Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям обитания

Зацепина, Ольга Георгиевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям обитания
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям обитания"

0034791Ю

На правах рукописи

Зацепина Ольга Георгиевна

Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям

обитания

03.00.03 - молекулярная биология

- 8 ОКТ 2009

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 2009 г.

003479110

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, в лаборатории молекулярных механизмов биологической адаптации.

Научный консультант д. б. н. проф. М. Б. Евгеньев

Официальные оппоненты:

д. б. н. проф. Б. А. Маргулис, Учреждение Российской академии наук Инстит) цитологии РАН.

д. б. н. Н. А. Чуриков, Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН. д. б. н. А. М. Сапожников, Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Ведущая организация

Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН.

Защита диссертации состоится 27-го октября 2009 г. в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991 г. Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991 г. Москва, ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан ХЛсиОсиЬр^ЛЛт г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Повышенная температура или тепловой шок (ТШ) при воздействии на все известные организмы, от бактерии до человека, активирует гены теплового шока, представляющие собой эффективную защитную систему, как на клеточном уровне, так и на уровне целого организма. Гены теплового шока кодируют специфические белки (БТШ).

Гены ТШ и их продукты, сразу после открытия в 1974 г., стали объектом пристального исследования. Оказалось, что БТШ индуцируются не только теплом, но и целым рядом других повреждающих факторов как физического, так и химического происхождения.

Система генов ТШ очень быстро реагирует на внешний стимул. Гены ТШ и их продукты высоко консервативны. Наиболее консервативными являются белки с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70). Аминокислотные последовательности БТШ70 у человека и Е. coli гомологичны на 50%, а ряд доменов - на 96% (Schlesinger, 1990). Такой консерватизм БТШ у всех изученных организмов свидетельствует об исключительно важной роли этих белков в защите клеток от повреждений во время и после стресса (Lidquist, 1986; Feder, Hofmann, 1999).

Со времени открытия БТШ были подробно исследованы их структура и функции, а также молекулярные механизмы их экспрессии. Вопрос об участии БТШ70 в адаптации на уровне целого организма в течение длительного времени оставался неисследованным. Наиболее актуальным в этом направлении является изучение молекулярных механизмов адаптации организмов и возможной роли БТШ в этом процессе у разных географических популяций одного и того же вида, а также у близких видов, живущих в условиях, резко отличающихся по средней температуре обитания. Такой подход, впервые предложенный М.Б. Евгеньевым, дает возможность не только исследовать молекулярно-физиологические функции БТШ при стрессе, но и понять их значение в экологии, адаптации и эволюции популяций.

Первые работы такого плана были выполнены в России на различных видах шелкопряда и на девяти видах ящериц, отличающихся по температуре обитания (Шейнкер и др., 1987; Ulmasov et al., 1992). В этих исследованиях были обнаружены различия в уровне синтеза БТШ70 у разных видов, в зависимости от температуры района их обитания. Однако в то время было неясно, какие механизмы регуляции экспрессии БТШ лежат в основе этих различий.

В частности, не было известно, имеются ли какие-нибудь различия в ответе на ТШ у теплокровных организмов, тысячелетиями проживавших в контрастных по температурному режиму районах (например, пустыни Средней Азии и северные районы России).

Основным механизмом термоустойчивости у пустынных видов ящериц (ШтаБОУ е1 а1., 1992) и муравьев (ОеЬпп§, \Vehner, 1995) является, по-видимому, конститутивный синтез БТШ в нормальных условиях, обусловливающий готовность организма пережить резкий подъем температуры. У мух рода Ого$орЫ1а синтез БТШ70 в норме репрессирован. Было актуально узнать, существует ли взаимосвязь между уровнем индукции БТШ70 и термоустойчивостью у разных видов мух рода Ого5орЫ1а. Важно было выяснить, какие молекулярные механизмы лежат в основе вариабельности уровня индукции БТШ70, обеспечивающей адаптацию мух и других организмов к различным условиям обитания.

Устройство кластера генов бтш70 у £>. melanogasler хорошо изучено, известна также и структура промоторной области генов бтш у этого вида. Было интересно провести сравнительный анализ локуса генов бтш70 у видов ЬгозорЬИа группы и/Жг, отделённых от группы melanogaster десятками миллионов лет дивергентной эволюции. Следовало также выяснить, имеются ли различия в устройстве кластера генов бтш70 внутри самой группы у/п7м, у контрастных по температуре обитания видов, таких как £>. у/г//м и 0.1иттеи Такого плана исследования могут прояснить пути эволюции и адаптации у родственных видов, обитающих в разных температурных нишах.

В последние десятилетия накоплено много фактов, говорящих о важной роли мобильных генетических элементов (МЭ) в адаптации и эволюции самых различных видов животных. Однако возможный вклад МЭ в адаптацию видов к определенным температурным режимам обитания не был изучен. Встраивание МЭ в регуляторную область генов бтш может иметь весьма важные последствия, способные повлиять на тонкие механизмы регуляции и эволюции этой важнейшей адаптационной системы. Соответственно, актуальность изучения закономерностей встраивания МЭ в промоторную область генов бтш и влияние таких встраиваний на термоустойчивость организмов не вызывает сомнения.

Цель работы. Выявление основных молекулярных механизмов регуляции генов бтш при адаптации организмов к различным условиям обитания. Основные задачи исследования

1. Провести анализ кинетики и уровня синтеза БТШ70 в норме и после ТШ у ящериц, резко различающихся по температуре среды обитания.

2. Выявить молекулярные механизмы регуляции экспрессии БТШ70 у изучаемых модельных видов. В частности исследовать:

а) число копий бтш70 у сравниваемых видов,

б) регуляцию транскрипции бтш.

3. На примере первичной культуры фибробластов, полученных из кожи коренных жителей Туркменистана и центральной части России, изучить возможные различия в термоустойчивости у теплокровных.

4. Провести детальное исследование ответа на ТШ на примере рядов видов и линий Drosophila (D. melanogaster, D. lummei, D. montana, D. íexana, D. virilis, D. novamexicana и D. mojavensis), различающихся по температуре экологической ниши обитания. Для этого исследовать:

а) базальную и индуцируемую термоустойчивость,

б) уровень экспрессии БТШ70,

в) паттерн белкового синтеза после ТШ,

г) регуляцию транскрипции бтш.

5. Исследовать механизмы эволюции генов бтш70 у группы видов с хорошо изученной филогенией (на примере группы virilis). Для этого изучить:

а) строение кластера генов бтш70 у D. virilis и D. lummei,

б) клонировать и секвенировать гены бтш70 с фланкирующими последовательностями у изучаемых видов и линий.

6. Оценить вклад других групп БТШ в термоустойчивость организмов.

7. Изучить роль МЭ в адаптации организмов к изменяющимся условиям среды обитания. Для этого на модельной системе исследовать частоту и локализацию внедрения Р элемента в гены бтш70 D. melanogaster, а также описать функциональные последствия таких внедрений.

Научная новизна

1. В ходе исследования на примере нескольких видов ящериц было показано, что основную защитную роль при ТШ у южных видов играет конститутивный синтез БТШ70, отсутствующий у северных видов. Впервые выявлена корреляция между естественными колебаниями температуры в течение дня и уровнем синтеза БТШ70 в клетках животных. Впервые показано, что конститутивный синтез БТШ70 обусловлен особенностями связывания фактора транскрипции ТШ с промотором. Выявлены характерные различия в пороге индукции БТШ и длительности их синтеза, в зависимости от температуры среды обитания сравниваемых видов.

2. Впервые выявлены различия в термоустойчивости клеток у теплокровных, на примере культур первичных фибробластов, полученных из кожи коренных жителей Туркменистана и центральной части России.

3. Впервые у видов Drosophila группы virílis изучен паттерн индукции ряда групп БТШ п ответ на различные температурные воздействия. Выявлен преимущественный синтез низкомолекулярных БТШ и БТШ40 у термоустойчивых видов, по сравнению с более термочувствительными, при жестком температурном воздействии.

4. Методом масс-спектрометрии достоверно определены основные члены семейства БТШ70 у видов группы virílis.

5. Впервые обнаружены различия в числе генов бтш70 у разных линий и видов данной группы.

6. Подробно изучена структура кластера генов бтш70 у группы видов virílis; предложена модель, объясняющая эволюцию этого кластера в роде Drosophila.

7. На примере видов Drosophila показаны сложные взаимоотношения между уровнем синтеза БТШ и термотолерантностью. Впервые выявлено встраивание МЭ Jockey в промоторную область терморезистентной линии D. melanogaster (ТТ), способной размножаться при повышенной температуре (32°С). Показано снижение экспрессии генов бтш70 и изменение паттерна синтеза БТШ в этой линии.

8. На модельной системе, разработанной для D. melanogaster, методом направленного Р-мутагенеза выявлено специфическое встраивание конструкции на основе Р элемента исключительно в промоторную область генов 6mui7fí. Найдены горячие точки встраивания. Положения, выносимые на защиту

1. Адаптационная эволюция ответа организма на стрессовое воздействие окружающей среды может существенно различаться в зависимости от вида и/или группы организмов.

2. Важную роль в термоустойчивости организмов играет БТШ70.

3. Пластичность индукции БТШ в значительной степени определяется фактором теплового шока (HSF). Как правило, у теплолюбивых видов температурный порог индукции белков теплового шока выше, чем у видов средней полосы.

4. Терморезистентные виды при физиологически нормальной температуре часто характеризуются наличием определенного базального уровня БТШ70 в клетках.

5. Базальный уровень синтеза БТШ может быть обусловлен свойствами HSF и промотора генов бтш.

6. В большинстве случаев адаптация организма к гипертермии достигается без изменения числа генов теплового шока, хотя у некоторых видов вариабельность в числе генов в популяции может иметь адаптивный характер.

7. Низкомолекулярные БТШ вносят существенный вклад в термоустойчивость организмов.

8. Мобильные элементы играют важную роль в регуляции активности и эволюции генов теплового шока.

Практическая ценность. Полученные в ходе исследований результаты важны для понимания механизмов адаптации организмов к изменяющимся условиям окружающей среды. В условиях глобального изменения климата и загрязнения окружающей среды, эти знания могут быть полезными для сохранения вымирающих видов. Полученные данные представляют ценность для создания практически важных трансгенных животных и растений, способных жить и размножаться в экстремальных условиях внешней среды. Апробация работы. Результаты работы были представлены на 6-й Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (29 июня - 5 июля 2003 г., Санкт-Петербург - Москва); 11-й Международной Конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» в сессии «Молекулярные и клеточные аспекты биологии стресса» (6-10 октября 2003 г., Санкт-Петербург); 1-м Международном Конгрессе по роли ответа на стресс в биологии и медицине (Квебек, Канада, 2003 г.); на международной конференции «Современные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции» (Ереван, 8 -11 сентября 2005 г.); на международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 28 июня - 2 июля 2006 г.); на международной конференции: «Факторы окружающей среды, клеточный стресс и эволюция», Университет Баранаса Хинду, Индия, 2006; на конференциях. «Динамика генофондов» 2006, 2007 гг., на 13 международной конференции по. молекулярным механизмам старения (Квебек, Канада, май 2009 г.) и др. Вклад автора. Основные результаты получены лично и совместно с М.Б. Евгеньевым, Х.А. Ульмасовым, Д.Г Гарбузом., В.Б. Молодцовым, В.Ю. Шиловой, Е.С. Зеленцовой. Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 статей в рецензируемых научных журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы по теме диссертации, списка цитируемой литературы, в который входит 376 ссылок. Работа изложена на 202 страницах, сдержит 62 рисунка и 4 таблицы.

Благодарности. Автор благодарит всех сотрудников Лаборатории молекулярных механизмов биологической адаптации за помощь и поддержку в работе, особенно д.б.н. проф. М.Б. Евгеньева, который инициировал весь проект, и все годы активно участвовал в экспериментах, во всех обсуждениях и анализе результатов. Автор весьма признателен за активное участие в работе Х.А. Ульмасову, В.Н. Ляшко, A.A. Караванову, Е.С.Зеленцовой, E.H. Мяснянкиной, Д.Г. Гарбузу, В.Ю. Шиловой, В.Б. Молодцову, Н.Г. Шостак. Автор благодарит за поддержку и дружеское участие сотрудников Лаборатории подвижности генома во главе с акад. Ю.В.Ильиным.

Результаты исследований и их обсуждение 1. Изучение молекулярных механизмов адаптации у холоднокровных животных из контрастных по температуре обитания экологических ниш

1.1. Экспрессия БТШ70 и HSF у ящериц. Для изучения роли БТШ в адаптации целого организма к определенным условиям обитания, в качестве объекта исследования мы использовали разные виды ящериц, населяющих пустыни Средней Азии. Для сравнения с ними мы выбрали вид из средней полосы, живущий в условиях холодного и умеренного климата (живородящая ящерица - Lacerta vivípara). Среди пустынных видов для подробных исследований выбрали ящериц, активных в дневное время суток (песчаная круглоголовка -Phrynocephaliis interscapularis) и в ночное (каспийский геккон - Caspian gecko).

Проведенное нами сравнение уровня синтеза БТШ70 у видов ящериц трех указанных выше категорий показало, что активные днем пустынные ящерицы характеризуются заметным уровнем БТШ70 в клетках и при нормальной температуре, у ночных уровень БТШ70 при нормальной температуре значительно ниже, а у видов ящериц средней полосы БТШ70 в клетках в норме почти полностью отсутствует (рис. 1).

1 2 3

Рис. 1. Иммуноблот-анализ уровня БТШ70 для круглоголовки (1), живородящей ящерицы (2), каспийского геккона (3) в нормальных условиях (25°С).

Интересно было выяснить, колеблется ли уровень синтеза БТШ70 у одного из самых термофильных на земле животных, песчаной круглоголовки, в норме в течение дня, в связи с естественными колебаниями температуры воздуха, почвы и тела животного. Мы показали, что тепловой шок у ящериц вызывает активный синтез двух изоформ БТШ70: БТШ68(-) и БТШ68(+). Одна изоформа, БТШ68(+), синтезируется преимущественно при ТШ, а другая, БТШ68(-), при нормальных условиях, при ТШ, а также при критических для жизни температурах, когда синтез всех других белков подавлен.

Для выявления возможных колебаний в синтезе БТШ70 в зависимости от изменения температуры тела ящериц, в течение дня in vivo вводили 35Б-Ь-метионин в тело песчаных круглоголовок, отловленных в различное время светового периода суток. Через час после введения метки из печени выделяли белки. После разделения методом двумерного

800-

700-

600-

500-

-100-

300-

200-

100-

т-1-1-1-1-1-1-Г"

6 8 10 12 ¡4 (6 18 20

.45 •40

35 -30

время суток

Рис. 2. Динамика колебаний: температуры тела - 1; синтеза БТШ68(+) - 2 и БТШ68(-) - 3 у песчаной круглоголовки в светлый период суток. Ящериц отлавливали, начиная с 6 ч утра до 22 ч вечера.

электрофореза выделенных из печени белков, из геля вырезали зоны, соответствующие БТШ68(-) и БТШ68(+), и определяли уровень включенного ^Б-Ь-метионина. Результаты этого эксперимента представлены на рис. 2.

Из графика видно, что уровень синтеза БТШ70 в клетках этого вида ящериц имеет положительную корреляцию с колебаниями температуры тела животного, достигающей максимума в середине дня, во время дневной жары. Следует отметить, что высокий уровень синтеза БТШ сохраняется даже после снижения температуры тела до 30 - 35°С.

Чтобы выяснить, обеспечивается ли высокий уровень накопления БТШ70 на стадии транскрипции, или же он достигается за счет высокой стабильности самих БТШ70, мы провели анализ экспрессии мРНК бтш70 в норме и после ТШ у живородящей ящерицы и круглоголовки. Проведенный Нозерн-анализ показал примерно одинаковый уровень накопления мРНК бтш70 после ТШ (42°С 1 ч) для обоих видов, при значительно более высоком конститутивном (при 25°С) уровне синтеза мРНК у круглоголовки (рис. 3).

К.к Ж.я.к К.ТШ Ж.я.ТШ Рис. 3. Нозерн-блот гибридизация с меченым

^ 01*11170 Фрагментом гена бтш70 Хепорт 1аеУ1$.

К.к и К. ТШ - круглоголовка, контроль

<-Актин и теплов°й шок> Ж.я.к и Ж.я.ТШ -живородящая ящерица, контроль и ТШ.

Различия в уровне мРНК бтш70 и БТШ70 в норме могут достигаться с помощью разных молекулярных механизмов. Одним из них, возможно, является изменение числа генов бтш70 в ходе эволюции, у южных и северных видов ящериц. Для проверки этой гипотезы был проведен анализ по Саузерну геномной ДНК, выделенной из песчаной круглоголовки и живородящей ящерицы. При обработке геномной ДНК ферментами рестрикции с последующей гибридизацией с меченым зондом (ген бтш70 Xenopus laevis), получена идентичная картина как по паттерну, так и по интенсивности полос гибридизации.

Исходя из полученных результатов, можно предположить сходную организацию генов бтш70 и равное число (вероятно 2 - 3) их копий у сравниваемых видов. То есть, наблюдаемые нами различия в уровне экспрессии БТШ70 у этих видов, скорее всего, обусловлены различиями в системе регуляции транскрипции или синтеза этих белков.

На стадии транскрипции регуляцию осуществляют факторы транскрипции ТШ (HSF -позитивный регулятор и CHBF - негативный). Было интересно выяснить, имеются ли различия в уровне мРНК hsf и соответствующего белка у изучаемых видов ящериц. Нельзя было исключить и вероятность того, что организация и число копий самих генов hsf различно. Для выяснения этого вопроса был проведен Саузерн-анализ с меченой пробой hsf L. vivípara. Паттерн гибридизации ДНК круглоголовки и живородящей ящериц, обработанных ферментами рестрикции, с пробой к гену hsf совершенно различен. Это свидетельствует в пользу сильной дивергенции этих генов, а также о возможном их количественном различии, в отличие от изученных у этих же видов генов бтш70. Для выяснения имеющихся различий в уровне мРНК hsf и, соответственно, белка у контрастных по термоустойчивости видов ящериц до и после ТШ были проведены Нозерн- и Вестерн-анализы.

А Б

1234 123456

Актин М.

■ HSF1

и * *

Рис. 4. Анализ уровня экспрессии HSF (А и Б). А. Нозерн анализ РНК (1,2- контроль, круглоголовка и живородящая ящерица. 3,4- ТШ, круглоголовка и живородящая ящерица (см. рис. 3) с меченой пробой первого экзона гена hsfL. vivípara. Б. Иммуноблот-анализ уровня HSF для круглоголовки (1, 2), живородящей ящерицы (3, 4), каспийского геккона (5, 6) при 25°С (1, 3, 5) и после шока в 42° С в течение I ч (2, 4, 6).

Из рисунка 4А видно, что у круглоголовки уровень синтеза мРНК Ьз/ значительно ниже, чем у живородящей ящерицы. Для подтверждения результатов Нозерн-гибридизации был проведен сравнительный анализ содержания общего количества НЭР методом иммуноблоттинга с использованием поликлональных антител к НЭП человека (рис. 4Б). Для каспийского геккона характерна единственная полоса иммунопреципитации с антителами к ШР в районе 75 кДа, для живородящей ящерицы, кроме сходной по молекулярной массе полосы, обнаружена вторая в 77 кДа. Обе полосы характеризуются большей интенсивностью у живородящей ящерицы в сравнении с полосами у круглоголовки. Таким образом, данные Нозерн- и Вестерн-анализа подтверждают предположение, сделанное на основе Саузерн-анализа о возможности существования различий в количестве и организации генов Ия/ у данных видов.

Совокупность полученных результатов указывает на возможную взаиморегуляцию различных компонентов системы ТШ у сравниваемых видов. Суммарное содержание НЭР позитивно коррелирует с уровнем индукции синтеза БТШ70 при ТШ и негативно - с внутриклеточным уровнем БТШ70 при нормальной температуре. Биологическое значение установленного феномена может состоять в том, что виды южного происхождения, с исходно высоким внутриклеточным содержанием БТШ70, регулярно подвергающиеся ТШ, не испытывают необходимости в резком увеличении количества этих белков при незначительном повышении температуры. При этом спасающую функцию берут на себя конститутивно присутствующие БТШ70. Виды северного происхождения, редко

А Б

Рис. 5. Электрофорез меченных in vivo 15S-L-MeTHOHHHOM белков, после различных температурных воздействий, из печени живородящей ящерицы и каспийского геккона. А - живородящая ящерица, Б - каспийский геккон.

25 37 39 42 °С

39 43 45 'С

испытывающие в процессе жизнедеятельности резкие колебания температуры, имеют исходно низкий уровень БТШ70, но высокий конститутивный уровень HSF. Высокий уровень HSF в клетках этих видов обеспечивает быструю и интенсивную индукцию БТШ при ТШ. Из рис. 5 видно, что у живородящей ящерицы интенсивность включения метки в БТШ70 при температурах 37 - 42°С значительно выше, чем у каспийского геккона. Также видно, что у северного вида индукция БТШ происходит при более низкой температуре, а у южного - при более высоких температурах. Иными словами, у северных видов порог индукции БТШ ниже, а уровень индукции выше, чем у южных.

Известно, что интенсивность транскрипции зависит от эффективности связывания факторов транскрипции с промоторным участком генов бтш при ТШ, которая определяется сродством факторов транскрипции к элементам теплового шока (HSE). При этом возможна конкуренция между позитивным фактором транскрипции HSF и негативным регулятором транскрипции (CHBF). Для исследования взаимодействия факторов транскрипции с промотором у контрастных по теплоустойчивости видов ящериц было проведено исследование комплексов белок - ДНК (HSE).

1.2. Исследование комплексов факторов транскрипции с элементами теплового шока. Активация HSF сопровождается его тримеризацией и связыванием с HSE. Анализировали связывание HSF и других факторов транскрипции с HSE, используя метод электрофореза в неденатурирующих условиях. При этом, образцы белковых экстрактов различных видов ящериц до и после ТШ инкубировали с меченым 32Р олигонуклеотидом, содержащим HSE. Анализ эффективности связывания HSE с факторами транскрипции в суммарных белковых экстрактах ящериц при нормальных условиях и сразу после ТШ (30 мин) представлен на рис. 6. Из рисунка видно, что в условиях опыта существуют три различных комплекса: I - комплекс характерен для южных видов в нормальных условиях; II - комплекс присутствует в нормальных условиях у всех видов, при этом его содержание

заметно выше у живородящей

Рис. 6. Анализ связывания факторов транскрипции с HSE.

Каспийский геккон (1,2); круглоголовка (3 - 6); живородящая ящерица (7 - 8); контроль 25°С (1, 3, 7); после ТШ 42°С (4, 8); 45°С (2, 5); 49° С (6). Стрелки указывают расположение HSE-связывающих комплексов (I, II, III).

ящерицы; III - комплекс появляется после ТШ. При ТШ наблюдается уменьшение связывания для комплекса II и его полное исчезновение при критических для жизни ящериц температурах (круглоголовка - 49°С 20 мин). Важно отметить, что у южных видов (особенно ярко это выражено у геккона) в контроле (25°С) наблюдается комплекс III.

Присутствие HSF в изучаемых комплексах можно доказать замедлением подвижности рассмотренных выше комплексов после инкубации их с антителами к HSF (рис. 7).

Рис. 7. Анализ специфичности связывания факторов транскрипции. Круглоголовка () - 2); живородящая ящерица (3-4); 1, 2 - ТШ 45°С; 3, 4 - ТШ 42°С; 2, 4 - добавлены антитела к HSF.

Резкое замедление подвижности комплексов III (2 и 4) после инкубации с антителами к HSF ясно показывает, что самый медленный комплекс - III появляется в результате связывания транскрипционного фактора HSF с HSE.

У контрастных по температуре среды обитания ящериц могут различаться пороговая температура индукции БТШ, кинетика накопления БТШ, а также продолжительность их синтеза. Изучая динамику связывания HSF и CHBF с HSE после ТШ, можно установить эти характеристики (рис. 8).

Видно, что температурный порог активации HSF и его связывания с HSE для живородящей ящерицы наступает уже при 34°С, а при шоке 42°С 15 мин наблюдается более

7 8 9 10 11 12. 13

Рис. 8. Анализ интенсивности связывания факторов транскрипции с ЩЕ при ТШ и в период восстановления. Песчаная круглоголовка (1 - 6); живородящая ящерица (7 - 13). Контроль (1 и 7); ТШ 34°С 15 мин (2 и 8); ТШ 42°С 15 мин (3 и 9); ТШ 42°С 30 мин (4); ТШ 42°С 60 мин (5 и 10); ТШ 42 °С 60 мин и восстановление в течение 60 мин (6 и II); 3 ч (12); и 6 ч (13).

мощное связывание, чем у круглоголовки. Процесс возврата в нормальное состояние у живородящей ящерицы также продолжается значительно дольше, чем у круглоголовки (6 ч против 1 ч).

Другой характеристикой эффективности функционирования системы ТШ может быть степень сродства HSF и CHBF к HSE. Были поставлены эксперименты по конкурентному связыванию HSF и CHBF с HSE, которые выявили большее сродство HSF к HSE для песчаной круглоголовки в сравнении с обитателем средней полосы (L. vivípara).

Таким образом, в экспериментах по связыванию белковых экстрактов с элементами HSE были обнаружены следующие закономерности.

Повышенная экспрессия БТШ70 у южных видов в норме (геккон и круглоголовка) контролируется на уровне транскрипции и обусловлена, по-видимому, присутствием незначительного количества активной формы фактора транскрипции генов ТШ в нормальных физиологических условиях, что приводит к «подтеканию» транскрипции.

Северные виды характеризуются более низким порогом индукции и значительно более продолжительным временем связывания HSF с HSE после ТШ (6 ч против 1 ч), что обусловливает более длительное время транскрипции бтш после ТШ, и, соответственно, значительное накопление БТШ после ТШ.

Показана большая степень сродства HSF к промоторной части генов бтш у круглоголовки, по сравнению с живородящей ящерицей. Возможно, благодаря этому, южным видам требуется меньшее количество HSF для активации транскрипции.

Для северных видов выявлена более значительная роль негативного фактора в регуляции транскрипции генов ТШ, чем, возможно, обусловлено отсутствие связывания HSF с HSE в нормальных условиях.

Проводимые нами исследования реакции на ТШ и синтеза БТШ у пустынных организмов не ограничились пойкилотермными (холоднокровными) организмами. Следовало выяснить, справедливы ли обнаруженные нами корреляции между синтезом БТШ и термоустойчивостью у теплокровных животных.

2. Синтез БТШ у народов, населяющих пустыни и области с умеренным климатом

На следующем этапе наших исследований мы решили сравнить характер синтеза БТШ у двух этнических групп людей: русских, проживающих в центральных районах России, и туркмен, живущих в Средней Азии. Проведенный сравнительный анализ показал, что фибробласты туркмен после длительного ТШ 42.5°С в течение 6 ч способны в полной мере синтезировать весь набор белков, в то время как фибробласты русских полностью

прекращают синтез всех белков после такого воздействия (рис, 9). При сравнении выживаемости фибробластов (способности образовывать клоны) после длительного ТШ, А. Б.

1 J t

- Li

Г- " *

< г .

* Ф

Рис. 9. Флюорограммы двумерных электрофорезов белков, синтезируемых в фибробластах кожи человека (А - туркмены; Б - русские). Белки метили 14С-аминокислотами (37°С, 1 ч после теплового шока 42,5°С, 6 ч). Стрелками показана индукция БТШ70 (ас - актин).

оказалось, что, как и ожидали, фибробласты туркмен характеризовались значительно более высокой частотой выживания, по сравнению с фибробластами русских.

Ранее в работе Ульмасова (Ulmasov et., 1993) на лимфоцитах верблюда (Camelus dromedaries) было показано, что они способны синтезировать БТШ при более высоких температурах, по сравнению с лимфоцитами человека.

В сумме, результаты этих исследований свидетельствуют о том, что и у теплокровных организмов, обитающих в условиях жарких пустынь, выработались молекулярные механизмы для обитания в экстремальных условиях.

3. Внутривидовые различия но термоустойчивости на примере Drosophila melanogaster При исследовании механизмов адаптации к высокой температуре у ящериц приходилось вести сравнение между филогенетически весьма отдалёнными видами, резко отличающимися по температуре экологических ниш. В связи с этим возникал вопрос; не обусловлены ли найденные различия в системе ответа на ТШ у видов, контрастных по температуре обитания, простой дивергенцией между видами (Garland and Adolph, 1994), либо они действительно вызваны адаптацией к высоким температурам среды обитания. С этой точки зрения наиболее корректно изучать эволюцию генов, кодирующих белки семейства БТШ70, их структуру и характер экспрессии у близкородственных видов, различающихся по климатическим условиям среды обитания и характеризующихся разным уровнем естественной термальной адаптации. Удобной модельной системой для изучения структуры и эволюции генов ТШ являются различные виды или популяции рода Drosophila.

Адаптация к ТШ у мух рода Drosophila, по-видимому, шла отличным путем, чем у ящериц. У разных видов ящериц мы обнаружили одинаковое число генов бтш70. У всех видов мух рода Drosophila произошла амплификация индуцибельного гена 6тш70. Так, у D. aura ría в единственном локусе находятся 3 копии бтш70, а виды D. simulans и D. mauritiana содержат в двух локусах по 2 тандемные копии бтш70. У D. melanogaster произошла дальнейшая амплификация копий гена бтш70. При этом в локусах 87В и 87А расположено по 3 - 4 и 2 копии, соответственно. Структура кластера генов бтш70 у группы virilis не была изучена вовсе. В начале наших исследований мы остановили свой выбор на мухах вида Drosophila melanogaster. Для сравнения взяли хорошо изученную линию Oregon R (OR) и линию, обозначенную нами как Termotolerance (TT). Линия TT была отловлена в начале 70-х годов в центральном Чаде (Африка). В данной местности в марте-июне наблюдается колебание дневных температур в диапазоне 20 - 38°С. Как оказалось, мухи линии TT остаются фертильными и способными к развитию при 32°С. Отловленные мухи линии TT в течение последних 20 лет велись в лабораторных условиях как при температуре 25°С (линия Т25), так и при температуре 32°С (линия Т32). При температуре выше 29°С мухи линии OR, так же, как и все другие линии D. melanogaster, становятся стерильными. Ответ на ТШ у мух линии OR, в отличие от линий TT, подробно изучен. В связи с этим интересно было выяснить, отличается ли линия TT от линии OR только способностью развиваться при более высоких температурах, либо она характеризуется также более высокой устойчивостью к экстремальным шоковым воздействиям и отличается по уровню синтеза БТШ от линии OR.

3.1. Сравнение линий по термоустойчивости. Для ответа на этот вопрос были проведены опыты по определению критической температуры выживания (рис.10). Под критической мы понимаем температуру, при которой количество выживших мух составляет менее 1% от числа подвергнутых ТШ. Из рисунка 10А видно, что для линии OR критической является температура 40°С, а для линий Т25 и Т32 - 40.5, 41°С, соответственно. Примечательно, что при 40°С выживает 75% мух линии Т32 и 25% - Т25. Известно, что предварительный слабый ТШ (35 - 37°С) ведет к увеличению количества выживших мух после сильного ТШ и повышает на 1.5 - 2°С критическую температуру выживания (индуцированная термотолерантность) (Krebs, 1999). Из рисунка видно (рис. 10Б, В, Г), что при индуцированной термотолерантности критическая температура выживания остается неизменной для всех рассматриваемых линий. С другой стороны, явно увеличивается количество выживших мух при температурах, близких к критической. Таким образом, установлено различие рассматриваемых линий по критической температуре выживания при схожести в динамике проявления индуцированной термотолерантности.

100 75 50 25 0 100 75 50 25 О

38.5 39 39.5 40 40.5 41

В 100 75 а36- ^. г -<з _

• 36* РТ \ 50 25 ®37" з\\

•37* РТ \ • за-

OR25 —.—.—V 0 Т32 '■•-.а

38.5 39 39.5 40 40.5 41 Рис. 10. Выживаемость мух в зависимости от ТШ (А) и индуцированной термотолерантности (Б, В, Г). По оси абсцисс указаны температуры теплового воздействия, по оси ординат - процент выживших мух через сутки после ТШ.

3.2. Сравнение уровня экспрессии БТШ70. Мы предположили, что основной причиной повышения термоустойчивости линий TT может являться повышенное содержание белков-членов семейства БТШ70. Для точного количественного определения содержания БТШ70 был использован метод иммуноферментного анализа (ИФА - ELISA). На рис. 11 представлено содержание БТШ70, накопленного в течение 1 ч восстановления после 30 мин ТШ. Представлено процентное содержание от стандарта БТШ70, выделенного из 20 нг белков, полученных из клеток Drosophila Schneider 2 после ТШ 36.5°С и восстановления в течение 1 ч (25°С). Результат анализа показывает, что в данных условиях линии OR и TT достигают относительного пика индукции БТШ70 после ТШ 37°С, причем у линии OR уровень накопления БТШ70 значительно больше, чем у линии ТТ.

3 ь

s X

а 0)

4 о о

200 150 100 50 0

JE5.

□ OR ST25

□ Т32

Рис. II. Количественный анализ содержания

индуцибельного БТШ70 в зависимости от температуры ТШ.

34 35 36 37 38 39 40

температура ТШ (градусы С)

При более высоких температурах у линии OR индукция БТШ70 резко падает (до нуля при 39°С), при сохранении детектируемых данным методом количеств белка у линии Т32. После шока 38°С индукция БТШ70 примерно одинакова для всех линий, поэтому данная температура была выбрана для изучения кинетики накопления БТШ70 во время восстановительного периода. Максимальное содержание БТШ70 достигается у обеих линий после 3 ч восстановления. В этом случае, у линий OR и Т25 накапливается белка примерно в три раза больше, чем после 1 ч. Падение до исходного уровня происходит между 5 и 6 ч. Таким образом, кинетика накопления индуцибельного БТШ70 в период восстановления после ТШ у разных линий одинакова, и различается по количеству синтезируемого БТШ70.

3.3. Анализ геномной ДНК линий ТТ и Oregon R. Обнаруженные различия в уровне индукции БТШ70 могут быть обусловлены отличиями в числе копий гена бтш70 и (или) в системе регуляции синтеза БТШ70. Для проверки первого предположения был проведен Саузерн-анализ геномной ДНК (рис. 12). Была получена идентичная картина гибридизации с пробой к гену hsf. При обработке ДНК ферментами рестрикции BamHl и HindlU и гибридизации с фрагментом гена бтш70 D. melanogaster для ДНК линии OR наблюдается 5 фрагментов гибридизации, каждый из которых совпадает с определенной копией гена (один с двумя копиями). При этом для линий Т25 и Т32 видно также 5 фрагментов, но 3 из них отличаются по подвижности от фрагментов гибридизации у OR. В случае использования других рестриктаз картина гибридизации для линий OR и ТТ, также различна. На основании примерно одинаковой интенсивности полос гибридизации можно предположить равное число копий гена бтш70 в сравниваемых линиях (у Oregon R - шесть копий).

OR Т25 Т32

КчЛ\ вшиН! .Sail г. оВ! AjwBl Sati fi»Rl famlll Sail

XBAl flintfl I Hindi 11 вашНЬШ! M11 Mm/!! 1 МП ЖйАШииПП Wintflll Ml

Рис. 12. Саузерн-блот гибридизация геномной ДНК с ХЬаУВатШ фрагментом гена 6mui70 D. melanogaster.

Важно было выяснить, вызваны ли различия в картине гибридизации рестрикционным сайт-полиморфизмом, либо произошли какие-то существенные изменения в структуре генов бтш70, приведшие к изменению уровня экспрессии БТШ70. Методом ПЦР у линии TT в 5'-районе одной из копий гена бтш70 была выявлена вставка. Оказалось, что в ßa-копию гена бтиПО между первым и вторым HSE произошло внедрение ретротранспозона Jockey. Последовательность депонирована в GeneBank под номером AY032740. Мутации, затрагивающие HSE, или встраивания МЭ между этими элементами, особенно между HSE1 и HSE2, существенно (по нашим данным, примерно на 75%) снижают уровень транскрипции гена. Таким образом, снижение уровня экспрессии БТШ70 в линии TT можно объяснить внедрением МЭ в промотор одного из генов бтш70.

Сейчас убедительно показано, что повышение количества БТШ70 у D. melanogaster выше определенного уровня приводит к повышенной смертности во время развития (Feder, 1999). Таким образом, возможно, число генов и, соответственно, уровень индукции БТШ70 у D. melanogaster достиг оптимального уровня, а для дальнейшего повышения термоустойчивости вовлекаются другие механизмы.

3.4. Синтез белков при тепловом шоке. Картина синтеза БТШ70 для D. melanogaster до и после ТШ хорошо изучена. Наряду с белком с молекулярной массой 70 кДа, семейство БТШ70 включает также индуцируемый тепловым шоком белок с молекулярной массой 68 кДа, который кодируется уникальным геном, расположенным в локусе 95D (Palter et al., 1986). При этом, как индуцибельные (БТШ68 и БТШ70), так и конститутивно синтезируемые члены семейства БТШ70 имеют общие антигенные детерминанты, что обусловливает их

Рис. 13. Включение in vivo ,5S L — метионина в белки слюнных желез личинок линий ТТ (слева) и OR (справа) после ТШ 39°С 20 мин.

а - актин; b - БТШ22;

d, с, е - белки, индуцируемые

ТШ в линии ТТ.

70»

i Г -83

"68- • *

V ♦

** * - ш, ♦ а Ф

ч27

совместное обнаружение методом иммуноблоттинга. Кинетику синтеза БТШ de novo после шока можно проследить, проанализировав включение in vivo 358-Ь-метионина в белки слюнных желез личинок.

Из рис. 13 видно преимущественное включение метки после T11I в белки семейства БТШ70, БТШ83 и низкомолекулярные БТШ (22 - 27кДа и 40 кДа). У линии ТТ повышена экспрессия низкомолекулярных БТШ (нмБТШ), по сравнению с линией OR, а также обнаруживается новая изоформа БТШ70 после ТШ. Чтобы однозначно определить, какие белки относятся к семейству БТШ70, был проведен иммуноблоттинг разделенных методом двумерного электрофореза белков с антителами 7.10.3 (Lindquist Lab.), узнающими индуцибельные и конститутивные члены семейства БТШ70. Результаты, отраженные на рис. 14, указывают на принадлежность рассматриваемых белков к семейству БТШ70.

Рис. 14. Вестерн-блот анализ белков, разделенных двумерным электрофорезом с использованием антител 7.10.3 к белкам семейства БТШ70 для линий OR и ТТ. 1 -при 25°С; 2 и 3 - после ТШ 37.5°С 30 мин, 1 ч и 3 ч восстановления при 25°С, соответственно. Окрашенный серебром актин служит для нормализации количества белка.

Анализ белков после ТШ методом двумерного электрофореза выявил следующие различия между линиями OR и ТТ: 1) снижение индукции БТШ68 у линии ТТ, по сравнению с линией OR; 2) при температурах ТШ, близких к критическим, у линии ТТ видна индукция дополнительных низкомолекулярных БТШ; 3) существование дополнительной изоформы БТШ69, принадлежащей семейству БТШ70, для линии ТТ. Таким образом, у линии ТТ повышение терморезистентности происходит не за счет увеличения накопления БТШ70, а, возможно, связано с индукцией дополнительного белка семейства БТШ70 (БТШ69), а также с повышенной экспрессией ряда низкомолекулярных БТШ.

4. Сравнительный анализ структуры и экспрессии генов бтш70у видов Drosophila филады virílis, обладающих различной термальной адаптацией

Для дальнейших исследований были выбраны несколько видов Drosophila, относящихся к филаде virílis с мало изученной системой ответа на ТШ. Группа virílis является одной из наиболее древних групп подрода Drosophila, что позволяет исследовать

возможные этапы эволюции генов бтш70 путём анализа их структуры и сравнения ее со структурой генов других видов (D. melanogaster). Время дивергенции видов D. vlrilis -D. melanogaster ~ 50 миллионов лет. Данные виды обитают в различных климатических поясах и, соответственно, должны отличаться по приспособляемости к воздействию высоких температур. Сравнивали пары видов, контрастные по уровню термальной адаптации: D. vlrilis (южный) - D. lummei (северный) и D. novamexicana (южный) - D. texana (северный). Данные пары видов способны скрещиваться в лабораторных условиях с получением частично фертильного потомства. D. virilis является предковым видом всей группы видов vlrilis, в пределах которой хорошо изучены филогенетические отношения. Время дивергенции видов D. vlrilis - D. lummei составляет -4-5 млн. лет. Можно предположить, что изменения в структуре и характере экспрессии генов ТШ у этих близких видов связаны с формированием термальной адаптации, а не обусловлены изменениями в ходе эволюционной дивергенции. В качестве дополнительного объекта исследования был взят вид D. montana (филада montana, подгруппа virilis), распространенный в пределах Северной Европы и США и, вероятно, близкий по термочувствительности к D. lummei. 4.1. Изучение термоустойчивости. Для определения устойчивости к кратковременному интенсивному тепловому шоку использовали мух из популяции, поддерживаемой при 25°С.

Таблица 1. Значения ЬТ50 и критической температуры для разных видов и линий группы

у/п'/и и вида О. mojavensis.

Географическое Т

Вид Линия происхождение, широта LT50, °С критическая

9 Батуми, Грузия (42°Ы)

101 Япония (~ 32 - 36°Ы) 41,3 42,5

160 Япония (~ 32 - 36°Ы) 41,2 42,5

1433 Южная Англия (53°Ы) 40,8 41,5

T-53 Ташкент, Узбекистан (41 °М) 41,1 42,0

T-61 Ташкент, Узбекистан (4Г1Ч) 41,2 42,5

D. virilis T-40 Ташкент, Узбекистан (41 41,1 42,0

200 Москва (55°Ы) 40,1 41,0

202 Краснодар (45°М) 40,1 41,0

207 Краснодар (45°1\1) 40,1 41,0

1102 Финляндия (60оЫ) 39,9 41,0

D. lummei 1109 Финляндия (60°М) 40,2 41,0

D. texana 423 Техас, США (32°Ы) 40,0 41,0

D.montana 1071.0 Финляндия (60°М) 39.7 41.0

D. novamexicana 424 Невада, США (32 - 370И) 40,8 42,0

D. mojavensls Мексика (30°М) 41,8 43,5

Определяли LT50 и критическую температуру. Число выживших мух определяли через 48 ч после ТШ. Из таблицы 1 видно, что все изученные линии D. lummei и D. montana характеризуются меньшей термоустойчивостью, чем линии D. virilis.

В целом, значения LT50 и критической температуры для D. virilis на 1,0 - 1,5°С выше, чем для D. lummei и D. montana. D. novamexicana - вид, обитающий в условиях аридной зоны, проявляет более высокую термоустойчивость, чем D. texana, и схож по этому показателю с D. virilis.

4.2. Определение индуцируемой термоустойчивости у видов и линий группы D. virilis. В

наших экспериментах по изучению индуцированной термоустойчивости мы подвергали мух предварительному ТШ интенсивностью 35,0, 36,0 и 37,0°С в течение 30 мин. Тепловой шок высокой интенсивности давали через 1 ч, 3 ч или сразу после предварительного ТШ. У D. lummei индуцированная термотолерантность не обнаруживается. D. lummei - первый изученный вид Drosophila, у которого практически отсутствует индуцируемая термоустойчивость. Для D. virilis (предварительный ТШ 36 - 37°С), была выявлена высокая индуцированная термотолерантность. Исходя из величины предварительного ТШ и данных по накоплению БТШ70 (см. ниже), можно предположить, что у D. virilis индуцированная термоустойчивость обусловливается индукцией и накоплением БТШ, предохраняющих клетки от более интенсивного ТШ.

4.3. Определение термоустойчивости реципрокных гибридов D. virilis и D. lummei.

Гибриды были получены путём реципрокных скрещиваний линии D. virilis 9 и линии D. lummei 200. Было интересно сравнить термоустойчивость родительских линий D. virilis и D. lummei с термоустойчивостью межвидовых гибридов для того, чтобы определить, существует ли доминирование термоустойчивого, либо термочувствительного фенотипа.

-а

га К

* \Mlix9$ х lummc¡200$ Iummei200$ х \'¡ritis9S

•v/ri/is»? х lummeüOOj 36,ОС Р>

ЧиттеПОО J х viriUs9S 36,ОС

*D. virilis 9 •D. lummei 200

39,0 39,5 40,0 40,5 41,0 41,5 42,0 42,5

t,C

Рис. 15. Базовая и индуцированная термоустойчивость гибридов D. virilis и D. lummei. (pt 36,0°С - предварительный ТШ 36°С)

Гибриды в обоих направлениях показывали приблизительно одинаковую базальную термоустойчивость. В отличие от D. lummei, гибриды проявляют достоверную индуцированную термоустойчивость при действии предварительного ТШ в обоих направлениях скрещивания (рис. 15).

4.4. Изучение общего белкового синтеза при ТШ у D. virilis и D. lummei. Важнейшим показателем степени воздействия теплового шока на организм является уровень синтеза белка в клетках. Для определения воздействия ТШ на общий белковый синтез были поставлены эксперименты по определению включения "Б-Ь-метионина в общий пул синтезируемых белков в клетках слюнных желёз личинок третьего возраста. В эксперименте использовали линию D. virilis 9 и линию D. lummei 200. Полученные результаты суммированы на рис. 16. Видно, что интенсивность включения метки в белки через I ч после ТШ 37,5°С не отличается от контрольного значения (25°С), т. е., происходит интенсивное включение метки в БТШ. После восстановительного периода продолжительностью 3 ч, уровень включения метки в белки выше у D. lummei, чем у D. virilis. Это связано с тем, что, синтез БТШ у D. lummei протекает более интенсивно и в течение более длительного времени, чем у D. virilis. Кроме того, в клетках D. lummei после возвращения к нормальным условиям уровень синтеза клеточных белков для восстановления их пула в цитоплазме, вероятно, выше, чем у D. virilis. Это можно объяснить тем, что тепловой шок 37,5°С оказывает более выраженное повреждающее воздействие на D. lummei, чем на D. virilis. При температурах близких к критическим, после восстановительного периода продолжительностью 1 ч, достоверной разницы в количестве включившейся метки между D. lummei и D. virilis не наблюдается. Очевидно, у обоих видов, при температурах выше 40°С, синтез белка блокируется практически полностью. Совершенно иная картина наблюдается через 3 ч после ТШ.

Рис. 16. Интенсивность включения "З-Ь-метионина в общий пул клеточных белков при ТШ разной интенсивности. По оси абсцисс -температура ТШ и время восстановления. По оси ординат -имп/мин.

Интенсивность включения метки у D. virilis превышает интенсивность включения у D. lummei в 2 раза после ТШ 40,0°С и в 3 раза - после ТШ 40,5 и 41,0°С. Это свидетельствует о восстановлении функций аппарата трансляции у D. virilis и глубоких нарушениях в механизме синтеза белка у D. lummei. При ТШ 41,0°С интенсивность включения метки в белки у D. lummei падает практически до нуля, что коррелирует с данными по выживаемости.

4.5. Накопление БТШ70 при тепловом шоке. Исходя из имеющихся литературных данных (Ulmasov, 1992; Gehring, Winner, 1995), мы предполагали, что у терморезистентных видов Drosophila будет обнаружена корреляция между повышенной термоустойчивостью и уровнем накопления БТШ70. Для проверки этой гипотезы мы провели иммуноблоттинг белков, выделенных из мух исследуемых видов и линий, с использованием моноклональных антител 7FB к индуцибельному БТШ70 и антител 7.10.3, реагирующих со всеми членами семейства БТШ70 (рис. 17).

Мух подвергали ТШ продолжительностью 30 мин, с последующим восстановительным периодом продолжительностью 1 и 3 ч, затем получали белковые экстракты для иммуноблоттинга. Выяснилось, что положительная корреляция между содержанием БТШ70 и терморезистентностью наблюдается в пределах филады virilis. Уровень накопления БТШ70 у D. virilis (линии 9, 101, 160) значительно превышает уровень накопления БТШ70 при соответствующих температурах у D. lummei (линия 200). У D. novamexicana (линия 424)

(г

£ 4 / / / / / / / & &

.хг J> J> J> »Sv

J> J> J> J> ч/ ч/ ч/ч/ У

Рис. 17. Количественный анализ накопления индуцибельной формы БТШ70 у имаго разных видов и линий Drosophila в зависимости от ТШ. Значения даны относительно концентрации БТШ70 в линии Oregon R при 37,5°С после 1 ч восстановления.

уровень накопления БТШ70 в два раза выше, чем у D. texana (линия 423) при 37,5°С. Линия D. lummei 200, с северным ареалом распространения, характеризуется более низким уровнем накопления БТШ70, по сравнению с более южными линиями 202 и 207. Особенно заметной разница в накоплении БТШ70 между парами контрастных по термоустойчивости видов становится при температурах, близких к критическим (40 - 41°С). При ТШ выше 40°С экспрессия БТШ70 практически полностью прекращается у D. lummei и D. texana, но сохраняется на достаточно высоком уровне у D. virilis и D. novamexicana. Эти показатели хорошо соотносятся с данными по термоустойчивости и включению радиоактивной метки в общий пул синтезируемых белков (рис. 16).

Однако, у термоустойчивой линии TT D. melanogaster уровень накопления БТШ70 после ТШ интенсивностью 37,5°С почти в 2 раза ниже, чем у стандартной линии OR (рис.17). У D, mojavensis, наиболее термоустойчивого вида Drosophila, накопление БТШ70 значительно ниже, чем у линии OR, даже при максимальном уровне индукции (Krebs, 1999). По нашим данным, все линии D. virilis и изучаемая линия D. novamexicana также характеризуются более низким уровнем накопления БТШ70, по сравнению с линией OR (см. рис. 17), которая является наиболее термочувствительной из всех изученных линий (критическая температура выживаемости - 40,0°С). Таким образом, во многих случаях наблюдается отрицательная корреляция между содержанием БТШ70 при умеренных тепловых шоках (37 - 38°С) и термоустойчивостью вида или линии. Однако при более высоких температурах все линии термоадаптированных видов накапливают БТШ70 в количествах, многократно превышающих накопление у термочувствительных видов. Кроме того, максимум индукции БТШ70 у D. virilis, D. novamexicana и D. mojavensis сдвинут в сторону более высоких температур по сравнению с D. lummei, D. texana и линией OR (см. рис. 17). Таким образом, можно сделать вывод о преимущественной защитной роли БТШ70 именно при высоких температурах.

4.6. Определение кинетики индукции мРНК БТШ70. Представляло интерес сопоставить данные по накоплению БТШ70 и кинетике синтеза мРНК бтшЮ. Сравнивали линию D. lummei 200 и линии D. virilis 9 и 160 (см. рис. 18). Видно, что у D. lummei полностью прекращается синтез мРНК бтш70 при 40,0 и 41,0°С. Восстановление транскрипции происходит через час после ТШ 40,0°С. Накопление белка при этом крайне незначительно даже после 3-х часов восстановительного периода (см. выше). У D. virilis 9 синтез мРНК бтш70 сохраняется как при 40,0, так и при 41,0°С. Таким образом, через 1 ч после ТШ 40,0°С у линии D. lummei 200 наблюдается уровень транскрипции, сравнимый с линиями

О. Ытта 200

О. г/л//.? 9

О. \4nlis 160

123456 1234 5 6 123456

Рис. 18. Уровень индукции мРНК бтш70 при различных значениях ТШ. 1 - 25°С, 2 - 31,5°С, 3 -37,5 °С, 4 - 40,0°С, 5 - 41,0°С, 6 -40,0°С, 1 ч восстановления. Внизу - гибридизация с зондом к гену актина О. melanogaster.

О. у/У/Уи 9 и 160, тогда как накопления белка, судя по данным Вестерн-анализа, не происходит. Следовательно, отсутствие синтеза БТШ70 у О. 1иттв1 при сублетальных температурах можно объяснить подавлением или нарушением трансляции мРНК бтшЮ. Аналогичную картину (транскрипцию РНК без последующего синтеза белка у линии (Ж) мы наблюдали при сравнении ответа на ТШ 39°С линий £>. melanogaster (Ж и ТТ.

4.7. Исследование ДНК-связывающей активности П8Р. Методом связывания и торможения фрагмента ДНК в геле определяли температуру тримеризации НЭР. У £). 1итте1 200 комплекс НЗР-НЭЕ образуется при 31°С, а у Л утГя 160 - при 32°С. Это отличие свидетельствует о более низком пороге индукции генов бтш у северного вида О. 1итте1, по сравнению с более южным видом £>. чЫИз. При температурах 37,5 - 40,0°С существенных отличий в связывании НЭР с НЭЕ не наблюдается. Следует отметить тот факт, что при ТШ 40° и 41°С у £>. 1итте1 связывание НБР с ДНК имеет место, а транскрипции генов бтш70 не происходит, По-видимому, при столь высокой температуре ДНК-связываюлцая активность ШР сохраняется, но происходит нарушение функций других компонентов аппарата транскрипции. Транскрипционная активность генов бтш70 восстанавливается только через 1 ч после ТШ 40°С (см. выше). Сходный характер связывания ШР с Н8Е у сравниваемых видов при высоких температурах позволяет предположить, что разница в накоплении белкового продукта у исследуемых видов объясняется не особенностями активации НБР, а, скорее всего, разницей в числе генов бтш70.

4.8. Анализ спектра изоформ БТШ70. Представляло интерес сравнить паттерн индукции БТШ70 у Д. 1итте1 и £>. virШs. Для этого белки разделяли методом двумерного электрофореза и детектировали методом окрашивания азотнокислым серебром, радиоавтографией радиоактивного метионина, либо с помощью иммуноблоттинга. Характер синтеза БТШ у видов группы тгИЬ изучался 8ипЬа1сН и 810111 (81шЬа1сИ, Э^мИ, 1982).

кДа D. virilis 9 101 160 1433 Т-53

72-* оо • оо • 00 ® о • о •

70—* ф • а® •

D. lummei 200 202 207 1102 1109

72—$ с • о • о ♦ о • 00 •

70 в» © • • • о О Ф • 9 •

D. mojavensis Oregon R D.montana D. texana D. nova тех

72—$ Ф Ф Ф о Ф 0 Ф

7 «0Э • Ф О • ф

~Т-1-1-г—i--1—I-1-1—г- —1—i-1-1—г —i—i-1-1—г —т—г—1-1—г- í

6.3 6.1 5.75 5.6 5.4 4.3 6.1 5.75 5.6 5.4 6.3 6.1 5.75 5.6 5.4 6.3 6.1 5.75 5.6 5.4 М 6.1 5.75 5,6 5.4 pl

■ - HSC70, узнаются только антителами 7.10.3 В - БТШ70, узнаются антителами 7.10.3 п 7FB О - БТШ68, узнаются только антителами 7.10.3

Рис. 19. Схема паттерна и серологические свойства БТШ70 разных видов Drosophila. Указаны значения градиента рН и молекулярные массы в кДа.

Нами был проведён анализ с более высоким разрешением зоны 70 кДа и изучен характер экспрессии БТШ при различных температурах. Паттерн БТШ70 разных линий и видов внутри группы virilis имеет сходные характеристики, сильно отличаясь от паттерна у D. melanogaster и D. mojavensis (рис. 19). У всех исследованных видов и линий группы virilis индуцибельные БТШ70 делятся на две группы, отличающиеся по молекулярной массе и изоэлектрической точке, причём каждая группа может включать несколько изоформ. Молекулярные массы белков, входящих в каждую группу, были ориентировочно определены методом электрофореза по маркеру как 70 и 72 кДа.

Практически каждая исследованная линия D. virilis и D. lummei имеет индивидуальный паттерн БТШ70. Интересно, что у всех видов группы viriüs только группа БТШ70 с молекулярной массой 70 кДа узнаётся антителами 7FB. Белки с молекулярной массой 72 кДа реагируют только с антителами 7.10.3, то есть их серологические свойства напоминают свойства БТШ68 D. melanogaster. Паттерн конститутивных БТ1П70, реагирующих с антителами 7.10.3, не отличается у всех рассматриваемых видов, что, очевидно, говорит об их более высокой эволюционной консервативности. Чтобы классифицировать две группы БТШ70 видов филады virilis, был предпринят пептидный анализ белков, относящихся к обеим группам. Подтвердилось, что белок с массой 70 кДа и изоэлектрической точкой ~ 6,1 у

видов филады \iriUs является гомологом БТШ70 Д те1апо%а$1ег, а белок с массой 72 кДа и изоэлектрической точкой ~ 5,75 гомологичен БТШ68.

Результаты секвенирования гена бтш68 выявили удлинение С-концевого домена, что объясняет большую молекулярную массу белка (УеПкос1уог8к:а1а й. а1., 2005). 4.9. Изучение паттерна других групп БТШ, индуцируемых тепловым шоком у видов группы Кроме БТШ70, была изучена экспрессия других семейств БТШ у видов

группы у;«/«. У всех термоадаптированных разновидностей наблюдается более интенсивное включение 358-Ь-метионина в низкомолекулярные БТШ и БТШ40.

Это было показано на примере линий 9, 101, 160, 1433, Т53 и Т61 Д \irilis, линии 424 Д поуатехкапа, О. то]амеп5!$ и линии ТТ Д. me/anogaster. У Д 1итте1 (линии 200, 202, 207, 1102 и 1109), Д 1ехапа (линия 423) и Д melanogaster (линия СЖ) включение метки в низкомолекулярные БТШ и БТШ40 происходит со значительно более низкой интенсивностью (рис. 20). При субкритических температурах у них снижается уровень включения метионина в БТШ70. Увеличение уровня экспрессии БТШ40 и низкомолекулярных БТШ у видов, обитающих в жарком климате и подверженных действию более высоких температур, может играть значительную роль в формировании термальной адаптации (см. ниже).

1 2

Рис. 20. Двумерный электрофорез белков, меченных 158-Ь-

метионином. 1 — О. 1утте/ 200, 2 -О. уМШ 9.

Все точки - 40,5°С, 3 ч восстановления. Числами указаны молекулярные массы белков в кДа, 70с - конститутивные формы БТШ70.

4.10. Вклад нмБТШ в термоустойчивость. Из ряда работ известно, что большой вклад в термоустойчивость вносит семейство низкомолекулярных БТШ (Morrow et al., 2006). Результаты двумерного электрофореза, показывают, что у более термоустойчивых видов: -D. virilis и D. novamexiccina включение 35 8-Ь-метионина в группу низкомолекулярных белков 22 - 27 KDa и 40 KDa значительно выше, чем у линий Д lummei и Д. texana.

Ч 4

-» •

. *

70с

\ V

!i 70С

27 - 30 / \

27-30

/ \

lii | \

* Л

Аналогичная картина характерна для линий й. melanogaster ОЯ и ТТ, а именно, у линии ТТ наблюдается более значительное включение 358-Ь-метионина в группу с мол. массой 40 кБ и 22 - 27 кО. Нами был подробно изучен синтез нмБТШ у видов йговоркИа с разным уровнем термальной адаптации - О. чтИв, й. 1итте'1, и О. melanogaster ОЯ. Количественное определение содержания нмБТШ, у всех трёх видов методом Вестерн-блоттинга с антителами, реагирующими с нмБТШ, с последующей денситометрией автографов, выявило более высокое содержание нмБТШ у £>. VЫШ по сравнению с£). 1итте1 и О. melanogaster как при контрольной температуре (25°С), так и при ТШ различной интенсивности (рис. 21).

Рис. 21. Результаты исследований нмБТШ у разных видов ОгозорМа. Содержание нмБТШ у й. melanogaster (Ж, й. 1итте/' 200 и О. у/п/к 9 в зависимости от значений ТШ и времени восстановления. Значения даны относительно концентрации нмБТШ у линии (Ж при 37.5°С и 1 ч восстановления.

Спектр изоформ нмБТШ у О. melanogaster (Ж значительно отличается от сходных друг с другом спектров изоформ нмБТШ у линий £). У1гШз и £>. 1итте\ (рис. 22.) При этом следует отметить большее число изоформ у термоустойчивого вида £>. и>/&, чем у £). ¡иттег и £). melanogaster СЖ.

I). 1итте1 2). \iritis Д. я/е/дло^а^/ег

25 кДа 21 кДа

4.0 -

<и 3.5 -

о 3.0 -

3 ь 2.5 -

л — « 2.0 -

5 1.5 -

а)

1.0 -

— <и

О 0.5 -

0 -

3 25*С

□ И.5"*С. I ч

□ 37.5°С, Зч о 39.0®С, I ч О 39.0*С. Зч в 40.0'С. I ч О 40.0''С. Зч

[Ь

|Ь

Огееоп К

200

БТШ26-27 л БТШ26-27

Ь1Ш / « * _ / Ж

21-22 / | БТШ /-..•»

*" 21-22 * * - " 5ТШ

^ 21-22 '

* » 0 '

Рис. 22. Двумерный электрофорез белков, выделенных из слюнных желез личинок, меченных 153-Ь-метионином в течение 1 ч после ТШ (37.5°С 30 мин).

4.11. Анализ структуры кластера генов бтш70 Л мп/м и />. 1иттеи Исходя из имеющихся литературных данных о важной роли БТШ70 в термальной адаптации у разных организмов, представляло интерес определить структуру кластера генов бтш70 у используемых в работе видов и линий, контрастных по термоустойчивости. Интересно также выяснить, обусловливается ли повышенный синтез БТШ70 при ТШ у некоторых линий £>. чМШ увеличением числа копий гена бтш70 или изменениями в их структуре. Для выяснения этих вопросов был проведён Саузерн-анапиз геномной ДИК разных линий £>. и О. 1итте'1 с использованием различных зондов к кодирующей части генов бтш70.

Для анализа использовались ферменты рестрикции, сайты которых находятся преимущественно вне кодирующей последовательности генов. При обработке ДНК всех линий £>. virilis рестриктазой ХЬа\ образуются три фрагмента ДНК длиной 3, 4 и 10 т.п.о., гибридизующиеся как с 5'-, так и с З'-фрагментом гена бтш70 О. те1апо%а$1ег, меченными 32Р (рис. 23).

Таким образом, сайты ХЬа\ расположены за пределами структурной части генов и консервативны для всех линий £>. утН5. Гибридизация в области фрагмента длиной 4 т.п.о. у разных линий О, \1пШ имеет разную интенсивность, что позволяет предположить наличие разного числа копий данных фрагментов и, соответственно, входящих в их состав генов бтш70 у разных линий. Внутривидовые различия в числе копий бтш70 ранее не были описаны в литературе.

ХЬа\ ХЬаУАсс1 ХЬаННШП

2345 6 78 12 3 45 6 78 12 3 45 6 78

kb (г- 10

tí

Рис. 23. Саузерн-анализ геномной ДНК из разных линий D. virilis и D. lummei. Гибридизация с PCR-фрагментом гена бтш70 D. lummei 200. 1 - D. lummei 200; 2 - D. lummei 202; 3 - D. lummei 1102; 4 -D. virlis 160; 5 - D. virlis 1433; 6 - D. virilis T-53; 1-D. virilis 9; 8 - D. virilis T-40.

Как уже говорилось выше, наибольший интерес в данной работе представляет сравнение числа копий и структуры генов бтш70 О. ^>¡>-¡¡¡5 и О. ¡итте'1. Будучи северным видом с низкой термальной адаптацией, О. Ьтте\ резко отличается от £>, \nrHis по количеству и динамике синтеза мРНК и белка БТШ70 (см. выше).

При рестрикции ХЪа\ у всех линий О. Ьтте! образуются четыре фрагмента длиной 2.8; 3.2; 4.5 и 10 т.п.о. (рис. 23). У 200-й линии все четыре фрагмента с одинаковой интенсивностью гибридизуются с 5'-фрагментом гена бтш70 О. melcmogastel■, у остальных линий фрагмент длиной 4,5 т.п.о. гибридизуется более интенсивно. При рестрикции ХЪа\1Асс\ из ЛТзаЬфрагмента длиной 2,8 т.п.о. вырезается участок длиной ~ 1,6 т.п.о. Оба эти фрагмента не гибридизуются с зондом к З'-кодирующей части гена 6тш70 О. те1апо§а51ег. По всей видимости, данная копия бтш70, утратила 3'-кодирующую часть гена и представляет собой функционально неактивный псевдоген. Таким образом, анализ геномной ДНК по Саузерну выявляет значительные отличия в структуре кластера генов бтш70 й. 1итте1 по сравнению с В. уНШ.

4.12. Определение числа копий гена бтш70 у разных линий О. уШГк и А 1иттеи Для

проверки гипотезы о наличии разного количества копий гена бтил70 у разных линий внутри вида В. было проведено измерение интенсивности гибридизации радиоактивно

меченого зонда из гена бтш70 О. Ытте: с фрагментами, получаемыми при обработке геномной ДНК разными ферментами рестрикции (метод определения числа копий гена по Саузерну). Рестрикция для анализа проводилась ферментами ХЪа\, ХЬаУАссХ и ХЬа1/Н/пЛП. Интенсивность гибридизации линейно зависит от содержания ДНК в геле. В качестве внутреннего стандарта для рестрикции ХЬа\ использовали уникальный фрагмент длиной 10 т.п.о., содержащий одну копию гена, а в случае рестрикции по ХЪаМАсс\ - фрагмент длиной 5 т.п.о.

Таблица 2. Число копий гена бтш70 у разных линий О. \nrilis и О. 1итте1. * - одна из копий функционально неактивна.

Линия Число копий

бтш70

D. virilis 9 6

160 7

101 7

1433 6

Т40 6

Т53 5

Т61 5

D. lummei 200 4*

202 5*

i 102 5*

Число копий гена бтш70 у различных линий £). мМШ приводится в таблице 2. Расчеты проводились на основе обсчета четырех независимых экспериментов, с достаточно высокой точностью (относительная ошибка не превышает 10%). Внутривидовые различия в числе копий бтш70 у природных линий йгоэорИНа обнаруживаются впервые. 4.13. 1п «Уи-гибридизация с политенными хромосомами А мг№$ и !)■ 1иттеи В работе М.Б. Евгеньева с соавторами (Еу§еп'еу М.В., Л а!., 1978) было показано, что мРНК, выделенная из клеток £>. virilis после ТШ, меченная радиоактивным йодом, гибридизуется с двумя единичными локусами политенных хромосом - 29С и 20Р. Нами было показано, что гены бтш70 расположены в локусе 29С. Для наглядной иллюстрации различия числа копий генов у й. у/гНм и £>. 1итте1 была поставлена т «'¿и-гибридизация с политенными хромосомами гибридов П О. у1гШз 160 х й. 1итте1 200. Гибридизация была поставлена с меченой пробой £). 1итте1 200, содержащей бтш70 и прилежащую З'-фланкирующую последовательность, включающую в себя повтор, специфичный для £>. 1итте1. На рис. 24 видно, что больший по размеру пуф О. у/н/й, содержащий 7 копий генов бтш70, гибридизуется с пробой интенсивнее, чем меньший по размеру пуф О. 1итте'1 200, содержащий 3 копии.

Рис. 24. Анализ генов бтш70 у гибридов D. virilis и D. lummei методом in situ гибридизации на политенных хромосомах.

4.14 Определение структуры кластера генов бтш70 D. virilis и D. lummei на основе рекомбинантных фагов X. Исходя из картины in s/fti-гибридизации, а также из данных, полученных для других видов Drosophila, мы предполагали, что у D. virilis и D. lummei гены бтш70 организованы в виде одного кластера, как, например, у D. auraria. Для проверки этой гипотезы, а также для определения нуклеотидной последовательности генов бтш70 и прилегающих последовательностей были получены геномные библиотеки в фаговом векторе XDASH. Для получения библиотек использовались линия D. virilis 160 и линия D. lummei 200.

Gene: g f

x н н н вх У У

Ht-

НВХ У X XHHX rR X X X XX X

ar sov s ouas s orrax sorar¿ s orrax s opnsnlí

s r ba 1

нУ^П-^ЧИ

£ r bar

s o r

1). virilis 160

S ORR

lOkb

tf a

X S ORRAX S O X X ИХ X НИХ

v ч R .

* S ORRAX S OR AX S OR

■/kb

4 kb

Legend 1 kb H

A—.4ccl B-Ba/;/HI Н-ЯшЛП R-ЕсоШ S-SacI L-.SY/Л O-XItol X—Xbal

Gene:

1 d

7TT

ro j

но rh

I. ,M

■tfntli

ZOO X i i

-ГТ

ro s xoo

но fct

X vji*

ir**T*fio1

Q2*

11 i

■да

НО RH

-w-

s xs в xx в

rsx

жт

i¡

ro s xoor'x s l J kb

■1.2 kb

10 kb

Рис. 25. Структура рекомбинантных фагов X и кластеров генов 6miu70 D. virilis 160 и D. lummei 200. Красными стрелками выделены гены 6тш70, нефункциональная копия D. lummei отмечена розовой стрелкой. Подробнее см. в тексте.

Было отобрано пять фагов из библиотеки D. virilis, обозначенных как 1, 2, 3, 7 и 17, и четыре фага из библиотеки D. lummei, обозначенных как 1/1, 17, 39 и 42 (см. рис. 25).

Фрагменты, полученные при расщеплении фаговой ДНК различными рестриктазами и их комбинациями, были переклонированы в плазмиду pBluescript SK'. Были построены рестриктные карты, проанализированы данные по гибридизации фрагментов рестрикции с зондами к различным участкам генов 6mut70 и фланкирующих последовательностей, и определены нуклеотидные последовательности ряда фрагментов. На основе этих результатов были сделаны выводы о перекрывании фагов, взаимной ориентации генов бтш70 и расстояниях между ними. В состав рекомбинантных фагов из линии D. virilis 160 входят шесть полных копий генов бтш70 и З'-фрагмент седьмой копии, ограниченный сайтом Sau3A, образованный при частичной рестрикции ДНК для последующего клонирования в составе вектора XDASH.

Фаги, полученные из линии D. lummei 200, также имеют в своём составе перекрывающиеся последовательности: было показано перекрывание между фагами 17, 39 и 42. В составе этих фагов были клонированы три полноразмерных копии гена 6mut70 D. lummei. Данные по перекрыванию фагов и структуре кластера генов 6mut70 D. virilis 160 и D. lummei 200 суммированы на рис. 25.

Было показано, что гены бтш70 линии D. virilis 160 действительно организованы в форме кластера из 7-и копий, что подтверждает данные Саузерн-анализа и гибридизации in situ. Шесть генов расположены в тандемной ориентации на расстоянии 4,8 т.п.о. один от другого (считая границами ТАТА-бокс и сигнал полиаденилирования ААТААА), а седьмая копия имеет обратную ориентацию и расположена на расстоянии ~ 1,5 т.п.о. от соседней (см. рис. 25). Таким образом, два гена бтш70 у линии D. virilis 160 образуют инвертированный повтор, что характерно для всех изученных на сегодняшний день видов Drosophila.

У 200-й линии D. lummei так же, как и у D. virilis, два гена 6mui70 расположены в виде инвертированного повтора на расстоянии ~ 1,5 т.п.о. друг от друга. Третья копия в составе фагов 17 и 42, как и копии, входящие в инвертированный повтор, является полноразмерной. Расстояние до этой копии установить не удалось, так как между фагами 1 и 17 отсутствует перекрывание. Для клонирования усеченной копии бтш70, из обработанной ферментом рестрикции ХЬа\ геномной ДНК D. lummei, была получена плазмидная библиотека, которую скринировали Xba\IBamH\ фрагментом гена бтш70а D. lummei. Полученные позитивные клоны секвенировали и обнаружили, что в состав клонированного 2.8 т.п.о. фрагмента входит усеченная копия бтш70с. У данной копии отсутствуют 300 н.п. кодирующей последовательности с 5' конца и 813 н.п. из 3'-участка. Для определения локализации псевдогена были подобраны праймеры из 3'-участка полученного клона и из 5'-конца фага

17. Методом ПЦР был амплифицирован, клонирован и секвенирован межгенный район 6miu70c - d.

Можно сделать вывод, что кластеры генов бтш70 у D. virilis и D. lummei различаются по структуре, что выражается в различном числе копий, больших расстояниях между тандемно расположенными генами у D, lummei и разной структуре межгенных участков. Кроме того, одна из копий в составе кластера 6mui70 D. lummei, является псевдогеном с делецией 5'- и З'-участков. С другой стороны, у D. lummei, как и у D. virilis имеются два гена, образующие инвертированный повтор.

4.15. Определение первичной последовательности генов бтш70 и прилежащих участков у D. lummei, D. virilis и D. montana. Для более детального функционально-структурного анализа кластера генов бтш70 была полностью определена нуклеотидная последовательность шести генов из линии D. virilis 160 (бтш70а - с и 6mui70e - g), и всех четырёх генов из линии D. lummei 200 (6mui7üd), клонированных в плазмиду pBluescript SK\ Из генома D. montana 1071.0 был клонирован и секвенирован ген бтш70, с прилежащими 5'-и З'-фланкирующими последовательностями.

Результаты сиквенса и трансляции белковых продуктов опубликованы в базе данных GenBank NCBI под номерами AY445083, AY445084, AY445085, AY445086, AY445087, AY445088, AY445089, AY445090, AY445091, AY445092, AY445093, AY665298 и AY665299. Полная нуклеотидная последовательность гена бтш70 D. montana депонирована под номером EU523047.

Шесть полностью секвенированных копий генов бтш70 D. virilis высоко консервативны и содержат всего 5 замен на всём протяжении кодирующей последовательности. Из них три замены приходятся на незначащий третий нуклеотид в мультикодирующих кодонах и две - приводят к замене аминокислотного остатка в последовательности кодируемого белка: замена GGG (глицин) на GTG (валин) и GTA (валин) на GCA (аланин). По сравнению с генами 6mut70 D. virilis, ген 6muj70d D. lummei содержит 33 нуклеотидных замены в составе кодирующей последовательности, из которых 28 являются незначащими, а 5 приводят к замене аминокислотного остатка, и делецию 9-и пар оснований после 1456-го нуклеотида относительно старта транскрипции.

Интересные результаты дало сравнение области промотора 6mui70 D. virilis с промоторами генов бтш70 D. lummei, D. montana и D. melanogaster. Промоторные области генов бтш70 D. virilis, D. lummei и D. montana имеют по две канонических последовательности HSE, тогда как в составе промотора 6mui70 D. melanogaster обнаружены четыре копии HSE.

В области 3'-фланкирующей последовательности генов бтш70 D. virilis и D. lummei наблюдается большая дивергенция, чем между самими генами, выражающаяся в наличии нуклеотидных замен и делеций. Нуклеотидная последовательность генов бтш70 D. virilis, D. lummei и D. montana на 80% гомологична генам бтш70 D. melanogaster, такая же гомология наблюдается и между аминокислотными последовательностями белковых продуктов.

В области 3'-фланкирующей последовательности всех генов бти/70 D. virilis, D. lummei и D. montana обнаружен фрагмент мобильного элемента SGM (Corvelo, 2004). Данный мобильный элемент относится к эволюционно древним повторяющимся последовательностям. Был клонирован Л"6й1/Лсс1-фрагмент из фага №7 D. virilis, содержащий данную последовательность, и проведён Саузерн-анализ геномной ДНК D. virilis и D. lummei на содержание последовательностей, гомологичных SGM. Как видно из рис. 26, у D. virilis данные повторы локализованы преимущественно в области генов бтш70. В случае D. lummei повторы амплифицированы и, помимо локуса 6mut70, распространены по всему геному. Повторяющиеся последовательности, в том числе мобильные элементы, могут играть важнейшую роль в эволюции, в частности способствовать изменению числа копий генов путём неравного кроссинговера и/или внутрихромосомной рекомбинации,

Для проверки гипотезы о роли ретроэлемента SGM в возможных перестройках кластера генов 6mui70 у видов группы virilis был проведён Саузерн-анализ структуры кластера у 10 различных генетических линий вида D. virilis. В ходе исследования в линии Al 1 была обнаружена вставка размером 3,6 т.п.о. в участок ДНК между генами 6miu70a и бтил70Ь, расположенными в виде инвертированного повтора. Клонирование и последующее секвенирование участка ДНК между генами бтш70а и 6mui70b линии Al 1 О. virilis показало,

12 3 4 ! 2 3 4

™•__

Рис. 26. А - Саузерн-гибридизация геномной ДНК с зондом к 5тш70. Рестрикция Ысй. 1 - Д 1итте1 1102, 2 - О. 1итте1 200, 3 - О. у1пШ 9, 4 - О. \nriUs Т-53. Б - то же, гибридизация с зондом к 5С/М

что в данном участке находится интермедиатный повтор SCM.

Кластер генов бтш70 D. lummei отличается от кластера D. virilis по числу и расположению тандемно ориентированных копий, находящихся на больших расстояниях друг от друга. Таким образом, можно сказать, что в ходе эволюции группы virilis изменялось число тандемно ориентированных копий. Общая схема предполагаемой эволюции кластера генов 6mui70 D. virilis и D. lummei приведена на рис. 27.

D. pseudoobscura, один из предковых видов рода Drosophila, имеет единственный локус, содержащий два гена бтш70 в виде инвертированного повтора (В. Bettencourt, unpublished data). Из этого следует, что дополнительные копии бтш70 D. virilis (бтш70с - g) образовались в ходе тандемных дупликаций. В ходе дивергенции видов D. virilis - D. lummei, по-видимому, произошла потеря части тандемно ориентированных копий и увеличение длины межгенных участков между ними. Возможным механизмом участия SGM в увеличении или уменьшении числа копий генов бтш70, а также увеличения расстояния между генами 6тш70 у D. lummei, может являться неравный кроссинговер и/или рекомбинация между гомологичными участками одной хромосомы.

Особи D. lummei с уменьшенным числом копий генов бтш70 и пониженной экспрессией БТШ70 не выбраковывались в ходе естественного отбора, так как, будучи

SGM

Предковая форма

D. virilis

D. lumn

Рис 27. Эволюция кластера генов у группы virilis.

обитателями климатических зон с умеренным климатом, не подвергались воздействию высоких температур. Эта гипотеза подтверждается наличием в 3'-фланкирующей последовательности генов 6mw70g D. virilis и 6mui70d D. lummei специфичной 24-нуклеотидной последовательности, не встречающейся в составе других генов. Возможно, гены 6mui70g D. virilis и 6miu70d D. lummei являются гомологами, и в ходе эволюции D. lummei были делетированы копии бтш70с -fD. virilis.

5. Роль мобильных элементов в эволюции генов бтшЮ

Одним из важных вопросов, привлекающих внимание исследователей, является анализ закономерностей эволюции семейства генов бтш70. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что при эволюции системы генов бтш70 могли происходить как изменения в числе копий бтш70, так и изменения в структуре самого кластера генов, как это было обнаружено у видов D. virilis и D. lummei. По-видимому, важную роль в этом процессе играет древний мобильный элемент SGM. Мобильные элементы (МЭ), встраиваясь в промоторную область генов, могут частично или полностью инактивировать соответствующие копии (Lerman et al., 2003), что приводит к изменению уровня экспрессии БТШ и терморезистентности организма. Некоторые исследования указывают на то, что МЭ неслучайно перемещаются по геному в процессе транспозиции (Евгеньев, 1998). Имеются данные, что гены бтш70, в особенности их регуляторные зоны, являются «горячими точками» при транспозиции МЭ, из-за конститутивно деконденсированного состояния хроматина таких районов ДНК (Karpov, 1984). Выявление преимущественных мест встраиваний и оценка влияния МЭ на функционирование генов бтиЛО позволяет изучить возможный путь эволюции основной защитной системы организмов, а также установить роль МЭ в процессах микроэволюции и адаптации.

Очередной задачей данного исследования была попытка ответить на вопрос -действительно ли промоторы генов бтшЮ являются «горячими точками» инсерций МЭ, и как такие встраивания влияют на терморезистентность. Для выполнения этой задачи, на модельной системе D. melanogaster, исследовали перемещение конструкции, созданной на основе Р элемента, в гены бтш70.

5.1. Получение инсерций конструкции на основе Р элемента в гены бтш70 методом Р-инсерционного мутагенеза. В данной работе была использована модель целенаправленного получения транспозиций конструкции EPgy2 на основе Р элемента в локус генов теплового шока, примененная при изучении малых генов ТШ (Timakov В., 2002), с некоторыми изменениями. Из коллекции центра (Bloomington Drosophila Stock Center) были получены две лабораторные линии D. melanogaster №15616 и №15904 (обозначенные

Саз 1211 ЛяшТОАа

1 kb

Рис. 28. Расположение исходной конструкции EPgy2 в линиях US-4 (в положении +243 относительно старта транскрипции гена CG12213) и US-2 (+33 относительно старта транскриции гена аиг) D. melanogaster. Стрелками указано направление транскрипции генов.

далее как US-4 и US-2), содержащие исходную конструкцию EPgy2 в локусе 87А на расстоянии 8 и 5 т.п.о., соответственно, от старта транскрипции гена 6mw70Ab (рис. 28).

Также была получена линия №1429 (обозначена далее как Д2-3), несущая ген транспозазы Р элемента.

В результате скрещиваний (Рис. 29) нами были выведены линии с перемещением конструкции. Для линий, полученных из US-4, общая частота перемещения конструкции составляет 7,5%, для линий US-2 - 4,9%. Некоторые инсерции конструкции в гены бтшЮ были переведены в гомозиготное состояние.

СтшПХЪ CG32S1 аиг

5' EPgy2 3'

CG 12213 CGI8347

rLS-2

3' EPgv2 5'

РО %% ук/ук;ЕРёу2/ЕРёу2 х +/У;ТМЗ,8Ъ А2-ЗЛ)ДЩС7

(линия иБ-2, №-4) \ (линия Д2-3)

И $ $ >> и>/у и» ^ х 66 У н</У;ЕР£У2/ТМЗ, А2-3

(линия П/(1)\и,у\у67г:з(2') ^ (мозаичные глаза)

индивидуальные скрещивания

Р2 $ $ .у к/у к 1 х ЗЗу»>/¥;ЕРю>2/+

(линия В/(1)-л\ул?7с:1,2)) (светло-желтая окраска глаз)

8вуп/У;ЕР&2*/+

усиленная окраска глаз (оранжевая или

ярко-красная) предположительно транспозиции ЕР§у2

дальнейшая индивидуальная проверка, и, в случае отсутствия расщепления по интенсивности окраски глаз, выведение гомозиготных линий

Рис. 29. Генетическая схема, использованная для получения локальных перемещений конструкции EPgy2. Знаком * отмечены самцы с дополнительными копиями EPgy2 в геноме.

5.2. Идентификация инсерцнй ЕР§у2 методом Саузерн-блот-анализа. Анализ проведенных скрещиваний позволил отобрать линии с дополнительными инсерциями ЕР%у2 в той же хромосоме, что и стартовый элемент. Для того чтобы определить, произошло ли встраивание ЕР&у2 в какую-либо из шести копий гена бтиЛО, был проведен Саузерн-анализ геномной ДНК трансгенных линий. При обработке геномной ДНК £>. melanogaster парой рестриктаз ВатННН'тсИИ образуется набор фрагментов разной величины, специфичный для разных копий гена бтш70 (рис. 30А, Б, В).

Использование данных рестриктаз и последующая гибридизация с зондами к 5' и 3' участкам гена бтиПО позволяет выявить изменения, происходящие со всеми копиями гена бтшЮ. Так как конструкция EPgy2 содержит на 5'- и З'-концах сайты для рестриктазы ШпеПИ, то появление инсерций в генах бтш70 в гетерозиготных линиях фиксировали как

4.3 т.п.о. ВЬЬ "3.3 т.п.о. ВЬ 6с

т ж- ж**т ■*•• «•* " — ж —25 ТПО-Аа

-2.1 т.п.о. Ва -1.8 т.п.о. АЬ

т ■»т • т * • ** - • * •

t ít í t

Aa.Ab Aa Aa Au

* ' ,

(38 т.п.о.)

.4.4 Be "4.3 АЬ, Bb

2.0 Aa, Ba

6mui70B 6mu/70 бтш 70

Рис. 30. А. Гибридизация с 5'-фрагментом гена 6тш70 D. melanogaster. Стрелками показаны линии, несущие инсерции EPg\>2 в разных копиях бтш70 (Аа и АЬ). Справа указан молекулярный вес фрагментов гибридизации, специфичных для разных копий бтиПО. Б. Гибридизация с 3'-фрагментом гена 6mui70 D. melanogaster. В. Схема сайтов рестрикции BaniHl/Hindlü генов бтиПО, расположенных в локусе 87А (6imu70 Аа , АЬ) и 87С (бтш70 Ва, Bbb, Bb, Be) (Gong, Golic, 2004); сайты рестриктаз йа/иН! и Hindlll обозначены серыми треугольниками.

появление низкомолекулярного дополнительного фрагмента гибридизации. При этом наблюдали уменьшение интенсивности гибридизации той копии гена бтшЮ, в которую произошло встраивание. При выведении линий в гомозиготное состояние, полностью исчезает фрагмент, соответствующий исходной копии гена, и увеличивается интенсивность гибридизации нового фрагмента с инсерцией EPgy2. Нами не было зафиксировано ни одного случая внедрения конструкции в 3'-кодирующий или фланкирующий участок бтш70 (рис. ЗОБ); все встраивания произошли в 5'-район генов бтшЮ, расположенных в локусе 87А -бтис70Аа и Ab.

Нами было зарегистрировано 31 встраивание EPgy2 в гены бтиПО из 375 локальных перемещений конструкции для линий, выведенных из US-4, и 14 инсерций для линий, полученных из US-2 (из 160 проанализированных локальных перемещений). 5.3. Точная локализация полученных инсерций EPgy2. С помощью Саузерн-анализа было выявлено, что все инсерции EPgy2 происходят в 5'-районы генов бтшЮ локуса 87А. Для точной локализации места встраивания были проведены полимеразные цепные реакции с разным набором праймеров с последующим секвенированированием полученных фрагментов. После серии ПЦР было доказано, что конструкция встраивается в регуляторную область бтшЮ. На рис. 31 приведен пример ПЦР для нескольких линий.

На дорожках 1 - 5 представлены результаты ПЦР для пяти разных трансгенных линий с праймерами из 5'-конца бтшЮ (№2) и из З'-конца EPgy2 (№7). Разный размер синтезированных фрагментов свидетельствует о разных местах встраивания.

123456789 10 11 М

Рис. 31. Локализация инсерций и ориентации конструкции EPgy2 методом ПЦР. А. ПЦР с праймерами: 2-7: 1 - линия ЗШа, 2 - Slid, 3-11 Ша, 4 - Ша, 5 - 1341b; с праймерами 2-6: 6 - Ша; с праймерами к Р элементу и гену аиг для идентификации исходной конструкции: 7-31 На, В - 5Hd, 9 -11 Ша, 10 - lila, 11 - 1341b. Б. Схематическое изображение встраивания EPgy2 в промоторную область гена бтшЮАа и праймеров, использованых для локализации инсерции.

Саузерн-анализ показал, что инсерции EPgy2 происходят в 5'-регуляторную зону генов бтшЮ Аа и АЬ. Для подтверждения транспозиции в ту или иную копию гена бтш70 были поставлены ПЦР с праймерами из 5'-кодирующей части бтшЮ наружу (последовательность идентична для обеих копий гена бтшЮ Аа и АЬ) и праймерами из 5' и З'-участков EPgy2 (№6 и 7). Соответственно, синтезировались фрагменты размером ~ 2.5 и 0.5 т.п.о. В качестве примера приведена картина ПЦР для линии lila (на рис. 31А дорожки 4, 6). Секвенирование показало, что фрагмент размером 2.5 т.п.о. соответствует межгенному участку, примыкающему к гену бтиЛОАЬ (см. схему на рис. 31 Б). Таким образом, инсерция в линию Ша произошла в регуляторный район гена бтиЛОАа.

,87% 5 г—*» з

i бтшЮАаТ бтшЮАЬ^. ^^

í>

US-4

13%

исходная конструкция

EPgy2

от

57% 5<= 3

mu 70А 6miu7(L

US-2 43%

исходная конструкция EPgy2

-I4ÍÍ37 -1(5) -Е

-56(5)

-229 -200

-135(4) -97(3)

Рис, 32. Результаты анализа трансгенных линий. А. Процент встраивания конструкции EPgy2 в гены бтиПОКа и бтиЛОАЪ в трансгенных линиях, полученных из US-4 (слева) и US-2 (справа); Б. Сайты инсерций EPgy2 в генах бтиЛО (суммарно для бтш70Аа и бтиЛОАЪ) для линий, полученных из US-4; цифрами указан нуклеотид, выше которого произошло встраивание (относительно старта транскрипции гена бтш10)\ в скобках указано число зафиксированных инсерций в данный сайт. В. Аналогичные результаты для линий, выведенных из US-2. Условные обозначения: Т - ТАТА-бокс, Н - HSE (heat shock element), G - сайт для связывания GAF (GAGA-factor).

ПЦР-анализ с праймерами из инвертированного повтора конструкции и из гена бтгиЮ, направленными внутрь и наружу гена, показал, что ни в одном случае не произошло инсерций в кодирующую и З'-фланкирующую области генов бтшЮ.

Результаты анализа трансгенных линий, полученных из US-4 и US-2, показали, что во всех случаях транспозиции EPgy2 происходят с переворотом по отношению к стартовому элементу (рис. 32), в промоторную область генов бтш70 между -28 и -240 п.о. выше старта транскрипции. Проведенный анализ выявил «горячие точки» встраиваний EPgy2: 59% всех инсерций для US-4 и 40% для US-2 происходят в одну и ту же область промотора -96 и -97 п.о. от старта транскрипции. Результаты по локализации инсерций EPgy2 в гены бтшЮ трансгенных линий представлены в таблице 3.

Встраивание EPgy2 исключительно в 5'-область генов бтиЛй можно объяснить свойствами Р элемента и особой организацией промоторной области генов теплового шока (Nacheva, 1989). Из литературы известно, что предпочтительным местом встраивания Р элемента являются регуляторные области генов (Spradling, 1995), преимущественно несколько сотен п.о. от старта транскрипции генов (Liao, 2000).

Промоторные районы генов бтиЛО обладают рядом свойств, делающих их уязвимыми для инсерций: в них отсутствует нуклеосомная организация и хроматин находится в деконденсированном состоянии. «Горячие точки» встраивания EPgy2, нуклеотиды -96, -97 выше старта транскрипции генов бтиЛО, также располагаются в особой области промотора.

In vivo, ДНК промоторных областей бтшЮ находится в связанном состоянии со многими белками (GAF, TBF и др.), поддерживающими «открытую» структуру хроматина. Белки GAF способны взаимодействовать друг с другом таким образом, что ДНК оборачивается вокруг нескольких GAF (Georgel, 2005), при этом определенные участки ДНК оказываются «открытыми». Нуклеотиды -96, -97 находятся в центре такого участка ДНК (с -80 по -111 п.о.), образованного GAF. Также известно, что Р элемент предпочтительно встраивается в районы ДНК с повышенным содержанием CG-пар (Liao, 2000). Нами был выявлен 8-нуклеотидный сайт дупликации в месте инсерций EPgy2: CGGCGCAC при транспозиции в положение -97 выше сайта инициации транскрипции и GGCGCACT при транспозиции в положение -96. Таким образом, предпочтительное встраивание EPgy2 в 5'-область бтшЮ и наличие «горячих» сайтов инсерций можно объяснить совокупностью многих факторов.

Большинство инсерций EPgy2 в промоторные области единичны; мы зафиксировали лишь два случая двойного встраивания - в линиях al981 и ЗОИЬ. В обоих случаях двойное встраивание выявлено по результатам Саузерн-гибридизации. Методами ПЦР и

Таблица 3. Сводная таблица локализации сайтов инсерций ЕР%у2 в гены бтшЮ трансгенных линий, выведенных из исходных линий 118-4 и 115-2 (а). Знаком * обозначены линии с перестройками геномной ДНК.

Локализация инсерций ген линия

EPgy2 относительно

старта транскрипции

-28 Аа 1341b

-40 Аа 288I(a, Ь, с, d, e,k), «19611

-42 Аа 1861b, 3091b

-96 Аа 481a, 611b, 105Ig, 1771, al48IIa

-96 АЬ a79Ia, al98I

-96 Аа,АЬ 3011b

-97 Аа lIIa,5IId,861, 11111a, 1631a, 169Ig, 1791,2531a, 2551a, 2841a, ct9Ib,al38IIa

-97 АЬ 332II*, 33211b*, a34I,

-135 Аа 3111a, 1231a, 2461, 258II, al96Ia, a250Ia

-135 АЬ a2001, a2271

-137 АЬ 310II

-144 Аа 3691

-160 Аа al98I

-174 АЬ 37711

-200 Аа a331b

-229 Аа a211b*

-230 не определен 9911a*

-240 Аа 6011a*

не определена Аа 1211*, 1841*

не определена не определен 21a*, 2441a*, al20I*,al21I*

секвенирования полученных фрагментов было установлено, что в линии al 981 произошли внедрения EPgy2 в разные места 5'-регуляторных районов генов бтшЮ (-160 п.о. гена Аа и -96 гена АЬ). В линии ЗОИЬ инсерции были зафиксированы выше -96 п.о. от старта транскрипции генов бтиЛОАа и АЬ.

Получение гомозиготной линии ЗОПЬ давало возможность исследовать влияние большой вставки (20 т.п.о.) на морфологию пуфа, образующегося в локусе 87А. Особое расположение генов бтшЮКа и АЬ в виде сближенных инвертированных копий важно для быстрого начала транскрипции этих генов в условиях ТШ, поэтому увеличение расстояния между генами может влиять на характер функционирования генов бтиЛО и вызывать изменение морфологии пуфа. По результатам иммунофлуоресцентного окрашивания хромосом (совместно с С. Г. Георгиевой), было установлено, что при активации транскрипции генов ТШ происходит изменение структуры пуфа в локусе 87А линии ЗОПЬ по сравнению с линией Oregon R. В контрольной линии две инвертированные копии гена б/гаи70, расположенные в локусе 87А, при ТШ образуют одиночный пуф, в линии ЗОНЬ этот

пуф становится двойным (рисунок не приводится), т.о. происходит физическое отдаление двух копий гена бтшЮ локуса 87А друг от друга, что может затруднять координированную регуляцию транскрипции этих генов.

5.4. Влияние инсерций EPgy2 на уровень транскрипции бтшИ). Инсерции МЭ могут по-разному влиять на экспрессию генов. Из экспериментальных работ (Lerman, 2003; Lerman, 2005; Michalak, 2001) известно, что в природе встречаются популяции Drosophila, содержащие инсерции МЭ в промоторных областях генов бтиЛО. Эти инсерции нарушают нормальное функционирование тех копий генов бтиЛО, в которые произошло встраивание. Представлялось интересным оценить влияние встраиваний EPgy2 в гены бтшЮ на уровень транскрипции этих генов.

В результате проведенной Нозерн-гибридизации нами было зафиксировано снижение уровня синтеза тотальной мРНК бтшЮ в гомозиготных трансгенных линиях ЗОНЬ (двойное встраивание в гены Аа и Ab в положение -96), 1341b (встраивание в положение -28 в район ТАТА-бокса), по сравнению с контрольной линией US-4.

Снижение уровня синтеза РНК в трансгенных линиях было подтверждено методом количественного ПЦР в реальном времени (quantitative real time PCR) с праймерами, позволяющими различить группу генов бтшЮА и бтшЮВ (рис. 33). На рис. ЗЗА приведена картина экспрессии генов бтиЛОА после 30 мин ТШ 37°С и 30 мин восстановительного периода при температуре 25°С, нормализованных относительно рибосомального гена гр49. Этот эксперимент позволил выявить зависимость снижения синтеза мРНК от места встраивания (рис. 33). У D. melanogaster в регуляторной области генов бтшЮ содержится 4 копии HSE (Jachansan, 1987). Мутации, затрагивающие HSE, или встраивания между этими элементами, особенно между HSE1 и HSE2, могут существенно снижать уровень транскрипции гена. Нами было показано, что при инсерции EPgy2 в район ТАТА-бокса (положение -28) уровень транскрипции двух генов локуса 87А, бтиЛО Аа и Ab, составляет лишь 44%, по сравнению с контрольной линией (уровень синтеза мРНК в линии US-4 принят за 100%); при инсерции в район -42 эти гены функционируют только на 51%; при двойном встраивании в положение -96 (линия ЗОПЬ) - на 52%.

Согласно полученным данным, можно предположить, что при встраивании EPgy2 в ТАТА-бокс (положение -28) и в положение -42 (между ТАТА-боксом и HSE1) один из генов группы бтиЛОА перестает транскрибироваться; при двойном встраивании, вероятно, существенно нарушается транскрибирование обеих копий гена бтшЮ. При инсерциях в область -134 и -144 п.о. от старта транскрипции уровень синтеза РНК составляет, соответственно 81 и 97%. Таким образом, чем ближе к старту транскрипции происходит встраивание, тем существеннее снижение уровня синтеза РНК генов бтшЮ.

А.

относительное количество мРНК бтшЮА

US-4 1341b 1861b 3011b lila ШИа a34I 332II 1231a 310II

81% 71% 57% 51% 44%

-240 -174 -137-135 -97

-42 -28

j * Ii i,_,,_.ulf*

HSE4 —— HSE3 HSE2 . HSE1 — TATA J_

HSE4 HSE3

-144 -96

-40

97%

Рис. 33. А. Относительная экспрессия генов бтиЛЪк (Аа и Ab) в трансгенных линиях (по оси ординат), определенная методом количественного ПЦР в реальном времени. В качестве контроля представлена линия US-4. РНК была выделена после ТШ (37°С 30 мин) и последующего периода восстановления (25°С 30 мин). Б. Уровень синтеза мРНК бтш70А у трансгенных линий относительно контрольной линии US-4 (принят за 100%). Цифрами указан нуклеотид относительно старта транскрипции гена бтиЛО, выше которого произошло встраивание.

5.5. Анализ синтеза БТШ70 в трансгенных линиях. Влияние инсерций EPgy2 на уровень трансляции генов бтиЛО в трансгенных линиях было оценено по результатам одномерного и двумерного электрофореза белков.

Количественная оценка накопления индуцибельного БТШ70 после ТШ была получена с помощью иммуноблоттинга с 7FB антителами. Результаты для некоторых трансгенных

Рис. 34. Количественный анализ накопления БТШ70 в линиях с инсерциями ЕР%у2 в гены бтиЛО. Относительная концентрация БТШ70 (ось ординат) в трансгенных линиях: А - сразу после ТШ (37°С 30 мин) и Б - через 30 мин после ТШ.

линий представлены на рис. 34. После ТШ 30 мин при температуре 37°С в линиях ЗОПЬ и 134ГЬ наблюдается более низкий уровень индукции БТШ70 по сравнению с 1)8-4. После получасового периода восстановления разница в уровне синтеза БТШ70 между линиями становится меньше.

Проведенный анализ показал снижение уровня трансляции бтшЮ, что согласуется с пониженным уровнем индукции мРНК бтшЮ в трансгенных линиях, по сравнению с контрольной. Несмотря на снижение уровня синтеза мРНК и белка БТШ70, вследствие внедрения ЕР&у2, термоустойчивость трансгенных линий существенно не меняется. 5.6. Определение плодовитости потомства трансгенных линий. Инсерции мобильных элементов по-разному проявляются на .уровне целого организма. Известно, что они могут влиять на одно из самых важных свойств всех живых существ - способность давать плодовитое потомство. Поскольку данное свойство является одним из главных факторов действия естественного отбора, представляло интерес оценить последствия внедрения ЕР^у2 на фертильность трансгенных линий. Эксперимент по оценке плодовитости потомства был проведен на гомозиготных трансгенных линиях (рис. 35).

В эксперимент были отобраны мухи, находящиеся на одной и той же стадии развития, четырех трансгенных линий ЗОПЬ, 111 Па, 1341Ь, 3691 (с инсерциями ЕР^2 соответственно в положения -96 генов бтш70 Аа и АЬ; -97 бтш70Аа; -28 б/да/70Аа; -144 бтиЛО Аа) и линии 118-4 (контроль). Ставили серии индивидуальных скрещиваний (одна самка х два самца) и исследовали фертильность мух трех-, шести- и девятидневного возраста. Были проведены исследования репродуктивной способности самок в нестрессовых условиях (постоянное развитие при 25°С) и самок, перенесших тепловой шок (в этом случае девственные самки были подвергнуты ТШ при температуре 37°С в течение 30 мин и скрещены с нестрессированными самцами). Подсчет потомства проводился после вылупления всех куколок (рис. 35). Было показано, что у самок с инсерцией EPgy2 в промотор гена бтш70 после ТШ увеличивалось число потомков, а у контрольной линии - снижалось.

4-6 7-9 10-12

US-4 3631 111 MUb 1341b US-4 J69I 111 3«lb 1341b ÜS-4 3 691 111 3011b 1341b IIa IIa IIa

Рис. 35. Определение фертипьности трансгенных линий. Столбиками обозначено число потомков трансгенных линий от индивидуальных скрещиваний после 4 - 6; 7 — 9; 10-12 дней после вылупления. Белые столбики - потомство от нестрессированных самок, темные от самок после ТШ. Для каждой линии было поставлено 12 независимых скрещиваний; проведен подсчет потомства и статистическая обработка.

Таким образом, эти линии могут иметь преимущество в размножении в условиях незначительных температурных перепадов. В работе (Lerman et al., 2003) было обнаружено, что природные линии с инсерцией Р элемента в промоторную область гена бтш70Ва, более плодовиты, чем линии без инсерций. В работе (Walser, 2006) обнаружили преимущественное встраивание Р элемента в промоторную область именно генов теплового шока на примере 48 естественных популяций. Так как большинство генов бтш мультикопийно, то встраивание Р элемента в отдельные промоторы генов бтш, и незначительное снижение уровня их экспрессии в условиях отсутствия резких перепадов температур может быть эволюционно выгодным. Дальнейший естественный отбор на термоустойчивость может приводить к появлению линий типа Termotolerance. Таким образом, МЭ, вероятно, играют важную роль в эволюции адаптации организмов к условиям их обитания.

Выводы:

1. Молекулярные механизмы адаптации к условиям обитания значительно различаются у разных организмов и связаны с уровнем БТШ70 в клетках при нормальных условиях и тепловом шоке. Экспрессия БТШ70 у разных видов может определяться:

а) на уровне регуляции транскрипции;

б) числом копий гена бтш70;

в) встраиванием в промоторную область генов бтш70 мобильных элементов.

2. Основным молекулярным механизмом, обеспечивающим термоустойчивость пустынных видов ящериц, является повышенная экспрессия БТШ70 при нормальных условиях. У северных видов при нормальных условиях синтез БТШ70 отсутствует. Уровень БТШ70 у пустынных организмов претерпевает значительные колебания в течение суток, коррелируя с изменениями температуры окружающей среды и тела животного.

3. Повышенная экспрессия БТШ70 у термофильных ящериц контролируется на уровне транскрипции и обусловлена присутствием активной формы Н8Б, связанной с промотором в нормальных условиях.

4. На примере культур первичных фибробластов, полученных из кожи коренных жителей Туркменистана и России, впервые выявлены различия в термоустойчивости клеток у теплокровных.

5. На примере видов Вго^орШа выявлены сложные взаимоотношения между уровнем синтеза БТШ и термотолерантностью. Показана положительная корреляция между уровнем синтеза БТШ70 и термоустойчивостью у различных географических линий и видов йговорЫ1а группы ип&, однако при сравнении видов, принадлежащих к разным группам рода ПгояоркИа, такой корреляции не наблюдается.

6. Показано наличие индивидуального спектра изоформ БТШ70 у всех изученных линий и видов ОгозорИНа. Показано, что у термоустойчивых видов более интенсивно экспрессируются низкомолекулярные БТШ и БТШ40, по сравнению с термочувствительными, при жестком температурном воздействии.

7. Подробно изучена структура и функционирование системы генов ТШ у нескольких видов £)«мор/н/я группы г/п/й:

а) обнаружены различия как в строении самого кластера генов, так и в числе генов бтш70 у видов и линий данной группы. Показано, что линии термофильного южного вида О. умНз имеют больше копий бтш70, чем линии северного филогенетически близкого вида £>. 1итте1, что может иметь адаптивное значение;

б) у всех копий генов бтш70 видов группы virilis в 3'-фланкирующей последовательности обнаружен древний МЭ 5СМ. На основании этих результатов предложена модель, объясняющая адаптивные изменения числа копий генов бтш70 у видов группы \>/У/7й.

8. Промоторная область генов 6тш70 й. melanogaster имеет особую структуру, которая определяет преимущественное встраивание Р элемента в определенные участки промотора. Показано, что МЭ играют важную роль в функционировании и эволюции генов бтш70 у различных видов рода йгозорЬИа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Lyashko VN, Vikulova VK, Chernicov VG, Ivanov VI, Ulmasov KA, Zatsepina OG, Evgen'ev MB. Comparison of the heat shock response in ethnically and ecologically different human populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. 91 (26): 12492 - 5.

2) Ульмасов X.A., Зацепина О.Г., Рыбцов C.A., Джумагельдыев Б.Т., Евгеньев М.Б. Некоторые аспекты состояния компонентов системы теплового шока у ящериц различных экологических ниш. Известия АН. Серия биологическая. 1997. 2: 133 -44.

3) Ulmasov KA, Zatsepina OG, Molodtsov VB, Evgen'ev MB. Natural body temperature and kinetics of heat-shock protein synthesis in the toad-headed agamid lizard Phrynocephalus interscapularis. Amphibia-Reptilia. 1999.20: 1 -9.

4) Zatsepina OG, Ulmasov KA, Beresten SF, Molodtsov VB, Rybtsov SA, Evgen'ev MB. Thermotolerant desert lizards characteristically differ in terms of heat-shock system regulation. J. Exp. Biol. 2000. 203 (6): 1017-25.

5) Zatsepina OG, Velikodvorskaia VV, Molodtsov VB, Garbuz D, Lerman DN, Bettencourt BR, Feder ME and Evgenev MB. A Drosophila melanogaster strain from sub-equatorial Africa has exceptional thermotolerance but decreased Hsp70 expression. The J. Exp. Biol. 2001. 204: 1869 -81.

6) Молодцов В. Б., Великодворская В. В., Гарбуз Д. Г, Зацепина О. Г., Евгеньев М. Б. Анализ экспрессии белков теплового шока и терморезистентной линии Drosophila melanogaster. Известия Академии наук, Серия биологическая, 2001. 5: 522 - 32.

7) Гарбуз Д. Г., Молодцов В. Б., Великодворская В. В., Зацепина О. Г., Евгеньев М. Б. Эволюция ответа на тепловой шок внутри рода Drosophila. Генетика, 2002. 38 (8): 1097 - 109.

8) Garbuz DG, Zatsepina OG, Feder ME, Evgen'ev MB. Evolution of termotolerance and the heat-shock response: evidence from inter/intra specific comparison and interspecific hybridization in the Drosophila virilis species group. I/ Thermal phenotype. J. Exp. Biol. 2003. 206: 2399-408.

9) Michael B. Evgen'ev, Martin E. Feder, David Garbuz, Daniel Lerman, Vera Velikodvorskaia and Olga G. Zatsepina. Evolution of Thermotolerance and Heat-Shock Response in the virilis Species Group of Drosophila. Biology International. 2004. 46: 49 - 51.

10) Evgenev MB, Zatsepina OG, Garbuz DG, Lerman DN, Velikodvorskaia VV, Zelentsova ES, Feder ME. Evolution and arrangement of the hsp70 gene cluster in two closely related species of the virilis group of Drosophila. Chromosoma. 2004. 113 (5): 223 - 32.

11) Zatsepina OG, Garbuz DG, Shilova V, Karavanov AA, Tornatore P, Evgen'ev MB. Use of surface-enhanced laser desorption ionization - time-of-flight to identify heat shock protein 70 isoforms in closely related species of the virilis group of Drosophila. Cell Stress and Chaperones. 2005. 10(1): 12-6.

12) Евгеньев M. Б., Гарбуз Д. Г., Зацепина О. Г. Белки теплового шока: функции и роль в адаптации к гипертермии. Онтогенез. 2005. 36 (4): 267 - 75.

13) Шилова В. Ю., Гарбуз Д. Г., Евгеньев М. Б., Зацепина О. Г. Низкомолекулярные белки теплового шока и адаптация к гипертермии у видов Drosophila. Молекулярная биология. 2006. 40 (2): 271 -6.

14) Victoria Y. Shilova, David G. Garbuz, Elena N. Myasniankina, Bing Chen, Michael B. Evgen'ev, Martin E. Feder, and Olga G. Zatsepina. Remarkable Site Specificity of Local Transposition into the hsp70 Promoter of Drosophila melanogaster. Genetics. 2006. 173: 809 - 20.

15) Evgen'ev M. B, Garbuz D. G., Shilova V.Y. and Zatsepina O. G. Molecular mechanisms underlying thermal adaptation of xeric animals. J. Biosci. 2007. 32 (3): 489 - 99.

16) Savvateeva-Popova E, Popov A, Grossman A, Nikitina E, Medvedeva A, Peresleni A, Korochkin L, Мое JG, Davidowitz E, Pyatkov K, Myasnyankina E, Zatsepina O, Schostak N, Zelentsova E, Evgen'ev M. Pathogenic chaperone-like RNA induces congophilic aggregates and facilitates neurodegeneration in Drosophila. Cell Stress Chaperones. 2007, 12 (1): 9 - 19.

17) Шилова В. Ю., Гарбуз Д. Г., Мяснянкина Е. Н., Евгеньев М. Б., Зеленцова Е. С., Зацепина О. Г. Качественный и количественный анализ транспозиций генетической конструкции на основе Р элемента в область генов бтш70 Drosophila melanogaster. Генетика, 2007.43 (12): 1333-43.

18) Bing Chen, V. Yu. Shilova, О. G. Zatsepina, M. B. Evgen'ev, M. E. Feder. Location of P element insertions in the proximal promoter region of Hsp70A is consequential for gene expression and fecundity in Drosophila melanogaster. Cell Stress Chaperones. 2008. 13 (1): 11-7.

19) Гарбуз Д.Г., Юшенова И.А., Евгеньев М.Б., Зацепина О.Г. Сравнительный анализ структуры кластера генов hsp70 у видов Drosophila группы virilis. Молекулярная биология. 2009.43 (1): 44-52.

Заказ № 103-а/09/09 Подписано в печать 16.09.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2.5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таИ:'т/о@с/г.т

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Зацепина, Ольга Георгиевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ б

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика ответа клеток и организмов на ТТТТ

1.2. Классификация и функции БТШ

1.3. Структура и эволюция генов ТШ

1.4. Регуляция экспрессии генов ТЩ

1.5. Роль белков ТШ в адаптации к условиям внешней среды и эволюции

1.6. Изучение роли БТШ в термальной адаптации на модели Drosophila

1.7. Экспрессия генов при изменении условий окружающей среды

1.8. БТШ в медицине

1.9. Мобильные элементы как возможный фактор эволюции генов ТШ 57 1.9.1. Особенности Р элемента и его использование в инсерционном мутагенезе

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Виды ящериц

2.1.2. Линии и виды Drosophila

2.1.3. Штаммы Е. Coli

2.1.4. Клоны бтш 70 D. Melanogaster

2.1.5. Ферменты рестрикции

2.1.6. Олигонуклеотиды для анализа связывания факторов транскрипции с элементами ТШ

2.1.7. Антитела

2.2. Методы

2.2.1. Условия содержания дрозофилы

2.2.2. Условия теплового шока

2.2.3. Определение базальной и индуцируемой термоустойчивости

2.2.4. Включение S-метионинав белки

2.2.5. Подсчёт общего включения 358-метионина в белки

2.2.6. Диск-электрофорез белков с ДДС-Na (по Лэммли)

2.2.7. Двумерный электрофорез белков по О'Фарреллу

2.2.8. Иммуноблоттинг

2.2.9. Иммунопреципитация

2.2.10. Очистка белков методом препаративного электрофореза

2.2.11. Обработка белка модифицированным трипсином для построения пептидных карт

2.2.12. Анализ связывания факторов транскрипции с элементами ТШ

2.2.13. Включение радиоактивной метки в ДНК

2.2.14. Выделение геномной ДНК

2.2.15. Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами

2.2.16. Электрофорез ДНК

2.2.17. Перенос и гибридизация по Саузерну

2.2.18. Определение числа копий гена по Саузерну

2.2.19. Выделение тотальной РНК

2.2.20. Электрофорез РНК

2.2.21. Нозерн-гибридизация

2.2.22. Получение геномных фаговых библиотек

2.2.23. Скрининг фаговых геномных библиотек

2.2.24. Выделение ДНК бактериофага X

2.2.25. Построение рестриктных карт рекомбинантных фагов

2.2.26. Выделение фрагментов ДНК

2.2.27. Клонирование фрагментов ДНК

2.2.28. Трансформация компетентных клеток

2.2.29. Выделение плазмидной ДНК

2.2.30. Модель генетического анализа

2.2.31. Определение фертильности трансгенных мух

2.2.32. Иммунофлуоресцентное окрашивание транскрипционных факторов

2.2.33. ПЦР-анализ

2.2.34. Секвенирование ДНК

2.2.35. Количественный ПЦР-анализ в реальном времени (qRT-PCR)

2.2.36. Статистическая обработка данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Изучение молекулярных механизмов адаптации у холоднокровных животных из контрастных по температуре обитания экологических ниш

3.1.1. Экспрессия БТШ70 и HSF у ящериц

3.1.2. Исследование комплексов факторов транскрипции с элементами теплового шока

3.2. Синтез БТШ у народов, населяющих пустыни и области с умеренным климатом

3.3. Внутривидовые различия по термоустойчивости на примере

Drosophila melanogaster

3.3.1. Сравнение линий по термоустойчивости

3.3.2. Сравнение уровня-экспрессии БТШ

3.3.3. Анализ геномной ДНК линий ТТ и OR

3.3.4. Анализ синтеза белков при тепловом шоке

3.4. Сравнительный анализ структуры и экспрессии генов бтш70 у видов филады virilis, с различной термальной адаптацией

3.4.1. Изучениетермоустойчивости

3.4.2. Определение индуцируемой термоустойчивости у видов и линий группы virilis

3.4.3. Определение термоустойчивости реципрокных гибридов

D. virilis и D. lummei

3.4.4. Изучение общего белкового синтеза при ТШ у D. virilis и D. lummei

3.4.5. Накопление БТШ70 при тепловом шоке

3.4.6. Определение кинетики индукции мРНК БТШ70 '

3.4.7. Исследование ДНК-связывающей активности HSF

3.4.8. Анализ спектра изоформ БТШ

3.4.9. Изучение паттерна других групп БТШ, индуцируемых тепловым шоком у видов группы virilis

3.4.10. Вклад нмБТШ в термоустойчивость

3.4.11. Анализ структуры кластера генов бтш70 D. virilis и D. lummei

3.4.12. Определение числа копий гена бтш70 у разных линий D. virilis и D. lummei

3.4.13. In situ гибридизация с политенными хромосомами D. virilis и D. lummei

3.4.14. Определение структуры кластера генов бтш70 D. virilis и D. lummei на основе рекомбинантных фагов X 126 3.4.15. Определение нуклеотидной последовательности генов бтш70 и прилежащих участков D. lummei и D. virilis и D. montana

3.5. Роль мобильных элементов в эволюции генов бтш

3.5.1. Получение инсерций конструкции на основе Р элемента в гены бтш!О методом /'-инссрционного мутагенеза

3.5.2. Идентификация инсерций EPgy2 методом Саузерн-блот анализа 137 3.5.3 Точная локализация полученных инсерций EPgy

3.5.4. Влияние инсерций EPgy2 на уровень транскрипции бтш

3.5.5. Анализ синтеза БТШ70 в трансгенных линиях

3.5.6. Анализ инсерций EPgy2, сопровождающихся перестройками геномной ДНК

3.5.7. Базальная и индуцированная термоустойчивость трансгенных линий

3.5.8. Определение плодовитости потомства трансгенных линий 155 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 15 8 Выводы 172 Список литературы по теме диссертации 174 Список литературы

Список используемых сокращений а. о.

БТШ (HSP)

ДДС-Na кБТШ (HSC) proteins) т.п.о.

Трис (Tris)

HEPES аминокислотных остатков аденоз интриф осфат аденозиндифосфат бляшкообразующая единица бычий сывороточный альбумин белки теплового шока (heat shock proteins) дитиотреитол додецилсульфат натрия конститутивные белки теплового шока (cognate heat shock интерлейкин мобильные элементы пара оснований тысяча пар оснований Трис(гидроксиметил)аминометан тепловой шок фактор некроза опухолей циклоаденозинмонофосфат этилендиаминтетрауксусная кислота эндоплазаматический ретикулум immunoglobulin heavy chain-binding protein glucose-regulated protein constitutive HSE binding factor c-jun N-terminal kinase

N-2-гидроксиэтилпиперазин-М'-2-этилсерная кислота heat shock element heat shock factor mitogen-activated protein kinase

Oregon R

Termotolerance

PCR polymerase chain reaction

SAPK stress-aktivated protein kinase

TAF transcription activation factor

TBP TATA-binding protein

TEMED N,N,N' ,N' -тетраметилэтилендиамид

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям обитания"

Повышенная температура^ или тепловой шок (ТШ) при воздействии на все известные организмы, от бактерии до человека, активирует гены теплового шока, представляющие собой эффективную защитную систему как на клеточном уровне, так и на уровне целого организма. Гены теплового шока кодируют специфические белки (БТШ). Активация специфических районов хромосом в ответ на воздействие теплового шока впервые была описана на дрозофиле в 1962 году (Ritossa, 1962).

Автор открытия обнаружил и описал появление-активно транскрибирующихся, пуфирующих районов политенных хромосом слюнных желез дрозофилы в ответ на тепловой шок (ТШ). Белки, кодируемые генами ТШ, были описаны существенно позднее - в 1974 году (Tissieres et аГ., 1974).

Гены ТШ и их продукты.сразу стали объектом пристального исследования. Стало понятно, что БТШ индуцируются' не только теплом, но и целым рядом- других повреждающих факторов как физического, так и химического происхождения (высокая температура, радиация, тяжелые металлы, пестициды, гипоксия, повышенная соленость, алкоголь, инфекции и т.д.)

Система генов ТШ очень быстро реагирует на внешний стимул. Быстрая индукция генов ТШ во многом связана с особенностями регуляции их транскрипции (Schirmer, 1996). В 5'-участке регуляторной области всех генов ТШ расположены, определенные последовательности «HSE» (Heat Shock Elements). С этими простыми последовательностями связывается белковый фактор, названный < фактором транскрипции генов ТШ-HSF (Heat Shock Factor), активируемый при стрессе.

Гены ТШ и их продукты высоко консервативны: аминокислотные вариации в кодирующих районах у разных видов весьма незначительны. Наиболее консервативным является ген, кодирующий белок с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70). Аминокислотные последовательности у человека и Е. coli гомологичны на 50%, а ряд доменов - на 96% (Schlesinger, 1990). Такой консерватизм БТШ у всех изученных организмов считается свидетельством об исключительно важной роли этих белков в защите клеток от повреждений во время и после стресса (Lidquist, 1986; Feder, Hoffman, 1999).

Основная функция БТШ при стрессе - предотвращение агрегации и восстановление нативной третичной структуры денатурированных белков, концентрация которых резко увеличивается- при повышении температуры. Было показано, что БТШ70 неспецифически взаимодействуют с гидрофобными участками ' денатурированных белков, способствуя восстановлению нормальной вторичной и третичной структуры (Fink, 1999; Hartl, Hayer-Hartl, 2002).

С момента открытия4 БТШ< были подробно исследованыих структура и функции, а также молекулярные механизмы их экспрессии. Вначале, исследования в основном проводили на клеточном уровне. Вопрос об участии БТШ70 в адаптации на уровне целого организма в течение длительного времени оставался малоизученным.

Адаптация организма .к неблагоприятным условиям, обусловливается чрезвычайно широким спектром механизмов. Прежде всего это поведенческие реакции, а также различные физиологические- и молекулярно-биологические механизмы адаптации, выработанные в течение длительной эволюции. Исследования роли БТШ в адаптации организмов к определенным условиям' обитания4 стало возможным после описания в 70-х гг. молекулярно-генетических процессов, вызываемых ТШ. С учетом этих открытий в лаборатории М. Б. Евгеньева были предложены' принципиально* новые подходы изучения механизмов- адаптации- различных организмов к экстремальным условиям обитания.

Основное внимание в исследованиях было сконцентрировано на молекулярных механизмах адаптации организмов и возможной роли БТШ в этом процессе в разных географических популяциях одного и того же вида, а также у близких видов, живущих в условиях, резко отличающихся по средней температуре обитания. Такой подход дает возможность исследовать не только молекулярно-физиологические функции БТШ при стрессе, но и понять их значение в экологии, адаптации и эволюции популяций.

Первые работы такого плана были выполнены в России на различных видах шелкопряда, и на девяти видах ящериц, отличающихся по температуре обитания (Шейнкер и др:, 1987; Ulmasov et al., 1992). В этих исследованиях были обнаружены различия в уровне синтеза БТШ70 у разных видов, в зависимости от температуры района их обитания. Однако в то время было неясно, какие механизмы регуляции экспрессии БТШ лежат в основе этих различий.

Не было известно, имеются ли какие-нибудь различия в ответе на ТШ у теплокровных организмов, тысячелетиями проживавших в контрастных по температурному режиму районах (например, пустыни Средней Азии и северные районы России).

Основным механизмом термоустойчивости у пустынных видов ящериц (Ulmasov et al., 1992) и муравьев (Gehring, Wehner, 1995) является, по-видимому, конститутивный синтез БТШ в нормальных условиях, обусловливающий готовность организма пережить резкий подъем температуры. С другой- стороны, у некоторых организмов, например, у мух рода Drosophila, синтез БТШ70 в норме полностью репрессирован. Было актуально узнать, существует ли взаимосвязь между уровнем индукции БТШ70 и термоустойчивостью у разных видов мух рода Drosophila. Важно было выяснить, какие молекулярные механизмы лежат в, основе вариабельности уровня индукции БТШ70, обеспечивающей адаптацию мух и других организмов.к различным условиям обитания.

Устройство кластера генов 6tmu70 у D. melanogaster хорошо изучено, известна также, и структура промоторной области генов бтш у этого вида. Было интересно провести-сравнительный анализ локуса генов бтш70 у видов Drosophila группы virilis, отделённых от группы melanogaster десятками миллионов лет эволюции. Следовало также выяснить, имеются ли* различия в устройстве кластера генов бтш70 и внутри самой группы virilis, у контрастных по температуре обитания видов, таких как D: virilis и D. lummei. Такого плана исследования могут прояснить пути эволюции и адаптации у родственных видов, обитающих в разных температурных нишах.

В последние десятилетия? накоплено' много фактов, говорящих о важной роли мобильных генетических элементов*(МЭ) в адаптации и эволюции самых разных видов животных. Однако возможный вклад МЭ в адаптацию видов к определенным температурным режимам обитания* не был изучен. Встраивание МЭ в регуляторную область генов бтш может иметь весьма важные последствия, способные повлиять на тонкие механизмы регуляции и эволюции этой важнейшей адаптационной системы. Соответственно, актуальность изучения закономерностей встраивания МЭ' в промоторную область генов бтш, и влияние таких встраиваний на термоустойчивость организмов не вызывает сомнения.

Целью данной работы являлось выявление основных молекулярных механизмов регуляции генов бтш при адаптации организмов к различным условиям обитания.

В ходе работы был поставлен ряд задач:

2. Выявить молекулярные механизмы регуляции экспрессии БТШ70 у изучаемых модельных видов. В частности изучить: а) число копий генов бтш70 у сравниваемых видов; б) регуляцию транскрипции бтш.

4. Провести детальное исследование ответа на ТШ на примере рядов видов и линий Drosophila (D. melanogaster, D lummei, D. montana, D texana, D. virilis, D. novamexicana и D. mojavensis), различающихся по температуре экологической ниши обитания. Для этого исследовать: а) базальную и индуцируемую термоустойчивость; б) уровень экспрессии БТШ70; в) паттерн белкового синтеза после ТШ; г) регуляцию транскрипции бтш;

5. Исследовать механизмы эволюции генов бтш70 у группы видов с хорошо изученной филогенией (на примере группы virilis). Для этого изучить: а) строение кластера генов бтш70 у D. virilis и D. lummei; б) клонировать и секвенировать гены бтш70 с фланкирующими последовательностями у изучаемых видов и линий.

6. Оценить вклад других групп БТШ в термоустойчивость организмов.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Зацепина, Ольга Георгиевна

Выводы:

1. Молекулярные механизмы адаптации к условиям обитания значительно различаются у разных организмов и связаны с уровнем. БТШ70 в клетках при нормальных условиях и тепловом шоке: Экспрессия БТШ70* у разных видов может определяться: а) на уровне регуляции транскрипции; б) числом копий гена бтш70\ в) встраиванием в промоторную область генов-бтш 70 мобильных элементов.

2. Основным молекулярным механизмом, обеспечивающим термоустойчивость пустынных видов ящериц, является, повышенная экспрессия БТШ70 при нормальных условиях. У северных видов- при нормальных условиях синтез БТШ70 отсутствует. Уровень БТШ70 у пустынных организмов' претерпевает значительные колебания в течение суток, коррелируя с изменениями температуры окружающей среды и тела животного.

3. Повышенная экспрессия! БТШ70 у термофильных ящериц контролируется на уровне транскрипции и обусловлена присутствием» активной формы HSF, связанной* с промотором в нормальных условиях.

5. На примере видов Drosophila выявлены сложные взаимоотношения, между уровнем синтеза БТШ и термотолерантностью. Показана положительная корреляция между уровнем синтеза БТШ70 и термоустойчивостью у различных географических линий и видов Drosophila группы virilis, однако при сравнении видов, принадлежащих к разным группам рода Drosophila, такой корреляции не наблюдается.

6. Показано наличие индивидуального спектра изоформ БТШ70 у всех изученных линий и видов Drosophila. Показано, что у термоустойчивых видов более интенсивно экспрессируются низкомолекулярные БТШ и БТШ40, по сравнению с термочувствительными, при жестком температурном воздействии.

7. Подробно изучена структура и функционирование системы генов ТШ у нескольких видов Drosophila группы virilis: а) обнаружены различия как в строении самого кластера генов, так и в числе генов бтш70 у видов и линий данной группы. Показано, что линии термофильного южного вида D. virilis имеют больше копий бтш70, чем линии северного филогенетически близкого вида D. lummei, что может иметь адаптивное значение; б) у всех копий генов бтш70 видов группы virilis в 3'-фланкирующей последовательности обнаружен древний МЭ SGM. На основании этих результатов предложена модель, объясняющая адаптивные изменения числа копий генов бтш70 у видов группы virilis.

8. Промоторная область генов бтш70 D. melanogaster имеет особую структуру, которая определяет преимущественное встраивание Р элемента в определенные участки промотора. Показано, что МЭ играют важную роль в функционировании и эволюции генов бтш70 у различных видов рода Drosophila.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Lyashko VN, Vikulova VK, Ghernicov VG, Ivanov VI, Ulmasov KA, Zatsepina OG, Evgen'ev MB'. Comparison of the heat shock response in ethnically and ecologically different human populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. 91 (26): 12492 - 5.

2) Ульмасов X.A., Зацепина О.Г., Рыбцов C.A., Джумагельдыев Б.Т., Евгеньев М.Б. Некоторые аспекты состояния компонентов системы теплового шока у ящериц различных экологических ниш: Известия АН. Серия биологическая. 1997. 2: 133 -44.

5) Zatsepina OG, Velikodvorskaia VV, Molodtsov VB, Garbuz D, Lerman DN, Bettencourt BR, Feder ME and: Evgenev MB. A Drosophila melanogaster strain from sub-equatorial:>Africa has exceptional thermotolerance but decreased Hsp70 expression. The J*. Exp. Biol. 2001.204: 1869-81.

6) Молодцов В. Б., Великодворская,В. В., Гарбуз Д. Г, Зацепина О. Г., Евгеньев М. Б. Анализ экспрессии белков теплового шока и терморезистентной линии Drosophila melanogaster. Известия Академии наук, Серия биологическая, 2001. 5: 522s-32.

7) Гарбуз Д. Г., Молодцов В. Б., Велнкодворская В. В., Зацепина О: Г., Евгеньев М. Б. Эволюция ответа на тепловой шок внутри рода Drosophila. Генетика, 2002. 38 (8): 1097 -109.

8) Garbuz DG, Zatsepina OG, Feder ME, Evgen'ev MB. Evolution of termotolerance and-the heat-shock response: evidence from inter/intra specific comparison and interspecific hybridization in the Drosophila virilis species group. I/ Thermal phenotype. J: Exp. Bioh 2003. 206: 2399-408.

10) Evgenev MB; Zatsepina OG, Garbuz DG, Lerman. DN, Velikodvorskaia W, Zelentsova ES, Feder ME. Evolution-and arrangement of the hsp70 gene cluster in two closely related species of the virilis group of Drosophila. Chromosoma. 2004. 113 (5): 223 - 32.

11) Zatsepina OG, Garbuz DG, Shilova V, Karavanov AA, Tornatore P, Evgen'ev MB. Use of surface-enhanced! laser desorption ionization - time-of-flight to identify heat shock protein 70 isoforms in closely related species of the virilis group of Drosophila. Cell Stress and Chaperones. 2005. 10 (1): 12-6.

13) Шилова В. Ю:, Гарбуз Д. Г., Евгеньев М. Б., Зацепина О. Г. Низкомолекулярные белки теплового шока и адаптация к гипертермии у видов Drosophila. Молекулярная4 биология. 2006. 40 (2): 271-6.

14) Victoria Y. Shilova, David G. Garbuz, Elena N. Myasniankina, Bing Chen, Michael B. Evgen'ev, Martin E. Feder, and' Olga G. Zatsepina. Remarkable Site Specificity of- Local Transposition into the hsp70 Promoter of Drosophila melanogaster. Genetics. 2006: 173: 809 -20.

15) Evgen'ev M. B, Garbuz D. G., Shilova V.Y. and Zatsepina O. G. Molecular mechanisms underlying thermal adaptation of xeric animals. J. Biosci. 2007. 32 (3): 489 - 99:

16)' Sawateeva-Popova E, Popov A, Grossman A, Nikitina E, Medvedeva A, Peresleni A, Korochkin L, Мое JG, Davidowitz E, Pyatkov K, Myasnyankina E, Zatsepina O, Schostak N, Zelentsova E, Evgen'ev M. Pathogenic chaperone-like RNA induces congophilic aggregates and facilitates neurodegeneration in Drosophila. Cell Stress Chaperones. 2007. 12 (1): 9- 19.

17) Шилова В. Ю,. Гарбуз Д. Г, Мяснянкина Е. Н.,. Евгеньев М. Б,. Зеленцова Е. С, Зацепина О. Г. Качественный и количественный анализ транспозиций генетической конструкции' на основе Р элемента в область генов бтш70 Drosophila melanogaster. Генетика, 2007.43 (12): 1333 - 43.

18) Bing Chen, V. Yu. Shilova, О. G. Zatsepina, M. B. Evgen'ev, M: E. Feder. Location of P element insertions in the proximal promoter region of Hsp70A is consequential for gene expression and fecundity in Drosophila melanogaster. Cell Stress Chaperones. 2008. 13 (1): 11 -7.

19) - Гарбуз Д-L Г, Юшенова И.А.,: Евгеньев? Mi Б;, Зацепина О. Г. Сравнительный анализ; структуры кластера генов hsp70 у видов Drosophila группы virilis. Молекулярная биология. 2009. 43 (1): 44-52. '

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Зацепина, Ольга Георгиевна, Москва

1. Васильева-Л: А., Ратнер В. А., Бубенщикова Е. В; Стрессовая; индукция транспозиций ретротранспозонов дрозофилы: реальность явления, характерные особенности и.возможная роль в быстрой эволюции. Генетика. 1997. Т. 33, №8, С. 1083 -10931

2. Гусев Н. Б., Богачева Н. В., Марстон С. Б. Структурами свойства малых белков теплового шока (sHsp)-и их взаимодействие с белками цитоскелета. Биохимия. 2002. Т. 67. №5, С. 613-623.

3. Гужова И: В., Новоселов С. С., Маргулис Б. А. Шаперон HSP70 и перспективы:его использования в противоопухолевоттерапии: Цитология. 2005.Л1 3. С. 187 199. .

4. Евгеньев М: Б., Мнджоян Е. И., Зеленцова:Е. С., Шостаю Н; Г., Лёзин;Г. Т., Великодворская: В;. В., Полуэктова Е. В. Мобильные; элементы» и видообразование. Молекулярная биология. 1998. Т. 32. № 1, С. 184 192.

5. Коваленко Е.И., Власкин П.А., Каневский Л.М., Стрельникова Ю.И., Сапожников А.М- Влияние белков теплового шока 70 кДа на продукцию у интерферона натуральными киллерами человека. ДАН; 2006. Т. 406, №1, С. 121 124.

6. Лозовская Е. Р., Евгеньев М. Б. Тепловой шок у дрозофилы и регуляция активности генома. Молекулярная биология. 1984. Т. 20. С. 142 185.

7. Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., «Мир», 1984. С. 480;

8. Маргулис Б.А., Гужова И.В. Белки стресса в эукариотической клетке. Цитология, 2000. Т. 42. №4, С. 323 342.

9. Ульмасов X. А., Каррыева Б. Ч., Караев К. Стрессовые белки и адаптация. Ашхабад, «Ылым», 1993. С. 212.

10. Ульмасов X. А., Овезмухаммедов А., Караев К. К., Евгеньев М. Б. Молекулярные механизмы адаптации к гипертермии у высших организмов. III. Индукция белков теплового шока у двух видов лейшманий. Молекулярная биология. 1988. Т. 22. № 6. С. 1583 1589.

11. Черлин В. А., Музыченко И. В. Термобиология сетчатой ящурки ушастой и песчаной круглоголовок летом в Восточных Каракумах. Зоол. журнал. 1983. Т.62. С. 897-908.

12. Фаддеев М. А. Элементарная обработка результатов эксперимента: Учебное пособие. Изд-во Нижегородского госуниверситета, 2002. С. 108.

13. Хлебодарова,Т. М: Как клетки защищаются от стресса? Генетика, 2002, Т. 38. N4, С. 437-452.

14. Abravaya K., Myers, M.P., Murphy, S.P. and Morimoto, R.I. The human heat shock protein hsp70 interacts with HSF, the transcription factor that regulates heat shock gene expression. Genes Dev., 1992, 6: 1153 1164.

15. Agam KM, Levy S, and Ben-Ami HC. et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. J Neurosci. 2000. 20: 57485755.

16. Akerfelt M, Trouillet D, Mezger V, Sistonen L. Heat shock factors at a crossroad between stress and development. Ann N Y Acad Sci. 2007. 1113: 15-27.

17. Ali A., Bharadwaj, S., О'Carroll,R. and Ovsenek,N. Hsp90 interacts with and regulates the activity of heat shock factor 1 in Xenpous oocytes. Mol. Cell. Biol., 1998. 18: 4949-4960.

18. Amin J, Ananthan J, Voellmy R. Key features of Heat Shock Regulatory Elements. Molecular and Cell Biology, 1988. 8, 9: 3761 -3769.

19. Amin J, R. Nestril, P. Schiller, M. Dreano, R. Voellmy. Organization of the Drosophila melanogaster hsplQ regulation unit. Mol. Cell. Biol., 1987. 7, 3: 1055 1062.

20. Aminetzach Y. Т., J. M* Macpherson and <D. A. Petrov, Pesticide resistance via transposition-mediated adaptive gene truncation in Drosophila. Science. 2005. 309: 764 767.

21. Ananthan J, Goldberg AL, Voellmy R. Abnormal proteins serve as eukaryotic stress signals and trigger the activation of heat shock genes. Science. 1986. 232, 4749: 522 -4.

22. Angus DC, Wax RS. Epidemiology of sepsis: an update. Crit Care Med. 200 V. 29: 109-16.

23. Anxolabehere D. P transposable element in Drosophila melanogaster: horizontal, transfer. С R Seances Soc Biol Fil. 1992. 186, 6: 641 55.

24. Arhipova I.R., Lyubomirskaya N.V., Ilyin Y.V. Drosophila retrotransposones. 1995// Austin, Texas: R.G. Landes company. 134.

25. Arrigo A, Mehlen P et al., Small Stress Proteins as Novel Negative1 Regulators of Programmed Cell Death. In: Molecular chaperones and heat shock response. Cold» Spring Harbor, New York, 1998:21.

26. Arthur AL, Weeks AR, Sgro CM: Investigating latitudinal clines for life history and stress resistance traits in Drosophila simulans from eastern*Australia. J Evol'Bioll 2008. 6: 1470-9:

27. Asea A, Rehli M, Kabingu E, Boch JA, Bare O, Auron PE, Stevenson MA, Calderwood SK. Novel signal transduction pathway utilized by extracellular HSP70: role of toll-like receptor.(TLR) 2 and TLR4. J Biol Chem. 2002. 277. 17: 15028 34.

28. Ayme A., Tissieres.A. Locus 67B of Drosophila melanogaster contains seven, not four, closely related heat shock genes. EMBOJ., 1985, 4 (11): 2949 2954.

29. Bahn YS, Geunes-Boyer S, Heitman, J. ,Ssk2 mitogen-activated protein kinase kinase kinase governs divergent patterns of the stress-activated Hogl signaling pathway in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 2007. 6 (12): 2278 89.

30. Bailey J.A., G. Liu and E.E. Eichler. An Alu transposition model for the origin and expansion of human segmental duplications. American Journal of Human-Genetics, 2003. 73: 823 834.

31. Balakrishnan K., A. De Maio. hsp70 binds it's own messenger RNA as part of gene expression self-limiting mechanism. Cell stress&.Chaperones. 2006, V. 11 (1): 44 50.

32. Becker J., and E. A. Craig. Heat-shock proteins as molecular chaperones. European Journal of Biochemistry. 1994.219: 11-23.

33. Becker T, Hartl F., and Wieland F. CD40, an extracellular receptor for binding and uptake of Hsp70-peptide complexes. The Journal of Cell Biology, 2002, 158 (7): 1277 -1285.

34. Beckmann Richard P., Lovett Michelle, William J. Welch. Examining the Function and Regulation of HSP70 in Cell Subjected to Metabolic Stress. The Journal of Cellular Biology, 1992. T. 117. №6. P. 1137-1150.'

35. Belikov S. V., Karpov V. L. Mapping Protein-DNA Interaction with CIS-DDP: Chromatine Structure of Promoter Region-of D. melanogaster HSP70 Gene. Biochem. Mol. Biol. Int., 1996, 38 (5): 997 1002.

36. Bellen H., C. J. O'Kane, C. Wilson, U. Grossniklaus, R.K. Pearson, W.J. Gehring. P-element mediated enhancer, detection: a versatile method* to study development in Drosophila. Genes Dev. 1989. V. 3 P. 1288 1300.

37. Benedict M. Q., Cockburn A. F., Seawright J. A. The Hsp70 heat-shock gene family of the mosquito Anopheles albimanus. Insect. Mol. Biol., 1993, 2 (2): 93 102.

38. Benedict M. Q., Levine B: J., Ke Z. X., Cockburn A. F,, Seawright J. A. Precise limitation of concerted evolution to ORFs in mosquito Hsp82 genes. Insect. Mol. Biol., 1996, 5 (1): 73-79.

39. Bettencourt B. R., I. Kim A., A. Hoffmann and M. E. Feder, Response to natural and laboratory selection at the Drosophila hsp70 genes. Evolution. 20026. v56: 1796 1801.

40. Bettencourt B.R., and M.E. Feder. Rapid concerted evolution via gene conversion at the Drosophila hsp70 genes. Journal of Molecular Evolution. 2002a. V54: 569 586.

41. Bettencourt BR; Feder ME. Hsp70 duplication? in the Drosophila melanogaster species group: how and when did two become five? Mol Biol Evol., 2001. T. 18. V. 7. P. 1272-1282.

42. Bienz M., H.Pelham. heat shock regulatory elements function as an inducible enhancern in the Xenopus hsplQ gene and when linked,to a heterologous promoter. Cell. 1986. V. 45 P.4 753-760.

43. Binganr P.Ml, Kidwell M.G., Rubin G.M: The molecular basis of P-M hibrid dysgenesis: the role of the P-element, P-strain specific transposon family. Cell. 1982. V. 29. P. 995 -1004.

44. Birch-Machin I, Gao S, Huen D, McGirr R, White RA, Russell S. Genomic analysis of heat-shock factor targets in Drosophila. Genome Biol. 2005; 6 (7): R63.

45. Bogwitz M! R., H. Chung L. Magoc, S. Rigby, W. Wong et al, Cypl2a4 confers lufenuron resistance in a natural population of Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005. 102: 12807 12812.

46. Bonisch C, Temme C, Moritz B, Wahle E. Degradation of hsp70 and other mRNAs in Drosophila via the 5' 3' pathway and its regulation by heat shock. J Biol Chem. 2007. 282 (30): 21818-28.

47. Bonner J. J., Berninger M., Pardue M. L. Transcription of polytene chromosomes and of the mitochondrial genome in Drosophila melanogaster. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 1978, 42 (2): 803 814.

48. Bonner J. J., Pardue M. L. Polytene chromosome puffing and in situ hybridization measure different aspects ofRNA metabolism. Cell, 1977, 12 (1): 227 234.

49. Boutanaev A. M:, A. I. Kalmykova, Y. Y. Shevelyou and D. I. Nurminsky, 2002 Large clusters of co-expressed genes in the Drosophila genome. Nature. 420: 666 669.

50. Brennecke T, Gellner K, Bosch TC. The lack of a stress response in Hydra oligactis is due to reduced hsp70 mRNA stability. Eur J Biochem. 1998. 255 (3): 703 9.

51. Bucheton. A., Busseau I., Teninges D. I elements in Drosophila melanogaster. Mobie DNAII; 2002, P. 796 812.

52. Buckley BA, Gracey AY, Somero GN. The cellular response to heat stress in. the goby Gillichthys mirabilis: a cDNA microarray and protein-level analysis. J Exp Biol. 2006; 209:2660-2677.

53. Buckley В A, Hofmann GE. Magnitude and, duration of thermal stress determine kinetics of hsp gene regulation in the goby Gillichthys mirabilis. Physiol Biochem Zool. 2004. 77(4): 570-81.

54. Buckley BA, Hofmann GE. Thermal acclimation changes DNA-binding activity of heat shock factor 1F (HSF1) in the goby Gillichthys mirabilis: implications for plasticity in the heat-shock response in natural populations J Exp Biol. 2002. (Pt 20): 3231 40.

55. Buckley BA, Owen ME, Hofmann GE.Adjusting the thermostat: the threshold induction temperature for the heat-shock response in intertidab mussels (genus Mytilus) changes as a function of thermal history. J Exp Biol. 200Г. 204 (Pt 20): 3571 9.

56. Buckley BA, Place SP, Hofmann GE. Regulation of heat shock genes in isolated hepatocytes from an Antarctic fish, Trematomus bernacchii. J Exp Biol. 2004. 207 (Pt 21): 3649-56.

57. Bush KT, Goldberg AL, Nigam SK. Proteasome inhibition leads to a heat-shock response, induction of endoplasmic reticulum chaperones, and thermotolerance. J. Biol Chem. 1997. V. 272 (14) P. 9086 92.

58. Busseau I.A., Pelisson A., Bucheton A. I elements of Drosophila melanogaster generate specific chromosomal rearrangements during transposition. Mol. Gen. Genet., 1989. V. 218 (2) Ft 222-228.

59. Carver JA, Guerreiro N, Nicholls KA, Truscott RJ. On the interaction of alpha-crystallin with unfolded proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1995; 1252: 251 -260.

60. Causton HC, Ren B, Koh SS, Harbison CT, Kanin E, Jennings EG, Lee TI, True HL, Lander ES, Young RA. Remodeling of yeast genome expression in response to environmental changes. Mol Biol Cell. 2001. 12 (2): 323 37.

61. Cervera Ji Induction of self-tolerance and; enhanced stress protein synthesis invL-132 cells by cadmium chloride andiby hyperthermia. CellBiolTnt Rep;, 1985. V.9 (2);P^ 131 — 41. ■

62. Chen Q, Ma E, Behar KL, Xu T, Haddad GG. Role of trehalose phosphate synthase in anoxia tolerance and development in Drosophila melanogaster!I J. Biol;, Chem., 2002. T.277. V.5; P.3274 3279.

63. Chomczynski P; and® Sacchi N. Single-step? method of RNA isolation! by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction; Anal; Biochem. 1987. 162; 156 159.

64. Clos J; Rabindran S, Wisniewski J, Wu C. Induction temperature of human heat shock factor is reprogrammed in a Drosophila cell environment. 1: Nature; 1999; 364 (6434): 252-5.

65. Corvelo R Evolutionary Dynamics of the SGM-like Insertion5. Sequences; and Phylogenetic analyses om gypsy retrotransposon, in Drosophila virilis. Universidade:de Evora: Curso de Biologia (Cientifico). 2004. P. 46.

66. Cotto J. J., Morimoto R. I. Stress-induced activation* of the heat-shock response: cell and molecular biology of heat-shock factors. Biochem Soc Symp. 1999, 64: 105 118:

67. Coveny Angela M.,1 Tammy Dray 1,2 and Gregory B. Gloor. The Effect: of Heterologous Insertions on Gene Conversion in Mitotically Dividing Cells- in Drosophila melanogaster. Genetics. 2002. V. 161, P. 249 258:

68. Cowen< LE, Lindquist S. Hsp90 potentiates the rapid, evolution of new traits: drug resistance in diverse fungi. Science. 2005. 309 (5744): 2185 9.

69. Graig CR, Fink JL, Yagi Y, Ip YT, Cagan RL A Drosophila p38> orthologue is required-for-environmental stress responses. EMBO Rep. 2004. 5 (11): 1058-63.

70. Cunningham CN, Krukenberg KA, Agard DA.Intra- andintcrmonomer interactions are required to- synergistically facilitate ATP'hydrolysis in Hsp90. J Biol Chem. 2008. 283 (30): 21170-8.

71. Daborn P.1 J., J. L. Yen, Mi R. Bbgwitz, G. Le Goff, E. Feil«. A single P450 allele associated with insecticide resistance in Drosophila. Science. 2002. 297: 2253 2256.

72. Delmas F., Trocheris V., Murat J.-C. Expression of stress proteins in cultured HT29 human cell-line; a model'for studing. environmental aggression. Int. J. Biochem. Cell Biol., 1995. V. 27 P: 385-39k

73. Diamant S., Eliahu-N., Rosenthal D., Goloubinoff P. Chemical chaperones regulate molecular chaperones in1 vitro and .in cells under combined salt and heat stresses. J. Biol. Chem., 2001, 276 (43): 39586 39591.

74. Ditzel L, Lowe J, Stock D, Stetter K, Huber H, Huber R and Steinbacher S. Crystall Structure of the thermosome, the Archaeal chaperonin and homolog of GCT. Cell, 1998, 93: 125 138.

75. Duncan. R. F., Cavener D. R., Qu-.S. Heat Shock Effects on Phosphorilation of Protein Sintesis Initiation Factor Proteins eIF4E and eIF2-alpha in Drosophila. Biochemistry, 1995, 34 (9): 2985-2997.

76. Dix DJ. Hsp70 expression and function during gametogenesis. Cell Stress Chaperones. 1997. V.2 (2), P. 73 7.

77. Dragon E, Sias S, Kato E, Gabe J. The genome of Trypanosoma cruzi containes a constitutively expressed, tandemly arranged multicopy gene homologous to a major heat shock protein. Mol Cell. Bioh, 1978, 7 (3): 1271 1275.

78. Dreher D., Vargas J.R., Hochstrasser D., Junod A.F. Effects of oxidative stress andл i

79. Ca antagonists on molecular chaperones in human umbilical vein endothelial cells. Electrophoresis. 1995*. V. 16 (7) P. 1205 14.

80. Drnevich JM, Reedy MM, Ruedi EA, Rodriguez-Zas S and Hughes KA. Quantitative evolutionary genomics: differential gene expression and male reproductive success mDrosophila melanogaster. Proc. R. Soc. Lond. B. 2004: 2267 2273.

81. Duncan RF. Inhibition of Hsp90 function delays and impairs recovery from heat shock. FEBS J. 2005. 272 (20): 5244 56.

82. Ekengren S, Hultmark D.A family of Turandot-related genes in the humoral stress response of Drosophila. Biochem Biophys Res Commun. 2001. 284 (4): 998 1003.

83. Evgen'ev M. В., Kolchinski A., Levin A., Preobrazhenskaya A.L., Sarkisova E. Heat-shock DNA homology in distantly related species of Drosophila. Chromosoma, 1978: 68 (4): 357-365.

84. Evgen'ev M., Levin A., Lozovskaya E. The analysis of a temperature-sensitive (ts) mutation influencing the expression of heat shock-inducible genes in Drosophila melanogaster. Mol. Gen. Genet., 1979. 176 (2): 275 280.

85. Fan CY. Mechanisms for regulation of hsplO function by hsp40f Cell stress&Chaperones. 2003. 8 (4): 309 316.

86. Farkas G. Chromatin organization and transcriptional control of gene expression in Drosophila. Gene. 2003. T.253. P. 117 136.

87. Feder M. E. and Hofmann G. E. Heat-Shock Proteins, Molecular Chaperones, and the Stress Response, Evolutionary and Ecological Phisiology. Annual-Review of Physiology. 1999. T. 61. P. 243-282.

88. Feder M. Necrotic fruit: a novel model system for thermal ecologists. J. Therm. Biol:, 1997.22(1): 1-9.

89. Feder ME, Blair N, Figueras H. Natural thermal stress and heat-shock protein expression in Drosophila Xarvae and pupae. Funct. Ecol. 1997. 11: 90 100.

90. Feder ME, Hofmann GE. Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology. Annu Rev Physiol. 1999; 61: 243 82.

91. Feder ME, Hofmann GE. 1998. Evolutionary and ecological physiology of heat-shock proteins and the heat-shock response: a comprehensive bibliography. http://www.annurev.org/sup/material.htm.

92. Fernandes M, Xiao H, Lis JT. Fine structure analyses of the Drosophila and Saccharomyces heat shock factor-heat shock element interactions. Nucleic Acids Res. 1994. 22: 167-73., ' 186

93. Fernando P, Heikkila JJ. :Eunctional characterization of Xenopus small heat shock protein; Hsp3 ОС: the carboxvl end is required for stability and chaperone activity. Cell Stress Chaperones. 2000 (2): 148 -59:

94. Fink A.L. Chaperone-mediated protein folding. Physiol. Rev., 1999: 79:425-449.

95. FlajnikM. F., Canel C., Kramer J., Kasahara M. Which came first, MHC class I or class II? Immunogenetics, 1991, 33 (5 6): 295 - 300.

96. Fornace AJ Jr, Alamo-1 Jr, Hollander MG, Lamoreaux E. Ubiquitin mRNA is a major stress-induced transcript in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 1989; 17 (3): 1215 -30.

97. Freeman BG, Myers MP, Schumacher. R; Morimoto RI Identification? of a regulatory motif in Hsp70 that affects ATPase activity, substrate binding and interaction with HDJ-1. EMBO J; 1995. 14 (10): 228T-92.

98. Freeman BG, Yamamoto KR. Disassembly of transcriptional; regulatory complexes; by molecular chaperones. Science. 2002. 296 (5576): 2232 35;

99. Frydman Judith; Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones; Annu: Rev. Biochem, 2001. T. 70. P: 603 649 ■

100. Fujikake N, Nagai Y, Popiel; НА, Капо Hj. Yamaguchi M-.TodatT-. Alternative splicing^ regulates the transcriptional activity of Drosophila heat shock transcription; factor in response to heat/cold stress. FEBS Lett. 2005. 579 (17): 3842 8:

101. Gabai V.L., Sherma M.Y. Molecular biology of thermoregulation: interplay between? molecular chaperones, and signaling- pathways in survival of heat: shock. J: Appl. Physiol; 2002: 92: 1743 1748;

102. Garland, T; Adolph;, S. Why riot to Do Two-Species Comparative:, studies: Limitations on Inferring Adaptation. Physiological Zoology. 1994, 67 (4), 797 828.

103. Gasch AP, Spellman PT, Kao CM, Carmel-Harel O, Eisen MB, Storz G, Botstein D, Brown PO.Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell. 2000 (12): 4241 57.

104. Gebauer Mathias, Matthias Zeiner and Ulrich Gehring. Interference between proteins Hap46 and Нор/рбО, which bind to different domains of the molecular chaperone hsplO/hsclO. Mol. Cell. Biol., 1998, 18 (11): 6238 -6244.

105. Gellner K, Praetzel G, Bosch TC. Cloning and expression of a heat-inducible hsp70 gene in two species of Hydra which differ in their stress response. Eur J Biochem: 1992. 210(3): 683-91.

106. Georgel P.T. Chromatin potentiation» of the hsplO promoter is linked to GAGA-factor recruitment. Biochem.Cell Biol., 2005: Vol. 83", p. 555 565:

107. Georgiev GP.Mobile genetic elements in animal cells and- their biological significance. Eur J Biochem. 1984. 145 (2): 203 20.

108. Gilmour D. S., G. H: Thomas and S. C. Elgin. Drosophila nuclear proteins bind'to regions of alternating С and T residues in gene promoters. Science. 1989. 245: 1487 ~ 1490.

109. Girardot F, Monnier V, Tricoire H. Genome wide analysis of common and specific stress responses in adult drosophila'melanogaster. BMC Genomics. 2004; 5 (1): 74.

110. Glass D, Ramona I. Polvere and Lex H. T. Van der Ploeg. Conserved sequences and Transcription'of the hsp70 gene family w. Trypanosoma brucei. Mol. Cell: Biol.,.1986, 6 (12): 4657-4666. '

111. Gloor Gregory В., Jessica Moretti, Joanne Mouyall and* Katherine J. Keeler2Distinct P-Element Excision Products in Somatic and Germline Cells of Drosophila melanogaster Genetics. 2000. V. 155, P. 1821 1830.

112. Golovnin A, Georgieva S, Hovhannisyan H, Barseguyan K, Georgiev P. P element-mediated duplications- of genomic regions in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 2002. V. Ill (2), P. 126- 138.

113. Gong W. J., and K. G. Golic Genomic deletions of the Drosphila melanogaster HsplO genes. Genetics. 2004. 168: 1467 1476.

114. Gray N.K. and.Wickens M. Control of translation initiation in animals. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 1998, 14: 399 458.

115. Gross SR, Kinzy TG. Translation elongation factor 1A is essential for regulation of the actin cytoskeleton and cell morphology.Nat Struct Mol Biol. 2005. (9): 772 8.

116. GuettoucheT, Boellmann F, Lane WS, Voellmy R. Analysis of phosphorylation of human heat shock factor L in cells experiencing a stress. BMC Biochem. 2005. 6: 4.

117. Guzhova I, Kislyakova K, Moskaliova O, Fridlanskaya I, Tytell M, Cheetham M, Margulis B. In vitro studies show that Hsp70 can be released by glia and that exogenous Hsp70 can enhance neuronal stress tolerance. Brain Res. 2001; 914 (1-2): 66 73.

118. Hahn JS, Hu Z, Thiele DJ; Iyer VR: Genome-Wide Analysis of the Biology of Stress Responses through Heat Shock Transcription Factor. Mol Cell Biol. 2004; V. 24 (12) P. 5249 5256.

119. Han G. M., Lin H., Head' M.", Jin M., Blank M., Goodman' R. Application of magnetic field-induced heat shock protein 70 for presurgical cytoprotection. J. Cell. Biochem. 1998,71:577-583.

120. Harbison* ST, Chang S, Kamdar KP, Mackay TF. Quantitative genomics of starvation stress resistance in Drosophila. Genome Biol. 2005. 6 (4): R36.

121. Hardie RC; Raghu P. Visual transduction in Drosophila. Nature: 2001. 413 (6852): 186-93.

122. Harris SF, Shiau AK, Agard DA. The crystal structure of the carboxy-terminal dimerization domain of htpG, the Escherichia coli Hsp90, reveals a potential substrate binding site. Structure. 2004. (6): 1087 97.

123. Hart C., Zhao K., Laemmli U. The scs' boundary element: characterization of boundary element-associated'factors. Mol. Cell. Biol., 1997, 17: 999 1009.

124. Hartl D.L., Lohe A.R., Lozovskaya E.R. Regulation of the transposable element mariner. Genetica. 1997. V. 100, P. 177 184.

125. Hartl F.U. (1996) Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature, 381: 571 -579.

126. Hartl FU, Hayer-Hartl M. Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. Science. 2002. 295 (5561): 1852 8.

127. Hartl D.L., Losovskaya E.R. Factors contributing to the hybrid dysgenesis syndrome in Drosophila virilisll Genet Res., 1998. V. 71, P. 109 117.

128. Heat Shock: from Bacteria to Man. 1982. Editors Schlesinger M J et al\ New York, Cold Spring Harbor Lab 440

129. Heino R., Lumme J. Inheritance of cold ,shock tolerance in hybrids of Drosophilatvirilis and Drosophila lummei. Genetica, 1989, 79: 17 — 25.

130. Hernandez G, Vazquez-Pianzola P, Sierra JM, Rivera-Pomar R. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos: RNA.,2004; 10: 1783 1797.

131. Heschl* M. F., Baillie D. L. Characterization* of the hsp70 multigenc family of Caenorhabditis elegans. DNA, 1989;' 8 (4): 233 243.

132. Heschl M. F., Baillie, D. L. The. HSP70- multigene family of Caenorhabditis elegans. Comp; Biochem. Physiol. B:, 1990; 96 (4): 633 637.

133. Hoffmann'AA, Weeks AR*. Climatic selection.on genes and traits after a 100 year-old invasion: a critical look at the temperate-tropical;clines in Drosophila melanogaster from eastern Australia. Genetica. 2007. 129 (2): 133 47.

134. Hofmann- GE, Buckley BA, Airaksinen S, Keen JE, Somero^ GN. Heat-shock protein- expression is absent, in the antarctic fish Trematomus bernacchii (family Nototheniidae). J'Exp'Biol: 2000; (PU 5): 2331-9:

135. Holmgren R., Livak K., Morimoto R. L, Frend R., Meselson M: Studies of cloned, sequences from four Drosophila heat shock loci. Cell*. 1979. 18: 1359 1370.

136. HoltsS. E. Function Requirement of p23 and HSP90 in Telomerase Complexes. Genes and Development. 1999. T. 13.V.7. P. 817 826. .

137. Hong Y, Rogers R,. Matunis M;. Mayhew С Goodson M, Park-Sarge О and Sarge K. Regulation of heat shock transcription factor 1 by stress-induced SUMO-1 modification. J. Biol. Chem., 2001. 276 (43): 40263 -40267.

138. Huisinga KL, Pugh BF.A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in, Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell. 2004. 13 (4): 573 85.

139. Hunt C. R., Gasser D. L., Chaplin D. D., Piers J. C., Kozak C. A. Chromosomal localization of five murine HSP70 gene family members: Hsp70-1, Hsp70-2, Hsp70-3, Hsp70t and Grp78. Genomics. 1993. 16: 193 198.

140. Hunt C., Morimoto R. I. Conserved features of eukaryotic hsp70 genes revealed by comparison with the nucleotide sequence of human hsp70. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. 82(19): 6455-6459.

141. Ingolia T. D., Craig E. A. Four small Drosophila heat shock proteins are related to each other and to mammalian alpha-crystallin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982. 79 (7): 2360 -2364.

142. Ish-Horowicz D., Leigh Brown A. J. Evolution of the 87A and'87C heat-shock loci in Drosophila. Nature. 1981. 290 (5808): 677 682.

143. Jensen LT, Nielsen MM, Loeschcke V. New candidate genes for heat resistance in Drosophila melanogaster are regulated by HSF. Cell Stress Chaperones. 2008. (2): 177 82.

144. Johnson R. N., Kucey B. L. Competitive inhibition of hsp70 expression causes thermosensitivity. Science. 1988. 242: 1551 1554.

145. Kapitonov V. V., and J. Jurka Molecular paleontology of transposable elements in the Drosophila melanogaster genome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003. 100: 6569 6574.

146. Karpov V. L., 0.! V. Preobrazhenskaya and A. D. Mirzabekov. Chromatin structure of hsplO genes, activated by heat shock: selective removal of histones from the coding region and their absence from the 5' region. Cell. 1984. 36: 423 431.

147. Kazazian H.H. Mobile elements: Drivers of genome evolution. Science 2004. 303: 1626-1632.

148. Kellett M, McKechnie SW. A cluster of diagnostic Hsp68 amino acid sites that'are identified in Drosophila from the melanogaster species group are concentrated around beta-sheet residues involved with substrate binding.Genome. 2005. 48 (2): 226 33.

149. Kidwell M. G. The evolutionary history of the P family of transposable elements. J. Heredity. 1994. V. 85. P. 339 346.

150. Kidwell M. G., Damon R. Lisch Transposable elements as sources of genomic variation, in Mobile DNAII, edited by N.L. Craig et. al., 2002. ASM Press, Washington.

151. Kim D. A Constitutive Heat Shock Element-binding Factor Is Immunologically Identical to the Ku Autoantigen. The Journal of Biological Chemistry. 1995. 270, 25: 15277 -15284.

152. Kim S, Nollen EA, Kitagawa K, Bindokas VP, Morimoto RI Polyglutamine protein aggregates are dynamic. Nat Cell Biol. 2002. (10): 826-31.

153. King V, Tower J. Aging-specific expression of Drosophila hsp22. Dev Biol. 1999. 207:107- 118.

154. Knowlton AA,.Grenier M, Kirchhoff SR, Salfity M. Phosphorylation at tyrosine-524 influences nuclear accumulation of HSP72 with heat stress. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol., 2000. 278 (6): H2143 2149.

155. Konstantopoulou I, Nikolaidis N, Scouras ZG. The hsplO locus of Drosophila auraria (montium subgroup) is single and contains copies in a conserved arrangement. Chromosoma. 1998. T. 107. V.8. P. 577-586.

156. Konstantopoulou I, Scouras ZG The heat-shock gene hsp83 of Drosophila auraria: genomic organization, nucleotide sequence, and long antiparallel coupled ORFs (LAC ORFs). J Mol Evol. 1998. 46 (3): 334 43.

157. Kosano, H., Stensgard, В., Charlesworth, M. C., McMahon, N. and Toft, D. The assembly of progesterone receptor-hsp90 complexes using purified proteins. J. Biol. Chem. 1998.273, 32973 -32979.

158. Krebs RA, Feder ME .Deleterious consequences of Hsp70 overexpression in Drosophila melanogaster larvae. Cell Stress Chaperones. 1997; 2 (1): 60-71.

159. Krebs RA, Feder ME. Hsp70 and larval thermotolerance in Drosophila melanogaster: how much is enough and when is more too much? J Insect Physiol. 1998; 44 (11): 1091-1101.

160. Krebs RA, La Torre V, Loeschcke V, Cavicchi S.Heat-shock resistance in Drosophila populations: analysis of variation in reciprocal cross progeny. Hereditas. 1996. 124 (1): 47-55.

161. Krebs RA, Loeschcke V. A genetic analysis of the relationship between life-history variation and heat-shock tolerance in Drosophila buzzatii. Heredity. 1999; 83 (Pt 1): 46 53.

162. Krebs RA, Loeschcke V. Response to environmental change: genetic variation and fitness in Drosophila buzzatii(following temperature stress. EXS. 1994. 68: 309 -21.

163. Krebs RA. A comparison of Hsp70 expression and thermotolerance in adults and larvae of three Drosophila species. Cell Stress Chaperones. 1999; 4 (4): 243 9.

164. Kruger С., Benecke B. J. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs ^ heterologous and homologous cell-free systems. Cell. 1981. 23 (2): 595 -603.

165. Kvitek DJ, Will JL, Gasch AP. Variations in stress sensitivity and genomic expression in diverse S. cerevisiae isolates. PLoS Genet. 2008; 4 (10): el000223.

166. Latchman DS. Heat shock proteins and cardiac protection. Cardiovasc Res. 2001 Sep; 51 (4): 637-46.

167. Lee H., Kraus K., Wolfner M., Lis J. DNA sequence requirements for generating paused polymerase at the start of hsp70. Genes. Dev., 1992, 6 (2): 284 295.

168. Lepore DA, Knight KR, Anderson RL, Morrison WA.Role of priming stresses and Hsp70 in protection from ischemia-reperfusion injury in cardiac and skeletal muscle. Cell Stress Chaperones. 2001; 6 (2): 93 6.

169. Lerman D.N., and M.E. Feder. Naturally occurring transposable elements disrupt hsplO promoter function in Drosophila melanogaster. Molecular Biology and Evolution. 2005.22: 776-783.

170. Lerman Daniel' N., Payvel Michalak. Amanda; B:- Helin, Brian R. Bettencourt, Martini E. Feder; Modification? of Heat-Shock,. Gene: Expression; in Drosophila melanogaster Populations'via?Transposable Elements. Mol. Biol. Evol., 2003. 20 (1): 135 144.

171. Lewis . Alan P I. and John F. Y. Brookfield Movement of Drosophila melanogaster transposable elements, other than P elements in a P-M hybrid dysgenic cross. Molecular and GeneraKGenetics, 1987. ¥. 2085(3) P: 506 510:

172. Li GG. Heat, shock; proteins:, role in thermotolerance,, drug- resistance, and relationship to DNA,topoisomerases;.NGI Monogn 1987; (4): 99 1031

173. Li F, Mao^HP; RuchalskiiKL, Wang YH; Ghoy W, Schwartz JH; BorkamSG. Heat stress prevents:mitochondrial* injuryim ATP-depleted«renal?epithelial';cells. Am J'PhysioLGelU Physiol. 2002. 283: C917 C926.

174. Lindquist S, Kim G. Heat-shock protein 104 expression is sufficient; for thermotolerance in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci; USA. 1996. T. 93. P. 5301?- 5306:

175. Lindquist S: The.heat-shock response. Annu. Rev. Biochem. 1986. T. 55. P. 11511191.

176. Lindquist S., Craige E. A. A heat shock proteins. Ann. Rev. Genet., 1988. 22: 631 -667.

177. Loones M. Т., Rallu M., Mezger V. Morange M. HSP Gene Expression and HSF2 in Mouse Development: Cell. Mol: Life Science. 1997. 53 (2): 179 190.

178. Lopez-Maury L, Marguerat S, Bahler J.Tuning gene expression to changing; environments:: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet; 2008: Aug;9(8): 583 -93.

179. Lori A. and Wassarman D.Localizing transcription factors on chromatin by immunofluorescence . Methods. 2002. V 26, P. 3 9.

180. Losovskaya E.R., Scheinker V.S., Evgen'ev M.B. A hybrid dysgenesis syndrome in Drosophila virilis. Genetics. 1990. V. 126 P: 619 623.

181. Lyne R, Burns G, Mata J, Penkett CJ, Rustici G, Chen D, Langford C, Vetrie D, Bahler J. Whole-genome microarrays of fission yeast: characteristics, accuracy, reproducibility, and processing of array data. BMC Genomics. 2003. 10; 4 (1): 27.

182. Mahecha A, Hales BF, Robaire B. Expression of stress response genes in germ cells during spermatogenesis . Biol Reprod. 2001; 65 (1): 119 27.

183. Marchler G, Wu C. Modulation of Drosophila heat shock transcription factor activity by the molecular chaperone DROJ1. EMBO J., 2001. V. 20 (3) P: 499 509.

184. Marcillat O, Zhang Y, Davies KJA. Oxidative and non-oxidative mechanisms in the inactivation of cardiac mitochondrial electron transport chain components by doxorubicin. Biochem J. 1989; 259: 181- 189.

185. Margulis B, Kinev A, Guzhova I. Chaperones in neurodegenerative pathologies: Therapeutic prospects. Heat Shock Proteins in Biology and Medicine. 2006. ISBN: 81-3080105-1. Editors: J.Radons and G. Multhoff.

186. Marin R, Tanguay RM.Stage-specific localization of the smalbheat shock protein Hsp27 during oogenesis in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 1996;105 (3): 142 9.

187. Marsano, R. M., R. Caizzi, R. Moschetti and N. Junakovic, 2005 Evidence for a functional interaction between the Baril transposable element and the cytochrome P450 cypl2a4 gene in Drosophila melanogaster. Gene. 357: 122 128.

188. Maside X, Bartolome C, Charlesworth B. S-element insertions are associated with the evolution.of the HsplO genes in Drosophila melanogaster. Curr. Biol., 2002. T. 12. V.19. P. 1686-1691.

189. McGarry, T. J. and Lindquist, S. The preferential translation of Drosophila hsplO mRNA requires sequences in the untranslated leader. Cell. 1985. 42, 903 -911.

190. Mehlen P., Schulze-Osthoff K., Arrigo A.P. Small stress proteins as novel regulators of apoptosis. Heat shock protein 27 blocks Fas/APO-1- and staurosporine-induced cell death. J Biol Chem. 1996. 271 (28): 16510 16514.

191. Menon V., Thomason D, B. Heat-down Tilt Increases Rat Cardiac Muscle eIF2a Phosphorilation. American Journal of Physiology, 1995, 269 (3): 802 804.

192. Mercier PA, Foksa J, Ovsenek N, Westwood J Xenopus heat shock factor 1 is at.nuclear protein before heat stress. J Biol Chem. 1997; 272 (22): 14147-51.

193. Mercier PA, Winegarden NA, Weslwood JT. Human heat shock factor 1 is predominantly a nuclear protein before and. after heat stress. J Cell Sci. 1999; 112 (Pt 16): 2765-74.

194. Michaud S, Marin R, Westwood JT, Tanguay RM. Cell-specific expression and heat-shock induction* of Hsps during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. J Cell. Sci. 1997. 110 (Pt 17): 1989 -97.

195. Michaud'S, Tanguay RM.' Expression of the Hsp23 chaperone during- Drosophila embryogenesis: association to distinct neural and glial lineages. BMC Dev Biol. 2003. 3: 9.

196. Miller WJ, Nagel A, Bachmann J, Bachmann L. Evolutionary dynamics of the SGM transposon family in the Drosophila obscura species group. Mol. Biol. Evol. 2000: V. 17. № 11. P. 1597-1609.

197. Milner С. M., Campbell R. D. Polymorphic analysis of three MHG-linked HSP70 genes. Immunogenetics. 1992. 36 (6): 357 -362.

198. Milner С. M., Campbell R. D. Structure and expression of the three MHC-linked HSP70 genes. Immunogenetics. 1990: 32 (4): 242-251'.

199. Morimoto Richard, Tissieres Alfred, Georgopoulos Costa. The Stress Response, Function of the Proteins, and Perspectives. Stress Proteins, in Biology and. Medicine. Cold Spring Harbor.Laboratory Press. 1990. P. 1 32.

200. Morrow G, Heikkila JJ, Tanguay RM: Differences in the chaperone-like activities of the four main small heat shock proteins of Drosophila melanogaster. Cell. Stress Chaperones. 2006V. 11 (1) P. 51 60:

201. Morrow G, Inaguma Y, Kato K, Tanguay RM. The small heat shock protein Hsp22 of Drosophila melanogaster is a mitochondrial protein displaying oligomeric organization. J Biol Chem. 2000. 275: 31204-31210.

202. Morrow G, Samson M, Michaud S, Tanguay RM. Overexpression of the small mitochondrial Hsp22 extends Drosophila life span and increases resistance to oxidative stress. FASEB J. 2004. 18: 598 599.

203. Morrow G, Tanguay RM.Heat shocks proteins and aging in Drosophila melanogaster. Semin CellDev Biol. 2003. 14: 291 -299.

204. Muhich M and. Boothroyd J. Synthesis of Trypanosome hsp70 mRNA is resistant to disruption offrww-splicing by heat shock. J. Biol. Chem., 1989. 264 (13): 7107-7110.

205. Murray JI, Whitfield ML, Trinklein ND; Myers RM, Brown PO, Botstein D. Diverse and specific gene expression1 responses to stresses in cultured human cells. Mol Biol Cell. 2004; 15 (5): 2361 -74.

206. Nacheva, G. A., D. Y. Guschin; О. V. Preobrazhenskaya; V. L. Karpov, К. K. Ebralidze. Change in the pattern of histone binding to DNA upon transcriptional activation. Cell. 1989. 58:27-36.

207. Nakai, M.Tanabe. HSF4, a new member of the human Heat Shock Factor family which lacks properties of a transcriptional activator. Molecular and cellular biology. 1997. №1. P. 469-481.

208. Nassif N W.R. Engels DNA homology requirements for mitotic gap repair in Drosophila. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90, pp. 1262 1266.

209. Nassif N, J. Penney, S. Pal, W.R. Engels and G.B. Gloor. Efficient Copying of Nonhomologous Sequences from Ectopic Sites via P-Element-Induced Gap Repair. Mol and Cell Biol., 1994. V. 14 (3), P. 1613 1625.

210. Nelson R. John, Thomas Ziegelhoffer, Charies Nicolet, Margaret Werner-Washburne, and Elizabeth A. Craig. The Translation Machinery and 70kd'Heat Shock Protein Cooperate in Protein Synthesis. Cell, 1992, 71: 97 105.

211. Neupert Walter, Franz-Ulrich Hartl, Elizabeth A. Craig, and Nikolaus Pfanner. How Do Polypeptides Cross the Mitochondrial Membranes? Cell. 1990. 63: 447 450.

212. Nielsen* MM; Sorensen JG, Kruhoffer M, Justesen J, Loeschcke V. Ph'ototransduction genes are up-regulated in a global gene expression study of Drosophila melanogaster selected for heat resistance. Cell Stress Chaperones. 2006; 11 (4): 325 33.

213. Nollen EA, Morimoto RI. Chaperoning signaling pathways: molecular chaperones as stress-sensing 'heat shock' proteins. J Cell Sci. 2002; 115 (Pt 14): 2809 16.250.»Novoselova TV, Margulis BA, Novoselov SS, Sapozhnikov AM, van der Spuy J,V

214. Cheetham ME, Guzhova IV.Treatment with'extracellular HSP70/HSC70-protein can reduce polyglutamine toxicity and aggregation. JNeurochem. 2005; 94 (3): 597 606.

215. О'Hare, K., and G. M. Rubin, 1983 Structures of P-Transposable Elements and Their Sites of Insertion and Excision in the Drosophila melanogaster Genome. Cel. 34: 25-35.

216. O'Brien Т., R. C. Wilkins, C. Giardina and J>. T. Lis, 1995. Distribution of GAGA protein on Drosophila genes in vivo. Genes & Dev. 9: 1098 1110.

217. O'Farrell P.H. High resolution two-dimentional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem., 1975.'250: 4007-4021.

218. Ohno A., Miller E., Fraek M;, Rucker S., Beck F.-x., Thurau K. Ketoconazole inhibits organic osmolyte efflux and induces heat shock proteins in rat renal medulla1. Kidney Intern. 1996. 50: SI 10-SI 18.

219. Ostling P, Bjork JK, Roos-Mattjus P, Mezger V, Sistonen L. Heat shock factor 2 (HSF2) contributes to inducible expression of hsp genes through interplay with HSF 1 J Biol Chem. 2007. Mar 9; 282 (10): 7077 86.

220. Panjwani N, Popova L, and. Srivastava P. Heat Shock Proteins gp96 and hsp70 Activate the Release of Nitric Oxide by APCs. The Journal of Immunology. 2002: 2997 -3003.

221. Papaconstantinou M, Wu Y, Pretorius HN, Singh N, Gianfelice G, Tanguay RM, Campos AR, Bedard PA. Menin is a regulator of the stress response in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2005; 25 (22): 9960 72.

222. Parsell D. A., Kowal A. S., Singer M. A., Lindquist S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hspl04. Nature. 1994. 372: 475 478.

223. Parsell DA, Kowal AS, Lindquist S. Saccharomyces cerevisiae Hspl04 protein. Purification and characterization of ATP-induced structural changes. J Biol Chem. 1994; 269 (6): 4480 -7.

224. Parsell DA, Lindquist S. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and,reactivation of damaged proteins. Annu Rev Genet. 1993. b27: 437 96.

225. Patriarka E. J*., Maresca B. Acquired thermotolerance following hsp synthesis prevents, impairment in mithohondria ATP-ase activity at elevated temperatures- in Saccharomyces cerevisiae. Exp. Cell. Res., 1990. 190: 57 64.

226. Patterson, J. Т., Stone, W. S. Evolution in the genus Drosophila. New York: The Macmillan'Company. 1952. P. 610.

227. Pedra JH, Mclntyre LM, Scharf ME, Pittendrigh BR. Genome-wide transcription profile of field- and1 laboratory-selected dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT)-resistant Drosophila. Proc Natl'Acad Sci USA. 2004. May 4; 101 (18): 7034 9.

228. Petesch SJ, Lis JT.Rapid, transcription-independent loss of nucleosomes over a large chromatin domain at Hsp70 loci. Cell. 2008; 134 (1): 74 84'.

229. Petricorena ZL, Somero GN Biochemical* adaptations of notothenioid fishes: comparisons between cold temperate South American and New Zealand species and Antarctic species. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2007; 147 (3): 799 807.

230. Petrov D., Schutzman J., Hartl D., Losovskaya E.R. Diverse transposable elements are mobilized in hybrid dysgenesis in Drosophila virilis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92 P. 8050-54.

231. Pile Lori A. and David A. Wassarman Localizing transcription factors on chromatin by immunofluorescence. Methods. 2002. V. 26, P. 3 9.

232. Pinsker W, Haring E, Hagemann S, Miller WJ. The evolutionary life history of P transposons: from horizontal invaders to domesticated neogenes. Chromosoma. 2001. 110 (3): 148-58.

233. Place P, Mackenzie L. Zippay, and. Hofrnann G Constitutive roles for inducible genes: evidence for the alteration in expression of the inducible hsp70 gene in Antarctic notothenioid fishes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2004. 287: p429 436.

234. Place SP, Hofmann GE. Comparison of Hsc70 orthologs from polar and temperate notothenioid fishes: differences in prevention of aggregation and refolding of denatured proteins. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2005. May; 288 (5): R1195 202.

235. Podrabsky J E, Somero G N. An inducible 70 kDa-class heat shock protein is constitutively expressed during early development and diapause in the annual killifish Austrofundulus limnaeus. Cell Stress Chaperones. 2007; 12 (3): 199-204.

236. Podrabsky J E, Somero G N. Changes in gene expression associated- with acclimation to constant temperatures and fluctuating daily temperatures in an annual killifish Austrofundulus limnaeus. J Exp Biol 2004. 207 2237-2254.

237. Podrabsky JE, Lopez JP, Fan TW, Higashi R, Somero GN. Extreme anoxia tolerance in embryos of the annual killifish Austrofundulus limnaeus: insights from a metabolomics analysis. J Exp Biol. 2007; 210 (Pt 13): 2253 66.

238. Portner HO, Peck L, Somero G. Thermal limits and adaptation in marine Antarctic ectotherms: an integrative view. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 2007;362 (1488): 2233 -58.

239. Prodromou C., Roe S. M., O'Brien R., Ladbury J. E., Piper P. W., Pearl L. H. Identification and structural characterization of the ATP/ADP-binding site in the Hsp90 molecular chaperone. Cell. 1997. 90 (1): 65 75.

240. Queitsch C, Sangster ТА, Lindquist S. Hsp90 as a capacitor of phenotypic variation Nature. 2002. Jun 6; 417 (6889): 618 24.

241. Quesneville H, Anxolabehere D. A simulation of P element horizontal transfer in Drosophila. Genetica. 1997. 100 (1 -3): 295-307.

242. Rabindran К Sridhar, Haroun J Raymond, Clos Joachim, Wisnievski Jan. Regulation of Heat Shock Factor trimer formaion: role of the conserved leucine zipper. Science. 1993. T. 259. P. 230 234.

243. Raboy B, Sharon G, Parag HA, Shochat Y, Kulka RG. Effect of stress on protein degradation: role of the ubiquitin system. Acta Biol Hung. 1991; 42 (1 3): 3 - 20.

244. Radons J, Multhoff G. Immunostimulatory functions of membrane-bound and exported heat shock protein 70. Exerc Immunol Rev. 2005. 11: 17-33.

245. Riehle MM, Bennett AF, Long AD. Changes in gene expression following high-teinperature adaptation in experimentally evolved populations of E. coli. Physiol Biochem Zool. 2005; 78 (3): 299-315.

246. Rinehart J P, Hayward S A, Elnitsky M A, Sandro L H, Lee R E Jr, Denlinger D L. Continuous up-regulation of heat shock proteins in larvae, but not adults, of a polar insect; PNAS. 2006. 38. 14223 14227.

247. Rio D.C. P Transposable Elements in Drosophila melanogaste. Mobile DNA II. 2002. chapter 21. PP484 518.

248. Ritossa F. A new puffing pattern induced by heat shock and DNP in Drosophila. Experientia. 1962. 18: 571-573.

249. Rubin D. M., Mehta A. D., Zhu J., Shoham S., Chen X., Wells Q. R., Palter К. B. Genomic structure and sequence analysis of Drosophila melanogaster HSC70 genes. Gene, 1993, 128(2): 155- 163

250. Rubin DM; Mehta AD, Zhu J, Shoham S, Chen X, Wells QR, Palter KB. Genomic structure and sequence analysis, of Drosophila melanogaster HSC70 genes. Gene. 1993. T. 128. V.2.P. 155- 163.

251. Russnak RH, Candido EP. Locus encoding a family of small heat shock genes in Caenorhabditis elegans: two genes duplicated to form a 3.8-kilobase inverted repeat. Mol. Cell. Biol., 1985. T.5. V.6. P. 1268 1278.

252. Rutherford, S. L. and Lindquist, S. Hsp90 as a capacitor for morphological evolution. Nature. 1998. 396, 336 342.

253. Salter-Cid L., Kasahara M., Flajnik M. F. Hsp70 genes are linked to the Xenopus major histocompatibility complex. Immunogenetics. 1994. 39 (1): 1 -7.

254. Sambrook J, Frisch EF, Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. N. Y.: Cold Spring Harbor Press.

255. Sanchez Y, Parsell DA, Taulien J, Vogel JL, Craig EA, Lindquist S. Genetic evidence for a functional relationship between Hspl04 and Hsp70. J Bacteriol., 1993. V. 175 (20) P. 6484-6491.

256. Sanchez Y., Taulien J., K. A. Borkovich and S. Linquist. Hspl04 is required for tolerance to many forms of stress. The EMBO journal. 1992. 11 (6): 2357 2364.

257. Sangster ТА, Salathia N, Lee HN, Watanabe E, Schellenberg K, Morneau K, Wang H, Undurraga S, Queitsch C, Lindquist S. HSP90-buffered genetic variation is common in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA. 2008. Feb 26; 105 (8): 2969 74.

258. Sangster ТА, Salathia N, Undurraga S, Milo R, Schellenberg K, Lindquist S, Queitsch C. HSP90 affects the expression of genetic variation and developmental stability in quantitative traits. Proc Natl Acad Sci USA. 2008. Feb 26; 105 (8): 2963 8.

259. Sapozhnikov AM, Gusarova GA, Ponomarev ED, Telford WG. Translocation of cytoplasmic HSP70 onto the surface of EL-4 cells during apoptosis. Cell Prolif. 2002;35 (4): 193-206.

260. Sato K, Torimoto Y, Tamura Y, Shindo M, Shinzaki H, Hirai H and Kohgo Y. Immunotherapy using heat-shock protein preparations of leukemia cells after syngeneic bone marrow transplantation in mice. Blood. 2001. 98 (6): 1852 1857.

261. Sato, S., Fujita, N. and Tsuruo, T. Modulation of Akt kinase activity by binding to Hsp90j Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97 (20): 10832 7.

262. Schirmer EC, Glover JR, Singer MA, Lindquist S. HSPlOO/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions. Trends Biochem Sci. 1996. 21 (8) P. 289 -296.

263. Schlenke, T. A., and D. J. Begun. Strong selective sweep associated with a transposon insertion in Drosophila simulans./Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004. 101: 1626 1631.

264. Schlesinger. Heat shock proteins. J Biol Chem. 1990; 265 (21): 12111 4.

265. Segal R, Ron EZ. Regulation and organization of the groE and dnaK operons in Eubacteria. FEMS Microbiol Lett. 1996; 138 (1): 1 10.

266. Sejerkilde M, Sorensen JG, Loeschcke V. Effects of cold- and heat hardening on thermal resistance in Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 2003; 49 (8): 719-26.

267. Shamovsky I, Ivannikov M, Kandel ES, Gershon D, Nudler E. RNA-mediated response to heat shock in mammalian cells. Nature. 2006; 440 (7083): 556 60.

268. Shamovsky I, Nudler E New insights into the mechanism of heat shock response activation. Cell Mol Life Sci. 2008; 65 (6): 855 -61.

269. Shapira M. and Pinelli E. Heat-shock protein 83 of Leishmania mexicana amazonensis is an abundant cytoplasmic protein with a tandemly repeated genomic arrangement. Eur. J. Biochem., 1989. 185: 231 -236.

270. Shi Y, Kroeger P, Morimoto R. The Carboxyl-Terminal Transcription Domen of Heat Shock Factor 1 Is Negatively Regulated and Stress Responsive. Molecular and Cellular Biology. 1995. 15 (8): 4309 -4318.

271. Sheikh M. S. and Fornace A. J. Jr. Regulation of Translation Following Stress. Oncogene, 1999; 18: 6421-6128.

272. Shiau AK, Harris SF, Southworth DR, Agard DA. Structural Analysis of E. coli hsp90 reveals dramatic nucleotide-dependent conformational rearrangements. Cell. 2006.

273. Shopland L.S., Hirayoshi K., Fernandes M., Lis, J.T. HSF access to heat shock elements in vivo depends critically on promoter architecture defined by GAGA-factor, TFIID, and RNA-polymerase II binding sites. Genes Dev. 1995. 9 (22): 2756 2769.

274. Siddiqui WH and Barlow CA. Population growth of Drosophila melanogaster at constant and alterating temperatures. Ann.Entomol.Soc.Am. 1972. 65: 993 1001.

275. Silbermann R and Tatar M. Reproductive costs of heat shock protein in transgenic Drosophila melanogster. Evolution. 2000. 54: 2038 2045.

276. Somero» GN. Linking biogeography to physiology: Evolutionary and acclimatory adjustments of thermal limits. Front Zool. 2005; 2 (1): 1-9.

277. Sorensen J G, Kristensen T N, Loeschke V. The evolutionary and ecological role of heat shock proteins. Ecology Letters. 2003. 6. 1025 1037.

278. Sorensen JG, Loeschcke V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. J Insect Physiol. 2001; 47 (11): 1301 1307.

279. Sorensen JG, Nielsen MM, Kruhoffer M, Justesen J, Loeschcke V. Full genome gene expression analysis of the heat stress response in Drosophila melanogaster. Cell Stress Chaperones. 2005; 10 (4): 312 -28.

280. Serensen-JG, Nielsen MM, Loeschcke V. Gene expression profile analysis of Drosophila melanogaster selected for resistance to environmental stressors. J Evol Biol. 2007; 20(4): 1624-36.

281. Southgate R., Mirault M., Ayme A., Tissieres A. Organization, sequences and induction of heat shock genes. In: Changes in eukaryotic gene expression in response to environmental stress, Academic Press, New-York, 1985:3-30.

282. Spradling, А. С., D. Stern, A. Beaton, E. J. Rhem, T. Laverty et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 1999.153: 135-177.

283. Stratman R., Markow T. A. Resistance to thermal1 stress in desert Drosophila. Functional Ecology. 1998. 12: 965 970.

284. Terlecky S. R., Chiang H. L., Olson T. S., Dice J. F. Protein and Peptide Binding and Stimulation of In Vitro Lysosomal Proteolysis by the 73-kDa Heat Shock Cognate Protein. The Journal of Biological Chemistry. 1992. T. 267. V. 13. P. 9202 9209.

285. Timakov В., X. Liu, I. Turgut and P. Zhang Timing and Targeting of P-EIement Local Transposition in the Male Germline Cells of Drosophila melanogaster. Genetics. 2002. Vol. 160, 1011 -1022.

286. Tissieres A, Mitchell HK, Tracy UM. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs.J Mol Biol. 1974; 84 (3): 389 98.

287. Tomanek L The importance of physiological limits in determining biogeographical range shifts due to global climate change: the heat-shock response. Physiol Biochem Zool. 2008; 81 (6): 709-17.

288. Tomanek L, Somero GN. Time course and magnitude of synthesis of heat-shock proteins in congeneric marine snails (Genus tegula) from different tidal heights.Physiol Biochem Zool. 2000; 73 (2): 249 56.

289. Tomanek L. Two-dimensional gel analysis of the heat-shock response in marine snails (genus Tegula): interspecific variation in protein expression and acclimation ability. J Exp Biol. 2005; 208 (Pt 16): 3133 -43.

290. Tower, J., G. H. Karpen, N. Craig and'A. C. Spradling. Preferential transposition of Drosophila P elements to nearby chromosomal sites. Genetics. 1993. 133: 347 359.

291. Tsukiyama, Т., P. B. Becker and C. Wu. ATP-dependent nucleosome disruption at a heat-shock promoter mediated by binding of GAGA transcription-factor. Nature. 1994. 367: 525-532.

292. Udvardy, A., E. Maine and P. Schedl. The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains. J Mol Biol. 1985. 185:341 -358.

293. Ulmasov H. A., Karaev К. K., Lyashko V. N., Evgen'ev M. B. Heat-shock response in camel (Camelus dromedarius) blood cells and adaptation to hyperthermia. Comp. Biochem. Physiol. В., 1993. 106 (4): 867 872.

294. Ulmasov KA, Shammakov S, Karavaev K, Evgen'ev MB. Heat shock proteins and thermoresistance in lizards. Proc Natl Acad Sci USA. 1992. V. 89, PP 1666 1670.

295. Uma S., Thulasiraman V., Matts R. L. Dual Role for HSC70 in the Biogenesis and Regulation of the Heme-regulated Kinase of the Alpha Subunit of Eukaryotic Translation Initiation Factor 2. Molecular and Cellular Biology. 1999. T. 19. V.9. P. 5861 5871.

296. Velazquez JM, Lindquist S. hsp70 nuclear concentration during environmental stress and cytoplasmic storage during recovery. Cell. 1984. 36 (3): 655 62.

297. Velikodvorskaia W, Lyozin GT, Feder ME, Evgen'ev MB. Unusual arrangement of the hsp68 locus in the virilis species group of Drosophila implicates evolutionary loss of an hsp68 gene. Genome. 2005; 48 (2): 234 40.

298. Venkatachalam K, Montell C. TRP channels. Annu Rev Biochem. 2007. 76: 387417.

299. Viera J., Viera C.P., Hartl D.L., Losovskaya E.R. Factors contributing to the hybrid dysgenesis syndrome in Drosophila virilis!! Genet Res., 1998. V. 71 P. 109 117

300. Voellmy R Feedback regulation of the heat shock response Handb Exp Pharmacol. 2006. (172): 43 68.

301. Voellmy R. On mechanisms that control heat shock transcription-'factor activity in metazoan cells. Cell Stress Chaperones. 2004; 9 (2): 122-133.

302. Vogel JL, Parsell DA, Lindquist S. Heat-shock proteins Hspl04 and Hsp70 reactivate mRNA splicing after heat inactivation. Curr Biol. 1995. V. 5 (3). P. 306 17.

303. Vries R. G. et al. Heat Shock Increases the Assotiation of Binding Protein-1 with Initiation Factor 4E. The Journal of Biological Chemistry, 1997, 272 (52): 32779 32784.

304. Walser JC, Chen B, Feder ME Heat-shock promoters: targets for evolution by P transposable elements in Drosophila. PLoS Genet. 2006; 2 (10): el65.

305. Walter L., Rauh F., Gunther E. Comparative analysis of the three major histocompatibility complex-linked heat shock protein 70 (hsp70) genes of the rat. Immunogenetics. 1994. 40: 325 330.

306. Wang T, Montell C. Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila. Pflugers Arch. 2007; 454 (5): 821 -47.

307. Weber JA., Taxman DJ., Q. Lu and Gilmour DS. Molecular architecture of the hsplO promoter after deletion of the TATA box or the upstream regulation region. Molecular and Cellular Biology. 1997. Vol. 17. p. 3799 3808.

308. Welte MA, Tetrault JM, Dellavalle RP, Lindquist SL.A new method for manipulating transgenes: engineering heat tolerance in a complex, multicellular organism. Curr Biol. 1993; 3 (12): 842 53.

309. Wendy К. Bern and William R. Engels A Stable Genomic Source of P Element Transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 19881 118: 461 -470.

310. William L. Kelley. How J-domains turn on Hsp70s. Curr. Biol., 1999. 9: 305 308.

311. Wisniewski J., Orosz,A., Allada,R. and Wu,C. The C-terminal region of Drosophila heat, shock factor (HSF) contains a constitutively functional transactivation domain. Nucleic Acids Res., 1996. V. 24, P. 367 374.

312. Wu C. Heat Shock Transcription Factors: Structure and Regulation. Annual Review of the Cellular and Development Biology. 1995. №11. P.' 441 469.

313. Wullschleger S, Loewith R, Hall MN. TOR signaling in growth and metabolism. Cell: 2006; 124 (3): 471*-84.

314. Xiao H and Lis JT. Heat shock and developmental regulation of the Drosophila melanogaster hsp83 gene. Mol Cell Biol. 1989; 9 (4): 1746 53.

315. Xing, H. Y., D. C. Wilkerson, C. N. Mayhew, E. J. Lubert, H. S. Skaggs et al.,, Mechanism of hsp70\ gene bookmarking.Science. 2005. 307: 421 -423.

316. Xu H, Ramsey IS, and Kotecha SA. et al., TRPV3 is a calcium-permeable temperature-sensitive cation channel. Nature. 2002. 418: 181 186.

317. Xu Y, Lindquist S. Heat-shock protein hsp90 governs the activity of pp60v-src kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. US. 1993. 90 (15): 7074 7078.

318. Yang S.-H., Hussenzweig A., Li L. et al. Modulation of thermal induction of hsplO expression by Ku autoantigen or its individual subunits. Mol. Cel. Biol., 1996. T. 16. V.7. P. 3799-3806.

319. Yanhong Shi, Morimoto R. Molecular chaperones as HSFl-specific transcriptional repressors. Genes and Development. 1998. T. 12. P. 654 666.1. Q f?

320. Yano M, Nakamuta S, Wu X, OEumura Y, Kido H. A novel function of 14-3-3 protein: 14-3-3zeta is a heat-shock-related molecular chaperone that dissolves thermal-aggregated proteins. Mol Biol Cell. 2006; 17 (11): 4769 79.

321. Yao J, Munson KM, Webb WW, Lis JT. Dynamics of heat shock factor association with native gene loci in living cells. Nature. 2006; 442 (7106): 1050 3.

322. Yueh A. and Schneider R J. Translation by ribosome shunting on adenovirus and hsp70 mRNAs facilitated by complementarity to 18S rRNA. Genes Dev., 2000, 14: 414-421.

323. Zelentsova E., Poluectova H., Mnjoian L., Lyozin G., Veleikodvorskaja V., Zhivotovsky L., Kigwell M.G., Evgen'ev MB. Distribution and evolution of mobile elements in the virilis species group of Drosophila. Chromosoma. 1999. V. 108 (7) P. 443 -456.

324. Zhao Y, Wang W, Qian L. Hsp70 may protect cardiomyocytes from stress-induced injury by inhibiting Fas-mediated apoptosis.Cell Stress Chaperones. 2007; 12 (1): 83 95.

325. Zhang, P., and A. C. Spradling. Efficient and dispersed local /"-element transposition from Drosophila females. Genetics. 1993. 133: 361 -373.

326. Zhong M., Kim, S.-Y. and Wu, C. Sensitivity of Drosophila heat shock transcription factor to low pH. J. Biol. Chem., 1999.V. 274, P. 3135 3140.

327. Zhong M., Orosz, A. and Wu, C. Direct sensing of heat and oxidation by Drosophila heat shock transcription factor. Mol. Cell 1998. V. 2, P. 101-108.

328. Zou J., Guo, Y., Guettouche, Т., Smith, D.F. and Voellmy, R. Repression of heat shock transcription factor HSF1 activation by Hsp90 (Hsp90 complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1. Cell. 1998. 94: 471 -480.г

Информация о работе

Зацепина, Ольга Георгиевна
доктора биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям обитания - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям обитания - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы