Изучение молекулярно-генетических факторов, участвующих в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster

Проскуряков, Кирилл Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение молекулярно-генетических факторов, участвующих в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение молекулярно-генетических факторов, участвующих в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 577 214 4 575 22

ПРОСКУРЯКОВ КИРИЛЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ Изучение молскулярно-генстических факторов, участвующих в регуляции длины теломер у ВгоьорИйа те1апо&аь1ет.

Специальность 03 00 26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидат биологических наук

1 8 СИТ 2003

Москва 2008

003448795

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН, в группе Структурно-функциональной организации генома ОгозорИйа те1апо£а$1ег

Научный руководитель

кандидат биологических наук Мельникова Л С Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Любомирская Н В кандидат биологических наук Лазебный О Е

Ведущая организация Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН

диссертационный совет Д002 037 01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу 119334, Москва, ул Вавилова, д 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, д 32

Автореферат разослан г

Ученый секретарь диссертационного совета

Защита диссертации состоится

часов на заседании

канд фарм наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Теломеры - это специализированные ДНК-белковые комплексы, находящиеся на концах линейных хромосом Основной функцией теломер является обеспечение стабильности эукариотического генома В настоящее время доказано, что поддержание строго определенного размера теломер критично для жизнедеятельности организма Изменение длины теломер тесно связано с опухолеобразованием и старением клетки Поэтому изучение механизмов контроля определенной длины теломер является актуальной научной задачей

У большинства высших эукариот теломеры состоят из простых повторов G-богатой последовательности, а их удлинение обеспечивается специальным ферментом - теломеразой У Drosophila melanogaster теломеры состоя! из :.,с5ч.пьн<-ч< элементов типа LINE, ориентированных «голова к хвосту» - НеТ-А, TART я TAHRE

Основными структурными единицами нормальной теломеры являются 1) Терминальный комплекс, формирующийся на конце хромосомы и защищающий его от ферментов репарации, 2) Теломерный хроматин, который формируется на последовательностях теломерной ДНК Данные структуры играют основную роль в процессе регуляции длины и стабильности теломер

Несколько лет назад были получены линии Drosophila melanogaster, которые несли терминальные делеции Было установлено, что терминально делетированные хромосомы дрозофилы также как и хромосомы с нормальными теломерами способны устойчиво поддерживаться в течение многих поколений Кроме того, было показано, что НеТ-А и TART элементы способны присоединяться к концам терминально делегированных хромосом Эти данные свидетельствуют что у Drosophila melanogaster на концевых последовательностях терминально делегированных хромосом формируется нормальный теломерный хроматин и собирается терминальный белковый комплекс Поэтому терминально делетированные хромосомы дрозофилы могут служить удобной модельной системой для изучения механизмов поддержания стабильной длины теломер и поиска составляющих компонентов специфических теломерных структур

Данные, полученные в нашей лаборатории в течение нескольких последних лет, свидетельствуют, что теломерный хроматин, формирующийся у Drosophila melanogaster на концевых последовательностях ДНК длиной 4-5 т п и обладает особыми свойствами Однако вопрос о том, как - позитивно или негативно - влияет теломерный хроматин на сборку субтеломерных белковых комплексов, до сих пор остается открытым В настоящей работе мы

изучили, каким образом теломерный хроматин влияет на репрессию, вызываемую белками группы Polycomb, которые участвуют в формировании субтеломерного хроматина

Гены, контролирующие длшгу теломер, в настоящее время неизвестны Несколько лет назад у Drosophila melanogaster были найдены два доминантных генетических фактора, влияющие на удлиннение теломер - это Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)) В представленной работе с помощью одной и той же модельной системы было проведено сравнение свойств генетических факторов Tel и E(tc) Цели и задачи исследования.

Основными целями данной работы являлись 1) изучение влияния теломерного хроматина на формирование субтеломерных белковых комплексов, 2) функциональное сравнение генетических факторов Tel и E(tc), влияющих на удлинение теломер Drosophila melanogaster

В работе были поставлены следующие задачи:

1 Создать модельные системы, позволяющие исследовать свойства теломерного хроматина и сравнить недавно открытые мутации Enhancer of terminal gene conversion и Telomere elongation

2 Выяснить как теломерный хроматин влияет на формирование репрессионного комплекса белков группы Polycomb

3 Определить участником какого механизма поддержания длины теломер (присоединения мобильных элементов к концу хромосомы или конверсии/рекомбинации) является доминантный генетический фактор Telomere elongation

Научная новизна и практическое значение работы-

В представленной работе впервые было показано, что особая структура теломерного хроматина негативно влияет на формирование репрессионного Polycomb-зависимого комплекса Полученные результаты позволяют предположить, что существует антагонизм между теломерным и субтеломерным (PcG-зависимым) хроматином

Кроме того, были функционально разделены новые генетические факторы Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)), участвующие в контроле длины теломер у дрозофилы Было установлено, что локализованные в одном и том же районе хромосомы 3 Tel и Eft с) являются разными мутациями Также, впервые было показано, что на второй хромосоме в линии Gaiano присутствует неизвестный генетический фактор, участвующий в контроле длины теломер

Несмотря на различия в структуре теломер, у теломеразозавимых организмов и у дрозофилы существуют общие механизмы, обеспечивающие поддержание стабильного

размера теломер Во-первых, эксперименты, проведенные на дрожжах и млекопитающих, доказали, что при инактивации теломеразы у данных организмов индуцируется альтернативный механизм удлинения теломер, связанный с процессами конверсии\рекомб|шации В том числе, альтернативные механизмы удлинения теломер часто реализуются в раковых клетках Во-вторых, в последнее время было найдено, что некоторые консервативные белки, участвующие в репарации ДНК, также принимают участие в формировании терминального комплекса, как у дрожжей и млекопитающих, так и у дрозофилы Поэтому данные, полученные при изучении теломер дрозофилы помогают понять закономерности процесса регуляции длины теломер у различных эукариотических организмов и выявить основные белки, формирующие теломерный комплекс

Апробация работы:

Основные результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции молодых ученых Young Scientist Forum (Вена, 2007), на 32-ой конференции FEBS (Вена, 2007), на международной молодежной научно-методической конференции «Пробземы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007)

Публикации

По теме диссертационной работы опубликованы две научные статьи и тезисы, представленные на грех конференциях

Структура и объем работы-

Диссертация изложена на 88 страницах, включает 2 таблицы, 18 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 112 источников

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Выбор базовой модельной системы для изучения свойств Polycomb-зависимого хроматина.

Ген polyhomeotic - один из генов группы Polycomb (PcG), которая включает около 30 локусов, играющих важную роль в процессе нормального развития дрозофилы и действующих как репрессоры гомеозисных генов (Jürgens, 1985) Известно, что PcG гены кодируют белки, которые влияют на компактизацию хроматина (Pirrotta & Rastelli, 1994) и связываются с особыми сайтами, названными Polycomb group Response Elements (PREs), найденными в регуляторных областях гомеозисных генов (Simon et al, 1993)

Несколько лет назад в нашей лаборатории было показано, что в результате встраивания Р-элемента в ген polyhomeotic возникает новый аллель pif' (Belenkaya et al, 1998) Аллель pif'

кодирует химерный белок P-Polyhomeotic (P-Ph), состоящий из ДНК-связывающего домена транспозазы Я-элемента и белка Polyhomeotic, у которого на N-конце отсутствуют 12 аминокислот Белок P-Ph связывается с последовательностью Р-элемента и рекрутирует другие PcG белки, что приводит к образованию функционального репрессионного комплекса, те в этом случае концевые последовательности /'-элемента выступают в роли PRE Таким образом, если /"-элемент встраивается перед промотором гена yellow, в присутствии мутации pif' наблюдается репрессия транскрипции этого гена Ген yellow отвечает за окраску кутикулярных структур дрозофилы В норме тело, крылья и щетинки у мухи имеют темную окраску При /»//''-зависимой репрессии тело и крылья дрозофилы становятся более светлыми, а щетинки приобретают вариабельную окраску (часть щетинок окрашена, а часть неокрашена) Сильная степень репрессии выражается в полном отсутствии окраски кутикулярных структур - тело, крылья и щетинки у мух светло-желтые

Как упоминалось ранее, у дрозофилы теломерный хроматин может формироваться на любой неспецифичной последовательности ДНК Ранее было показано, что теломерный хроматин, образующийся на концах терминально делегированных хромосом, негативно влияет на активность транспозазы /"-элемента (Melnikova et al, 2004) Чтобы выяснить, влияет ли теломерный хроматин на степень ¿»/^'-зависимой репрессии, мы использовали линии Drosophila melanogaster, в которых концевые последовательности ДНК, формирующие нормальную теломеру, отсутствовали, и концы X хромосом находились в кодирующей или регуляторной области гена yellow (линии у71') (Mason et al, 1984, Biessmann & Mason, 1988) Локус yellow определяет пигментацию кутикулы, при этом степень пигментации прямо коррелирует с уровнем транскрипции, что позволяет визуально оценивать экспрессию гена Энхансеры гена yellow, отвечающие за окраску тела и крыльев, расположены на расстоянии около 1 т п н перед промотором гена, а энхансер, отвечающий за окраску щетинок находится в нитроне (Рис 1) Поэтому, когда в линиях, несущих терминальные делении, отсутствуют дистальные энхансеры, мухи имеют фенотип у2 - тело и крылья остаются желтыми, а щетинки окрашены Однако необходимо отметить, что вследствие негативного влияния теломерного хроматина, энхансеры гена yellow неактивны, если они находятся на расстоянии менее 4 т п н от конца терминально делегированной хромосомы (Mikhailovsky et а!, 1999)

Таким образом, степень пигментации кутикулы прямо кореллирует с расстоянием до конца терминально делегированной хромосомы чем больше расстояние между энхансерами и концом хромосомы - тем темнее у мух тело и крылья

Ген yellow находится на дистальном конце X хромосомы. Гемизиготные самцы или гомозиготные no ут-хромосоме самки не выживают, так как между геном yellow и теломерой находятся несколько жизненно важных генов.

Н N Н

Кр Т -рг- щ

НК В SK N £

R S N

3" 2 5 7

1 V'4

С5Л

и а -е11 • - "М

1.5 1.0

0.5

Рис. 1. Схема строения линии ую1. Обозначения: направление транскрипции гена yellow показано горизонтальной стрелкой над осью координат. Экзоны гена обозначены черными горизонтальными прямоугольниками. Энхансеры тела (Т), крыльев (Кр) и щетинок (Щ) обозначены серыми овалами. Н - Hindlil. К - Крп\, В - BumYiJ, N - Ncol, S - Spe 1, R - ScoRl. Серыми горизонтальными стрелками обозначены лраймеры для ПЦР-анализа. Вертикальная стрелка обозначает место обрыва X хромосомы в линии утш. Отрезок под осью координат - фрагмент гена yellow, использованный для гибридизации с ДНК полученных производных линий. Ниже приведены результаты Саузерн-блот анализа линии угш, буквы над изображением обозначают использованные рестриктазы. Для гибридизации использовали фрагмент BamHl-Spel из кодирующей части гена yellow.

Поэтому для поддержания терминально делегированных хромосом используют различные балансерные линии. Для проведения экспериментов нами была выбрана линия yTDIw"/y ac w. В балансерной линии у ас w последовательности гена yellow отсутствуют, но сохраняется нормальная теломера. Поэтому хромосома у ас w не мешает молекулярному и фенотипическому анализу гомологичной хромосомы, несущей терминальную делецию. Мухи линии yTD1 /у ас w имели неокрашенные (светло-желтые) тело, крылья и щетинки, что говорит об отсутствии транскрипции гена yellow. С помощью Саузерн-блот анализа мы установили, что в описываемой линии отсутствует вся регуляторная область гена yellow, включая промотор (Рис. 1).

2. Получение терминально делетированных хромосом, содержащих Р-элсмент в предпромоторной области гена yelhw.

Терминально делегированная хромосома может удлиняться при помощи генной конверсии, что позволяет получить измененные последовательности ДНК в нативном положении гена yellow (Melmkova & Georgiev, 2005). Это возможно, если матрица для конверсии частично гомологична оборванной хромосоме, но содержит в своем составе некую новую последовательность. В качестве матрицы для терминальной генной конверсии мы использовали линию дрозофилы у2',4\с, в которой /"-элемент размером 1200 п.н. встроился перед промотором гена yellow в положение - 69 п.н. относительно сайта начала транскрипции гена (Belenkaya et at., 1998) (Рис. 2). Самки из линии yTD'/y ас w и самцы из линии у2'и w были скрещены между собой.

1 О

1.П.Н.

X н р

yettow

нк в к

----Щ -

-69 п.н,

Рис. 2. Схема строения мутаптпого аллеля y2sU. Ориентация /^-элемента указана стрелкой внутри обозначающего его треугольника. -69 п.н. - расстояние от Р-элемента до сайта начала транскрипции гена yellow. X - Xhol. Остальные обозначения смотри рис. I.

Целью этого скрещивания являлось получение производных линий, в которых /'-элемент, встроенный в предпромоторную область гена yellow, должен был находиться на разном расстоянии от конца терминально делетированных хромосом. Ранее было показано, что теломерный хроматин супрессирует генную конверсию, которая потенциально возможна при возникновении терминальной делеции (Melnikova et а!., 2004). Поэтому для повышения вероятности конверсионных событий в исходные линии дополнительно вводилась мутация E(tc), которая увеличивает частоту терминальной генной конверсии в десятки раз. Полученные гетерозиготные самки yTDw"/ y2sl4w были скрещены с самцами y2*l4w. Линия

TD1 а, 2*14

у w / у' w поддерживалась на протяжении трех поколении, в течение которых происходили конверсионные события. Затем самки yT0'w°/ y2sl4w' были скрещены с самцами

н н

- кр ; т

у-мрУ'. В потомстве этого скрещивания были получены мухи с разной степенью рУ'-зависимой репрессии.

Самки уТ1)1м1"/ ууорУ'1 с полностью окрашенными или вариабельными щетинками были отобраны и индивидуально скрещены с самцами у ас и\ Саузерн-блот анализ полученных производных линий (Рис. 3) выявил прямую корелляцию между эффектом, который мутация р№ оказывала на окраску щетинок и расстоянием от /'-элемента до конца терминально делетировакной хромосомы. Полученные результаты позволили нам разделить производные линии на 4 класса (А, В, С, Р).

3. Анализ /^""-зависимой репрессии в полученных производных линиях ОгоьорИНа

Самки класса А - \т" А\\-"/у\\рИ'', имели фенотип у2. ¡3 этом случае терминальный обрыв хромосомы находился на расстоянии 100 - 500 п.н. по отношению к сайту встраивания Р-элемента в аллелеуг>м(Рис. 3, табл. I класс А).

11 10 9876543210

Т.11.Н

D С ............ В............. .......А............

X н

3D 5f) :n ID -И) 2( К И 2В )В ЯВ 4В 5Б 4А 1Л 2А ЗА ,ww

, 1 -Y У/" "V"

123 4 5 12312 345 1234

-10

-8

-6

-5

-4

-2 -1.5

фрагмент BamHl-HindlU

Рис. 3. а - Схематичное изображение линий с терминально делегированной X хромосомой, использованных в работе. Обозначения: Пунктирными отрезками обозначены районы, в которых были картированы терминальные обрывы - вертикальные стрелки над осью координат - у соответствующих классов производных линий. Остальные обозначения смотри рис. 1 и рис. 2. б - Картирование терминальных обрывов хромосом в получепных производных линиях разных классов. ДНК производных линий была обработана рестриктазой Вам HI, для гибридизации был использован фрагмент Hindlll-BamHl из rem yellow.

Однако несмотря на присутствие Р-элемента в предпромоторной области гена yellow, в отобранных линиях класса А ^//'-зависимая репрессия отсутствовала Возможно, в данном случае на последовательностях Р-элемента не собирался репрессионный комплекс

Таблица 1 Влияние расстояния между Р-элементом и концом терминально делегированной хромосомы на Polycomb-зависимую репрессию гена>е//<ж>

Класс Генотип линии Окраска щетинок

А (100-500 п н ) уША/уас yTDÁ/ypWl + + +

В (2-3,5 тпн) у /у ас утов/уРИ" + слабо вариабельная слабо вариабельная

С (5-6 тпн) у /у ас у^с/урН" + средне вариабельная средне вариабельная

D (>8 тпн) у /у ас yTD-D/ypff> + сильно вариабельная неокрашены

/ш(>10тпн) yh'u !у ас /TD/ypff' yhTD/y2s"plf' + сильно вариабельная неокрашены

контроль уЫ4/урГ уЫ4/у2°"рН" сильно вариабельная неокрашены

Пояснение В скобках указано расстояние между Я-элементом и терминальным обрывом хромосомы Окраска щетинок + - щетинки полностью окрашены как у мух дикого типа, слабо вариабельная - неокрашены 10-20% щетинок и волосков, средне вариабельная - неокрашеиы 30-60% щетинок и волосков, сильно вариабельная - неокрашены 80-90% щетинок и волосков, неокрашены - все щетинки и волоски светло-желтого цвета (фенотип у')

Чтобы проверить данное предположение, мы попытались воспроизвести известный феномен кооперативной репрессии, который выражается в усилении активности слабого PRE при наличие сильного PRE на гомологичной хромосоме Для этого был использован аллель уь" (Belenkaya et а!, 1998), содержащий две копии Я-элемента перед промотором гена yellow в положении - 69 п н относительно сайта начала транскрипции (Рис 4)

В присутствии мутации рУ1 Рс-О комплекс, который собирается на двух .Р-элементах, вызывает полную репрессию транскрипции гена yellow Поэтому последовательности Р-элементов в аллелеу*1" выступают в роли эффективного PRE У гетерозиготных самок у2*'4/у pff1 тело и крылья слабо окрашены, а окраска щетинок сильно вариабельная, тогда как гетерозиготные самки уЫ4/ уы>РИ" имеют фенотип у' (неокрашенные тело, крылья и щетинки) (табл 1 контроль)

Наблюдаемое в этом случае усиление репрессии in Irans обусловлено взаимодействием PcG комплексов, собирающихся на Р-элементах гомологичных хромосом. Однако в гетерозиготных линиях утг>'А/ у1'"/)^'1 щетинки у мух оставались полностью окрашенными, следовательно, даже мощный репрессионный комплекс на гомологичной хромосоме не усиливает репрессию в линиях, где P-Ph ассоциированный белковый комплекс, вероятно, не может связаться с последовательностью /-элемента, расположенного практически на конце хромосомы.

У гетерозиготных самок yr!>Bw1 /у^рУ', отнесенных нами к классу В, в окраске щетинок наблюдалась слабая вариабельность, а терминальный обрыв находился на расстоянии 2 - 3,5 т.п.н. от места встраивания Р-элемента. Однако аллель ybup1i'' не усиливал репрессию in Irans (Рис. 3, табл. 1 класс В).

В линиях класса С расстояние между концом терминально делегированной хромосомы и Р-элементом составляло около 5 т.п.н. В этом случае у гетерозиготных самок у"' ' w"/vwph1'1 часть щетинок была неокрашена (средняя степень вариабельности), т.е. наблюдалась частичная /з/г"'-:зависимая репрессия. Однако эта репрессия не усиливалась, даже если линии yTD'1 скрещивались с аллелем yls"pH''(?nc. 3, табл. 1 класс С). Вероятно, в классах В и С связывание репрессивного белкового комплекса с последовательностью Р- элемента, расположенного близко к концу хромосомы было очень нестабильным.

Щ-

Рис. 4. Схема строения мутантного аллеля y2s,lw. Ориентация двух Р-элемснтов указана стрелками внутри обозначающего их треугольника. Остальные обозначения смотри рис. 1 и рис. 2.

Для полного восстановления р/^'-зависимой репрессии требуется, чтобы расстояние между Р-элементом и местом терминального обрыва хромосомы было не менее 8 т.п.н. В линиях, отнесенных нами к классу D - ут[>'° размер последовательности, зачитанной с помощью терминальной генной конверсии составлял от 8 до 12 т.п.н. В этом случае энхансеры гена yellow, также как и Р-элемент, находились на большом расстоянии от конца хромосомы, поэтому окраска тела, крыльев и щетинок у мух была сравнима с диким типом. У

1 О

Т ПН

X Н X

Кр Т

2хР

Xt'lfHH'

нк в к

-69 п.н.

гетерозиготных стоку70'0 и>"/уч/рИ1' тело и крылья светлели, а щетинки становились сильно вариабельными в той же степени как в контрольной линии уъ,41умрИ'1. Если же в положении ¡п-1гат присутствовала хромосома у2'прИ'! {у100/ у2'"рНр1), мухи имели фенотип у1 (Рис. 3, табл. 1 класс О). Следовательно, в данном случае на последовательности /"-элемента собирался функциональный репрессионный комплекс.

Интересно, что в одной из производных линий с максимальной степенью ¿»//''-зависимой репрессии рестриктная карта последовательности ДНК, находящейся между Р-элементом и концом терминально делегированной хромосомы частично не совпадала с рестриктной картой гена уе11ст' (Рис. 5).

11 10 987654 3210

т.п.н.

X н

и-, л mRKm * Р

Н НКН н н ЬК ! В К R уп

- Кр , Т -Щ--

I-1

у /у-ас-B-R. В К R

—10 ,—8

Рис. 5. Схематичное изображение линии у Место присоединения ИеТ-А элемента в аллеле у'7; показано вертикальной стрелкой над осью координат. НеТ-А элемент обозначен черной горизонтальной стрелкой. Ниже приведены результаты Саузерн-блот анализа линии yhTD, обработанной различными рестриктазами. Для гибридизации использовали фрагмент HindlW-HindlII из регуляторной части гена yellow (черный горизонтальный отрезок под осью координат). Остальные обозначения смотри рис. I, рис. 2. и рис.3.

На основании дополнительного Саузерн-блот анализа было выдвинуто предположение, что в данном случае к последовательности гена yellow, зачитанной при терминальной конверсии, присоединился НеТ-А элемент, поэтому линия получила название yhTD. ПЦР с использованием праймеров из регуляторной области гена yellow и 5' нетранслируемой области НеТ-А элемента позволила амплифицировать фрагмент ДНК в месте предполагаемого присоединения. В дальнейшем амплифицированный фрагмент был клонирован в плазмиду

pBluescnpt II SK(+) и просеквенирован Полученные результаты подтвердили, что в линии yhT0 терминальный фрагмент ДНК является последовательностью НеТ-А элемента

4 Выбор базовой модельной системы для сравнения свойств мутаций Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc))

Ранее в нашей лаборатории было показано, что у дрозофилы удлинение теломер может происходить по трем механизмам с помощью транспозиции мобильных элементов на конец хромосомы, с помощью генной конверсии и с помощью рекомбинации между таломерными повторами (Kahn et at, 2000) В 2002 году у Drosophita melanogaster были найдены два доминантных генетических фактора, влияющие на удлиннение теломер- это Telomere elongation (Tel) (Siriaco et al, 2002) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)) (Melnikova & Georgiev, 2002) Мутация Tel, выделенная из природной л»«ии Gaiano, существенно увеличивает количество мобильных элементов НеТ-А и TART в теломерных районах хромосом Мутация Tel была идентифицирована при помощи in situ гибридизации политенных хромосом линии Oregon, несущей хромосому 3 из линии Gaiano, с фрагментами ДНК НеТ-А и TART элементов Поэтому неизвестно, какой именно механизм - присоединение новых ретротранспозонов или конверсия/рекомбинация между гомологичными последовательностями мобильных элементов - привел к увеличению количества НеТ-А и TART (Smaco et al, 2002)

В отличие от Tel, мутация E(tc), обнаруженная нами в лабораторной линии у w, практически не влияет на присоединение НеТ-А и TART элементов, но значительно повышает частоту терминальной генной конверсии Функциональная роль E(tc) изучалась при помощи линий с терминально делетированной X хромосомой, в которых терминальный обрыв находился в регуляторной области гена yellow (yw") (Melnikova & Georgiev, 2002)

С помощью генетической рекомбинации оба фактора, Tel и E(tc), были локализованы в районе 91-93 хромосомы 3R Этот район включает более 320 тли и 27 описанных на настоящий момент генов Возникает вопрос являются ли Tel и Е(1с) одной и той же мутацией или это мутации в различных генах'* Если мы имеем дело с одной и той же мутацией, то разница в природе наблюдаемых событий (присоединения мобильных элементов и терминальная генная конверсия) обусловлена модельной системой и методами исследования, при помощи которых был обнаружен соответствующий генетический фактор

Чтобы выяснить, может ли Tel также как E(tc) вызывать увеличение частоты терминальных генных конверсий, мы решили протестировать мутацию Tel в обычно используемой нами модельной системе Для этого мы заменили аутосомы в выбранных дня работы линиях yTD'/y w на хромосому 2(G2/G2) или 3(G5/G3) из линии Gaiano С помощью

генетических скрещиваний были получены контрольные линии у /у w; CyO/If; TM6,Tb/MKRS,Sb , в которых все аутосомы являлись балансерными хромосомами, то есть не несли какие-либо факторы, влияющие на изменение длины теломер; линии yTD /у w; G2/G2; TM6,Tb/MKRS,Sb , которые несли хромосому II из линии Gaiano и линии yTD /у w; CyO/If; G3/G3, которые несли хромосому III из линии Gaiano.

S. Получение линий дрозофилы, несущих терминально делегированные хромосомы и аутосомы из линии Gaiano.

Изначально были использованы 3 линии, в которых концы терминально делегированных хромосом находились на расстоянии -80 п.н.( у™0), -100 п.н.( yTD'W0), -140 п.н.( у D U0) 0т сайта начала транскрипции гена yellow (Рис. 6).

/(А-)

тт°£

1 ТД1.Н.

Н NGH Кр Т

нк

В SK N

— щ -

Rglll Nco\ EcoRl Spe I

фрагмент ВатШ-Clal

0.9

3 I

2 5 ^ гй W n X

Ё Л

2 о Ш .

0.7

Рис. 6. Схематичное изображение линий с терминальными делениями уТ°~80^ у7Х>"ш, у >ыо. Обозначения: вертикальными стрелками обозначены места обрывов X хромосомы в соответствующих линиях. Пунктирными линиями обозначены различные фенотипы от у1 до у2, не окрашенные аристы - А-. ТАТА-бокс (Т) обозначен квадратом, +1 - начало транскрипции. С - Clal, G - В gill. Ниже приведены результаты Саузерн-блот анализа линий yTD'S0, yTD'100^ yTD-i40^ над изображением обозначены использованные рестриктазы. Для гибридизации использовали фрагменты BamHl-Clal^ BamHl-Spel из кодирующей части гена yellow. Остальные обозначения смотри рис. I и рис. 3.

В исходных линиях yTD' терминальный обрыв хромосомы находился в непосредственной близости от промотора гена yellow, отсутствовали энхансеры, отвечающие за пигментацию тела и крыльев, но в интроне гена присутствовал энхансер, отвечающий за окраску щетинок, поэтому мухи имели неокрашенные тело и крылья и вариабельно окрашенные щетинки -фенотип yv

В таких линиях присоединение содержащего промотор НеТ-А элемента к концам терминально делетированных хромосом приводит к появлению мух, у которых все щетинки становятся полностью окрашенными - фенотип у2 (Kahn et а!, 2000) В используемых линиях хромосома ут' была сбалансирована хромосомой у и', т к гомозиготные по терминально делегированной хромосоме мухи не выживают Аллель у w не мешает фенотипическому анализу, т к вследствие замены нуклеотида в aTG кодо.»с re" yellow не экспрессируется Однако в линии yTD / у w хромосома, несущая аллель у w, может служить матрицей для терминальной генной конверсии (Mikhailovsky et al, 1999) Поэтому удлинение хромосомы уTD' может происходить как с помощью присоединений мобильных элементов, так и с помощью терминальных конверсий Появление в результате конверсии перед промотором гена yellow последовательности размером до 1700 пн также приводит к возникновению у2 фенотипа После введения в линии у725 so, yw ,оя и уш,4° аутосом из линии Gaiano и балансерных хромосом в потомстве были отобраны отдельные самки, имеющие фенотип у2 Необходимо отметить, что такие самки появились только в линияхyTD'fy w, CyO/lf, G3/G3

6 Анализ природы производных линий, полученных на фоне мутации Tel.

Скрестив отобранных самок, имеющих фенотип у2 с самцами у ас w, у которых на X хромосоме отсутствовали последовательности гена yellow, мы получили индивидуальные производные линии дрозофил Чтобы выяснить, какое именно событие - терминальная генная конверсия или присоединение мобильного элемента явилось причиной изменения фенотипа в полученных линиях, структура терминально делетированных хромосом в этих линиях была изучена с помощью Саузерн-блот анализа и ПЦР-анализа с использованием праймеров из промоторной области гена yellow и из 5' нетранслируемой области НеТ-А и TART элементов (Рис 7)

Всего нами было протестировано 132 индивидуальные линии Полученные результаты показали, что генетический фактор Tel, находящийся в линии Gaiano на хромосоме 3 вызывает два типа событий Было установлено, что в 39 производных линиях удлинение хромосомы произошло вследствие присоединения мобильного элемента к концу терминально делетированной хромосомы, в остальных же 93 линиях при помощи терминальной генной конверсии

3 _ у V— уг(А+) ____________у2(_а:>_______

S G

W'lhw

„ Н Jl R V

Кр Т -Х--tH~y

У(А-)

cTGl+171 пн.)

-. TV-80 TD-100 TD-140

HeT-A(TART)-Li_J-MA)nj

У(А-)

^-------------------- 1и,аи IU.TUU

IM_>(А) ,_-У 'У

¿i

фра] мент B(wiH\-EcoR\

фрагмент Hi mil W-HimÜ i 1

Рис. 7. а) Схематичное изображение линий с терминальными делециями у7™0, у70100, уТо-но положение терминальных обрывов указано по отношению к балансерной хромосоме у w, черными стрелками изображены возможные присоединения мобильных элементов, а пунктирной стрелкой - терминальная генная конверсия, приведены исходные и производные фенотипы от у до у". Окрашенные аристы - А+, не окрашенные аристы -А-. S-Saä. Остальные обозначения смотри рис. 1 и рис. 6. б) Результат Саузерн-блот анализа потомства производных от ут ' ут'100 и уТй-140 с фенотипом у'(А-). Мембрана была последовательно

сгибридизована с двумя районами гена yellow. Звездочками отмечены линии, в которых происходили присоединения Het-A элемента, нижняя размытая полоса соответствует расстоянию от сайта £coRI до конца хромосомы.

7. Анализ соотношения частоты терминальной генной конверсии и присоединений мобильных элементов к концу хромосомы в созданной модельной системе.

Чтобы выяснить, как в присутствии доминантного фактора Tel соотносятся частота конверсионных событий и частота присоединений мобильных элементов к концу хромосомы, мы использовали две полученные производные линии, в которых мухи имели фенотип у2 и неокрашенные аристы, а терминальный обрыв хромосомы находился на расстоянии -900 п.н.( у D'900) и -1100 п.н.( yTD'llQö) от сайта начала транскрипции гена yellow, то есть в непосредственной близости от энхансеров тела и крыльев (Рис. 8а).

___________________________-

у5 уВ

э о

I т.п.«.

у2(А-) ......

гЛ.»'

н Д-^^у'

Н Н

_ Кр т ---^-

сТ8(«171 пл.)

У*—УГ

--.---------571—, Н-1 ™.900

НсТ-ДО-ЛЯГ)___/(А-)—У(А-^) >(д)п|_}у

у**—У'

'-------------------------------------- (-\

НеТ-А(ТАЯТ)_/(А-) —/(А+) ■>(д)ч_}У

б П.,.„ у».»« г /""......!у:и! ;СуО/1[:С1И/СП11

гпн

I-2

—0.9 АМН Щ _1.1

фрагмент ИатН\-Н//иЛ1\

I *

фрагмент ВатН\-Нмсй\\

ут'"'/у'к':СуО//[:С/1Ш11 у""*/у'к :СуО/1(;СШ/СП1

У' у' У' У' У2У' У' у2 Уг У / У' К// у1 у' у' у' у* у' У1 у' у* / у' у1 у у' у' у'

9.8кЬ- » ш —

10 9.8кЬ- . ■ -да- ■ ■ -щит......,„. 1°

- ~ ' "И 2

- 6 5

* _ ( 5 т 4

_ 4 3.5

Р % " «... * «

2.5 9 9 "* 2

2 ' 1.5

фрагмент ¿Л 11

фрагмент 5а/и111 -Ниий II

фрагмент у5-у6

Рис. 8. а) Схематичное изображение линий с терминальными делениями у70 900\ уТГ>-"°° Многоточием обозначены конверсии, не приводящие к изменению фенотипа, б) Саузерн-блот анализ потомства индивидуальных самок уют/у1 н7:СуО/1/;ТМ6,ТЬ/МКЯЗ,8Ь с исходным фенотипом /'(А-), в) Саузерн-блот анализ потомства контрольных линий ут'ш/утг>-1т/уСу0/1/;ТМ6, ТЫМКЛЗ,БЬ. г) Пример Саузерн-блот анализа производных линий у т/уш'т/у1 К,/;Су0/1'{:СЯ//С/Я ДНК линий обрабатывалась рестриктазой ВатШ. Мембраны, показанные на Рис. 8а и 96, гибридизовались с фрагментом Ват\\\~Шпс1\\\ из регуляторной части гена уеНоы, на Рис. 8г дополнительно с фрагментом у5-уб. Остальные обозначения смотри рис. 1, рис. 5 и рис. 7,

Ранее было показано, что при присоединении НеТ-А или TART элемента к концам терминально делегированных хромосом, расположенным в этой области, окраска тела и крыльев не изменяется, но полностью восстанавливается окраска арист (Savitsky et al, 2002) Также было показано, что при появлении на конце терминально делегированной хромосомы энхансеров тела и крыльев, мухи становятся более темными

Уровень пигментации кутикулы прямо кореллирует с размером зачитанной при конверсии последовательности - чем больше расстояние от энхансеров до конца хромосомы, тем темнее тело и крылья - фенотипы у' и у+ (Mikhailovsky et al, 1999) (Рис 8а) Таким образом, мы можем фенотипически различать, какой именно механизм привел к удлинению хромосомы в потомстве выбранных линий В линии yTD 9М и yTD """ нами были введены хромосомы 2 и 3 из линии Galano, а также балансерные хромосомы Затем из производных каждой линии нами были отобраны по 3 самки, которые имели только вторую (G2/G2) или третью (G3/G3) хромосому из линии Galano или же почностью стабилизированные аутосомы (CyO/If, ТМ6, Tb/MKRS,Sb)

Далее был проведен фенотипический анализ потомства этих самок Все мухи, имеющие темную окраску тела и крыльев или окрашенные аристы были отобраны

ПЦР-анализ с использованием праймеров из различных участков гена yellow и из 5' нетранслируемой области НеТ-А элемента подтвердил, что различные обнаруженные в потомстве фенотипы соответствуют разным механизмами удлинения терминально делегированной хромосомы

Потомство каждой линии с неизмененным фенотипом (у2, неокрашенные аристы) было размножено и в следующем поколении был проведен количественный анализ частоты присоединений НеТ-А элементов и терминальных генных конверсий (Табл 2)

Среди потомства контрольных линий ут"'/у w, CyO/If, ТМб Tb/MKRSSb мы обнаружили только 3 самки с темными аристами, то есть частота присоединений мобильных элементов к отдельному концу хромосомы в этих линиях не отличалась от нормальной, которая варьирует в пределах от 10 1 до < 10"4 (Btessmann et al 1992, Kahn et al 2000, Golubovsky et al 2001)

Саузерн-блот анализ выявил, что в контрольных линиях происходила постепенная деградация конца хромосомы (Рис 86) Этот результат подтверждает, что модельная

TD' г

хромосома у не содержит какие-либо мутации, влияющие на изменение длины теломер

В двух линиях yTD'/y w, G2/G2, ТМ6, Tb/MKRS Sb также были найдены только 2 самки, у которых к концу терминально делетированной хромосомы присоединился НеТ-А элемент Однако в остальных четырех линиях, несущих хромосому 2 из линии Gaiano, наблюдалось небольшое увеличение частоты транспозиций мобильных элементов к концам терминально

делегированных хромосом (Табл 2) Во всех линиях ути'/у и', СуО/Ц, СЗЮЗ удлинение терминально делегированных хромосом происходило с высокой частотой при помощи обоих механизмов - присоединений НеТ-А элементов и терминальных генных конверсии - что было подтверждено молекулярными методами анализа (Рис 8в, табл 2)

Таблица 2 Анализ соотношения частот транспозиций мобильных элементов к концу хромосомы и терминальных генных конверсий в присутствии мутации Те1

Генотип линии у10' Общее Количество самок Количество

количество самок фенотипа у2, окра- самок

в линии шенные аристы (% от общего количества) фенотипов у'- у+, (% от общего количества)

у'и м, контроль 945 1 (.0,1) -

у'и ш,2/у и>, контроль 450 - -

уштн/у*, контроль 832 - -

у'и-"»а"/у»>,к онтроль 778 1 (0,1) -

н>, контроль 287 - -

у'ии"т/у», контроль 985 1(0,1) -

уш-шт/у^ 02/02 1178 41 (3,5) -

у'^'/у П', С2/С2 961 1 (0,1) -

ушт"/ук, 02/02 1274 9 (0,7) -

уш"т"/ук, 02/02 789 I (0,1) -

у,1"'т"/уу,, 02/02 1330 12(0,9) -

и-, 02/02 583 24(4,1) -

03/03 450 12 (2,7) 41 (9,1)

у,ито"/уы,ОЪЮЪ 800 94(11,8) 4(0,5)

860 195 (22,7) 87(10)

У™/у№,03/03 973 161(16,5) 12(1,2)

у'и-"т"/у», 03/03 1168 306 (26,2) 27 (2,3)

03/03 688 124(18,0) 57 (8,3)

Пояснение В описании генотипа использованных линий контроль обозначает балансерные хромосомы (СуО/1/ ТМ6 ГЫМКЛЗВЬ), сна - введена хромосома 2 из линии вампо (С2/С2 ТМ6 ТЬ/ММ^БЬ), -

введена хромосома 3 из линии О^ало (СуО/1/ 03/03)

Кроме того нами были протестированы несколько производных линий, имевшие исходный фенотип у2 и неокрашенные аристы Было установлено, что дайна терминально делегированных хромосом у мух с неизмененным фенотипом различна (Рис 8г) В линиях

yTD'/y w, CyO/If, G3/G3 происходили как длиные терминальные конверсии, приводившие к появлению мух с фенотипом у' или у+, так и короткие конверсии размером до 500-700 п н , которые не приводили к изменению фенотипа Поэтому подсчитанная частота терминальных конверсий может быть несколько ниже реальной Также был проведен анализ потомства нескольких отобранных во втором поколении самок G3/G3, имевших темную окраску тела и крыльев Было обнаружено, что в нескольких производных линиях к концам удлиненных в результате конверсии хромосом присоединились НеТ-А элементы Таким образом, введение мутации Tel в yTD' линии, которые обычно используются нами как модельная система для изучения влияния различных факторов на изменение длины теломер, не приводит к предпочтению конверсионного механизма удлинения теломер

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

1 Антагонизм между теломерным и Polycomb - зависимым хроматином на конце терминально делегированных хромосом у Drosophila melanogaster

Основной структурой, обеспечивающей стабильность теломер является особый теломерный хроматин Именно с ним ассоциировано большинство белков, участвующих в регуляции длины теломер В настоящее время наиболее хорошо изучена структура теломерного хроматина Saccharomyces cerevisiae, что связано с небольшим размером теломер у этих дрожжей (Louis, 1995) Структура теломерного хроматина у дрозофилы в настоящий момент практически не изучена Однако в течение нескольких последних лет были проведены исследования, которые позволяют предположить, что у дрозофилы размер последовательностей, на которых формируется теломерный хроматин составляет 4-5 т п н Кроме того, эта структура обладает особыми свойствами Теломерный хроматин препятствует взаимодействию между регуляторными элементами, расположенными на конце хромосомы, но не препятствует связыванию транскрипционных факторов с промотором и даже облегчает его (Savitsky et al, 2003, Melnikova et al, 2008) Также теломерный хроматин препятствует связыванию транспозазы с концами /'-элемента, расположенного на конце хромосомы (Melnikova et al, 2004) Таким образом, теломерный хроматин дрозофилы негативно влияет на сборку либо стабильность одних белковых комплексов, сайты для которых находятся в зоне его действия, но в то же время может способствовать функционированию других, т е не обладает репрессорным эффектом

Известно, что у всех эукариотических организмов непосредственно к теломерам примыкают особые субтеломерные повторяющиеся последовательности, с которыми ассоциирован специфический белковый комплекс (Kamnert et al, 1997) В формировании субтеломерного хроматина у дрозофилы участвуют белки группы Polycomb, обладающие

репрессорнымн свойствами (Pirrotta et а!, 1994) Предполагается, что именно с функционированием PcG - комплексов связан известный репрессорный эффект субтеломерных районов (Karpen & Spradling, 1992, Wallrath & Elgin, 1995, Gryderman et a! 1999) Следовательно, теломерный хроматин отличается от субтеломерного хроматина и перицентрического гетерохроматина, которые репрессируют транскрипцию эухроматиновых генов Возможно, репрессивный субтеломерный гетерохроматин и теломерный хроматин функционально антагонистичны Поэтому вопрос о том, как - позитивно или негативно -влияет теломерный хроматин на сборку субтеломерных белковых комплексов, представляет особый интерес

В представленной работе мы использовали модельную систему, в которой /'-элемент был встроен перед промотором гена yellow и находился ..а различном пасстоянии от конца терминально делегированной хромосомы Последовательности гена yellow, находящиеся на конце хромосомы имеют свойства реальной теломеры Это связано с тем, что теломерные белки дрозофилы не требуют специфичных сайтов связывания и могут образовывать теломерный комплекс на любой терминальной последовательности ДНК

В использованной модельной системе /'-элемент в присутствии мутантного аллеля php1 являлся местом связывания белков группы Polycomb (PcG) Таким образом, мы изучили, как теломерный хроматин, образующийся на концевых последовательностях гена yellow, влияет на формирование репрессионного Polycomb-зааисимого комплекса, который собирается на последовательностях Р-элемента и ассоциирован у дрозофилы с субтеломерными повторами

Полученные результаты свидетельствуют, что расстояние между концом терминально делегированной хромосомы и /'-элементом в используемой модельной системе является основным фактором, от которого зависит формирование белкового PcG-комплекса Если расстояние между концом хромосомы и /'-элементом составляло менее 4 тли то область формирования теломерного хроматина включала в себя последовательность /"-элемента и формирование Polycomb-зависимого репрессионного комплекса было подавлено При увеличении расстояния до 5-6 т п н зона сборки теломерного хроматина непосредственно граничила с зоной сборки PcG-комплекса Наблюдаемая в этом случае слабая репрессионная активность свидетельствует, что близость последовательностей, обладающих свойствами теломер, негативно влияет на формирование репрессионного комплекса Хорошо выраженная Polycomb-зависимая репрессия наблюдалась нами только если расстояние от конца хромосомы до Я-элемента возрастало до 8 т п н Вероятно, Pc-G комплекс в присутствии мутации plf' может стабильно связываться с последовательностью /'-элемента и взаимодействовать с таким же комплексом, находящимся на гомологичной хромосоме, только

если расстояние между ним и теломерным комплексом, который формируется на конце хромосомы достаточно велико

Если предположить, что у дрозофилы как и у дрожжей на конце хромосомы формируется Т-петля, то полученные нами результаты можно объяснить следующим образом вероятно, в линиях класса А репрессионный PcG-зависимый комплекс не может собираться, т к Р-элемент находится в зоне сборки белкового комплекса, замыкающего Т-петлю (так называемой D-петли) В линиях класса В /'-элемент располагается внутри Т-петли Он становится более доступным, но сборка репрессионного комплекса все еще сильно затруднена В линиях класса С Р-элемент уже находится за пределами Т-петли Однако ее близость влияет на сборку репрессионного комплекса В случае класса D Р-элемент находится на значительном расстоянии от предполагаемой Т-петли Связыванию репрессионных белков ничто не мешает, поэтому наблюдается максимальная степень Polycomb-зависимой репрессии Таким образом, полученные нами результаты являются косвенным доказательством формирования Т-петли на конце хромосом у дрозофилы

Отсутствие разницы в степени /^''-зависимой репрессии в линиях утп" , полученных путем терминальной генной конверсии и в линии yhTD, где к концу хромосомы присоединился НеТ-А элемент, позволяет сделать вывод, что степень /^'-зависимой репрессии в терминально делегированных линиях напрямую зависит от расстояния до конца хромосомы и не зависит от природы концевой последовательности ДНК

Полученные в представленной работе результаты свидетельствуют, что между теломерным и субтеломерным (Pc-G-зависимым) хроматином существует антагонизм

Для понимания природы этого явления необходимо подробное изучение состава терминального белкового комплекса и теломерного хроматина, механизмов их образования, поддержания и функциониования

2 Функциональное разделение генетических факторов Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)), участвующих в регуляции длины теломер у Drosophtla melanogaster

Терминально делегированные хромосомы Drosophtla melanogaster являются наиболее удобной модельной системой как для поиска белков, которые образуют структуру теломерного хроматина или входят в состав терминального комплекса, так и для изучения влияния мутаций в различных генах на изменение длины теломер В течение нескольких последних лет при успешном использовании этой модельной системы в нашей лаборатории было показано, что несколько белков играют негативную роль в регуляции удлинения последовательностей ДНК на конце делегированной хромосомы Однако мутации в генах,

кодирующих эти белки, влияют иа различные механизмы, участвующие в поддержании длины теломер

Недавние исследования показали, что основной фактор, определяющий структуру гетерохроматина, НР1 (heterochromatin protein 1) связывается с теломерами и необходим для их функционирования (Fanti eta!, 1998) Снижение концентрации белка НР1 в клетках приводит к слиянию теломер и резко снижает стабильность хромосом (Fanti etal, 1998) Белок НР1 также присутствует на концах терминальных делеций Недавно было продемонстрировано, что мутации в гене Su(var) 25 , кодирующем НР1, в гетерозиготном состоянии увеличивают более чем в 100 раз частоту НеТ-А и TART присоединении к концу делегированной хромосомы (Savitsky et al, 2002)

Два белка Ku70 и Ku80 являются высококипссрсат'-гчь'чи Они были найдены у всех эукариот Гетеродимер Ku70/Ku80 - это основной компонент белкового комплекса, осуществляющего репарацию ДНК (Pastwa & Blasiak, 2003) Неожиданно у дрожжей Кц белки были найдены на концах хромосом, а затем было доказано, что данные белки играют важ!гую роль в метаболизме дрожжевых теломер Недавно было показано, что Ки комплекс также участвует в регуляции длины теломер у млекопитающих и у растений (Bertuch & Lundblad, 2003) Ранее в нашей лаборатории было показано, что Ки белки связываются с концами теломер дрозофилы и участвуют в формировании терминального комплекса Мутации в генах, кодирующих Ки70 и Ки80 влияли как на частоту транспозиций мобильных элементов так и на частоту терминальной генной конверсии (Melmkova et аI 2005)

В отличие от Su(var)2 5 мутаций и мутаций в генах Ки70/ Ки80, мутация Enhancer of terminal gene conversion (.E(tc■)), впервые описанная в нашей таборатории, существенно увеличивает частоту удлинений терминальной ДНК при помощи генной конверсии, но не влияет на частоту транспозиций НеТ-А и TART элементов к концу хромосомы (Melmkova et al, 2005) В настоящее время неизвестно, в каком гене находится мутация E(tc) и какой белок кодирует этот ген

Недавно была описана новая доминантная мутация, названная Telomere elongation (Tel), стимулирующая удлинение теломер (Smaco et al, 2002) Мутация Tel была обнаружена в линии Gaiano, изолированной из природной популяции Drosophila (Sinaco etal, 2002) Однако, механизм удлинения теломер, в котором участвует Tel не известен Предполагается, что Tel может прямо или косвенно увеличивать активность обратной транскриптазы, которая обеспечивает транскрипцию НеТ-А и TART элементов Также возможно, что Tel может кодировать продукт, который увеличивает доступность РНК НеТ-А и TART элементов для обратной транскриптазы или же является посредником в процессе

транспозиций к концам хромосом Кроме того не отрицается, что Tel является участником механизма конверсии/рекомбинации на концах хромосом Ген, в котором находится мутация Tel и белок, который этот ген кодирует также неизвестны Интересно, что Tel и E(tc) картированы в одной области третьей хромосомы Таким образом, мутации Tel и E(tc) имеют различное происхождение, но могут оказывать сходный эффект на удлинение теломер

В представленной работе, совместив метод, при помощи которого был обнаружен доминантный фактор Tel и модельную систему, в которой был обнаружен E(lc), мы функционально разделили эти две мутации Ранее было показано, что именно мутация Tel, находящаяся на хромосоме III из линии Gaiano вызывает существенное увеличение НеТ-А и TART элементов на концах хромосом (Siriaco et al, 2002) При введении хромосомы III из линии Garano в линии с терминально делегированными хромосомами было показано, что удлинение конца хромосомы может происходить как с помощью транспозиций мобильных элементов, так и путем терминальной генной конверсии Таким образом, хромосома III из линии Gaiano, содержащая мутацию Tel, проявляет более широкие функции, чем мутация E(tc) Какой-либо другой генетический фактор, кроме Tel, находящийся на хромосоме III и увеличивающий частоту присоединений НеТ-А и TART элементов в настоящее время неизвестен Поэтому полученные данные позволяют утверждать, что Те! и E(tc) - это не одна и та же мутация

Нужно заметить, что мутация Tel также как E(tc) индуцирует только относительно короткие удлинения терминальной ДНК у Drosophila Мы предполагаем, что короткие присоединения терминальной ДНК вызваны генной конверсией, а не механизмом сходным с BIR - нереципроктной рекомбинационно-зависимой репликацией, которая является эффективным механизмом репарации поврежденных хромосом Ране было показано, что BIR может вызывать очень большие удлинения ДНК (Kraus et al, 2001) Возможно, что события, инициированные BIR у S Cerevisiae, могут не отличаться от возникающих во время генной конверсии Однако, репликация ДНК в случае генной конверсии является менее эффективной, наблюдается высокий уровень диссоциации ДНК-полимеразы с матрицей Поэтому мы предполагаем, что наблюдаемые нами события вызваны именно терминальной генной конверсией, использующей последовательности на гомологичной хромосоме в качестве матрицы

Суммируя полученные данные, можно предположить, что хромосома III из линии Gaiano содержит оба генетических фактора - Tel и E(tc), которые находятся в районе 91-93, а хромосома III из лабораторной линии у w - только E(tc) Также можно предположить, что Tel и E(tc) являются аллельными вариантами одного и того же гена Для физического разделения

этих генетических факторов необходимы дальнейшие молекулярно-генетические исследования, позволяющие выявить гены из района 91-93 хромосомы 3R, нарушения в которых влияют на изменение длины теломер

Интересно также отметить, что при введении в используемую модельную систему хромосомы II из линии Gaiano наблюдалось некоторое увеличение частоты присоединений мобильных элементов к концам терминально делегированных хромосом Полученный результат демонстрирует, что вторая хромосома из линии Gaiano содержит слабый, возможно рецессивный, генетический фактор, участвующий в контроле длины теломер Возможно, это мутация в каком-либо гене, функциональная связь которого с регуляцией удлинения теломер еще не установлена Однако нельзя отрицать возможность того, что обнаруженный фактор -это слабая мутация в гене bu(varjr \ кодир^Ющг;: бело«- НР1 Вероятно, этот фактор не был найден одновременно с Tel, т к модельная система, в которой ранее тестировалась хромосома II из линии Gaiano, была менее чувствительной по сравнению с используемой нами в представленной работе

ВЫВОДЫ

1 Созданы оригинальные модельные системы, позволяющие выявить новые свойства геломерного хроматина и сравнить свойства недавно открытых мутаций Enhancer of terminal gene conversion и Telomere elongation, влияющих на регуляцию длины теломер у Drosophila melanogaster

2 Доказано, что теломерный хроматин негативно влияет на формирование реирессионного белкового PcG-комплекса, что свидетельствует о наличии антагонизма между теломерным и субтеломерным Polycomb-зависимым хроматином

3 Впервые показано, что доминантный генетический фактор Telomere elongation участвует в различных механизмах поддержания длины теломер, он влияет как на присоединение мобильных элементов к концу хромосомы, так и терминальную генную конверсию

4 Продемонстрировано, что доминантные генетические факторы Enhancer of terminal gene conversion и Telomere elongation не являются одной и той же мутацией

5 Впервые показано, что вторая хромосома Drosophila melanogaster из линии Gaiano содержит генетический фактор, участвующий в контроле длины теломер

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Проскуряков К А , Мельникова Л С Антагонизм между теломерным и Polycomb -зависимым хроматином на конце терминально делегированных хромосом у Drosophüa melanogaster Генетика 2008 Т 44 №11 С 1562-1566

2 Проскуряков К.А, Мельникова Л С Функциональное разделение генетических факторов Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)), участвующих в регуляции длины теломер у Drosophüa melanogaster Доклады Академии Наук 2008 Т 421 №3 С 406-410

3 Проскуряков К А , Георгиев П Г , Мельникова Л С Активация промотора на конце терминально делегированной хромосомы у Drosophüa melanogaster Сборник материалов международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» Томск, 9-12 мая, 2007 С 149

4 К Proskuryakov, Р Georgiev and L Melnikova Promoter activation at the end of the terminally truncated chromosome in Drosophüa melanogaster The FEBS journal 2007 V 234 1

5 K Proskuryakov, P Georgiev and L Melnikova Promoter activation at the end of the terminally truncated chromosome m Drosophtla melanogaster Abstracts of the 7th Young Scientist Forum Molecular Networks, Vienna, Austria, 5-7 July, 2007 P 44

si P 72

Заказ Xs 183/09/08 Подписано в печать 22 09 2008 Тираж ЮОэкз Уел пл 1,5

^ ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 ' <yJ. www cfr ru , e-mail info@cfr ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Проскуряков, Кирилл Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Теломеры, их функции и типы.

1.2. Структура теломер.

1.2.1. Кэппинговый комплекс теломер.

1.2.2. Теломерный гетерохроматин.

1.2.3. Теломер-ассоциированые последовательности.

1.2.4. Механизм удлинения хромосом и контроля их длины.

1.3. Гипотезы об эволюционной связи между теломерами дрозофилы и теломерами, использующими теломеразу.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Генетические методы.

2.1.1. Мутации и линии Drosophila melanogaster, использованные в работе.

2.1.2. Генетические скрещивания.

2.2. Биохимические методы.

2.2.1. Приготовление компетентных клеток для трансформации плазмидной ДНК.

2.2.2. Трансформация компетентных клеток плазмидами.

2.2.3. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса.

2.2.4. Полимеразная цепнная реакция.

2.2.5. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.2.6. Агарозный гель-электрофорез.

2.2.7. Выделение фрагментов ДНК из геля и очистка ДНК от продуктов ферментативных реакций.

2.2.8. Выделение геномной ДНК Drosophila melanogaster.

2.2.9. Саузерн-блот анализ.

2.2.10. Сиквенирование.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Изучение влияния терминального хроматина на Polycomb— зависимую репрессию.

3.1.1.Выбор базовой модельной системы для изучения свойств Polycomb-зависимого хроматина.

3.1.2. Получение терминально делетированпых хромосом, содержащих Р-элемент в предпромоторной области гена yellow.

3.1.3. Анализ /?/грУ-зависимой репрессии в полученных производных линиях Drosophila melanogaster.

3.2. Функциональное разделение генетических факторов Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)).

3.2.1. Выбор базовой модельной системы для сравнения свойств мутаций Telomere elongation (Тel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)).

3.2.2. Получение линий дрозофилы, несущих терминально делетированные хромосомы и аутосомы из линии Gaiano.

3.2.3. Анализ природы производных линий, полученных на фоне мутации Tel.

3.2.4. Анализ соотношения частоты терминальной генной конверсии и присоединений мобильных элементов к концу хромосомы в созданной модельной системе.

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Антогонизм между теломерным и Polycomb - зависимым хроматином на конце терминально делетированных хромосом у Drosophila melanogaster.

4.2. Функциональное разделение генетических факторов Telomere elongation (Тel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)), участвующих в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение молекулярно-генетических факторов, участвующих в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster"

Теломеры — это специализированные ДНК-белковые комплексы, находящиеся на концах линейных хромосом. Теломеры предохраняют концы хромосом от слипания, деградации, узнавания системой репарации ДНК (Blackburn, 2001; Cech, 2004). Таким образом, основной функцией теломер является обеспечение стабильности эукариотического генома. В настоящее время доказано, что поддержание строго определенного размера теломер критично для жизнедеятельности организма. Изменение длины теломер тесно связано с опухолеобразованием и старением клетки.

У большинства высших эукариот теломеры состоят из простых повторов G-богатой последовательности, а их удлинение обеспечивается специальным ферментом — теломеразой (Blackburn, 2001; Cech, 2004). У Drosophila melanogaster теломеры состоят из мобильных элементов типа LINE, ориентированных «голова к хвосту» - НеТ-А, TART и I

TAHRE (Biessmann & Mason, 2003; Casacuberta & Pardue, 2003a; Casacuberta & Pardue, 2003b; Pardue & DeBaryshe, 2003; Abad et al., 2004a; Abad et al, 2004b).

Основными структурными единицами нормальной теломеры являются: 1) Терминальный комплекс - это белковый комплекс, формирующийся на конце хромосомы и защищающий его от ферментов репарации; 2) Теломерный хроматин, который формируется на последовательностях теломерной ДНК. Данные структуры играют основную роль в процессе регуляции длины и стабильности теломер. Важной особенностью дрозофилы, является то, что у нее теломерный хроматин может формироваться на любой неспецифичной последовательности ДНК, в то время как у теломеразозависимых организмов теломерная структура формируется только при наличии строго определенных последовательностей, которые представляют собой сайты связывания для белков, формирующих теломерный хроматин.

Несколько лет назад были получены линии Drosophila melanogaster, которые несли терминальные делеции (Biessmann and Mason 1988; Biessmann et.al. 1990a; Golubovsky et.al. 2001; Levis 1989; Mason et.al. 1984; Traverse and Pardue 1988). Было установлено, что 4 терминально делетированные хромосомы дрозофилы также как и хромосомы с нормальными теломерами способны устойчиво поддерживаться в течение многих поколений (Biessmann et.al. 1990а; Levis 1989). Кроме того, было показано, что НеТ-А и TART элементы способны присоединяться к концам терминально делетированпых хромосом (Biessmann et.al. 1990b; 1992; Sheen and Levis 1994; Traverse and Pardue 1988). Эти данные свидетельствуют что у Drosophila melanogaster на концевых последовательностях терминально делетированных хромосом формируется нормальный теломерный хроматин и собирается терминальный белковый комплекс. Поэтому терминально делетированные хромосомы дрозофилы могут служить удобной модельной системой для изучения механизмов поддержания стабильной длины теломер и поиска составляющих компонентов специфических теломсрных структур.

Необходимо отметить, что несмотря на различия в структуре теломер, у теломеразозавимых организмов и у дрозофилы существуют общие механизмы, обеспечивающие поддержание стабильного размера теломер. Во-первых, эксперименты, проведенные на дрожжах и млекопитающих, доказали, что при инактивации теломеразы у данных организмов индуцируется альтернативный механизм удлинения теломер, связанный с процессами конверсии\рекомбинации. В том числе, альтернативные механизмы удлинения теломер часто реализуются в раковых клетках. Во-вторых, в последнее время было найдено, что некоторые консервативные белки, участвующие в репарации ДНК, также принимают участие в формировании терминального комплекса, как у дрожжей и млекопитающих, так и у дрозофилы. Поэтому данные, полученные при изучении теломер дрозофилы помогут понять закономерности процесса регуляции длины теломер у различных эукариотических организмов и выявить основные белки, формирующие теломерный комплекс. В настоящее время найдено и изучено только несколько отдельных белков, входящих в состав теломерного комплекса дрозофилы: это

НР1 (основной компонент гетерохроматина), НО АР (белок, взаимодействующий с НР1), Mrel 1/Rad50 (белки систем репарации и рекомбинации).

Данные, полученные в нашей лаборатории в течение нескольких последних лет, свидетельствуют, что теломерный хроматин, формирующийся у Drosophila melanogaster на концевых последовательностях ДНК длиной 4-5 т.п.н. обладает особыми свойствами (Savitsky et al., 2003; Melnikova et al., 2008). В настоящей работе мы изучили, каким образом теломерный хроматин влияет на репрессию, вызываемую белками группы на Polycomb. Известно, что многие белки группы Polycomb участвуют в формировании субтеломерного хроматина и подавляют экспрессию встроенного в него трансгена. Однако вопрос о том, как - позитивно или негативно - влияет теломерный хроматин на сборку субтеломерных белковых комплексов, до сих пор остается открытым. Используя модельную систему, в которой Р-элемент, встроенный перед промотором гена yellow и находящийся на конце терминально делегированной хромосомы, в присутствии мутантного аллеля phP1 может служить местом связывания белков PcG, мы показали, что особая структура теломерного хроматина негативно влияет на формирование репрессионного Ро1усотЬ-зависимого комплекса. Полученные результаты позволяют предположить, что существует антогонизм между теломерным и субтеломерным (PcG-зависимым) хроматином.

Болыненство генов, контролирующие длину теломер, в настоящее время неизвестны. Несколько лет назад у D. melanogaster были найдены два доминантных генетических фактора, влияющие на удлинение теломер - это Telomere elongation (Тel) (Siriaco et al., 2002) и Enhancer of terminal gene conversion (E(lc)) (Melnikova & Georgiev, 2002). Почти одновременно эти мутации независимо были получены в разных лабораториях.

В представленной работе с помощью одной и той же модельной системы было проведено сравнение свойств генетических факторов Tel и E(tc). Было установлено, что Telomere elongation и Enhancer of terminal gene conversion являются разными мутациями.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основными целями данной работы являлись: 1) изучение влияния теломерного хроматина на формирование субтеломерных белковых комплексов; 2) функциональное сравнение генетических факторов Tel и E(tc), влияющих на удлинение теломер Drosophila melanogaster.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Создать модельные системы, позволяющие исследовать свойства теломерного хроматина и сравнить недавно открытые мутации Enhancer of terminal gene conversion и Telomere elongation.

2. Выяснить как теломерный хроматин влияет на формирование репрессионного комплекса белков группы Polycomb.

3. Определить участником какого механизма поддержания длины теломер (присоединения мобильных элементов к концу хромосомы или конверсии/рекомбинации) является доминантный генетический фактор Telomere elongation.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ПЦР - полимеразная цепная реакция

2. т.п.н. - тысяч пар нуклеотинов

3. п.н. — пар нуклеотидов

4. TAS — теломер ассоциированная последовательность (Telomere associated sequence)

5. PRE - элемент, связывающий белки группы Polycomb (Polycomb response element)

6. P-Ph - химерный белок P-Polyhomeotic

7. PcG - белки группы Polycomb

8. BIR - нереципроктная рекомбинационно-зависимая репликация (Break -induced replication)

9. E(tc) - энхансер терминальной генной конверсии {Enhancer of terminal gene conversion)

10. Tel - генетический фактор, участвующих в регуляции длины теломер (!Telomere elongation)

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Проскуряков, Кирилл Александрович

1. Созданы оригинальные модельные системы, позволяющие выявить новые свойства теломерпого хроматина и сравнить свойства недавно открытых мутаций Enhancer of terminal gene conversion и Telomere elongation, влияющих на регуляцию длины теломер у Drosophila melanogaster.2. Доказано, что теломерный хроматин негативно влияет на формирование репрессионного белкового PcG-комплекса, что свидетельствует о наличии антагонизма между теломерным и субтеломерным Polycomb-зависимым хроматином.3. Продемонстрировано, что доминантные генетические факторы Enhancer of terminal gene conversion и Telomere elongation не являются одной и той же мутацией.4. Впервые показано, что вторая хромосома Drosophila melanogaster из линии Gaiano содержит генетический фактор, участвующий в контроле длины теломер.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Проскуряков, Кирилл Александрович, Москва

1. Abad J.P., de Pablos В., Osoegawa К., de Jong P.J., Marin-Gallardo A., Villasante A. Genomic analysis of Drosophila melanogaster telomeres: full-length copies of HeT-A and TART elements at the telomeres. Mol. Biol. Evol. 2004a. V. 21. P. 1613-1619.

2. Abad J.P., de Pablos В., Osoegawa K., de Jong P.J., Marin-Gallardo A., Villasante A. TARHE, a novel telomeric retrotransposon from Drosophila melanogaster, reveals the origin of Drosophila telomeres. Mol. Biol. Evol. 2004b. V. 21. P. 1620-1624.

3. Alexander M.K., Zakian V.A. Raplp telomere association is not required for mitotic stability of a C 3 TA 2 telomere in yeast. EMBO J. 2003. V. 22. P. 1688-1696.

4. Alkhimova O.G., Mazurok N.A., Potapova T.A., Zakian S.M., Heslop-Harrison J.P., Vershinin A.V. Diverse pattern of the tandem repeat organization in rye chromosomes. Chromosoma. 2004. V. 113. P. 42-52.

5. Azzalin C.M., Nergadze S.G., Giulloto E. Human intrachomosomal telomeric-like repeats: sequence organization and mechanism of origin. Chromosoma. 2001. V. 110. P. 75-82.

6. Belenkaya Т., Soldatov A., Nabirochkina E., Birjukova I., Georgieva S., Georgiev P. The allele of the polyhomeotic gene induced by P element insertion encodes a new chimeric protein, that negatively regulates the expression of P-induced alleles in the yellow locus of Drosophila melanogaster. Genetics. 1998. V. 150. P. 687-697.

7. Bertuch A.A., Lundblad V. Which end: dissecting Kus function at telomeres and doublestrand breaks. Genes Dev. 2003. V. 17. P. 2347-2350. 8. Bi X., Wei S.C., Rong Y.S. Telomere protection without a telomerase, the role of ATM and Mrell in Drosophila telomere maintenance. Curr. Biol. 2004. V. 14. P. 1348-1353.

8. Biessmann H., Champion L.E., OHare K., Ikenaga K., Kasravi В., Mason J.M. Frequent transpositions of Drosophila melanogaster HeT-A transposable elements to receding chromosome ends. EMBO J. 1992. V. 11. P. 4459-4469.

9. Biessmann H., Mason J.M. Genetics and molecular biology of telomeres. Adv. Genet. 1992. V. 30. P. 185-249. 77

10. Biessmann H., Mason J.M. Telomere maintenance without telomerase. Chromosoma. 1997. V. 106. P. 63-69.

11. Biessmann H., Mason J.M. Telomerase-independent mechanism of telomere elongation. Cell Mol. Life Sci. 2003. V. 60. P. 2325-2333.

12. Biessmann H., Mason J.M., Ferry K., dHulst M.5 Valgeirsdottir K., Traverse K.L., Pardue M.L. Addition of telomere-associated HeT DNA sequences "heals" broken chromosome ends in Drosophila. Cell. 1990. V. 61. P. 663-673. 15. 661-673.

13. Blackburn E.H., Szostak J.W. The molecular structure of centromeres and Blackburn E.H. Switching and signaling at the telomere. Cell. 2001. V. 106. P. telomeres. Ann. Rev. Biochem. 1984. V. 53. P. 163-194.

14. Boivin A., Gaily C Netter S., Anxolabehere D., Ronsseray S. Telomeric associated sequences of Drosophila recruit Polycomb-group proteins in vivo and can induce pairing-sensitive repression. Genetics. 2003. V. 164. P. 195-208.

15. Brevet V., Berthiau A.-S., Civitelli L., Donini P., Schramke V., Geli V., Ascenzioni F., Giison E. The number of vertebrate repeats can be regulated at yeast telomeres by Rap 1-independent mechanisms. EMBO J. 2003. V. 22. P. 1697-1706.

16. Broccoli D., Godley L.A., Donehower L.A., Varmus H.E., de Lange T. Telomerase activation in mouse mammary tumors: lack of telomere shortening and evidence for regulation of telomerase RNA with cell proliferation. Mol. Cell Biol. 1996. V. 16. P. 3765-3772.

17. Casacuberta E., Pardue M.L. HeT-A elements in Drosophila virilis: retrotransposon telomeres are conserved across the Drosophila genus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003a. V. 100. P. 14091-14096. 78

18. Cech T.R. Beginning to understand the end of the chromosome. Cell. 2004. V. 116. P. 273-279.

19. Cenci G., Siriaco G., Raffa G.D., Kellum R., Gatti M. The Drosophila HOAP protein is required for telomere capping. Nat. Cell. Biol. 2003. V. 5 P. 82-84.

20. Ciapponi L., Cenci G., Ducau J., Flores C Jonnson-Schlitz D., Gorski M.M., Engels W., Gatti M. The Drosophila Mrell/Rad50 complex is required to prevent both telomeric fusion and chromosome breakage. Cur. Biol. 2004. V. 14. P. 1360-1366.

21. Danilevskaya O.N., Arkhipova I.R., Traverse K.L., Pardue M.-L. Promoting in tandem: the promoter for telomere transposon HeT-A and implications for the evolution of retroviral LTRs. Cell. 1997. V. 88. P. 647-655.

22. Danilevskaya O.N., Traverse K.L., Hogan N.C., deBaryshe P.G., Pardue M.L. The two Drosophila telomeric transposable elements have very different patterns of transcription. Mol. Cell Biol. 1999. V. 19. P. 873-881. 27. De Lange T. T-loops and the origin of telomeres. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2004. V. 5. P. 323-329. 28. De Lange T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Gene&Dev. 2005. V. 19. P. 2100-2110.

23. Eissenberg J.C., Elgin S.C.R. The HP1 protein family: getting a grip on chromatin. Curr. Opin. Genet. Dev. 2000. V. 10. P. 204-210.

24. Fajkus J., Kovarik A., Kravolics R., Bezdek M. Organization of telomeric and subtelomeric chromatin in the higher plant Nicotiana tabacum. Mol. Gen Genet. 1995. V. 247. P. 633-638. 79

26. Fanti L., Giovinazzo G., Berlogo M., Pimpinelli S. The Heterochromatin protein 1 prevents telomere fusions in Drosophila. Mol. Cell. 1998. V. 2. P. 527-538.

27. Flint J., Bates G.P., Clark K., Dorman A., Willingham D., et al. Sequence comparison of human and yeast telomeres identifies structurally distinct subtelomeric domains. Hum. Mol. Genet. 1997. V. 6. P. 1305-1313.

28. Garcia-Cao M., OSullivan R., Peters A.H., Jenuwein Т., Blasco M.A. Epigenetic regulation of telomere length in mammalian cells by the Suv39hl and Suv39h2 histone methyltransferases. Nat. Genet. 2004. V. 36 P. 94-99.

29. Gdula D.A., Corces V.G. Characterization of functional domains of the su(Hw) protein that mediate the silencing effect of mod(mdg4) mutations. Genetics. 1997. V. 145. P. 153-161.

30. Georgiev P., Kozycina M. Interaction between mutations in the suppressor of Hairy wing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gypsy-induced mutations. Genetics. 1996. V. 142. P. 425-436.

31. Georgiev P., Tikhomirova Т., Yelagin V., Belenkaya Т., Gracheva E., Parshikov A., Evgenev M.B., Samarina O.P., Corces V.G. Insertions of hybrid P elements in the yellow gene of Drosophila cause a large variety of mutant phenotypes. Genetics. 1997. V. 146. P. 583594.

32. Golubovsky M.D., Konev A.Y., Walter M.F., Biessmann H., Mason J.M. Terminal retrotransposons activate a subtelomeric white transgene at the 2L telomere in Drosophila. Genetics. 2001. V. 158. P. 1111-1123.

33. Greider C.W., Blackburn E.H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. 1985. V. 43. P. 405-413. 80

34. Harley СВ., Futcher A.B., Greider C.W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 1990. V. 345. P. 458-460.

35. Hastie N.D., Dempster M., Dunlop M.G., Thompson A.M., Green D.K., Allshire R.C/ Telomere reduction in human colorectal carcinoma and with ageing. Nature. 1990. V. 346. P. 866-868.

36. Henderson E.R., Blackburn E.H. An overhanging 3terminus is a conserved feature of telomeres. Mol. Cell Biol. 1989. V. 9. P. 345-348.

37. Jurgens G. A group of genes controlling the spatial expression of the Bithorax Complex in Drosophila. Nature. 1985. V. 316. P. 153-155.

38. Kahn Т., Savitsky M., Georgiev P. Attachment of HeT-A sequences to chromosomal termini in Drosophila melanogaster may occur by different mechanisms. Mol. Cell. Biol. 2000. V. 20. P. 7634-7642.

39. Kamnert I., Lopez C.C., Rosen M., Edstrom J.-E. Telomeres terminating with long complex tandem repeats. Hereditas. 1997. V. 127. P. 175-180.

40. Karpen G.H., Spradling A.C. Analysis of subtelomeric heterochromatin in the Drosophila minichromosome Dpi 187 by single-P element insertional mutagenesis. Genetics. 1992. V. 132. P. 737-753.

41. Kass-Eisler A., Greider C.W. Recombination in telomere-length maintenance. TIBS. 2000. V. 25. P. 200-204.

42. Kellum R. HP1 complexes and heterochromatin assembly. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2003. V. 274. P. 53-77.

43. Kilian A., Stiff C Kleinhofs A. Barley telomeres shorten during differentiation but grow in callus culture. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 9555-9559. 81

44. Klobutcher L.A., Swanton M.T., Donini P., Prescott D.M. All gene-sized DNA molecules in four species of hypotrichs have the same terminal sequences and an unusual 3 terminus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 3015-3019.

45. Kraus T, Leung W-Y, Haber JE (2001) Break-induced replication: a review and an example in budding yeast. Proc Natl Acad Sci USA 98:8255-8262.

46. Levis R.W. Viable deletions of a telomere from a Drosophila chromosome. Cell. 1989. V. 58 P. 791-801.

47. Levy D.L., Blackburn E.H. Counting of Riflp and Rif2p on Saccharomyces cerevisiae telomeres regulates telomere length. Mol. Cell. Biol. 2004. V. 24. P. 10857-10867.

48. Linger J., Cooper J.P., Cech T.R. Telomerase and DNA end replication: no longer a lagging strand problem? Science. 1995. V. 269. P. 1533-1534.

49. Lindsley D. L., Zimm G. G. The genome of Drosophila melanogaster. Academic Press. 1992. New York. N.Y.

50. Louis E.J. The chromosome ends of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 1995. V. 11. P. 1553-1573. 59. P. 522-531.

51. Marcand S., Brevet V., Mann C Gilson E. Cell cycle restriction of telomere Lundblad V. Telomere maintenance without telomerase. Oncogene. 2002. V. 21. elongation. Curr. Biol. 2000. V. 10. P. 487-490.

52. Mason J.M., Konev A.Y., Biessmann H. Telomeric position effect in Drosophila melanogaster reflects a telomere length control mechanism. Genetica. 2003b. V. 117. P. 319325. 82

53. Mason J.M., Ransom J., Konev A.Y. A deficiency screen for dominant suppressors of telomeric silencing in Drosophila. Genetics. 2004. V. 168. P. 1353-1370.

54. Mason J.M., Strobel E., Green M.M. Mu-2: a mutation gene in Drosophila that potentiates the induction of terminal deficiencies. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 60906094. 65. McClintock B. The stability of broken ends of chromosomes in Zea mays. Genetics. 1941. V. 26. P. 234-282.

55. Mikhailovsky S., Belenkaya Т., Georgiev P. Broken chromosome ends can be elongated by conversion in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 1999. V. 108. P. 114-120.

56. Melnikova L., Biessmann H., Georgiev P. The Ku protein complex is involved in length regulation of Drosophila telomeres. Genetics. 2005. V. 170. P. 221-235.

57. Melnikova L., Biessmann H., Georgiev P. The vicinity of a broken chromosome end affects P element mobilization in Drosophila melanogaster. Mol. Genet. Genomics. 2004. V. 272. P. 512-518.

58. Melnikova L., Biryukova I., Kahn Т., Georgiev P. Long-distance interactions between regulatory elements are suppressed at the end of a terminally deficient chromosome in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 2008. V. 117. P. 41-50.

59. Melnikova L., Georgiev P. Drosophila telomeres: the non-telomerase alternative. Chromosome research. 2005. V. 13. P. 431-441.

60. Melnikova L., Georgiev P. Enhancer of terminal gene conversion, a new mutation in Drosophila melanogaster that induces telomere elongation by gene conversion. Genetics. 2002. V. 162. P. 1301-1312. 83

61. Muller A.E., Kamisugi Y., Gruneberg R., Niedenhof I., Horold R.J., Meyer P. Muller H.J. The remaking of chromosomes. Collecting Net. 1983. V. 8. P. 181- Palindromic sequences and A+T elements promote illegitimate recombination in Nicotiana tabacum. J. Mol. Biol. 1999. V. 291. P. 29-46.

62. Nash W.G., Yarkin R.J. Genetic regulation and pattern formation: a study of the yellow locus in Drosophila melanogaster. Genet Res. 1974. V. 24. P. 19-26.

63. Pardue M.L., DeBaryshe P.G. Pertotransposons provide an evolutionarily robust non-telomerase mechanism to maintain telomeres. Annu. Rev. Genet. 2003. V. 37. P. 485-511.

64. Pardue M.L., deBaryshe P.G. Telomeres and telomerase: more than the end of line. Chromosoma. 1999. V. 108. P. 73-82.

65. Pastwa E., Blasiak J. Non-homologous end joining. Acta. Biochem. Pol. 2003. V. 50. P. 891-908.

66. Perini В., Piacentini L., Fanti L., Altieri F., Chichiarelli S., Berloco M., Turano C Ferraro A., Pimpinelli S. HPl controls telomere capping, telomere elongation, and telomere silencing by two different mechanisms in Drosophila. Mol. Cell. 2004. V. 15. P. 467-476. 84

67. Rashkova S., Karam S.E., Kellum R., Pardue M.L. Gag proteins of the two Purdy A., Su T.T. Telomeres: not all breaks are equal. Cur. Biol. 2004 V. 14. P. Drosophila telomeric retrotransposons are targeted to chromosome ends. J. Cell. Sci. 2002. V. 159. P. 397-402.

68. Richards E.J., Ausubel F.M. Isolation of a higher eukaryotic telomere from Arabidopsis thaliana. Cell. 1988. V.53. P. 127-136.

69. Riethman H., Ambrosini A., Castaneda C Finklestein J., Hu X.-L., et al. Mapping and initial analysis of human subtelomeric sequence assemblies. Genome Res. 2004. V. 14. P. 18-28.

70. Riha K., McKnight T.D., Fajkus J., Vyskot В., Shippen D.E. Analysis of the G- overhangs structures on plant telomeres: evidence for two distinct telomere architectures. Plant J. 2000. V. 23. P. 633-641.

71. Roth C.W., Kobeski F., Walter M.F., Biessmann H. Chromosome end elongation by recombination in the mosquito Anopheles gambiae. Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P. 51765183.

72. Rusche L.N., Kirchmaier A.L., Rine J. The establishment, inheritance, and function of silenced chromatin in Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Biochem. 2003. V. 72. P. 481-516.

73. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual. Ed2 Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor NY. 1989.

74. Savitsky M., Kalin Т., Pomerantseva E., Georgiev P. Transvection at the end of the truncated chromosome in Drosophila melanogaster. Genetics. 2003. V. 163. P. 1375-1387. 85

75. Shareef M.M., King C Damaj M., Badagu R., Huang D.W., Kellum R. Drosophila heterochromatin protein 1 (HPl) origin recognition complex (ORC) protein is associated with HPl and ORC and functions in heterochromatin-induced silencing. Mol. Biol. Cell. 2001. V. 12. P. 1671-1685.

76. Sharma G.G., Hwang K.K., Pandita R.K., Gupta A., Dhar S., Parenteau J., Agarwal M., Worman H.J., Wellinger R.J., Pandita Т.К. Human heterochromatin protein 1 isoforms HPl (Has) and HPl(Hsb) interfere with hTERT-telomere interactions and correlate with changes in cell growth and response to ionizing radiation. Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 83638376.

77. Sheen F.M., Levis R. W. Transposition of the LINE-like retrotransposon TART to Drosophila chromosome termini. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 12510-12514.

78. Silva E., Tiong S., Pedersen M., Homola E., Royou E., Fasulo В., Siriaco G., Campbell S.D. ATM is required for telomere maintenance and claromosome stability during Drosophila development. Curr. Biol. 2004. V. 14. P. 1341-1347.

79. Simon J., Chiang A., Bender W., Shimell M.J., OConnor M. Elements of the Drosophila bithorax complex that mediate repression by Polycomb group products. Dev. Biol. 1993. V. 153. N. L P 131-144.

80. Siriaco G.M., Cenci G., Haoudi A., Champion L.E., Zhou C Gatti M., Mason J.M. Telomere elongation (Tel), a new mutation in Drosophila melanogaster that produces long telomeres. Genetics. 2002. V. 160. P. 235-245.

81. Smith CD., Smith D.L., DeRisi J.L., Blackburn E.H. Telomeric protein distributions and remodeling through the cell cycle in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cell. 2003. V. 14. P. 556-570. 86

82. Song Y.H., Mirey G., Betson M., Haber D.A., Settleman J. The Drosophila ATM ortholog, dATM, mediates the response to ionizing radiation and spontaneous DNA damage during development. Curr. Biol. 2004. V. 14. P. 1354-1359.

83. Song K., Jung Y., Jung D., Lee I. Human Ku70 interacts with heterochromatin protein 1 alpha. J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 8321-8327.

84. Sykorova E., Cartagena J.5 Horakova M., Fukui K., Fajkus J. Characterization of telomere-subtelomere junction in Silene latifolia. Mol. Gen. Genet. 2003. V. 269. P. 13-20.

85. Teixeira M.T., Arneric M., Sperisen P., Lingner J. Telomere length homeostasis is achieved via a switch between telomerase -extendible and -nonextendible states. Cell. 2004. V. 117. P. 323-335.

86. Teng S.C., Zakian V.A. Telomere-telomere recombination in an efficient bypass pathway for telomere maintenance in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 1999. V. 19. P. 8083-8093.

87. Vershinin A.V., Heslop-Harrison J.S. Comparative analysis of the nucleosomal structure of rye, wheat and they relatives. Plant Mol. Biol. 1998. V. 36. P. 149-161.

88. Wallrath L.L., Elgin S.C. Position effect variegation in Drosophila is associated with an altered chromatin structure. Genes Dev. 1995. V. 9. P. 1263-1277.

89. Walter M.F., Jang C Kasravi В., Donath J., Mechler B.M., Mason J.M., Biessmann H. DNA organization and polymorphism of a wild-type Drosophila telomere region. Chromosoma. 1995. V. 104. P. 229-241. 110. 197-201.

90. Wellinger R.J., Ethier K., Labrecque P., Zakian V.A. Evidence for a new step in Watson J.D. Origin of concatemeric T7 DNA. Nat. New. Biol. 1972. V. 239. P. telomere maintenance. Cell. 1996. V. 85. P. 423-433. 87

Информация о работе

Проскуряков, Кирилл Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.26

Диссертация

Изучение молекулярно-генетических факторов, участвующих в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы