Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль механизма РНК-интерференции в регуляции экспресии теломерных ретротранспозонов Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль механизма РНК-интерференции в регуляции экспресии теломерных ретротранспозонов Drosophila melanogaster"

□03488129

На правах рукописи

ШПИЗ Сергей Григорьевич

Роль механизма РНК-интерференции в регуляции экспрессии теломерных ретротранспозонов 1)го$орМ1а

те1апо§аиШ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о ДЕК 2009

Москва-2009

003488129

Работа выполнена в группе исследования геномных повторов эукариот Учреждения Российской академии наук Институте молекулярной генетики РАН.

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук

Калмыкова Алла Ивановна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Кандидат биологических наук

Георгиева София Георгиевна Дмитриев Сергей Евгеньевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН.

диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгеяьгардта РАН по адресу 119991 Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учереждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан «. /(у> _2009г.

Защита состоится

2009 года в //^часов на заседании

Ученый секретарь Диссертационного Кандидат химических наук

Общая характеристика работы. Актуальность темы.

Известно, что различные пути РНК-интерференции (РНКи) служат защитой от заражения вирусами и от экспансии мобильных элементов в геноме. Формиование теломер дрозофилы с помощью транспозиций специализированных ретротранспозонов является одним из немногих примеров приобретения паразитическими элементами жизненно важной футащи в геноме. Тем не менее, теломерные ретротранспозоны также являются мишенью системы РНКи. Экспрессия ретротранспозонов Drosophila, в том числе и теломерных, находится под контролем особого пути РНКи, работающего в терминальных тканях и связанного с короткими РНК класса Piwi interacting РНК (piPHK), имеющими размер 25-29 нт. и взаимодействующих с особыми белками семейства Аргонавт, относящимися к подсемейству Piwi. Показано, что мутации некоторых компонентов piPHK пути приводят не только к накоплению транскриптов теломерных ретроэлементов в терминальных тканях, но и к удлинению теломер за счет увеличения частоты ретротранспозиций элементов НеТ-А и TART к концу хромосомы (Savitsky et al. 2006).

Механизм РНКи-зависимого сайлснсикга теломерных ретроэлементов, так же как и других ретротранспозонов, остается неизвестным. Биохимический путь, связанный с короткими РНК, может приводить как к постгранскрипционной деградации мРНК, так и к формированию неактивного хроматина в гомологичном локусе, т.е. к транскрипционному сайленсингу. Для дрожжей и растений показано, что короткие РНК в составе белкового комплекса, основным компонентом которого является белок семейства Аргонавт, привлекают гистонметилтрансферазы к гомологичным последовательностям, формируя эпигенетическую метку, характерную для гетерохроматина. У млекопитающих короткие РНК вызывают метилирование промоторов ретротранспозонов. В случае теломерных ретротранспозонов вопрос о механизме сайленсинга наиболее интересен, т.к. ответ на него позволит понять, вносит ли piPHK-зависимый сайленсинг вклад в формирование теломерного хроматина.

Важным вопросом является происхождение антисмысловых транскриптов ретротранспозонов, из которых образуются антисмысловые piPHK, которые по принципу комплементарное™ узнают мРНК мобильных элементов. В этом свете отдельного рассмотрения заслуживает антисмысловая транскрипция ретротранспозонов. Используя теломерные ретротранспозоны и репортерные системы на их основе, мы исследовали такие

вопросы, касающиеся понимания роли РНКи в подавлении экспрессии ретротранспозонов, как механизм подавления их экспрессии в помощью коротких РНК, локализацию и стабильность коротких РНК, а также происхождение антисмысловых транскриптов.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Исследовалась роль РНК-интерференции в регуляции экспрессии теломерных ретротранспозонов в терминальных тканях дрозофилы. Контроль активности мобильных элементов в предшественниках половых клеток особенно важен, т.к. мутации, произошедшие в этих тканях, наследуются и могут приводить к серьезным нарушениям в развитии. Несмотря на то, что теломерные ретротранспозоны выполняют жизненно важную функцию в геноме, количество их транскриптов строго регулируется системой РНК-интерференции. В работе исследовалось поведение эндогенных ретротранспозонов и трансгенных репоргерных конструкций в мутантах по генам РНКи. Показано, что транскрипты теломерных ретротранспозонов накапливаются в терминальных тканях на фоне мутаций компонентов РНКи. Анализ транскриптов теломерных элементов в мутантах по генам РНКи, где их количество увеличено, позволил изучить паттерн их экспрессии. Полученные данные в сочетании с детальной характеристикой недавно открытого теломерного элемента TAIIRE позволили предложить, что именно TAHRE, а не TART, как считалось раньше, является источником ревертазы для перемещения неавтономного элемента НеТ-А - основного компонента теломерной ДНК дрозофилы.

Механизм РНКи использует короткие РНК, комплементарные РНК-мишени, что подчеркивает значимость антисмысловой транскрипции. Мы показали, что мобильный элемент НеТ-А транскрибируется по обеим цепям с внутреннего двунаправленного промотора. Исследование такого двунаправленного промотора представляет собой отдельный интерес с точки зрения понимания механизмов регуляции транскрипции. Впервые показано, что антисмысловые транскрипты, а не только смысловые, являются мишенью коротких РНК. Недавние исследования показали, что огромное число клеточных генов у различных организмов транскрибируются в обе стороны и являются потенциальной мишенью РНКи. Полученные на примере теломерных ретротранспозонов дрозофилы данные о биогенезе некодирующих антисмысловых РНК являются принципиально новыми в понимании роли антисмыслового пула РНК.

Исследование роли РНКи в формировании теломерного гетерохроматина является фундаментальной проблемой и позволит по-новому рассмотреть роль повторяющихся элементов в функционировании теломеры у разных организмов.

Апробация работы.

Результаты, полученные в данной работе, были представлены на семинарах ИМГ РАН, на американских ежегодных конференциях по генетике дрозофилы (США, 2006, 2007), на Кейстоунских симпозиумах, посвященных функциям коротких РНК и РНК сайленсингу (2007, 2009), на конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза» (Москва, 2006), на международном конгрессе по мобильным элементам (Сан-Мало, Франция, 2008).

Структура работы.

Диссертация изложена на _ страницах и включает в себя стандартные разделы:

введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждения, выводы. Диссертация содержит _ рисунков и _ ссылок.

Результаты и обсуждение.

Короткие РНК теломерных ретротранслозонов в мутантах piPHK пути.

У дрозофилы описано несколько путей РНКи, но все эти пути подразумевают образование коротких РНК, комплементарных мишени. Короткие РНК, специфичные для НеТ-А, TART и TAHRE были выявлены ранее в библиотеках коротких РНК яичников мух диких линий (Aravin et al. 2003; Brennecke et al. 2007). Мы исследовали поведение коротких РНК теломерных ретротраспозонов НеТ-А, TARTk TAHRE в мутантах по генам piPHK пути для того, чтобы выявить те компоненты piPHK-зависимого сайленсинга, которые влияют на стабильность коротких РНК, специфичных для теломерных повторов. Проводился Нозерн-анализ РНК, выделенной из яичников гетеро- и гомозигот по генам piwi и aubergine, кодирующими белки семейства Аргонавт, а также гену spn-E, кодирующему РНК-хеликазу, и локусу vasa, содержащему два гена vig и vasa, РНК-связывающий белок и РНК-хеликазу, соответственно. В качестве зондов были использованы однонигевые меченые РНК, синтезированные на высокоспецифичных для данных элементов последовательностях. В качестве контроля нагрузки РНК на дорожку использовалась гибридизация тех же фильтров с олигонуклеотидом, комплементарным микроРНК mirl3b, детектируемой в яичниках. Мутация единственного гена из проанализированных нами, piwi, приводила к снижению количества этой миРНК. Для данного случая была использована гибридизация с олигонуклеотидом, комплементарным 2S РНК, имеющей размер 30 н. Показано, что для всех трех элементов короткие РНК имеют размер 25-29 п., т.е. относятся к классу piPHK. Антисмысловые piPHK теломерных ретроэлементов эффективно детектируются в яичниках природных (Gaianó), лабораторных (у ;сп 'bw'sp') линии и в гетерозиготах исследуемых мутантов. В яичниках гомозигот aub/aub количество piPHK заметно убывает, а в яичниках гомозигот piwi/piwi, vig;vasa/vig;vasa и spn-E/spn-E короткие РНК не детектируются (рис1А). Сходным образом себя ведут смысловые короткие РНК НеТ-А (рис1Б). Исчезновение коротких РНК коррелирует с дерепрессией теломерных ретротранспозонов, что является прямым указанием на роль piPHK в регуляции их экспрессии.

А spn-E aub piwi

с? 1 у § * ■ о \ S? ^ , tf i V € V $ v

TART (p 4 ' i

mirl3b Ш <m л. - m -

2s Шш

НеТ-А Щ Щ

mirBb « • «- - •

2S фф

ТАПКИ -25n I

mirl3b • » «

-25ш

,-25ш

HeT-A piPHK

AS S

spn-E mir-l3h piwi 2S | aub mir-Hb •

-25ii r

-25HT

-25n i

g HeT-A piRNAs

antisi'iisc sense

Я Ц Я Ц

Рис 1. Эффект мутаций генов spn-E, aub, piwi, vig на количество коротких РНК HeT-A, TART и TAHRE в яичниках Drosophila. A Nothern анализ РНК полученной из яичников мух линий Gaiano,

spn-E' /+, spnE'/spn-E"i39sy (-/-).,aub0042/*, aub^42/ aub ш (-/-), у';cn'bw'sp', piwi1 /+, piw?/piwi3(-/-), vig®Psi2/+, vijf?sn/vasFH,6i (-/-). Гибридизация со смысловой рибопробой выявила короткие РНК НеТ-А, TART и TAHRE длиной 25-29 нуклеотидов в линиях Gaiano и у ;cn'bw'sp' и в гегерозиготах описанных мутаций. Их количество снижено в трансгетерозиготе aub, в трансгетерозиготах короткие РНК HeT-A, TART и TAHRE не детектируются. Б Сравнение эфекта мутации spn-E на количество коротких РНК НеТ-А разных полярностей. На нижних панелях представлена гибридизация с меченными олигонуклеотидами, комплементарными miPHK mir-13b и рибоеомной 2S РНК. В Короткие РНК НеТ-А разных полярностей в ядерной(Я) и цитоплазматической(Ц) фракциях яичников Drosophila melanogaster.

А

aub/+ spn-E/+ pi\vi/+ vig/+

b/aub spn-E/spn-E ^^

aub/aub spn-E/spn-E ^^ piwi/piwi vijj/viy

/

*

' Л»»'

i

в

TART

HeT-A

W

TAHRE

♦ ..#

t Л

■С -о i о О

Рис 2. Гены piPHK пути подавляют экспрессию TAHRE в яичниках Drosophiia. A In situ РНК гибридизация антисмыслового однонитивого зонда TAHRE с яичниками мух aub00'2/*, aub^42/ aub ш,*рП-Е' /+, spnE'/spn-EJ*3987, piw,2 /+, piwf/piwi3, vigEPS,2/+, vig"™2/va/H16" . Транскрипты TAHRE детектируются в цитоплазме питающих клеток и развивающемся ооците (показано стрелками) в яичниках трансгетерозигот«ри£'/£рт-£АЫ!М7, piwf/piwi3, vigEP8'2/vasm"*° и цитоплазме питающих клеток в aubер42/ aub ш. Б Распределение транскриптов HeT-A, TART и TAHRE в яичниках мух piwi2/piwt3 . Транс1фипты НеТ-А и TAHRE демонстрируют одинаковый патерн распределения. Стрелками обозначено накопление транскрипта TAHRE в развивающемся ооците. С RT-PCR анализ РНК из яичников мух линий аиЪ8°"/+, aub®242/ aub m,spn-E' /+, spnE'/spn-B^39S7, ры>12/+, piwf/ptwi3, vigEPSJ2/+, vigEPSnhas""m. Сигнал, полученный с использованием праймеров, специфичных для ретротранспозона TAHRE, нормирован на сигнал, соответствующий экспрессии конститутивно экепресирующегося гена гр49 . За единицу принято отношение количества амплифицированных продуктов TAHRE и гр49 в гетерозиготе.

Регуляция экспрессии TAHRE в мутантах piPHK пути.

Элемент TAHRE был открыт in silico в результате анализа секвенированного генома D. melanogasíer (Abad et al. 2004). Экспрессия теломерного элемента TAHRE исследовалась в яичниках мух, мутантных по генам piwi, aub, spn-E и локусу vasa методом in situ РНК гибридизации и RT-PCR. Показано, что эти мутации приводят к увеличению экспрессии TAHRE более чем на порядок в яичниках гомозиготных самок (рис 2В). На фоне мутаций генов spn-E, piwi и локуса vasa смысловые транскипты TAHRE накапливаются в районе ооцига, начиная с ранних стадий оогенеза, а также в цитоплазме питающих клеток. Мы сравнили клеточную локализацию транскриптов всех трех теломерных рстротранспозонов в яичниках у мутантов piwi (рис 2Б) и показали сходство в паттерне распределения транскриптов НсТ-А и TAHRE. Транскрипты ретроэлемента TART обнаруживаются только на поздних стадиях оогенеза в цитоплазме питающих клеток, а смысловые транскипты НеТ-А и TAHRE накапливаются в районе ооцита, начиная с ранних стадий, а также в цитоплазме питающих клеток. Нозерн-анализ выявил, что в яичниках присутствуют короткие РНК, специфичные для TAHRE, их размер 25-29 н. и они не детектируются в мутантах spn-E (рис 1А). Эти данные подтверждают, что механизм РНКи участвует в регуляции экспрессии третьего теломерного элемента дрозофилы - TAHRE.

Элемент НеТ-А является неавтономным, т.к. не содержит ОРС, кодирующего ревертазу, в то время как элементы TART и TAHRE кодируют ревертазу, необходимую для процесса транспозиции. Считается, что ревертазную активность НеТ-А заимствует in trans, возможно, в транспозиции НеТ-А участвует ревертаза TART или TAHRE. Однако паттерн распределения смысловых транскриптов НеТ-А и TART в яичниках мутантных мух резко различается. Совпадение клеточной локализации транскриптов автономного элемента TAHRE и неавтономного элемента НеТ-А позволяет предположить, что TAHRE может служить источником обратной транскриптазы для перемещений ретротранспозона НеТ-А -основного компонента теломерной ДНК у дрозофилы.

Экспрессия репортерных генов, находящихся под промотором ретротрапспозона НеТ-А, находится под контролем р!РНК пути.

В качестве одного из подходов к исследованию механизма РНКи-зависимого сайленсинга теломерных ретротранспозонов были исследованы репортерные системы, в которых гены-репортеры экспрессировались под контролем промотора НеТ-А. В первом случае в качестве такой репортерной системы были использованы линии с присоединениями теломерных элементов к терминально-делетированной X хромосоме, разрыв в которой произошел в районе тепа yellow (рис 3). В этих линиях исследовалась экспрессия гена yellow, находящегося под контролем НеТ-А или TART, в мутантах по генам РНКи. Такую репортерную систему можно считать эндогенной, т.к. известно, что терминальноделетированные хромосомы, так же как и нормальные, подвергаются процессу «кэпирования», т.е. на их конце формируется белковый комплекс, характерный для теломер, как было показано на политенных хромосомах слюнных желез (Fanti et al. 1998). Методом иммуноокрашивания и ДНК FISH (fluorescence in situ hybridization) мы показали, что на конце терминальноделетированной хромосомы, так же как и на теломерах нормальных хромосом, в питающих клетках яичников локализуется основной белок «кэпа», НР1 (рис ЗБ).

В тех линиях, где произошли присоединения НеТ-А (рис ЗВ, линии zh24, zh25, Gi24) или TART (рис ЗВ, линии hl, рбЗ, zh70 ), но ген yellow экспрессируется с собственного промотора, изменений в количестве транскрипта yellow на фоне мутации РНКи гена spn-E не происходит. Это указывает на то, что даже если и происходит формирование неактивного хроматина РНКи-зависимым способом на последовательностях TART и НеТ-А, как это

N

описано для центромеры дрожжей (Volpe et al. 2002), то распространения его на соседний промотор не происходит, даже в случае присоединений НеТ-А, промотор которого расположен в 3'части элемента и расстояние между промоторами НеТ-А и yellow меньше 200 по. В тех линиях, где присоединения НеТ-А к гену yellow произошли уже после концевой деградации промотора yellow, ген yellow находится под контролем промотора НеТ-А, находящегося в 3' области. Экспрессия теш yellow в таких линиях меняется на фоне мутаций РНКи генов spn-E, aub, и локуса vasa (рис ЗГ). С помощью 5' RACE анализа было показано, что транскрипция гена yellow начинается в З'части НеТ-А. Выявлено два старта транскрипции, -30 и -95 п.н. перед сайтом полиаденилирования НеТ-А, при этом положение -30 является основным стартом. Т.о., часть ретротранспозона НеТ-А (30-95 нуклеотидов) входящая в состав слитного транскрипта HeT-A-yellow, ответственна за то, что данный транскрипт становится мишенью РНКи. Вероятно, имеет место поспранскрипционный

механизм деградации слитного транскрипта. Ген yellow содержит интрон, что делает возможным исследовать количество как сплайсированных так и несплайсированных транскриптов HeT-A-yellow (рис ЗГ). Представленность несплайсированного транскрипга косвенно отражает уровень транскрипции, т.к. сплайсинг происходит ко-транскрипционно. Если количество сплайсированного слитного транскрипта HeT-A/yellow увеличивается на фоне мутаций РНКи генов spn-E, aub и локуса vasa, то количество несплайсированного транскрипта не меняется. Эти данные предполагают постгранскрипционный механизм деградации слитного транскрипта HeT-A/yellow, хотя мы не можем полностью исключить то, что компоненты «кэпирующего» или транскрипционного комплекса, собирающегося на промоторе НеТ-А, могут участвовать в транскрипционном механизме регуляции экспрессии HeT-A-yellow.

В

Ai

DAPI уе11оп(ДНК)

k yCZZ

.i" down

TIRT

z г к

U i

п.уг

HIM наложение

Ш-у in I ui/h viji hiч

yeltmv

Рис 3. Экспрессия гена yellow, находящегося под промотором НеТ-А, находится под контролем piPHK пути. А Принцип использования терминально делегированной хромосомы как маркера присоединений теломерных элементов к концу хромосомы. Тонкая стрелка - старт транскрипции. Кругом обозначен кэпирующий теломерный комплекс. Толстая стрелка -присоединившийся теломерный мобильный элемент. Б Имуноокрашивание основного белка «кэпа», НР1, выявляет его на конце терминальноделетированной хромосомы . ДНК FISH анализ яичников мух с присоединением НеТ-А к терминальноделетированной хромосоме с зондом yellow (зеленый) в сочетании с иммуиоокрашиванием на белок НР1(красный). Синим показано окрашивание DAPI. В Схема присоединения мобильных элементов к терминальной делеции в районе гена yellow (верхняя панель) Ген yellow обозначен желтым. Толстые синяя и красная стрелки обозначают мобильные элементы TART и НеТ-А соответственно Угловые стрелки обозначают старты транскрипции. Горизонтальные прямые стрелки показывют участки отжига праймеров для ПЦР. Варианты присоединений теломерных ретротранспозонов к терминальноделетированной хромосоме (нижняя панель). Вертикальными стрелками показаны места присоединений мобильных элементов: сверху -TART (голубыми стрелками) перед промотором гена yellow , снизу - НеТ-А (красными). Цифрами указаны расстояния от места присоединения относительно старта транскрипции гена yellow. Зеленым показана промоторная область гена yellow. Г RT-ПЦР анализ слитного транскрипта НеТ-А-yellow в яичниках мух линии z2 несущих мутации аиУ^42/+, aubвС42/ aub , vigs™2/+, vigBrsl2/vasrH"i" .spn-E1 /+, spnEf/spn- . Вверху изображена схемыа присоединения в линии z2. Желтыми прямоугольниками обозначены экзоны гена yellow, тонкой черной линией - интрон. Толстой стрелкой показан присоединвшийся элемент НеТ-А. Угловая стрелка соответствует старту транскрипции. Прямые стрелки показывют участки отжига праймеров для ПЦР. Левая панель -сигнал, полученный с использованием праймеров, специфичных для сплайсированного транскрипта ffeT-A-yellow, нормирован на сигнал, соответствующий экспрессии конститутивно экспресирующегося гена гр49 . За единицу принято отношение количества амплифицированных продуктов HeT-A-yellow и гр49 в гетерозиготе.Правая панель - сигнал, полученный с использованием праймеров, специфичных для несплайсированного транскрипта HeT-A-yellow. На рисунке приведен автограф полуколичественного RT-ПЦР анализа. Верхняя панель соответствует сигналу ПЦР HeT-A-yellow, нижняя - сигналу ПЦР для несплайсированного гр49.

Интересным является вопрос о том, важна ли для системы РНКи локализация теломерного ретроэлемента в теломерной области, другими словами, насколько важно хроматиновое окружение. Для ответа на этот вопрос мы исследовали экспрессию репоргерного гена 1ас2, находящегося под промотором элемента НеТ-А в составе трансгенной конструкции, расположенной в эухроматиновых сайтах, в мутантах по генам Р1РНК пути. Для нескольких независимых линий, содержащих вставку трансгена на разных хромосомах, показано, что репортерный ген активируется в яичниках мутантов по генам рШ и 5рп-Е (Рис 4). Интересно то, что промотор НеТ-А вне теломерного окружения, демонстрирует паттерн экспрессии, схожий с таковым для эндогенных теломерных копий. Например, одна доза мутантного гена рШ приводит к экспрессии НеТ-А в гермариуме яичника, где также детектируется репортерный белок р-галактозидаза.

X-Kal окрашивание яичников iu мух несущих ipaiicieiiiiMii конструкт НеТ-ЛЛасУ.

НеТ-А Б-

+/+

I 434 bp •

+lspn-E

лpn-E/spn-E

В

О

S 2

ta

X

а.

I

+/- -/-Н95

+/- -/-Н124

+/- -/-Н12

Рис 4. Экспрессия трансгенной конструкции HeT-A-lacZ находится под контролем piPHK пути.

А Схема трансгенной конструкции, полученной на основе вектора pCaSpeR-AUG-P-gal и содержащей промоторную 3' область НвТ-А. Угловыми стрелками обозначен старт транскрипции. Б Окрашивание яичников на активность Р-галакгозидазы с помощью X-gal в spn-E мутантах. В Эфект мутации гена spn-E на экспрессию слитного транскрипта НеТ-АЛас-Z в линиях с инсерцией трансгена HeT-A/lac-Z в эухроматиновые участки X (Н12) и 2R(H124, Н95) хромосом. Верхняя панель. Количественное измерение активности р-галактозидазы в лизате яичников мух spn-E1 /+ (+/-), spnE'/spn-Ьнормированное на количество белка, определенного по методу Брэдфорда. За единицу принята активность р-галактозидазы в гетерозиготе. Нижняя панель. RT-PCR анализ РНК из яичников мух spn-E1 /+, spnE1/spn-Ii^3957. Сигнал, полученный с использованием праймеров, специфичных для lac-Z, нормирован на сигнал, соответствующий экспрессии конститутивно экспресирующегося гена гр49 . За единицу принято отношение количества амплифицированных продуктов lac-Z и гр49 в гетерозиготе.

Мы показали, что количество белка bgal и РНК слитного транскрипта HeT-A-lacZ, меняется примерно в одинаковой степени в яичниках у мутантов spn-E( Рис4В). Т.о., эухроматиновое окружение трансгена не мешает считываемым с него транскриптам подвергаться piPHK-зависимому сайленсингу. С помощью метода 5' RACE (rapid amplification of cDNA ends) показано, что основной старт транскрипции в трансгенных конструкциях находится в положении -30 пар нуклеотидов от конца фрагмента НеТ-А. Таким образом, 30 п.н. последовательности НеТ-А достаточного для того, чтобы транскрипт, считываемый с трансгенной конструкции, был мишенью piPHK пути. В данном случае мы опять же не исключаем, что компоненты транскрипционного комплекса, собирающегося на промоторе НеТ-А, могут участвовать в piPHK-зависимом сайленсинге трансгена.

А В

р»а! активность 100%

тлиншнп 1. 15,8 s 0.7%

guiu .Mucai \u\\

П1М |)01l

«1)

"-ууу-7<l)

spn-E/xpn-E I pA

TAR Tits

в® itft

~VW—VV

4(3)

rP49

Рис 5. Характеристика антисмысловых трапскриптов НеТ-А и TART. А Определение старта антисмысловой транскрипции НеТ-Л с помощью 5' RACE. Схематически представлен ретротрапепозон НеТ-А; позиции старта смысловой, антисмысловой транскрипции и сайта полиаденилирования обозначены в соответствии с последовательностью клона DMU6920, представленном в GenBank. Верхняя строка сиквенса представляет собой фрагмент из этого клона, нижняя - фрагмент элемента НеТ-А z2, клонированного в составе репортерной конструкции. Точками обозначены сайты инициации транскрипции, выявленные с помощью 5' RACE для эндогенных копий (верхняя строка) и для конструкции НеТА-as в экспериментах по трансфекции культуры клеток. Б Антисмысловые транскрипты НеТ-А содержат множественные интроны. Структура антисмысловых трапскриптов определена на основании анализа последовательностей 5' RACE клопов. Фрагмент теломерного клона АС010841, содержащий стык двух копий НеТ-А ( обозначены черной и серой стрелкой), представляет последовательности эндогенных НеТ-А. Короткими стрелками обозначены праймеры, использованные для 5' RACE. Варианты сплайсинга показаны стрелками со схематически обозначенными нитронами и пронумерованы слева(1-5) и справа(б-9); цифры в скобках обозначают количество независимо проанализированных клонов с такой схемой сплайсинга. Цифрами сверху обозначены координаты первых и последних букв нитронов в соответствии с последовательностью клона АС010841, а также координата стыка двух копий НеТ-А -обозиачина жирным. В Антисмысловая промоторная активность 3' области НеТ-А, определенная в результате экспериментов по трансфекции культуры клеток дрозофилы Schneider2. Конструкции HeT-A-s и HeT-A-as содержат фрагмент 3' области НеТ-Л в прямой и обратной ориентации, соответственно, заклонированный в вектор pCaSpeR-AUG-[!-gal. Ферментативная активность Р-галактозидазы для HeT-A-as выражена как % от таковой для HeTA-s. Старты транскрипции обозначены короткими стрелками. Транскрипт HeT-A/lacZ обозначен длинной стрелкой с указанием позиции нитрона. Сиквенс отражает экзон-шпроннуга структуру НеТ-А в составе конструкции, определенную в результате секвенирования продуктов 5' RACE (последовательность экзонов и интрона обозначена большими и малыми буквами, соответственно, консервативные последовательности на границах интрона обозначены жирным шрифтом).Г Антисмысловые транскрипты TART полиадснилированы. Нозерн-анализ тотальной РНК (Т) и поли-А РНК (рА) из яичников мух spn-E/spn-E с использованием зонда, детектирующего антисмысловые транскрипты TART.. Гибридизация с транскриптами гр49 служит в качестве контроля нагрузки.

Картирование антисмыслового промотора НеТ-А н характеристика антисмысловых трапскриптов теломермых регротранспозопои Drosophila.

Источником антисмысловых коротких РНК, с помощью которых осуществляется регуляция экспрессии смысловых транскриптов, служат антисмысловые транскрипты. Изучение транскриптомов разных организмов выявило необычайно высокий процент генов, транскрибирующихся двунаправлено. Предполагается, что активность этих генов находится под контролем системы РНКи. Однако, метаболизм антисмысловых транскриптов не изучен. Что касается мобильных элементов, происхождение их антисмысловых транскриптов во многих случаях неясно. Например, только для некоторых ретротранспозоков были выявлены внутренние антисмысловые промоторы. Это И-элемент и гшсгор1а у ОгозорИНа, а также Ы у человека. Теломерный ретротранспозон дрозофилы ТАЯТ также обладает двунаправленной экспрессией. Попытки выявить антисмысловые транскрипты ретроэлемента НеТ-А до сих пор были безуспешными, хотя антисмысловые короткие РНК НеТ-А детектируются в библиотеках коротких РНК у ОгозорШа. Нозерн-блот анализ был применен для исследования смысловых и антисмысловых р1РНК НеТ-А в яичниках у мутантов р1РНК пути.

piPHK обеих полярностей выявляются в яичниках гетерозигот spn-E/+, piwi/+, aub/+, в то время как и те и другие piPHK отсутствуют в яичниках гомозигот spn-E/spn-E и piwi/piwi (рис 1 Б). В яичниках aub/aub количество piPHK снижено. В данном опыте использовался зонд, соответствующий 3' концу НеТ-А, где расположен его прямой промотор. Т.к. этот зонд эффективно выявляет антисмысловые piPHK НеТ-А, было предположено, что экспрессия антисмысловых транскриптов НеТ-А осуществляется с промотора, расположенного в 3' области элемента или в прилегающей последовательности. Например, фрагменты теломерных ретротранспозонов выявляются в прицентромерном гетерохроматине, где они могут транскрибироваться с прилегающих промоторов. Для определения старта антисмысловой транскрипции НеТ-А в яичниках был применен метод 5' RACE (rapid amplification of cDNA ends) с использованием праймеров, специфичных к 3' области НеТ-А (рис 5 А, Б). РНК выделялась из яичников линии D. melanogasier у'; en' bw' sp', использованной для секвенирования генома, что облегчило анализ последовательностей 5'RACE продуктов. В результате секвенирования 25 5' RACE клонов было обнаружено, что антисмысловая транскрипция НеТ-А инициируется в районе, расположенном на 190 п.н. раньше, чем старт смысловой транскрипции. Несмотря на наличие гетерогенности в сайтах инициации антисмысловой транскрипции, есть наиболее часто встречающиеся положения (рис 6 А). Секвенирование полученных клонов показывает, что антисмысловые транскрипты образуются с различных полиморфных копий НеТ-А. Выявлены также транскрипты, начинающиеся в укороченной копии НеТ-А и продолжающиеся в следующую копию, причем последовательности таких клонов четко соответствуют теломерному району 4 хромосомы. Это говорит о том, что в образовании антисмысловых транскриптов принимают участие теломерные копии НеТ-А. Антисмысловые транскрипты НеТ-А содержат множественные интроны; для большинства интронов выявлено соответствие консервативным последовательностям сайтов сплайсинга. В различных копиях НеТ-А используются альтернативные пути сплайсинга. Протяженных ОРС в этих транскриптах не выявлено. Ранее было показано, что антисмысловые транскрипты теломерного ретротранспозона TART также сплайсируются (Maxwell et al. 2006). Роль сплайсинга в некодирующих транскриптах ретроэлементов остается загадкой. Важнейшей модификацией транскриптов, синтезированных второй РНК-полимеразой является полиаденилирование. Чтобы понять полиаденилируются антисмысловые транскрипты теломерных элементов Дрозофилы или нет мы провели сравнительный Нозерн-анализ тотальной и полиаденилированной РНК из яичников Дроофилы. Мы показали, что антисмысловые транскрипты TART полиаденилированы (Рис 5 Г). Антисмысловые транскрипты НеТ-А при помощи Нозерн-анализа детектировать не удалось. Однако кДНК (ВТ015972) из базы

GenBank, соответствующая антисмысловой FHK НеТ-А, содержала поли-А тракт, что может указывать на возможность ее полиаденилирования.

Промоторная активность 3' области НеТ-А была исследована в экспериментах по трансфекции культуры клеток. Для этого фрагмент НеТ-А размером 434 п.н., расположенный перед сайтом полиаденилирования, был заклонирован в прямой и обратной ориентациях в вектор, содержащий репортерный ген lacZ (конструкции HeT-As и HeT-Aas). Активность антисмысловой конструкции составила около 15% от активности смысловой конструкции (рис 5В).Для определения старта транскрипции конструкции HeT-Aas был проведен также 5'RACE анализ. Показано, что старт антисмысловой транскрипции НеТ-А для этой конструкции совпал с таковым, определенным для эндогенных копий (рис 5А). Более того, транскрипт, считываемый с конструкции HeT-Aas, также как и эндогенные транскрипты, подвергался сплайсингу (рис 5В). Т.о., НеТ-А обладает двунаправленным промотором, расположенном в его 3' области. Исследование такого двунаправленного промотора представляет собой отдельный интерес с точки зрения понимания механизмов регуляции транскрипции.

Анализ антисмысловой экспрессии теломериых ретротранспозонов.

Исследования роли РНКи в сайленсинге ретротранспозонов в основном фокусируется на поведении смысловых кодирующих транскриптов, являющихся интермедиатами транспозиций в геноме. Однако, смысловые короткие РНК также присутствуют в клетке (рис 1Б), что ставит вопрос о том, не являются ли длинные антисмысловые транскрипты ретротранспозонов также мишенью системы РНКи. Поведение антисмысловых транскриптов НеТ-А и TART исследовалось с помощью метода РНК in situ гибридизации однонитевых зондов с яичниками мутантов piPHK пути. Антисмысловые транскрипты теломерных ретротранспозонов накапливаются в виде дискретных точек в ядрах питающих клеток мух spn-E/spn-E (рис 6). Показано также накопление антисмысловых транскриптов TART в ядрах питающих клеток у мутантов по гену аиЬ и локусу vasa. Эти данные указывают на то, что piPHK путь участвует в регуляции экспрессии антисмысловых транскриптов регроэлементов. Интересен тот факт, что смысловые транскрипты НеТ-А и TART накапливаются не только в цитоплазме герминальных клеток, но и в ядрах (рис 6В,Г). Накопление как смысловых, так и антисмысловых транскриптов ретротранспозонов в ядрах у мутантов по piPHK пути указывает на то, что этот путь работает не только в цитоплазме, но и в ядре. Это подтверждает также тот факт, что короткие РНК соответствующие мобильному элементу НеТ-А детектируются в ядерной фракции, (рис.1 В).

НеТ-А (AS)

+/- -/-

y «

é»

^ NC

//

j л t

д

Б TART {KS)

В НеТ-А (S) +/- -/-

Г TART (S)

+/- -/-

E

Hl'/'-KS) /Л'"/1.-! lASI

ufi

T I

Î:iâ7(SI

tel

,.: H

Рис 6. Литисмысловыс траискрипты теломерных рстроэлсмептов. Антисмыслоаыс РНК 11еТ-Л (А) и TART (Б) накапливаются в ядрах питающих клеток (пс) у гомозиготных мутантов spn-Е (-/-) (обозначено стрелками). In situ РНК гибридизация в использованием однонитевых смысловых зондов и антител, коныогированных со щелочной фосфатазой (верхняя панель) или родамином (нижняя панель). Смысловые РНК НеТ-А (В) и TART (Г) накапливаются в ядрах питающих клеток (пс) у гомозиготных мутантов spn-E (-/-) (обозначено стрелками) Д Антисмысловыс транскрипты TART (зеленый) колокализуются с ДНК зондом НеТ-А (красный), детектирующим теломеру. ДНК окрашена DAPI. Е Сравнение количества смысловых (s) и антисмысловых (as) транскриптов НеТ-А и TART в тотальной РНК (Т), цитоплазматической (Ц) и ядерной (Я) фракциях яичников spn-E/+ (+/-) и spn-E/spn-E (-/-) с помощью RT-PCR с использованием цепь-специфичных праймеров. Высота столбцов гистограммы отражает отношение количества транскриптов ретротранспозонов HeT-A/TART к количеству транскриптов конститутивного гена гр49 в яичниках мух spn-E/spn-E (-/-), нормированное на таковое соотношение для муx.spn-E/+ (+/-).

Методом RT-PCR анализа было проведено сравнение количества смысловых и антисмысловых транскриптов НеТ-А и TART в цитоплазматической и ядерной фракциях яичников мутантов spn-E (рис 6Е). Накопление антисмысловых транскриптов НеТ-А и TART в ядерной фракции яичников мутантов spn-E/spn-E подтверждает данные, полученные с помощью РНК in situ гибридизации. Видна заметная разница в поведении смысловых и антисмысловых транскриптов. Смысловые транскрипты накапливаются в большей степени в цитоплазме, чем в ядре, в то время как накопление антисмысловых транскриптов происходит в основном в ядрах. Можно предположить, что некодирующие антисмысловые транскрипты способны выходить в цитоплазму, где они являются мишенью деградационной машины, распознающей аберрантные транскрипты, NMD (nonsense codon mediated decay).

Итак, показано, что эндогенные длинные антисмысловые транскрипты ретротранспозонов, так же как и смысловые, являются мишенями механизма сайленсинга с участием piPHK. Длинные транскрипты необходимы для образования коротких РНК обеих полярностей, которые, в свою очередь, контролируют количество этих транскриптов. Такое сложное взаимодействие с участием piPILK обеспечивает регуляцию экспрессии ретротранспозонов в терминальных тканях.

Нас заинтересовал характер накопления транскриптов НеТ-А и TART в ядре в виде дискретных точек. Сочетание методов РНК FISH и ДНК FISH показывает, что сигнал от РНК гибридизации яичников гомозиготы spn-E с антисмысловыми транскриптами TART колокализуется с сигналом от окрашивания теломерной ДНК зондом к НеТ-А (рис 6Д). Накопление транскриптов теломерных элементов вблизи их геномного локуса, соответствующего теломере, указывает на то, что регуляция экспрессии в ядре с помощью коротких РНК может происходить на транскрипционном или ко-транскрипционном уровне, однако, хроматиновые компоненты этого пути пока остаются неизвестными. Эти данные указывают на то, что регуляция экспрессии теломерных ретроэлементов в ядре с помощью коротких РНК происходит на транскрипционном или ко-транскрипционном уровне, однако,

хроматиновые компоненты этого пути пока остаются неизвестными. По-видимому, если говорить о механизме р1Р1Ж-зависимого сайленсинга ретротранспозонов, важны оба пути, как пост-транскрипционный, работающий на уровне деградации мишени, так и транскрипционный, работающий на уровне изменения структуры хроматина.

Выводы:

1. Теломерный ретротранспозон TAHRE является мишенью РНКи в яичниках дрозофилы. Его транскрипты накапливаются в яичниках мутантов по генам spn-E, piwi, aub и локусу vasa, что коррелирует с исчезновением специфичных для него piPHK.

2. Как смысловые, так и антисмысловые короткие РНК теломерных ретротранспозонов исчезают в яичниках мутантов piPHK пути.

3. Экспрессия репортерных генов, экспрессирующихся под промотором теломерного элемента НеТ-А, находится под контролем piPHK пути независимо от положения репортерных конструкций в геноме.

4. Антисмысловой промотор теломерного элемента НеТ-А картирован в 3' области элемента вблизи смыслового промотора.

5. Антисмысловые транскрипты теломерных ретроэлементов НеТ-А и ТАКТ, так же как и смысловые транскрипты являются мишенями РНКи.

6. Смысловые и антисмысловые транскрипты НеТ-А и TART накапливаются в ядрах терминальных клеток у мутантов по генам РНКи в области теломеры, следовательно piPHK путь работает в ядре и, возможно, на транскрипционном уровне.

Публикации:

1. С.Г.Шпиз, А.И.Калмыкова Структура тсломсрного хроматина у Drosophila. Биохимия 70: 759-773,2007.

2. S. Shpiz, D. Kwon, A. Uneva, М, Kim, М. Kleiiov, Y. Rozovsky, P. Gcorgiev, M. Savitsky, A. Kalmykova Characterization of Drosophila telomeric retroelement TAIIRE: transcription, transpositions and RNAi-based regulation of expression. Mol. Biol. Evol. 24: 2535 - 2545,2007.

3. S. Shpiz, D. Kwon, Y. Rozovsky, A. Kalmykova: rasiRNA pathway controls antisense expression of Drosophila telomeric rctrotransposons in the nucleus. Nucleic Acids Res. 37:268278,2009.

4. S. Shpiz, A. Kalmykova: Epigenetic transmission of piRNAs through the female germline. Genome BioL 10:208. 2009.

Презентации:

1. M.Savitsky, D. Kwon, S.Shpiz, P.Georgiev, A.Kalmykova, V. Gvozdev. Telomere maintenance is under control of the RNAi-based mechanism in the Drosophila germline. 47th annual Drosophila research conference, Houston, Texas, USA, March 29-April 2,2006.

2. А.Калмыкова, Савицкий M., С.Шпиз, Д. Квон. Роль механизма РНК-интерференции в поддержании теломер дрозофилы.Копференция «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза», посвященная памяти А.А. Нейфаха, Москва, 15-16 мая 2006 г.

3. S.Shpiz, D.Kwon, M.Savitsky, A.Kalmykova. " RNAi in the functioning of Drosophila telomeres".Keystone symposia "MicroRNAs and siRNAs: biological functions and mechanisms", Keystone Colorado, January 28- February 2,2007. (Доклад - докладчик Шпиз С.)

4. A.Uneva, S.Shpiz, M.Kim, D. Kwon, A. Kalmykova, M. Savitsky. Drosophila retroelement TAHRE transposes to telomere. 48th annual Drosophila research conference, Philadelphia, Pennsylvania, USA, March 7-11,2007.

5. A. Kalmykova, S. Shpiz, Y. Abramov, D. Kwon, Y. Rozovsky. RNA silencing and Drosophila telomeres.International congress on transposable elements, Saint-malo, France, April 20-23,2008.

6. S. Shpiz, Y. Abramov, D. Kwon, A. Kalmykova. Mechanism of the rasiRNA - mediated silencing of telomeric retrotranspozon HeT-A.International congress on transposable elements, Saint-malo, France, April 20-23,2008.

7. S. Shpiz, E. Peskova, Y. Rozovsky, A. Kalmykova. "piRNAs control antisense expression of Drosophila retroelements in the nucleus." Keystone symposia "The biology of RNA silencing", Victoria, British Columbia, Canada. April 25-30,2009

Подписано в печать 29.10.2009 г. Печать на ризографе. Тираж 100 экз. Заказ № 2037. Объем 1,3 п.л. Отпечатано в типографии ООО "Алфавит 2000", ИНН: 7718532212, г. Москва, ул. Маросейка, д. 6/8, стр. 1, т. 623-08-10, www.alfavit2000.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шпиз, Сергей Григорьевич

Содержание

Введение

Список сокращений

Обзор литературы

Структурно-функциональная организация теломер Drosophila

Структура теломерных ретротранспозонов

Регуляция длины и поддержание структуры теломер Drosophila

Механизмы РНК интерференции

Dicer, Drosha и их белки-помощники

Семейство белков Argonaute

Роль РНК-хеликаз в РНК-интерференции

Другие РНК-связывающие белки в составе RISC

Механизм образования piPHK

Материалы и методы

Лабораторные линии Drosophila и линии культур клеток, использованные в работе

Выделение геномной ДНК

Выделение РНК

Полуколичественный RT-PCR

РНК in situ гибридизация

Нозерн-блот анализ тотальной РНК Drosophila melanogaster

Нозерн-блот анализ коротких РНК Drosophila melanogaster

Сочетание методов РНК, ДНК FISH и иммуноокрашивания

Стандартные генно-инженерные методики

5' RACE (rapid amplification of cDNA ends) анализ

Клонирование промоторной области ретротранспозона НеТ-А для измерения ее активности

Трансфекция культуры клеток Drosophila и количественное определение активности галактозидазы

Вестерн-анализ

Получение экспрессирующих конструкций и конструкций для Р-элементной трансформации

Окрашивание тканей на Р-галактозидазу. Количественное определение активности [3-галактозидазы

Результаты

Короткие РНК теломерных ретротранспозонов в мутантах piPHK пути

Регуляция экспрессии TAHRE в мутантах piPHK пути

Исследование экспрессии гена гена-репортера, находящегося под контролем НеТ-Л и TART элементов

Экспрессия репортерного гена yellow, находящегося под промотором НеТ-А и расположенного в области теломеры, контролируется генами piPHK пути

Экспрессия репортерного гена lacZ, находящегося под промотором НеТ-А и расположенного в эухроматине, контролируется генами piPHK пути

Антисмысловая транскрипция теломерных ретротранспозонов Drosophila

Картирование антисмыслового промотора НеТ-А

3' область НеТ-А обладает промоторной активностью в антисмысловом направлении

Анализ антисмысловой экспрессии теломерных ретротранспозонов

Особенности локализации транскриптов НеТ-А и TART в ядре

Обсуждение

Выводы