2-3 последних нуклеотида (4 случая). В некоторых из этих случаев между геном yellow и НеТ-А элементом появились короткие добавочные последовательности, которые оказались гомологичными последовательностям, расположенным в 3' конце (-981) или в 5' нетранслируемой области (-470) НеТ-А элемента. В двух случаях (-55 и -59) присоединения ДНК несли две тандемные копии 3' конца ИеТ-А с поли-А трактом.

Рис. 1. Молекулярная структура хромосом с терминальными делениями в районе reHayellow.

(A) Схема локуса гена yellow в районе обрыва хромосомы с указанием у фенотипов. Черными прямоугольниками обозначена кодирующая часть гена yellow. Место начала транскрипции показано горизонтально расположенной стрелкой. Прерывистыми линиями обозначены области reuayellow, в которых различаются закономерности смены фенотипов при присоединении к ним НеТ-А или TART. Фрагменты Kpnl-ЕсоУУ и BamU]~EcoR\, используемые в качестве зондов для Саузерн-блот гибридизации, показаны толстыми черными линиями внизу схемы. Маленькими стрелками отмечены места присоединений НеТ-А (внизу линии) и TART элементов (сверху). Номера присоединений соответствуют их месту прикрепления относительно сайта начала транскрипции гена yellow. Сайтспецифические эндонуклеазы обозначены следующим образом: В, ВатШ; К, Крп\. Н, HindüV, Е, £coRV; N, Nru\\ S, Spei.

(B) Эффект мутации Su(var)2-5ös на степень деградации конца хромосомы. ДНК была обработана рестриктазой EcoRI. В качестве зонда использовался фрагмент BamHl-EcoRl. Полосы более высокого молекулярного веса в F2 - F4 на фоне Su(var)2-50i мутации указывают на новые присоединения к деградирующему концу хромосомы.

(C) ИеТ-А и TART присоединения к терминальной делении в гене yellow. ДНК обработана следующими рсстриктазами: £YoRV (П), NriA (N), SpeI (S). 13 качестве зонда использовался фрагмент Kpnl-EcoKV.

(D) НеТ-А и TART присоединения, полученные в потомстве одной самки ут0/у ас; Su(var)2-505/CyO у'-подобного фенотипа. ДНК для Саузерн-блот анализа была обработана рестриктазами Kpnl (К) и EcoRV (Е). В качестве зонда использовался фрагмент Kpnl-EcoKV.

Маленький размер присоединившейся ДНК последовательности, наличие олиго(А) и консервативный 3' конец указывают на присоединение НеТ-А элемента к деградирующему концу гена yellow путем транспозиции (Kahn et al, 2000). Этим критериям удовлетворяют 7 из 11 коротких ДНК присоединений. Напротив, большой размер ДНК присоединений, наличие всего нескольких адениновых оснований между последовательностями гена yellow и присоединенной ДНК, а также нуклеотидные замены в консервативном в норме 3' терминальном триплете свидетельствуют в пользу рекомбинации между деградирующим концом гена yellow и 3' концом теломерного НеТ-А элемента. В четырех случаях присоединения обладают всеми вышеперечисленными чертами, а в трех большой размер присоединенной ДНК сочетается с олиго(А) в гене yellow. Эти присоединения также могли возникнуть в результате рекомбинации. Однако, в большинстве случаев данные Саузерн-блот гибридизации и секвенирования не позволяют точно провести границу между двумя возможными механизмами присоединения НеТ-А элементов: транспозицией и рекомбинацией. Нам представляется вероятным, что Su(var)2-5 мутации способны индуцировать оба механизма.

Su(var)2-S мутации не усиливают генную конверсию по матрице на гомологичной хромосоме. Ранее в нашей лаборатории было обнаружено, что хромосомы с терминальной делецией могут частично восстанавливаться при помощи генной конверсии, используя в качестве матрицы гомологичную хромосому (Mikhailovsky et al., 1999). Поскольку частота таких событий сильно зависит от генетического фона соответствующей линии, мы проверили частоту концевых удлинений ДНК на фоне Su(var)2-5 мутаций.

В первой серии экспериментов, мы проверили способность Su(var)2-5 мутаций индуцировать длинные конверсионные тракты. С этой целью были отобраны две линии с терминальными делециями, концы которых находились приблизительно в районах 550 пн (yTD~S5°) и -1100 пн (yTD'lm) от начала транскрипции гена yellow. В качестве матрицы для генной конверсии использовался у' аллель (у w хромосома). Этот аллель несет точечную замену (ATG cTG) в первом кодоне гена yellow (Morris et al., 1998) и, следовательно, непродуктивную кодирующую часть, что

Таблица 2. Частота НеТ-А/ТАИТ присоединений и генных конверсии в линиях уто/у'т фоне мутаций Зи(уаг)2-5

Поколение Su(var)2-5 мутации Общее кол-во Конверсии Присоединения

No Q, % No Q, %

F, Su(var)2-5* 4522 12 0.27 2 0.04

Su(var)2-502 3067 14 0.45 1 0.03

Su(var)2-5" 1290 3 0.23 0 <0.07

Su(var)2-50> 2175 10 0.45 1 0.05

F2 Su(var)2-5f 3821 15 0.40 1 0.03

Sit(var)2-502 1246 3 0.24 162 13

Su(var)2-50i 1548 1 0.06 375 24

Su(var)2-50> 1266 2 0.16 243 20

F3 Su(var)2-5* 2484 18 0.72 0 <0.04

Su(var)2-f2 648 2 0.31 102 15

Su(var)2-5" 984 1 0.10 162 16

Su(var)2-5°s 1690 2 0.12 281 17

N0 - общее число мух с новыми у фенотипами, получившимися в результате генных конверсии или в результате присоединений НеТ-А или ТАЯТ элементов. Жирным шрифтом выделена средняя частота видимых событий С? (в %,).

А

Еп-Ь

У Г

-y/J

•52 —ij-25 С© ¡+'71 00 АТАТАААА cTG AcccgggA ATG

minimal detectable conversion track

_________________,.......

___________/..............

у

Рис. 2. Модельная система для изучения восстановления терминалы torn конца гена yellow путем генной конверсии по матрице, находящейся на гомологичной хромосоме, на фоне мутаций Su(var)2-5. Схема, сопоставляющая yTD аллели с аллелями, которые использовались в качестве матрицы для генной конверсии. Показана молекулярная структура./ и у'а,а мутаций. Энхансеры крыльев (En-w) и тела (F,n-b) изображены в виде овалов. Толстыми черными линиями показаны взятые в эксперимент yTD аллели, их левые концы соответствуют приблизительному месту обрыва в гене yellow. Линией, состоящей из точек, показан минимальный конверсионный тракт, который можно зафиксировать по изменению фенотипа yellow. Пунктиром обозначена область гена yellow, приобретение хотя бы части которой в результате генной конверсии ведет к образованию нового уг фенотипа. Толстые линии в верхней части рисунка отражают фрагменты, которые использовались как зонды для Саузерн-блот анализа. Сайтспецифические эидонуклеазы: A, Sali; С, С1а\. Другие обозначения такие же как на рис. \.

3.2 kb

е s к

У1

I

фенотипически проявляется отсутствием кутикулярной пигментации у мух во всех частях тела. Важно отметить, что этот нуль аллель несет не измененную 5' регуляторную часть, что и было использовано в данном эксперименте. Присоединение НеТ-Л или TART элементов к концу делегированной хромосомы в утй линии приводит к возникновению у2(А+) фенотипа. Добавление же хотя бы энхансеров тела (-1600 пн) в результате генной конверсии частично восстанавливает экспрессию гена yellow в теле (yr- yellow revertant). Чем длиннее конверсионный тракт, тем больший участок 5' регуляторной области гена yellow приобретает yTD аллель, и тем ближе экспрессия гена yellow к дикому типу, что хорошо заметно по интенсивности пигментации крыльев и кутикулы тела. Таким образом, используя yTD'55" и у™-"00 линии, мы могли фиксировать (рис. 2) конверсионные тракты длиной от 1050 пн и 500 пн соответственно.

Нами были синтезированы линии yTD/y w; Su(var)2-504/CyO and yTD/y w; Su(var)2-501/CyO. В течение трех поколений проводилось наблюдение за появлением мух с новым у фенотипом (Таблица 2). В результате генной конверсии появлялись самки уг фенотипа, в то время как присоединения НеТ-А и TART элементов давали самок фенотипа у2(А+). В первом поколении линии, несущие Su(var)2-5 мутации, и контрольные линии имели сходную частоту присоединений и конверсионных событий. Однако в двух последующих поколениях частота НеТ-А и TART присоединений возросла в сто раз, в то время как частота конверсионных событий не изменилась.

Хотя полученные результаты свидетельствуют, что Su(var)2-5 мутации увеличивают только частоту присоединений HeT-A/TART элементов, остается вероятность существования коротких конверсионных событий, идентификация которых в вышеописанной системе была не возможна. Для проверки этой возможности мы разработали специальную генетическую систему, позволяющую фиксировать небольшие конверсионные тракты порядка 100-200 пн (рис. 2). Нами была отобрана линия yTD*250 с терминальной делецией, оканчивающейся в кодирующей части гена yellow. yTD*2S0 хромосома была соединена с у""" хромосомой, в которой ТАТА-промотор (ТАТААА) гена yellow заменен на CCCGGG (Morris et al., 1999). В результате этой замены мухи имеют желтые

щетинки. Раннее нами было показано, что промотор НеТ-А элемента способен активировать транскрипцию гена yellow, и химерная HeT-A-yellow мРНК дает функциональный продукт при условии сохранения стартового ATG кодона гена yellow (Kahn et ai., 2000); такие мухи имеют у2-подобный фенотип. Таким образом, присоединение ИеТ-А элементов восстанавливало бы yellow пигментацию в щетинках только в тех случаях, когда ATG кодон был бы введен на конец производных у10*250 линии в результате произошедшей раньше генной конверсии по уа'° матрице. Таким образом, учитывая 20% вероятность присоединения НеТ-А элемента (Таблица 1), мы были способны различать фенотипически каждое пятое конверсионное событие.

Нами были синтезированы семь независимых yTD*2sll/y'""'w; Su(var)2-5/CyO линий с Su(var)2-5°4 или Su(var)2-f5 мутантными аллелями. Все сконструированные линии в первом поколении несли делецию с концом в районе +250 от начала транскрипции гена yellow. Таким образом, в этих линиях отсутствовал ATG старт-кодон гена yellow (+171). Полученные утп линии наблюдались в течение трех поколений. В общей сложности нами были проанализированы фенотипы около 5000 самок, несущих делецию. В результате было найдено только две самки у2-подобного фенотипа. В обоих случаях НеТ-А элемент был присоединен к последовательности гена yellow перед ATG старт-кодоном, указывая на то, что частичное восстановление гена yellow произошло до присоединения НеТ-А элемента. Частота конверсии в данном случае составляет около 0,2%. Это значение не выходит за рамки значений, определенных предыдущим экспериментом (Таблица 2).

Таким образом, Su(var)2-5 мутации предпочтительно увеличивают частоту присоединений НеТ-А и TART элементов к концу усеченной хромосомы, в то время как частота генных конверсии по ДНК матрице, находящейся на гомологичной хромосоме, не изменяется.

Линии Drosophila с Su(var)2-5 мутациями обычно содержат большое количество НеТ-А и TART элементов. Поскольку, полученные нами данные свидетельствуют о высокой частоте ДНК присоединений к концу терминальной делеции на фоне Su(var)2-5 мутаций, мы предположили, что линии, долгое время

А НеТ-А

Рис. 3. Относительное содержание НеТ-А и ТАКТ элементов в линиях с мутациями 51¡(тг)2-5.

TART

(Л) Схемы строения ИеТ-А и ТАКТ элементов. Толстые черные линии под схемами обозначают зонды, использованные при Саузерн-блот анализе.

J? Uii

(В) Определение копийности НеТ-А и ТАКТ элементов Саузерн-блот анализом в линиях 8и^аг)2-5. Использованные сокращения: * помечены линии, в которые мутации Зи^аг)2-5 введены относительно недавно (Ьи М а). 2000). Яи(уаг)02* - 0/(1)к, у'н>"с"; $и(уаг)2'5"2/СуО, у'; Би(уаг)04* - г>/<7>, у'к"с!'; Зи(юг)2-?4/СуО. у*; $и(уаг)05* -0/(1)щ у'м/"'"; 5фаг)2-5"/СуО, у. Зи(маг)01 ■ ///СуО 5и(уаг)2-3"/$М1;

5и(уаг)04 - 0/(1)ы, у'к"'21; ¡и(уаг)2-31и/СуО, /; 5и(уаг)05 - 1п(1)*/"к; ¡и(уаг)2-5°'/1п(21}Су' 1п(2К)Су\ 0Р(2;2)Р90 - у к; йр(2;2)Р90/Су0,у+. ДНК была обработана эндонуклеазами ВатШ (В) или ЕаЛ{\ (Я).

\ probe 1

развивающиеся на фоне Su(var)2-5 мутаций, должны обладать длинными теломерами. Чтобы определить относительную длину теломер Drosophila, мы оценили содержание НеТ-А и TART в разных линиях, несущих Su(var)2-5 мутации.

В качестве контроля нами использовались линии Oregon, у ас, и Gaiano. Известно, что линия Gaiano, полученная из природной популяции, имеет очень длинные теломеры (Mason et al., 2000; Siriaco et al., 2002). Для получения более объективной картины при гибридизации мы использовали зонды из разных частей НеТ-А и TART элементов (рис. ЗА).

Мы нашли, что ДНК, изолированная из Su(var)2-5el, Su(var)2-5a4 и Su(var)2-50s линий, при гибридизации с меченными зондами из НеТ-А и TART элементов дает приблизительно одинаковый по интенсивности сигнал по сравнению с ДНК из линии Gaiano (рис. ЗВ) и значительно более сильный по сравнению с другими контрольными линиями, Oregon и у ас. Это означает, что хромосомы этих

Su(var)2-5 линий несут очень длинные теломерные повторы НеТ-А и TART элементов, близкие по длине к теломерам линии Gaiano.

Однако, в линиях у; Su(var)2-502/CyO, у*, у; Su(var)2-504/CyO, у* и у; Su(var)2-5os/CyO, улюбезно предоставленных Джойлом Эйссенбергом (Joel Eissenbcrg), длина HeT-A/TART повторов была значительно меньше. Последние три линии были синтезированы недавно: около полутора лет назад относительно времени наших экспериментов (Lu et al., 2000). Линии же Su(var)2-5 поддерживались в течении многих лет. Можно предположить, что увеличение длины теломер на фоне Su(var)2-5 мутаций - процесс не настолько стремительный, чтобы его последствия было легко наблюдать при помощи Саузерн-блот анализа всего через полтора года после введения мутаций.

Su(var)2-S мутации активируют транскрипцию НеТ-А элементов. НеТ-А и TART элементы относятся к семейству ретротранспозонов, не содержащих длинные терминальные повторы. Их транспозиция в новое место происходит в результате обратной транскрипции. То есть, чем больше транскриптов, тем активнее ретротранспозоны перемещаются.

Белок НР1, как известно, вызывает транскрипционную репрессию (Eissenberg et al., 1990; Eissenberg and Elgin, 2000). Мы предположили, что белок НР1 также подавляет транскрипцию НеТ-А элементов, a Su(var)2-5 мутации ее восстанавливают, что увеличивает количество транскриптов и, как следствие, увеличивается частота транспозиций НеТ-А элементов.

Для проверки выдвинутого предположения, мы сравнили транскрипцию НеТ-А элементов в линии дикого типа и на фоне Su(var)2-5 мутаций. Было обнаружено, что линии с мутациями Su(var)2-50', Su(var)2-502, Su(var)2-504 и Su(var)2-505, а также линия Gaiano содержат значительно больше НеТ-А транскриптов, чем контрольные линии Oregon и у ас (рис. 4А,В).

Чтобы исключить вклад высокой копийности НеТ-А элементов в увеличение числа транскриптов, мы также исследовали транскрипцию НеТ-А элементов в Sn(var)2-5/CyO и lf/CyO самках, полученных в Fi и F2 после скрещивания самок у ас; If/CyO с самцами Su(var)2-5 (рис. 4В). В самках Sn(var)2-5/CyO и Jf/CyO из Fi

л £ & £

/// / / /

й i&

\ НеТ-А

ras2

ras2

Рис. 4. Анализ транскрипции НеТ-Л элементов на фоне мутаций Su(var)2-5.

(A) Нозерн-блот анализ РНК из следующих линии: In(l)wm4h; Su(var)2-504 JIn(2L)'In(2R)Cy Cy'Roi'pR'cn', [Su(var)04/Cy], Df(l)w, y'w6,c!': Su(var)2-S°'/Cy0. y* [Su(var)02/Cy]; Oregon R\ ¡n(l)W"4h: Su(var)2-505/In(2L)Cy' ln(2R)Cy [Su(var)05/C]): Gaiano, у ас. В качестве зонда использовался фрагмент ДНК из открытой рамки считывания НеТ-А элемента. Длина основного детектируемою транскрипта составляет 6 тпн. Проба из гена ras2 гибридизуется с транскриптом 1.6 тип; одинаковая интенсивность этих полос в разных пробах свидетельствует об одинаковом количестве тотальной РНК, взятой на Нозсрн-блот анализ.

(B) Изменение транскрипции ПеТ-А элементов при введении мутаций Su(var)2-5. Линии Gaiano и Ij/CyO использованы в качестве контроля, отражающего высокий и низкий уровень транскрипции соответственно.

отмечен приблизительно одинаковый невысокий уровень транскрипции НеТ-А элементов (рис. ЗВ), что коррелирует с низким уровнем НеТ-А присоединений к терминально делетированым хромосомам и может быть объяснено значительным вкладом материнского НР1 белка. Однако, в Рг мы наблюдали значительное повышение уровня транскрипции НеТ-А элементов у самок 8и^аг)2-5/СуО, в то время как экспрессия в контрольных самках 1//СуО не изменилась.

Обсуждение результатов. Белок НР1 участвует в контроле длины теломер у ОгонорИИа те1апо§а51ег. НР1 первый из идентефицированных белков, который участвует в кепировании концов хромосом у D.me¡anogaster (РапИ е1 а1. 1998а). На теломерах также присутствует белок НОАР. Мутации в генах, кодирующих эти белки, имеют

одинаковое фенотипическое проявление, и часто приводят к неправильному поведению хромосом (Ccnci et al. 2003b). В результате образуются спайки между хромосомами. Особенно часто встречаются теломер-теломерные слияния так, что на препаратах митотических хромосом иногда видны цепочки слившихся конец в конец хромосом. Белки специфически взаимодействуют друг с другом и находятся на концах хромосом в составе теломерного белкового комплекса НР1/НОАР, отличного от комплекса HP1/ORC/HOAP, необходимого для инициации сборки гетерохроматина на ранних эмбриональных стадиях (Shareef et al. 2003;Shareef et al. 2001a).

В наших экспериментах мы использовали хромосомы с терминальными делециями, е обрывом, находящимся в гене yellow. Ранее на D.melanogaster было показано, что хромосомы с отсутствующими терминальными последовательностями благополучно передаются из поколения в поколение, не теряются и не приводят к значимым нарушениям в процессе развития (Biessmann et al. 1992;Biessmann et al. 1990b;Biessmann et al. 1990a;Levis 1989), и это прямо указывает на то, что конец таких хромосом защищен кепирующим комплексом. Кроме того, на концах таких нарушенных хромосом, также как и на нормальных хромосомах, обнаружены белки НР1 и HOAP (Cenci et al. 2003a;Fanti et al. 1998c). Таким образом, белки кепирующего комплекса способны сиквенс-неспецифически связываться с концами хромосом, а терминальные делеции обладают свойствами нормальных хромосом и являются замечательной модельной системой для изучения теломер у дрозофилы.

Нами было обнаружено, что па фоне мутаций Su(var)2-5 частота присоединений НеТ-Л и TART элементов к концу хромосомы с терминальной делецией увеличивается более чем в сто раз. Также в нашей лаборатории было показано, что мутациями в гене Su(var)2-5 усиливается способность концов хромосом удлиняться путем генной конверсии, если матрица для синтеза ДНК находится на той же самой, а не на гомологичной хромосоме (Savitsky et al. 2002). Такой сильный доминантный эффект мутаций наводит на мысль, что для регуляции длины теломер важна концентрация белка НР1. Роль белка НР1 в регуляции длины теломер подтверждаетя также тем, что линии, которые в течении

многих лет велись на фоне мутаций Su(var)2-5, имели очень длинные последовательности НеТ-А и TART повторов.

Белок НР1 содержит два домена N-концевой CD (chromo domain) и С-концевой CSD (chromo shadow domain), которые соединены между собой линкерной последовательностью (Eissenberg and Elgin 2000). При помощи CSD осуществляются большинство белок-белковых взаимодействий, в которые может быть вовлечен НР1. Некоторые из этих взаимодействий, возможно, важны для привлечения НР1 на теломеры. CSD в частности способен связываться с N-концевым пептидом гистона Н4 (Zhao et al. 2000), взаимодействовать с белком Ku70 (Song et al. 2001a), который входит репарационный комплекс, узнающий двуцепочечные разрывы ДНК и играет немаловажную роль в поддержании теломер у млекопитающих и дрожжей (de Lange 2002;Hopfner et al. 2002). Эти факты могут объяснить сиквенс-неспецифическое связывание НР1 с теломерами.

Мутация Su(var)2-502 , в отличие от других мутаций, не вызывает хромосомных аберраций. Однако, в наших экспериментах она имела такой же сильный эффект на удлинение хромосом как и мутация Su(var)2-50s, которая является функциональным аналогом ноль-мутации гена Su(var)2-5. Таким образом, по-видимому, CD не критичен для связывания белка НР1 с теломерами и поддержания их защитных функций, но необходим для супрессии элонгации теломер. Мутация Su(var)2-502 приводит к образованию белка НР1 с заменой V26M в CD, что нарушает связывание НР1 с МеНЗК9 (Jacobs et al. 2001b;Jacobs and Khorasanizadeh 2002b;Nielsen et al. 2001;Nielsen et al. 2002b) и приводит к значительному ослаблению репрессии в гетерохроматине. На теломерах политенных хромосом D.melanogaster были обнаружены метил-трансферазы гистона НЗ Su(var)3-9 (Schotta et al. 2002b) и E(z) (Czermin et al. 2002), которые, метилируя лизин 9 гистона НЗ, создают сайты связывания для CD НР1 (Jacobs and Khorasanizadeh 2002a;Lachner et al. 2001;Bannister et al. 2001;Nielsen et al. 2002a;Jacobs et al. 2001a), a также белок Su(var)3-7 (Delattre et al. 2000), который является составной частью гетерохроматин-образующего белкового комплекса Su(var)3-9/HPl/Su(var)3-7 (Schotta et al. 2002a). Образование теломерного гетерохроматина можно рассматривать как один из механизмов негативной

регуляции длины теломер; репрессионный статус хроматина препятствует частым рекомбинациям, как это происходит в гетерохроматине у D.melanogaster (Westphal and Reuter 2002) или в субтеломерных районах у Saccharomyces cerevisiae (Wright and Zakian 1995;Wright ct al. 1992). В тоже время, рекомбинацией теломерных повторов может происходить удлинение теломер (Kahn et al. 2000;Roth et al. 1997;McEachern and Blackburn 1996;Pluta and Zakian 1989), а короткие теломеры у дрожжей проявляют повышенную рекомбинационную активность (McEachern and Iyer 2001). Таким образом, на теломерах дрозофилы, возможно, собирается репрессионный комплекс, который делает конец хромосомы менее доступным, в данном случае, для белков участвующих в транспозиции НеТ-А и TART элементов и белковых комплексов, осуществляющих репликацию и рекомбинацию, а роль CD, по-видимому, заключается в стабилизации этого комплекса.

Другое объяснение особым свойствам НР1 с нарушенным CD можно предложить, исходя из участия теломер в общей архитектуре ядра. Известно, что у S.cerevisiae теломеры расположены кластерами вблизи периферии ядра (Gotta et al. 1996;Laroche ct al. 2000). Кроме того, у дрожжей нарушение локализации теломер на ядерной оболочке коррелирует с уменьшением теломерного сайленсинга (Galy et al. 2000;Tham and Zakian 2002;Dubrana et al. 2001). В частности, такие изменения происходят в штаммах мутантных по уКи70 и уКи80 (Gotta and Gasser 1996). В качестве кандидатов, способных участвовать в подобном процессе у дрозофилы, можно рассматривать белок LBR (Lamin В Receptor) и белок Ku70. То есть, нарушенный CD изменяет характер взаимодействия CSD НР1 с Ku70 (Song ct al. 2001b) и модулирует их в составе комплекса HP1/(H3/H4)/LBR (Polioudaki et al. 2001). Нарушения локализации теломер на ядерной ламине с одновременным изменением репрессионного статуса в свою очередь приводит к тому, что конец хромосомы становится более мобильным, более доступным для других белков, вовлеченных в регуляцию длины теломер.

Осталась не освещена роль линкерного участка белка IIP1, который соединяет CD и CSD. До недавнего времени считалось, что, будучи столь не консервативным среди разных организмов, он выполняет только связующую роль между доменами, обеспечивая их подвижность относительно друг друга. Сейчас уже показано, что

линкерный участок НР1 у дрозофилы способствует его рекрутированию в гетерохроматин (Smothers and Henikoff 2001). Кроме того, интересные результаты были получены на Xcnopus: при исследовании связывания НР1а с хроматином in vitro, оказалось, что ни CD ни CSD самостоятельно не могут связываться с хроматином, тогда как линкер самостоятельно или вместе с CD делали это успешно (Meehan et al. 2003). Безусловно линкерная область НР1 также важна для создания комплекса НОАР/НР1 на теломерах, так как именно она определяет специфичность взаимодействия между этими белками (Badugu et al. 2003b). Более того, в белке НОАР имеется специальный PETEMNE мотив взаимодействующий исключительно с последовательностью линкера. Интересно, что именно в линкерном районе находятся 3 из 6 найденных в НР1 консенсусов для разных протеинкиназ, и поскольку особенности фосфорилирования НР1 сказываются на гетерохроматине (Eissenberg et al. 1994;Zhao and Eissenberg 1999;Zhao et al. 2001), разумно предположить участие особых фосфорилированных форм НР1 в теломерном комплексе. К сожалению, пока не ясно как комплекс НОАР/НР1 привлекается на конец хоромосомы, но оба белка являются ключевыми в поддержании его стабильности.

Мутации в гене Su(var)2-5 способствуют удлинению хромосомы разными способами. Нами было показано, что мутации Su(var)2-5 увеличивают транскрипцию НеТ-А и TART элементов. Также известно, что НР1 находится на теломерных НеТ-А и TART элементах (Badugu et al. 2003а), что подтверждает роль НР1 в репрессии их транскрипции. С другой стороны, теломерные НеТ-А и TART последовательности не приводят к установлению сайленсинга на прилежащих последовательностях генов yellow и white (Kahn et al. 2000;Bicssmann et al. 1992;Golubovsky et al. 2001;Savitsky et al. 2003). Это указывает скорее на специфическую репрессию белком НР1 промоторов НеТ-А элементов, которая влияет на их транскрипцию и, соответственно, отражается на частоте их транспозиций. Таким образом, повышение частоты транспозиций, происходящих в результате обратной транскрипции, можно объяснить изменением транскрипционной активности НеТ-А элементов.

Однако, наличие НР1 на теломерах и в особенности на терминальных делениях, плюс выполнение белком защитных функций, что обсуждалось в предыдущей главе, указывает на двоякую роль НР1 в процессе поддержания длины теломер. Ряд фактов указывает на то, что высокий уровень транскрипции НеТ-А элементов не обязательно сопутствует высокой частоте транспозиций. Так, некоторые мутации Su(var) при заметно более высоком уровне транскрипции НеТ-А элементов не показали значимого увеличения частоты транспозиций на конец хромосомы с терминальной делецией (Кравчук О, личное сообщение). Другой аналогичный результат был получен Т.Кан (личное сообщение). В этом случае были синтезированы специальные линии, которые несли Х-хромосому с терминальной делецией и хромосомы из линии Gaiano. Линия Gaiano происходит из природной популяции и обладает экстремально длинными теломерами. На третьей хромосоме в этой линии был локализован доминантный фактор, положительно влияющий на длину теломер и названный Tel (Telomere elongation) (Siriaco et al. 2002). Используя линию Gaiano в наших экспериментах в качестве контроля, нами был установлен высокий уровень транскрипции НеТ-А элементов в линии. Оказалось, что этого не достаточно для значительного повышения количества транспозиций на конец хромосомы. Иными словами, мутации в гене Su(var)2-5 повышают уровень удлинения терминальных последовательностей в такой степени, что объяснения только увеличением транспозиций в следствие изменения транскрипции НеТ-А элементов явно не достаточно.

Раннее нами было показано, что последовательность НеТ-А элемента, находясь на конце терминальной делецни, может восстанавливаться путем генной конверсии, если матрица находится на гомологичной хромосоме (Kahn et al. 2000). В данной работе мы продемонстрировали, что частота генных конверсии по гомологичной хромосоме на фоне мутации Su(var)2-5 не меняется. В тоже время в лаборатории Георгисва П.Г. были получены результаты, из которых следовало, что увеличение частоты конверсии на фоне мутаций Su(var)2-5 возможно при условии, если гомологичная матрица находится на конце той же самой хромосомы. В данном случае использовалась терминальная делеция с дуплицированной последовательностью гена yellow на конце. Терминальная последовательность

1000-1500 пи длиной (в зависимости от степени деградации конца хромосомы) проксимальнее имела свою копию, от которой была отделена 12 тин фрагментом ДНК (Melnikova and Georgiev 2002). В данной генетической системе получилось, что при введении мутаций Su(var)2-5 не только увеличивается частота генных конверсии, но одновременно происходит и уменьшение числа присоединений НеТ-А и TART последовательностей, по сравнению с экспериментами, где использовались простые терминальные делеции (Savitsky et al. 2002). Эти результаты прямо подтверждают двоякую роль белка НР1 в регуляции длины теломер у D.melanogaster. Таким образом, при недостатке белка НР1 стимулируются разные механизмы удлинения терминальных последовательностей.

У млекопитающих, дрожжей, некоторых простейших теломерная ДНК может находиться в двух конформациониых состояниях. Одна из них закрытая конформация - Т-петля, которая образуется в результате отжига 3' оверхенга, или как его еще называют G-хвоста, на предшествующих двуцепочечных теломерных повторах той же хромосомы. В результате инвазии одноцепочечного G-хвоста в двуцепочечную ДНК образуется D-петля, по строению напоминающая репликационную вилку. Подобная конформация называется закрытой, потому что конец теломеры спрятан и не доступен для теломеразы (Stanscl et al. 2001;Greider 1999). Если же петля размыкается (открытая конформация), то конец становится доступным и происходит теломеразо-зависимое удлинение. Длина Т-петели варьирует у разных организмов от 300 пн у трипаносомы до 30 тпн в мышиных клетках (Munoz-Jordan ct al. 2001;Murti and Prescott 1999;Griffith et al. 1999). Такое разброс указывает на то, что сама Т-петля не является функциональной единицей, а функциональную нагрузку несет D-пстля, стабильность которой и определяет доступность конца для теломеразы.

Возможность удлинения концевых последовательностей по матрице находящейся на той же хромосоме указывает, что структура подобная Т-петле образуется и у D.melanogaster. Возможно, I IP 1 принимает участие в стабилизации D-пстли, и таким образом способствует образованию Т-петли. Под стабилизацией D-петли мы понимаем, что НР1 вероятно не только способствует поддержанию этой структуры, но и репрессирует инициацию репликации. В результате

уменьшения концентрации НР1 нарушается установившееся равновесие: причем в основном снимается запрет на репликацию, в то время как образование Т-петли остается возможным. Именно невысокая частота присоединений НеТ-А и TART элементов в данном случае говорит в пользу того, что конец "спрятан" в D-петле а теломера находится в закрытой копформации. Таким образом, наличие гомологической последовательности является определяющим для образования Т-петли и, соответственно, диктует способ, каким будет происходить удлинение концевых последовательностей. Поэтому в экспериментах с использованием простых терминальных делеций мы наблюдали высокую частоту именно транспозиций НеТ-А и 7МйГэлемеитов. Поскольку теломеры дрозофилы состоят из НеТ-А и TART повторов, возможно, что такой механизм контроля длины теломер посредством конформационных модуляций реализуется и у D.melanogaster.

Хотя для понимания роли НР1 и других теломеросвязывающих белков в контроле длины теломер у D.melanogaster требуется большая степень детализации. На данном этапе, можно утверждать, что, по-видимому, несмотря па очевидные отличия организации и структуры теломерного хроматина у млекопитающих, дрожжей и D.melanogaster, всеми для контроля длины теломер используются сходные базовые механизмы.

Выводы

1. Создана генетическая система на основе локуса yellow для определения коротких

конверсионных трактов.

2. Впервые показано, что белок НР1 - негативный регулятор длины теломер у

D.melanogaster. Мутаций Su(var)2-5 увеличивают частоту присоединений НеТ-А и TART элементов к концу хромосомы с терминальной делецией.

3. Удлинение конца хромосомы на фоне мутаций Su(var)2-5 может происходить

разными способами.

4. Показано, что НР1 репрессирует транскрипцию НеТ-А элементов.

5. Продемонстрировано, что линии D.melanogaster, несущие мутантные аллели

Su(var)2~5, имеют длинные теломеры.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Kahn Т., Savitsky М., Georgiev P. Attachment of НеТ-А sequences to chromosomal

termini in Drosophila melanogaster may occur by different mechanisms. Mol. Cell. Biol., 2000, Vol. 20, No. 20, p. 7634-7642.

2. Георгиев П.Г., Мельникова Л.С., Кап Т.Г., Кравчук О.И., Михайловский С.С.,

Савицкий М.Ю. Различные механизмы регуляции длины теломер. Мол. Биол., 2000, т.34, №5, с.743-752.

3. Savitsky М. , Kravchuk О., Melnikova L., Georgiev P. Heterochromatin protein 1 is

involved in control of telomere elongation in Drosophila melanogaster. Mol. Cell. Biol., 2002, Vol. 22, No.9, p. 3204-3218.

4. Savitsky M.. Kahn Т., Pomerantseva E., Georgiev P. Transvection at the end of

truncated chromosome in Drosophila melanogaster. Genetics, 2003, 163, p. 13731387. Тезисы

1. Georgiev P., Kahn Т., Savitsky M.. Addition of telomere-associated HeT-a

DNAsequenccs to the chromosoma ends may occur either by transposition or by geneconversion in Drosophila melanogaster. 16,h European Drosophila Research Conference, September 29 to October 2, 1999, Zurich, Switzerland., C-09, p.60

2. Georgiev P., Kahn Т., Savitsky M„ Melnikova L.. Addition of telomere-associated

HeT-a DNA sequences to the chromosoma ends may occur by transposition or conversion/recombination in Drosophila. 41s1 Annual Drosophila Research Conference, March 22-26, 2000, Pittsburgh, Pennsylvania, 239A, p. a84

3. Georgiev P., Savitsky M.. Kravchuk O., Melnikova L. Heterochromatin protein 1 is

involved in control of telomere elongation in Drosophila melanogaster. 43s1 Annual Drosophila Research Conference, April 10-14, 2002, San Diego, California, 314A, p. al09.

4. Savitsky M.. Kahn Т., Pomerantseva E., Georgiev P. Transvection at the end of

truncated chromosome in Drosophila melanogaster. International conference "Molecular gcnetics of eucariotes", Moscow, 4-7 February 2003, Russian Academy of Sciences Institute of Gene Biology, p. 30.

Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 393 тираж 100 экз. Подписано в печать 13. 10. 2003 г.