Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль системы РНК-интерференции в регуляции длины теломер Drosophila

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль системы РНК-интерференции в регуляции длины теломер Drosophila"

На правах рукописи

КВОН ДМИТРИИ АРКАДЬЕВИЧ

РОЛЬ СИСТЕМЫ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ В РЕГУЛЯЦИИ ДЛИНЫ ТЕЛОМЕР тюзорннл

03.00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 0К1

Москва 2008

003448307

Работа была выполнена в Институте молекулярной генетики РАН

Научны« руководитель: Кандидат биологических наук Научный консультант:

Доктор биологических наук профессор

Калмыкова Алла Ивановна,

Гвоздев Владимир Алексеевич,

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Муха Дмитрий Владимирович,

Кандидат биологических наук Головнин Антон Клеменсович,

Ведущая организация. Институт молекулярной биологии РАН им В А Энгельгардта

Защита состоится 008 года в часов на заседании диссертационного

совета Д 501.001.76 по защите кандидатских и докторских диссертаций при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу 119992, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им А Н. Белозерского, ауд 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В Ломоносова

Автореферат разослан

2008г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Кандидат биологических наук Крашенинников И.А.

0К1ЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Теломеры представляют собой нукпеопротеиновый комплекс на концах линейных хромосом. Одной из функций теломерной ДНК является компенсация деградации концевой последовательности, являющейся следствием процесса концевой недорепликации ДНК В 1971 году нашим соотечественником А. Оловниковым впервые была сформулирована проблема потери ДНК на концах линейных хромосом, или «проблема концевой недорепликации», и предположена защитная, буферная роль теломерной ДНК (Оловников 1971). Потеря ДНК на конце хромосомы является следствием того, что ДНК-полимераза не может полностью реплицировать концевую последовательность, в результате чего линейная хромосома укорачивается при каждом цикле репликации, и это может привести к деградации субтеломерных генов. У подавляющего большинства организмов фермент теломераза осуществляет удлинение теломеры за счет синтеза коротких последовательностей ДНК (6-11 нуклеотидов) на матрице РНК, кодируемой клеточным геном. Теломеры ОторИНа образуются за счет ретротранспозиций специализированных теломерных ретротранспозонов Во всех случаях удлинение теломер происходит с использованием механизма обратной транскрипции, т е. синтеза ДНК на матрице РНК. Это даег почву для дискуссии об общности происхождения теломеразного и ретротраиспозонного способов удлинения теломер.

Механизмы контроля длины геломерной ДНК, а также формирования белковою состава теломерпого комплекса, т е поддержания гомеостаза теломеры, являются объектом активного исследования. Основные данные получены на тех организмах, у которых осуществляется теломеразный механизм поддержания теломеры. Теломерная ДНК служит платформой для связывания многочисленных белков, а собственно теломера - это находящийся на концах линейных хромосом сложнейший комплекс теломерной ДНК и связанных с ней белков Функции этого комплекса, как теперь выясняется, многочисленны. К ним относятся защита конца хромосомы от деградации, определение положения хромосомы внутри ядра, взаимодействие хромосом во время деления клетки, а также осуществление контроля длины теломеры путем регуляции доступности конца хромосомы для теломеразы. Регуляция длины теломер - это комплексный процесс, зависящий от многих факторов, тем не менее, упрощенно его можно свести к титрованию белков на геломерной ДНК: снижение количества теломерных белков на укороченной теломере делает ее доступной для активности теломеразы в терминальных клетках или

является сигналом для остановки деления соматической клетки. В то же время опухолевая трансформация клетки часто сопровождается повышенной активностью теломеразы Такая клетка способна к бесконечному числу делений и является бессмертной Даже из этих кратких пояснений понятно, почему исследование регуляции длины теломер является одним из приоритетных направлений современной науки. В отличие от большинства эукариот, удлинение теломер у ОговорЫа происходит за счет перемещений специализированных теломерных мобильных элементов на концы хромосом. Очевидно, что для обеспечения нормальной длины теломер у дрозофилы необходим строгий контроль частоты транспозиций. В клетке существуют защитные механизмы, снижающие активность мобильных элементов. Важнейшим из них является работа системы РНК-интерференции (РНКи). Теломерные ретротранспозоны дрозофилы отличаются от разбросанных по геному и перемещающихся случайным образом мобильных элементов; они перемещаются исключительно на конец хромосомы и выполняют важнейшую функцию поддержания теломер. Тем не менее, как показали наши исследования, эти элементы также являются мишенью системы РНКи. ОгагорЫа, у которой теломеры поддерживаются за счет ретротранспозиций, не является исключением, список видов, у которых теломера поддерживается за счет ретроэлементов, растет, кроме того, сложные повторы являются неотъемлемой частью теломерных районов у всех организмов. Повторяющиеся элементы являются потенциальным источником двухцепочечной РНК (дцРНК) и мишенью РНКи Мы показали, что экспрессия и транспозиция теломерных ретроэлементов Дгогор/н/я /ие/сшо£<и/ег находится под контролем некоторых генов, являющихся компонентами РНКи. Показано, чго на фоне мутаций по генам РНКи происходит не только накопление транскриптов теломерных элементов в яичниках дрозофилы, но и увеличение частоты их транспозиций на конец хромосомы Полученные в работе результаты позволили сделать очень важный вывод о том, что система РНКи участвует в негативной регуляции длины теломер у дрозофилы. Исследование роли РНКи в контроле длины теломер и формировании теломерного гетерохроматина является фундаментальной проблемой и позволит по-новому рассмотреть роль повторяющихся элементов в функционировании теломеры у разных организмов

Цель и задачи исследования

Целями настоящей работы является изучение общих принципов организации теломер у Д melanogaster, а также исследование роли механизма РНКи в контроле длины теломер. Были поставлены следующие задачи.

1. Провести анализ уровня экспрессии теломерных ретротранспозонов на фоне мутаций по генам РНКи

2. Провести анализ частоты транспозиций на конец хромосомы теломерных ретротранспозонов на фоне мутаций по генам РНКи

3. Выяснить, участвует ли недавно обнаруженный в теломерных участках дрозофилы ретротранспозон ТАНКЕ в поддержании теломер у дрозофилы

Научная новизна работы

Впервые показана роль механизма РНКи в регуляции длины теломер у эукариот. У дрозофилы РНКи участвует в негативной регуляции длины теломер. Система РНКи подавляет экспрессию ретротранспозонов, но позволяет сохранить количество транскриптов, служащих пусковым механизмом самой системы, на том низком уровне, который достаточен для осуществления относительно редких (не в каждом поколении) актов удлинения хромосом дрозофилы. Надо отметить, то большинство белков теломерного комплекса у организмов, имеющих теломеразу, также участвует именно в негативной регуляции длины теломер, не считая саму теломеразу, активность которой удлиняет теломеры. Возможно, что роль РНКи в поддержании теломер может быть универсальна для разных организмов независимо от конкретного способа удлинения теломер - с помощью теломеразы или перемещений мобильных элементов. Действительно, теломерные районы у всех организмов обогащены повторяющимися последовательностями различной природы, в том числе, и мобильными элементами. Именно геномные повторы и мобильные элементы являются излюбленной мишенью системы РНКи. Влияя на экспрессию этих повторов, система РНКи будет вмешиваться в функциональную структуру теломеры Действительно, у дрожжей механизм РНКи играет важную роль в формировании теломерного белкового комплекса Появились данные о роли этой системы в функционировании теломер инфузории Однако, данных о влиянии системы РНКи на длину теломер у организмов, использующих теломеразу, пока не получено. Хочется предположить, что начавшиеся исследования роли РНКи в функционировании теломер приведут к появлению новых данных, особенно при изучении

терминальных тканей, где у всех организмов происходит удлинение теломер и где активно работает система РНКи.

Апробация

Результаты, полученные в данной работе, были представлены на следующих научных семинарах и конференциях' на семинарах кафедры молекулярной биологии МГУ им Ломоносова, на семинарах Отдела молекулярной генетики клетки ИМГ РАН, на международной конференции по гетерохроматипу дрозофилы (Губбио, Италия, 2005), на американских ежегодных конференциях по генетике дрозофилы (Хьюстон, США, 2006; Филадельфия, США, 2007), на конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза», Москва,2006.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 2 статьи в международных рецензируемых журналах. Структура

Диссертация изложена на 78 страницах и включает в себя следующие разделы: Введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждения, выводы. Диссертация содержит 3 таблицы, 15 рисунков, 178 ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Структура тсломср Дпюор/л'/я

Теломеры йгозорЫЬ образуются в результате транспозиций ретротранспозонов трех семейств - НеТ-А, ТАКТ и ТАНКЕ. Все они относятся к ретроэлементам, не содержащим ДКП (длинные концевые повторы). Особенностью теломерных элементов является специфичность и\ транспозиций на конец хромосомы, так, что разные элементы

у ТЬ _центромера

НеТ-А

TART

ТАНКЕ -—»ZSL^--

Рис 1 Схема теломер дрозофилы (Л) Показано тандемное расположение, по принципу голова-к-хвосту, ретротранспозонов НеТ-Л, TART и TAHRE, образующих теломерную ДНК НеТ-А представлен в теломере D melanogasler наибольшим числом копий. (Б) Представлены схемы строения ретротранспозонов НеТ-А, TART и TAHRE. Стрелки соответствуют открытым рамкам считывания, короткими стрелками обозначены промоторы элементов.

располагаются в случайном порядке, но всегда по принципу голова-к-хвосту, их поли(А) хвосты направлены к центромере (рис.1).

Перечисленные выше теломерные элементы представлены в теломерах не в равном соотношении. Основным структурным компонентом теломер является элемент НеТ-А, число копий которого в геномах линий D melanogasler около 30, TART представлен меньшим числом - около десяти - копий (George et al. 2006). Представителей третьего семейства, TAHRE, выявлено 4 копии в геноме линии D melanogasler, использованной для секвенирования в рамках геномного проекта, только одна копия является полноразмерной (Abad et al. 2004а) До сих пор транспозиии ретроэлемента TAHRE детектированы не были. Элемент НеТ-А содержит только одну рамку, кодирующую белок Gag, подобный РНК-связывающему ядерному белку Gag ретровирусов, и не содержит рамки трансляции белка, кодирующего ревертазу. Элементы TART и TAHRE, однако, имеют две рамки,

кодирующие белки Gag и Pol, последний содержит эндонуклеазный и ревертазный домены Считается, что ревертазную активность НеТ-А заимствует in trans, возможно, в транспозиции НеТ-А участвует ревертаза TART или TAHRE. Характерной особенностью теломерных ретротранспозонов является наличие необычно протяженных 5' и 3' нетранслируемых областей (UTR, untranslated region). 3' UTR НеТ-А составляет более 3 т.п.н., а у TART - до 5 т.п.н.. Особенностью транскрипции НеТ-А является то, что его промотор находится в 3' области и осуществляет экспрессию следующего за ним элемента (Danilevskaya et al. 1997) (рис.1). НеТ-А активно транскрибируется в терминальных тканях и активно делящихся клетках, например, в имагинальных дисках личинки, где происходит закладка будущих тканей взрослой особи (George and Pardue 2003; Walter and Biessmann 2004). Особенностью транскрипции TART является наличие двух промоторов, смыслового и антисмыслового (Danilevskaya et al. 1999). Старты смысловой и антисмысловой транскрипции TART расположены в 5' и 3' UTR, в области длинных прямых нсконцевых повторов, характерных для этого элемента (Maxwell, Belote and Levis 2006). Функциональные особенности элемента TAHRE до сих пор не были исследованы.

Очевидно, что элементы TART и TAHRE, не смотря на то, что они консервативны в разных видах Drosophila, не могут выполнять структурную роль, т.к. они присутствуют не на всех теломерах. Предполагается, что последовательность 3' UTR НеТ-А, содержащая повторяющиеся А-богатые участки, служит для связывания с белками, формирующими специфический теломерный хроматин, выполняющий многие важные выше перечисленные функции теломер.

Поддержание теломер дрозофилы с помощью мобильных элементов является, пожалуй, уникальным примером выполнения жизненно важной функции паразитическими элементами генома В клетке существуют защитные механизмы, снижающие активность мобильных элементов. Важнейшим из них является работа системы РНКи, которую принято считать иммунитетом на уровне нуклеиновых кислот. Механизм РНКи эволюционно возник как защита от вирусов, в жизненном цикле многих из которых, в отличие от хозяйской клетки, образуются молекулы дцРНК. Именно появление в клетке дцРНК является сигналом к началу работы механизма РНКи. Такие молекулы РНК разрезаются на более короткие РНК, так называемые короткие интерференционные РНК, которые в составе сложных белковых комплексов, далеко не все компоненты которых охарактеризованы, находят в клетке гомологичную им матричную РНК В результате ферментативной активности белков, связывающих короткие РНК, происходит расщепление и деградация длинных молекул матричной РНК В данном случае

подавление экспрессии гена или его активности, происходит на посттранскрипционном уровне, т.е. воздействию подвергается уже сформированная матричная РНК

Считается, что механизм РНКи был адаптирован для нужд генома, в частности, для подавления активности мобильных элементов, многие из которых, также как и вирусы, обладают способностью транскрибироваться в обоих направлениях Для многих организмов, в том числе для дрозофилы, доказана роль РНКи в поддержании стабильности генома путем контролирования количества транскриптов и частоты перемещений мобильных элементов (Wu-Scharf et al 2000, Aravin et al. 2001; Sijen and Plasterk 2003; Shi et al 2004; Svoboda et al. 2004; Kalmykova, Klcnov and Gvozdev 2005) Как показывают наши исследования, теломерные ретроэлементы, не смотря па то, что они выполняют важнейшую функцию в геноме, также являются мишенью системы РНКи.

Сравнение экспрессии рстротранспозонов НеТ-А и TART в яичниках мух,

мутантных по генам системы РНКи.

Ранее было показано, что на фоне мутаций по генам системы РНКи spn-E и aub, кодирующим РНК-хсликазу и белок семейства Аргонавт, соответственно, происходит накопление транскриптов теломерного ретротранспозона НеТ-А в терминальных тканях дрозофилы (Vagin et al. 2004) Методом РНК in situ гибридизации на яичниках дрозофилы с использованием однонитевых зондов мы показали, что на фоне мутаций по вышеперечисленным компонентам системы РНКи происходит также резкое увеличение количества смысловых транскриптов ретротранспозона TART. Интересно то, что паттерн распределения транскриптов НеТ-А и TART в яичниках мутангных мух резко различается (рис.2А, Б). Например, на фоне мутаций генов spn-E и aub, смысловые транскипты НеТ-А накапливаются в районе ооцита, начиная с ранних стадий оогенеза, а транскрипты ретроэлемента TART обнаруживаются на поздних стадиях оогенеза в цитоплазме питающих клеток Данный метод не детектирует разницы в количестве антисмысловых транскриптов IhT-A и TART. Известно, что НеТ-А активно экспрессируется в соматических тканях с активно делящимися клетками (в мозге и имагинальпых дисках) (George and Pardue 2003; Walter and Biessmann 2004). Мы исследовали экспрессию НеТ-А методом шбридизации РНК in situ в глазо-антеннальных имагинальпых дисках мутантов гена spn-E. Разницы в экспрессии НеТ-А в клетках так называемой борозды деления диска у мух, гетеро- и гомозиготным по мутации spn-E, обнаружено не было (рис 2В) Эги данные подчеркивают специфическую роль системы РНКи в регуляции экспрессии теломерных ретроэлементов в терминальной ткани.

A spn-E:/+

spn-E'/spn-E"*3987

aubOC4*/+

аиЬаС4г/аиЬлр'3в

Рис. 2 Накопление транскриптов ретротранспозонов TART и НеТ-А в яичниках особей, мутантных по генам spn-E и aub. Представлены результаты РНК in situ гибридизации с использованием однонитевых зондов.

(A) Гибридизация яичников с рибопробой, детектирующей смыловые (s , верхний ряд) и антисмысловые транскрипты (as, нижний ряд) ретротранспозона TART. Смысловые транскрипты TART детектируются в цитоплазме питающих клеток на поздних стадиях оогенеза в трансгетерозиготах spn-E 'spn-It,s3987 и aub^ 42/aub №'ia. На количество антисмысловых траскриптов TART мутации влияние не оказывают.

(Б) Гибридизация яичников с рибопробой, детектирующей смыловые траскрипты ретротранспозона НеТ-А, в особях, мутантных по гену aub. Транскрипты НеТ-А детектируются в цитоплазме питающих клеток и в развивающемся ооците (отмечено стрелками) в трансгетерозиготах aub-C42,aub AP"j0.

(B) Детекция смысловых транскриптов ретротранспозона НеТ-А в имагинальных дисках личинок, несущих мутацию по гену spn-E. Уровень экспрессии НеТ-А в активно делящихся клетках одинаков у особей spn-E1!+ и spn-E17 spn-E'

Увеличение частоты транспозиций теломерных элементов на конец хромосомы на фоне мутаций по генам spn-E и aub

Частота присоединений НеТ-А и ТАЯТ в РНКи мутантах была исследована с применением генетической системы, позволяющей фенотипически отслеживать

транспозиции теломерньгх элементов к концу терминальноделетированной хромосомы (Savitsky et al. 2002). Эта система была разработана в лаб. ГТ.Г. Георгиева (ИБГ РАН), 1енетическая часть данной работы была сделана совместно с М Ю Савицким (ИБГ РАН) Эта система основана на том, что присоединения теломсрных ретроэлсментов к концу терминальноделетированной хромосомы в ооцитах самки могут быть детектированы фенотипически у потомства в результате активации гена, находящегося на конце хромосомы. Мы использовали терминальную делецшо X хромосомы в районе локуса yellow, продукт которого в норме определяет темную окраску тела и щетинок мух. Мутации гена нарушают синтез пигмента, и особи с концевой хромосомной делецией приобретают желтую окраску, т.к. ген yellow у них не работает. Однако к оборванному концу хромосомы могут присоединяться теломерные ретротранспозоны, что приведет к активации того же гена и появлению темноокрашенных мух. Механизм такой активации до копна не ясен Считается, что белковый комплекс, формирующийся на конце хромосомы, так называемый кэп (колпак), препятствует работе гена, а присоединение теломерного элемента открывает возможность функционированию регуляторных элементов гена Т к терминальная делеция затрагивает несколько жизненно важных генов, то хромосома, несущая ее (yTD), детальна в гомозиготном состоянии. В качестве гомологичной X хромосомы используют хромосому с делецией генов yellow и achaete (хромосома у ас), которые не являются жизненно важными генами. Данная система позволяет следить за событиями, происходящими только на конце терминальноделетированной хромосомы. Кроме того, отсутствие гена yellow в гомологичной хромосоме a priori позволяет отвергнуть возможность удлинения хромосомы за счет генной конверсии. Т.о. появление темноокрашенных мух в данной системе свидетельствуют о транспозиции на конец оборванной хромосомы теломерного элемента.

Для того, чтобы исследовать влияние генов системы РНКи на частоту присоединений теломерпых элементов к концу хромосомы, в линию, содержащую терминальноделетированную X хромосому угд, вводили хромосому, несущую мутации генов ьрп-Е и aub. Т к особи, гомозиготные по большинству РНКи мутаций, стерильны, эта система позволяет исследовать генетически только дозовые эффекты у самок, гетерозиготных по мутации (самцы с хромосомой ут не выживают) Терминальная делеция находилась в регуляторной области гена yellow, в результате чего особи с терминальной делецией были у1 фенотипа и имели желтые аристы. Присоединение ретротранспозона к концу хромосомы приводило к изменению фенотипа и аристы особи и ее потомков становились черными (рис. ЗА).

При исследовании мух, несущих хромосому ут и мутации по генам spn-E и aub в гетерозиготном состоянии было отмечено появление особей с черными аристами. Генетический анализ проводился в течение пяти поколений. Исследовался аллель гена aub aub^C42 и два различных аллеля гена spn-E: spn-E1, вызванный точечной заменой в хеликазном домене и spn-Ehhm', являющийся результатом инсерции Р-элемента. При анализе контрольной линии yTD, не несущей мутаций РНКи генов, особей с измененным фенотипом выявлено не было. Однако ранее при использовании данной системы с терминалыюделетированной X хромосомой была определена частота спонтанных присоединений, она равнялась 0,04% (Kahn et al. 2000) В таблице 1 приведены сводные данные. Видно, что оба мутантных аллеля гена spn-E привели к более чем 100-кратному повышению частоты появления мух с темными аристами, а мутация по гену aub к более низкому, но также значительному эффекту. Эти данные позволяют сделать вывод об участии системы РНКи в регуляции частоты транспозиций теломерных ретротранспозонов на конец хромосомы, другими словами, в регуляции длины теломер у дрозофилы.

Таблица 1

Частот присоединений к терминальноделетированной хромосоме на фоне мутаций spn-E и aub

Число особей с измененным фенотипом/общее число особсй в поколении

РНКи мутации Fl F2 F3 F4 F5 % Q (F2 - F5)*

spn-E'/MKRS 1/569 3/146 41/1281 13/1162 37/998 2.1

spn-£"ми7MKRS 1/556 36/416 18/156 35/247 37/998 65

aub» "/СуО 0/651 3/306 10/787 17/2629 — 08

Контроль** 0/735 0/1005 0'595 0/744 0/824 0.0

*<3 - средняя частота события изменения фенотипа на общее число особей в поколении ** объединенный результат для линий уп'/у ас, ТШ/МКЯБ и/°/у ас; СуО/ф

Мутации генов spn-E и aub в гетерозиготном состоянии вызывают активные транспозиции па конец хромосомы ретротранспозона TART

Для того, чтобы определить природу присоединившегося элемента в мухах с измененным фенотипом, необходимо было проанализировать границу между геном yellow и присоединившимся ретротранспозоном. Геномная ДНК для анализа терминальных

присоединений выделялась из потомства самок с темными аристами. Определение того, какой мобильный элемент присоединился к концу хромосомы, было проведено с помощью ПЦР с использованием праймеров из 5' области гена yellow и 3' области ретротранспозонов TART или НеТ-А (рис. ЗЬ). Место терминальной делеции в гене yellow было определено в предварительных опытах с использованием Саузерн-анализа и находилось в районе 1.5 т.п.н. перед стартом транскрипции гена yellow. Т.к. известно несколько семейств рстротрапспозона TART, сильно различающихся в их 3' области, праймсры подбирались к трем основным семействам - A, D1 и С (номера последовательностей в базе данных GcnBank U02279, U14101 и AY600955, соответственно). V последова1едьность НеТ-А в значительной степени полиморфна между разными копиями, поэтому праймсры подбирались к наиболее консервативному участку. Кроме того, необходимо отметить, что эти праймсры были универсальны для элементов НеТ-А и TAHRE Полученные ПЦР продукты были отссквенирОЕаны.

Результаты приведены в таблице 2. Па фоне мутации spn-E1 в подавляющем большинстве случаев происходило присоединение рстротрапспозона TART, а на фоне мутаций sрп-ЬflsX37 и aub®C42 были детектированы только присоединения TART, при этом были выявлены транспозиции представителей всех трех семейств - А, В1 и С

Таблица №2

Идентификация теломерных ретротранспозонов, присоединившихся к концу терминалыгоделетированной хромосомы на фоне мутаций ¡рп-Е и аиЬ

РНК-и мутации "айь

ipn-E

TART 29 38 16

НеТ-А 6 - -

Общее число * 35 38 16

♦общее число проанализированных отводок с черными аристами

b EcoRI EcoR 1 HeT-A | _

TART

123456789 10 1234

^ ^тшкашп ари

Рис. 3 Анализ присоединений теломерных ретротранспозонов HeT-A/TART к концу терминальноделетированной X хромосомы.

(A) Изменение окраски арист (отмечено стрелками) с желтой (слева) на черную (справа) в результате присоединения НеТ-А или TART к терминальноделетированной Х-хромосоме в регуляторной области гена yellow.

(Б) схематическое изображение присоединений НеТ-А или TART к терминальноделетированной X-хромосоме в области гена yellow. Область теш yellow обозначена желтым прямоугольником. Присоединения НеТ-А или TART обозначены соответственно красной и зеленой стрелками. Вертикальной стрелкой обозначен сайт рестриктазы EcoRI. Синей горизонтальной линией обозначен зонд к гену yellow, использовавшийся для Саузерн-блот анализа. Область присоединения ретротранспозонов к терминальноделетированной Х-хромосоме была амплифицирована при помощи праймеров, схематически обозначенных маленькими горизонтальными стрелками.

(B) Саузерн-блот анализ ДНК потомства индивидуальных особей yW'y ac: spn-E1/AiKRS с желтыми аристами (без присоединений, дорожка 10), и с черными аристами (с присоединениями TART или НеТ-А, дорожки 1-6 и 7-9, соответственно). ДНК была обработана рестриктазой EcoRI. Фильтр был гибридизован с зондом, отмеченным на схеме Б. Фрагмент размером около 4 т.п.н. дорожки 10 соответствует расстоянию от сайта рестриктазы EcoRI до конца терминальноделетированной Х-хромосомы. Фрагменты размером от 5 до 15 т.п.н. дорожек 1-6 соответствуют различным по длине присоединениям ретротранспозона TART. Фрагменты размером около 5 т.п.н. дорожек 7-9 соответствуют присоединениям ретротранспозона НеТ-А, имеющего консервативный сайт рестриктазы EcoRI в 3" области.

(Г) Саузерн-блот анализ геномной ДНК, выделенной из линий, полученных от четырех самок с черными аристами (присоединение сетротранспозона TART), которые, в свою очередь, являлись потомством от индивидуальной особи у 'у ас; с желтыми аристами. Идентичность гибридизовавпшхея

фрагментов подтверждает гипотезу присоединения TART на ранней премейотической стадии оогенеза. Размер ДНК-маркера отмечен в т.п.н.

Это было неожиданно, т к. в предшествующих работах, где исследовалось влияние Ки белков и белка НР1 на регуляцию длины теломер дрозофилы с использованием этой же генетической системы, в большинстве случаев к терминальноделетированной хромосоме присоединялся НеТ-А (Savitsky et al. 2002; Melnikova, Biessmann and Georgiev 2005).

В результате секвенирования ПЦР продуктов было выявлено, что присоединения происходили к разным нуклеотидным позициям регуляторной области гена yellow. Это объясняется укорочением терминальноделетированной хромосомы в результате концевой недорепликации Все присоединившиеся регротранспозоны имели на 3' конце олиго(А) участки, короткие (3-11 нуклеогидов) в случае присоединения НеТ-А и длинные (20-28 нуклеотидов) в случае присоединения TART. Тот факт, что присоединившиеся ретротранспозоны имели олиго(А) последовательности на 3' конце, и присоединение происходило к различным позициям регуляторной области гена yellow, свидетельствует о том, что присоединение произошло в результате процесса ретротранспозиции к концу хромосомы.

Генетический скрининг терминальных присоединений проводился у потомков мух, поддерживающихся как при массовом, так и при индивидуальных скрещиваниях В потомстве отдельных самок, несущих хромосому ут и мутации генов spn-E"ls39S7 или aub®С42, были выявлены несколько особей с измененным фенотипом При анализе ПЦР продуктов, содержащих границу между присоединением и геном yellow, на фоне каждой из мутаций были выявлены несколько случаев абсолютно идентичных присоединений как по типу присоединившегося элемента (во всех случаях были обнаружены присоединения TART), так и по нуклеотидной позиции присоединения к гену yellow. Саузерн анализ подтвердил идентичность присоединений у мух, являющихся потомками одной самки (рис ЗВ). Появление таких кластеров потомков одной мухи с идентичными присоединениями свидетельствует о том, что присоединения происходят на премейотических стадиях оогенеза, после чего терминальные клетки делятся и дают начало нескольким ооцитам с идентичными присоединениями теломерных элементов

В результате проведенного Саузерн анализа геномной ДНК из потомства выборочных особей с различными типами присоединений было показано, что присоединения имеют различную длину, и присоединяются различные по своей структуре элементы (рис ЗВ) Для Саузерн анализа была выбрана рестриктаза EcoRl, сайт узнавания которой расположен в области ~ 4 т п н. проксимальнее кониа терминальной делеции в гене yellow, зонд был подобран из этой же области (см. рис ЗБ) Ретротранспозон НеТ-А имеет консервативный сайт рестриктазы ЕсоКХ в 3' области, в то время как в

канонических копиях TART таких сайтов нет. На автографе Саузерн блота в ДНК мух с присоединениями НеТ-А действительно присутствуют полосы длиной ~ 5 т п и. (рис ЗВ дорожки 7-10), в ДНК линий с присоединениями TART детектируются полосы длиной от ~5 до -15 т.п.н. (рис. ЗВ дорожки 1-6). Различия в длине продуктов рестрикции ДНК для линий с присоединением ретротранспозона TART могут быть объяснены как присоединением различных копий мобильною элемента, некоторые из которых имеют полиморфный сайт рестриктазы EcoR\, так и присоединением неполноразмерных копий, имеющих оборванный 5' конец в результате низкой процессивности обратной транскриптазы, что косвенно является дополнительным доказательством именно транспозиционного механизма перемещения данного мобильного элемента к концу хромосомы.

Таким образом, было показано, что мутации по генам, кодирующим компоненты РНКи spn-E и аиЬ в гетерозиготном состоянии, приводят к существенному повышению частоты присоединений теломерного ретротранспозона TART к концу хромосомы.

Активные транспозиции ретротранспозона НеТ-А к концу хромосомы

происходят на фоне мутации гена spn-E в гомозиготном состоянии

Как было показано ранее, мутации генов, кодирующих компоненты РНКи, приводят к значительному накоплению транскриптов ретротранспозона ПеТ-А в области ооцита в яичниках мух, гомозиготных по мутации. Ввиду того, что такие особи стерильны, и анализировать результаты присоединений к концу терминальноделетированной хромосомы генетическими методами в них было невозможно, мы исследовали присоединения НеТ-А к концу хромосомы в яичниках у мух spn-E''/spn-E1 и spn-E1/spn-£Wi3M7> содержащих терминалыюделетированную хромосому .у™ с помощью ПЦР анализа Для этого из зрелых ооцитов этих мух была выделена геномная ДНК, которая содержала ДНК из ооцита и окружающих его фолликулярных клеток, где, однако, эффекта РНКи на экспрессию НеТ-А не наблюдалось (рис. 2Б). В качестве контроля, геномная ДНК была выделена из каркасов мух после удаления яичников. Был проведен вложенный ПЦР с использованием праймеров к гену yellow и HeT-A/TART. ПЦР продукты гетерогенного размера были выявлены только в ДНК из ооцитов мутантных мух при использовании праймеров к элементу НеТ-А Секвенирование этих фрагментов подтвердило присоединения НеТ-А к концу хромосомы 'Г.о , активная экспрессия НеТ-А в яичниках мух, гомозиготных или 1рансгетерозиготных по мутации гена spn-E, действительно сопровождается активными транспозициями этого элемента к концу хромосомы.

ОТ-ПЦР анализ экспрессии НеТ-А и TART в яичниках мутантов no i ену spn-E.

Для того, чтобы понять, почему в яичниках гетерозигот по мутациям РНКи генов происходят преимущественные присоединения элемента TART, в то время как в гомозиготах наблюдаются транспозиции НеТ-А элемента, мы провели полуколичественный ОТ-ПЦР анализ экспрессии обоих элементов в яичниках мух, наиболее близких по генетическому фону и различающихся отсутствием (уто/у ас, TM6/MKRS) или наличием одного {yTD/y ас; spn- E'/MKRS), или двух (yTD/y ас, spn-E1/spn-мутантных аллелей гена spn-E (рис.4). Для обратной транскрипции был использован олиго(дТ) праймер. Т к. методом РНК in situ гибридизации не было детектировано заметной разницы в уровне антисмысловой экспрессии обоих элементов, мы можем относить замеченные различия к изменению смысловой экспрессии. В случае элемента TART наблюдается ярко выраженный дозовый эффект мутации spn-E на его экспрессию, т.е. увеличение в несколько раз количества транскриптов при появлении одной или двух доз мутантного аплеля этого гена. В случае НеТ-А наблюдается резкое накопление транскриптов в яичниках гомозиготных самок (в десятки раз выше, чем в норме), что и может объяснять преимущественные присоединения НеТ-А к концу хромосомы у гомозиготных мутантов по гену spn-E. Однако, остается до конца неясной причина того, почему TART является первичной мишенью РНКи в гетерозиготных мутантах. Одним из возможных объяснений может быть то, что TART активно транскрибируется в обоих направлениях (Danilevskaya ct al. 1999), что может быть причиной образования двухцепочечных РНК и коротких РНК, которые направляют работу системы РНКи. Действительно, сейчас в литературе появилось много данных о секвенировании библиотек коротких РНК, в том числе из яичников дрозофилы, где выявляются короткие РНК как для TART, так и для НеТ-А элемента (Aravin et al. 2003, Brennecke et al. 2007; Gunawardane et al. 2007) Итак, основным результатом этой части работы является демонстрация того, что система РНКи участвует в регуляции длины теломер у Drosophila, а именно, осуществляет негативный контроль экспрессии и частоты транспозиций на конец хромосомы специфических теломерных ретрогранспозонов Механизм этой регуляции остается пока что неизвестным. Он может осуществляться как на посттранскрипционном уровне и сводиться к регуляции количества транскрипов, являющихся интермедиатами транспозиций, так и на уровне изменения структуры теломерного хроматина, и, как следствие, приводить к увеличению уровня транскрипции ретроэлементов и/или изменению доступности конца хромосомы для присоединения ретроэлемента.

А

$> £ +/+ i 4

& Г

# Jf

o

O) •t

P ce

s

10 -

6 —^

4 щ—

2 ---- —

0 .. • 'i

TART

HeT-A

Рис. 4 spn-E участвует в подавлении экспрессии TART и НеТ-А в яичниках дрозофилы. ОТ-ПЦР анализ количества траскриптов TART (А) и НеТ-А (Б) в яичниках мух без мутации РНКи гена (у//у ас; TM6/MKKS, обозначена +/+), с мутацией в гетерозиготном состоянии (у "/у ас; spn-E'/MKRS, обозначена spn-E!+) и в гомозиготном состоянии (ут/у ас; spn-E1/spn-E1'1""'' . обозначена spn-E/spn-E). Гистограммы являются результатом обработки данных пяти экспериментов. Высота столбцов отражает отношение количества транскриптов ретротранспозонов TART или НеТ-А к количеству транскриптов конститутивного гена rp49 (Rpl32) в яичниках мух spn-E/+ и spn-E/spn-E, нормированное па та к о нас соотношение для мух без мутации (+/+). Показано, что мутация spn-E оказывает дозовое влияние на TART, в то время как для НеТ-А наблюдается мощное накопление транскриптов на фоне гомозиготного состояния мутации (spn-E/spn-E).

Ретротранспозон TAHRE участвует в поддержании теломер Drosophiia.

Как упоминалось выше, в теломерах D. melanogaster обнаружены три семейства ретротранспозонов - НеТ-А, TART и TAURE. Спонтанные присоединения к теломере первых двух элементов были описаны неоднократно (Biessraann et al. 1992; Sheen and Levis 1994; Kahn et al. 2000; Golubovsky et al. 2001). Элемент TAHRE был обнаружен in silico при анализе геномного сиквенса D. melanogaster (Abad et al. 2004a). Этот элемент, так же как и TART, имеет две открытые рамки считывания, кодирующие белки Gag и Pol, однако, его 5' и 3' нетранслируемые области высоко гомологичны элементу НеТ-А, что и послужило причиной к выбору названия этого элемента (telomere-associated and НеТ-А-related element). Обнаружение нового теломерного элемента, TAHRE, заставило по-новому взглянуть на эволюцию теломерных ретротранспозонов Drosophiia. Предпогагается, что TART и TAHRE возникли в результате дивергенции общего предкового элемента, а НеТ-А произошел от TAHRE, утратив ген ревертазы (Abad et al.2004a).

Оставалось неясным, участвует ли TAHRE в поддержании теломер у Drosophiia. В нашем анализе мы использовали праймеры, универсальные для НеТ-А и TAHRE, поэтому мы не можем сказать, происходили ли транспозиции TAHRE к концу терминальноделетированной хромосомы в нашей системе. Единственное, что можно

сказать, что если они происходили, то поведение этого элемента больше напоминает поведение элемента НеТ-А. Для того, чтобы однозначно ответить на вопрос о возможности спонтанных транспозиций TAHRE на конец хромосомы, были проанализированы ранее полученные линии мух со спонтанными присоединениями к терминальноделетированной X хромосоме Детально эта генетическая система была описана в предыдущем разделе Геномная ДНК, выделенная из таких мух с неидентифицированными присоединениями, была подвергнута ПЦР анализу с использованием праймеров из гена yellow и 3' области элемента TAHRE (рис.5, праймеры у17 и ТЗ') Однако, элементы НеТ-А и TAHRE высоко гомологичны в 3' области, поэтому полученные положительные результаты (таковых было получено 5) нуждались в дополнительном подтверждении Для этого на ДНК из таких линий, полученных при первичном отборе, был поставлен ПЦР с использованием праймеров из гена yellow и специфического для TAHRE праймера из рамки, кодирующей ревертазу (рис 5А, праймеры TL и yL) В одной из пяти линий был получен ампликон размером около 6 т п н. Продукты ПЦР с использованием специфичных для TAHRE внутренних праймеров, полученные на матрице этого ампликона, подтвердили то, что присоединившимся элементом являлся TAHRE (рис 5Б) Амплифицированный фрагмент TAHRE размером 6 т п н был клонирован, секвенирован, а полученная последовательность была выровнена с известными копиями элемента TAHRE Секвенирование позволило однозначно отнести этот элемент к семейству ретротранспозонов TAHRE. Вновь перемещенная копия обладает такими чертами, характерными для TAHRE, как наличие 3' нетранслируемой области, высоко гомологичной таковой НеТ-А, примыкающей к рамке считывания, кодирующей ревертазу, которая отсутствует у НеТ-А. Обнаруженный нами элемент гомологичен на 99 8% ранее секвенированной копии TAHRE (номер последовательности в GenBank -AJ542584) и также обладает делецией размером 327 п н в 3 ' области, что отличает его от других трех секвенированных копий TAHRE Этот элемент содержит поли(А) последовательность на 3' конце, что свидетельствует о ретротранспозиции

Т.о, недавно обнаруженный в теломерах дрозофилы элемент TAHRE способен перемещаться на конец хромосомы, а, следовательно, этот элемент является полноправным участником поддержания теломер у дрозофилы Является ли наличие в теломерах D. melanogaster трех семейств ретротранспозонов избыточным или разные элементы выполняют различные функции'' Основным структурным компонентом теломер Drosophila является ретроэлемент НеТ-А, лишенный собственной ревертазы, другими словами, неавтономный ретроэлемент Предполагается, что ревертаза TART и/или TAHRE может осуществлять транспозиции НеТ-А (Rashkova et al 2002, Abad et al 2004a)

Действительно, TART и TAHRE являются консервативными теломерными элементами в разных видах Drosophila (Casacuberta and Pardue 2002; Casacuberta and Pardue 2003), хотя присутствуют не на всех теломерах и очевидно, не могут выполнять структурную роль. Секвенирование теломерных областей у эволюционно отдаленных видов Drosophila выявило в них ретроэлементы, значительно отличающиеся от теломерных элементов D. melanogasler, однако, для теломер всех проанализированных видов Drosophila является наличие в них сочетания автономных и неавтономных ретротранспозопов (Villasante et al. 2007), что указывает на эволюционно устойчивое сочетание таких элементов в теломере, и предполагает разделение функций между ними.

А

р

! 2 J 4

Рис. 5 Транспозиция TAHRE к концу терминальноделетированной X хромосомы

(А) Схема присоединения ТАНКЕ к гену yellow, находящемуся на конце терминальноделетированной хромосомы. Праймеры, использованные б опыте, обозначены стрелками.

(Б) ПЦР анализ подтверждает присоединение TAIIRE. Продукт ПЦР размером ~6 т.п.н,, полученный на геномной ДНК мух с присоединением TAHRE с помощью праймерав TL и yL (дорожка 1) был использован для амплификации границы между элементом и геном yellow (дорожка 2, праймеры ТЗ' и у 17), внутреннего фрагмента рамки, кодирующей ревертазу (дорожка 3, праймеры Т7 и Т2) и границы между рамкой, кодирующей ревертазу, и 3'UTR (дорожка 4, праймеры ТЗ and Т4). Размеры ДНК-маркера отмечены в т.п.н.

3' област ь TAHRE обладает промоторной активностью

Известно, что промотор НеТ-А обладает необычным свойством, т.к. расположен в 3' UTR элемента и направляет транскрипцию следующей копии в теломерной цепи

ретроэлемептов (Danilevskaya et al. 1997). HeT-A и TAHRE высоко гомологичны в 3' области. Мы исследовали промоторную активность 3' области вновь присоединившегося TAHRE с использованием транзиснтной трансфекции культуры клеток дрозофилы репортерными конструкциями. Фрагменты размером около 400 п.н. от 3' конца элементов НеТ-А и TAHRE были клонированы в вектор pCaSpeR-AUG-P-gal. Промотор НеТ-Л был также субклонирован из копии НеТ-А, присоединившейся к терминальноделетированной хромосоме (рис. 6). Последовательности анализируемых фрагментов НеТ-А и TAHRE были г омологичны примерно на 80%. Ферментативная активность [3-галактозидазы была измерена в экстрактах трансфецированных клеток дрозофилы Schneider 2. Активность репортерного гена под промотором TAHRE была высокой, 64+14% от активности, обеспечиваемой промотором НеТ-А. Т.о., TAHRE как и НеТ-А обладает промотором, расположенным в конце 3' UTR.

Данная часть работы позволяет характеризовать недавно обнаруженный в теломерах ретротрапепозон TAHRE, как способный к теломерным транспозициям ретроэлемент, промотор которого расположен также необычно, как у элемента НеТ-А - в 3' UTR.

„__НеТ-Л ?.-............

Z2 ...............ф < yellow

/ \ ...........

/ \

îa-inivc/ . ^..............

V7 ———митщдяи^^ yellow

/ \ ...........

/ \

Рис.6 Промоторная активность 3' области TAHRE

Фрагменты НеТ-А и TAHRE (около 400 п.н. от сайта полиаденилирования) были субклонированы из копий, присоединившихся к терминальноделетированной X хромосоме (соответствующие линии дрозофилы обозначены как z2 и v7). Конструкции для трансфекции культуры клеток были сделаны на основе вектора pCaSpeR-AUG-P-gal. Ферментативная активность конструкции, содержащей TAHRE, выражена как процент от таковой для НеТ-А. Активность (3-г алакгозидазы в клетках, трансфецированных вектором без вставки, не детектировалась.

Заключение

Теломеры - это важнейший нуклеопротеиновый комплекс на концах линейных хромосом эукариот, обеспечивающий поддержание постоянно укорачивающейся концевой ДНК. Впервые продемонстрировано участие механизма РНК интерференции в поддержании теломер эукариот. Теломеры Drosophila образуются в результате транспозиций специфических теломерных рстротранспозонов НеТ-А и TART, в отличие от большинства организмов, у которых теломераза образует короткие последовательности ДНК на матрице РНК. Впервые показано участие третьего семейства теломерных ретротранспозонов - ТАНКЕ - в поддержании теломер у D. melanogaster. Является ли наличие в теломерах дрозофилы трех семейств ретротранспозонов результатом избыточности или связано с разделением функций между ними? На этот вопрос еще предстоит ответить. Показано, что на фоне мутаций генов spn-E и aubergine, кодирующих такие консервативные компоненты системы РНКи, как РНК-хеликаза и белок семейства Аргонавт, соответственно, происходит резкое накопление транскриптов теломерных ретротранспозонов НеТ-А и TART в яичниках мутантов. Это приводит к увеличению частоты транспозиций этих элементов к теломере на нремейотической стадии оогенеза. Эти данные указывают на то, что механизм, сходный с РНКи, участвует в регуляции экспрессии и частоты транспозиций теломерных элементов Drosophila в терминальных клетках, что особенно важно для поддержания целостности генома в ряду поколений Не смотря на то, что НеТ-А и TART являются мишенями системы РНКи, выявлена значительная разница в их поведении В отличие от транскриптов НеТ-А. локализующихся в ооците, транскрипты TART накапливаются на поздних стадиях оогенеза в питающих клетках. Мутантные аллели генов РНКи, исследованных в данной работе, в гетерозиготном состоянии вызывают преимущественные транспозиции рстроэлемента TART, а в гомозиготном - НеТ-А элемента. Эга очевидная разница в их поведении требует дальнейшего изучения

Полученные данные открывают возможность исследования предположительной связи РНКи и формирования теломерного хроматина за счет привлечения РНКи-зависимого ингибирующего транскрипционного комплекса Наличие в теломерах у всех изученных организмов сложных повторов, являющихся потенциальной мишенью РНКи, позволяет предполагать, что РНКи является универсальным механизмом регуляции функции теломер независимо от способа удлинения теломеры

Выводы:

1 Транскрипты теломериых ретротранспозоиов НеТ-А и TART накапливаются в яичниках мух, мутантных по генам РНКи spn-E и aub. В отличие от транскришов НеТ-А, локализующихся в ооците, транскрипты TART накапливаются на поздних стадиях оогенеза в питающих клетках.

2. Продемонстрировано участие механизма РНКи в контроле длины теломср дрозофилы Частота транспозиций теломсрных ретротранспозонов к концу терминально-делстированной хромосомы увеличивается на фоне мутаций РНКи генов spn-E и aub Мутантный аллель в гетерозиготном состоянии вызывает преимущественные транспозиции ретроэлемента TART, а в гомозиготном - НеТ-А элемента.

3. Недавно обнаруженный ретротранспозон TAHRE способен перемещаться на конец хромосомы, и, следовательно, этот элемент является полноправным участником поддержания теломер у дрозофилы

4. Промотор ретротранспозона TAHRE, так же как у НеТ-А, находится в конце 3' нетранслируемой области данного элемента.

Список публикаций. Статьи в научных журналах

1) Savitsky М, Kwon D, Georgiev Р, Kalmykova A, Gvozdev V.

Telomere elongation is under the control of the RNAi-based mechanism in the Drosophila germhne Genes Dev. 2006,20:345-354.

2) Shpiz S *, Kwon D *, Uneva A, Kim M, Klenov M, Rozovsky Y, Georgiev P, Savitsky M, Kalmykova A I. Characterization of Drosophila telomeric retroelement TAHRE: transcription, transpositions, and RNAi-based regulation of expression. Mol Biol Evol, 2007,24 2535-2545.

* равный вклад двух авторов

Тезисы и презентации

1) Kalmykova А I, Klenov M.S , Kwon D., Gvozdev V.A. Derepression of mobile element activity due to mutations m the RNA-i genes in Drosophila melanogaster. 7th international conference on Drosophila heterochromatm. June 5-11, 2005, Gubbio, Italy.

2) Savitsky M„ Kwon D, Shpiz S., Georgiev P., Kalmykova A, Gvozdev V Telomere maintenance is under control of the RNAi-based mechanism in the Drosophila germline. 47th annual Drosophila research confcrence, March 29-April 2,2006, Houston, Texas, USA.

3) Калмыкова A , Савицкий M, Шпиз С., Квои Д. Роль механизма РНК-интерференции в поддержании теломер дрозофилы. Конференция «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза», посвященная памяти А.А. Нейфаха, 15-16 мая 2006 г., Москва.

4) A.Uneva, S.Shpiz, M.Kim, D.Kwon, A.Kalmykova, M.Savitsky Drosophila retroelement TAHRE transposes to telomere. 48th annual Drosophila research conference, March 7-11, 2007, Philadelphia, USA

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www stpnnt ru e-mail: zakaz@stpnnt ru тел : 939-33-38 Тираж 100 экз Подписано в печать 26.09.2008 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Квон, Дмитрий Аркадьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение

Принципы организации теломер, образуемых теломеразой

Теломераза - фермент, поддерживающий длину теломер

Теломеразная РНК, ее взаимодействие с белками теломеразного комплекса

Белковые компоненты теломерного комплекса

TRF-белки -основные структурные белковые компоненты теломеры

Другие компоненты теломерного белкового комплекса

Принципы оранизации теломер Drosophila

Структура теломер Drosophila

Белковые компоненты теломер Drosophila

Регуляция транскрипции теломерных ретротранспозонов 15 Система РНК интерференции и ее роль в регуляции экспрессии ретротранспозонов

Общие принципы работы системы РНКи

Роль РНКи в регуляции экспрессии ретротранспозонов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лабораторные линии, использованные в работе

Выделение геномной ДНК

ПЦР на геномной ДНК

Полукличественная ПЦР на геномной ДНК

Southern-блот анализ.

Рестрикция и гель-электрофорез.

Синтез РНК зонда для последующей гибридизации.

Гибридизация с меченым зондом.

Клонирование ПЦР-продукта.

Лигирование.

Приготовление компетентных клеток Е. coli.

Трансформация клеток E.coli и высев на селективную среду.

Выделение плазмидной ДНК

Секвенирование.

Меченые праймера.

ПЦР с термосеквеназой. 33 Клонирование промоторных областей рстротранспозонов

НеТ-А и TAHRE для измерения их активности 33 Трансфекция культуры клеток Drosophila и количественное определение активности галактозидазы

Выделение тотальной РНК Drosophila

RT-PCR (ОТ-ПЦР)

РНК in situ гибридизация

Фиксация яичников Drosophila

Получение зонда

Гибридизация

Детекция

РЕЗУЛЬТАТЫ 38 Сравнение экспрессии ретротранспозонов НеТ-А и

TART в яичниках мух, мутантных по генам системы РНКи.

Описание генетической системы, использованной в работе 40 Мутации генов spn-E и aub приводят к повышенной частоте транспозиций теломерных ретроэлементов к концу хромосомы 41 Мутации генов spn-E и aub в гетерозиготном состоянии вызывают активные транспозиции на конец хромосомы ретротранспозона TART 43 Активные транспозиции ретротранспозона НеТ-А к концу хромосомы происходят на фоне мутации гена spn-E в гомозиготном состоянии 48 ОТ-ПЦР анализ экспрессии НеТ-А и TART в яичниках мутантов по гену spn-E.

Ретротранспозон TAHRE участвует в поддержании теломер Drosophila. 51 Ретротранспозон TAHRE присутствует в геномах разных линий D. melanogaster и других видов Drosophila

3' область TAHRE обладает промоторной активностью

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Квон, Дмитрий Аркадьевич

Выводы:

1. Транскрипты теломерных ретротранспозонов НеТ-А и TART накапливаются в яичниках мух, мутантных по генам РНКи spn-E и aub. В отличие от транскриптов НеТ-А, локализующихся в ооците, транскрипты TART накапливаются на поздних стадиях оогенеза в питающих клетках.

2. Продемонстрировано участие механизма РНКи в контроле длины теломер дрозофилы. Частота транспозиций теломерных ретротранспозонов к концу терминально-делетированной хромосомы увеличивается на фоне мутаций РНКи генов spn-E и aub. Мутантный аллель в гетерозиготном состоянии вызывает преимущественные транспозиции ретроэлемента TART, а в гомозиготном - НеТ-А элемента.

3. Недавно обнаруженный ретротранспозон TAHRE способен перемещаться на конец хромосомы, и, следовательно, этот элемент является полноправным участником поддержания теломер у дрозофилы.

4. Промотор ретротранспозона TAHRE, так же как у НеТ-А, находится в конце 3' нетранслируемой области данного элемента.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Квон, Дмитрий Аркадьевич, Москва

1. Кленов М.С., Гвоздев В.А. 2005. Формирование гетерохроматина: роль коротких РНК иметилирования ДНК. Биохимия 70,11: 1445- 459 Котельников Р.Н.,.Шпиз С.Г, Калмыкова А.И.,.Гвоздев В.А. 2006. Белки, связывающие

2. РНК, в процессах РНК-интерференции. Молекулярная биология 40, 4:595-608 Оловников A.M. Принцип маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. 1971.

3. Доклады АН СССР. 201: 1496-1499. Щербакова Д.М., Зверева М.Е., Шпанченко О.В.Донцова О.А. 2006. Теломераза: строение и свойства фермента, особенности теломеразы дрожжей. Биохимия 40:580-584

4. Aravin, A.A., M.S. Klenov, Y.V. Vagin, F. Bantignies, G. Cavalli, and V.A. Gvozdev. 2004.

5. Baulcombe, D. 2004. RNA silencing in plants. Nature 431: 356-63.

6. Baumann, P. and T.R. Cech. 2000. Protection of telomeres by the Ku protein in fission yeast.

7. Mol Biol Cell 11:3265-75. Bi, X., D. Srikanta, L. Fanti, S. Pimpinelli, R. Badugu, R. Kellum, and Y.S. Rong. 2005.

8. Drosophila ATM and ATR checkpoint kinases control partially redundant pathways for telomere maintenance. Proc Natl Acad Sci USA 102: 15167-72. Bi, X., S.C. Wei, and Y.S. Rong. 2004. Telomere protection without a telomerase; the role of

9. Blackburn, E.H. 1992. Telomerases. Annu Rev Biochem 61: 113-29.

10. Blumenstiel, J.P. and D.L. Hartl. 2005. Evidence for maternally transmitted small interfering RNA in the repression of transposition in Drosophila virilis. Proc Natl Acad Sci USA 102: 15965-70.

11. Bohnsack, M.T., K. Czaplinski, and D. Gorlich. 2004. Exportin 5 is a RanGTP-dependentdsRNA-binding protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs. RNA 10: 185-91.

12. Boivin, A., C. Gaily, S. Netter, D. Anxolabehere, and S. Ronsseray. 2003. Telomeric associated sequences of Drosophila recruit polycomb-group proteins in vivo and can induce pairing-sensitive repression. Genetics 164: 195-208.

13. Brennecke, J., A.A. Aravin, A. Stark, M. Dus, M. Kellis, R. Sachidanandam, and G.J. Hannon. 2007. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell 128: 1089-103.

14. Bryan, T.M. and T.R. Cech. 1999. Telomerase and the maintenance of chromosome ends. Curr Opin Cell Biol 11: 318-24.

15. Carrington, J.C. and V. Ambros. 2003. Role of microRNAs in plant and animal development. Science 301: 336-8.

16. Casacuberta, E. and M.L. Pardue. 2002. Coevolution of the telomeric retrotransposons across Drosophila species. Genetics 161: 1113-24.

17. Casacuberta, E. and M.L. Pardue. 2003a. HeT-A elements in Drosophila virilis: retrotransposon telomeres are conserved across the Drosophila genus. Proc Natl Acad Sci USA 100: 14091-6.

18. Casacuberta, E. and M.L. Pardue. 2003b. Transposon telomeres are widely distributed in the Drosophila genus: TART elements in the virilis group. Proc Natl Acad Sci U SA 100: 3363-8.

19. Cenci, G., G. Siriaco, G.D. Raffa, R. Kellum, and M. Gatti. 2003. The Drosophila HOAP protein is required for telomere capping. Nat Cell Biol 5: 82-4.

20. Cenci, G., L. Ciapponi, and M. Gatti. 2005. The mechanism of telomere protection: a comparison between Drosophila and humans. Chromosoma 114: 135-45.

21. Chan, S.W. and E.H. Blackburn. 2002. New ways not to make ends meet: telomerase, DNA damage proteins and heterochromatin. Oncogene 21: 553-63.

22. Chapon, C., T.R. Cech, and A.J. Zaug. 1997. Polyadenylation of telomerase RNA in budding yeast. RNA 3: 1337-51.

23. Ciapponi, L., G. Cenci, J. Ducau, C. Flores, D. Johnson-Schlitz, M.M. Gorski, W.R. Engels, and M. Gatti. 2004. The Drosophila Mrel 1/Rad50 complex is required to prevent both telomeric fusion and chromosome breakage. Curr Biol 14: 1360-6.

24. Collins, R.E. and X. Cheng. 2005. Structural domains in RNAi. FEBS Lett 579: 5841-9.

25. Cox, D.N., A. Chao, J. Baker, L. Chang, D. Qiao, and H. Lin. 1998. A novel class ofevolutionarily conserved genes defined by piwi are essential for stem cell self-renewal. Genes Dev 12: 3715-27.

26. Cox, D.N., A. Chao, and H. Lin. 2000. piwi encodes a nucleoplasmic factor whose activitymodulates the number and division rate of germline stem cells. Development 127: 50314.

27. Czech, B., C.D. Malone, R. Zhou, A. Stark, C. Schlingeheyde, M. Dus, N. Perrimon, M. Kellis, J.A. Wohlschlegel, R. Sachidanandam, G.J. Hannon, and J. Brennecke. 2008. An endogenous small interfering RNA pathway in Drosophila. Nature 453: 798-802.

28. Danilevskaya, O.N., I.R. Arkhipova, K.L. Traverse, and M.L. Pardue. 1997. Promoting intandem: the promoter for telomere transposon HeT-A and implications for the evolution of retroviral LTRs. Cell 88: 647-55.

29. Danilevskaya, O.N., K.L. Traverse, N.C. Hogan, P.G. DeBaryshe, and M.L. Pardue. 1999. The two Drosophila telomeric transposable elements have very different patterns of transcription. Mol Cell Biol 19: 873-81.

30. David, A., N. Mabjeesh, I. Azar, S. Biton, S. Engel, J. Bernstein, J. Romano, Y. Avidor, T.

31. Day, A., M. Schirmer-Rahire, M.R. Kuchka, S.P. Mayfield, and J.D. Rochaix. 1988. Atransposon with an unusual arrangement of long terminal repeats in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. EmboJl: 1917-27.

32. Denli, A.M., B.B. Tops, R.H. Plasterk, R.F. Ketting, and G.J. Hannon. 2004. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature 432: 231-5.

33. Desset, S., C. Meignin, B. Dastugue, and C. Vaury. 2003. COM, a heterochromatic locus governing the control of independent endogenous retroviruses from Drosophila melanogaster. Genetics 164: 501-9.

34. Di Nocera, P.P. and I.B. Dawid. 1983. Transient expression of genes introduced into cultured cells of Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA 80: 7095-8.

35. Diede, S.J. and D.E. Gottschling. 1999. Telomerase-mediated telomere addition in vivo requires DNA primase and DNA polymerases alpha and delta. Cell 99: 723-33.

36. Fanti, L., D.R. Dorer, M. Berloco, S. Henikoff, and S. Pimpinelli. 1998a. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. Chromosoma 107: 286-92.

37. Fanti, L., G. Giovinazzo, M. Berloco, and S. Pimpinelli. 1998b. The heterochromatin protein 1 prevents telomere fusions in Drosophila. Mol Cell 2: 527-38.

38. George, J. A. and M.L. Pardue. 2003. The promoter of the heterochromatic Drosophila telomeric retrotransposon, HeT-A, is active when moved into euchromatic locations. Genetics 163: 625-35.

39. George, J.A., P.G. DeBaryshe, K.L. Traverse, S.E. Celniker, and M.L. Pardue. 2006. Genomic organization of the Drosophila telomere retrotransposable elements. Genome Res 16: 1231-40.

40. Ghildiyal, M., H. Seitz, M.D. Horwich, C. Li, T. Du, S. Lee, J. Xu, E.L. Kittler, M.L. Zapp, Z. Weng, and P.D. Zamore. 2008. Endogenous siRNAs derived from transposons and mRNAs in Drosophila somatic cells. Science 320: 1077-81.

41. Gillespie, D.E. and C.A. Berg. 1995. Homeless is required for RNA localization in Drosophila oogenesis and encodes a new member of the DE-H family of RNA-dependent ATPases. Genes Dev 9: 2495-508.

42. Girard, A., R. Sachidanandam, G.J. Hannon, and M.A. Carmell. 2006. A germline-specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins. Nature 442: 199-202.

43. Golubovsky, M.D., A.Y. Konev, M.F. Walter, H. Biessmann, and J.M. Mason. 2001. Terminal retrotransposons activate a subtelomeric white transgene at the 2L telomere in Drosophila. Genetics 158: 1111-23.

44. Gregory, R.I., K.P. Yan, G. Amuthan, T. Chendrimada, B. Doratotaj, N. Cooch, and R.

45. Shiekhattar. 2004. The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs. Nature 432: 235-40.

46. Greider, C.W. and E.H. Blackburn. 1985. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell 43: 405-13.

47. Griffith, J.D., L. Comeau, S. Rosenfield, R.M. Stansel, A. Bianchi, H. Moss, and T. de Lange. 1999. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell 97: 503-14.

48. Gunawardane, L.S., K. Saito, K.M. Nishida, K. Miyoshi, Y. Kawamura, T. Nagami, H. Siomi, and M.C. Siomi. 2007. A slicer-mediated mechanism for repeat-associated siRNA 5' end formation in Drosophila. Science 315: 1587-90.

49. Haley, B. and P.D. Zamore. 2004. Kinetic analysis of the RNAi enzyme complex. Nat Struct Mol Biol 11: 599-606.

50. Hall, I.M., K. Noma, and S.I. Grewal. 2003. RNA interference machinery regulates chromosome dynamics during mitosis and meiosis in fission yeast. Proc Natl Acad Sci USA 100: 1938.

51. Hall, I.M., G.D. Shankaranarayana, K. Noma, N. Ayoub, A. Cohen, and S.I. Grewal. 2002. Establishment and maintenance of a heterochromatin domain. Science 297: 2232-7.

52. Hamilton, A., O. Voinnet, L. Chappell, and D. Baulcombe. 2002. Two classes of short interfering RNA in RNA silencing. Embo J21: 4671-9.

53. Han, J., Y. Lee, K.H. Yeom, Y.K. Kim, H. Jin, and V.N. Kim. 2004. The Drosha-DGCR8 complex in primary microRNA processing. Genes Dev 18: 3016-27.

54. Han, J., Y. Lee, K.H. Yeom, J.W. Nam, I. Heo, J.K. Rhee, S.Y. Sohn, Y. Cho, B.T. Zhang, and V.N. Kim. 2006. Molecular basis for the recognition of primary microRNAs by the Drosha-DGCR8 complex. Cell 125: 887-901.

55. Harris, A.N. and P.M. Macdonald. 2001. Aubergine encodes a Drosophila polar granulecomponent required for pole cell formation and related to eIF2C. Development 128: 2823-32.

56. Henikoff, S. 1997. Nuclear organization and gene expression: homologous pairing and longrange interactions. Curr Opin Cell Biol 9: 388-95.

57. Henson, J.D., A.A. Neumann, T.R. Yeager, and R.R. Reddel. 2002. Alternative lengthening of telomeres in mammalian cells. Oncogene 21: 598-610.

58. Herr, A.J., M.B. Jensen, T. Dalmay, and D.C. Baulcombe. 2005. RNA polymerase IV directs silencing of endogenous DNA. Science 308: 118-20.

59. Horwich, M.D., C. Li, C. Matranga, V. Vagin, G. Farley, P. Wang, and P.D. Zamore. 2007. The Drosophila RNA methyltransferase, DmHenl, modifies germline piRNAs and single-stranded siRNAs in RISC. Curr Biol 17: 1265-72.

60. Hsu, H.L., D. Gilley, S.A. Galande, M.P. Hande, B. Allen, S.H. Kim, G.C. Li, J. Campisi, T. Kohwi-Shigematsu, and D.J. Chen. 2000. Ku acts in a unique way at the mammalian telomere to prevent end joining. Genes Dev 14: 2807-12.

61. Humphreys, D.T., B.J. Westman, D.I. Martin, and T. Preiss. 2005. MicroRNAs controltranslation initiation by inhibiting eukaryotic initiation factor 4E/cap and poly(A) tail function. Proc Natl Acad Sci USA 102: 16961-6.

62. Kahn, T., M. Savitsky, and P. Georgiev. 2000. Attachment of HeT-A sequences to chromosomal termini in Drosophila melanogaster may occur by different mechanisms. Mol Cell Biol 20:7634-42.

63. Kalmykova, A.I., M.S. Klenov, and Y.A. Gvozdev. 2005. Argonaute protein PIWI controlsmobilization of retrotransposons in the Drosophila male germline. Nucleic Acids Res 33: 2052-9.

64. Kanoh, J., M. Sadaie, T. Urano, and F. Ishikawa. 2005. Telomere binding protein Tazlestablishes Swi6 heterochromatin independently of RNAi at telomeres. Curr Biol 15: 1808-19.

65. Kawamura, Y., K. Saito, T. Kin, Y. Ono, K. Asai, T. Sunohara, T.N. Okada, M.C. Siomi, and H. Siomi. 2008. Drosophila endogenous small RNAs bind to Argonaute 2 in somatic cells. Nature 453: 793-7.

66. Kelleher, C., M.T. Teixeira, K. Forstemann, and J. Lingner. 2002. Telomerase: biochemical considerations for enzyme and substrate. Trends Biochem Sci 27: 572-9.

67. Kim, N.W., M.A. Piatyszek, K.R. Prowse, C.B. Harley, M.D. West, P.L. Ho, G.M. Coviello, W.E. Wright, S.L. Weinrich, and J.W. Shay. 1994. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science 266: 2011-5.

68. Kim, Y.N. 2005. MicroRNA biogenesis: coordinated cropping and dicing. Nat Rev Mol Cell Biol 6: 376-85.

69. Kim, Y.K. and V.N. Kim. 2007. Processing of intronic microRNAs. Embo J 26: 775-83.

70. Kishi, S., G. Wulf, M. Nakamura, and K.P. Lu. 2001. Telomeric protein Pin2/TRF1 inducesmitotic entry and apoptosis in cells with short telomeres and is down-regulated in human breast tumors. Oncogene 20: 1497-508.

71. Matranga, C., Y. Tomari, C. Shin, D.P. Bartel, and P.D. Zamore. 2005. Passenger-strandcleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes. Cell 123: 607-20.

72. Matzke, M.A. and J.A. Birchler. 2005. RNAi-mediated pathways in the nucleus. Nat Rev Genet 6: 24-35.

73. Maxwell, P.H., J.M. Belote, and R.W. Levis. 2006. Identification of multiple transcriptioninitiation, polyadenylation, and splice sites in the Drosophila melanogaster TART family of telomeric retrotransposons. Nucleic Acids Res 34: 5498-507.

74. Megosh, H.B., D.N. Cox, C. Campbell, and H. Lin. 2006. The role of PIWI and the miRNA machinery in Drosophila germline determination. Curr Biol 16: 1884-94.

75. Meister, G., M. Landthaler, A. Patkaniowska, Y. Dorsett, G. Teng, and T. Tuschl. 2004. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Mol Cell 15: 18597.

76. Melnikova, L., H. Biessmann, and P. Georgiev. 2005. The Ku protein complex is involved in length regulation of Drosophila telomeres. Genetics 170: 221-35.

77. Mikhailovsky, S. T. Belenkaya, and P. Georgiev. 1999. Broken chromosomal ends can be elongated by conversion in Drosophila melanogaster. Chromosoma 108: 114-20.

78. Miyoshi, K., H. Tsukumo, T. Nagami, H. Siomi, and M.C. Siomi. 2005. Slicer function of

79. Drosophila Argonautes and its involvement in RISC formation. Genes Dev 19: 2837-48.

80. Mochizuki, K. and M.A. Gorovsky. 2005. A Dicer-like protein in Tetrahymena has distinct functions in genome rearrangement, chromosome segregation, and meiotic prophase. Genes Dev 19: 77-89.

81. Mourelatos, Z., J. Dostie, S. Paushkin, A. Sharma, B. Charroux, L. Abel, J. Rappsilber, M.

82. Mann, and G. Dreyfuss. 2002. miRNPs: a novel class of ribonucleoproteins containing numerous microRNAs. Genes Dev 16: 720-8.

83. Noma, K., T. Sugiyama, H. Cam, A. Verdel, M. Zofall, S. Jia, D. Moazed, and S.I. Grewal.2004. RITS acts in cis to promote RNA interference-mediated transcriptional and post-transcriptional silencing. Nat Genet 36: 1174-80.

84. Nussenzweig, A., C. Chen, V. da Costa Soares, M. Sanchez, K. Sokol, M.C. Nussenzweig, and G.C. Li. 1996. Requirement for Ku80 in growth and immunoglobulin V(D)J recombination. Nature 382: 551-5.

85. O'Connor, M.S., A. Safari, D. Liu, J. Qin, and Z. Songyang. 2004. The human Rapl protein complex and modulation of telomere length. J Biol Chem 279: 28585-91.

86. Oikemus, S.R., N. McGinnis, J. Queiroz-Machado, H. Tukachinsky, S. Takada, C.E. Sunkel, and M.H. Brodsky. 2004. Drosophila atm/telomere fusion is required for telomeric localization of HP1 and telomere position effect. Genes Dev 18: 1850-61.

87. Okamura, K., S. Balla, R. Martin, N. Liu, and E.C. Lai. 2008. Two distinct mechanisms generate endogenous siRNAs from bidirectional transcription in Drosophila melanogaster. Nat Struct Mol Biol 15: 581-90.

88. Onodera, Y., J.R. Haag, T. Ream, P.C. Nunes, O. Pontes, and C.S. Pikaard. 2005. Plant nuclear RNA polymerase IV mediates siRNA and DNA methylation-dependent heterochromatin formation. Cell 120: 613-22.

89. Pal-Bhadra, M., B.A. Leibovitch, S.G. Gandhi, M. Rao, U. Bhadra, J.A. Birchler, and S.C. Elgin. 2004. Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery. Science 303: 669-72.

90. Palm, W. and T. de Lange. 2008. How Shelterin Protects Mammalian Telomeres. Annu Rev Genet.

91. Pane, A., K. Wehr, and T. Schupbach. 2007. zucchini and squash encode two putative nucleases required for rasiRNA production in the Drosophila germline. Dev Cell 12: 851-62.

92. Pardue, M.L., O.N. Danilevskaya, K. Lowenhaupt, J. Wong, and K. Erby. 1996. The gag coding region of the Drosophila telomeric retrotransposon, HeT-A, has an internal frame shift and a length polymorphic region. JMol Evol 43: 572-83.

93. Pardue, M.L. and P.G. DeBaryshe. 2003. Retrotransposons provide an evolutionarily robust non-telomerase mechanism to maintain telomeres. Annu Rev Genet 37: 485-511.

94. Pelisson, A., S.U. Song, N. Prud'homme, P.A. Smith, A. Bucheton, and V.G. Corces. 1994.

95. Gypsy transposition correlates with the production of a retroviral envelope-like protein under the tissue-specific control of the Drosophila flamenco gene. Embo J13: 4401-11.

96. Peterson, S.E., A.E. Stellwagen, S.J. Diede, M.S. Singer, Z.W. Haimberger, C.O. Johnson, M. Tzoneva, and D.E. Gottschling. 2001. The function of a stem-loop in telomerase RNA is linked to the DNA repair protein Ku. Nat Genet 27: 64-7.

97. Plasterk, R.H. 2006. Micro RNAs in animal development. Cell 124: 877-81.

98. Prescott, J. and E.H. Blackburn. 1997. Telomerase RNA mutations in Saccharomyces cerevisiae alter telomerase action and reveal nonprocessivity in vivo and in vitro. Genes Dev 11: 528-40.

99. Rand, T.A., S. Petersen, F. Du, and X. Wang. 2005. Argonaute2 cleaves the anti-guide strand of siRNA during RISC activation. Cell 123: 621-9.

100. Rashkova, S., S.E. Karam, R. Kellum, and M.L. Pardue. 2002a. Gag proteins of the two

101. Drosophila telomeric retrotransposons are targeted to chromosome ends. J Cell Biol 159: 397-402.

102. Rashkova, S., S.E. Karam, and M.L. Pardue. 2002b. Element-specific localization of Drosophila retrotransposon Gag proteins occurs in both nucleus and cytoplasm. Proc Natl Acad Sci USA 99: 3621-6.

103. Rashkova, S., A. Athanasiadis, and M.L. Pardue. 2003. Intracellular targeting of Gag proteins of the Drosophila telomeric retrotransposons. J Virol 77: 6376-84.

104. Robert, V., N. Prud'homme, A. Kim, A. Bucheton, and A. Pelisson. 2001. Characterization of the flamenco region of the Drosophila melanogaster genome. Genetics 158: 701-13.

105. Romero, D.P. and E.H. Blackburn. 1991. A conserved secondary structure for telomerase RNA. Cell 67: 343-53.

106. Saito, K., K.M. Nishida, T. Mori, Y. Kawamura, K. Miyoshi, T. Nagami, H. Siomi, and M.C. Siomi. 2006. Specific association of Piwi with rasiRNAs derived from retrotransposon and heterochromatic regions in the Drosophila genome. Genes Dev 20: 2214-22.

107. Sambrook and Russel. 2001. Molecular cloning. New York, Cold Spring Harbor press.

108. Samper, E., F.A. Goytisolo, P. Slijepcevic, P.P. van Buul, and M.A. Blasco. 2000. Mammalian Ku86 protein prevents telomeric fusions independently of the length of TTAGGG repeats and the G-strand overhang. EMBO Rep 1: 244-52.

109. Sarot, E., G. Payen-Groschene, A. Bucheton, and A. Pelisson. 2004. Evidence for a piwi-dependent RNA silencing of the gypsy endogenous retrovirus by the Drosophila melanogaster flamenco gene. Genetics 166: 1313-21.

110. Savitsky, M., O. Kravchuk, L. Melnikova, and P. Georgiev. 2002. Heterochromatin protein 1 is involved in control of telomere elongation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol 22: 3204-18.

111. Savitsky, M., D. Kwon, P. Georgiev, A. Kalmykova, and V. Gvozdev. 2006. Telomere elongation is under the control of the RNAi-based mechanism in the Drosophila germline. Genes Dev 20: 345-54.

112. Seto, A.G., A.J. Livengood, Y. Tzfati, E.H. Blackburn, and T.R. Cech. 2002. A bulged stem tethers Estlp to telomerase RNA in budding yeast. Genes Dev 16: 2800-12.

113. Seto, A.G., A.J. Zaug, S.G. Sobel, S.L. Wolin, and T.R. Cech. 1999. Saccharomyces cerevisiae telomerase is an Sm small nuclear ribonucleoprotein particle. Nature 401: 177-80.

114. Sheen, F.M. and R.W. Levis. 1994. Transposition of the LINE-like retrotransposon TART to Drosophila chromosome termini. Proc Natl Acad Sci U SA 91: 12510-4.

115. Shi, H., A. Djikeng, C. Tschudi, and E. Ullu. 2004. Argonaute protein in the early divergent eukaryote Trypanosoma brucei: control of small interfering RNA accumulation and retroposon transcript abundance. Mol Cell Biol 24: 420-7.

116. Sijen, T. and R.H. Plasterk. 2003. Transposon silencing in the Caenorhabditis elegans germ line by natural RNAi. Nature 426: 310-4.

117. Silva, E., S. Tiong, M. Pedersen, E. Homola, A. Royou, B. Fasulo, G. Siriaco, and S.D.

118. Campbell. 2004. ATM is required for telomere maintenance and chromosome stability during Drosophila development. Curr Biol 14: 1341-7.

119. Siolas, D., C. Lerner, J. Burchard, W. Ge, P.S. Linsley, P.J. Paddison, G.J. Hannon, and M.A. Cleary. 2005. Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers. Nat Biotechnol 23: 227-31.

120. Siriaco, G.M., G. Ccnci, A. Haoudi, L.E. Champion, C. Zhou, M. Gatti, and J.M. Mason. 2002. Telomere elongation (Tel), a new mutation in Drosophila melanogaster that produces long telomeres. Genetics 160: 235-45.

121. Smith, S., I. Giriat, A. Schmitt, and T. de Lange. 1998. Tankyrase, a poly(ADP-ribose) polymerase at human telomeres. Science 282: 1484-7.

122. Song, K., D. Jung, Y. Jung, S.G. Lee, and I. Lee. 2000. Interaction of human Ku70 with TRF2. FEBS Lett 481: 81-5.

123. Song, Y.H., G. Mirey, M. Betson, D.A. Haber, and J. Settleman. 2004. The Drosophila ATM ortholog, dATM, mediates the response to ionizing radiation and to spontaneous DNA damage during development. Curr Biol 14: 1354-9.

124. Sowd, G., M. Lei, and P.L. Opresko. 2008. Mechanism and substrate specificity of telomericprotein POT1 stimulation of the Werner syndrome helicase. Nucleic Acids Res 36: 424256.

125. Stapleton, W., S. Das, and B.D. McKee. 2001. A role of the Drosophila homeless gene in repression of Stellate in male meiosis. Chromosoma 110: 228-40.

126. Stellwagen, A.E., Z.W. Haimberger, J.R. Veatch, and D.E. Gottschling. 2003. Ku interacts with telomerase RNA to promote telomere addition at native and broken chromosome ends. Genes Dev 17: 2384-95.

127. Sugiyama, T., H. Cam, A. Verdel, D. Moazed, and S.I. Grewal. 2005. RNA-dependent RNApolymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci USA 102: 152-7.

128. Sugiyama, T., H.P. Cam, R. Sugiyama, K. Noma, M. Zofall, R. Kobayashi, and S.I. Grewal. 2007. SHREC, an effector complex for heterochromatic transcriptional silencing. Cell 128:491-504.

129. Svoboda, P., P. Stein, M. Anger, E. Bernstein, G.J. Hannon, and R.M. Schultz. 2004. RNAi and expression of retrotransposons MuERV-L and IAP in preimplantation mouse embryos. Dev Biol 269:276-85.

130. Tabara, H., M. Sarkissian, W.G. Kelly, J. Fleenor, A. Grishok, L. Timmons, A. Fire, and C.C. Mello. 1999. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell 99: 123-32.

131. Taddei, A., F. Hediger, F.R. Neumann, and S.M. Gasser. 2004. The function of nuclear architecture: a genetic approach. Annu Rev Genet 38: 305-45.

132. Taggart, A.K. and V.A. Zakian. 2003. Telomerase: what are the Est proteins doing? Curr Opin Cell Biol 15:275-80.

133. Tomari, Y., C. Matranga, B. Haley, N. Martinez, and P.D. Zamore. 2004. A protein sensor for siRNA asymmetry. Science 306: 1377-80.

134. Torok, T., C. Benitez, S. Takacs, and H. Biessmann. 2007. The protein encoded by the gene proliferation disrupter (prod) is associated with the telomeric retrotransposon array in Drosophila melanogaster. Chromosoma 116: 185-95.

135. Vagin, V.V., A. Sigova, C. Li, H. Seitz, V. Gvozdev, and P.D. Zamore. 2006. A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science 313: 320-4.

136. Villasante, A., J.P. Abad, R. Planello, M. Mendez-Lago, S.E. Celniker, and B. de Pablos. 2007. Drosophila telomeric retrotransposons derived from an ancestral element that was recruited to replace telomerase. Genome Res 17: 1909-18.

137. Volpe, T.A., C. Kidner, I.M. Hall, G. Teng, S.I. Grewal, and R.A. Martienssen. 2002. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science 297: 1833-7.

138. Walter, M.F. and H. Biessmann. 2004. Expression of the telomeric retrotransposon HeT-A in

139. Drosophila melanogaster is correlated with cell proliferation. Dev Genes Evol 214: 211-9.

140. Wienholds, E. and R.H. Plasterk. 2005. MicroRNA function in animal development. FEBS Lett 579:5911-22.

141. Wu-Scharf, D., B. Jeong, C. Zhang, and H. Cerutti. 2000. Transgene and transposon silencing in Chlamydomonas reinhardtii by a DEAH-box RNA helicase. Science 290: 1159-62.

142. Yi, R., Y. Qin, I.G. Macara, and B.R. Cullen. 2003. Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes Dev 17: 3011-6.

143. Zappulla, D.C. and T.R. Cech. 2004. Yeast telomerase RNA: a flexible scaffold for protein subunits. Proc Natl Acad Sci USA 101: 10024-9.

144. Zijlmans, J.M., U.M. Martens, S.S. Poon, A.K. Raap, H.J. Tanke, R.K. Ward, and P.M.1.nsdorp. 1997. Telomeres in the mouse have large inter-chromosomal variations in the number of T2AG3 repeats. Proc Natl Acad Sci USA 94: 7423-8.

145. Zilberman, D., X. Cao, L.K. Johansen, Z. Xie, J.C. Carrington, and S.E. Jacobsen. 2004. Role of Arabidopsis ARGONAUTE4 in RNA-directed DNA methylation triggered by inverted repeats. Curr Biol 14: 1214-20.1. Благодарности