Эволюция и механизмы регуляции экспрессии повторяющихся генов в геноме Drosophila

Калмыкова, Алла Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эволюция и механизмы регуляции экспрессии повторяющихся генов в геноме Drosophila
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Эволюция и механизмы регуляции экспрессии повторяющихся генов в геноме Drosophila"

На правах рукописи

КАЛМЫКОВА Алла Ивановна

Эволюция и механизмы регуляции экспрессии повторяющихся генов в геноме 1Уго$орЫ1а

03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной генетики РАН

Научный консультант:

Академик РАН, профессор В.А. Гвоздев

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор А.И. Ким

Доктор биологических наук, профессор Д.А. Крамеров Доктор биологических наук A.A. Буздин

Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится гз декабря 2009 года в /У часов на заседании диссертационного совета Д 002.37.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991 г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан « го » ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических .flay

ЬсС

Грабовская Л.С.

Актуальность проблемы

Одна из наиболее захватывающих проблем геномики состоит в понимании молекулярных принципов эволюции генома, включающих такие аспекты, как появление новых генов, приобретение генами новых функций, появление и эволюция гетерохроматиновых локусов. Изучение механизмов регуляции экспрессии генов также остается одним из глобальных направлений исследований в биологии. Транскрипционный, посттранскрипционный и трансляционный уровни регуляции генной активности осуществляются сложными биохимическими путями, зачастую связанными между собой. Исследование экспрессии мобильных элементов, обогащенных разнообразными регуляторными элементами, является традиционным и наиболее плодотворным направлением в данной области. Особый интерес к мобильным элементам генома возник после обнаружения защитной клеточной системы, РНК интерференции (РНКи), распознающей в клетке присутствие двухцепочечной РНК (дцРНК). Повторяющиеся элементы являются источником дцРНК и мишенью РНКи. Мобильные элементы занимают значительную часть генома, составляя 15% генома Ого$орЫ1а и 40% генома человека. Одним из классов мобильных элементов, представленных во всех изученных эукариотических геномах, являются ретротранспозоны — мобильные генетические элементы, перемещающиеся внутри генома путем образования РНК-копии. По своему природному происхождению мобильные элементы являются паразитическими последовательностями: их внедрение в жизненно важные гены может приводить к летальным или вредным мутациям, серьезному нарушению развития и возникновению некоторых форм рака. Тем не менее, они вносят значительный вклад в эволюцию генома-хозяина. Так, изменение регуляции активности гена за счет инсерции мобильного элемента может иметь адаптивное значение и быть подхваченным естественным отбором. Известны многочисленные примеры прямого использования регуляторных последовательностей мобильных элементов, таких как промоторы, энхансеры, сигнал полиаденилирования и т.д. для регуляции активности клеточных генов. Анализ геномных баз данных выявляет обширные группы функциональных генов, в регуляторной или кодирующей части которых находятся фрагменты мобильных элементов, причем, такое соседство может сохраняться в ходе эволюции. Наиболее ярким примером вклада мобильных элементов в регуляцию клеточных процессов являются теломеры ОгояоркИа, образующиеся в результате присоединения ретротранспозонов к концам хромосом, что является уникальным примером выполнения жизненно важной функции паразитическими структурами генома.

В клетке существуют защитные механизмы, снижающие активность мобильных элементов. Важнейший из них — система РНКи: ее принято считать иммунитетом на уровне нуклеиновых кислот. Это открытие было сделано 10 лет назад американскими учеными Крэгом Меллоу и Эндрю Фаером (нобелевские лауреаты за 2006 г.). Механизм РНКи служит для подавления активности гена при появлении в клетке гомологичной дцРНК и возник эволюционно как защитная функция генома против вирусов и транспозонов. ДцРНК разрезаются на короткие интерференционные РНК, которые и служат, находясь в составе специальных белковых комплексов, основным посредником этого механизма, находя в клетке гомологичную им матричную РНК. В результате ферментативной активности белков, связывающих короткие РНК, происходит расщепление и деградация мРНК. Мутации генов, участвующих в РНКи, приводят к активации мобильных элементов у многих организмов. Особенную опасность для целостности генома представляет активность мобильных элементов в терминальных тканях, т.к. вызванные транспозициями нарушения генома передаются следующему поколению. Исследования последних лет позволили выявить особый биохимический путь, связанный с использованием коротких РНК и участвующий в подавлении активности мобильных элементов в терминальных тканях.

Не смотря на огромное количество работ, посвященных исследованию механизма РНКи, в этой области остается множество нерешенных проблем, связанных, в первую очередь, с биологической функцией различных коротких РНК в геноме.

Используя в качестве модельной системы хорошо изученный геном £>. ше/опо^скгег, мы показали происхождение гетерохроматиновых тандемных повторов половых хромосом от эухроматинового функционального гена, а также проследили эволюционную историю одного из ретротранспозонов дрозофилы, для которого нами было показано существование в одном геноме структурных вариантов, принципиально отличающихся своими регуляторпыми свойствами. В данной работе было проведено исследование роли РНКи в регуляции активности широкого спектра ретротранспозонов БюзорЬИа в терминальных тканях.

Цели и задачи исследования

Целями настоящей работы было:

1) исследование эволюционной истории повторяющихся

последовательностей генома дрозофилы на примере семейства семенник-специфичных генов, родственных р субъединице казеин киназы 2 (СК2) и ДКЩдлинный концевой повтор)-содержащего ретротранспозона дрозофилы 1731;

2) изучение роли различных компонентов системы РНКи на активность

широкого спектра ретротранспозонов дрозофилы в терминальных тканях.

В первой части работы предполагалось исследовать эволюционную историю рассматриваемых генов, используя различные методы геномного анализа, такие как скрининги геномных и кДНК библиотек, ПЦР анализ геномной ДНК, анализ геномов различных видов йгозорИНа.

Основным подходом в исследованиях роли РНКи в регуляции экспрессии ретротранспозонов было сравнение уровня экспрессии и частоты транспозиций ретротранспозонов в норме и особях, мутантных по различным компонентам РНКи. В качестве объектов исследования были выбраны как паразитические ретроэлементы, так и те, которые выполняют жизненно-важную функцию в геноме, теломерные ретротранспозоны. В данном случае задачей исследования было понять, участвует ли система РНКи в регуляции длины теломер у дрозофилы, контролируя частоту перемещений теломерных ретротранспозонов на конец хромосомы. Для понимания механизма РНК-сайленсинга в терминальных клетках, предполагалось исследование основных интермедиатов процесса РНКи, коротких РНК, специфичных для ретроэлементов, а также изучение биогенеза антисмысловых РНК, как основного источника эффекторных коротких РНК, комплементарных мишени - кодирующей РНК ретроэлементов. Решение поставленных задач позволит ответить на вопрос о функциональной роли мобильных элементов и РНКи, как механизма контроля их активности, в эволюции регуляторных путей генома.

Научная новизна и практическая ценность работы

В ходе выполнения работы исследовались вопросы, связанные с такими фундаментальными проблемами, как эволюция генома высших эукариот. Впервые показано, что протяженные участки гетерохроматина возникли путем амплификации функционального эухроматинового гена. Подробно прослежена эволюционная история одного из ретротранспозонов дрозофилы, что подчеркивает эволюционную лабильность мобильных элементов, которые являются мощным потенциалом для изменений генома их хозяев.

Изучена роль механизма РНКи в регуляции активности мобильных элементов генома в терминальных тканях, что чрезвычайно важно для сохранения целостности генома, так как перемещения мобильных элементов в предшественниках половых клеток являются наследуемыми и могут быть причиной мутаций, нарушения развития и опухолевой трансформации. Объектами исследования были как паразитические

ретротранспозоны, так и выполняющие жизненно важную функцию - теломерные ретроэлементы. Основным подходом в этих исследованиях было использование мутантов по генам системы РНКи, у которых, с помощью широкого спектра молекулярно-генетических и цитологических методов, изучалось поведение как эндогенных ретротранспозонов, так и трансгенных репортерных систем. Показано, что мутации компонентов РНК-сайленсинга приводят к значительному накоплению транскриптов ретротранспозонов в терминальных тканях дрозофилы. Впервые для высших эукариот удалось показать, что мутация ртч, основного компонента терминального пути РНК-сайленсинга, приводит не только к накоплению транскриптов, но и к повышенной частоте транспозиций рстроэлсмснта в терминальных тканях, что прямо доказывает роль системы РНКи в контроле частоты транспозиций ретротранспозонов.

Впервые показана роль механизма РНКи в регуляции длины теломер у эукариот. Теломерные ретротранспозоны дрозофилы отличаются от разбросанных по геному и перемещающихся случайным образом мобильных элементов; они перемещаются исключительно на конец хромосомы и выполняют важнейшую функцию поддержания теломер. Как показали наши исследования, эти элементы также являются мишенью системы РНКи. Мы показали, что экспрессия и транспозиция теломерных ретроэлементов йгозорЬИа melanogaster находится под контролем некоторых генов, являющихся компонентами РНКи. Показано, что на фоне мутаций по генам РНКи происходит не только накопление транскриптов теломерных элементов в яичниках дрозофилы, но и увеличение частоты их транспозиций на конец хромосомы, что позволило сделать очень важный вывод о том, что система РНКи участвует в негативной регуляции длины теломер у дрозофилы. Этот механизм использует короткие РНК, комплементарные РНК-мишени, что указывает на важную роль антисмысловой транскрипции в осуществлении данного контроля. Мы обнаружили, что теломерный ретроэлемент НеТ-Л транскрибируется в обоих направлениях за счет активности двунаправленного промотора, исследование которого представляет общебиологический интерес с точки зрения понимания функционирования эукариотических промоторов. Впервые показано, что не только смысловые, но и антисмысловые транскрипты, являются мишенью системы РНКи. Недавние исследования показали, что многие клеточные гены транскрибируется в обоих направлениях, и являются потенциальными мишенями РНКи. Полученные на примере теломерных ретротранспозонов дрозофилы данные о биогенезе некодирующих антисмысловых РНК являются принципиально новыми в понимании роли антисмыслового пула РНК в регуляции клеточных генов.

В ходе выполнения работы исследовались также общие принципы организации теломер у D. melanogaster. Показано, что недавно обнаруженный в теломерах дрозофилы ретротранспозон TAHRE способен перемещаться на конец хромосомы, следовательно, этот элемент является полноправным участником поддержания теломер у дрозофилы. Детальная характеристика этого элемента позволила предположить, что TAHRE может служить источником ревертазы для перемещений ретротранспозона -НеТ-А - основного компонента теломерной ДНК у дрозофилы, что указывает на разделение функций между различными элементами теломер дрозофилы.

Исследование роли РНКи в контроле длины теломер и формировании теломерного гетерохроматина является фундаментальной проблемой и позволит по-новому рассмотреть роль повторяющихся элементов в функционировании теломеры у разных организмов.

Апробация работы

Результаты, полученные в данной работе, были представлены на семинарах ИМГ РАН, на американских ежегодных конференциях по генетике дрозофилы (США, 1996, 1997, 2006, 2007), на международной конференции по гетерохроматину дрозофилы (Италия, 2005), на Кейстоунских симпозиумах, посвященных функциям микроРНК (2007, 2009), на ежегодных коллоквиумах по мобильным элементам (Франция, 2003, 2004), на конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза» (Москва, 2006), на международном конгрессе по мобильным элементам (Сан-Мало, Франция, 2008), а также на других конференциях и научных школах.

Структура работы

Диссертация изложена на 169 страницах, включает в себя стандартные разделы и иллюстрирована 3 таблицами и 36 рисунками.

Ряд данных, представленных в работе, был получен в результате плодотворного сотрудничества с Ю.А. Абрамовым, М.С. Кленовым, Я.М. Розовским, М.Ю. Савицким, Ю.Я. Шевелевым, с работавшими под руководством автора аспирантами A.A. Добрицей, Д.А. Квоном, С.Г. Шпизом, Е.Ю. Песковой, а также с К. Мезонот (Национальный центр научных исследований, Франция) и О.-Г. Иссингером (Университет г. Оденса, Дания), которым автор приносит глубокую благодарность.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 статей в международных и отечественных рецензируемых журналах, из них 3 обзорные публикации.

Результаты и обсуждение

Молекулярная эволюция повторяющихся генов Drosophila

Эволюционное происхождение генов дрозофилы, участвующих в сперматогенезе.

На основе молекулярно-эволюционного анализа были прослежены эволюционные взаимоотношения семейства родственных генов, участвующих в сперматогенезе.

Мы исследовали эволюцию гетерохроматиновых повторов Stellate (Ste) и Suppressor-of-Stellate (Su(Ste)). Гиперэкспрессия генов Sie, происходящая в отсутствии локуса Su(Sle), приводит к накоплению в семенниках кристаллов белка Ste, родственного регуляторной ß-субъединице казеин-киназы 2 (СК2), следствием чего является нарушение сперматогенеза и стерильность самцов. Экспрессия генов Ste супрессируется по механизму, близкому к РНКи, в котором основную роль играют короткие РНК, образуемые повторами Su(Ste) (Aravin et al. 2001). Был обнаружен новый уникальный эухроматиновый ген ßCK2tes, кодирующий семенник-специфичную р-субъединицу СК2, сходный по своей структуре и нуклеотидной последовательности с генами Ste и Su(Ste), и являющийся их эволюционным предшественником (рис.1).

Обнаружение этого гена приходится на то время, когда последовательность генома дрозофилы была еще не полностью представлена в базах данных. кДНК этого гена были выявлены случайно при скрининге библиотеки кДНК из семенников с помощью зонда, специфичного для генов Su(Ste). Кроме кДНК генов Su(Ste), был отобран ряд кДНК неизвестного гена, гомологичного генам Su(Ste) на 70% и обладающего протяженной ОРС, гомологичной РСК2. Ген был назван SSL (Su(Ste)-like), а позднее переименован в ßCK2tes (от testes, семенники). Из космидной библиотеки генома дрозофилы был отобран клон, содержащий этот ген. Сравнение структуры гена и кДНК выявляет наличие двух нитронов, положение и последовательность которых совпадает с интронами генов Ste. Гибридизация in situ с политенными хромосомами позволила картировать новый ген на 2 хромосоме, в сайте 60D1-2. На рис. 1А представлено сравнение структур трех родственных генов: ßCK2tes, Ste и Su(Ste). На основе молекулярно-эволюционного анализа нуклеотидной последовательности гена ßCK2tes было показано, что этот ген произошел от предкового гена, ßСК2, активного на всех

этапах развития, с участием обратной транскрипции, т.е. процесса образования копии ДНК на матрице РНК с последующим встраиванием этой копии в геном. Об этом

1360 у Sa (Ste) зонд

КЖРРё^ИШШШШШРР

SSL

// - V 25 kl)a у -(A)n

Ste 100 и.о.

! ; h—1

19.5 к!Ъ у(А)п

SSL

1 2 3 4 5 6

Sft*» ■

РШ SSL Ste Su(Ste)

Рис. 1 Семейство родственных генов, участвующих в сперматогенезе.

А Сравнение структур родственных генов Sie, Su(Ste) и SSL (ßCK2tes) и их транскриптов. Области гомологии не заштрихованы; Y-специфическая область Sn(Sle) и гомологичный ей район гена SSL затемнены; заштрихованные участки обозначают специфичные районы для гена Ste и гомологичную им область в SSL. Тонкой линией обозначена последовательность, уникальная для гена SSL. Указан зонд, использованный для скрининга библиотеки кДНК. Мобильный элемент 1360 обозначен черным треугольником. Б Эволюционные взаимоотношения семейства генов, родственных регуляторной субъединице казеин киназы 2. В Нозерн-анализ РНК, выделенной из семенников (1), эмбрионов (2), личинок (3), куколок (4), самцов (5) и самок (6) выявляет семенник-специфичную экспрессию гена SSL. В качестве контроля нагрузки использовали гибридизацию с транскриптами конститутивно экспрессирующегося гена гр49.

свидетельствует отсутствие некоторых интронов, характерных для гена ßСК2, в гене ßC.K2tes. При этом сохраняется непрерывная гомология аминокислотной последовательности. Можно предположить, например, интеграцию кДНК, образованной на частично процессированной РНК ßCK2. В любом случае, точное вырезание трех интронов в гене ßCK2tes по сравнению в предковым геном ßCK2 говорит о том, что ßCK2tes является ретрогеном, причем, функциональным ретрогеном, как показали дальнейшие исследования.

Эволюционную историю семейства генов, родственных регуляторной субъединице СК2, можно представить следующим образом (рис.1 Б). Ген ßC.K2tes является

ретрогеном, произошедшим от гена ¡ЗС.К2, приобретя тканеспецифичные свойства. По-видимому, дупликация гена pCKltes привела к появлению общего предка генов Ste/Su(Ste). Появившиеся гены Ste и Su(Ste) в дальнейшем амплифицировались, дав начало современным кластерам гетерохроматиновых генов X и Y хромосом у D. melanogaster. В данном случае очевидно происхождение гетерохроматиновых генов половых хромосом от аутосомного гена, хотя некоторые промежуточные этапы эволюции пока остаются неясными. По-видимому, эволюция гетерохроматина половых хромосом имеет общие принципы для разных организмов, о чем свидетельствует происхождение гетерохроматиновых повторов Y хромосомы человека от аутосомного семенник-специфичного гена (Saxena et al. 1996).

Несмотря на гомологию всего в 45% между ОРС pCK2tes и fiCK2, предполагаемый белок pCK2tes содержит консервативные участки, необходимые для его функционирования, как регуляторная субъединица холофермента СК2, такие как Glu-Asp-богатый мотив, С-конец, обогащенный пролинами, что важно для образования комплекса с каталитической а субъединицей СК2, мотив «цинковые пальцы». СК2 является одним из ключевых клеточных протинкиназ, участвующих в регуляции клеточного цикла, развитии и дифференцировке. Было предположено, что fX2K2tes кодирует тканеспецифичную, а именно, семенник-специфичную, р субъединицу СК2. Действительно, Нозерн-анализ выявляет транскрипты ¡3CK2tes только в семенниках (рис. 1В). Биохимические исследования, проведенные нами in vitro на очищенном белке и на белковых экстрактах из тканей дрозофилы, продемонстрировали, что обнаруженный нами ген действительно кодирует регуляторную субъединицу протеинкиназы СК2 в семенниках (рис.2). Для исследования свойств белка pCK2tes были получены высокоспецифичные поликлональные кроличьи антитела к рекомбинантному белку, экспрессированному в Е. соЧ.

Холофермент СК2 состоит из двух а и двух (5 субъединиц, при этом р субъединицы способны увеличивать активность а субъединиц, не обладая каталитической активностью. Мы исследовали способность pCK2tes стимулировать активность аСК2, используя рекомбинантные белки аСК2 и pCK2tes в тесте in vitro с участием синтетического полипептида, являющегося субстратом СК2. Было показано, что активность аСК2 увеличивается в 5.5 раз в присутствии эквимолярного количества белка pCK2tes в физиологических условиях (рис. 2А). Была также выявлена специфичность действия pCK2tes в отношении некоторых субстратов СК2, характерная для канонической регуляторной рСК2. Эксперименты с использованием метода гель-

фильтрации выявляют способность рекомбинантных белков аСК2 и рСК^еэ образовывать гетеротетрамер а2р2, характерный для СК2, а белок рСК21ез образует

2 5liD-Е 400-| 300£ 2U0-| IDO«

- - uCK2-[)CK2los «СК2

50 I0i> 150 20(í концентрация NaCl, illM

fiCK2!cs-[H'i.i] fXial

15 16 17 IS 19 20

airni-|iícs апти-Ptcs

liles

a*|)rcs ra+ptes

Рис. 2 Функциональная активность продукта гена pCK2tes.

А Очищенный белок pCK2tes стимулирует активность аСК2. Представлены графики зависимости фосфорилирующей активности аСК2 от концентрации NaCl в присутствии (незакрашенные точки) или отсутствии (темные точки) эквимолярного количества рекомбинантного белка pCK2tes. В качестве субстрата использовался синтетический пептид RRRDDDSDDD. Б Анализ состава комплекса pCK2tes и аСК2 с помощью гель-фильтрации. Белки аСК2 и pCK2tes по отдельности и в эквимолярном соотношении были пропущены через колонку Superóse 6, Pharmacia SMART system. Полученные фракции были проанализированы с помощью Вестерн-анализа с использованием анти- pCK2tes и анти- аСК2 антител. Позиции белковых маркеров указаны стрелками. В Иммунопреципитация слитного белка pCK2tes-P-галактозидаза из экстракта семенников с помощью анти- аСК2 антител. Белковый экстракт из семенников трансгенных самцов, экспрессирующих р-галактозидазу (1) или слитный белок рСКЛеБ-р-галактозидаза (3) был преципитирован с анти- аСК2 антителами. Полученный комплекс был очищен и проанализирован с помощью Вестерн-анализа и антител против Р-галактозидазы (2 и 4). Т - белковый экстракт из семенников; IP - очищенный комплекс после иммунопреципитации.

гомодимер (рис.2Б). И наконец, иммунопреципитация экстракта белков из семенников с использованием антител к аСК2 выявляет в связавшейся фракции белок pCK2tes, что прямо указывает на то, что pCK2tes входит в состав холофермента СК2 в семенниках (рис. 2В). Это первый пример обнаружения отдельного гена для регуляторной субъединицы протеинкиназы СК2, продукт которого выполняет тканеспецифичную роль.

Ген fiCK2tes является примером появления в геноме функционального ретрогена. Поскольку ретрокопии лишены регуляторных последовательностей, обычно они

образуют в геноме псевдогены, т.е. гены, не способные экспрессироваться, подвергаться воздействию отбора и поэтому постепенно вырождающиеся. Было предположено, что в данном случае ретрокопия, по-видимому, попала под влияние семенник-специфичных регуляторных элементов, которые либо возникли в результате мутаций, либо предсуществовали в месте интеграции этой копии в геноме. Действительно, секвенирование космиды, содержащий ген /ЗСАГ2/е5, выявило на расстоянии меньше, чем 1 т.п.н., от гена рСК^еа другой семенник-специфичный ген, Рго$28.1В. Этот ген также является геномной копией конститутивно-экслрессирующегося гена Рго$28.1. После появления геномного сиквенса стало возможным провести транскрипционное картирование района ближайшего окружения генов рс.К21е$ и Ргоз28.1В, в результате чего в этом районе были выявлены другие гены, имеющие семенник-специфичную экспрессию (Ка1шукоуа е! а1. 2005). Данные о присутствии в одном коротком хромосомном фрагменте не родственных друг другу генов, проявляющих одинаковый тип транскрипции (в семенниках), позволили выдвинуть гипотезу о существование внутри кластера общих для всех генов ткане-специфичных регуляторных элементов, координированно активирующих их транскрипцию на определенной стадии сперматогенеза. В дальнейшем, анализ геномов различных организмов позволил выявить кластеры ткане-специфичных генов у дрозофилы и других организмов.

Эволюция структурных вариантов ретротранспозона Отор/н'/я 1731

Функциональная роль и эволюционное значение ретротранспозонов, составляющих значительную часть генома эукариот, являются темой нескончаемых научных дискуссий. Накоплен большой экспериментальный материал, демонстрирующий процесс коадаптации ретротранспозонов и генома хозяина. Многие клеточные гены заимствовали у ретроэлементов их регуляторные участки, такие как энхансеры, участки полиаденилирования, сайты связывания с регуляторными белками. Впечатляющим примером являются теломеры дрозофилы, основной составляющей частью которых являются ретроэлементы. Увеличивающееся число данных о вовлечении и использовании ретротранспозонов в систему регуляции генома дает основания считать, что эти элементы поддерживаются в геноме как источник молекулярных возможностей для эволюционных изменений. Необходимость избегать систему защиты генома, направленную на подавление экспансии мобильных элементов, приводит к быстрому эволюционированию регуляторных и структурных функций ретротранспозонов, о чем ярко свидетельствует полиморфизм мобильных элементов. Именно с функциональной

точки зрения была исследована эволюция ретротранспозонов в разных видах дрозофилы на примере ДКП-содержащего ретротранспозона 1731, для которого нами было показано существование структурных вариантов, принципиально отличающихся своими регуляторными свойствами и стратегией экспрессии.

Мы исследовали детально структурные варианты регуляторной и кодирующей областей ретротранспозона 1731 (рис.3). Показано существование двух типов копий, различающихся структурными изменениями в области трансляционного сдвига рамки считывания. Один тип копий, в результате механизма сдвига рамки трансляции +1 (+1 frameshifting), кодирует, как и многие ретровирусы и ретротранспозоны, два полипептида, Gag и Pol, необходимых в определенном соотношении для обеспечения жизненного цикла ретроэлемента. Сдвиг рамки обеспечивается трансляционной паузой; обычно это редко используемый сериновый кодон AGU. В данном случае в районе предполагаемого сдвига рамки находятся два таких кодона. Второй тип копий содержит делецию одного нуклеотида после предполагаемого сайта сдвига рамки, что приводит к образованию слитной рамки (Рис. ЗА). Анализ представительной выборки клонов, содержащих район сдвига рамки, из разных видов Drosophila подгруппы melanogaster, выявил, что такой вариант является наиболее распространенным в геномах D. melanogaster, D. simulans, D. mauritiana и D. sechellia. Однонуклеотидная делеция выявляется в различных позициях, что предполагает возникновение слитной рамки в результате независимых событий. Во всех копиях со слитной рамкой наблюдаются замены нуклеотидов в области сдвига рамки, причем эти замены приводят к появлению часто используемых кодонов вместо двух «редких» сериновых кодонов. Доказана роль одного из сериновых кодонов в механизме сдвига рамки (рис.ЗА). Присутствие этих замен, повышающих эффективность трансляции белка, указывает на то, что подобные изменения возникли под давлением отбора. Эти замены элиминируют трансляционную паузу, а однонуклеотидная делеция восстанавливает рамку Pol в отсутствии +1 сдвига рамки (рис.ЗА). В результате этих эволюционных событий образуется слитный белок, обладающий такими свойствами составляющих его белков Gag и Pol, как сигнал ядерной локализации и ревертазная активность. Можно предположить, что слитный полипептид, являющийся неканоническим для ретротранспозонов, однако кодируемый большинством копий элемента 1731, мог приобрести новую функцию в геноме.

Для этого же ретротранспозона 1731 был выявлен полиморфизм регуляторной области длинного концевого повтора. Известно, что ДКП разных ретротранспозонов содержат большой набор регуляторных элементов, таких как энхансеры, инсуляторы, сайты связывания многих регуляторных белков. ДКП ретротранспозона 1731 содержит

элементы, ответственные за гормональный ответ, тепловой шок и стрессовые воздействия (Ziarczyk and Best-Belpomme 1991). Выявлены два варианта копий 1731, в одном из которых содержится удвоенный участок в ДКП размером 28 пар нуклеотидов (рис. ЗБ). Появление тандемных дупликаций характерно для активности

+ 1 Pol

Gag -

Gag-Pol

1.4.70 AUG-i^iL*- |S gal 100%

AGU +1 . I»p70 AUG-(- [3 ga I I 2 %

—С—

мутяция^Ь

▼ .+1

GGU . . 0/ hsp70 AUG- pgal 1%

Рис. 3 Структурные варианты ретротранспозона 1731.

А структурный полиморфизм в области сдвига рамки трансляции. Прямоугольниками обозначены длинные концевые повторы (ДКП); стрелками - открытые рамки считывания; звездочкой - делеция; +1 обозначает область сдвига рамки. Указаны триплеты, участвующие в механизме сдвига рамки: редко встречающийся сериновый кодон Айи и часто встречающийся глициновый кодон ООи. Приведены схемы конструкций, использованных для измерения эффективности трансляции белков ретротранспозона 1 731 в системе трансфекции культуры клеток. Относительное количество репортерного белка р-галактозидазы обозначено в %.

Б: структурный полиморфизм длинного концевого повтора ретротранспозона 1731. Представлены типы ДКП А1А2 и А1. Стрелками обозначена повторяющаяся последовательность, крестиками - нуклеотиды, по которым различаются повторы. Справа представлены результаты полуколичественного ЯТ-РСЯ, выявляющего транскрипты А1А2 копий в семенниках ((б), яичниках (оу) и эмбрионах (ет), а А1 копий - только в семенниках. В качестве контроля нагрузки использовали ЯТ-РСК для конститутивно экспрессирующегося гена гр49.

обратной транскриптазы, основного фермента регроэлементов. Возникающие повторы могут дивергировать и приобретать разные свойства. Так в случае с ретротранспозоном 1731 - в копиях, несущих дупликацию (А1А2), повторы лишь слегка различаются по

последовательности, но обладают совершенно разными функциями. Известно, что только один из повторов ответственен за гормональный ответ и регуляцию при тепловом шоке. В геноме сохранились также исходные копии, не содержащие дупликацию этого района (А1). Эти копии не обладают новыми регуляторными элементами, отвечающими на тепловую и гормональную регуляцию. Была исследована тканевая специфичность экспрессии двух выявленных вариантов ДКП. Показано, что вариант Al А2 экспрессируется в эмбрионах, культуре клеток, терминальных тканях, т.е. обладает более широким спектром экспрессии, чем вариант А1, который преимущественно экспрессируется в семенниках (рис.ЗБ). Кроме того, в геномах трех независимо полученных клеточных культур, где многие мобильные элементы амплифицируются, происходит преимущественная экспансия варианта А1А2. Дупликация произошла до того, как разделились виды подгруппы melanogaster, т.к. подобные структурные варианты обнаружены в геномах D. simulons, D. mauritiana и D, sechellia. Интересно то, что в геноме D. mauritiana структурный вариант А1 является доминирующим, в то время как в других видах преобладают копии Al А2.

Анализ последовательности генома D. melanogaster, собственных данных, а также отдельных ранее описанных клонов ретротранспозона 1731, позволил сделать вывод о том, что основное количество активных копий этого элемента в геноме D. melanogaster представлено структурным вариантом, обладающим дупликацией в ДКП и кодирующим слитный белок. Т.о., удалось проследить замену одного типа копий ретротранспозона в геноме на функционально и структурно иной тип копий, что произошло за эволюционно короткий срок. Существование в одном геноме нескольких структурно-функциональных вариантов ретротранспозона указывает на эволюционную динамику мобильных элементов, что вносит вклад в эволюционный потенциал генома.

Роль системы РНК-сайленсинга в пегуляиин активности широкого спектра ретротранспозонов в терминальных тканях Drosophila

Дерепрессия ретротранспозонов в яичниках Drosophila у мутантов piPIIK пути

Мобильные элементы являются источником возникновения мутаций и нарушений развития, поэтому их активность в геноме строго контролируется. РНКн является важным регуляторным механизмом, контролирующим экспрессию и частоту перемещений мобильных элементов в разных организмах. Согласно последним данным, у дрозофилы существуют три класса коротких РНК и три пути, работающие с их участием. микроРНК, образующиеся из шпилечных структур, и кодируемые

клеточными генами, осуществляют трансляционный контроль клеточных мРНК. piPHK (Piwi interacting), имеющие размер 25-29 нт., служат для подавления активности мобильных элементов в терминальных тканях, где они взаимодействуют с особыми белками семейства Аргонавт, относящимися к подсемейству Piwi (Vagin et al. 2006; Brennecke et al. 2007). Их биогенез пока остается загадкой, т.к. эндонуклеазы Dicer, участвующие в образовании микроРНК и siPHK (short interfering RNA), не влияют на процессинг piPHK в терминальных тканях. siPHK образуются из дцРНК с помощью рибонуклеазы Dicer2 и в комплексе с белком Ago2, осуществляют постгранскрипционную деградацию гомологичной РНК-мишени (Hammond 2005). Считалось, что этот путь направлен на экзогенную дцРНК вирусного происхождения, или искусственно введенную. Недавно методом секвенирования библиотек коротких РНК было показано существование эндогенных siPHK, endo-siPHK, гомологичных разнообразным мобильным элементам и образующихся с помощью белков Dcr2 и Ago2 в соматических тканях (Czech et al. 2008; Ghildiyal et al. 2008; Kawamura et al. 2008). По-видимому, в соматических тканях также осуществляется РНКи-зависимое подавление экспрессии мобильных элементов, хотя несколько другим путем, нежели в терминальных тканях.

GATE

+/- -/ПС

. 'i

, ■ I

Рис. 4 Влияние мутации гена spn-E на экспрессию ретротранспозонов в яичниках. Представлены результаты РНК in situ гибридизации с использованием однонитевых зондов, выявляющих смысловые транскрипты ретротранспозонов GATE, 1731, mdgl, I-элемента в яичниках гетерозиготных самок spn-E/+ (+/-) и гомозиготных самок spn-E/spn-E (-/-). Накопление транскриптов GATE, mdgl и 1731 наблюдается в питающих клетках (ne), а I-элемента - как в питающих клетках, так и в области ооцита (обозначено черными стрелками).

Особенно важен контроль активности ретротранспозонов в терминальных клетках, т.к. мутации, вызванные перемещениями мобильных элементов в этих тканях, передаются следующему поколению. Методом in situ РНК гибридизации было изучено влияние мутаций, нарушающих образование белков, участвующих в piPHK пути, на характер транскрипции ретротранспозонов, относящихся к различным классам, в

1731 mdgl I-element

* /

терминальных тканях мутантных мух. Показано, что нарушение piPHK сайленсинга, вызываемое мутацией гена spn-E, кодирующего РНК-хеликазу, приводило к дерепрессии всех исследуемых ретротранспозонов, как ДКП-содержащих (мдг1, 1731, GATE), так и элементов типа LINE (/-элемент) в яичниках гомозиготных мух (рис. 4). Показано, что мутация spn-E приводит к накоплению транскриптов ретротранспозонов в цитоплазме питающих клеток, начиная с ранних стадий оогенеза. Для ретротранспозона I показано, что его транскрипты накапливаются не только в питающих клетках, но и в ооците (рис.4), причем такая картина локализации транскриптов наблюдается во всех исследованных мутантах piPHK пути, таких как spn-E, аиЪ, vasa, armilage. Это позволяет сделать вывод о том, что piPHK путь осуществляет контроль экспрессии широкого спектра ретротранспозонов в яичниках дрозофилы. Большинство перечисленных выше компонентов piPHK пути локализуется в особой перинуклеарной структуре, nuage (от фр. «облако»), где, как считается, происходят основные этапы РНК сайленсинга.

Белок Piwi контролирует частоту транспозиций ретротранспозона в терминальных тканях самцов

Исследование распределения транскриптов тех же ретротранспозонов в семенниках мутантных мух выявило более сложную картину. Мутация гена spn-E приводит к накоплению транскриптов ретротранспозона copia в семенниках и не влияет на транскрипцию других ретротранспозонов. Была исследована мутация гена piwi, кодирующего белок семейства Аргонавт подсемейства Piwi. Этот белок в норме необходим для поддержания терминальных стволовых клеток (Сох, Chao and Lin 2000). Мутация piwi, приводящая к исчезновению продукта этого гена в стволовых клетках (рис.5В), вызывает повышение уровня транскрипции ретротранспозона мдг! только в области пролиферативного центра, где расположены терминальные стволовые клетки, как видно из результатов РНК in situ гибридизации с семенниками (Рис. 5Б). В то же время, транскрипты copia накапливаются на более поздних стадиях сперматогенеза (рис. 5А). Эти данные указывают на то, что наряду с универсальными механизмами супрессии ретротранспозонов в терминальных тканях, существуют индивидуальные особенности регуляции для различных мобильных элементов. Транскрипты ретроэлементов являются интермедиатами транспозиций, и их количество регулируется системой РНКи, однако, до сих пор прямых данных о влиянии РНКи на частоту транспозиций мобильных элементов у дрозофилы не было получено. Подобные исследования затруднены тем, что подавляющее большинство известных мутантов piPHK пути стерильны. Мы

исследовали роль рЫч в контроле частоты транспозиций ретротранспозона мдг1. Т.к. самцы р'тИр'ю! частично фертильны, есть возможность получить потомство таких самцов и исследовать в нем распределение ретротранспозонов. Была получена геномная ДНК из отдельных особей Р1 от скрещивания самцов ртч3/+ и рю^/р'т? с самками р/а также геномная ДНК родителей. Для анализа количества копий

Г F1 f -/- F1 m -/- parents F1 f +/- F1 m +/-I-Il-1 m f I-Il-1

rj* ..... г " ' ' psjf -^f—jp—IJ-7-JJ—|r-|p|p5

—..lZZZI ' — f"-r~ir-irir~• r*i'•"'j'

Рис.5 Влияние мутации гена piwi на экспрессию ретротранспозонов в семенниках. Представлены результаты РНК in situ гибридизации с семенниками самцов piwi/+ (+/-) и piwi/piwi (-/-). А Транскрипты ретротранспозона copia накапливаются на всех стадиях сперматогенеза в семенниках мух, мутантных по гену piwi. Б Активация транскрипции ретротранспозона мдг-1 в терминальных стволовых клетках самцов на фоне мутации piwi. Транскрипты мдг1 в терминальных стволовых клетках обозначены стрелкой. В Исчезновение транскриптов piwi в терминальном центре семенников piwi/piwi (транскрипты piwi в апикальной части семенника у самцов piwi/+ обозначены стрелкой). Г Транспозиции мдг! в мутантах piwi. Геномная ДНК, выделенная из индивидуальных особей (самцов, m, самок, f, как гетерозиготных, +/-, так и гомозиготных, -/-) была обработана рестриктазой, лигирована и амплифицирована с помощью ,гк)г/-специфичных праймеров. Представлен анализ геномной ДНК особей F1 от скрещивания самцов piwi'/piwi и самок piwiJ/+ (parents, 111, f). Дополнительные полосы в препаратах ДНК у потомков, отсутствующие в родительской ДНК (обозначены стрелками), указывают на транспозиции мдг1.

ретротранспозона мдг! в геномах родителей и потомков был применен метод обратной ПЦР, с последующим разделением радиоактивно меченых продуктов в ПААГ. С помощью этого метода можно выявить появление дополнительных полос, соответствующих новым копиям мдг!, в геноме у потомков по сравнению с родительской ДНК. Этим методом удалось выявить появление новых инсерций у потомков от гомозиготного самца (рис.5Г), в то время как у потомков гетерозиготного самца отличий от родительского паттерна распределения копий мдг1 выявлено не было. Частота транспозиций мдг] в семенниках piwi мутантов оценивается как 0.19 транспозиций на поколение. Для сравнения, частота спонтанных транспозиций составляет 10"4 на элемент на поколение. Таким образом, мутация компонента piPHK пути приводит к «транспозиционному взрыву», сопровождающемуся высокой частотой перемещений ретротранспозона. Интересно то, что все мутации, влияющие на биогенез piPHK и приводящие к дерепрессии мобильных элементов, сопровождаются нарушениями гаметогенеза, остановкой мейоза и стерильностью. Предположено, что перемещения мобильных элементов вызывают разрывы ДНК и активацию ответа клетки на поврежденную ДНК, что приводит к остановке мейоза. Подтверждением этой гипотезы служат данные о том, что мутации генов, кодирующих такие компоненты репарационного пути как киназы ATR и Chk2, супрессируют нарушения оогенеза, вызванные мутациями генов piPHK пути (Chen, Pane and Schupbach 2007; Klattenhoff et al. 2007). Наши данные о мобилизации мобильных элементов в piPHK мутантах пока являются единственными фактами, которые указывают на целесообразность данного предположения.

Роль системы РНК-сайлеисинга в регуляции активности теломепных ретроэлементов Drosophiln

Структура теломер Drosophila

Теломеры представляют собой нуклеопротеиновый комплекс на концах линейных хромосом. Основной функцией удлинения теломерной ДНК является компенсация деградации хромосом в результате концевой недорепликации (Оловников 1971). Концы линейной ДНК могут подвергаться процессам репарации, как в случае двухцепочечных разрывов, что может привести к слиянию теломер и нарушению целостности хромосом. Предотвращает этот нежелательный процесс образование так называемого кэпа (от англ.

cap, колпак), представляющего из себя белковый комплекс на конце хромосомы. Кроме того, теломеры, наряду с центромерами, играют важнейшую роль в митотическом и мейотическом поведении хромосом, а в интерфазном ядре определяют хромосомную территорию своей хромосомы в ядерном пространстве. Белки, связанные с теломерными и субтеломерными последовательностями, формируют особый теломерный хроматин, структура которого обеспечивает выполнение перечисленных выше функций теломер. У подавляющего большинства организмов фермент теломераза осуществляет удлинение теломеры за счет синтеза коротких последовательностей ДНК (6-11 нуклеотидов) на матрице РНК, кодируемой собственным клеточным геном (Greider and Blachburn 1985). Теломеры Drosophila образуются за счет ретротранспозиций специализированных теломерных ретротранспозонов (Pardue and DeBaryshe 2003).

► ►►► ►►►► ►►

центромера

► llet-A pi»- TAHRE [> TART

TART 5

Рис.6 Схема теломер дрозофилы. Показано тандемное расположение, по принципу голова к хвосту, ретротранспозонов НеТ-А, ТАЯТ» ТАНКЕ, образующих теломерную ДНК. НеТ-А представлен в теломере О. melanogasler наибольшим числом копий. Представлены схемы строения ретротранспозонов НеТ-А, ТАИТ и ТАНКЕ. Овалами обозначены открытые рамки считывания, черными короткими стрелками - промоторы элементов, известные из литературных данных, пунктирными стрелками - обнаруженные в данной работе.

В теломерах Drosophila обнаружено три семейства ретротранспозонов - НеТ-А, TART и ТАНКЕ. Все они относятся к ретроэлементам, не содержащим ДКП. Особенностью теломерных элементов является специфичность их транспозиций на конец хромосомы, так, что разные элементы располагаются в случайном порядке, но всегда по принципу голова-к-хвосту, их поли(А) хвосты направлены к центромере (рис.6). Основным структурным компонентом теломер является элемент НеТ-А, число копий которого в геномах линий D. melanogaster около 30; TART представлен меньшим

числом - около десяти - копий (George et al. 2006). Представителей третьего семейства, TAHRE, выявлено 4 копии в геноме линии D. melanogaster, использованной для секвенирования в рамках геномного проекта, только одна копия является полноразмерной (Abad et al. 2004b). До сих пор транспозиции ретроэлемента TAHRE детектированы не были. Элемент НеТ-А является неавтономным, т.к. не содержит ОРС, кодирующего ревертазу, в то время как элементы TART и TAHRE кодируют ревертазу, необходимую для процесса транспозиции. Считается, что ревертазную активность НеТ-А заимствует in trans, возможно, в транспозиции НеТ-А участвует ревертаза TART или TAHRE. Особенностью транскрипции НеТ-А является то, что его промотор находится в 3' области и осуществляет экспрессию следующего за ним элемента (Danüevskaya et al. 1997) (рис.6). НеТ-А транскрибируется в терминальных тканях и активно делящихся клетках, например, в имагинальных дисках личинки, где происходит закладка будущих тканей взрослой особи (George and Pardue 2003; Walter and Biessmann 2004). Особенностью транскрипции TART является наличие двух промоторов, смыслового и антисмыслового, расположенных в 5' и 3' UTR, в области длинных прямых неконцевых повторов, характерных для этого элемента (Danilevskaya et al. 1999; Maxwell, Belote and Levis 2006). Функциональные особенности элемента TAHRE до сих пор не были исследованы.

Поддержание теломер дрозофилы с помощью мобильных элементов является, пожалуй, уникальным примером выполнения жизненно важной функции паразитическими элементами генома. Известно, что за одно поколение теломера дрозофилы укорачивается на 70-75 н. (Biessmann and Mason 1988), в то время как транспозиция полноразмерного ретротранспозона приводит к удлинению хромосомы на несколько т.п.н.. Очевидно, что для обеспечения нормальной длины теломер необходим строгий контроль частоты транспозиций. В клетке существуют защитные механизмы, снижающие активность мобильных элементов, важнейшим из которых является система РНКи. Как показано в данной работе, теломерные ретроэлементы, не смотря на их важнейшую функцию в геноме, также являются мишенью системы РНКи.

Экспрессия теломерных ретротранспозопов НеТ-А, TART и TAHRE в терминальных тканях регулируется с помощью piPHK

Экспрессия теломерных ретротранспозонов в яичниках мутантов piPHK пути исследовалась с помощью RT-PCR и in situ РНК гибридизации. Методом РНК in situ гибридизации на яичниках дрозофилы с использованием однонитевых зондов показано,

что на фоне мутаций по локусу vasa, и генам spn-E, кодирующему РНК-хеликазу, aub и piwi, кодирующим белки подсемейства Piwi, происходит значительное увеличение количества смысловых транскриптов всех трех семейств теломерных ретротранспозонов, НеТ-А, TART и TAHRE. Интересно то, что паттерн распределения их транскриптов в яичниках мутантных мух резко различается (рис.7). Транскрипты рстроэлемснта TART обнаруживаются на поздних стадиях оогенеза в цитоплазме питающих клеток. На фоне мутаций генов spn-E, aub и vasa, смысловые транскипты НеТ-А и TAHRE накапливаются в районе ооцита, начиная с ранних стадий оогенеза, а также в цитоплазме питающих клеток. РНК FISH (fluorescence in situ hybridization) анализ позволил локализовать транскрипты НеТ-А в цитоплазме ооцита (рис. 7Д). Совпадение клеточной локализации транскриптов автономного элемента TAHRE и неавтономного элемента НеТ-А позволяет сделать вывод о том, что TAHRE может служить источником обратной транскриптазы для перемещений ретротранспозона НеТ-А - основного компонента теломерной ДНК у дрозофилы, что указывает на разделение функций между различными элементами теломер дрозофилы. Известно, что НеТ-А активно экспрессируется в соматических тканях с активно делящимися клетками (в мозге и имагинальных дисках) (George and Pardue 2003; Walter and Biessmann 2004). Мы ие выявили изменения в экспрессии НеТ-А методом гибридизации РНК in situ в глазо-антеннальных имагинальных дисках мутантов гена spn-E (рис.7Г), что подчеркивает специфическую роль системы piPHK в регуляции экспрессии теломерных ретроэлементов в терминальной ткани.

RT-PCR и Нозерн-блот анализы подтверждают накопление транскриптов теломерных ретроэлементов в яичниках у мутантов по piPHK пути (рис.8). В случае НеТ-А наблюдается резкое накопление транскриптов в яичниках гомозиготных самок (в десятки раз выше, чем в норме). Количество транскриптов TART и TAHRE также значительно увеличивается (рис.8А). Нозерн-блот анализ показывает накопление транскриптов НеТ-А и TART, соответствующих по размеру полноразмерным копиям, в яичниках гомозиготных мутантов spn-E (рис.8Б).

Короткие РНК, специфичные для НеТ-А, TART и TAHRE, были исследованы в яичниках мутантов piPHK пути с помощью Нозерн-анализа (рис.8В). Показано, что для всех трех элементов короткие РНК имеют размер 25-29 н., т.е. относятся к классу piPHK. Эти РНК детектируются только в яичниках гетерозигот и исчезают, или их количество убывает, в яичниках гомозигот по всем исследованным мутациям. Исчезновение коротких РНК коррелирует с дерепрессией ретротранспозонов, что является прямым указанием на роль piPHK в регуляции экспрессии теломерных ретротранспозонов.

Транскрипты ретротранспозонов являются интермедиатами транспозиций, поэтому возникает вопрос, меняется ли у таких мутантов частота транспозиций теломерных элементов на конец хромосомы? Иными словами, участвует ли система р1РНК в контроле длины теломер у дрозофилы?

TART +/- -/-

ПС

НеТ-А +/- -/-

Ч4^

* ПС

TAHRE

+/-

DNA Orb

НеТ-А sense Merge

Рис. 7 Накопление транскриптов теломерных ретротранспозонов в яичниках мутантов по гену sprt-E. Представлены результаты РНК in situ гибридизации с использованием однонитевых антисмысловых зондов с яичниками мух spn-E/+ (+/-) и spn-E/spn-Е (-/-). А Смысловые транскрипты TART детектируются в цитоплазме питающих клеток (пс) на поздних стадиях оогенеза в гомозиготных самках. Б Транскрипты НеТ-А детектируются в цитоплазме питающих клеток и в развивающемся ооците (отмечено красными стрелками) у самок spn-E/spn-E. В Транскрипты TAHRE имеют такой же паттерн распределения, как и транскрипты НеТ-А. Г Детекция смысловых транскриптов ретротранспозона НеТ-А в имагинапьных дисках личинок у мутантов spn-E. Уровень экспрессии НеТ-А в активно делящихся клетках одинаков у особей spn-E'/+ и spn-E11 spn-E1. Д РНК FISH анализ яичников мух spn-E/spn-E с антисмысловым НеТ-А зондом в сочетании с иммуноокрашиванием. Транскрипты НеТ-А (красные) локализуются в цитоплазме ооцита, маркером которой служит белок Orb (зеленый). ДНК покрашена DAPI (синий).

«50

ОС

CL.

Ш 40 H о п>

s 30

4 о и

0 20

1 0J

5 10

CD >>

TART s as

" 9

HeT-A s as

TART HeT-A TAURE

^ШШШШ • •••

TART -25

mirl3b Ш _

HeT-A Щ . 25 niirlVi — —-

TAURE . 25

nrirlSb *

Рис. 8 spn-E участвует в подавлении экспрессии теломерных ретротранспозонов в яичниках дрозофилы.

A RT-PCR анализ количества транскриптов HeT-A, TART и TAHRE в яичниках мутантов по гену spn-E. Гистограммы являются результатом обработки данных пяти экспериментов. Высота столбцов отражает отношение количества транскриптов ретротранспозонов HeT-A. TART или TAHRE к количеству транскриптов конститутивного гена гр49 в яичниках мух spn-E/spn-E (-/-), нормированное на таковое соотношение для мух spn-E/+ (+/-). Наблюдается накопление транскриптов теломерных ретротранспозонов на фоне гомозиготного состояния мутации (spn-E/spn-E). Б Нозерн-анализ тотальной РНК, выделенной из яичников мутантов spn-E; гибридизация с однонитевыми зондами, специфичными к смысловым (s) или антисмысловым (as) транскриптам НеТ-А и TART. Позиции РНК маркера обозначены в т.н.. В качестве контроля нагрузки использовали гибридизацию с транскриптами конститутивно экспрессирующегося гена гр49. Наблюдается накопление полноразмерных смысловых транкриптов НеТ-А и TART, а также антисмысловых транскриптов TART в мутантах spn-E/spn-E. Антисмысловые транскрипты НеТ-А не детектируются. В Нозерн-анализ коротких РНК, специфичных для теломерных ретроэлементов, в яичниках мутантов spn-E; гибридизация со смысловыми однонитевыми зондами. Гибридизация с олигонуклеотидом, комплементарным микроРНК mirl3b сделана в качестве контроля нагрузки. Обозначена позиция РНК маркера размером 25 н.. piPHK, специфичные для НеТ-А. TART и TAHRE, исчезают в яичниках spn-E/spn-E.

Увеличение частоты транспозиций теломерных элементов на конец хромосомы на фоне мутаций по генам spn-E и aub

Частота присоединений теломерных ретроэлементов в piPHKH мутантах была исследована с применением генетической системы, разработанной в лаборатории П.Г. Георгиева, позволяющей фенотипически отслеживать транспозиции теломерных элементов к концу терминальноделетированной хромосомы (Savitsky et al. 2002). Эта система основана на том, что присоединения теломерных ретроэлементов к концу терминальноделетированной хромосомы в ооцитах самки могут быть детектированы фенотипически у потомства в результате активации гена, находящегося на конце хромосомы. Мы использовали терминальную делецию X хромосомы в районе локуса yellow, продукт которого в норме определяет темную окраску тела и щетинок мух. Мутации гена нарушают синтез пигмента, и особи с концевой хромосомной делецией приобретают желтую окраску, т.к. ген yellow у них не работает. Однако к оборванному концу хромосомы могут присоединяться теломерные ретротранспозоны, что приведет к активации того же гена и появлению темноокрашенных мух (рис.9А). Механизм такой активации до конца не ясен. Считается, что белковый комплекс, формирующийся на конце хромосомы, кэп, препятствует работе гена, а присоединение теломерного элемента открывает возможность функционированию регуляторных элементов гена. Т.к. терминальная делеция затрагивает несколько жизненно важных генов, то хромосома, несущая ее (ут), детальна в гомозиготном состоянии. В качестве гомологичной X хромосомы используют хромосому с делецией генов yellow и achaete (хромосома у ас), которые не являются жизненно важными генами. Данная система позволяет следить за событиями, происходящими только на конце терминальноделетированной хромосомы.

Кроме того, отсутствие гена yellow в гомологичной хромосоме a priori позволяет отвергнуть возможность удлинения хромосомы ут за счет генной конверсии. Т.о. появление темноокрашенных мух в данной системе свидетельствуют о транспозиции на конец оборванной хромосомы теломерного элемента.

Для того, чтобы исследовать влияние генов piPHK пути на частоту присоединений теломерных элементов к концу хромосомы, в линию, содержащую терминальноделетированную X хромосому уТД, вводили хромосому, несущую мутации

£coR1

TART

probe

Рис. 9 Анализ присоединений теломерных ретротранспозонов к концу терминальноделетированной X хромосомы.

А Изменение окраски арист (отмечено стрелками) с желтой (слева) на черную (справа) в результате присоединения НеТ-Л или TART к терминальноделетированнон Х-хромосоме и активации гена yellow. Б схематическое изображение присоединений НеТ-А или TART к терминальноделетированной Х-хромосоме в области гена yellow. Область гена yellow обозначена желтым прямоугольником. Присоединения НеТ-А или TARТ обозначены соответственно красной и зеленой стрелками. Вертикальной стрелкой обозначен сайт рестриктазы EcoRl. Синей горизонтальной линией обозначен зонд к гену yellow, использовавшийся для Саузерн-блот анализа (Рис.9В, Г). Область присоединения ретротранспозонов к терминальноделетированной Х-хромосоме была амплифицирована при помощи праймеров, схематически обозначенных маленькими горизонтальными стрелками. В Саузерн-блот анализ ДНК потомства индивидуальных особей y1D/y ас, spn-E'/MKRS с желтыми аристами (без присоединений, дорожка 10), и с черными аристами (с присоединениями TART или НеТ-А, дорожки 1-6 и 7-9, соответственно). ДНК была обработана рестриктазой EcoRl. Фильтр был гибридизован с зондом, отмеченным на схеме Б. Фрагмент размером около 4 т.п.н. дорожки 10 соответствует расстоянию от сайта рестриктазы EcoRl до конца терминальноделетированной Х-хромосомы. Фрагменты размером от 5 до 15 т.п.н. дорожек 1-6 соответствуют различным по длине присоединениям ретротранспозона TART. Фрагменты размером около 5 т.п.н. дорожек 7-9 соответствуют присоединениям ретротранспозона НеТ-А, имеющего консервативный сайт рестриктазы EcoRl в 3' области. Г Саузерн-блот анализ геномной ДНК, выделенной из линий, полученных от четырех самок с черными аристами (присоединение ретротранспозона TART), которые, в свою очередь, являлись потомством от индивидуальной особи у'°/у ас; аиЬвС4!/СуО с желтыми аристами. Идентичность гибридизовавшихся фрагментов подтверждает гипотезу присоединения TART на ранней премейотической стадии оогенеза. Размер ДНК-маркера отмечен в т.п.н.

генов spn-E и aub. Т.к. особи, гомозиготные по большинству мутаций генов piPHK пути, стерильны, эта система позволяет исследовать генетически только дозовые эффекты у самок, гетерозиготных по мутации (самцы с хромосомой утд не выживают). Терминальная делеция находилась в регуляторной области гена yellow, в результате чего особи с терминальной делецией имели желтые аристы. Присоединение ретротранспозона к концу хромосомы приводило к изменению фенотипа и аристы особи и ее потомков становились черными (рис. 9А).

При исследовании мух, несущих хромосому yTD и мутации по генам spn-E и аиЬ в гетерозиготном состоянии было отмечено появление особей с черными аристами. Генетический анализ проводился в течение пяти поколений. Исследовался аллель гена аиЬ - aub^ci2 и два различных аллеля гена spn-E: spn-E1, вызванный точечной заменой в хеликазном домене и spn-E1'1'3987, являющийся результатом инсерции Р-элемента. При анализе контрольной линии ут, не несущей мутаций РНКи генов, особей с измененным фенотипом выявлено не было. Однако ранее при использовании данной системы с терминальноделетированной X хромосомой была определена частота спонтанных присоединений, она равнялась 0,04% (Kahn et al. 2000). В таблице 1 приведены сводные данные. Видно, что оба мутантных аллеля гена spn-E привели к более чем 100-кратному повышению частоты появления мух с темными аристами, а мутация по гену аиЬ к более низкому, но также значительному эффекту. Эта данные позволяют сделать вывод об участии piPHK пути в регуляции частоты транспозиций теломерных ретротранспозонов на конец хромосомы, другими словами, в регуляции длины теломер у дрозофилы.

Таблица 1

Частоты присоединений к терминальноделетированной хромосоме на фоне мутаций spn-E и анЬ

Число особей с измененным фенотипом/общее число особей в поколении

РНК-и мутации Fl F2 F3 F4 F5 %Q (F2-F5)*

sprt-K'/MKRS 1/569 3/146 41/1281 13/1162 37/998 2.1

spn-£™"M« S 1/556 36/416 18/156 35/247 37/998 6.5

О 0/651 3/306 10/787 17/2629 — 0.8

Контроль* 0/735 0/1005 0/595 0/744 0/824 0.0

*() - средняя частота события изменения фенотипа на общее число особей в поколении ** объединенный результат для линий у /у ас; ТМЫМККХ и ут"/у ас; СуО/1/

Мутации генов spn-E и nub в гетерозиготном состоянии вызывают активные транспозиции на конец хромосомы ретротранспозона TART

Для того, чтобы определить природу присоединившегося элемента в мухах с измененным фенотипом, необходимо было проанализировать границу между геном yellow и присоединившимся ретротранспозоном. Геномная ДНК для анализа терминальных присоединений выделялась из потомства самок с темными аристами. Определение того, какой мобильный элемент присоединился к концу хромосомы, было

проведено с помощью ПЦР с использованием праймеров из 5' области кт yellow и 3' области ретротранспозонов TART или НеТ-А (рис. 9Б). Место терминальной делении в гене yellow было определено в предварительных опытах с использованием Саузерн-анализа и находилось в районе 1.5 т.п.н. перед стартом транскрипции гена yellow (рис.9В). Т.к. известно несколько семейств ретротранспозона TART, сильно различающихся в их 3' области, праймеры подбирались к трем основным семействам -А, В1 и С (номера последовательностей в базе данных GenBank U02279, U14101 и AY600955, соответственно). 3' последовательность НеТ-А в значительной степени полиморфна между разными копиями, поэтому праймеры подбирались к наиболее консервативному участку. Кроме того, необходимо отметить, что эти праймеры были универсальны для элементов НеТ-А и TAHRE. Полученные ПЦР продукты были отсеквенированы.

Результаты приведены в таблице 2. На фоне мутации spn-E1 в подавляющем большинстве случаев происходило присоединение ретротранспозона TART, а на фоне мутаций spn-EM>mJ и aub®C42 были детектированы только присоединения TART, при этом были выявлены транспозиции представителей всех трех семейств - А, В1 и С.

Таблица 2

Идентификация теломерных ретротранспозонов, присоединившихся к концу

терминальноделетированной хромосомы на фоне мутаций spn-E и auh

РНК-и мутации

spn-E' spn-É'km' 2 анЬ*'*

TART 29 38 16

НчТ-А 6 - -

Общее число * 35 38 16

*общее число проанализированных отводок с черными аристами.

Это было неожиданно, т.к. в предшествующих работах, где исследовалось влияние Ки белков и белка НР1 на регуляцию длины теломер дрозофилы в этой же генетической системе, в большинстве случаев к терминальноделетированной хромосоме присоединялся НеТ-А (Savitsky et al. 2002; Melnikova, Biessmann and Georgiev 2005).

В результате секвенирования ПЦР продуктов было выявлено, что присоединения происходили к разным нуклеотидным позициям регуляторной области гена yellow. Это объясняется укорочением терминальноделетированной хромосомы в результате концевой недорепликации. Все присоединившиеся ретротранспозоны имели на 3' конце олиго(А) участки, короткие (3-11 нуклеотидов) в случае присоединения НеТ-А и

длинные (20-28 нуклеотидов) в случае присоединения TART. Эти факты свидетельствуют о том, что присоединения произошли в результате процесса ретротранспозиции к концу хромосомы.

Генетический скрининг терминальных присоединений проводился у потомков мух, поддерживающихся как при массовом, так и при индивидуальных скрещиваниях. В потомстве отдельных самок, несущих хромосому yTD и мутации генов spn-E/'hm7 или аиЪ*™, были выявлены несколько особей с измененным фенотипом. При анализе ПЦР продуктов, содержащих границу между присоединением и геном yellow, на фоне каждой из мутаций были выявлены несколько случаев абсолютно идентичных присоединений как по типу присоединившегося элемента (во всех случаях были обнаружены присоединения TART), так и по нуклеотидной позиции присоединения к гену yellow. Саузерн анализ подтвердил идентичность присоединений у мух, являющихся потомками одной самки (рис.9Г). Появление таких кластеров потомков одной мухи с идентичными присоединениями свидетельствует о том, что присоединения происходят на премейотических стадиях оогенеза, после чего терминальные клетки делятся и дают начало нескольким ооцитам с идентичными присоединениями теломерных элементов.

В результате проведенного Саузерн анализа геномной ДНК из потомства выборочных особей с различными типами присоединений было показано, что присоединения имеют различную длину, и присоединяются различные по - своей структуре элементы (рис 9В). Различия в длине продуктов рестрикции ДНК для линий с присоединением ретротранспозона TART могут быть объяснены как присоединением различных копий мобильного элемента, некоторые из которых имеют полиморфный сайт рестриктазы EcoRl, использованной для Саузерн-анализа, так и присоединением неполноразмерных копий, имеющих оборванный 5' конец в результате низкой процессивности обратной транскриптазы.

Таким образом, было показано, что мутации по генам, кодирующим компоненты РНКи spn-E и аиЪ в гетерозиготном состоянии, приводят к существенному повышению частоты присоединений теломерного ретротранспозона TART к концу хромосомы.

Активные транспозиции ретротранспозона НеТ-А к концу хромосомы происходят на фоне мутации гена spn-E в гомозиготном состоянии

Как было показано ранее, мутации генов, кодирующих компоненты РНКи, приводят к значительному накоплению транскриптов ретротранспозона НеТ-А в области ооцита в яичниках мух, гомозиготны х по мутации . Ввиду того, что такие особи

стерильны, и анализировать результаты присоединений к концу терминальноделетированной хромосомы генетическими методами в них было невозможно, мы исследовали присоединения НеТ-А к концу хромосомы в яичниках у мух spn-E1/spn-Е1 и spn-E1/spn-Е!ikW7, содержащих терминальноделетированную хромосому yw с помощью ПЦР анализа. Для этого из зрелых ооцитов этих мух была выделена геномная ДНК, которая содержала ДНК из ооцита и окружающих его фолликулярных клеток, где, однако, эффекта РНКи на экспрессию НеТ-А не наблюдалось (рис. 7Б). В качестве контроля, геномная ДНК была выделена из каркасов мух после удаления яичников. Был проведен вложенный ПЦР с использованием праймеров к гену yellow и HeT-A/TART. ПЦР продукты гетерогенного размера были выявлены только в ДНК из ооцитов мутантных мух при использовании праймеров к элементу НеТ-А. Секвенирование этих фрагментов подтвердило присоединения НеТ-А к концу хромосомы. Т.о., активная экспрессия НеТ-А в яичниках гомозиготных по мутации гена spn-E мух действительно сопровождается активными транспозициями этого элемента к концу хромосомы. Причина того, почему TART является первичной мишенью РНКи в гетерозиготных мутантах, остается до конца неясной. Возможно, что в гетерозиготах по генам РНКи ревертаза, кодируемая элементом TART, связывается со своей же матрицей и осуществляет ее транспозицию в соответствии с так называемой моделью цис-предпочтения. В гомозиготе, где резко увеличивается количество транскриптов НеТ-А, происходит конкуренция за связывание с ревертазой, и наблюдаются транспозиции НеТ-А.

Итак, основным результатом этой части работы является демонстрация того, что система РНКи участвует в регуляции длины теломер у Drosophila, а именно, осуществляет негативный контроль экспрессии и частоты транспозиций на конец хромосомы специфических теломерных ретротранспозонов. Механизм этой регуляции остается пока что неизвестным. Он может осуществляться как на посттранскрипционном уровне и сводиться к регуляции количества транскриптов, так и на уровне изменения структуры теломерного хроматина, и, как следствие, приводить к увеличению уровня транскрипции ретроэлементов и/или изменению доступности конца хромосомы для присоединения ретроэлемента.

Рстротранспозон TAHRE участвует в поддержании теломер Drosopliila.

Как упоминалось выше, в теломерах D. melanogaster обнаружены три семейства ретротранспозонов - НеТ-А, TART и TAHRE. Спонтанные присоединения к теломере первых двух элементов были описаны неоднократно (Biessmann et al. 1992; Sheen and Levis 1994; Kahn et al. 2000; Golubovsky et al. 2001). Элемент TAHRE был обнаружен in silico при анализе геномного сиквенса D. melanogaster (Abad et al. 2004b). Этот элемент, так же как и TART, имеет две открытые рамки считывания, кодирующие белки Gag и Pol, однако, его 5' и 3' нетранслируемые области высоко гомологичны элементу НеТ-А, что и послужило причиной к выбору названия этого элемента (telomere-associated and НеТ-А-related element). Обнаружение нового теломерного элемента, TAHRE, заставило по-новому взглянуть на эволюцию теломерных ретротранспозонов Drosophila. Предполагается, что TART и TAHRE возникли в результате дивергенции общего предкового элемента, а НеТ-А произошел от TAHRE, утратив ген ревертазы (Abad et al. 2004b).

Оставалось неясным, участвует ли TAHRE в поддержании теломер у Drosophila. В анализе присоединений к терминальноделетированной хромосоме мы использовали праймеры, универсальные для НеТ-А и TAHRE, поэтому мы не можем сказать, происходили ли транспозиции TAHRE к концу хромосомы в данной системе. Для того, чтобы однозначно ответить на вопрос о возможности спонтанных транспозиций TAHRE на конец хромосомы, были проанализированы ранее полученные линии мух со спонтанными присоединениями к терминальноделетированной X хромосоме. Геномная ДНК, выделенная из таких мух с неидентифицированными присоединениями, была подвергнута ПЦР анализу с использованием праймеров из гена yellow и 3' области элемента TAHRE (рис.1 OA, праймеры у 17 и ТЗ'). Однако, элементы НеТ-А и TAHRE высоко гомологичны в 3' области, поэтому полученные положительные результаты нуждались в дополнительном подтверждении. Для этого на ДНК из пяти линий, полученных при первичном отборе, был поставлен ПЦР с использованием праймеров из гена yellow и специфического для TAHRE праймера из рамки, кодирующей ревертазу (рис.10А, праймеры TL и yL). В одной из пяти линий был получен ампликон размером около 6 т.п.н.. Амплифицированный фрагмент TAHRE размером 6 т.п.н. был клонирован, секвенирован, а полученная последовательность была выровнена с известными копиями элемента TAHRE. Секвенировапие позволило однозначно отнести этот элемент к семейству ретротранспозонов TAHRE. Вновь перемещенная копия

обладает такими чертами, характерными для TAHRE, как наличие 3' нетранслируемой области, высоко гомологичной таковой НеТ-А, примыкающей к рамке считывания, кодирующей ревертазу, которая отсутствует у НеТ-А, Обнаруженный нами элемент гомологичен на 99.8% ранее секвенированной копии TAHRE (номер последовательности в GenBank - AJ542584) и также обладает делецией размером 327 п.н. в 3 ' области, что отличает его от других трех секвенированных копий TAHRE. Этот элемент содержит поли(А) последовательность на 3' конце, что свидетельствует о ретротранспозиции.

........... тх а- ...........

TAHRE RT | 3, UTR yellow ~

.....GTACCTCCACCAGCAAAGTT(A)nGAACAGCATAAGCCACCTGA...

Z2 ■

НеТ-А

yellow

-434 |>р-

активность pgal 100%

V7 ■

TAHRE

yellow

-414 bp-

активность Pga] 65 ± 14%

Рис. 10 Характеристика теломерного ретротраиспозона TAHRE

A TAHRE может присоединяться к концу хромосомы. Схема присоединения TAHRE к гену yellow, находящемуся на конце терминальноделетированной хромосомы. Праймеры, использованные в опыте, обозначены стрелками.

Б Промоторная активность 3' области TAHRE. Фрагменты НеТ-А и TAHRE (около 400 п.н. от сайта полиаденилирования) были субклонированы из копий, присоединившихся к терминальноделетированной X хромосоме (соответствующие линии дрозофилы обозначены как z2 и v7). Конструкции для трансфекции культуры клеток были сделаны на основе вектора pCaSpeR-AUG-|3-gal. Ферментативная активность конструкции, содержащей TAHRE, выражена как процент от таковой для НеТ-А. Активность р-галактозидазы в клетках, трансфецированных вектором без вставки, не детектировалась.

Для того, чтобы более подробно охарактеризовать новый теломерный элемент TAHRE, была исследована его промоторная активность. Известно, что промотор НеТ-А

обладает необычным свойством, т.к. расположен в 3' UTR элемента и направляет транскрипцию следующей копии в теломерной цепи ретроэлементов (Danilevskaya et al. 1997). НеТ-А и TAHRE высоко гомологичны в 3' области. Мы исследовали промоторную активность 3' области вновь присоединившегося TAHRE с использованием транзиентной трансфекции культуры клеток дрозофилы репортерными конструкциями. Фрагменты размером около 400 п.н. от 3' конца элементов НеТ-А и TAHRE были клонированы в вектор pCaSpeR-AUG-ß-gal. Промотор НеТ-А был также субклонирован из копии НеТ-А, присоединившейся к терминальноделетированной хромосоме (рис. 10Б). Последовательности анализируемых фрагментов НеТ-А и TAHRE были гомологичны примерно на 80%. Ферментативная активность ß-галактозидазы была измерена в экстрактах трансфецированных клеток дрозофилы Schneider 2. Активность репортерного гена под промотором TAHRE была высокой, 64+14% от активности, обеспечиваемой промотором НеТ-А. Т.о., TAHRE как и НеТ-А обладает промотором, расположенным в конце 3' UTR.

Т.о., недавно обнаруженный в теломерах дрозофилы элемент TAHRE способен перемещаться на конец хромосомы, а, следовательно, этот элемент является полноправным участником поддержания теломер у дрозофилы. Является ли наличие в теломерах D. melanogaster трех семейств ретротранспозонов избыточным, или разные элементы выполняют различные функции? Основным структурным компонентом теломер Drosophila является ретроэлемент НеТ-А, лишенный собственной ревертазы, другими словами, неавтономный ретроэлемент. TART и TAHRE, несмотря на то, что присутствуют не на всех теломерах, являются консервативными теломерными элементами в разных видах Drosophila (Casacuberta and Pardue 2002; Casacuberta and Pardue 2003). Предполагалось, что ревертаза TART и/или TAHRE может осуществлять транспозиции НеТ-А (Rashkova et al. 2002; Abad et al. 2004b). Данные о совпадении клеточной локализации транскриптов TAHRE и НеТ-А, представленные в данной работе, указывают на то, что TAHRE может служить источником ревертазы для перемещений ретротранспозона НеТ-А. Секвенирование теломерных областей у эволюционно отдаленных видов Drosophila выявило в них ретроэлементы, значительно отличающиеся от теломерных элементов D. melanogaster, однако, для теломер всех проанализированных видов Drosophila является характерным наличие в них сочетания автономных и неавтономных ретротранспозонов (Villasante et al. 2007), что указывает на эволюционно устойчивое сочетание таких элементов в теломере, и предполагает разделение функций между ними.

Экспрессия репортерных генов, находящихся под промотором ретротранспозоиа НеТ-А, находится под контролем piPHK пути

Механизм РНКи-зависимого сайленсинга теломерных ретроэлементов, так же как и других ретротранспозонов, остается неизвестным. Биохимический путь, связанный с короткими РНК, может приводить как к посттранскрипционной деградации мРНК, так и к формированию неактивного хроматина в гомологичном локусе, т.е. к транскрипционному сайленсингу (Matzke and Birchler 2005). Для дрожжей и растений показано, что короткие РНК в составе белкового комплекса, основным компонентом которого является белок семейства Аргонавт, привлекают гистонметилтрансферазы к гомологичным последовательностям, формируя эпигенетическую метку, характерную для гетерохроматина (Herr et al. 2005; Onodera et al. 2005; Volpe et al. 2002). У млекопитающих короткие РНК вызывают метилирование промоторов ретротранспозонов (Aravin et al. 2008). Наиболее вероятно, что в сайленсинге ретротранспозонов дрозофилы принимают участие оба механизма, как транскрипционный, так и пост-транскрипционный, что достигается с помощью процесса компартментализации (Klattenhoff and Theurkauf 2008), а именно, ядерный белок Piwi участвует в образовании и функционировании первичных piPHK в ядре, которые передаются в цитоплазму, где происходит их амплификация по механизму «пинг-понг» с образованием вторичных piPHK, осуществляющих деградацию мишени в цитоплазме. Скорее всего, этот механизм работает в особой структуре терминальных клеток, nuage. Nuage представляет собой перинуклеарное пространство, содержащее РНП-гранулы, в которых могут концентрироваться piPHK и их мишени.

В случае теломерных ретротранспозонов вопрос о механизме сайленсинга наиболее интересен, т.к. ответ на него позволит понять, вносит ли piPHK-зависимый сайленсинг вклад в формирование теломерного хроматина. В качестве одного из подходов к исследованию механизма РНКи-зависимого сайленсинга теломерных ретротранспозонов были исследованы репортерные системы, в которых гены-репортеры экспрессировались под контролем промотора НеТ-А. В качестве такой репортерной системы были использованы линии с присоединениями теломерных элементов к терминальноделетированной хромосоме, на конце которой находится ген yellow. В этих линиях исследовалась экспрессия гена yellow, находящегося в непосредственной близости от присоединившихся к концу хромосомы элементов НеТ-А или TART, в

ЧсГ-Л ^ ¿¡¡^^^^Ш

4.5

aub vasa spn-E

Рис. 11 Экспрессия гена yellow, находящегося под промотором НеТ-А, находится под контролем piPHK пути

Схемы присоединения НеТ-А (А) или TART (Б) к концу хромосомы, терминальноделетированной в области гена yellow, сохранившего свою промоторную область. В таких случаях изменения экспрессии гена yellow не происходит. В Схема присоединения НеТ-А к терминальноделетированной хромосоме после деградации регуляторной области yellow, в результате чего образуется слитный транскрипт HeT-A-yellow. RT-PCR анализ количества траскриптов HeT-A-yellow в яичниках мутантов по генам spn-E, mib и vasa. Гистограммы являются результатом обработки данных трех экспериментов. Высота столбцов отражает отношение количества транскриптов HeT-A-yellow к количеству транскриптов конститутивного гена гр49 в яичниках гомозиготных по мутациям мух (-/-), нормированное на таковое соотношение для гетерозиготных мух (+/-). Старты транскрипции обозначены изогнутыми стрелками; короткими стрелками обозначены праймеры, используемые для RT-PCR; схематично показан интрон гена yellow.

мутантах по генам РНКи. Такую репортерную систему можно считать эндогенной, т.к. известно, что терминальноделетированные хромосомы, так же как и нормальные, подвергаются процессу «кэпирования», т.е. на их конце формируется белковый комплекс, характерный для теломер и содержащий белок НР1. В тех линиях, где произошли присоединения НеТ-А (рис. ПА) или TART (рис. 11Б), но ген yellow экспрессируется с собственного промотора, изменений в количестве транскрипта yellow на фоне мутации РНКи гена spn-E не происходит. Это указывает на то, что если и формируется на последовательностях TART и НеТ-А неактивный хроматин РНКл-зависимым способом, то распространения его на соседний промотор не происходит, даже в случае присоединений НеТ-А, промотор которого расположен в З'части элемента, и расстояние между промоторами НеТ-А и yellow меньше 300 п.н.. В тех линиях, где присоединения НеТ-А к гену yellow произошли уже после концевой деградации промотора yellow, ген yellow находится под контролем промотора НеТ-А, находящегося

в его 3' области (рис. 11В). Экспрессия гена yellow в таких линиях меняется на фоне мутаций генов piPHK пути spn-E, anb и vig (рис. 11В). С помощью 5' RACE (rapid amplification of cDNA ends) анализа было показано, что транскрипция гена yellow начинается в З'части НеТ-А. Выявлено два старта транскрипции, -30 и -95 п.н. перед сайтом полиаденилирования НеТ-А, при этом положение -30 является основным стартом. Т.о., часть ретротранспозона НеТ-А (30-95 нуклеотидов) входящая в состав слитного транскрипта HeT-A-yellow, ответственна за то, что данный транскрипт становится мишенью РНКи. Ген yellow содержит интрон, что делает возможным исследовать количество как сплайсированных так и не сплайсированных транскриптов HeT-A-yellow. Представленность несплайсированного транскрипта косвенно отражает уровень транскрипции, т.к. сплайсинг происходит ко-транскрипционно.

эндогенные

транекрипты _

А Б ШТ-А p-gal

Рис. 12 Экспрессия трансгенной конструкции HeT-A-lacZ находится под контролем р1РНК пути. А Схема трансгенной конструкции, полученной на основе вектора рСа5ре!1-А1ГС-р^а1 и содержащей промоторную 3' область НеТ-А. Стрелками обозначены старты транскрипции. Б Окрашивание яичников на активность Р-галактозидазы с помощью X-(справа) в мухах дикого типа (+/+) и в />М'/ мутантах (гетеро- и гомозиготах, +/- и -/-, соответственно). Слева представлены результаты ¡п зИи РНК гибридизации с зондом НеТ-А яичников рЫ/1 мутантов. Стрелки указывают на появление окраски в гермариуме самок piwi/+.

Если количество спланированного слитного транскрипта НеТ-А/уеПом> увеличивается на фоне мутаций РНКи генов эрп-Е, аиЪ и vig, то количество несплайсированного

транскрипта не меняется. Эти данные предполагают посттранскрипционный механизм деградации слитного транскрипта HeT-A/yellow, хотя мы не можем полностью исключить то, что компоненты «кэпирующего» или транскрипционного комплекса, собирающегося на промоторе НеТ-А, могут участвовать в транскрипционном механизме регуляции экспрессии HeT-A-yellow.

Интересным является вопрос о том, важна ли для системы РНКи локализация теломерного ретроэлемента в теломерной области, другими словами, насколько важно хроматиновое окружение. Для ответа на этот вопрос мы исследовали экспрессию репортерного гена lacZ, находящегося под промотором элемента НеТ-А в составе трансгенной конструкции, расположенной в эухроматиновых сайтах, в мутантах по генам piPHK пути (рис. 12А). Для нескольких независимых линий, содержащих вставку трансгена на разных хромосомах, показано, что репортерный ген активируется в яичниках мутантов по генам spn-E и piwl (рис. 12Б). Интересно то, что промотор НеТ-А, находясь вне теломерного окружения, демонстрирует паттерн экспрессии, схожий с таковым для эндогенных теломерных копий; например, одна доза мутантного гена piwi приводит к экспрессии НеТ-А в гермариуме яичника, где также детектируется репортерный белок (3-галактозидаза (рис. 12Б). Мы показали, что количество белка (3-галактозидазы и РНК слитного транскрипта HeT-A-lacZ, меняется примерно в одинаковой степени в яичниках у мутантов spn-E. Т.о., эухроматиновое окружение трансгена не мешает считываемым с него транскриптам подвергаться piPHK-зависимому сайленсингу. С помощью метода 5' RACE показано, что основной старт транскрипции в трансгенных конструкциях находится в положении -30 пар нуклеотидов от конца фрагмента НеТ-А. Таким образом, 30 п.н. последовательности НеТ-,4 достаточного для того, чтобы транскрипт, считываемый с трансгенной конструкции, был мишенью piPHK пути. В данном случае мы опять же не исключаем, что компоненты транскрипционного комплекса, собирающегося на промоторе НеТ-А, могут участвовать в piPHK-зависимом сайленсинге трансгена.

Картирование аитисмыслового промотора НеТ-А

Источником антисмысловых коротких РНК, с помощью которых осуществляется регуляция экспрессии смысловых транскриптов, служат антисмысловые транскрипты. Изучение транскриптомов разных организмов выявило необычайно высокий процент генов, транскрибирующихся двунаправлено. Предполагается, что активность этих генов находится под контролем системы РНКи. Однако метаболизм антисмысловых

транскриптов не изучен. Что касается мобильных элементов, происхождение их антисмысловых транскриптов во многих случаях неясно. Например, только для некоторых ретротранспозонов были выявлены внутренние антисмысловые промоторы. Это F-элемент (Minchiotti and Di Nocera 1991) и micropia (Lankenau et al. 1994) у Drosophila, а также LI у человека (Speek 2001). Теломерный ретротранспозон дрозофилы TART также обладает двунаправленной экспрессией (Danilevskaya et al. 1999;

Z2 TGCAATATßATTATGTTACCAGACCATATTTCTGTC-AAAAGCC

H • •« • «

• • • •

• •

НеТА-i

- ^Дй^Ш^КЯИ activity

г^^ИЫШ 100% HeTA-as

ßgfl] activity

¡^Е^^^^Шал^Ш 15,8 ±0,7%

...CATAATCATArfTGCACGgtitpttnctjti...im!3cttt1;agGTACAa:CGCCAGM...

нитрон

Рис.13 Картирование антисмыслового промотора НеТ-А А

А Определение старта антисмысловой транскрипции НеТ-А с помощью 5' RACE. Схематически представлен ретротранспозон НеТ-А; позиции старта смысловой, антисмысловой транскрипции и сайта полиаденилирования обозначены в соответствии с последовательностью клона DMU6920, представленном в GenBank. Верхняя строка сиквенса представляет собой фрагмент из этого клона, нижняя - фрагмент элемента НеТ-А z2, клонированного в составе репортерной конструкции (рис. 13Б). Точками обозначены сайты инициации транскрипции, выявленные с помощью 5' RACE для эндогенных копий (верхняя строка) и для конструкции HeTA-as в экспериментах по трансфекции культуры клеток. Б Антисмысловая промоторная активность 3' области НеТ-А, определенная в результате экспериментов по трансфекции культуры клеток дрозофилы Schneidet. Конструкции HeTA-s и HeTA-as содержат фрагмент 3' области НеТ-А в прямой и обратной ориентации, соответственно, заклонированный в вектор pCaSpeR-AUG-ß-gal. Ферментативная активность ß-галактозидазы для HeTA-as выражена как % от таковой для HeTA-s. Старты транскрипции обозначены короткими стрелками. Транскрипт HeTA/lacZ обозначен длинной стрелкой с указанием позиции интрона. Сиквенс отражает экзон-интронную структуру НеТ-А в составе конструкции, определенную в результате секвенирования продуктов 5' RACE (последовательность экзонов и интрона обозначена большими и малыми буквами, соответственно, консервативные последовательности на границах интрона обозначены жирным шрифтом).

Maxwell et al. 2006). Попытки выявить антисмысловые транскрипты ретроэлемента НеТ-А до сих пор были безуспешными (Danilevskaya et al. 1999; Walter and Biessmann 2004), хотя антисмысловые короткие РНК НеТ-А детектируются в библиотеках коротких РНК у Drosophila (Aravin et al. 2003; Brennecke et al. 2007). Нозерн-блот анализ был применен

для исследования смысловых и антисмысловых piPHK НеТ-А в яичниках у мутантов piPHK пути. piPHK обеих полярностей выявляются в яичниках гетерозигот spn-E/+, piwi/+, aub/+, в то время как и те и другие piPHK отсутствуют в яичниках гомозигот spn-E/spn-E и piwi/piwi (рис. 14А). В яичниках aub/aub количество piPHK снижено. В данном опыте использовался зонд, соответствующий 3' концу НеТ-А, где расположен его прямой промотор (Danilevskaya et al. 1997). Т.к. этот зонд эффективно выявляет антисмысловые piPHK НеТ-А, было предположено, что экспрессия антисмысловых транскриптов НеТ-А осуществляется с промотора, расположенного в 3' области элемента или в прилегающей последовательности. Например, фрагменты теломерных ретротранспозонов выявляются в прицентромерном гетерохроматине, где они могут транскрибироваться с прилегающих промоторов. Для определения старта антисмысловой транскрипции НеТ-А в яичниках был применен метод 5' RACE с использованием праймеров, специфичных к 3' области НеТ-А. РНК выделялась из яичников линии D. melanogaster у1; en' bw' sp', использованной для секвенирования генома, что облегчило анализ последовательностей 5'RACE продуктов. В результате секвенирования 25 5' RACE клонов было обнаружено, что антисмысловая транскрипция НеТ-А инициируется в районе, расположенном на 190 п.н. раньше, чем старт смысловой транскрипции (рис.1 ЗА). Несмотря на наличие гетерогенности в сайтах инициации антисмысловой транскрипции, есть наиболее часто встречающиеся положения. Секвенирование полученных клонов показывает, что антисмысловые транскрипты образуются с различных полиморфных копий НеТ-А. Выявлены также транскрипты, начинающиеся в укороченной копии НеТ-А и продолжающиеся в следующую копию, причем последовательности таких клонов четко соответствуют теломерному району 4 хромосомы. Это говорит о том, что в образовании антисмысловых транскриптов принимают участие теломерные копии НеТ-А. Антисмысловые транскрипты НеТ-А содержат множественные нитроны; для большинства интронов выявлено соответствие консервативным последовательностям сайтов сплайсинга. В различных копиях НеТ-А используются альтернативные пути сплайсинга. Протяженных ОРС в этих транскриптах не выявлено. Ранее было показано, что антисмысловые транскрипты теломерного ретротранспозона TART также сплайсируются. Роль сплайсинга в некодирующих транскриптах ретроэлементов остается загадкой. Показано, что антисмысловые транскрипты TART полиаденилированы, т.к. они присутствуют в поли(А)-содержащей фракции РНК из яичников.

Промоторная активность 3'-области НеТ-А была исследована в экспериментах по трансфекции культуры клеток. Для этого фрагмент НеТ-А размером 434 п.н.,

расположенный перед сайтом полиаденилирования, был заклонирован в прямой и обратной ориентациях в вектор, содержащий репортерный ген lacZ (конструкции НеТ-As и HeT-Aas). Активность антисмысловой конструкции составила около 15% от активности смысловой конструкции (рис, 13Б). Для определения старта транскрипции конструкции HeT-Aas был проведен также 5' RACE анализ. Показано, что старт антисмысловой транскрипции НеТ-А для этой конструкции совпал с таковым, определенным для эндогенных копий (рис. 13А). Более того, транскрипт, считываемый с конструкции HeT-Aas, также как и эндогенные транскрипты, подвергался сплайсингу (рис. 13Б). Т.о., НеТ-А обладает двунаправленным промотором, расположенном в его 3' области. Исследование такого двунаправленного промотора представляет собой отдельный интерес с точки зрения понимания механизмов регуляции транскрипции.

Анализ антисмысловой экспрессии теломерных ретротранспозонов

Исследования роли РНКи в сайленсинге ретротранспозонов в основном фокусируется на поведении смысловых кодирующих транскриптов, являющихся интермедиатами транспозиций в геноме. Однако смысловые короткие РНК также присутствуют в клетке (рис. 14А), что ставит вопрос о том, не являются ли длинные антисмысловые транскрипты ретротранспозонов также мишенью системы РНКи. Поведение антисмысловых транскриптов НеТ-А и TART исследовалось с помощью метода РНК in situ гибридизации однонитевых зондов с яичниками мутантов piPHK пути. Антисмысловые транскрипты теломерных ретротранспозонов накапливаются в виде дискретных точек в ядрах питающих клеток мух spn-E/spn-E (рис.МБ). Показано также накопление антисмысловых транскриптов TART в ядрах питающих клеток у мутантов по гену aub и локусу vasa. Эти данные указывают на то, что piPHK путь участвует в регуляции экспрессии антисмысловых транскриптов ретроэлементов. Интересен тот факт, что смысловые транскрипты НеТ-А и TART накапливаются не только в цитоплазме терминальных клеток, но и в ядрах. Аналогичные данные по накоплению антисмысловых транскриптов в ядрах питающих клеток мутантов по гену spn-E получены для нетеломерного ретротранспозона дрозофилы /-элемента. Накопление как смысловых, так и антисмысловых транскриптов ретротранспозонов в ядрах у мутантов по piPHK пути указывает на то, что этот путь работает не только в цитоплазме, но и в ядре. Методом RT-PCR анализа было проведено сравнение количества смысловых и антисмысловых транскриптов НеТ-А и TART в цитоплазматической и ядерной фракциях яичников мутантов spn-E (рис.14Г).

Накопление антисмысловых транекриптов НеТ-А и TART в ядерной фракции яичников мутантов spn-E/spn-E подтверждает данные, полученные с помощью РНК in situ гибридизации. Видна заметная разница в поведении смысловых и антисмысловых транекриптов. Смысловые транскрипты накапливаются в большей степени в цитоплазме, чем в ядре, в то время как накопление антисмысловых транекриптов происходит в основном в ядрах. Можно предположить, что некодирующие антисмысловые транскрипты способны выходить в цитоплазму, где они являются мишенью деградационной машины, распознающей аберрантные транскрипты, например, NMD (nonsense codon mediated decay).

Итак, показано, что эндогенные длинные антисмысловые транскрипты ретротранспозонов, так же как и смысловые, являются мишенями механизма сайленсинга с участием piPHK. Длинные транскрипты необходимы для образования коротких РНК обеих полярностей, которые, в свою очередь, контролируют количество этих транекриптов. Такое сложное взаимодействие с участием piPHK обеспечивает регуляцию экспрессии ретротранспозонов в терминальных тканях.

Нас заинтересовал характер накопления транекриптов НеТ-А и TART в ядре в виде дискретных точек. Сочетание методов иммуноокрашивания, РНК FISH и ДНК FISH показывает, что накопление транекриптов теломерных ретроэлементов в ядре, как смысловых так и антисмысловых, происходит в районе геномного локуса, соответствующего теломере. На рис. 14В приведены результаты гибридизации с антисмысловой РНК TART в сочетании с окрашиванием теломеры с помощью зонда к НеТ-А. Эти данные указывают на то, что регуляция экспрессии теломерных ретроэлементов в ядре с помощью коротких РНК происходит на транскрипционном или ко-транскрипционном уровне, однако, хроматиновые компоненты этого пути пока остаются неизвестными. По-видимому, если говорить о механизме piPHK-зависимого сайленсинга ретротранспозонов, важны оба пути, как пост-транскрипционный, работающий в цитоплазме на уровне деградации мишени, так и транскрипционный, работающий на уровне изменения структуры хроматина.

НеТ-А

TART

DAPI TART as РНК

НеТ-А ДНК наложение

Рис. 14 Антисмысловые транскрипты теломерных ретрозлементов

А ЯеГ-Л-специфичные piPHK, как смысловые (s), так и антисмысловые (as), выявляются с помощью Нозерн-анализа с однонитевыми зондами в яичниках гетерозигот (+/-) spn-E/+, piwi/+ и anb/+ и отсутствуют или убывают у гомозигот (-/-) spn-E/spn-E7 , piwi/piwi и аиЫаиЬ. Гибридизация с олигонуклеотидами, комплементарными микроРНК mir!3b или 2S РНК сделана в качестве контроля нагрузки. Обозначена позиция РНК маркера размером 25 н.. Б Антисмысловые РНК НеТ-А и TART накапливаются в ядрах питающих клеток (пс) у гомозиготных мутантов spn-E (-/-) (обозначено стрелками). In situ РНК гибридизация с использованием однонитевых смысловых зондов и антител, коньюгированных со щелочной фосфатазой (верхняя панель) или родамином (нижняя панель). В Антисмысловые транскрипты TART (зеленый) колокализуются с ДНК зондом НеТ-А (красный), детектирующим теломеру. ДНК окрашена DAPI. Г Сравнение количества смысловых (s) и антисмысловых (as) транскриптов НеТ-А и TART в тотальной РНК (Т), цитоплазматической (С) и ядерной (N) фракциях яичников spn-E/+ (+/-) и spn-E/spn-E (-/-) с помощью RT-PCR с использованием цепь-специфичных праймеров. Высота столбцов гистограммы отражает отношение количества транскриптов ретротранспозонов HeT-A/TART к количеству транскриптов конститутивного гена гр49 в яичниках мух spn-E/spn-E (-/-), нормированное на таковое соотношение для мух spn-E/л-(+/-).

Выводы:

1. Установлены эволюционные взаимоотношения семейства родственных генов, участвующих в сперматогенезе. Впервые показано эволюционное происхождение в геноме протяженных участков конститутивного гетерохроматина дрозофилы в результате амплификации функционального эухроматического гена. Обнаружен новый функциональный ген, кодирующий семенник-специфичную регуляторную субъединицу казеин-киназы 2 (рсК2ге!). Являясь функциональной ретрокопией гена /ЗСК2, этот ген, в свою очередь, является предком семейств тандемно-повторяющихся генов X и У хромосом и йифе)).

2. Показано существование в одном геноме нескольких структурно-функциональных вариантов ретротранспозона 1731. Исследованы структурные варианты регуляторной и кодирующей областей ретротранспозона 1731. Выявлено наличие двух типов копий, различающихся изменениями в области трансляционного сдвига рамки считывания, а также исследован полиморфизм регуляторной области длинного концевого повтора. Показано, что недавно возникшие копии этого элемента, обладающие широким спектром экспрессии, вытеснили более древний вариант.

3. Гены, кодирующие компоненты РНК интерференции, участвуют в контроле экспрессии и частоты перемещений ретротранспозонов в терминальных тканях Показано, что компоненты РНКи подавляют экспрессию широкого спектра ретротранспозонов в терминальных клетках яичников. Белок участвует в регуляции экспрессии и частоты транспозиций ретротранспозонов в семенниках.

4. Экспрессия и частота перемещений теломерных ретротранспозонов в яичниках дрозофилы регулируется с помощью коротких РНК, т.о., система РНКи осуществляет негативную регуляцию длины теломер у дрозофилы.

5. Экспрессия репортерных генов, находящихся под контролем промотора теломерного ретротранспозона НеТ-А, регулируется по механизму РНКи в терминальных тканях самок дрозофилы независимо от положения репортерных конструкций в геноме.

6. Ретротранспозон ТАНЯЕ способен перемещаться на конец хромосомы, и, следовательно, этот элемент является полноправным участником поддержания теломер у дрозофилы. Установлено, что промотор ретротранспозона ТАНИЕ, так же как у НеТ-А, находится в З'-конце нетранслируемой области данного элемента.

7. Изучено происхождение и биогенез антисмысловых транскриптов теломерных ретротранспозонов, необходимых для образования коротких РНК. Картирован

антисмысловой промотор теломерного ретротранспозона НеТ-А. Показано, что некоднрующие антисмысловые транскрипты процессируются и полиаденилируются. Антисмысловые транскрипты теломерных ретроэлементов НеТ-А и TART являются мишенями РНКи, так же как и смысловые транскрипты, и накапливаются в ядрах терминальных клеток у мутантов по генам РНКи в области теломеры, что указывает на транскрипционный механизм сайленсинга теломерных повторов.

Список публикаций:

1. А.И.Калмыкова. А.А.Добрица, В.А.Гвоздев. Экспрессия гена Y-хромосомы Drosophila melanogaster, кодирующего изоформу регуляторной р-субъединицы казеинкиназы 2. Молекулярная биология, 31, 462-468, 1997.

2. А.И. Калмыкова. А.А. Добрица, В.А. Гвоздев Ген pCK2tes кодирует образование тканеспецифичной регуляторной р-субъединицы казеинкиназы 2 у Drosophila melanogaster, Биохимия, 62, 535-540, 1997.

3. A. I. Kalmvkova. Y. Y. Shevelyov, A. A. Dobritsa, and V. A. Gvozdev. Acquisition and amplification of a testis expressed autosomal gene, SSL, by the Drosophila Y chromosome. Proc. Natl. Acad. Set. USA, 94, 6297-6302, 1997.

4. A. I. Kalmvkova. A. A. Dobritsa, V. A. Gvozdev. The Su(Ste) repeat in the Y-chromosome and betaCK2tes gene encode predicted isophorms of regulatory beta-subunit of protein kinase CK2 in Drosophila melanogaster. FEBS Let., 416, 164-166, 1997.

5. A. I. Kalmvkova. A. A. Dobritsa, V. A. Gvozdev. Su(Ste) diverged tandem repeats in a Y-chromosome of Drosophila melanogaster are transcribed and variously processed. Genetics, 148,243-249, 1998.

6. A. Kalmvkova. C. Maisonhaute & V. Gvozdev. Retrotransposon 1731 in Drosophila melanogaster changes retrovirus-like expression strategy in host genome. Genetica, 107: 73-79, 1999.

7. A. I. Kalmvkova. Y. Y. Shevelyov, О. O. Polesskaya, A. A. Dobritsa, A. G. Evstafieva, B. Boidyreff, O-G. Issinger, V. A. Gvozdev. 2002. CK2(3tes gene encodes a testis-specific isoform of the regulatory subunit of casein kinase 2 in Drosophila melanogaster. Eur. J. Biochem., 269, 1418-1427, 2002.

8. G.L. Kogan, A.V. Tulin, A.A. Aravin, Y.A. Abramov, A.I. Kalmvkova. C. Maisonhaute, V.A. Gvozdev. The GATE retrotransposon in Drosophila melanogaster: mobility in heterochromatin and aspects of its expression in germline tissues. Mol Genet Genomics 269: 234-242, 2003.

9. V.V. Vagin, M.S. Klenov, A.I. Kalmvkova, A.D. Stolyarenko, R.N. Kotelnikov, and V.A. Gvozdev. The RNA interference proteins and vasa locus are involved in the silencing of retrotransposons in the female germline of Drosophila melanogaster. RNA Biology 1: 54-58,2004.

10. A.I. Kalmvkova. D.A. Kwon, Ya.M. Rozovsky, N. Hueber, P. Сару, C. Maisonhaute, and V.A. Gvozdev. Selective expansion of the newly evolved genomic variants of retrotransposon 1731 in the Drosophila genomes. Mol. Biol. Evol. 21: 2281-2289, 2004.

11. A.I. Kalmvkova. M.S. Klenov, and V.A. Gvozdev. Argonaute protein PIWI controls mobilization of retrotransposons in the Drosophila male germ line. Nucl. Acids Res. 33: 2052-2059,2005.

12. M. Savitsky, D. Kwon, P. Georgiev, A. Kalmvkova, V. Gvozdev Telomere elongation is under the control of the RNAi-based mechanism in the Drosophila germline. Genes Dev. 20: 345-354,2006.

13. P.H. Котельников, С.Г. Шпиз, А.И. Калмыкова. В.А. Гвоздев. Белки, связывающие РНК, в процессах РНК-интерференции. Молекулярная биология. 40:595-608, 2006.

14. С.Г. Шпиз, А.И. Калмыкова. Структура теломерного хроматина у Drosophila. Биохимия 70: 759-773, 2007.

15. S. Shpiz , D. Kwon, A. Uneva, М. Kim, М. Klenov, Y. Rozovsky, P.. Georgiev , M. Savitsky , A. Kalmvkova Characterization of Drosophila telomeric retroelement TAHRE: transcription, transpositions and RNAi-based regulation of expression.. Mol. Biol. Evol. 24:2535-45, 2007.

16. S. Shpiz , D. Kwon, Y. Rozovsky, A. Kalmvkova rasiRNA pathway controls antisense expression of Drosophila telomeric retrotransposons in the nucleus Nucl. Acids Res. 37:268-278,2009.

17. S. Shpiz and A. Kalmvkova Epigenetic transmission of piRNAs through the female germline Genome Biology 10: 208,2009.

Заказ №91-а/11/09 Подписано в печать 16.11.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:ш$)@сщ/г.ги

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Калмыкова, Алла Ивановна

Список сокращений

Введение б

Обзор литературы

Общие принципы организации и функционирования гетеро\роматина

Структура п эволюция гетерохроматиновых кластеров генов половых хромосом у Drosophila

Ретротранспозоны и их роль в эволюции генома-хозяина

Система РНК-интерференции и ее роль в регуляции экспрессии ретротранспозонов

Общие принципы работы системы РНК-интерференции

Роль РНК-интерференции в регуляции экспрессии ретротранспозонов

Механизм образования piPHK 23 Функции теломер 27 Принципы организации теломер, образуемых теломеразой

Принципы оранизации теломер Drosophila

Структура теломер Drosophila 33 Клтровапие теломер Drosophila

Хроматин, связанный с субтеломерными последовательностями

Модификации гистонов в теломерной обпасти дрозофилы 43 Структура хроматина в области повторов HeT-A/TART/TAHRE и регуляция транскрипции теломерных ретротранспозонов Drosophila

Материалы и методы

Лабораторные линии Drosophila и линии культур клеток, использованные в работе

Выделение геномной ДНК

ПЦР на геномной ДНК. Полукличественная ПЦР на геномной ДНК

Саузерн-блот анализ.

Обратный ПЦР и детекция транспозиций mdgl

Стандартные генно-инженерные методики

Выделение РНК

Полуколичественный RT-PCR

РНК in situ гибридизация

Нозерн-блот анализ тотальной РНК Drosophila melanogaster

Нозерн-блот анализ коротких РНК Drosophila melanogaster

Сочетание методов РНК, ДНК FISH и иммуноокрашпвания

5' RACE (rapid amplification of cDNA ends) анализ 62 Клонирование промоторных областей ретротранспозонов НсТ-А и ТАНЯЕаля измерения их активности 63 Получение конструкций для исследования механизма трансляционного сдвига (frameshifting) ретротранспозона

Трансфекция культуры клеток Drosuphila и количественное определение активности галактозидазы

Вестерн-анализ

Иммуноирецинитация и гель-фильтрация

Получение эксирессирующих конструкций и конструкций для Р-элементной трансформации

Тесты на активность СК2 67 Окрашивание тканей на Р-галактозидазу. Количественное определение активности Р-галактоэидазы

Результаты

Эволюционные связи в семействе генов, роде i венных регуляторной субъединице казеин киназы 2 (СК2) Drosophila

Обнаружение гена SSL (j3CK2tes) pCK2tes выполняет функции регуляторной субъединицы СК2 в семенниках

Эволюция структурных вариантов ретро гранспозона Drosophila

Структурные варианты кодирующей области ретротранспозона

Структурные варианты ДКГ1 ретротранспозона

Роль системы РНК-сайленсннга в регуляции активности широкого спектра ретротранспозонов в терминальных тканях Drosophila

Деренрессия ретротранспозонов в яичниках Drosophila у мутантов piPHK пути

Белок Piwi контролирует частоту транспозиций ретротранспозона в герминальных тканях самцов

Роль системы РНК-сайленсинга в регуляции активности теломерных ретроэлементов Drosophila

Экспрессия теломерных ретротранспозонов НеТ-А, TART и TAHRE в герминальных тканях регулируется с помощью piPHK

Увеличение частоты транспозиций теломерных элементов на конец хромосомы на фоне мутаций но генам spn-E и aub

Мутации генов spn-E и aub в гетерозиготном состоянии вызывают активные транспозиции на конец хромосомы ретротранспозона TART

Характеристика теломерного ретротранспозона TAHRE

Ретротранспозон TAHRE участвует в поддержании теломер Drosophila

Ретротранспозон TAHRE присутствует в геномах разных линий D. melanogaster и других видов Drosophila область TAHRE обладает промоторной активностью

Экспрессия репортерных генов, находящихся под промотором ретротранспозона НеТ-А, находится под контролем piPHK пути

Свойства антисмысловой экспрессии теломерных ретротранспозонов

Картирование антисмыслового промотора НеТ-А

Анализ ашписмысловой экспрессии теломерных ретротранспозонов

Обсуждение

Эволюция повторяющихся последовательностей генома Drosophila

Роль РНКи в регуляции экспрессии ретротранспозонов у Drosophila

Выводы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Калмыкова, Алла Ивановна

Выводы:

1. Установлены эволюционные взаимоотношения семейства родственных генов, участвующих в сперматогенезе. Впервые показано эволюционное происхождение в геноме протяженных участков конститутивного гетерохроматина дрозофилы в результате амплификации функционального эухроматического гена. Обнаружен новый функциональный ген, кодирующий семенник-специфичную регуляторную субъединицу казеин-киназы 2 (jBCK2tes). Являясь функциональной ретрокопией гена /ЗСК2, этот ген, в свою очередь, является предком семейств тандемно-повторяющихся генов X и Y хромосом (Ste и Su(Ste)).

3. Гены, кодирующие компоненты РНК интерференции, участвуют в контроле экспрессии и частоты перемещений ретротранспозонов в герминальных тканях Показано, что компоненты, РНКи подавляют, экспрессию широкого спектра ретротранспозонов в герминальных клетках яичников. Белок Piwi участвует в регуляции экспрессии и частоты транспозиций ретротранспозонов в семенниках.

5. Экспрессия репортерных генов, находящихся под контролем промотора теломерного ретротранспозона НеТ-А, регулируется по механизму РНКи в герминальных тканях самок дрозофилы независимо от положения репортерных конструкций в геноме.

6. Ретротранспозон TAHRE способен перемещаться на конец хромосомы, и, следовательно, этот элемент является полноправным участником поддержания теломер у дрозофилы. Установлено, что промотор ретротранспозона TAHRE, так же как у НеТ-А, находится в 3'-конце нетранслируемой области данного элемента.

7. Изучено происхождение и биогенез антисмысловых транскриптов. теломерных ретротранспозонов, необходимых для образования коротких РНК. Картирован антисмысловой промотор теломерного ретротранспозона НеТ-А. Показано, что некодирующие антисмысловые транскрипты процессируются и полиаденилируются. Антисмысловые транскрипты теломерных ретроэлементов НеТ-А и TART являются мишенями РНКи, так же как и смысловые транскрипты, и накапливаются в ядрах терминальных клеток у мутантов по генам РНКи в области теломеры, что указывает на транскрипционный механизм сайленсинга теломерных повторов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Калмыкова, Алла Ивановна, Москва

1. Ambros, V. 2004. The functions of animal microRNAs. Nature 431: 350-5.

2. Andreyeva, E.N., E.S. Belyaeva, V.F. Semeshin, G.V. Pokholkova, mid I.F. Zhimulev. 2005. Three distinct chromatin domains in telomere ends of polytene chromosomes in Drosophila melanogaster Tel mutants. J Cell Sci 118: 5465-77.

3. Aravin, A.A., G.J. Harmon, and J. Brennecke. 2007a. The Piwi-piRNA pathway provides an adaptive defense in the transposon arms race. Science 318: 761-4.

4. Aravin, A.A., M.S. Klenov, V.V. Vagin, F. Bantignies, G. Cavalli, and V.A. Gvozdev. 2004.

5. Dissection of a natural RNA silencing process in the Drosophila melanogaster germ line. Mol Cell Biol 24: 6742-50.

6. Aravin, A.A., M. Lagos-Quintana, A. Yalcin, M. Zavolan, D. Marks. B. Snyder, T. Gaasterland, J. Meyer, and T. Tuschl. 2003. The small RNA profile during Drosophila melanogaster development. Dev Cell 5: 337-50.

7. Aravin, A.A., N.M. Naumova, A.V. Tulin, V.V. Vagin, Y.M. Rozovsky, and V.A. Gvozdev. 2001. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster gcrmline. Curr Biol 11: 1017-27.

8. Aravin, A.A., R. Sachidanandam, D. Bourc'his, C. Schaefer, D. Pezic, K.F. Toth, T. Bestor, and GJ. Hannon. 2008. A piRNA pathway primed by individual transposons is linked to de novo DNA methylation in mice. Mol Cell 31: 785-99.

9. Aravin, A.A., R. Sachidanandam, A. Girard, K. Fejes-Toth, and G.J. Hannon. 2007b.

10. Developmentally regulated piRNA clusters implicate MILI in transposon control. Science 316: 744-7.

11. Arkhipova, I.R. and H.G. Morrison. 2001. Three retrotransposon families in the genome of Giardia lamblia: two telomeric, one dead. Pro с Natl Acad Sci USA 98: 14497-502.

12. Ashburner, M. 1989. Drosophila: a laboratory manual. In, pp. 106-107. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

13. Badugu, R., M.M. Shareef, and R. Kellum. 2003. Novel Drosophila heterochromatin protein 1

14. HPl)/origin recognition complex-associated protein (IIOAP) repeat motif in HP1/HOAP interactions and chromocenter associations. J Biol Chem 278: 34491-8.

15. Balakireva, M.D., Y. Shevelyov, D.I. Nurminsky, К J. Livak, and V.A. Gvozdev. 1992.

16. Structural organization and diversification of Y-linked sequences comprising Su(Ste) genes in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res 20: 3731-6.

17. Bartel, D.P. 2004. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116: 28197.

18. Baulcombe, D. 2004. RNA silencing in plants. Nature 431: 356-63.

19. Baumann, P. and T.R. Cech. 2000. Protection of telomeres by the Ku protein in fission yeast. Mol Biol Cell 11: 3265-75.

20. Berloco, M., L. Fanti, F. Sheen, R.W. Levis, and S. Pimpinelli. 2005. Heterochromatic distribution of HeT-A- and TART-like sequences in several Drosophila species. Cytogenet Genome Res 110: 124-33.

21. Bi, X., D. Srikanta, L. Fanti, S. Pimpinelli, R. Badugu, R. Kellum. and Y.S. Rong. 2005.

22. Drosophila ATM and ATR checkpoint kinases control partially redundant pathways for telomere maintenance. Proc Natl Acad Sci USA 102: 15167-72.

23. Bi, X., S.C. Wei, and Y.S. Rong. 2004. Telomere protection without a telomerase; the role of ATM and Mrel 1 in Drosophila telomere maintenance. Curr Biol 14: 1348-53.

24. Bidwai, A.P., J.C. Reed, and C.V. Glover. 1993. Phosphorylation of calmodulin by the catalytic subunit of casein kinase II is inhibited by the regulatory subunit. Arch Biochem Biophys 300: 265-70.

25. Biessmann, H., L.E. Champion, M. O'Hair, K. Ikenaga, B. Kasravi, and J.M. Mason. 1992. Frequent transpositions of Drosophila melanogaster HeT-A transposable elements to receding chromosome ends. EmboJ 11: 4459-69.

26. Biessmann, H. and J.M. Mason. 1988. Progressive loss of DNA sequences from terminal chromosome deficiencies in Drosophila melanogaster. Embo J 7: 1081-6.

27. Biessmann, H., S. Prasad, V.F. Semeshin, E.N. Andreyeva, Q. Nguyen, M.F. Walter, and J.M.

28. Mason. 2005. Two distinct domains in Drosophila melanogaster telomeres. Genetics 171: 1767-77.

29. Billy, E., V. Brondani, H. Zhang, U. Muller, and W. Filipowicz. 2001. Specific interference with gene expression induced by long, double-stranded RNA in mouse embryonal teratocarcinoma cell lines. Proc Natl Acad Sci USA 98: 14428-33.

30. Birnbaum, M.J., J. Wu, D.R. O'Reilly, C.A. Rivera-Marrero, D.E. Hanna, L.K. Miller, and C.V. Glover. 1992. Expression and purification of the alpha and beta subunits of Drosophila casein kinase II using a baculovirus vector. Protein Expr Purify. 142-50.

31. Blackburn, E.H. 1992. Telomerases. Anmi Rev Biochem 61: 113-29.

32. Blumenstiel, J.P. and D.L. Hartl. 2005. Evidence for maternally transmitted small interfering RNA in the repression of transposition in Drosophila virilis. Proc Natl Acad Sci USA 102: 15965-70.

33. Bohnsack, M.T., K. Czaplinski, and D. Gorlich. 2004. Exportin 5 is a RanGTP-dependentdsRNA-binding protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs. RNA 10: 185-91.

34. Boivin, A., C. Gaily, S. Netter, D. Anxolabehere, and S. Ronsseray. 2003. Telomeric associated sequences of Drosophila recruit polycomb-group proteins in vivo and can induce pairing-sensitive repression. Genetics 164: 195-208.

35. Borsani, O., J. Zhu, P.E. Verslues, R. Sunkar, and J.K. Zhu. 2005. Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis-antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis. Cell 123: 1279-91.

36. Boutanaev, A.M., A.I. Kalmykova, Y.Y. Shevelyov, and D.I. Nurminsky. 2002. Large clusters of co-expressed genes in the Drosophila genome. Nature 420: 666-9.

37. Brandtner, E.M., Т. Lechner, P. Loidl, and A. Lusser. 2002. Molecular identification of

38. PpHDACl, the first histone deacetylase fron the slime mold Physarum polycephalum. Cell Biol Int 26: 783-9.

39. Brennecke, J., A.A. Aravin, A. Stark, M. Dus, M. Kellis, R. Sachidanandam, and G.J. Hannon. 2007. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell 128: 1089-103.

40. Brennecke, J., C.D. Malone, A.A. Aravin. R. Sachidanandam. A. Stark, and G.J. Hannon. 2008. An epigenetic role for maternally inherited piRNAs in transposon silencing. Science 322: 1387-92.

41. Bryan, T.M. and T.R. Cech. 1999. Telomerase and the maintenance of chromosome ends. Curr Opin Cell Biol 11: 318-24.

42. Caudy, A.A., R.F. Ketting, S.M. Hammond, A.M. Denli, A.M. Bathoorn, B.B. Tops, J.M. Silva, M.M. Myers, G.J. Hannon, and R.H. Plasterk. 2003. A micrococcal nuclease homologue in RNAi effector complexes. Nature 425: 411-4.

43. Caudy, A.A., M. Myers, G.T. Hannon, and S.M. Hammond. 2002. Fragile X-related protein and V1G associate with the RNA interference machinery. Genes Dev 16: 2491-6.

44. Cenci, G. L. Ciapponi, and M. Gatti. 2005. The mechanism of telomere protection: a comparison between Drosophila and humans. Chromosoma 114: 135-45.

45. Cenci, G., G. Siriaco, G.D. Raffa, R. Kellum, and M. Gatti. 2003. The Drosophila HOAP protein is required for telomere capping. Nat Cell Biol 5: 82-4.

46. Chakalova, L., D. Carter, and P. Fraser. 2004. RNA fluorescence in situ hybridization tagging and recovery of associated proteins to analyze in vivo chromatin interactions. Methods Enzymol 375: 479-93.

47. Chan, S.W. and E.H. Blackburn. 2002. New ways not to make ends meet: telomerase, DNA damage proteins and heterochromatin. Oncogene 21: 553-63.

48. Chang, Y.F., J.S. Imam, and M.F. Wilkinson. 2007. The nonsense-mediated decay RNA surveillance pathway. Annu Rev Biochem 76: 51-74.

49. Chen, Y., A. Pane, and T. Schupbach. 2007. Cutoff and aubergine mutations result inretrotransposon upregulation and checkpoint activation in Drosophila. Curr Biol 17: 63742.

50. Chendrimada, T.P., R.I. Gregory, E. Kumaraswamy, J. Norman, N. Cooch, K. Nishikura, and R. Shiekhattar. 2005. TRBP recruits the Dicer complex to Ago2 for microRNA processing and gene silencing. Nature 436: 740-4.

51. Ciapponi, L., G. Cenci, J. Ducau, C. Flores, D. Johnson-Schlitz, M.M. Gorski, W.R. Engels, and M. Gatti. 2004. The Drosophila Mrel 1/Rad50 complex is required to prevent both telomeric fusion and chromosome breakage. Curr Biol 14: 1360-6.

52. Clark, A.G. et al. 2007. Evolution of genes and genomes on the Drosophila phylogeny. Nature 450: 203-18.

53. Cohen, B.A., R.D. Mitra, J.D. Hughes, and G.M. Church. 2000. A computational analysis of whole-genome expression data reveals chromosomal domains of gene expression. Nat Genet 26: 183-6.

54. Cook, H.A., B.S. Koppetsch, J. Wu, and W.E. Theurkauf. 2004. The Drosophila SDE3 homolog armitage is required for oskar mRNA silencing and embryonic axis specification. Cell 116: 817-29.

55. Cooper, J.P. 2000. Telomere transitions in yeast: the end of the chromosome as we know it. Curr Opin Genet Dev 10: 169-77.

56. Cox, D.N., A. Chao, and Н. Lin. 2000. piwi encodes a nucleoplasmic factor whose activitymodulates the number and division rate of germline stem cells. Development 127: 50314.

57. Cryderman, D.E., E.J. Morris, H. Biessmann, S.C. Elgin, and L.L. Wallrath. 1999. Silencing at Drosophila telomeres: nuclear organization and chromatin structure play critical roles. Embo J18: 3724-35.

58. Czech, В., C.D. Malone, R. Zhou, A. Stark, C. Schlingeheyde, M. Dus, N. Perrimon, M. Kellis, J.A. Wohlschlegel, R. Sachidanandam, G.J. Hannon, and J. Brennecke. 2008. An endogenous small interfering RNA pathway in Drosophila. Nature 453: 798-802.

59. Czermin, В., R. Melfi, D. McCabe, V. Seitz, A. Imhof, and V. Pirrotta. 2002. Drosophilaenhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyl transferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell 111: 185-96.

60. Dalmay, Т., R. Horsefield, Т.Н. Braunstein, and D.C. Baulcombe. 2001. SDE3 encodes an RNA helicase required for post-transcriptional gene silencing in Arabidopsis. Embo J20: 2069-78.

61. Danilevskaya, O.N., I.R. Arkhipova, K.L. Traverse, and M.L. Pardue. 1997. Promoting intandem: the promoter for telomere transposon HeT-A and implications for the evolution of retroviral LTRs. Cell 88: 647-55.

62. Danilevskaya, O.N., K.L. Traverse, N.C. Hogan, P.G. DeBaryshe, and M.L. Pardue. 1999. The two Drosophila telomeric transposable elements have very different patterns of transcription. Mol Cell Biol 19: 873-81.

63. Day, A., M. Schirmer-Rahire, M.R. Kuchka, S.P. Mayfield, and J.D. Rochaix. 1988. Atransposon with an unusual arrangement of long terminal repeats in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Embo J 7: 1917-27.

64. Denli, A.M., B.B. Tops, R.H. Plasterk, R.F. Ketting, and G.J. Hannon. 2004. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature 432: 231-5.

65. Dcsset, S., С. Meignin, В. Dastugue, and C. Vaury. 2003. COM, a heterochromatic locus governing the control of independent endogenous retroviruses from Drosophila melanogaster. Genetics 164: 501-9.

66. Di Franco, C., D. Galuppi, and N. Junakovic. 1992a. Genomic distribution of transposable elements among individuals of an inbred Drosophila line. Genetica 86: 1-11.

67. Di Franco, С., C. Pisano, F. Fourcade-Peronnet, G. Echalier, andN. Junakovic. 1992b. Evidence for de novo rearrangements of Drosophila transposable elements induced by the passage to the cell culture. Genetica 87: 65-73.

68. Di Nocera, P.P. 1988. Close relationship between non-viral retroposons in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res 16: 4041-52.

69. Di Nocera, P.P. and G. Casari. 1987. Related polypeptides are encoded by Drosophila Felements, I factors, and mammalian LI sequences. Proc Natl Acad Sci USA 84: 5843-7.

70. Di Nocera, P.P. and I.B. Dawid. 1983. Transient expression of genes introduced into cultured cells of Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA 80: 7095-8.

71. Di Nocera, P.P. and Y. Sakaki. 1990. LINEs: a superfamily of retrotransposable ubiquitous DNA elements. Trends Genet 6: 29-30.

72. Diede, S.J. and D.E. Gottschling. 1999. Telomerase-mediated telomere addition in vivo requires DNA primase and DNA polymerases alpha and delta. Cell 99: 723-33.

73. Dimitri, P., R. Caizzi, E. Giordano, M. Carmela Ac card о, G. Lattanzi, and G. Biamonti. 2009. Constitutive heterochromatin: a surprising variety of expressed sequences. Chromosoma 118:419-35.

74. Dombroski, B.A., S.L. Mathias, E. Nanthakumar, A.F. Scott, and H.H. Kazazian, Jr. 1991. Isolation of an active human transposable element. Science 254: 1805-8.

75. Dunn, C.A. and D.L. Mager. 2005. Transcription of the human and rodent SPAM1 / PH-20 genes initiates within an ancient endogenous retrovirus. BMC Genomics 6: 47.

76. Dunn, C.A., P. Medstrand, and D.L. Mager. 2003. An endogenous retroviral long terminal repeat is the dominant promoter for human betal,3-galactosyltransferase 5 in the colon. Proc Natl Acad Sci USA 100: 12841-6.

77. Echalier, G. 1997. Drosophila cells in culture. Academic Press, New York.

78. Egorova, K.S., O.M. Olenkina, M.V. Kibanov, A.I. Kalmykova, V.A. Gvozdev, and L.V.

79. Olenina. 2009. Genetically Derepressed Nucleoplasmic Stellate Protein in Spermatocytes of D. melanogaster interacts with the catalytic subunit of protein kinase 2 and carries histone-like lysine-methylated mark. JMol Biol 389: 895-906.

80. Eickbush, Т.Н. 1992. Transposing without ends: the non-LTR retrotransposable elements. New Biol 4: 430-40.

81. Eissenberg, J.C. and S.C. Elgin. 2000. The HP1 protein family: getting a grip on chromatin. Curr Opin Genet Dev 10: 204-10.

82. Fairman, M.E., P.A. Maroney, W. Wang, H.A. Bowers, P. Gollnick, T.W. Nilsen, and E.

83. Jankowsky. 2004. Protein displacement by DExH/D "RNA helicases" without duplex unwinding. Science 304: 730-4.

84. Fanti, L., D.R. Dorer, M. Berloco, S. Henikoff, and S. Pimpinelli. 1998. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. Chromosoma 107: 286-92.

85. Farabaugh, P.J. 1996. Programmed translational frameshifting. Microbiol Rev 60: 103-34.

86. Fawcett, D.H., C.K. Lister, E. Kellett, and D.J. Finnegan. 1986. Transposable elementscontrolling I-R hybrid dysgenesis in D. melanogaster are similar to mammalian LINEs. Cell AT. 1007-15.

87. Findley, S.D., M. Tamanaha, N.J. Clegg, and H. Ruohola-Baker. 2003. Maelstrom, a Drosophila spindle-class gene, encodes a protein that colocalizes with Vasa and RDEl/AGOl homolog, Aubergine, in nuage. Development 130: 859-71.

88. Fourcade-Peronnet, F., L. d'Auriol, J. Becker, F. Galibert, and M. Best-Belpomme. 1988. Primary structure and functional organization of Drosophila 1731 retrotransposon. Nucleic Acids Res 16: 6113-25.

89. Garcia-Cao, M., R. O'Sullivan, A.H. Peters, T. Jenuwein, and M. A. Blasco. 2004. Epigenetic regulation of telomere length in mammalian cells by the Suv39hl and Suv39h2 histone methyltransferases. Nat Genet 36: 94-9.

90. George, J.A., P.G. DeBaryshe, K.L. Traverse, S.E. Celniker, and M.L. Pardue. 2006. Genomic organization of the Drosophila telomere retrotransposable elements. Genome Res 16: 1231-40.

91. George, J.A. and M.L. Pardue. 2003. The promoter of the heterochromatic Drosophila telomeric retrotransposon, HeT-A, is active when moved into euchromatic locations. Genetics 163: 625-35.

92. Ghildiyal, M., H. Seitz, M.D. Ilorwich, C. Li, T. Du, S. Lee, J. Xu, E.L. Kittler, M.L. Zapp, Z. Weng, and P.D. Zamore. 2008. Endogenous siRNAs derived from transposons and mRNAs in Drosophila somatic cells. Science 320: 1077-81.

93. Gillespie, D.E. and C.A. Berg. 1995. Homeless is required for RNA localization in Drosophila ■ oogenesis and encodes a new member of the DE-H family of RNA-dependent ATPases. Genes Dev 9: 2495-508.

94. Girard, A., R. Sachidanandam, G.J. Hannon, and M.A. Carmell. 2006. A germline-specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins. Nature 442: 199-202.

95. Golubovsky, M.D., A.Y. Konev, M.F. Walter, H. Biessmann, and J.M. Mason. 2001. Terminal retrotransposons activate a subtelomeric white transgene at the 2L telomere in Drosophila. Genetics 158: 1111-23.

96. Gregory, R.I., K.P. Yan, G. Amuthan, T. Chendrimada, B. Doratotaj, N. Cooch, and R.

97. Shiekhattar. 2004. The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs. Nature 432: 235-40.

98. Greider, C.W. and E.H. Blackburn. 1985. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell 43: 405-13.

99. Grewal, S.I. and S.C. Elgin. 2002. Heterochromatin: new possibilities for the inheritance of structure. Curr Opin Genet Dev 12: 178-87.

100. Griffith, J.D., L. Comeau, S. Rosenfield, R.M. Stansel, A. Bianchi, H. Moss, and T. de Lange. 1999. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell 97: 503-14.

101. Grimaud, C., N. Negre, and G. Cavalli. 2006. From genetics to epigenetics: the tale of Polycomb group and trithorax group genes. Chromosome Res 14: 363-75.

102. Gunawardane, L.S., K. Saito, K.M. Nishida, K. Miyoshi, Y. Kawamura, T. Nagami, H. Siomi, and M.C. Siomi. 2007. A slicer-mediated mechanism for repeat-associated siRNA 5' end formation in Drosophila. Science 315: 1587-90.

103. Haley, B. and P.D. Zamore. 2004. Kinetic analysis of the RNAi enzyme complex. Nat Struct Mol Biol 11: 599-606.

104. Hall, I.M., K. Noma, and S.I. Grewal. 2003. RNA interference machinery regulates chromosome dynamics during mitosis and meiosis in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U SA 100: 1938.

105. Hall, I.M., G.D. Shankaranarayana, K. Noma, N. Ayoub, A. Cohen, and S.I. Grewal. 2002. Establishment and maintenance of a heterochromatin domain. Science 297: 2232-7.

106. Hamilton, A., O. Voinnet, L. Chappell, and D. Baulcombe. 2002. Two classes of short interfering RNA in RNA silencing. Em bo J 21: 4671-9.

107. Han, J., Y. Lee, K.H. Yeom, Y.K. Kim, H. Jin, and V.N. Kim. 2004. The Drosha-DGCR8 complex in primary microRNA processing. Genes Dev 18: 3016-27.

108. Han, J., Y. Lee, K.H. Yeom, J.W. Nam, I. Heo. J.K. Rhee. S.Y. Sohn, Y. Cho, B.T. Zhang, and V.N. Kim. 2006. Molecular basis for the recognition of primary microRNAs by the Drosha-DGCR8 complex. Cell 125: 887-901.

109. Hannon, G.J. and J.J. Rossi. 2004. Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature 431: 371-8.

110. Haoudi, A., M.H. Kim, S. Champion, M. Best-Belpomme, and C. Maisonhaute. 1995. The Gag polypeptides of the Drosophila 1731 retrotransposon are associated to virus-like particles and to nuclei. FEBS Lett 371: 67-72.

111. Hardy, R.W., D.L. Lindsley, K.J. Livak, B. Lewis, A.L. Siversten, G.L. Joslyn, J. Edwards, and S. Bonaccorsi. 1984. Cytogenetic analysis of a segment of the Y chromosome of Drosophila melanogaster. Genetics 107: 591-610.

112. Harris, A.N. and P.M. Macdonald. 2001. Aubergine encodes a Drosophila polar granulecomponent required for pole cell formation and related to eIF2C. Development 128: 2823-32.

113. Hediger, F., F.R. Neumann, G. VanHouwe, K. Dubrana, and S.M. Gasser. 2002. Live imaging of telomeres: yKu and Sir proteins define redundant telomere-anchoring pathways in yeast. Curr Biol 12: 2076-89.

114. Henikoff, S. 1997. Nuclear organization and gene expression: homologous pairing and long-range interactions. Curr Opin Cell Biol 9: 388-95.

115. Henson, J.D., A.A. Neumann, T.R. Yeager, and R.R. Reddel. 2002. Alternative lengthening of telomeres in mammalian cells. Oncogene 21: 598-610.

116. Herr, A.J., M.B. Jensen, T. Dalmay, and D.C. Baulcombe. 2005. RNA polymerase IV directs silencing of endogenous DNA. Science 308: 118-20.

117. Himber, C., P. Dunoyer, G. Moissiard, C. Ritzenthaler, and O. Voinnet. 2003. Transitivitydependent and -independent cell-to-cell movement of RNA silencing. Embo J 22: 452333.

118. Horwich, M.D., С. Li, С. Matranga, V. Vagin, G. Farley, P. Wang, and P.D. Zamore. 2007. The Drosophila RNA methyltransferase, DmFIenl, modifies germline piRNAs and single-stranded siRNAs in RISC. Curr Biol 17: 1265-72.

119. Hsu, H.L., D. Gilley, S.A. Galande, M.P. Hande, B. Allen, S.H. Kim. G.C. Li, J. Campisi, T. Kohwi-Shigematsu, and D.J. Chen. 2000. Ku acts in a unique way at the mammalian telomere to prevent end joining. Genes Dev 14: 2807-12.

120. Humphreys, D.T., B.J. Westman, D.I. Martin, and T. Preiss. 2005. MicroRNAs controltranslation initiation by inhibiting eukaryotic initiation factor 4E/cap and poly(A) tail function. Proc Natl AcadSci USA 102: 16961-6.

121. Jakubczak, J.L., Y. Xiong, and Т.Н. Eickbush. 1990. Type I (Rl) and type II (R2) ribosomal DNA insertions of Drosophila melanogaster are retrotransposable elements closely related to those of Bombyx mori .J Mol Biol 212: 37-52.

122. Jordan, I.K. and J.F. McDonald. 1998. Evolution of the copia retrotransposon in the Drosophila melanogaster species subgroup. Mol Biol Evol 15: 1160-71.

123. Jordan, I.K., I.B. Rogozin, G.V. Glazko, and E.Y. Koonin. 2003. Origin of a substantial fraction of human regulatory sequences from transposable elements. Trends Genet 19: 68-72.

124. Josse, Т. L. Teysset, A.L. Todeschini, C.M. Sidor, D. Aiixolabehere, and S. Ronsseray. 2007. Telomeric trans-silencing: an epigenetic repression combining RNA silencing and heterochromatin formation. PLoS Genet 3: 1633-43.

125. Kahn, Т., M. Savitsky. and P. Georgiev. 2000. Attachment of HeT-A sequences to chromosomal termini in Drosophila melanogaster may occur by different mechanisms. Mol Cell Biol 20: 7634-42.

126. Kalmykova, A., C. Maisonhaute, and V. Gvozdev. 1999. Retrotransposon 1731 in Drosophila melanogaster changes retro virus-like expression strategy in host genome. Genetica 107: 73-7.

127. Kalmykova. A.I., A.A. Dobritsa, and V.A. Gvozdev. 1998. Su(Ste) diverged tandem repeats in a Y chromosome of Drosophila melanogaster are transcribed and var iously processed. Genetics 148: 243-9.

128. Kalmykova, A.I., M.S. Klenov, and V.A. Gvozdev. 2005a. Argonaute protein PIWI controlsmobilization of retrotransposons in the Drosophila male germline. Nucleic Acids Res 33: 2052-9.

129. Kalmykova, A.L, D.A. Kwon, Y.M. Rozovsky, N. Hueber, P. Сару, C. Maisonhaute, and V.A. Gvozdev. 2004. Selective expansion of the newly evolved genomic variants of retrotransposon 1731 in the Drosophila genomes. Mol Biol Evol 21: 2281-9.

130. Kalmykova, A.I., D.I. Nurminsky, D.V. Ryzhov, and Y.Y. Shevelyov. 2005b. Regulatedchromatin domain comprising cluster of co-expressed genes in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res 33: 1435-44.

131. Kalmykova, A.I., Y.Y. Shevelyov, A.A. Dobritsa, and V.A. Gvozdev. 1997. Acquisition and amplification of a testis-expressed autosomal gene, SSL, by the Drosophila Y chromosome. Proc Natl Acad Sci USA 94: 6297-302.

132. Kalmykova, A.I., Y.Y. Shevelyov, O.O. Polesskaya, A.A. Dobritsa, A.G. Evstafieva, B.

133. Boldyreff, O.G. Issinger, and V.A. Gvozdev. 2002. CK2(beta)tes gene encodes a testis-specific isoform of the regulatory subunit of casein kinase 2 in Drosophila melanogaster. EurJBiochem 269: 1418-27.

134. Kanoh, J., M. Sadaie, T. Urano, and F. Ishikawa. 2005. Telomere binding protein Tazlestablishes Swi6 heterochromatin independently of RNAi at telomeres. Curr Biol 15: 1808-19.

135. Kapitonov, V.V. and J. Jurka. 2003. Molecular paleontology of transposable elements in the Drosophila melanogaster genome. Proc Natl Acad Sci USA 100: 6569-74.

136. Karpen, G.H. and A.C. Spradling. 1992. Analysis of subtelomeric heterochromatin in the Drosophila minichromosome Dpi 187 by single P element insertional mutagenesis. Genetics 132: 737-53.

137. Kavvamura, Y., K. Saito, T. Kin, Y. Ono, K. Asai, T. Sunohara, T.N. Okada, M.C. Siomi, and H. Siomi. 2008. Drosophila endogenous small RNAs bind to Argonaute 2 in somatic cells. Nature 453: 793-7.

138. Kazazian, H.H., Jr., C. Wong, H. Youssoufian, A.F. Scott, D.G. Phillips, and S.E. Antonarakis. 1988. Haemophilia A resulting from de novo insertion of LI sequences represents a novel mechanism for mutation in man. Nature 332: 164-6.

139. Kelleher, С., M.T. Teixeira, K. Forstemann, and J. Lingner. 2002. Telomerase: biochemical considerations for enzyme and substrate. Trends Biochem Sci 27: 572-9.

140. Kennerdell, J.R., S. Yamaguchi, and R.W. Carthew. 2002. RNAi is activated during Drosophila oocyte maturation in a manner dependent on aubergine and spindle-E. Genes Dev 16: 1884-9.

141. Kidwell, M.G. and D.R. Lisch. 2001. Perspective: transposable elements, parasitic DNA, and genome evolution. Evolution 55: 1-24.

142. Kim, A., C. Terzian, P. Santamaria, A. Pelisson, N. Purd'homme, and A. Bucheton. 1994a. Retroviruses in invertebrates: the gypsy retrotransposon is apparently an infectious retrovirus of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U SA 91: 1285-9.

143. Kim, A.I., E.S. Belyaeva, and M.M. Aslanian. 1990. Autonomous transposition of gypsy mobile elements and genetic instability in Drosophila melanogaster. Mol Gen Genet 224: 303-8.

144. Kim, J., J. Daniel, A. Espejo, A. Lake, M. Krishna, L. Xia, Y. Zhang, and M.T. Bedford. 2006. Tudor, МВТ and chromo domains gauge the degree of lysine methyl ation. EAfBO Rep.

145. Kim, J.K., H.W. Gabel, R.S. Kamath, M. Tewari, A. Pasquinelli, J.F. Rual, S. Kennedy, M. Dybbs, N. Benin, J.M. Kaplan, M. Vidal, and G. Ruvkun. 2005. Functional genomic analysis of RNA interference in C. elegans. Science 308: 1164-7.

146. Kim, N.W., M.A. Piatyszek, K.R. Prowse, C.B. Harley, M.D. West, P.L. Ho, G.M. Coviello, W.E. Wright, S.L. Weinrich, and J.W. Shay. 1994b. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science 266: 2011-5.

147. Kishi, S., G. Wulf, M. Nakamura, and K.P. Lu. 2001. Telomeric protein Pin2/TRF1 inducesmitotic entry and apoptosis in cells with short telomeres and is down-regulated in human breast tumors. Oncogene 20: 1497-508.

148. Kiyosawa, H., I. Yamanaka, N. Osato, S. Kondo, and Y. Hayashizaki. 2003. Antisensetranscripts with FANTOM2 clone set and their implications for gene regulation. Genome Res 13: 1324-34.

149. Klattenhoff, C., D.P. Bratu, N. McGinnis-Schultz, B.S. Koppetsch, H.A. Cook, and W.E. Theurkauf. 2007. Drosophila rasiRNA pathway mutations disrupt embryonic axis specification through activation of an ATR/Chk2 DNA damage response. Dev Cell 12: 45-55.

150. Klattenhoff, C. and W. Theurkauf. 2008. Biogenesis and germline functions of piRNAs. Development 135: 3-9.

151. Klenov, M.S., S.A. Lavrov, A.D. Stolyarenko, S.S. Ryazansky, A.A. Aravin, T. Tuschl, and V.A. Gvozdev. 2007. Repeat-associated siRNAs cause chromatin silencing of retrotransposons in the Drosophila melanogaster germline. Nucleic Acids Res 35: 5430-8.

152. Avedisov, A.I. Kim, and Y.V. Ilyin. 2001. Two variants of the Drosophila melanogaster retrotransposon gypsy (mdg4): structural and functional differences, and distribution in fly stocks. Mol Genet Genomics 265: 367-74.

153. Malone, C.D., J. Brennecke, M. Dus, A. Stark, W.R. McCombie, R. Sachidanandam, and G.J.

154. Hannon. 2009. Specialized piRNA Pathways Act in Germline and Somatic Tissues of the Drosophila Ovary. Cell.

155. Mason, J.M. and H. Biessmann. 1995. The unusual telomeres of Drosophila. Trends Genet 11: 58-62.

156. Matranga, C., Y. Tomari, C. Shin, D.P. Bartel, and P.D. Zamore. 2005. Passenger-strandcleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes. Cell 123: 607-20.

157. Matyunina, L.V., I.K. Jordan, and J.F. McDonald. 1996. Naturally occurring variation in copia expression is due to both element (cis) and host (trans) regulatory variation. Proc Natl AcadSci USA 93: 7097-102.

158. Matzke, M.A. and J.A. Birchler. 2005. RNAi-mediated pathways in the nucleus. Nat Rev Genet 6: 24-35.

159. Maxwell, P.H., J.M. Belote, and R.W. Levis. 2006. Identification of multiple transcriptioninitiation, polyadenylation, and splice sites in the Drosophila melanogaster TART family of telomeric retrotransposons. Nucleic Acids Res 34: 5498-507.

160. McCollum, A.M., E.W. Ganko, P.A. Barrass, J.M. Rodriguez, and J.F. McDonald. 2002. Evidence for the adaptive significance of an LTR retrotransposon sequence in a Drosophila heterochromatic gene. BMC Evol Biol 2: 5.

161. McKee, B.D. 2004. Homologous pairing and chromosome dynamics in meiosis and mitosis. Biochim Biophys Acta 1677: 165-80.

162. Medstrand, P., L.N. van de Lagemaat, C.A. Dunn, J.R. Landry, D. Svenback, and D.L. Mager. 2005. Impact of transposable elements on the evolution of mammalian gene regulation. Cytogenet Genome Res 110: 342-52.

163. Mefford, H.C. and B.J. Trask. 2002. The complex structure and dynamic evolution of human subtelomeres. Nat Rev Genet 3: 91-102.

164. Megosh, H.B., D.N. Cox, C. Campbell, and H. Lin. 2006. The role of PIWI and the miRNA machinery in Drosophila germline determination. Curr Biol 16: 1884-94.

165. Meister, G., M. Landthaler, A. Patkaniowska, Y. Dorsett, G. Teng, and T. Tuschl. 2004. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Mol Cell 15: 18597.

166. Melnikova, L., H. Biessmann, and P. Georgiev. 2005. The Ku protein complex is involved in length regulation of Drosophila telomeres. Genetics 170: 221-35.

167. Mikhailovsky, S., T. Belenkaya, and P. Georgiev. 1999. Broken chromosomal ends can be elongated by conversion in Drosophila melanogaster. Chromosoma 108: 114-20.

168. Miki, Y., I. Nishisho, A. Horii, Y. Miyoshi, J. Utsunomiya, K.W. Kinzler, B. Vogelstein, and Y. Nakamura. 1992. Disruption of the APC gene by a retrotransposal insertion of LI sequence in a colon cancer. Cancer Res 52: 643-5.

169. Minchiotti, G. and P.P. Di Nocera. 1991. Convergent transcription initiates from oppositelyoriented promoters within the 5' end regions of Drosophila melanogaster F elements. Mol Cell Biol 11: 5171-80.

170. Miyoshi, К., H. Tsukumo, T. Nagami, H. Siomi, and M.C. Siomi. 2005. Slicer function of

171. Drosophila Argonautes and its involvement in RISC formation. Genes Dev 19: 2837-48.

172. Mochizuki, K. and M.A. Gorovsky. 2005. A Dicer-like protein in Tetrahymena has distinct functions in genome rearrangement, chromosome segregation, and meiotic prophase. Genes Dev 19: 77-89.

173. Montchamp-Moreau, C., S. Ronsseray, M. Jacques, M. Lehmann, and D. Anxolabehere. 1993. Distribution and conservation of sequences homologous to the 1731 retrotransposon in Drosophila. Mol Biol Evol 10: 791-803.

174. Morse, В., P.G. Rotherg, V.J. South, J.M. Spandorfer, and S.M. Astrin. 1988. Insertional mutagenesis of the myc locus by a LINE-1 sequence in a human breast carcinoma. Nature 333: 87-90.

175. Mourelatos, Z., J. Dostie, S. Paushkin, A. Sharma, B. Charroux, L. Abel, J. Rappsilber, M.

176. Mann, and G. Dreyfuss. 2002. miRNPs: a novel class of ribonucleoproteins containing numerous microRNAs. Genes Dev 16: 720-8.

177. Noma, К., Т. Sugiyama, Н. Cam, A. Verdel, М. Zofall, S. Jia, D. Moazed, and S.I. Grewal.2004. RITS acts in cis to promote RNA interference-mediated transcriptional and post-transcriptional silencing. Nat Genet 36: 1174-80.

178. Nurminsky, D.I., Y. Shevelyov, S.V. Nuzhdin, and V.A. Gvozdev. 1994. Structure, molecular evolution and maintenance of copy number of extended repeated structures in the X-heterochromatin of Drosophila melanogaster. Chromosoma 103: 277-85.

179. Nuzhdin, S.V. and T.F. Mackay. 1995. The genomic rate of transposable element movement in Drosophila melanogaster. Mol Biol Evol 12: 180-1.

180. O'Connor, M.S., A. Safari, D. Liu, J. Qin, and Z. Songyang. 2004. The human Rapl protein complex and modulation of telomere length. J Biol Chem 279: 28585-91.

181. Oikemus, S.R., N. McGinnis, J. Queiroz-Machado, H. Tukachinsky, S. Takada, C.E. Sunkel, and M.H. Brodsky. 2004. Drosophila atm/telomere fusion is required for telomeric localization of HP 1 and telomere position effect. Genes Dev 18: 1850-61.

182. Okamura, K., S. Balla, R. Martin, N. Liu, and E.C. Lai. 2008. Two distinct mechanisms generate endogenous siRNAs from bidirectional transcription in Drosophila melanogaster. Nat Struct Mol Biol 15: 581-90.

183. Oliver, В., N. Perrimon, and A.P. Mahowald. 1987. The ovo locus is required for sex-specific germ line maintenance in Drosophila. Genes Dev 1: 913-23.

184. Onodera, Y., J.R. Haag, T. Ream, P.C. Nunes, O. Pontes, and C.S. Pikaard. 2005. Plant nuclear RNA polymerase IV mediates siRNA and DNA methylation-dependent heterochromatin formation. Cell 120: 613-22.

185. Osato, N., H. Yamada, K. Satoh, H. Ooka, M. Yamamoto, K. Suzuki, J. Kawai, P. Caminci, Y. Ohtomo, K. Murakami, K. Matsubara, S. Kikuchi, and Y. Hayashizaki. 2003. Antisense transcripts with rice full-length cDNAs. Genome Biol 5: R5.

186. Palm, W. and T. de Lange. 2008. How shelterin protects mammalian telomeres. Annu Rev Genet 42: 301-34.

187. Pane, A., K. Wehr, and T. Schupbach. 2007. zucchini and squash encode two putative nucleases required for rasiRNA production in the Drosophila germline. Dev Cell 12: 851-62.

188. Pardue, M.L., O.N. Danilevskaya, K. Lowenliaupt, J. Wong, and K. Erby. 1996. The gag coding region of the Drosophila telomeric retrotransposon, HeT-A, has an internal frame shift and a length polymorphic region. J Mol Evol 43: 572-83.

189. Pardue, M.L. and P.G. DeBaryshe. 2003. Retrotransposons provide an evolutionarily robust non-telomerase mechanism to maintain telomeres. Annu Rev Genet 37: 485-511.

190. Parker, J.S., S.M. Roe, and D. Barford. 2004. Crystal structure of a PIWI protein suggests mechanisms for siRNA recognition and slicer activity. Embo J23: 4727-37.

191. Pasyukova, E., S. Nuzhdin, W. Li, and A.J. Flavell. 1997. Germ line transposition of the copia retrotransposon in Drosophila melanogaster is restricted to males by tissue-specific control of copia RNA levels. Mol Gen Genet 255: 115-24.

192. Pasyukova, E.G. and S.V. Nuzhdin. 1993. Doc and copia instability in an isogenic Drosophila melanogaster stock. Mol Gen Genet 240: 302-6.

193. Pelisson, A., S.U. Song, N. Prud'homme, P.A. Smith, A. Bucheton, and V.G. Corces. 1994.

194. Gypsy transposition correlates with the production of a retroviral envelope-like protein under the tissue-specific control of the Drosophila flamenco gene. EmboJ13: 4401-11.

195. Pimpinelli, S., M. Berloco, L. Fanti, P. Dimitri, S. Bonaccorsi, E. Marchetti, R. Caizzi, C.

196. Caggese, and M. Gatti. 1995. Transposable elements are stable structural components of Drosophila melanogaster heterochromatin. Proc Natl Acad Sci USA 92: 3804-8.

197. Ponting, C.P. 1997. Tudor domains in proteins that interact with RNA. Trends Biochem Sci 22: 51-2.

198. Priimagi, A.F., L.J. Mizrokhi, and Y.Y. Ilyin. 1988. The Drosophila mobile element jockeybelongs to LINEs and contains coding sequences homologous to some retroviral proteins. Gene 70: 253-62.

199. Prud'homme, N., M. Gans, M. Masson, C. Terzian, and A. Bucheton. 1995. Flamenco, a gene controlling the gypsy retrovirus of Drosophila melanogaster. Genetics 139: 697-711.

200. Rabl, C. lS85.Morphol. Jahrb. 10: 214-330.

201. Rand, T.A., S. Petersen, F. Du, and X. Wang. 2005. Argonaute2 cleaves the anti-guide strand of siRNA during RISC activation. Cell 123: 621-9.

202. Rashkova, S., A. Athanasiadis, and M.L. Pardue. 2003. Intracellular targeting of Gag proteins of the Drosophila telomeric retrotransposons. J Virol 77: 6376-84.

203. Rashkova, S., S.E. Karam, R. Kellum, and M.L. Pardue. 2002. Gag proteins of the two

204. Drosophila telomeric retrotransposons are targeted to chromosome ends. J Cell Biol 159: 397-402.

205. Ringrose, L. and R. Paro. 2004. Epigenetic regulation of cellular memory by the Polycomb and Trithorax group proteins. Annu Rev Genet 38: 413-43.

206. Robert, V., N. Prud'homme, A. Kim, A. Bucheton, and A. Pelisson. 2001. Characterization of the flamenco region of the Drosophila melanogaster genome. Genetics 158: 701-13.

207. Romanish, M.T., W.M. Lock, L.N. van de Lagemaat, C.A. Dunn, and D.L. Mager. 2007.

208. Repeated recruitment of LTR retrotransposons as promoters by the anti-apoptotic locus NAIP during mammalian evolution. PLoS Genet 3: elO.

209. Romero, D.P. and E.H. Blackburn. 1991. A conserved secondary structure for telomerase RNA. Cell 67: 343-53.

210. Sadaie, M., T. Naito, and F. Ishikawa. 2003. Stable inheritance of telomere chromatin structure and function in the absence of telomeric repeats. Genes Dev 17: 2271-82.

211. Saito, K., A. Ishizuka, H. Siomi, and M.C. Siomi. 2005. Processing of pre-microRNAs by the Dicer-1-Loquacious complex in Drosophila cells. PLoS Biol 3: e235.

212. Saito, К., K.M. Nishida, T. Mori, Y. Kawamura, K. Miyoshi, T. Nagami, H. Siomi, and M.C. Siomi. 2006. Specific association of Piwi with rasiRNAs derived from retrotransposon and heterochromatic regions in the Drosophila genome. Genes Dev 20: 2214-22.

213. Sambrook, J. and D.W. Russell. 2001. Molecular cloning. A laboratory manual. In. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

214. Sarot, E., G. Payen-Groschene, A. Bucheton, and A. Pelisson. 2004. Evidence for a piwi-dependent RNA silencing of the gypsy endogenous retrovirus by the Drosophila melanogaster flamenco gene. Genetics 166: 1313-21.

215. Savitsky, M., O. Kravchuk, L. Melnikova, and P. Georgiev. 2002. Heterochromatin protein 1 is involved in control of telomere elongation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol 22: 3204-18.

216. Savitsky, M., D. Kwon, P. Georgiev, A. Kalmykova, and V. Gvozdev. 2006. Telomere elongation is under the control of the RNAi-based mechanism in the Drosophila germline. Genes Dev 20: 345-54.

217. Saxena, R., L.G. Brown, T. Hawkins, R.K. Alagappan, H. Skaletsky, M.P. Reeve, R. Reijo, S.

218. Rozen, M.B. Dinulos, C.M. Disteche, and D.C. Page. 1996. The DAZ gene cluster on the human Y chromosome arose from an autosomal gene that was transposed, repeatedly amplified and pruned. Nat Genet 14: 292-9.

219. Scadden, A.D. 2005. The RJSC subunit Tudor-SN binds to hyper-edited double-stranded RNA and promotes its cleavage. Nat Struct Mol Biol 12: 489-96.

220. Scherthan, H., S. Weich, H. Schwegler, C. Heyting, M. Harle, and T. Cremer. 1996. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of chromosome pairing. J Cell Biol 134: 1109-25.

221. Schotta. G., A. Ebert, V. Krauss, A. Fischer. J. Hoffmann, S. Rea, T. Jenuwein, R. Dorn, and G. Reuter. 2002. Central role of Drosophila SU(VAR)3-9 in histone H3-K9 methylation and heterochromatic gene silencing. Embo J 21: 1121-31.

222. Shevelyov, Y.Y. 1992. Copies of a Stellate gene variant are located in the X heterochromatin of Drosophila melanogaster and are probably expressed. Genetics 132: 1033-7.

223. Shi, H., A. Djikeng, C. Tschudi, and E. Ullu. 2004. Argonaute protein in the early divergent eukaryote Trypanosoma brucei: control of small interfering RNA accumulation and retroposon transcript abundance. Mol Cell Biol 24: 420-7.

224. Shinagawa, T. and S. Ishii. 2003. Generation of Ski-knockdown mice by expressing a long double-strand RNA from an RNA polymerase II promoter. Genes Dev 17: 1340-5.

225. Shpiz, S., D. Kwon, Y. Rozovsky, and A. Kalmykova. 2009. rasiRNA pathway controlsantisense expression of Drosophila telomeric retrotransposons in the nucleus. Nucleic Acids Res 37: 268-78.

226. Sijen, T. and R.H. Plasterk. 2003. Transposon silencing in the Caenorhabditis elegans germ line by natural RNAi. Nature 426: 310-4.

227. Silva, E., S. Tiong, M. Pedersen, E. Homola, A. Royou, B. Fasulo, G. Siriaco, and S.D.

228. Campbell. 2004. ATM is required for telomere maintenance and chromosome stability during Drosophila development. Curr Biol 14: 1341-7.

229. Singer, M.F. 1982. SINEs and LINEs: highly repeated short and long interspersed sequences in mammalian genomes. Cell 28: 433-4.

230. Siriaco, G.M., G. Cenci, A. Haoudi, L.E. Champion, C. Zhou, M. Gatti, and J.M. Mason. 2002. Telomere elongation (Tel), a new mutation in Drosophila melanogaster that produces long telomeres. Genetics 160: 235-45.

231. Smith, S., I. Giriat, A. Schmitt, and T. de Lange. 1998. Tankyrase, a poly(ADP-ribose) polymerase at human telomeres. Science 282: 1484-7.

232. Song, J.J., S.K. Smith, G.J. Hannon, and L. Joshua-Tor. 2004a. Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305: 1434-7.

233. Song, K., D. Jung, Y. Jung, S.G. Lee, and I. Lee. 2000. Interaction of human Ku70 with TRF2. FEBSLett 481: 81-5.

234. Song, S.U., T. Gerasimova, M. Kurkulos, J.D. Boeke, and Y.G. Corces. 1994. An env-like protein encoded by a Drosophila retroelement: evidence that gypsy is an infectious retrovirus. Genes Dev 8: 2046-57.

235. Song, S.U., M. Kurkulos, J.D. Boeke, and V.G. Corces. 1997. Infection of the germ line by retroviral particles produced in the follicle cells: a possible mechanism for the mobilization of the gypsy retroelement of Drosophila. Development 124: 2789-98.

236. Song, Y.H., G. Mirey, M. Betson, D.A. Haber, and J. Settleman. 2004b. The Drosophila ATM ortholog, dATM, mediates the response to ionizing radiation and to spontaneous DNA damage during development. Curr Biol 14: 1354-9.

237. Speek, M. 2001. Antisense promoter of human LI retrotransposon drives transcription of adjacent cellular genes. Mol Cell Biol 21: 1973-85.

238. Stapleton, W., S. Das, and B.D. McKee. 2001. A role of the Drosophila homeless gene in repression of Stellate in male meiosis. Chromosoma 110: 228-40.

239. Styhler, S., A. Nakamura, A. Swan, B. Suter, and P. Lasko. 1998. vasa is required for GURKEN accumulation in the oocyte, and is involved in oocyte differentiation and germline cyst development. Development 125: 1569-78.

240. Sugiyama, Т., H. Cam, A. Verdel, D. Moazed, and S.I. Grewal. 2005. RNA-dependent RNApolymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci USA 102: 152-7.

241. Sugiyama, Т., H.P. Cam, R. Sugiyama, K. Noma, M. Zofall, R. Kobayashi, and S.I. Grewal. 2007. SHREC, an effector complex for heterochromatic transcriptional silencing. Cell 128: 491-504.

242. Svoboda, P., P. Stein, M. Anger, E. Bernstein, G.J. Hannon, and R.M. Schultz. 2004. RNAi and expression of retrotransposons MuERV-L and IAP in preimplantation mouse embryos. Dev Bio! 269: 276-85.

243. Tabara, H., M. Sarkissian, W.G. Kelly, J. Fleenor, A. Grishok, L. Timmons, A. Fire, and C.C. Mello. 1999. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell 99: 123-32.

244. Tabara, H., E. Yigit, H. Siomi, and C.C. Mello. 2002. The dsRNA binding protein RDE-4interacts with RDE-1, DCR-1, and a DExH-box helicase to direct RNAi in C. elegans. Cell 109: 861-71.

245. Taddei, A., F. Hediger, F.R. Neumann, and S.M. Gasser. 2004. The function of nuclear architecture: a genetic approach. Annu Rev Genet 38: 305-45.

246. Tchurikov, N.A. and O.V. Kretova. 2007. Suffix-specific RNAi leads to silencing of F element in Drosophila melanogaster. PLoS ONE 2: e476.

247. Thummel, C.S., A.M. Boulet, and H.D. Lipshitz. 1988. Vectors for Drosophila P-element-mediated transformation and tissue culture transfection. Gene 74: 445-56.

248. Tijstennan, M., R.F. Ketting, K.L. Okihara, T. Sijen, and R.H. Plasterk. 2002. RNA helicase MUT-14-dependent gene silencing triggered in C. elegans by short antisense RNAs. Science 295: 694-7.

249. Ting, C.N., M.P. Rosenberg, C.M. Snow, L.C. Samuelson, and M.H. Meisler. 1992. Endogenous retroviral sequences are required for tissue-specific expression of a human salivary amylase gene. Genes Dev 6: 1457-65.

250. Tomari, Y., T. Du, B. Haley, D.S. Schwarz, R. Bennett, H.A. Cook, B.S. Koppetsch, W.E. Theurkauf, and P.D. Zamore. 2004. RISC assembly defects in the Drosophila RNAi mutant armitage. Cell 116: 831-41.

251. Torok, Т., С. Benitez, S. Takacs, and H. Biessmann. 2006. The protein encoded by the gene proliferation disrupter (prod) is associated with the telomeric retrotransposon array in Drosophila melanogaster. Chromosoma.

252. Usakin, L.A., G.L. Kogan, A.I. Kalmykova, and V.A. Gvozdev. 2005. An alien promoter capture as a primary step of the evolution of testes-expressed repeats in the Drosophila melanogaster genome. Mol Biol Evol 22: 1555-60.

253. Vagin, V.V., A. Sigova, C. Li, H. Seitz, V. Gvozdev, and P.D. Zamore. 2006. A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science 313: 320-4.

254. Vaury, C., A. Bucheton, and A. Pelisson. 1989. The beta heterochromatic sequences flanking the I elements are themselves defective transposable elements. Chromosoma 98: 215-24.

255. Villasante, A., J.P. Abad, R. Planello, M. Mcndez-Lago. S.E. Celniker, and B. de Pablos. 2007. Drosophila telomeric retrotransposons derived from an ancestral element that was recruited to replace telomerase. Genome Res 17: 1909-18.

256. Yolpe, T.A., C. Kidner, I.M. Hall, G. Teng, S.I. Grewal, and R.A. Martienssen. 2002. Regulation of heterochromatic silencing and histone 113 lysine-9 methylation by RNAi. Science 297: 1833-7.

257. Wallrath, L.L. and S.C. Elgin. 1995. Position effect variegation in Drosophila is associated with an altered chromatin structure. Genes Dev 9: 1263-77.

258. Walter, M.F. and H. Biessmann. 2004. Expression of the telomeric retrotransposon HeT-A in

259. Drosophila melanogaster is correlated with cell proliferation. Dev Genes Evol 214: 211-9.

260. Walter, M.F., C. Jang, B. Kasravi, J. Donath, B.M. Mechler, J.M. Mason, and H. Biessmann.1995. DNA organization and polymorphism of a wild-type Drosophila telomere region. Chromosoma 104: 229-41.

261. Wienholds, E. and R.H. Plasterk. 2005. MicroRNA function in animal development. FEBS Lett 579: 5911-22.

262. Wilhelm, J.E. and C.A. Smibert. 2005. Mechanisms of translational regulation in Drosophila. Biol Cell 97: 235-52.

263. Wu-Scharf, D., B. Jeong, C. Zhang, and H. Cerutti. 2000. Transgene and transposon silencing in Chlamydomonas reinhardtii by a DEAH-box RNA helicase. Science 290: 1159-62.

264. Xiong, Y. and Т.Н. Eickbush. 1990. Origin and evolution of retroelements based upon their reverse transcriptase sequences. Embo J 9: 3353-62.i

265. Yan, X. J.F. Mouillet, Q. Ou, and Y. Sadovsky. 2003. A novel domain within the DEAD-box protein DP 103 is essential for transcriptional repression and helicase activity. Mol Cell Biol 23:414-23.

266. Yi, R., Y. Qin, l.G. Macara, and B.R. Cullen. 2003. Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes Dev 17: 3011-6.

267. Zappulla, D.C. and T.R. Ccch. 2004. Yeast telomerase RNA: a flexible scaffold for protein submits. Proc Natl Acad Sci USA 101: 10024-9.

268. Zhang, H., F.A. Kolb, L. Jaskiewicz, E. Westhof, and W. Filipowicz. 2004. Single processing center models for human Dicer and bacterial RNase III. Cell 118: 57-68.

269. Ziarczyk, P. and M. Best-Belpomme. 1991. A short 5' region of the long terminal repeat isrequired for regulation by hormone and heat shock of Drosophila retrotransposon 1731. Nucleic Acids Res 19: 5689-93.

270. Ziarczyk, P., F. Fourcade-Peronnet, S. Simonart, C. Maisonhaute, and M. Best-Belpomme. 1989. Functional analysis of the long terminal repeats of Drosophila 1731 retrotransposon: promoter function and steroid regulation. Nucleic Acids Res 17: 8631-44.

271. Кленов, M.C. and B.A. Гвоздев. 2005. Формирование гетерохроматина: роль коротких РНК и метилирования ДНК. Биохимия 70: 1187-1198.

272. Оловников, A.M. 1971. Принцип маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. Доклады АН СССР 201: 1496-1499.

273. Филатов, Д.А., С.В. Нуждин, and Е.Г. Пасюкова. 1998. Преимущественная транскрипция ретротранспозона copia в семенниках Drosophila melanogaster. Молекулярная биология 32: 976-980.

274. Щербакова, Д.М., М.Е. Зверева, О.В. Шпанченко, and О.А. Донцова. 2006. Теломераза: строение и свойства фермента, особенности теломеразы дрожжей. Биохимия 40: 580-584.1. Благодарности

Информация о работе

Калмыкова, Алла Ивановна
доктора биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.26

Диссертация

Эволюция и механизмы регуляции экспрессии повторяющихся генов в геноме Drosophila - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы