Малые интерферирующие РНК Drosophila virilis и их роль в экспрессии мобильных элементов

Рожков, Николай Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Малые интерферирующие РНК Drosophila virilis и их роль в экспрессии мобильных элементов
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Малые интерферирующие РНК Drosophila virilis и их роль в экспрессии мобильных элементов"

На правах рукописи

РОЖКОВ НИКОЛАЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

МАЛЫЕ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ РНК ОЛОЗОРНИА ¥Ш1Ш И ИХ РОЛЬ В ЭКСПРЕССИИ МОБИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степеии кандидата биологических наук

- 9 ДЕК 2010

Москва-2010

004616225

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных механизмов биологической адаптации Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Научный руководитель:

д. б. н., проф. М. Б. Евгеньев

Официальные оппоненты:

д. б. н., проф. Н. А. Чуриков д. б. и. А. И. Калмыкова

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН

заседании диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991 г. Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991 г. Москва, ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан «_!__» _ _2010 г.

Учёный секретарь диссертационного со] кандидат химических наук

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Геномы всех изученных организмов содержат в своём составе мобильные генетические элементы (МЭ). Долгое время эту «мусорную» часть генома недооценивали и отводили ей пассивную роль в процессе эволюции. Однако, в настоящее время достоверно известно, что мобильные элементы являются неотъемлемой составляющей геномов и одной из движущих сил микроэволюции. С одной стороны, встраиваясь в промоторную или кодирующую части генов, они могут изменять их экспрессию или вызывать различные мутации; с другой стороны, такие транспозоны как НеТ-А и ТАКТ играют ключевую роль в поддержании длины теломерных участков хромосом у видов ОгохорИНа.

Актуальность изучения МЭ не вызывает сомнения. Стоит упомянуть хотя бы открытие /'-элемента, с помощью которого стал возможен трансгенез О. те1апо%а$1ег, получение разнообразных мутаций и открытие функций множества генов у этого вида. Исследование функций мобильных элементов и механизмов их контроля стало новой вехой в развитии молекулярной биологии и генетики на рубеже 20 и 21 веков. Особенно это стало актуальным в связи с открытием явления РНК-интерференции (РНКи), которое представляет собой совокупность высококонсервативных механизмов борьбы организма с экзогенными (вирусные инфекции) и эндогенными (мобильные элементы) нуклеиновыми кислотами. РНКи впервые открыта у СаепогИаЬсИИ.ч однако уже скоро была доказана

широкая распространённость данного явления среди множества эукариотических организмов, а её аналоги были найдены у прокариот и архей.

Особый интерес вызывает исследование механизмов, предотвращающих негативные последствия транспозиций МЭ в геноме терминальных клеток и, таким образом, способствующих нормальной передаче наследственной информации следующему поколению.

Следует подчеркнуть, что кроме РНК-интерференции в ходе эволюции виды выработали и другие, весьма эффективные механизмы, предотвращающие инвазии и перемещения МЭ в геномах. Поэтому большое значение для понимания механизмов, нейтрализующих вредное действие МЭ, имеет изучение случаев, при которых МЭ выходят из-под контроля и «распрыгиваются» по геному хозяина. К таким случаям относятся описанные у О. melanogaster и О. хчг'йк системы гибридного дисгенеза (ГД), когда при скрещивании линий, отличающихся по

содержанию того или иного МЭ, данный элемент претерпевает массовые транспозиции в потомстве, что приводит к стерильности и другим нарушениям.

В целом, стоит отметить, что исследования общих генетико-молекулярных механизмов, обеспечивающих транспозиции различных МЭ, имеют большое значение для понимания роли МЭ в формировании структуры и контроле функционирования эукариотического генома.

Цели и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было исследование малых интерферирующих РНК в геноме D. virilis и изучение их роли в экспрессии мобильных элементов. Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать основные классы и характеристики малых интерферирующих РНК, гомологичных известным мобильным генетическим элементам в геноме D. virilis;

2. Изучить РНКи ответ вида D. melanogaster на введение МЭ Penelope, выделенного из генома D. virilis;

3. Оценить вклад различных типов малых РНК, гомологичных МЭ Penelope, в явление гибридного дисгенеза (ГД), наблюдаемое в потомстве межлинейных гибридов!), virilis;

4. Изучить локализацию и провести детальное исследование геномных локусов - источников Piwi-interacting РНК (piPHK) в геноме различных линий D. virilis;

5. Установить стадию, на которой начинается гибель клеток зародышевого пути у эмбрионов от дисгенного скрещивания, а также исследовать время начала транскрипции МЭ Penelope.

В качестве основного метода изучения РНКи-интермедиатов было использовано высокоточное секвенирование коротких фрагментов РНК ("deep sequencing") и их последующий биоинформатический анализ с помощью геномных баз данных. Материалом исследования были выбраны эмбрионы различных стадий развития линий и межлинейных гибридов D. virilis, а также терминальные и соматические ткани взрослых особей.

В работе использованы разнообразные молекулярно-генетические методы, такие как in situ гибридизация на политенных хромосомах, ПЦР-анализ, иммунопреципитация белковых комплексов и другие.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе выполнения работы впервые использовали метод высокоточного секвенирования для изучения всего спектра коротких РНК в различных тканях D. virilis. Подробно изучен РНКи-сайленсинг с помощью коротких РНК МЭ Penelope в терминальных тканях линий D. virilis из различных географических регионов.

Получены принципиально новые данные о молекулярных механизмах, задействованных в синдроме гибридного дисгенеза у D. virilis. Исследованы малые интерферирующие РНК, образующиеся в геноме D. melanogaster в ответ на введение МЭ Penelope, выделенного из D. virilis. Таким образом, впервые исследовали популяции малых РНК, гомологичных МЭ Penelope в геномах двух различных отдалённых видов Drosophila. D. virilis является естественным хозяином данного элемента, тогда как в геном D. melanogaster МЭ Penelope был введён искусственным путём.

В качестве модельных объектов в работе были использованы виды D. virilis и D. melanogaster, время дивергенции которых составляет около 50-60 млн. лет. Таким образом, сравнение основных характеристик малых интерферирующих РНК у обоих видов важно для понимания общей структуры организации и эволюции РНКи-зависимого сайленсинга мобильных генегических элементов у всею рода Drosophila. Разработанная модель позволяет детально исследовать молекулярные механизмы, включающиеся в геноме эукариотического организма при инвазии нового для данного вида МЭ или вируса.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы, а основные результаты были представлены на ежегодных аспирантских конференциях ИМБ РАН, международной Кейстоновской конференции «Биология РНК-сайленсинга» (Канада, 2009), конференции молодых учёных (Пущино, 2010) и международной конференции «Некодирующий геном» (Германия, 2010).

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на__

страницах машинописного текста, иллюстрирована _ таблицами, _

рисунками и включает в себя такие разделы как введение, литературный обзор, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы.

Результаты исследования и их обсуждение

Типы малых интерферирующих РНК в терминальных и соматических

тканях D. virilis

С помощью высокоточного секвенирования мы получили 36 библиотек малых РНК из яичников, семенников и соматических тканей D. virilis. Продукты деградации значительной части клеточных РНК были удалены из каждой библиотеки, а оставшиеся малые РНК разделили на три класса. Все известные микроРНК (21-22 н) были аннотированы на основе базы miRBase. Оставшуюся фракцию малых РНК классифицировали как piPHK (на основе их размера, 23-29 нуклеотидов) и потенциальные small interfering РНК (siPHK) (рис. 1А). Неаннотированные микроРНК могут попасть в последнюю группу, однако они вряд ли гомологичны последовательностям мобильных генетических элементов и поэтому не могут влиять на результаты нашего анализа.

Следует заметить, что в нашем исследовании было использовано несколько линий D. virilis, при этом нас более всего интересовали линии 9 и 160, так как именно скрещивания между самками линии 9 и самцами линии 160 приводят к проявлению синдрома гибридного дисгенеза (ГД) у их потомков. Данный феномен характеризуется стерильностью потомства, появлением мутаций и другими нарушениями. Так, приблизительно 40% и 60% гибридов от таких скрещиваний проявляют одно- или двустороннюю редукцию семенников и яичников, соответсвенно (Lozovskaya et al., 1990). При реципрокном же скрещивании этих линий наблюдаются схожие нарушения, но с гораздо меньшей частотой, как минимум в 10 раз. Все линии, использованные в работе, относились к трём «цитотипам» по аналогии с Р-М дисгеиезом D. melanogaster. Так линия 160, дающая при скрещивании с самками линии 9 высокий уровень стерильного потомства, относилась нами к Р-типу, соответственно линия 9 - к М-типу, а две другие линии D. virilis, использованные в работе, при скрещивании с участием которых ни в какой комбинации ГД не наблюдался, мы относили к нейтральным или N-линиям.

К настоящему времени геном D. virilis полностью секвенирован и аннотирован, поэтому для анализа мы выбрали набор достаточно хорошо охарактеризованных транспозонов. Большинство из них были изначально изолированы из мутаций, обнаруженных среди потомков от дисгенного скрещивания между линиями 9 и 160 D. virilis. К этим МЭ относятся: Ulysses, Penelope, Paris, Helena, Telemac и Tvl

(Scheinker et al., 1990; Petrov et al., 1995; Evgen'ev et al., 1997). Другие же элементы - Gypsy, НеТ-А и TART - были аннотированы и выбраны нами на основе их высокой гомологии с аналогичными элементами в геноме D. melanogaster (Mizrokhi and Mazo, 1991 ; Casacuberta and Pardue, 2005).

На протяжении последних 15 лет в нашей лаборатории наблюдали асимметричную транспозицию мобильных элементов Ulysses и Penelope в геномах линий 9 и 160. Так, методом in situ гибридизации на политенных хромосомах было показано, что в геноме линии 160 за это время не произошло ни одного события перемещения ретротранспозоиа Ulysses, но, в то же время, количество копий МЭ Penelope в этой линии увеличилось с 37 до 53. Отметим, что только транспозон Penelope присутствует в линии 160 и отсутствует в линии 9, тогда как большинство других элементов присутствуют в геномах обеих линий (Petrov et al., 1995; Evgen'ev et al., 1997).

В процессе исследования были выявлены межлинейные различия по набору транспозон-гомологичных малых интерферирующих РНК. Например, гораздо больше Penelope-гомологич пых малых РНК было секвенировано в линии 160, чем в линии 9 (рис. 1Б, В). Данные результаты согласуются с наличием большого числа полноразмерных активных копий МЭ Penelope в геноме линии 160, тогда как геном линии 9 содержит только дивергированные, гетерохроматиновые и, очевидно, не активные копии этого транспозона (Lyozin et al., 2001). Более того, Ре«е/оре-гомологичные малые РНК преобладали в семенниках, а не в яичниках. Были обнаружены и менее существенные отличия, а именно: ГЛЛГ-гомологичные малые РНК больше представлены в яичниках 160 линии, а ретроэлемента Ulysses -в семенниках линии 9 (рис. 1Б, В).

Далее, для каждого мобильного элемента в изучаемых тканях все секвенированные последовательности мы подразделяли на si- и на piPHK, в зависимости от их размера (рис. 1Г). Видно, что большинство изучаемых транспозонов являются мишенями как для siPHK, так и для piPHK путей. Важно отметить, что практически для всех транспозонов, особенно для МЭ Ulysses, piPHK путь является преобладающим механизмом сайленсинга. Интересно, что биогенез транспозона Penelope, играющего важную роль в ГД, в линии 160 является уникальным и приводит к образованию преимущественно 21-нуклеотидных siPHK (рис. 1 Г, 2А).

■ р»РНК ИЗ siPHK

19 20 21 22 ' 23 24 25 26 27 28 29 длина малых РНК, {и}

Кол-ао ееквевировамвых малых РНК, (тыс. на млн.) 5 siPHK {21 н) piPHK (23-29 н)

4 3 2 1 0 0 10 20 30 40

Penelopes Paris i

шлиния 9 «вяиния 160

в.

во .

S 50

го 40-

6 30

f- го

X 10

а.

X 0

га

л В.

X лп

ffi

ей о 35

о.

5* 30

$ 25

Ф 20

о 15

£ 10

о 5

Кол-во малых РНК в яичниках

ливия 9 3®яиния160

..л"*

Кол-во малы* РНК в семенниках

й линия 9 ВЯИНИЯ1вО

^ G4»'

,54 7W

^vv

Рис. 1. Малые РНК Л. у;У/7м, секвенированные из гонад линий 9 и 160. (А) Типы малых РНК, секвенированные да яичников линии 160; относительное количество малых РНК, гомологичных различным транспозонам, в яичниках (Б) и семенниках (В) линий 9 и 160; (Г) относительное количество з1РНК (21 н) и р1РНК (23-29 н) фракций в яичниках линий 9 и 160.

РНКи-зависимый сайленсинг МЭ Penelope в геноме D. melanoguster

МЭ Penelope активен и, по-видимому, находится в процессе инвазии генома D. virilis (Evgenev et al, 2000). Исследования, проведённые с использованием различных линий D. virilis, показали наличие двух классов коротких РНК, гомологичных траиспозону Penelope. Однако, в линии 160, в которой МЭ Penelope транспозиционно активен, siPHK класс является преобладающим (рис. 2А). Интересно было изучить ответ организма на уровне малых РНК, при искусственном введении полноразмерного МЭ Penelope в геном другого неродственного вида Drosophila. Выбранный нами для этих исследований геном D. melanogaster не содержит каких-либо следов инвазий транспозона Penelope и является «чистым» по отношению к этому элементу (Kapitonov and Jurka, 2003). Таким образом, у нас возникла уникальная возможность проследить поведение

МЭ, экспериментально введённого в геном D. melanogaster, который прежде никогда не подвергался инвазии данным элементом.

В нашей лаборатории путём Р-элемент зависимой трансформации были получены несколько трансгенных линий D. melanogaster с полноразмерными копиями транспозона Penelope, а также линии с открытой рамкой считывания МЭ Penelope под промотором гена теплового шока D. melanogaster (Pyatkov et al., 2002). Интересно, что транспозиции этого элемента происходят во всех трансгенных линиях, куда была инъецирована полноразмерная копия МЭ Penelope. Наиболее хорошо изучены в этом отношении линии А1 и А2. В настоящее время известно, что линия А1 имеет 4-5, а линия А2 - 10-12 активных копий МЭ Penelope. В библиотеках малых РНК, полученных из обеих линий, мы детектировали только 21-нуклеотидные siPHK, гомологичные МЭ Penelope, причём как в яичниках, так и в семенниках (рис. 2А; табл. 1). Более того, среди иммунопреципитированых комплексов малых интерферирующих РНК с ключевыми белкам si- и piPHK путей - Ago2, Piwi, Aub и Ago3 - мы обнаружили Репе1оре-гоыоттчнък малые интерферирующие РНК с длиной 21 нуклеотид только в составе Ag02-HMMyii0K0Mri;ieKca. Ранее, в исследованиях на D. melanogaster было показано связывание транснозон-слецифичных siPHK с белком Ago2 (Czech et al, 2008; Ghildiyal et al., 2008; Kawamura et al., 2008), однако же, эти транспозоны одновременно узнавались и piPHK путём.

Таблица 1. Размер и количество Репс1оре-гомологичных коротких РНК в различных трансгенных линиях А melanogaster. Исходная линия у\у№2ад служит в качестве контроля.

длина малых РНК, [н] |

Название библиотеки 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Всего

yW67cffl« j^gHHuio, 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

67(23(2) ~ yw _яичники 2 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 4

А2_семенники 374 904 6529 765 149 61 23 13 3 1 0 8822

№_ятнит 56 137 IBS! 278, 47 111 30 111 9 glf 111 2476

Piwi IP, А2_яичники 0 0 0 1 3 0 1 4 1 0 0 10

AUB IP, А2_яичники 0 0 2 1 1 1 0 0 0 0 0 5

AG03 IP, А2_яичники 0 1 13 8 1 2 0 1 0 0 0 26

AG02 IP, А2_яичниш Bill 1209 Ml ¡¡¡¡¡I 111 llll «111 lii- ffffl! Si 1330

А1_семенниш 269 704 4690 597 56 15 3 4 0 0 0 6338

А1_яимники 37 97 1238 147 27 39 37 35 11 1 0 1669

hs-Pene/ope_ceueHHHKn 15 8 8 6 13 7 6 3 6 3 1 76

hs-Репе/ореяичники 5 0 9 0 0 4 0 0 1 7 0 26

А.

240021001800-

,-ч800 1600 £ тлп

линия А2

линия 160

линия 140

1ДД1дШ

1Я 20 21 22 2Л 34 25 2G 27 2Я 23 1820 21 22 23 2« 25 26 »2^29 19202122233422211272829 19 20 21 22 23 24 25 2Я 27 а

дпина малых РНК, («]

1.1.1,«

Аргентина

-...

'2400 ■2100 •1800 ■1500 ■1200 900 ■600 ■300

жшзф' ' ' ' ' /' , ^ ' ' s&llWsf

р . 6.00 . ipoo, 1500. 2000. 2500. 3900. позиция в транспозоне, {п.«.]

Рис. 2. Малые РНК, гомологичные МЭ Penelope. (А) Размеры Реие/оре-специфичиых малых РНК в различных линиях D. virilis и трансгенных линиях D. melanogasler; (Б, В) распределение Penelope-siPHK (21 н) по последовательности транспозона в яичниках трансгенных линий А1 и А2 D. melanogasler, соответственно; (Г) Penelope-siPHK (21 н) в яичниках линии 160. Структура МЭ Penelope с "псевдо-ДКП" изображена внизу рисунка.

Мобильные генетические элементы могут являться мишеныо одновременно для si- и piPHK путей и на данный момент не ясно, почему отдельный элемент в определённой ситуации узнаётся каким-то одним из этих механизмов. Перестроенные копии МЭ Penelope с длинными концевыми инвертированными повторами были найдены в геномах обеих линий А1 и А2 и потенциально такие копии могут служить источником образования двуцепочечной РНК (дцРНК). Это

вполне вероятно, исходя из того, что значительная часть siPIIK, секвенированных в трансгенных линиях в D. melanogaster, соответсвует инвертированным повторам, содержащимся в таких перестроенных копиях МЭ Penelope (рис. 2Б, В). Подтверждением служит тот факт, что в трансгенных линиях D. melanogaster с открытой рамкой считывания под промотором белка теплового шока мы не обнаружили Реие/оре-специфичных малых РНК даже после сильной индукции транскрипции этой конструкции тепловым шоком (табл. 1). С другой стороны, у D. virilis Penelope-s\?ÏÏK распределены более или менее одинаково по всей длине транспозона (рис. 2Г). Таким образом, механизмы, участвующие в узнавании транспозона и его последующем «нарезании» на siPHK фрагменты, могут различаться у D. melanogaster и D. virilis.

В целом, наблюдаемые нами события в геномах D. melanogaster и линии 160 D. virilis имеют общую черту, а именно то, что в обоих случаях инвазия нового элемента провоцирует его процессинг преимущественно в siPHK. Это, в свою очередь, может свидетельствовать о древней роли siPHK пути, как первичного барьера в защите генома от вредного действия экзогенных паразитов - вирусов и мобильных генетических элементов. По-видимому, этот путь не полностью ингибирует перемещения МЭ Penelope и поэтому, как в трансгенных линиях D. melanogaster, так и в Р-линии 160 D. virilis этот элемент по-прежнему претерпевает транспозиции.

Пластичность организации piPHK пути в геноме D. virilis

РНКи-зависимый сайленсинг повторяющихся последовательностей генома с помощью piPHK (размер варьирует от 23 до 30 нуклеотидов) был открыт последним среди прочих и получил своё название в связи с ассоциацией этого класса малых РНК с белками семейства Piwi - Piwi, Aub и Ago3, которые экспрессируются преимущественно в терминальных клетках животных (Aravin et al., 2006; Girard et al, 2006; Vagin et al., 2006). В последнее время был достигнут значительный прогресс в понимании механизма, лежащего в основе piPHK биогенеза. Так, секвенирование и последующий анализ piPHK, связанных с белками Piwi в терминальных тканях Drosophila и лабораторной мыши, привели к открытию модели биогенеза piPHK, известной как пинг-понг цикл (Brennecke et al., 2007; Gunawardane et al., 2007; Aravin et al., 2008).

Среди множества секвенированных транспозон-гомологичных малых интерферирующих РНК из яичников D. virilis siPHK имели смысловую и

антисмысловую ориентацию примерно в равной степени (рис. 2Г, МЭ Penelope для примера), что ранее было продемонстировано в соматических и терминальных тканях D. melanogaster (Vagin et al., 2006; Chung et al., 2008; Czech et al., 2008; Ghildiyal et al., 2008). Однако piPHK, гомологичные МЭ D. virilis, имели преимущественно антисмысловую ориентацию (рис. ЗА). Единственным заметным исключением является транспозон Ulysses, для которого, например, в линии 9 около 99% всех piPHK происходило из смысловой цепи.

Обычно piPHK классифицируют на первичные или вторичные в зависимости от механизма их биогенеза. Первичные антисмысловые piPHK, как правило, имеют на своём 5'-конце уридин (Brennecke et al., 2007; Aravin et al., 2008). Интересно, что /7(у^е5-гомологичные piPHK смысловой ориентации имели ту же характеристику (рис. ЗБ) и распределены практически по всей последовательности транспозона, что свидетельствует о полноразмерности транспозона-источника

этих piPHK (рис. ЗВ).

А. В.

Рис. 3. Сравнительные характеристики транспозон-гомологичных piPHK в линиях 9 и 160. (А) относительное количество и ориентация транспозон-специфичных piPHK; (Б) первичные и вторичные piPHK; (В) распределение Ulysses-piPHK по последовательности транспозона в яичниках линий 9 и 160; (Г) количество геномных картирований Ulysses-piPHK в линиях 9 и 160.

Интересно, что линия 160, помимо многочисленных piPHK смысловой ориентации, гомологичных Ulysses, имеет популяцию антисмысловых piPHK,

* ni,,,. r-ГГ.......— . , . -----т

g. 123456769 10111213141516171819202122232426262726 в кол-во картирований в геноме

позиция в транопозоне, [п.н,]

гомологичных этому элементу (рис. ЗВ). Однако, в этом случае, piPHK распределены преимущественно в пределах длинных концевых повторов (ДКП) Ulysses, и являются вторичными piPHK, имеющими в позиции 10 аденин. Значительная часть Wmes-piPHK картируется в геноме линий 9 и 160 множество раз (17-20), что соответствует известному числу копий ретроэлемента в геноме этих линий, установленному методом in situ гибридизации (рис. ЗГ).

Такое необычное поведение МЭ Ulysses побудило нас более подробно охарактеризовать другие элементы. Например, TART и Tvl имеют преимущественно антисмысловые piPHK. В этом и во всех других случаях вторичные piPHK имеют смысловую ориентацию (рис. ЗБ). Таким образом, большинство МЭ в геноме D. virilis используют принципиально схожий piPHK путь, как и у D. melanogaster, где транскрипты дивергированных мобильных элементов из piPHK локусов служат источником первичных антисмысловых piPHK внутри пинг-понг цикла (Brennecke et al, 2007).

Существует несколько объяснений таким поразительным различиям между МЭ Ulysses и другими элементами. Отметим, что имеется явное сходство между piPHK паттерном Ulysses и принципиальной схемой piPHK пути в половых клетках семенников мыши, где именно полноразмерные копии мобильных элементов каким-то образом узнаются и используются для образования первичных piPHK смысловой ориентации. Однако, вторичные piPHK антисмысловой ориентации в этой системе происходят из транскрибирующихся геномных piPHK кластеров. Аналогичным образом, полноразмерные, разбросанные по геному копии ретроэлемента Ulysses, могут быть источником первичных piPHK, что делает этот элемент отличным от других изучаемых транспозонов у D. virilis. В линии 160 большее количество антисмысловых piPHK, по сравнению с линией 9, может быть следствием инсерции длинного концевого повтора данного элемента в piPHK кластеры, являясь, таким образом, источником для пинг-понг цикла уже в обратной ориентации. Возможна и другая гипотеза, согласно которой несколько инсерций МЭ Ulysses определённой ориентации в сильноэкспрессирующиеся одноцепочечные piPHK кластеры, могут служить источником образования смысловых первичных piPHK. В то же время антисмысловые транскрипты, которые используются только для пинг-понг цикла и биогенеза вторичных piPHK, могут происходить из копий в составе других piPHK кластеров или фрагментов в геноме, чья антисмысловая транскрипция может находиться под контролем внешних промоторов.

Материнское наследование транспозои-специфичных малых РНК и их возможное значение в проявлении синдрома гибридного дисгенеза у D. virilis

Защита клеток зародышевого пути от губительного влияния мобильных элементов и вирусов является необходимым условием для передачи полноденной копии генома этих клеток следующему поколению. Известно, что такую защитную функцию выполняют piPHK, образующиеся из геномных кластеров (Brennecke et al., 2007; Aravin et al., 2007). Последние содержат в себе информацию о предшествующих инвазиях мобильных элементов в виде дивергированных, часто неполных, копий этих элементов, локализованных обычно в гетерохроматине.

МЭ Penelope участвует в индукции гибридного дисгенеза при скрещивании линий, отличающихся по содержанию этого элемента (Petrov et al., 1995; Evgen'ev et al., 1997). Более того, в результате дисгенного скрещивания происходит не только увеличение экспрессии МЭ Penelope, но, возможно, и дерепрессия других МЭ. В последних исследованиях синдрома гибридного дисгенеза на моделях D. melcmogaster (Р-М и 1-R системы) была показана важная роль материнских piPHK в сайленсинге мобильных элементов, отвечающих за дисгенез (Brennecke et al., 2008).

Сходные результаты были получены и на модели ГД у D. virilis, где также было показано важное значение унаследованных от матери коротких РНК в супрессии транспозиций МЭ Penelope в потомстве от скрещивания линий 9 и 160 (Blumenstiel and Hartl, 2005). Однако, эти исследования на D. virilis были сделаны с помощью Нозерн-блот анализа малых интерферирующих РНК, который не позволял точно определить размер малых РНК и отнести их к тому или иному классу. Исходя из этого, мы решили провести более детальное изучение роли малых РНК в контроле синдрома ГД у D. virilis, используя высокоточное секвеиирование.

С целью определения спектра и количества малых РНК, приходящих от материнского организма (материнское наследование), собирали ранние 0-2 часовые эмбрионы, в которых ещё не началась зиготическая транскрипция, и, таким образом, популяция малых РНК должна соответствовать таковой в материнских ооцитах. siPHK и piPHK, соответствующие различным МЭ, были унаследованы потомками от линии 160 (рис. 4А). Однако, в случае МЭ Penelope малые РНК в ранних эмбрионах от скрещивания с участием самок линии 160 были представлены только piPHK классом, и в них практически не было выявлено

siPHK. Последнее свидетельствует о соматическом происхождении Penelope-siPHK, а сравнение пула малых РНК, секвенированных в соме или «каркасах» (тело мухи после удаления яичников или семенников) и яичниках (соматические и терминальные ткани) целиком поддерживает эту гипотезу (рис. 4Б).

При /- и Р-зависимом дисгенезе у D. melanogaster гибель эмбрионов или их развитие в стерильные потомки происходит в том случае, если количество пришедших от матери элемент-специфических piPHK значительно меньше, по сравнению с нормальными эмбрионами от реципрокных скрещиваний (Brennecke et al., 2008).

В первую очередь, оценивали количество piPHK в родительских линиях (рис. 4В /, ii). В целом, яичники Р-линии 160, а также нейтральных линий 140 и Аргентина имеют схожий уровень Penelope-piPHK. То же самое можно сказать и о семенниках линии 160 и Аргентина. Во всех скрещиваниях с участием самок линий 160, 140 и Аргентина, наблюдалось гораздо большее наследование Pene/ope-piPHK гибридными эмбрионами, чем в скрещиваниях с участием самок линии 9 (рис. 4В ///). Однако, несмотря на отсутствие материнских Penelope-piPHK в гибридных эмбрионах от скрещивания самок линии 9 с самцами линий 160, 140 и Аргентина, только эмбрионы от скрещивания самок линии 9 и самцов линии 160 развиваются во взрослые особи с дисгенным фенотипом. Яичники взрослых потомков от скрещивания самцов линии 9 с самками линий 160, 140 и Аргентина имели относительно большее количество Pene/ope-piPHK, чем яичники потомков от реципрокного скрещивания (рис. 4В iv). Важно отметить, что транскрипция МЭ Penelope индуцируется в яичниках самок or дисгенного скрещивания, а также в линиях D. melanogaster, трансформированных этим элементом (Evgen'ev et al., 1997; Pyatkov et al., 2002), однако такой индукции не было отмечено в потомках от скрещивания нейтральных линий с линией 9 (данные не приводятся). Хотя мы и наблюдали значительные колебания в количесве Penelope-piPHK в семенниках гибридов от скрещивания линии 140 с линией 9, по сравнению с семенниками гибридов от скрещивания линии 9 с линиями 160 и Аргентина (рис. 4В v), но эти различия также не сопровождались какими-либо изменениями в проявлении фенотипических признаков, характерными для ГД.

Б.

I 80

; х

Г [О -эк

, о

: о _п I я 30

х а о ю

° а 20 га п

р. о- 10

ж л

5. с

// **/У/*/

РвпеЬрв

НеМ

т„1

4 6 8 10 фракция транспоэон-специфичных малых РНК в яичниках, [%]

В.

Кол-во секвенированных Ре/)е/оре-р|РНК (23-29 н), (тыс. на млн.)

2.5 2 1.5 1 0.5

Потомки первого поколения

х 1?Ш0 од х <5140

х с^гд

эмбрионы

ьс X

о. 6-п.

¿5.

140>

? з-0-2-о ¥ 1В о

£3

¿12

0= 8

^ 4 0.

о 2

семенники

Рис. 4. Материнское наследование и уровни Репе/о/;е-гомологичных ргРНК в различных линиях О. virilis и их гибридах. (А) Материнское наследование транспозон-гомологичных коротких РНК в линии 160; (Б) относительное количество (%) малых интерферирующих РНК, гомологичных различным транспозонам в соматических тканях (каркасы) и терминальных тканях (яичники) линии 160; (В) количество материнских РепеЬре-р1РНК, унаследованных гибридными эмбрионами, и их количество в гонадах гибридов первого поколения от скрещивании линии 9 с линиями 160, 140 и Аргентина: уровни Репе1оре-р\РНК в яичниках («) и семенниках (и) изучаемых линий 160, 140 и Аргентина; (да) количество материнских РепеЬре-р|РНК, унаследованных гибридными эмбрионами от скрещивании линии 9 с линиями 160, 140 и Аргентина; количество Репе1оре-р\РИК в яичниках (/у) и семенниках (V) гибридов первого поколения от скрещиваний линии 9 с линиями 160, 140 и Аргентина.

Таким образом, с одной стороны, результаты наших исследований по изучению наследования материнских piPHK в D. virilis согласуются с ранее опубликованными результатами, полученными при описании ГД D. melanogaster (Brennecke et al., 2008). Наши данные также согласуются с гипотезой, постулирующей что материнские Penelope-piPHK в скрещиваниях между линиями 9 и 160 D. virilis обеспечивают своевременный и эффективный «иммунитет» в потомках от реципрокного скрещивания, запуская пинг-понг цикл для нейтрализации МЭ Penelope. С другой стороны, использование в нашем исследовании нейтральных линий показало сложность и неоднозначность феномена ГД у D. virilis, который требует дальнейшего изучения. Геномы нейтральных линий содержат полноразмерные копии МЭ Penelope и гомологичные этому элементу piPHK, которые матерински наследуются при скрещиваниях с самцами линии 9. Однако, при скрещивании самцов нейтральных линий с самками линии 9, хотя ранние гибридные эмбрионы и не содержат популяцию Penelope-piPHK, ГД не развивается и потомство таких скрещиваний полностью фертильно.

Функциональная активность piPHK кластеров как источников piPHK в различных линиях D. virilis

Поскольку мы показали, что нейтральные линии (140 и Аргентина) практически не отличаются от Р-линии 160 по наличию копий МЭ Penelope, нами были предприняты исследования piPHK кластеров во всех изучаемых линиях.

piPHK кластеры являются эволюционной летописью инвазий транспозонов, поэтому содержание этих протяжённых участков генома может меняться в пределах вида достаточно быстро. Так piPHK кластеры даже близкородственных линий одного и того же вида могут различаться вследствие инсерций новых МЭ в эти локусы (Brennecke et al., 2008). Однако, наличие и локализация большинства piPHK кластеров в геноме данного вида характеризуются своим постоянством. Например, локус flamenco, расположенный на X хромосоме, и кластер 42АВ на хромосоме 2 найдены не только у всех изученных к настоящему времени линий D. melanogaster, но и функционально консервативны на протяжении примерно 12 млн. лет дивергентной эволюции и присутствуют в геномах видов той же группы, а именно, Drosophilayakuba и Drosophila erecta (Malone et al., 2009).

Несмотря на общую консервативность локуса flamenco, данный piPHK кластер может быть представлен у D. melanogaster пермиссивным или рестриктивным

аллелями (Prud'homme et al., 1995; Brennecke et al., 2007; Mevel-Ninio et al., 2007; Malone et al., 2009). Ещё до понимания роли flamenco, именно как piPHK кластера, на протяжении многих лет оставалось загадкой, как эти аллели могут контролировать сразу несколько неродственных элементов - gypsy, Zam и Idefix (Prud'homme et al., 1995; Mevel-Ninio et al., 2007). Интересно, что y D, virilis в результате дисгенных скрещиваний также наблюдается мобилизация сразу нескольких неродственных МЭ. То есть, возможно, что именно межлинейные различия по кластерам и соответсвующим им piPHK могут индуцировать стерильный фенотип и другие ненормальности при дисгенном скрещивании.

Таблица 2. Характеристика 20 наиболее активных р1РНК локусов, обнаруженных в геноме О. ъчгШх (линии 9, 160, 140 и Аргентина).

№ / / координаты длина. Kfi Kon-so уникальных piPHK ! ЛИНИИ 180 ил-во уникальных piPHK 8 линии 8 кол-во уникальных piPHK я линии 140 Kon-ва уникальных piPHK в линии Аргентина КОЛ-ВО 1стекииапь ных piPHK г линии 160 ориентации потенциальных piPHK в линии 160 (-/♦)>

щ >stí¡!»d_t»2tíSM48í51 í: :V j;4«¡>«:v f ' 4.

2 ¡ S íÍKlftM :ШЙ: 1581054-1526888 ; ; ......... :: 35427 ¿0 ■ Щ ;' ;й; J-"

3 4 >BCaf!btd_12723: S84749-1045698 61 29696 13429 6486 S829 30285 «Ой

4 3 «м»АМ0322:42170345232? 31 28200 33 13230 15 28265 64/36

S 3 >saffoíd_13C49:2452S546-24741236 218 26384 19220 36380 20459 74(09 89)41

6 - >sca1to1d_12100'3319-269238 268 21558 9571 12687 7785 48903 61»»

7 s »SCaltotè J3324: 1490374-1800556 311 14464 7780 8128 4911 37908 63)37

í - ta№MJ27SS: 2528-283391 281 14070 6682 3277 3571 13235 42®3

8 - «eftH.12337; 138029-258729 151 10911 3913 2010 1859 14485 60/40

I 10 5 >sal»W_1 2823:174998-185392 21 9938 3884 6777 80 9936 31169

11 X >sca«Ai_12932:6764S3-707267 31 9804 3204 2157 1788 9835 100®

12 2 >scaWdJ2954:311677-681831 271 8841 2116 2473 835 39109 29/71

13 3 »acaflowj 3049:24340945-24411205 71 7761 4833 3312 2162 11270 01103

M 5 >«alü>MJ332<: 5543M30851 378 4785 1707 2728 991 14290 54/43

15 >sra»M_12958:586817-737593 171 4554 3277 2474 3339 18348 2/98

16 г >sra«MJ2954 805943-776W3 Ш 4467 997 1210 581 14000 mi

IT >sa1M<J.12734:387862-503389 116 4307 4310 2507 4069 10291 em

18 г >KaltatdJ2«S5:8711211-9806955 96 4014 1158 748 1159 418! Oil 00

19 3 »Кз1№_13049:25145г71«5268е49 123 3778 1815 2511 1753 23352 38)62

го s >»«lfcW_13324:1265331-1441221 175 3159 2705 3439 3325 12231 30/70

_____ кластеры, активные только в линии 160

околоцектромерная локализация кластеров на хромосомах

Ш прителомерная локализация кластеров на хромосомах

Мы идентифицировали основные piPHK кластеры в геноме D. virilis с помощью ~20% уникальных, картирующихся в геноме один раз piPHK. Среди всех обнаруженных кластеров подробнее остановились на 20, которые охватывали большее количество piPHK и, как следствие, возможно, оказывали влияние на фенотип потомков (табл. 2). Найденные кластеры мы классифицировали как одноцепочечные (подобно flamenco), производящие piPHK из одной геномной

цепи; и кластеры, продуцирующие piPHK с обеих цепей, так называемые двуцепочечные кластеры. Подобно локусу flamenco у D. melanogaster, все выявленные одноцепочечные кластеры у D. virilis были картированы в прицентромерных гетерохроматиновых районах хромосом. Для этого была использована база данных Flybase, а в некоторых случаях точную локализацию кластеров на хромосомах подтверждали методом in situ гибридизации. Было также показано, что гомологичные им малые интерферирующие РНК практически не передаются по материнской линии, что говорит об их преимущественной экспрессии в соматических тканях яичников.

С другой стороны, выявленные двуцепочечные кластеры активны в терминальных клетках, а специфичные им piPHK детектируются в ранних эмбрионах (данные не приводятся). Под активностью кластеров понимается их способность процессировать piPHK. С помощью методов in situ гибридизации на политенных хромосомах и ПЦР-анализа с кластер-специфическими праймерами, подтверждено наличие этих локусов в геномах всех изучаемых линий D. virilis (данные не показаны), однако, как оказалось, некоторые кластеры проявляют свою активность преимущественно в Р-линии 160, но не в М-линин 9 и нейтральных линиях (табл. 2). Любопытно, что эти кластеры были локализованы в прителомерных участках хромосом, а в состав этих кластеров, помимо МЭ, входят белок-кодирующие последовательности, продуцирующие множество piPHK. К сожалению, из-за отсутствия мутаций piPHK пути в D. virilis, было невозможно изучить эффект этих piPHK на экспрессию находящихся в кластерах генов.

Таким образом, наши наблюдения свидетельствуют о межлинейных различиях в активности нескольких piPHK кластеров. Несмотря на присутствие их последовательностей в геноме всех изученных линий D. virilis, несколько весьма активных теломерных кластеров активно продуцируют piPHK в линии 160, но не в линиях 9, 140 и Аргентина. В первую очередь, это может быть связано с изменениями состояния и/или количества гетерохроматина теломер, вследствие их различной длины или эпигенетических модификаций таких участков (Schoeftner and Blasco, 2009). Впрочем, прителомерные участки хромосом могут также активироваться в линии 160 по причине накопления неизвестых мутаций, которые каким-то образом активизируют эти геномные регионы и превращают их в piPHK кластеры. Системные мутации такого типа описаны у D. melanogaster и у некоторых других организмов (Klattenhoff et al., 2009).

Морфологические и молекулярные проявления ГД в онтогенезе D. virilis

Атрофия гоиад и стерильность потомков обоего пола от дисгениых скрещиваний является одним из основных проявлений ГД (Picard, 1976; Kidwell et al, 1977). Большинство исследований такого рода было проделано на хорошо изученных моделях ГД D. melanogaster, тогда как нарушения гонадогенеза, наблюдаемые в гибридах от дисгениых скрещиваний на разных стадиях развития D. virilis изучены недостаточно.

Использование специфических для полярных клеток антител Vasa показало, что уже на 11-12 стадии, что соответствует 7-13 часам эмбриогенеза D. virilis, в дисгениых эмбрионах (30-50% в зависимости от эксперимента) число зародышевых клеток значительно меньше, чем в норме (рис. 5 а, б). Пройдя через стенку зачатка средней кишки, полярные клетки в эмбрионах от дисгенного скрещивания на пути к месту формирования первичных гонад претерпевают деструктивные изменения и разрушаются. Важно отметить, что количественно все полярные клетки покидают карман зачатка средней кишки и располагаются дорзально между ним и мезодермальным слоем. Гибель же клеток происходит при их продвижении, и это может послужить ориентиром для дальнейшего изучения механизмов, лежащих в основе этого процесса. В первичной гонаде происходит ассоциация с соматическими мезодермалышми клетками лишь некоторых, достигших ее, зародышевых клеток, дающих впоследствии начало немногим стволовым клеткам гонад, морфология которых впоследствии оказывается нарушенной (у личинок, куколок и взрослых особей). У взрослых дисгениых гибридов в 40-50% случаев наблюдали атрофию одной или обеих гонад (рис. 5 в, г). По своей морфологии наблюдаемые нарушения яичников (гонадная атрофия) весьма сходны с нарушениями, наблюдаемыми у D. melanogaster в системе Р-М дисгенеза (Lozovskaya et al., 1990).

Интересно было установить, имеется ли временная корреляция между наблюдаемыми нарушениями формирования гонад у эмбрионов дисгениых гибридов и временем начала экспрессии мРНК МЭ Penelope, который, по-видимому, играет важную роль в индукции ГД.

Рис. 5. Формирование первичных гонад в нормальных эмбрионах линии 9 (а) и дисгенных эмбрионах (б) D. virilis, приводящее к развитию нормальных (в) и редуцированных (г) яичников (стрелкой показан недоразвитый яичник).

С помощью метода обратной транскрипции и последующего ПЦР анализа мы детектировали транскрипты МЭ Penelope в 0-2 часовых эмбрионах линии 160 и эмбрионах, полученных от скрещивания самок линии 160 и самцов линии 9 |(реципрокное скрещивание), тогда как соответствующие транскрипты отсутствовали на этой стадии в дисгенных гибридах (рис. 6).

Рис. 6. Транскрипционный анализ МЭ Penelope в 0-2 и 2-S часовых эмбрионах в линии 9 (1), линии 160 (2), дисгенных (3) и реципрокных (4) эмбрионах. М - ДНК „;аркер.

С другой стороны, мы обнаружили транскрипцию МЭ Penelope как в дисгенных, гак и в реципрокных 2-5 часовых эмбрионах. Следует отметить, что 02 часовые эмбрионы у дрозофилы характеризуются полным отсутствием транскрипции, а её начало соответствует более поздним стадиям. В этой связи можно предположить, что транскрипция МЭ Penelope начинается одновременно с

ЗООН-Н; W

началом общей транскрипции генома в 2-5 часовых эмбрионах, а детектируемые нами транскрипты на более ранней стадии (0-2 часовые эмбрионы) являются материнскими.

Так как мы обнаруживали транскрипты МЭ Penelope лишь несколько раньше начала гибели зародышевых клеток, причём соответствующие piPHK в дисгенных гибридах отсутствуют, мы не исключаем, что именно активность этого элемента и приводит к наблюдаемой гибели зародышевых клеток. Мы также не исключаем вклада экспрессии других МЭ, активизирующихся в результате дисгенных скрещиваний, в развитие синдрома гибридного дисгенеза, транскрипция которых не изучалась в настоящем исследовании.

Таким образом, хотя полученные данные и являются ещё одним подтверждением роли МЭ Penelope в развитии синдрома ГД у D. virilis, не исключено, что в контроле этого явления важны как факторы хозяйского генома, так, по-видимому, и другие МЭ, активизирующиеся в результате дисгенных скрещиваний.

Выводы

1. Исследованы основные типы и характеристики малых интерферирующих РНК, гомологичных всему спектру мобильных генетических элементов генома D. virilis. Большинство транспозонов в геноме D. virilis являются мишенью одновременно для si- и piPHK путей в терминальных тканях.

2. Показано, что при искусственном введении МЭ Penelope в геном D. melanogaster, данный элемент процессируется только в 21-нуклеотидные siPHK, которые связаны с белком Ago2 - ключевым белком siPHK пути. Выявлена их преимущественная локализация в пределах инвертированных концевых повторов МЭ Penelope, которые могут образовывать двуцепочечные РНК-интермедиаты («шпильки») и являться мишеныо siPHK пути.

3. Хотя ретротранспозон Ulysses и находится под контролем piPHK пути, но биогенез piPHK, гомологичных этому элементу, идет по обратному пинг-понг циклу, где смысловые транскрипты МЭ Ulysses являются источником первичных piPHK.

4. Среди обнаруженных классов Реие/оре-гомологичных коротких РНК, только piPHK передаются в потомстве и таким образом являются «материнским фактором», играющим важную роль в супрессии данного МЭ.

5. В геноме D. virilis описаны и локализованы piPHK локусы, проявляющие дифференциальную активность в разных линиях, а также впервые найдены множественные piPHK, гомологичные белок-кодирующим последовательностям.

6. Транскрипция МЭ Penelope начинается одновременно с началом общей транскрипции генома, спустя 2-5 часа с момента оплодотворения яйца, и предшествует гибели клеток зародышевого пути у эмбрионов от дисгенного скрещивания, что согласуется с важной ролью этого МЭ в дисгенезе.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Н. В. Рожков. А. А. Аравин, Р. Сачиданандам, Г. Дж. Хэнон, О. Н. Соколова, Е. С. Зеленцова, Н. Г. Шостак, М. Б. Евгеньев. Система РНК-интерференции отдалённых видов Дрозофилы по-разному реагирует на присутствие одного и того же мобильного элемента. Докл. Акад. Наук. 2010, т. 431, №3, с. 411-413.

2. N. У. Rozhkov, A. A. Aravin, Е. S. Zelentsova, N. G. Schostak, R. Sachidanandam, W. R. McCombie, G. J. Hannon, M. B. Evgene'ev. Small RNA-based silencing strategies for transposons in the process of invading Drosophila species. RNA, 2010, v. 16 (8), p. 1634-45.

3. M. И. Соколова, E. С. Зеленцова, H. В. Рожков. M. Б. Евгеньев. Морфологические и молекулярные проявления гибридного дисгенеза в онтогенезе Drosophila virilis. Онтогенез, 2010, т. 41, № 6, с. 461-464.

Список тезисов:

1. N. Rozhkov. A. Aravin, Е. Zelentsova, R. Sachidanandam, E. Rozhkova, N. Shostak, G. Hannon, M. Evgen'ev. What happens when Penelope comes. Abstracts of the Keystone Symposia "The Biology of RNA Silencing". Victoria, Canada, 2009. p. 100.

2. H. В. Рожков. А. А. Аравин, E. С. Зеленцова, P. Сачинарадам, H. Г. Шостак, Г. Хэннон, М.Б. Евгеньев. Роль малых интерферирующих РНК в адаптации видов Drosophila к инвазиям мобильных генетических элементов. 14-я международная школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино, 2010. Сборник тезисов, т. 2. с. 174.

3. N. У. Rozhkov. A. A. Aravin, E. S. Zelentsova, N. G. Schostak, R. Sachidanandam, W. R. McCombie, G. J. Hannon, M. B. Evgene'ev. Small RNA-based silencing strategies for transposons in the process of invading Drosophila species. Abstracts of Symposia "The Non-coding genome". Heidelberg, Germany, 2010. p. 256.

Для заметок

Подписано в печать 26 октября 2010 г.

Формат 60x90/16

Объём 1,5 п.л.

Тираж 100 экз.

Заказ № 261010325

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт»

ИНН/КПП 7728572912\772801001

Адрес: г. Москва, улица Ивана Бабушкина, д. 19/1.

Тел. 740-76-47, 989-15-83.

http://www.univerprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рожков, Николай Васильевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Мобильные генетические элементы: открытие, классификация и значение.

1. 1. 1. ДНК-транспозоны.

1. 1.2. Ретротранспозоны.

1. 1.3. Роль МЭ в эволюция геномов.

1. 2. Системы гибридного дисгенеза.

1.2. 1. Р-Мдисгенез.

1. 2. 2. /-Я-дисгенез.

1. 2. 3. Яобо-дисгенез.

1. 2. 4. Модель гибридного дисгенеза у £). утШ.

1.3. Регуляция экспрессии мобильных генетических элементов.

1. 4. РНК-интерференция.

1.4. 1. микроРНК.

1.4.2. з1РНК.

1.4.2. 1. Эндо^РНК.*.

1. 4. 3. р1РНК - самые длинные среди коротких.

1. 4. 3. 1. Биогенез р1РНК у И. те1апо£а$1ег.

1. 4. 3. 2. р1РНК в соматических клетках вне гонад.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2. 1. Линии мух и условия их содержания.

2. 2. Выделение геномной ДНК.

2. 3. Саузерн-блот гибридизация.

2. 4. ПЦР с геномной ДНК.

2. 5 .In situ гибридизация с ДНК-пробами на политенных хромосомах.

2. 6. In situ гибридизация с антителами Vasa.

2. 7. Выделение тотальной РНК.

2.8. Клонирование малых интерферирующих РНК.

2. 9. Биоинформатический анализ последовательностей малых РНК.

2. 10. Полуколичественный ОТ-ПЦР.

2. 11. Иммунопреципитация малых РНК-белковых комплексов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Анализ транспозиционной активности МЭ Penelope и Ulysses с помощью in situ гибридизации на политенных хромосомах.

3. 2. Типы малых интерферирующих РНК в терминальных и соматических тканях D. virilis.

3. 6. Функциональная активность piPHK кластеров как источников piPHK в различных линиях D. virilis.

3. 7. Морфологические и молекулярные проявления ГД в онтогенезе D. virilis.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Малые интерферирующие РНК Drosophila virilis и их роль в экспрессии мобильных элементов"

Геномы всех изученных организмов содержат в своём составе' мобильные генетические элементы (МЭ). Долгое время эту «мусорную» часть генома недооценивали и отводили ей пассивную роль в процессе эволюции. Однако, в настоящее время достоверно известно, что мобильные элементы являются неотъемлемой составляющей геномов и одной из движущих сил микроэволюции. С одной стороны, встраиваясь в промоторную или кодирующую части генов, они могут изменять их экспрессию или вызывать различные мутации; с другой стороны, такие транспозоны как НеТ-А и ТАЯТ играют ключевую роль в поддержании длины теломерных участков хромосом у видов ВгозорЪИа.

Актуальность изучения МЭ не вызывает сомнения. Стоит упомянуть хотя бы открытие /'-элемента, с помощью которого стал возможен трансгенез И. melanogaster, получение разнообразных мутаций и открытие функций множества генов у этого вида. Исследование функций мобильных элементов и механизмов их контроля стало новой вехой в развитии молекулярной биологии и генетики на рубеже 20 и 21 веков. Особенно это стало актуальным в связи с открытием явления РНК-интерференции (РНКи), которое представляет собой совокупность высококонсервативных механизмов борьбы организма с экзогенными (вирусные инфекции) и эндогенными (мобильные элементы) нуклеиновыми кислотами. РНКи была впервые открыта у СаепогкаЬс1Ш.ь' е^апБ, однако уже скоро была доказана широкая распространённость данного явления среди множества эукариотических организмов, а её аналоги были найдены у прокариот и архей.

Следует подчеркнуть, что кроме РНК интерференции в ходе эволюции виды выработали и другие весьма эффективные механизмы, предотвращающие инвазии и перемещения МЭ в геномах. Поэтому большое значение для понимания механизмов, нейтрализующих вредное действие МЭ, имеет изучение случаев, при которых МЭ выходят из-под контроля и «распрыгиваются» по геному хозяина. К таким случаям относятся описанные у И. те1апо%а$1ег и В. утИх системы (ГД), когда при скрещивании линий, отличающихся по содержанию того или иного МЭ, данный элемент претерпевает массовые транспозиции в потомстве, что приводит к стерильности и другим нарушениям.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Рожков, Николай Васильевич

ВЫВОДЫ:

1. Исследованы основные типы и характеристики малых интерферирующих РНК, гомологичных всему спектру мобильных генетических элементов генома D. virilis. Большинство транспозонов в геноме D. virilis являются мишенью одновременно для si-и piPHK путей в терминальных тканях.

2. Показано, что при искусственном введении МЭ Penelope в геном D. melanogasîer, данный элемент процессируется только в 21-нуклеотидные siPHK, которые связаны с белком Ago2 - ключевым белком siPHK пути. Выявлена их преимущественная локализация в пределах инвертированных концевых повторов МЭ Penelope, которые могут образовывать двуцепочечные РНК-интермедиаты («шпильки») и являться мишенью siPHK пути.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рожков, Николай Васильевич, Москва

1. Aravin, A. A., Hannon, G. J., and Brennecke, J. (2007a). The Piwi-piRNA pathway provides an adaptive defense in the transposon arms race. Science 318, 761-764.

2. Aravin, A. A., Naumova, N. M., Tulin, A. V., Vagin, V. V., Rozovsky, Y. M., and Gvozdev, V. A. (2001). Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr Biol 11, 1017-1027.

3. Aravin, A. A., Sachidanandam, R., Bourc'his, D., Schaefer, C., Pezic, D., Toth, K. F., Bestor, T., and Hannon, G. J. (2008). A piRNA pathway primed by individual transposons is linked to de novo DNA methylation in mice. Mol Cell 31, 785-799.

4. Aravin, A. A., Sachidanandam, R., Girard, A., Fejes-Toth, K., and Hannon, G. J. (2007b). Developmentally regulated piRNA clusters implicate MILI in transposon control. Science 316, 744-747.

5. Arkhipova, I. R., Pyatkov, K. I., Meselson, M., and Evgen'ev, M. B. (2003). Retroelements containing introns in diverse invertebrate taxa. Nat Genet 33, 123-124.

6. Baek, D., Villen, J., Shin, C., Camargo, F. D., Gygi, S. P., and Bartel, D. P. (2008). The impact of microRNAs on protein output. Nature 455, 64-71.

7. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., and Hannon, G. J. (2001). Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409, 363-366.

8. Bestor, T. H. (2003). Cytosine methylation mediates sexual conflict. Trends Genet 19, 185190.

9. Biemont, C., and Vieira, C. (2005). What transposable elements tell us about genome organization and evolution: the case of Drosophila. Cytogenet Genome Res 110, 25-34.

10. Bingham, P. M., Kidwell, M. G., and Rubin, G. M. (1982). The molecular basis of P-M hybrid dysgenesis: the role of the P element, a P-strain-specific transposon family. Cell 29, 995-1004.

11. Blackman, R. K., Grimaila, R., Koehler, M. M., and Gelbart, W. M. (1987). Mobilization of hobo elements residing within the decapentaplegic gene complex: suggestion of a new hybrid dysgenesis system in Drosophila melanogaster. Cell 49, 497-505.

12. Blumenstiel, J. P., and Hartl, D. L. (2005). Evidence for maternally transmitted small interfering RNA in the repression of transposition in Drosophila virilis. Proc Natl Acad Sci USA 102, 15965-15970.

13. Bohnsack, M. T., Czaplinski, K., and Gorlich, D. (2004). Exportin 5 is a RanGTP-dependent dsRNA-binding protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs. RNA 10, 185-191.

14. Boussy, I. A., and Daniels, S. B. (1991). hobo transposable elements in Drosophila melanogaster and D. simulans. Genet Res 58, 27-34.

15. Boussy, I. A., and Itoh, M. (2004). Wanderings of hobo: a transposon in Drosophila melanogaster and its close relatives. Genetica 120, 125-136.

16. Bregliano, J. C., Picard, G., Bucheton, A., Pelisson, A., Lavige, J. M., and L'Heritier, P. (1980). Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. Science 207, 606-611.

17. Brennecke, J., Aravin, A. A., Stark, A., Dus, M., Kellis, M., Sachidanandam, R., and Hannon, G. J. (2007). Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell 128, 1089-1103.

18. Brennecke, J., Malone, C. D., Aravin, A. A., Sachidanandam, R., Stark, A., and Hannon, G. J. (2008). An epigenetic role for maternally inherited piRNAs in transposon silencing. Science 322, 1387-1392.

19. Brouha, B., Schustak, J., Badge, R. M., Lutz-Prigge, S., Farley, A. H., Moran, J. V., and Kazazian, H. H., Jr. (2003). Hot Lis account for the bulk of retrotransposition in the human population. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 5280-5285.

20. Bucheton, A. (1978). Non-Mendelian female sterility in Drosophila melanogaster: influence of ageing and thermic treatments. I. Evidence for a partly inheritable effect of these two factors. Heredity 41, 357-369.

21. Bucheton, A. (1979). Non-Mendelian female sterility in Drosophila melanogaster: influence of aging and thermic treatments. III. Cumulative effects induced by these factors. Genetics 93, 131-142.

22. Bucheton, A. (1990). I transposable elements and I-R hybrid dysgenesis in Drosophila. Trends Genet 6, 16-21.

23. Bucheton, A. (1995). The relationship between the flamenco gene and gypsy in Drosophila: how to tame a retrovirus. Trends Genet 11, 349-353.

24. Bucheton, A., Paro, R., Sang, H. M., Pelisson, A., and Finnegan, D. J. (1984). The molecular basis of I-R hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster: identification, cloning, and properties of the I factor. Cell 38, 153-163.

25. Bucheton, A., Yaury, C., Chaboissier, M. C., Abad, P., Pelisson, A., and Simonelig, M. (1992). I elements and the Drosophila genome. Genetica 86, 175-190.

26. Calvi, B. R., and Gelbart, W. M. (1994). The basis for germline specificity of the hobo transposable element in Drosophila melanogaster. EMBO J 13, 1636-1644.

27. Calvi, B. R, Hong, T. J., Findley, S. D., and Gelbart, W. M. (1991). Evidence for a common evolutionary origin of inverted repeat transposons in Drosophila and plants: hobo, Activator, and Tam3. Cell 66, 465-471.

28. Cappello, J., Handelsman, K., and Lodish, H. F. (1985). Sequence of Dictyostelium DIRS-1: an apparent retrotransposon with inverted terminal repeats and an internal circle junction sequence. Cell 43, 105-115.

29. Casacuberta, E., and Pardue, M. L. (2005). HeT-A and TART, two Drosophila retrotransposons with a bona fide role in chromosome structure for more than 60 million years. Cytogenet Genome Res 110, 152-159.

30. Chaboissier, M. C., Finnegan, D., and Bucheton, A. (2000). Retrotransposition of the I factor, a non-long terminal repeat retrotransposon of Drosophila, generates tandem repeats at the 3' end. Nucleic Acids Res 28, 2467-2472.

31. Chalker, D. L., and Sandmeyer, S. B. (1992). Ty3 integrates within the region of RNA polymerase III transcription initiation. Genes Dev 6, 117-128.

32. Chambeyron, S., Bucheton, A., and Busseau, I. (2002). Tandem UAA repeats at the 3'-end of the transcript are essential for the precise initiation of reverse transcription of the I factor in Drosophila melanogaster. J Biol Chem 277, 17877-17882.

33. Chan, S. W. (2008). Inputs and outputs for chromatin-targeted RNAi. Trends Plant Sci 13, 383-389.

34. Cheloufi, S., Dos Santos, C. O., Chong, M. M., and Hannon, G. J. (2010). A dicer-independent miRNA biogenesis pathway that requires Ago catalysis. Nature 465, 584-589.

35. Chung, W. J., Okamura, K., Martin, R., and Lai, E. C. (2008). Endogenous RNA interference provides a somatic defense against Drosophila transposons. Curr Biol 18, 795-802.

36. Cox, D. N., Chao, A., Baker, J., Chang, L., Qiao, D., and Lin, H. (1998). A novel class of evolutionary conserved genes defined by piwi are essential for stem cell self-renewal. Genes Dev 12, 3715-3727.

37. Craig, N. L. (2002). Mobile DNAII, (Washington, D.C.: ASM Press).

38. Czech, B., Malone, C. D., Zhou, R., Stark, A., Schlingeheyde, C., Dus, M., Perrimon, N., Kellis, M., Wohlschlegel, J. A., Sachidanandam, R., et al. (2008). An endogenous small interfering RNA pathway in Drosophila. Nature 453, 798-802.

39. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., and Hannon, G. J. (2004). Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature 432, 231-235.

40. Desset, S., Buchon, N., Meignin, C., Coiffet, M., and Vaury, C. (2008). In Drosophila melanogaster the COM locus directs the somatic silencing of two retrotransposons through both Piwi-dependent and -independent pathways. PLoS ONE 3, el526.

41. Devine, S. E., and Boeke, J. D. (1996). Integration of the yeast retrotransposon Tyl is targeted to regions upstream of genes transcribed by RNA polymerase III. Genes Dev 10, 620-633.

42. Dimitri, P., Area, B., Berghella, L., and Mei, E. (1997). High genetic instability of heterochromatin after transposition of the LINE-like I factor in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 8052-8057.

43. Duval-Valentin, G., Marty-Cointin, B., and Chandler, M. (2004). Requirement of IS911 replication before integration defines a new bacterial transposition pathway. EMBO J 23, 3897-3906.

44. Fawcett, D. H., Lister, C. K., Kellett, E., and Finnegan, D. J. (1986). Transposable elements controlling I-R hybrid dysgenesis in D. melanogaster are similar to mammalian LINEs. Cell 47,1007-1015.

45. Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Jr., and Boeke, J. D. (1996). Human LI retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell 87, 905-916.

46. Finnegan, D. J. (1989). Eukaryotic transposable elements and genome evolution. Trends Genet 5, 103-107.

47. Galindo, M. I., Bigot, Y., Sanchez, M. D., Periquet, G., and Pascual, L. (2001). Sequences homologous to the hobo transposable element in E strains of Drosophila melanogaster. Mol Biol Evol 18, 1532-1539.

48. Gazzani, S., Lawrenson, T., Woodward, C., Headon, D., and Sablowski, R. (2004). A link between mRNA turnover and RNA interference in Arabidopsis. Science 306, 1046-1048.

49. Ghildiyal, M., Seitz, H., Horwich, M. D., Li, C., Du, T., Lee, S., Xu, J., Kittler, E. L., Zapp, M. L., Weng, Z., and Zamore, P. D. (2008). Endogenous siRNAs derived from transposons and mRNAs in Drosophila somatic cells. Science 320, 1077-1081.

50. Ghildiyal, M., and Zamore, P. D. (2009). Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet 10, 94-108.

51. Girard, A., Sachidanandam, R., Hannon, G. J., and Carmell, M. A. (2006). A germline-specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins. Nature 442, 199-202.

52. Goodier, J. L., Ostertag, E. M., Du, K., and Kazazian, H. H., Jr. (2001). A novel active LI retrotransposon subfamily in the mouse. Genome Res 11, 1677-1685.

53. Gregory, R. I., Yan, K. P., Amuthan, G., Chendrimada, T., Doratotaj, B., Cooch, N., and Shiekhattar, R. (2004). The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs. Nature 432, 235-240.

54. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., and Enright, A. J. (2008). miRBase: tools for mieroRNA genomics. Nucleic Acids Res 36, D154-158.

55. Gunawardane, L. S., Saito, K., Nishida, K. M., Miyoshi, K., Kawamura, Y., Nagami, T., Siomi, H., and Siomi, M. C. (2007). A slicer-mediated mechanism for repeat-associated siRNA 5' end formation in Drosophila. Science 315, 1587-1590.

56. Haase, A. D., Fenoglio, S., Muerdter, F., Guzzardo, P. M., Czech, B., Pappin, D. J., Chen, C., Gordon, A., and Hannon, G. J. (2010). Probing the initiation and effector phases of the somatic piRNA pathway in Drosophila. Genes Dev.

57. Hamilton, A., Voinnet, O., Chappell, L., and Baulcombe, D. (2002). Two classes of short interfering RNA in RNA silencing. EMBO J 21, 4671-4679.

58. Han, J., Lee, Y., Yeom, K. H., Kim, Y. K., Jin, H., and Kim, V. N. (2004). The Drosha-DGCR8 complex in primary mieroRNA processing. Genes Dev 18, 3016-3027.

59. Han, J. S., and Boeke, J. D. (2005). LINE-1 retrotransposons: modulators of quantity and quality of mammalian gene expression? Bioessays 27, 775-784.

60. Harris, A. N., and Macdonald, P. M. (2001). Aubergine encodes a Drosophila polar granule component required for pole cell formation and related to eIF2C. Development 128, 28232832.

61. Horwich, M. D., Li, C., Matranga, C., Vagin, V., Farley, G., Wang, P., and Zamore, P. D. (2007). The Drosophila RNA methyltransferase, DmHenl, modifies germline piRNAs and single-stranded siRNAs in RISC. CurrBiol 17, 1265-1272.

62. Hutvagner, G., McLachlan, J., Pasquinelli, A. E., Balint, E., Tuschl, T., and Zamore, P. D. (2001). A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA. Science 293, 834-838.

63. Jakubczak, J. L., Xiong, Y., and Eickbush, T. H. (1990). Type I (Rl) and type II (R2) ribosomal DNA insertions of Drosophila melanogaster are retrotransposable elements closely related to those of Bombyx mori. J Mol Biol 212, 37-52.

64. Jurka, J. (1997). Sequence patterns indicate an enzymatic involvement in integration of mammalian retroposons. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 1872-1877.

65. Kapitonov, V. Y., and Jurka, J. (2003). Molecular paleontology of transposable elements in the Drosophila melanogaster genome. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 6569-6574.

66. Karginov, F. V., and Hannon, G. J. (2010). The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell 37, 7-19.

67. Kawamura, Y., Saito, K., Kin, T., Ono, Y., Asai, K., Sunohara, T., Okada, T. N., Siomi, M. C., and Siomi, H. (2008). Drosophila endogenous small RNAs bind to Argonaute 2 in somatic cells. Nature 453, 793-797.

68. Kazazian, H. H., Jr. (2004). Mobile elements: drivers of genome evolution. Science 303, 1626-1632.

69. Khvorova, A., Reynolds, A., and Jayasena, S. D. (2003). Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell 115, 209-216.

70. Kidwell, M. G., and Kidwell, J. F. (1976). Selection for male recombination in Drosophila melanogaster. Genetics 333-351.

71. Kidwell, M. G., Kidwell, J. F., and Sved, J. A. (1977). Hybrid Dysgenesis in DROSOPHILA MELANOGASTER: A Syndrome of Aberrant Traits Including Mutation, Sterility and Male Recombination. Genetics 86, 813-833.

72. Kidwell, M. G., and Novy, J. B. (1979). Hybrid Dysgenesis in DROSOPHILA MELANOGASTER: Sterility Resulting from Gonadal Dysgenesis in the P-M System. Genetics 92, 1127-1140.

73. Kim, V. N., Han, J., and Siomi, M. C. (2009). Biogenesis of small RNAs in animals. Nat Rev Mol Cell Biol 10, 126-139.

74. Malone, C. D., Brennecke, J., Dus, M., Stark, A., McCombie, W. R., Sachidanandam, R., and Hannon, G. J. (2009). Specialized piRNA pathways act in germline and somatic tissues of the Drosophila ovary. Cell 137, 522-535.

75. Malone, C. D., and Hannon, G. J. (2009). Small RNAs as guardians of the genome. Cell 136, 656-668.

76. Matthews, B. B., and Crews, S. T. (1999). Drosophila center divider gene is expressed in CNS midline cells and encodes a developmentally regulated protein kinase orthologous to human TESK1. DNA Cell Biol 18, 435-448.

77. McClintock, B. (1951). Chromosome organization and genie expression. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 16, 13-47.

78. McGinnis, W., Shermoen, A. W., and Beckendorf, S. K. (1983). A transposable element inserted just 5' to a Drosophila glue protein gene alters gene expression and chromatin structure. Cell 34, 75-84.

79. Mevel-Ninio, M., Pelisson, A., Kinder, J., Campos, A. R., and Bucheton, A. (2007). The flamenco locus controls the gypsy and ZAM retroviruses and is required for Drosophila oogenesis. Genetics 175, 1615-1624.

80. Mizrokhi, L. J., and Mazo, A. M. (1991). Cloning and analysis of the mobile element gypsy from D. virilis. Nucleic Acids Res 19, 913-916.

81. Morgante, M., Brunner, S., Pea, G., Fengler, K., Zuccolo, A., and Rafalski, A. (2005). Gene duplication and exon shuffling by helitron-like transposons generate intraspecies diversity in maize. Nat Genet 37, 997-1002.

82. Neumann, P., Pozarkova, D., and Macas, J. (2003). Highly abundant pea LTR retrotransposon Ogre is constitutively transcribed and partially spliced. Plant Mol Biol 53, 399-410.

83. Niki, Y., Yamaguchi, T., and Mahowald, A. P. (2006). Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 16325-16330.

84. Obbard, D. J., Jiggins, F. M., Halligan, D. L., and Little, T. J. (2006). Natural selection drives extremely rapid evolution in antiviral RNAi genes. Curr Biol 16, 580-585.

85. Okamura, K., Hagen, J. W., Duan, H., Tyler, D. M., and Lai, E. C. (2007). The mirtron pathway generates microRNA-class regulatory RNAs in Drosophila. Cell 130, 89-100.

86. Olivieri, D., Sykora, M. M., Sachidanandam, R., Mechtler, K., and Brennecke, J. (2010). An in vivo RNAi assay identifies major genetic and cellular requirements for primary piRNA biogenesis in Drosophila. EMBO J 29, 3301-3317.

87. Ostertag, E. M., and Kazazian, H. H. (2005). Genetics: LINEs in mind. Nature 435, 890-891.

88. Ostertag, E. M., and Kazazian, H. H., Jr. (2001). Biology of mammalian LI retrotransposons. Annu Rev Genet 35, 501-538.

89. Pal-Bhadra, M., Leibovitch, B. A., Gandhi, S. G., Rao, M., Bhadra, U., Birchler, J. A., and Elgin, S. C. (2004). Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery. Science 303, 669-672.

90. Pardue, M. L., and DeBaryshe, P. G. (2003). Retrotransposons provide an evolutionarily robust non-telomerase mechanism to maintain telomeres. Annu Rev Genet 37, 485-511.

91. Pascual, L., and Periquet, G. (1991). Distribution of hobo transposable elements in natural populations of Drosophila melanogaster. Mol Biol Evol 8, 282-296.

92. Pelisson, A. (1979). The I-R system of hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster: influence on SF females sterility of their inducer and reactive paternal chromosomes. Heredity 43, 423-428.

93. Pelisson, A. (1981). The I—R system of hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster: are I factor insertions responsible for the mutator effect of the I—R interaction? Mol Gen Genet 183, 123-129.

94. Peragine, A., Yoshikawa, M., Wu, G., Albrecht, H. L., and Poethig, R. S. (2004). SGS3 and SGS2/SDE1/RDR6 are required for juvenile development and the production of transacting siRNAs in Arabidopsis. Genes Dev 18, 2368-2379.

95. Periquet, G., Ronsseray, S., and Hamelin, M. H. (1989). Are Drosophila melanogaster populations under a stable geographical differentiation due to the presence of P elements? Heredity 63 (Pt 1), 47-58.

96. Petrov, D. A., Schutzman, J. L., Hartl, D. L., and Lozovskaya, E. R. (1995). Diverse transposable elements are mobilized in hybrid dysgenesis in Drosophila virilis. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 8050-8054.

97. Picard, G. (1979). Non-Mendelian Female Sterility in DROSOPHILA MELANOGASTER: Principal Characteristics of Chromosomes from Inducer and Reactive Origin after Chromosomal Contamination. Genetics 91, 455-471.

98. Picard, G., Bregliano, J. C., Bucheton, A., Lavige, J. M., Pelisson, A., and Kidwell, M. G. (1978). Non-mendelian female sterility and hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. Genet Res 32, 275-287.

99. Plasterk, R. H. (1996). The Tcl/mariner transposon family. Curr Top Microbiol Immunol 204, 125-143.

100. Pritchard, M. A., Dura, J. M., Pelisson, A., Bucheton, A., and Finnegan, D. J. (1988). A cloned I-factor is fully functional in Drosophila melanogaster. Mol Gen Genet 214, 533540.

101. Proust, J., and Prudhommeau, C. (1982). Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. I. Further evidence for and characterization of the mutator effect of the inducer-reactive interaction. Mutat Res 95, 225-235.

102. Prud'homme, N., Gans, M., Masson, M., Terzian, C., and Bucheton, A. (1995). Flamenco, a gene controlling the gypsy retrovirus of Drosophila melanogaster. Genetics 139, 697-711.

103. Prudhommeau, C., and Proust, J. (1990). I-R hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster: nature and site specificity of induced recessive lethals. Mutat Res 230, 135-157.

104. Pyatkov, K. I., Arkhipova, I. R., Malkova, N. V., Finnegan, D. J., and Evgen'ev, M. B. (2004). Reverse transcriptase and endonuclease activities encoded by Penelope-like retroelements. Proc Natl Acad Sei U S A 101, 14719-14724.

105. Rhoades, M. W., Reinhart, B. J., Lim, L. P., Bürge, C. B., Bartel, B., and Bartel, D. P. (2002). Prediction of plant microRNA targets. Cell 110, 513-520.

106. Robine, N., Lau, N. C., Balla, S., Jin, Z., Okamura, K., Kuramochi-Miyagawa, S., Blower, M. D., and Lai, E. C. (2009). A broadly conserved pathway generates 3'UTR-directed primary piRNAs. Curr Biol 19, 2066-2076.

107. Rubin, G. M., Kidwell, M. G., and Bingham, P. M. (1982). The molecular basis of P-M hybrid dysgenesis: the nature of induced mutations. Cell 29, 987-994.

108. Sabot, F., and Schulman, A. H. (2006). Parasitism and the retrotransposon life cycle in plants: a hitchhiker's guide to the genome. Heredity 97, 381-388.

109. Saito, K., Inagaki, S., Mituyama, T., Kawamura, Y., Ono, Y., Sakota, E., Kotani, H., Asai, K., Siomi, H., and Siomi, M. C. (2009). A regulatory circuit for piwi by the large Maf gene traffic jam in Drosophila. Nature 461,1296-1299.

110. Saito, K., Ishizu, H., Komai, M., Kotani, H., Kawamura, Y., Nishida, K. M., Siomi, H., and Siomi, M. C. (2010). Roles for the Yb body components Armitage and Yb in primary piRNA biogenesis in Drosophila. Genes Dev.

111. Saito, K., Sakaguchi, Y., Suzuki, T., Siomi, H., and Siomi, M. C. (2007). Pimet, the Drosophila homolog of HEN1, mediates 2-O-methylation of Piwi- interacting RNAs at their 3' ends. Genes Dev 21, 1603-1608.

112. Sang, H. M., Pelisson, A., Bucheton, A., and Finnegan, D. J. (1984). Molecular lesions associated with white gene mutations induced by I-R hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. EMBO J 3, 3079-3085.

113. Savitsky, M., Kwon, D., Georgiev, P., Kalmykova, A., and Gvozdev, V. (2006). Telomere elongation is under the control of the RNAi-based mechanism in the Drosophila germline. Genes Dev 20, 345-354.

114. Scheinker, V. S., Lozovskaya, E. R., Bishop, J. G., Corces, V. G., and Evgen'ev, M. B. (1990). A long terminal repeat-containing retrotransposon is mobilized during hybrid dysgenesis in Drosophila virilis. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 9615-9619.

115. Schoeftner, S., and Blasco, M. A. (2009). A 'higher order' of telomere regulation: telomere heterochromatin and telomeric RNAs. EMBO J 28, 2323-2336.

116. Schroder, A. R., Shinn, P., Chen, H., Berry, C., Ecker, J. R., and Bushman, F. (2002). HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell 110, 521-529.

117. Schwarz, D. S., Hutvagner, G., Du, T., Xu, Z., Aronin, N., and Zamore, P. D. (2003). Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 115, 199-208.

118. Senti, K. A., and Brennecke, J. (2010). The piRNA pathway: a fly's perspective on the guardian of the genome. Trends Genet.

119. Shaham, S. (2006). Worming into the cell: viral reproduction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 3955-3956.

120. Spradling, A. C., Stern, D. M., Kiss, I., Roote, J., Laverty, T., and Rubin, G. M. (1995). Gene disruptions using P transposable elements: an integral component of the Drosophila genome project. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 10824-10830.

121. Stamatis, N., Yannopoulos, G., and Pelecanos, M. (1981). Comparative studies of two male recombination factors (MRF) isolated from a Southern Greek Drosophila melanogaster population. Genet Res 38, 125-135.

122. Tabara, H., Sarkissian, M., Kelly, W. G., Fleenor, J., Grishok, A., Timmons, L., Fire, A., and Mello, C. C. (1999). The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell 99, 123-132.

123. Tsubota, S., Ashburner, M., and Schedl, P. (1985). P-element-induced control mutations at the r gene of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol 5, 2567-2574.

124. Vagin, V. V., Sigova, A., Li, C., Seitz, H., Gvozdev, V., and Zamore, P. D. (2006). A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science 313, 320324.

125. Vaury, C., Pelisson, A., Abad, P., and Bucheton, A. (1993). Properties of transgenic strains of Drosophila melanogaster containing I transposable elements from Drosophila teissieri. Genet Res 61, 81-90.

126. Vieira, J., Vieira, C. P., Hartl, D. L., and Lozovskaya, E. R. (1998). Factors contributing to the hybrid dysgenesis syndrome in Drosophila virilis. Genet Res 71, 109-117.

127. Walsh, C. P., Chaillet, J. R., and Bestor, T. H. (1998). Transcription of IAP endogenous retroviruses is constrained by cytosine methylation. Nat Genet 20, 116-117.

128. Wei, G., Oliver, B., and Mahowald, A. P. (1991). Gonadal dysgenesis reveals sexual dimorphism in the embryonic germline of Drosophila. Genetics 129, 203-210.

129. Wightman, B., Burglin, T. R., Gatto, J., Arasu, P., and Ruvkun, G. (1991). Negative regulatory sequences in the lin-14 3'-untranslated region are necessary to generate a temporal switch during Caenorhabditis elegans development. Genes Dev 5, 1813-1824.

130. Wightman, B., Ha, I., and Ruvkun, G. (1993). Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell 75, 855-862.

131. Wu, X., Li, Y., Crise, B., and Burgess, S. M. (2003). Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science 300, 1749-1751.

132. Xie, Z., Johansen, L. K., Gustafson, A. M., Kasschau, K. D., Lellis, A. D., Zilberman, D., Jacobsen, S. E., and Carrington, J. C. (2004). Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol 2, El04.

133. Yang, N., and Kazazian, H. H., Jr. (2006). LI retrotransposition is suppressed by endogenously encoded small interfering RNAs in human cultured cells. Nat Struct Mol Biol 13, 763-771.

134. Yannopoulos, G., Stamatis, N., Monastirioti, M., Hatzopoulos, P., and Louis, C. (1987). hobo is responsible for the induction of hybrid dysgenesis by strains of Drosophila melanogaster bearing the male recombination factor 23.5MRF. Cell 49, 487-495.

135. Zhu, Y., Dai, J., Fuerst, P. G., and Voytas, D. F. (2003). Controlling integration specificity of a yeast retrotransposon. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 5891-5895.1. БЛАГОДАРНОСТИ

136. Приношу глубокую признательность всем соучастникам настоящей работы, кто на различных этапах её выполнения внёс посильный вклад в то, чтобы сделать её интересной и довести до логического конца.

137. Искренне благодарен моей жене Елене Рожковой за то, что она всегда поддерживала и разделяла все мои идеи и начинания, а также помогала во многих научных экспериментах.

138. В целом, хочется выразить искреннюю признательность всем членам лаборатории проф. М. Б. Евгеньева за поистине дружескую и рабочую атмосферу, которая сохраняется в лаборатории каждый день.

Информация о работе

Рожков, Николай Васильевич
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Малые интерферирующие РНК Drosophila virilis и их роль в экспрессии мобильных элементов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы