Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Геномная организация и регуляция экспрессии генов теплового шока у организмов с различной термальной адаптацией

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Геномная организация и регуляция экспрессии генов теплового шока у организмов с различной термальной адаптацией"

На правах рукописи

Астахова Любовь Николаевна

ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА У ОРГАНИЗМОВ С РАЗЛИЧНОЙ ТЕРМАЛЬНОЙ АДАПТАЦИЕЙ

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 з \т 2щ

Москва, 2014 г.

005549300

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных механизмов биологической адаптации Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук

Научный руководитель: Старший научный сотрудник Федерального

государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук,

кандидат биологических наук Гарбуз Давид Григорьевич

Заведующий лабораторией Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биофизики клетки Российской академии наук, доктор биологических наук, Винокуров Максим Григорьевич

Научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биологии гена Российской академии наук, кандидат биологических наук Воробьева Надежда Евгеньевна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт цитологии РАН

Защита диссертации состоится ^■¿'¿¿¿¿/'/¿^ 2014 г. в-/г^часов на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991 г. Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991 г. Москва, ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета^, кандидат химических наук ,-у /?

Официальные оппоненты:

рицын А. М.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Белки теплового шока (БТШ или Hsp - Heat shock proteins) являются одним из основных факторов, обеспечивающих адаптацию организмов к неблагоприятным условиям среды обитания. Эти белки обеспечивают фолдинг новосинтезированных полипептидов, транспорт белков через мембраны, а также участвуют в регуляции сигнальных путей, контролируя активность многих протеинкиназ и факторов транскрипции. Защитная функция БТШ в условиях стресса основана на их способности восстанавливать структуру денатурированных белков и препятствовать образованию белковых агрегатов. БТШ делятся на группы в соответствии с их молекулярными массами. Гены, кодирующие БТШ, были названы генами теплового шока (далее "гены ТШ"). Условно выделяют две группы этих генов: индуцируемые и конститутивные. В нормальных условиях экспрессия индуцируемых генов находится, как правило, на низком уровне, а при стрессе возрастает многократно (в десятки и сотни раз). Конститутивные гены по структуре гомологичны индуцируемым на 50 - 75%, они стабильно транскрибируются в нормальных условиях, а при стрессе уровень их экспрессии увеличивается незначительно.

Индуцируемый характер экспрессии генов ТШ у всех исследованных в этом плане эукариот определяется наличием в составе регуляторной области выше ТАТА-бокса консервативных последовательностей, названных HSE (heat shock elements) (Tian, 2010). С этими последовательностями связывается транскрипционный фактор HSF (Heat Shock Factor), активирующийся при различных видах стресса (Morimoto 1998). Таким образом считается, что в плане структуры генов и регуляции экспрессии система ответа на тепловой шок характеризуется значительной эволюционной консервативностью. При этом основные работы, позволяющие сделать такой вывод, проводились на небольшом количестве модельных лабораторных видов. На природных популяциях, обитающих в условиях, контрастных по температурному режиму, данный вопрос изучен недостаточно. У млекопитающих особый интерес в плане структуры и регуляции экспрессии представляет кластер генов hsp70 (группа hspAl), находящийся в локусе главного комплекса гистосовместимости (МНС - major histocompatibility complex) и состоящий из трех генов: двух индуцируемых и одного с конститутивным характером экспрессии. Представляло интерес провести сравнение структуры и уровня активности промоторов кластера генов hspAl у видов млекопитающих, живущих в разных климатических зонах и в разной степени подверженных стрессовым воздействиям окружающей среды. В качестве вида, наиболее устойчивого к неблагоприятным климатическим условиям, был выбран верблюд Camelus dromedar'ms (дромадер). Отличия в структуре и уровне экспрессии генов hsp70 верблюда и других млекопитающих могут иметь важное адаптивное значение.

Значительный интерес представляет сравнение структуры и характера экспрессии генов ТШ у насекомых, обитающих в неблагоприятных условиях окружающей среды. К настоящему моменту достаточно полно изучен ответ на

ТШ у видов семейства Drosophila. Данных по адаптации диких популяций видов двукрылых, обитающих в контрастных условиях окружающей среды, гораздо меньше. Объектами нашего исследования стали два вида семейства Stratiomyidae, Stratiomys singularior и Oxycera pardalina. Личинки S. singularior разиваются в прибрежной зоне гиперсалинных озер Крыма, температура которых летом может достигать 40°С. Средой обитания личинок О. pardalina являются холодные родниковые воды (4 - 5°С). Сопоставление данных, полученных на этих видах, может дать информацию об эволюционных изменениях структуры и регуляции экспрессии генов ТШ в ходе адаптации организмов к неблагоприятным условиям среды обитания.

Цель работы

Определение закономерностей в эволюционных изменениях структуры и геномной организации генов, относящихся к группам hsp70 и hsp83, у организмов с различным уровнем термальной адаптации. Сравнительный анализ структуры промоторов и поиск регуляторных последовательностей и транскрипционных факторов, отвечающих за различия в регуляции экспрессии генов hsp70 и hsp83 у организмов, относящихся к разным филогенетическим группам и обитающих в контрастных климатических условиях.

Задачи исследования

1.Исследовать структуру кластера МНС-ассоциированных генов hsplO верблюда С. dromedarius. Провести сравнительный анализ структуры и геномной организации генов hsp70 С. dromedarhis и других видов млекопитающих.

2.Клонировать и секвенировать гены hsp83 и описать их геномную организацию у двух контрастных в отношении условий обитания видов двукрылых - S. singularior и О. pardalina. Сравнить структуру генов hsp83 S. singularior, О. pardalina и других видов двукрылых.

3.Провести сравнительный анализ структуры регуляторных областей генов hsplO верблюда С. dromedariits и других видов млекопитающих. Сравнить активность промоторов генов группы hspAl С. dromedarius и Н. sapiens в культуре клеток НЕК293.

4.Проанализировать структуру, характер взаимодействия с транскрипционными факторами и уровень транскрипционной активности регуляторных областей генов hsp70 S. singularior и D. melanogaster.

5.Провести сравнительный анализ структуры регуляторных областей генов hsp83 S. singularior, О. pardalina и других видов двукрылых. Сравнить активность промоторов генов hsp83 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток D. melanogaster Schneider 2.

Научная новизна работы и практическая ценность

В данной работе впервые описана структура кластера МНС-ассоциированных генов hsp70 верблюда С. dromedarius. Полученные результаты

показали, что кластер генов hsp70 верблюда имеет несколько более компактную структуру по сравнению с человеческим. Результаты сравнения генов hsp70 верблюда и ряда других видов млекопитающих показали, что кластер МНС-ассоциированных генов hsp70 млекопитающих в целом высококонсервативен. Обнаруженные различия заключаются только в расстояниях между генами и размере интрона конститутивного гена hspAlL. Некоторые данные заставляют предположить, что высокая консервативность кластера генов hsp70 характерна не только для млекопитающих, но и в целом для позвоночных. У насекомых, относящихся к отряду Díptera (двукрылые) нами впервые обнаружен новый, ранее не описанный, вариант строения кластера генов hsp83 в виде тандемного повтора.

Были получены данные по сравнению активности промоторов генов hsp70 верблюда и человека. Несмотря на то, что промоторные области генов hsp70 млекопитающих достаточно сходны по наличию и локализации сайтов связывания основных транскрипционных факторов, было показано, что активность промоторов hsp70 этих двух видов значительно различается в норме и при ТШ.

Показано, что система регуляции экспрессии генов hsp70 очень вариабельна и у некоторых видов помимо основного транскрипционного фактора (HSF), требует участия других факторов, участвующих в процессах модификации хроматина или задействованных на других этапах транскрипции. Нащи исследования в этом направлении свидетельствуют о том, что система регуляции ответа на стресс достаточно пластична, и в ходе эволюции подвергалась множеству тонких "настроек", оптимизирующих экспрессию отдельных генов ТШ у разных видов в плане особенностей геномного окружения, физиологии организма и условий среды обитания.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на конференциях: 16 международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 16-21 апреля 2012 года); XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2013» (Москва, 8-13 апреля 2013 года); 38 Federation of European Biochemical Societies CONGRESS 2013 "Mechanisms in Biology" (Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013 года).

Публикации

По теме диссертации было опубликовано 6 печатных работ, 3 из которых -статьи в рецензируемых научных журналах.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Список литературы», «Приложения». Работа изложена на ^страницах машинописного текста, содержит /<Г таблиц(ы) и -/^рисунков. Библиография включает^У источников.

Результаты исследования

1. Клонирование и анализ структуры кластера генов \tspA 1 у верблюда С. йготеёагшь

Для изучения строения и организации генов к,чр70 из геномной ДНК верблюда была получена библиотека на основе фага X. После скринирования библиотеки и секвенирования клонов, полученных в ходе скрининга, была полностью определена структура кластера МНС-ассоциированных генов одногорбого верблюда. Первый клон, обозначенный в ходе скрининга библиотеки как СЗ, содержит два полных гена /м/?70 и короткий 5'-фрагмент третьего гена. Два полноразмерных гена являются гомологами человеческих генов НЯРЛ1Р и Н5РА1А. Третий ген, фрагмент которого содержится в составе фага СЗ, гомологичен гену Н5РА1В. Гены ИврА1Ь и ИярА1А находятся в инвертированной ориентации, в то время как ИярАИЗ расположен в тандемной ориентации по отношению к гену Н.чрЛ 1А. Перекрывающийся с фагом СЗ клон N10 содержит полноразмерный ген А ярА1В с протяженными 5'- и З'-фланкирующими последовательностями (рис. 1А).

А

нн в

■ III

СЗ

Н X

=>тт

RR

Н Н

-н-

R

НХ ВВ

НХ ВВ

N10

i>

RR

R R R R

В

HSPA1L HSPA1A

>

v-

V

HSPA1L HSPA1A

—Ф

7643

9793

HSPA1B j-

HSPA1B j-k_

Рис. 1. А. Рестрикционная карта фагов СЗ и N10. В - Ват\\\. Н - HindiII, R -ЕсоШ. X - ХЬа\: В. Структура кластера генов hspAl у С. dromedarius: С. Структура кластера генов HSPA1 Н. sapiens. Даны расстояния между генами в парах оснований.

Анализ структуры фагов показал, что у верблюда кластер генов hspA/ имеет более компактную структуру по сравнению с человеческим. Расстояние между точками старта транскрипции генов hspAlA и hspAlL у верблюда составляет 414 п.о. (пар оснований), в то время как у И. sapiens — 505 п.о. Гены hspAIA и hspAIВ верблюда разделяют 7643 п.о., а у человека - 9793 п.о. (рис. IB,С). Последовательность кластера генов hspAI верблюда с прилегающими областями длиной 28255 п.о. была депонирована в GenBank под номером JF837187.

6

Для установления числа копий генов группы ИврА1 в геноме и уточнения структуры исследуемого нами кластера, была проведена Саузерн-гибридизация с геномной ДНК верблюда. В качестве зонда был использован меченый фрагмент гена hsp.HA. Из рисунка видно, что фрагменты, полученные при рестрикции геномной ДНК, соответствуют по длине фрагментам, клонированным в составе фагов СЗ и N10 (рис. 2).

Гены ИэрА1А/В у верблюда, как и у других млекопитающих (в том числе у человека), не имеют в своей структуре интронов. Ген к.ърАИ С. с!готес1аг/их содержит два экзона - первый длиной 137 п.о., и второй - 2254 п.о., в котором находится открытая рамка считывания. Расположенный между ними интрон значительно короче, чем у человека (2898 п.о.). Длина его составляет 1169 п.о. Границы транскрипционных областей генов ЬзрА1 С. ¿готедапт были определены методом 5'- и З'-ЯАСЕ-анализа.

Рис. 2. Саузерн-гибридизация геномной ДНК верблюда с ПЦР-фрагментом гена Н5рЛ1Л. 1 - ВатН1, 2 -ХЬа\, 3-ХЬаУВатШ, 4 -ЕсоШ.

I 2 3 4 M

kb

_lü

-8

_6

_5

_4

— 3.5

Последовательности открытых рамок считывания генов hspAlA и hspAIB практически идентичны друг другу и содержат всего четыре нуклеотидных замены, три из которых приводят к замене аминокислоты: A/G в положении 55, А/Р в положении 70 и T/S в положении 145. Таким образом, замены обнаруживаются в N-концевом домене белка, выполняющем функцию АТФ-азы. Наши результаты подтверждают известную консервативность белков семейства Hsp70 в целом и группы генов hspAl млекопитающих в частности.

Сходство последовательностей открытых рамок считывания генов hspAlL и hspAlA/B составляет 82%. При этом кодируемые ими белки идентичны на 90%. Большинство замен приходится на С-концевой домен, что согласуется с литературными данными о более высокой вариабельности этого участка белков семейства Hsp70.

5'-нетранслируемые области (5'-UTR) генов hspAlA и hspAIB идентичны на 82%. Интересно, что в составе 5'-UTR гена hspAlA верблюда обнаруживается старт-кодон ATG, находящийся перед основной открытой рамкой считывания на расстоянии 174 п.о. Сразу за ним следует стоп-кодон TAG (Kozak 1987). Поиск по базе нуклеотидных последовательностей показал наличие подобных преждевременных старт-кодонов в составе 5'-UTR некоторых опубликованных последовательностей мРНК генов hspAlA Bos taurus и Biibalits bubalis (номера в GenBank NM_174550.1 и HM025989.2). Данные преждевеременные старт-кодоны

некоторых генов hsp70 копытных, по-видимому, не участвуют в инициации трансляции, так как находятся в неоптимальном нуклеотидном окружении (Kozak 1987).

З'-UTR генов hspAlA и hspAlB С. dromedarius более вариабельны по сравнению с 5'-UTR и сходство последовательностей составляет только 50%. В составе обеих З'-UTR обнаруживается сигнал полиаденилирования ААТААА. З'-UTR гена hspAlL несёт альтернативный сигнал AGTAAA, аналогично соответствующим генам человека и крысы Rattus norvégiens. Все три мРНК С. dromedarius полиаденилируются, о чём говорят данные 3'-RACE-aHanH3a.

2. Дифференциальный анализ экспрессии генов hspIA, hspAIB и

ItspA IL

Для качественного анализа экспрессии генов hspAlA/B и hspAlL была проведена обратнотранскриптная ПЦР с праймерами к данным генам. Материалом для исследования служила тотальная РНК, выделенная из двух фракций лимфоцитов и сердечной мышцы верблюда. Первая фракция была взята в качестве контроля при температуре 37°С. Лимфоциты второй пробы были подвергнуты тепловому шоку (43°С в течение 20 мин).

При RT-PCR с тотальной РНК, полученной из обеих фракций лимфоцитов и сердечной мышцы, подтверждается транскрипция как гена hspAlL, так и хотя бы

Рис. 3. Экспрессия МНС-ассоциированных генов /крУО верблюда. А. RT-PCR с мРНК из лимфоцитов со

специфичными парами

праймеров. В. RT-PCR с мРНК. выделенной из ткани сердечной мышцы. "-К Г" - отрицательный контроль (проба без обратной траскриптазы).

В с -юг

1 2 3 1 2 3 М

одного из генов hspAlA и hspAIB (рис. ЗА). А

43 С 20 min

12 3 12 3 12 3

hxpA U/B

hspAim (1356|

Г

hspAlAJB (1356)

Г

м

hspA IL (839)

hspAlA/B (1356)

-

г —

hsp70A IL (839) «4 ~

После теплового шока при ПЦР обнаруживается дополнительный фрагмент длиной 1252 п.о. Секвенирование показало, что он относится к кДНК гена grp78,

который кодирует гомолог Hsp70, локализующийся в эндоплазматической сети (рис. ЗА).

Результаты RT-PCR подтверждаются путём З'-ЯАСЕ-анализа. Данный метод позволил обнаружить З'-нетранслируемые фрагменты, специфичные для всех трёх генов, как в контрольной, так и в подвергнутой тепловому шоку пробе. Таким образом, можно сделать вывод, что все три гена транскрипционно активны в периферических лимфоцитах.

3. Клонирование и анализ структуры кластера генов Itsp83 у S. singularior и О. parclalina

Для изучения структуры генов hsp83 были секвенированы рекомбинантные клоны, которые были выделены из геномных фаговых библиотек, полученных из ДНК 5. singularior и О, pardalina. Было получено 7 рекомбинантных фагов из S. singularior (рис. 4А). В одном из них (СЗ) были обнаружены фрагменты двух генов Iisp83, находящиеся в тандемной ориентации на расстоянии около 12,5 т.п.о. друг от друга. Обнаруженные гены были названы hsp83Sl и hsp83S2 по аналогии с номеклатурой генов hsplO S. singularior. Остальные клоны (С2, С4, С5, С7 и С8) содержат длинные фрагменты, перекрывающиеся различными областями с фагом СЗ. Оба гена hsp83 S. singularior имеют типичную структуру, характерную для генов группы hsp90 всех известных двукрылых, и состоят из 5'-нетранслируемой области, образующей короткий первый экзон, одного интрона и второго экзона, содержащего рамку считывания с последующей З'-нетранслируемой областью (рис. 4В). С помощью 5'- и З'-ЯАСЕ-анализа были определены точки старта транскрипции, локализация интрона и З'-конец мРНК. Длина открытых рамок считывания (ORF) двух генов S. singularior составляет 2157 п.о. Сходство последовательностей ORF гена hsp83 D. melanogasler и других двукрылых составляет 80%. Идентичность белков hsp83 S. singularior составляет около 85% с hsp83 D. melanogasler. Полученные последовательности были депонированы в GenBank: JN627861 (10320 п.о.) и JN627862 (8230 п.о.) (рис. 4В).

При секвенировании перекрывающихся фрагментов разных клонов был обнаружен индивидуальный полиморфизм аллелей генов hsp83 S. singularior и фланкирующих регионов: 13 одиночных нуклеотидных замен в пяти аллелях гена hsp83Sl, две из которых приводят к замене аминокилот в белке, и 7 незначащих замен в двух аллелях hsp83S2. Отдельные замены в 5'-фланкирующей области гена hsp83SI S. singularior дают около 1% различий между клонами на расстоянии до 2670 п.о. от старта транскрипции. Секвенирование З'-фланкирующей области клонов с hsp83Sl показало наличие коротких делеций и инсерций (около 6%) на расстоянии 1400 п.о. после З'-нетранслируемой области.

При сравнении ORF hsp83Sl и hsp83S2 были обнаружены 43 нуклеотидные замены, 15 из которых приводят к замене аминокислотных остатков. Первые экзоны обоих генов имеют 100% сходство последовательностей. При сравнении интронов генов hsp83Sl и hsp83S2 была обнаружена только одна замена.

С5

С6

В

С

сз Н

С4 х I

I—

С8

х X I

С2 х и ххх

I-ь^дь-ц

X н ххх

_и_II

X н ххх

_и_II

ОН

10.3 кЬ

И.чр835/

7 кЬ

1 н х ххх

ш

н

I—I

1кЬ

ИьрНЗР! н

X н ххх X н

-и-о^,» I I

С7

Н X XX X

J_|__11

II X

I I

Н X XX X

J_I_X1

18 кЬ

1щ)8332

3.5 кЬ

х хнх н I

I—]——

ПН н н

X

Ьрвзрг

Рис. 4. Общая организация и номенклатура генов /ирвЗ у Би-айотув $1П%и1а>-\ог и Охусега рагёаИпа. (А) Структура рекомбинантных фагов, полученных из геномной библиотеки 5. ът^апог. (В) Организация кластера генов 1кр83 8. ят^Шгюг. (С) Структура фагов из геномной библиотеки О. раЫаИпа. содержащих гены Изр83. Отдельные гены /гярвЗ показаны серыми прямоугольниками со стрелками, разделенными интронами. Заштрихованными прямоугольниками обозначены тандемные повторы, обнаруженные во фланкирующих районах генов 1ир83 О. рагс!аНпа. Направление повторов показано черными стрелками. Н - НтсЛII. X —ХЬа\. Локализация и размеры рестрикционных фрагментов в т.п.о. показаны в соответствии с анализм по Саузерну (см. рис. 5).

Данные по количеству замен в составе кодирующих последовательностей генов кзр83 5. $1п%и1аг'юг свидетельствуют об отсутствии конверсии между двумя генами. Этим гены Изр83 отличаются от генов Ьзр70 того же вида 5. я1п^1апог и

D. melanogaster, для которых было показано поддержание консервативной структуры по механизму генной конверсии (Garbuz, 2011).

При скринировании геномной библиотеки О. pardalina было получено 2 неперекрывающихся клона, (обозначенных 1 и 5), каждый из которых содержал по одному полноразмерному гену hsp83 (рис. 4С). Структуры этих клонов похожи, но не идентичны. Анализ З'-фланкирующих областей генов hsp83 клонов выявил отсутствие гомологии последовательностей на расстоянии более чем 1000 п.о. после З'-нетранслируемой области. 5'-фланкирующие области также отличаются друг от друга рядом делеций и инсерций, так что сходство последовательностей данных областей составляет около 83%. Полученные данные говорят о том, что в составе фагов I и 5 были клонированы два разных гена hsp83 О. pardalina (рис. 4С). Эти гены были обозначены hsp83P1 и hsp83P2 и депонированы в GenBank: JN627859 (14519 п.о.) и JN627860 (14764 и.о.), соответственно.

Как видно из рис. 5С, фаги 1 и 5 содержат длинные повторяющиеся последовательности в 5'- и З'-фланкирующих областях генов hsp83. Выявленные повторы и общая структура клонов 1 и 5 позволяют предполагать, что две копии гена hsp83 О. pardalina находятся в тандемной ориентации, так же как и гены hsp83 S. singularior, но на расстоянии не менее чем 12 т.п.о.

Саузерн-гибридизация подтверждает, что оба вида содержат по две копии гена hsp83. При этом наличие двух гибридизующих фрагментов 7 и 3,5 т.п.о.) у О. pardalina соответствует генам hsp83PI и hsp83P2, что согласуется с описаной структурой фагов 1 и 5 (рис. 5).

Общая структура генов hsp83 О. pardalina в основном не отличается от S. singularior. Сходство последовательностей ORF hsp83Pl и hsp83P2 составляет 99% (14 незначащих замен). Первый экзон и интрон hsp83Pl и hsp83P2 идентичны на 99%. Сходство последовательностей ORF между S. singularior и О. pardalina состаляет 83% по нуклеотидным последовательностям и по кодирующему белку - 91%. Первые экзоны идентичны на 60% между генами hsp83SI и hsp83Pl.

1 2

hsp83Pl(7kb)

hsp83P2 (3.5Щ

kbs — in —

i — J.J —

r hsp83S2(~18kh) . hsp83Sl(10.3kb)

Рис. 5. Саузерн-анализ геномной ДНК,

обработанной эндонуклеазой рестрикции Шпс1\\\. Охусега parda¡ina (1) и БГгаПотув singularior (2). Размеры основных рестрикционных фрагментов даны в т.п.о. Стрелками показаны

возможные псевдогены Изр83 у О. раЫаПпа.

З'-нетранслируемые области генов hsp83SI и 52 значительно различаются по структуре. Интересно, что в генах hsp83 5. singularior обнаружены два альтернативных полиА-сигнала, что теоретически может приводить к

образованию мРНК с различной длиной З'-UTR (Liu, 2006). Сходство последовательностей З'-нетранслируемых областей генов hsp83Sl и hsp83S2 составляет 89%. С помощью З'-RACE определена длина З'-нетранслируемых областей мРНК hsp83S¡ и hsp83S2, составляющая 342 п.о. и 345 п.о., соответственно.

У О. pardalina в генах hsp83P¡ и hsp83P2 З'-нетранслируемая область имеет длину 344 п. о. и содержит один классический полиА-сигнал.

4. Сравнение последовательностей генов hsp83 и hsp70 у Stratiomys singularior и Stratiomys japónica

Было проведено сравнение фрагментов ORF генов hsp83 (703 п.о.) и hsp70 (1135 п.о.) еще одного вида семейства Stratiomyidae, Stratiomys japónica, обитающего в горячих вулканических источниках на острове Кунашир (Курильские острова) с генами hsp83 и hsp70 S. singularior. Фрагменты генов депонированы в GenBank (EU523049 для hsp83 и JN627863 для hsp70). Сходство сравниваемых фрагментов генов hsp83 S. singularior и S. japónica составляет 80%. Идентичность секвенированного фрагмента гена hsp70 S. japónica и гена hsp70SI S. singularior равна 95%. Эти данные, так же как и анализ полиморфизма генов hsp83 S. singularior, свидетельствуют о значительно более высокой скорости эволюционной дивергенции кодирующих областей генов hsp83 по сравнению с генами hsp70 видов рода Stratiomys. При этом промоторы генов hsp83, напротив, гораздо более консервативны по сравнению с промоторами генов hsp70 у всех описанных видов отряда двукрылых (см. ниже).

5. Анализ экспрессии генов hsp83 у S. singularior и О. pardalina

Так как анализ последовательностей показал значительную разницу в З'-нетранслируемых областях генов hsp83Sl и hsp83S2, становится возможным определить экспрессию обоих генов отдельно друг от друга с помощью 5'- и З'-RACE. Данные 5'- и З'-RACE и RT-PCR показывают, что оба гена активны у S. singularior.

Нозерн-гибридизация со специфичными пробами к генам hsp83 обоих видов подтверждает результаты RT-PCR. мРНК hsp83 S. singularior и О. pardalina присутствует в нормальных условиях и индуцируется после теплового шока. Даже после 24 часов после теплового шока у обоих видов обнаруживается мРНК hsp83 в достаточно высоких концентрациях. Можно предположить, что мРНК hsp83 обладает высокой стабильностью и/или пролонгированной транскрипцией у S. singularior и О. pardalina в сравнении с мРНК hsp70, которая деградирует через 12 часов после Tili (Garbuz, 2011). Нозерн-гибридизация не показала значительных различий в накоплении мРНК hsp83 у сравниваемых видов (рис. 6А). Белок Hsp83 в личинках изучаемых видов при нормальных условиях обнаруживается методом двумерного электрофореза (рис. 6В). Идентификация белков проводилась методом пептидного фингерпринтинга. Молекулярные массы и изоэлектрические точки белков S. singularior (Hsp83Sl и Hsp83S2),

определенные методом двумерного электрофореза и масс-спектрометрией, соответствуют значениям, полученным при трансляции последовательностей с помощью программы СепеЯиппег (82 кЭ и р1 = 4.91 для Нзр8351, и 82 кЭ и р1 = 4.92 для НБр8382). У О. рагЫаПпа белки, кодируемые генами кяр83Р1 и Ь.чр83Р2, идентичны и по молекулярной массе составляют 83 кЭ, а изоэлектрическая точка равна 4.98.

А

S. singularior

1 2 3

О. pardalina

1 2 3

• Actin

Рис. 6. (А) Нозерн-гибридизация тотальной мРНК S. singularior и О. pardalina, выделенной из личинок при нормальной температуре и после теплового шока с hsp83-пробами. S. singularior: 1 -контроль (25 °С); 2 - 43°С; 3 -43°С, 24 ч восстановления. О. pardalina: 1 - контроль (4°С); 2 - 40°С; 3 - 40°С, 24 ч восстановления. Внизу показана гибридизация с зондом к мРНК актина в качестве нормализации количества РНК. (В) Двумерный электрофорез

белков S. singularior и О. pardalina, выделенных после теплового шока (43 °С для S. singularior и 40 °С для О. pardalina) и 24 ч восстановления. Стрелками показаны конститутивный (Hsc70) и индуцибельный Hsp70 и Hsp83.

6. Сравнительный анализ структуры промоторных областей генов группы hspAl верблюда и других видов млекопитающих

Промоторы генов hspAlA и hspAlB у С. dromedarius содержат канонический ТАТА-бокс, в то время как в промоторе hspAlL он отсутствует. В этом плане промоторы у верблюда не отличаются от других видов млекопитающих. С помощью программ Matlnspector и MEME был проведен сравнительный анализ последовательностей промоторов генов группы hspAI верблюда с промоторами ортологичных генов других видов млекопитающих (Bos lawns, Equus caballus, Sus

scrofa, Homo sapiens, Canis familiaris, Pteropus vampyrus, и Tursiops truncatus), последовательности которых доступны в GenBank. На рис. 7 показано расположение наиболее значимых регуляторных элементов (ТАТА-бокс, HSE, сайты связывания факторов NF-Y и Spl), которые присутствуют в промоторах генов hsp.41А и hspA IL у всех 8 рассмотренных видов.

Кроме того, в составе промоторной области гена hspAlL человека и других приматов (Gorilla gorilla и Pan troglodytes) обнаруживается вставка длиной 100 п.о., содержащая два сайта узнавания гомеодомена, отсутствующая в промоторах генов hspA IL других видов млекопитающих. Высокая консервативность промоторных областей генов hsp70 характерна исключительно для позвоночных и не наблюдается у других описанных групп организмов, в частности у двукрылых (см. ниже). Тем не менее, на фоне общей высокой консервативности при сравнении регуляторных последовательностей генов hsp70 млекопитающих обнаруживаются ряд нуклеотидных замен, вставок и делеций, которые могут обусловливать разницу в активности промоторов у разных видов.

100 bps

HSPA IL

Sp1 Sp1

Homo sapiens

Sp1 ^ Sp1

Sus scrofa _

Bos taurus -

Camelus dromedarius Equus caballus Tursiops truncatus Canis familiaris Pteropus vampyrus

HSPA IA

Sp1 NF-Y/Sp1 HSE NF-Y/Spl HSE MF-Y(Sp1 TATA Sp1 HSE NF-Y/Sp1 HSE NF-Y/Sp1 TATA

HSE NF-Y/Sp1 HSE NF-Y/Sp1 TATA

Рис. 7. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей промоторных областей генов 1прА1А, и 1ирА1Ь С. dromedаrius и других видов млекопитающих. Стрелочками показаны точки инициации транскрипции.

7. Сравнение активности промоторов hsp70 С. dromedarius и Н. sapiens в культуре клеток НЕК293

Активность промоторов генов группы hspAl С. dromedarius и Н. sapiens сравнивали с использованием ряда репортерных конструкций, в которых рамка считывания гена люциферазы находилась под контролем различных участков регуляторных областей генов hspAlA, hspAl В и hspAIL.

Для исследования активности промоторов индуцируемого гена hspAl А были получены пять вариантов конструкций. Две конструкции под контролем промоторов hspAl А верблюда различаются между собой по длине 5'-нетранслируемой области (-413...+31 п.о. и -413...+192 п.о. относительно точки

старта транскрипции), аналогичные две конструкции были получены для определения активности промотора гена hspAl.4 человека (-505...+25 п.о. и -505/+221, соответственно). В пятой конструкции в 5'-нетранслируемой области гена hspAIA верблюда преждевременный старт-кодон ATG был заменен на TTG для определения влияния преждевременного старт-кодона на экспрессию гена (рис. 8А). Результаты измерения уровня люминесценции в культуре клеток человека НЕК293, трансформированных полученными конструкциями, свидетельствует о том, что активность промотора гена hspAIA С. dromedarius при нормальной температуре в 2.5 раза выше по сравнению с активностью промотора гена hspAIA человека. После теплового шока разница в активности промоторов обоих видов нивелировалась (рис. 8D). Замена преждевременного ATG-кодона практически не сказывалась на активности промотора гена hspAIA верблюда ни в нормальных условиях, ни после ТШ.

Для исследования активности промоторов индуцибельного гена hspAlB было получено по две пары конструкций под контролем промоторв человека и верблюда, отличающихся по длине 5'-нетранслируемой области (-738...+8 п.о. и -738...+ 195 п.о. относительно старта транскрипции для С. dromedarius и -733/+35 п.о. и -733...+206 п.о. для Н. sapiens) (рис. 8В). По результатам измерения уровня экспрессии данных репортерных конструкций активность промоторов hspAlB человека и верблюда практически не отличалась ни в норме, ни при ТШ (рис. 8Е). Уровень экспрессии генов hspAIA и hspAlB после ТШ как у человека, так и у верблюда повышался одинаково, в 5 - 6 раз.

Для исследования активности промоторов конститутивного гена hspA/L была получена серия из семи конструкций (рис. 8С). Четыре из них, по аналогии с индуцибельными генами, включали в себя всю промоторную область между генами hspAIA и hspAlL, отличающуюся по длине 5'-UTR. Две конструкции имели делеции области, содержащей последовательности HSE, ответственные за индукцию транскрипции при тепловом шоке. Также была получена конструкция с делецией участка, содержащего сайты узнавания гомеодомена в промоторной области гена hspAlL Н. sapiens. Результаты измерения уровня люминесценции в культуре клеток, трансформированных полученными конструкциями, свидетельствуют о том. что промотор гена hspAlL С. dromedarius проявляет в 5 раза более высокую активность как в нормальных условиях, так и при тепловом шоке, по сравнению с промотором гена hspAlL человека. Индукции экспрессии конструкций под контролем промоторов гена hspAlL верблюда или человека при ТШ не происходит. Делеция фрагмента длиной 100 п.о., несущего сайты узнавания гомеодомена в промоторе гена hspAlL человека приводит к увеличению уровня транскрипции в 2 - 3 раза по сравнению с интактным промотором (рис. 8F).

0 ■ Control a Heat Shock | (

.8

598,0

МВМНш] [ I I в.™ 6

—-X t 1 и-

Ш 200.0 ЖО 4DM №0 600.0 1 Лншинисиенинл ЛЮШфериы IpFFipRL) .0 во

HSE NF-Y/Spl HSE NF-Y/Sp1 TA.TA HSE NF-Y/Sp1 HSE NF-Y/Sp1 TATA HSE NF-Y/Sp1 HSE NF-Y/Spl TATA

лккжфермы (pFF'pRL)

I" 42.0 46.0 Control Heat She ck |

161,2 — 198.4

4186.5

44.0 43.8

84.0 224.2

00 МС niOM»H«ueHiw.n»w®epM^!(^fF/pRL)25

!00bp

| сайт связывания белков, содерждащнх homeodomen -старт транскрипции Lbssp-ORF гена люциферазы

Рис. 8. Анализ активности репортерных конструкций под контролем промоторов генов (A) hspAlA, (В) hspAlB, (С) hspAlL в норме (37°С - control) и после ТШ (43.5°С -Heat Shock). Значения даны в отношении уровня люминесценции люциферазы Photinus pyralis (pFF) к уровню люминесценции люциферазы Renilla reniformis (pRL). которая продуцируется вектором pGL-SV40, использованным для нормирования.

Обобщенные данные, отражающие уровень активности промоторных областей генов группы И.чрА 1 человека и верблюда в норме и после ТШ представлены на рис. 9.

Рис. 9. Обобщенные данные по активности промоторов генов группы /?.?/? 7(Ш человека и верблюда в культуре клеток ПЕК293 при нормальной температуре и после теплового шока.

8. Сравнительный анализ структуры промоторных областей генов и$р70 и 1щ>83 5. ит^Шапог и О. рагЛаИпа

Ранее была подробно изучена структура кластера генов Ьзр70 5. singlllarior (СагЬиг, 2011). Два гена в кластере и 52) расположены в виде

инвертированного повтора, и еще три (И*р70ЯЗ, 54 и 55) находятся после гена 52 в тандемной ориентации (ОагЬиг, 2011). В отличие от генов И$р70 ОгояорИНа, у Ьхр70 5. singularior более или менее консервативны только кодирующие области и первые 50 и.о. выше старта транскрипции, расположенные в 5'-фланкирующей области, в которой находятся ТАТА-бокс и первый ШЕ. У разных копий Ьяр70 5. singularior последовательности, расположенные выше первого НБЕ и ниже стоп-кодона открытой рамки считывания не имеют значимой гомологии и различаются по числу Н8Е. У О. melanogasler регуляторные области всех шести генов к.чр70 высококонсервативны и содержат по четыре НБЕ, расположенных на одинаковых расстояниях от ТАТА-бокса.

Помимо Н8Е у О. melanogaster (и остальных видов ОгоьорЬНа) промоторы генов Алр7(7 на протяжении первых 130 п.о. выше ТАТА-бокса содержат несколько ОАОА-сайтов, абсолютно необходимых для эффективной транскрипции (Сеог§е1 2005). Функционально активный САвА-сайт у ОгоьорЬИа как правило имеет вид ОАОАО, САОАОАО или состоит из нескольких

тринуклеотидов GAG, разделенных спейсерами из нечетного числа нуклеотидов (один, три или пять). В некоторых случаях в составе тринуклеотидов допускаются замены (OmeHna, 2011). Поиск сайтов связывания GAF в регуляторных районах генов hsp70 S. singularior с помощью программы Matlnspector не дал результатов. В отличие от Drosophila, промоторы генов hsp70 S. singularior содержат только единичные тринуклеотиды GAG (или СТС).

Для того, чтобы ответить на вопрос, взаимодействует ли GAF с промоторами генов hsp70 S. singularior, был проведен анализ связывания рекомбинантного GAF D. melanogaster с фрагментами промоторных областей генов hsp70S3 и hsp70S4. В качестве положительного контроля использовались фрагменты промоторной области гена hsp70Aa D. melanogaster. Полученные результаты показывают, что промоторы генов hsp70S3 и hsp70S4 в отличие от промотора гена hsp70Aa не взаимодействуют с олигомерной формой белка GAF, необходимой для инициации транскрипции генов hsp70 D. melanogaster (рис. 10).

+

^ > ^ ^ 00 О-) 00

d с с г

Г ", г - г . г -..

а, с», о, -=: -г: -г: -г:

Рис. 10. Связывание рекомбинантного белка вАР ^ О. melanogaster с промоторами генов Изр70 О.

т melanogaster и 5. singularior. Стрелкой показано

положение комплекса GAF-GAGA.

I

ш »( т., « md

12 3 4

Сравнение нуклеотидных последовательностей промоторных областей генов !кр83 5. singularior, О. рагс!аПпа и других видов двукрылых показывает, что в отличие от генов \isp7Q промоторы генов И$р83 двукрылых значительно более консервативны: у всех видов, взятых нами для сравнения, имеется один Н8Е-фрагмент на практически одинаковом расстоянии от ТАТА-бокса. У 5. singularior обнаруживается также потенциальный САСА-элемент, расположенный между ТАТА-боксом и точкой инициации транскрипции. На рис. 1 I показано сравнение промоторных областей и 5'-иТЛ генов hsp83 Б. л•/«g;/to7'o/• и О. рагс/аИпа и некоторых других видов двукрылых.

S. singularior SI&2 O. pardalina D. melanogaster

10 bps

HSE

D. virilis

D. mojavensis

HSE

HSE

TATA G G p -O-O-CH

Start

HSE

TATA —a-

Start

HSE

TATA —□-

HSE

TATA —о-

HSE

TATA —ш-

Start

Start

Start

Anopheles albimanus Lucilla cuprina HSE

IISE

TATA —en—

Start

HSE

TATA

Aedes aegypti

HSE

Start

Start

HSE

Ceratitis capitata

HSE

TATA

-CD-

Start

J*

300 bps

Рис. 11. Общая организация промоторных областей генов hsp83 у S. singularior, Oxycera pardalina и других видов двукрылых, относящихся к семействам Drosophilidac. Culicidae. Tephritidae и Calliphoridae. Предполагаемые GAF-связывающие сайты у S. sigularior обозначены как 'G'.

9. Сравнение активности промоторов hsp70 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток D. melanogaster Schneider 2

Исходно были получены три конструкции, в которых рамка считывания гена люциферазы контролировалась промоторами разных копий hsp70 S. singularior и гена hsp70Aa D. melanogaster (рис. 12). В первой конструкции репортерный ген находился под промотором гена hsp70Aa D. melanogaster. Во второй конструкции рамка считывания гена люциферазы контролировалась промотором гена hsp7QS3, т.к. этот ген имеет наибольшие структурные отличия в сравнении с генами hsp7fí D. melanogaster. Кроме того, получена конструкция под контролем промотора гена hsp70S4, с тем, чтобы сравнить активность промоторов двух разных генов hsp70 S. singularior, максимально различающихся по своей структуре (Garbuz, 2011). Полученные результаты свидетельствуют о том, что активность промоторов генов hsp70 S. singularior в клетках D. melanogaster оказывается в 10 раз ниже по сравнению с эндогенным промотором как при нормальной температуре, так и при ТШ (рис. 12).

А В

oFF/nRL

-зон

О 200 400 500 »00 1000 1600 1800

АТС

АТС

hsp70SS-GAGA+ __, (, j

— 159.6

hsp70S3-GAGA*~ ~ п., ¡4 6

-1--т- ШШШ 170.0

GAGA(-) OAGA(+) ATG

ш if "J™-*

GAGA1-)oaoa(+)

ЬрЖЗЫСА --.■ __k r__—^79.0_9lg 2

Oft '

GAGAt-)GAGA(-) GAGA(+) Al°

CiACiAl-l(ЗлОлГ) AKi

■-канонический USE ►-ТАТА-бокс [3 Control

■ -неканонический HSE и-сайт связывания GAGA ■ 37.5°C

Рис. 12. Различия в активности промоторов генов \\sp70 5. з\п£и1апог и О. melanogaster в культуре клеток 82. Основные ОАОА-элементы в составе промотора £). \nelanogaster показаны в виде заштрихованных прямоугольников. В скобках (+ или -) указана ориентация ОАОА-элементов. Стрелками показаны вставки ОАОА-элементов в промотор 5. и/апог. pGL4.lt) - результат трансфекции вектора, не содержащего промотор, в качестве отрицательного контроля. Значения даны в отношении уровня люминесценции люциферазы РЬоНпиз ругаИз (рРР) к уровню люминесценции люциферазы ЯепШа гет/отт (рЯЬ), продуцируемой вектором рОЬ-8У40, использованным для нормирования. П.о. - расстояние относительно точки старта транскрипции.

10. Эффект вставки GAGA-сайтов в промотор гена hsp70S3

Согласно данным компьютерного анализа и анализа связывания GAF in vitro, принципиальное отличие промоторов hsp70 D. melanogaster и S. singularior состоит в отсутствии у последнего функциональных GAGA-сайтов. Для того, чтобы определить, насколько обнаруженная нами разница в уровне активности промоторов изучаемых видов обусловлена влиянием фактора GAF, мы получили ряд конструкций с вставками GAGA-сайтов в промотор гена hsp70S3 S. singularior в расположении и ориентации, максимально близких к промоторам генов hsp70 D. melanogaster. на расстоянии -65 (прямая ориентация), -120 (в обратной ориентации) и -145 п. о. (в обратной ориентации) от точки старта транскрипции (рис. 12). Вставка одного GAGA-сайта в прямой ориентации или двух сайтов на расстоянии 80 п.о. друг от друга практически не оказывает влияния на активность конструкции. Вставка двух сайтов во взаимообратной ориентации в положениях

-65 и -120 п.о. от старта транскрипции приводит к повышению уровня экспрессии конструкции в 2 раза. В случае конструкции под контролем промотора гена hsp70S3 S. singularior, содержащего все три вставки GAGA, уровень экспрессии повышается почти в 20 раз по сравнению с конструкцией под контролем промотора hsp70S3 дикого типа при нормальной температуре, и в 5.6 раза — при ТШ. Иными словами, эффективность промотора hsp70S3 S. singularior с вставками трех функциональных GAGA-элементов в клетках Schneider 2 при ТШ оказывается всего лишь в 1.8 раз ниже, чем промотора гена hsp70Aa D. melanogaster (рис. 12). Эти результаты говорят о том, что отсутствие GAGA-сайтов в составе регуляторных областей генов hsp70 S. singularior является причиной различий в активности промоторов hsp70 двух рассматриваемых видов в культуре клеток D. melanogaster.

11. Сравнение активности промоторов генов Itsp83 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток Schneider 2

Активность промоторов hsp83 у обоих видов анализировали с использованием двух пар конструкций, содержащих фрагменты регуляторных областей разной длины (рис. 13). По результатам трансфекции и последующего измерения интенсивности люминесценции активность укороченного промотора S. singularior была сравнима с активностью промотора D. melanogaster как при 25°С, так и при 37.5°С (рис. 13).

п.О. pFF/pRL

-300_-200_-100_+ 1 +150 о so юо 150 200 250 зоо 350 400 450

PGL4.10 "" hspH3 D melanogaster _______р. i-

-канонический HSE ЯЗ -сайт связывания GAG А О - 25 С

> -TATA-бокс И " 37'5°С

Рис. 13. Различия в активности промоторов генов hsp83 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток Schneider2. Значения даны в отношении уровня люминесценции люциферазы Photinus pyralis (pFF) к уровню люминесценции люциферазы Reni/la reniformis (pRL). продуцируемой вектором pGL-SV40. использованным для нормирования. П.о. - расстояние относительно точки старта транскрипции.

Промоторы, содержащие нуклеотидные последовательности, расположенные выше HSE, проявляли большую активность, и экспрессия конструкции с промотором 5. singularior после ТШ слабо, но статистически значимо превышала уровень экспрессии конструкции с промотором D. melanogaster.

Таким образом, можно сделать вывод, что GAGA-сайт, расположенный в промоторе hsp83S2 S. singularior, не влияет на уровень его активности. С другой стороны, у S. singularior выше HSE-последовательности, очевидно, находятся элементы, повышающие уровень транскрипции. В целом, полученные результаты говорят о большей консервативности и универсальности промоторов генов hsp83 по сравнению с промоторами генов hsplO у сравниваемых видов.

Обсуждение результатов

Эволюционные изменения структуры и характера экспрессии генов, относящихся к семействам hsp70 и hsp90, представляют большой интерес в свете изучения механизмов адаптации организмов к тем или иным условиям окружающей среды. У большинства описанных на сегодня видов имеется тенденция к расположению генов hsp70 в виде кластера (Evgen'ev, 2004). Строение кластера генов hsp70, выделяемых в группу hspAl, ранее было описано у нескольких видов млекопитающих, включая человека (Milner, 1992; Hunt, 1993). У всех исследованных в этом плане видов группа генов hspAl расположена в локусе, несущем гены главного комплекса гистосовместимости. Кроме того, было показано, что в геноме лягушки Xenopus два или три гена hsp70 также колокализуются с генами МНС (Salter-Cid, 1994). В настоящей работе были клонированы и секвенированы гены группы hspAl верблюда Camelus dromedarius, являещегося одним из наиболее устойчивых к различным неблагоприятным условиям среды видов млекопитающих. При сравнении уровня включения радиоактивной метки в БТШ70 на культурах клеток человека и верблюда было показано, что в клетках последнего БТШ70 экспрессируется на гораздо более высоком уровне. При этом клетки верблюда отличались более высокой термоустойчивостью и выживали при тепловом шоке, летальном для клеток человека (Ulmasov, 1993). В настоящей работе было показано, что у верблюда кластер генов, относящихся к группе hspAl, имеет в целом такое же строение, как и у других млекопитающих: два гена, hspAlA и hspAIB, не имеющие в своем составе интронов и характеризующиеся индуцируемым характером экспрессии, расположены в тандемной ориентации, тогда как третий ген, hspAl L, экспрессирующийся конститутивно, находится по отношению к ним в противоположном направлении (рис. 1). У всех описанных видов млекопитающих данный ген имеет один интрон и промотор, лишенный ТАТА-бокса, что характерно для многих конститутивно экспрессирующихся генов. Межвидовые различия, обнаруженные при сравнении структуры кластера генов группы hspAl разных видов млекопитающих, ограничиваются небольшими изменениями в расстояниях между генами и длине интрона гена hspAlL (рис. 1). Промоторные области трех генов, входящих в состав кластера, у млекопитающих также высоко консервативны за исключением ряда замен, небольших вставок и делеций, и

22

обладают характерным набором регуляторных элементов (рис. 7). При этом в других таксонах, в частности у различных видов насекомых из отряда Díptera, высокая степень консервативности присуща только кодирующим районам генов hsp70, тогда как регуляторные области и общая структура кластера (число генов и длина межгенных участков ДНК) высоковариабельны иногда даже в пределах одного вида. Так, высокая вариабельность по числу копий генов hsp70 была показана у разных географических линий видов Drosophila virilis и D. lummei, а также для разных популяций вида S. singularior (Evgen'ev, 2004; Garbuz, 2011). Таким образом, эволюционные изменения структуры кластера генов hsp70 характеризуются различными тенденциями у разных таксонов.

Несмотря на высокую в целом консервативность 5'-фланкирующих регуляторных областей генов группы hspAl и сходный набор сайтов связывания транскрипционных факторов, промоторы генов hspAlA и в особенности hspAlL верблюда проявляют более высокую транскрипционную активность при нормальной физиологической температуре по сравнению с генами hspAlA и hspAlL человека. Очевидно, эти различия обусловлены рядом нуклеотидных замен, а также коротких инсерций и делеций в непосредственной близости от точки старта транскрипции обоих генов (рис. 7). Кроме того, более низкий уровень активности промотора гена hspAlL человека частично определяется наличием 100-нуклеотидной вставки, отсутствующей у других видов (рис. 7). Высокий уровень экспрессии генов hspAlA и hspAlL у С. dromedarius может иметь важное адаптивное значение в условиях обитания этого вида.

Ранее на основе данных многочисленных экспериментов считалось, что промоторы генов ТШ высококонсервативны и универсальны. У всех эукариот транскрипция генов ТШ контролируется фактором HSF, узнающим одни и те же консервативные последовательности (HSE) GAANNTTCNNGAA. У большинства организмов HSE присутствует в составе промоторов ТШ в виде нескольких повторов, находящихся на сходных расстояниях от точки начала транскрипции. Промотор гена hsp70 D. melanogaster достаточно универсален и может эффективно работать в клетках разных организмов, в том числе весьма отдаленных филогенетически. В этом плане использовались культуры клеток как насекомых (шелкопряда, комара Aedes aegypti), так и клетки весьма филогенетически удаленных организмов, в т.ч. млекопитающих (Berger, 1985; McMahon, 1984; Uhlirova, 2002). Во всех случаях в клетках неродственных организмов промотор гена hsp70 D. melanogaster обеспечивал выраженную индукцию транскрипции в ответ на тепловой шок, что лишний раз свидетельствует о высокой консервативности механизмов стрессового ответа у разных организмов.

Было обнаружено, что у ряда видов двукрылых промоторы hsp70 могут быть очень вариабельны даже при сравнении соседних копий генов hsp70 одного и того же вида. В частности, такая картина была обнаружена у S. singularior (Garbuz, 2011). Сравнение нуклеотидных последовательностей промоторных районов генов hsp70 S. singularior и D. melanogaster показывают, что принципиальным отличием между этими двумя видами является отсутствие у 5. singularior GAGA-элементов. Это приводит к тому, что активность промоторов hsp70 S. singularior в

клетках D. melanogaster оказывается в 10 раз ниже активности эндогенного промотора как при нормальной температуре, так и после ТШ. Введение в промотор S. singularior трех GAGA-сайтов в тех же положениях относительно старта транскрипции, в которых они находятся в составе промотора hsp70 D. melanogaster, увеличивает эффективность транскрипции в 5 и более раз (рис. 12). Ранее было показано, что GAGA-фактор абсолютно необходим для деконденсации хроматина и инициации транскрипции генов hsp70 Drosophila (Georgel 2005). Несмотря на то, что экспрессия генов hsp70 S. singularior носит выраженный индуцируемый характер и не отличается в этом плане от экспрессии генов hsp70 Drosophila, GAGA-фактор не требуется для инициации транскрипции в случае S. singularior.

Таким образом, результаты, полученные нами в различных клеточных системах (клетки млекопитающих и D. melanogaster) на репортерных конструкциях под контролем промоторов генов hsp70 человека и верблюда, а также S. singularior и D. melanogaster, показывают, что промоторы теплового шока, ранее считавшиеся практически универсальными, могут значительно отличаться по структуре и набору регуляторных элементов между разными видами. Строго консервативными у всех описанных организмов являются только HSE-последовательности, узнаваемые фактором HSF, и ТАТА-бокс, тогда как уровень транскрипции как при нормальной температуре, так и при ТШ в не меньшей степени может зависеть от наличия дополнительных регуляторных элементов, специфичных для определенных видов или групп видов (например, батарея из трех GAGA-элементов обнаруживается только у видов, относящихся к роду Drosophila). В других работах видоспецифичные элементы в составе промоторов hsp70 были обнаружены также у минирующих мух Liriomyza (Chen, 2011). У млекопитающих ключевое различие, определяющее уровень транскрипции генов hsplO у разных видов, может определяться расстоянием между регуляторными элементами в составе промоторов.

В отличие от генов hsp70, промоторы генов hsp83 гораздо более консервативны и универсальны по крайней мере в пределах отряда двукрылых (рис. 11). Так, промотор гена hsp83S2 S. singularior работает в клетках D. melanogaster с эффективностью не меньшей, чем собственный хозяйский промотор (рис. 13). Напротив, скорость эволюционных изменений кодирующих областей генов оказывается выше по сравнению с генами hsp70 тех же видов двукрылых. Наши результаты по анализу степени полиморфизма разных аллелей генов hsp83 у S. singularior и сравнению последовательностей генов hsp83 S. singularior и S. japónica показывают, что между двумя копиями hsp83 этого вида отсутствует генетическая конверсия, которая поддерживала бы их структуру, как это происходит в случае генов hsp70 (Garbuz, 2011). По-видимому, консервативность промоторной и кодирующей областей генов hsp83 обеспечивается в основном давлением отбора, т.к. кодируемый ими белок (как и все белки семейства БТШ90) отвечает за активность множества ключевых регуляторных протеинкиназ, транскрипционных факторов и белков - компонентов системы РНК-интерференции (Abravaya, 1992; Xu, 1993; Whitesell, 1998; Kosano, 1998; Sato, 2000), так что нарушения транскрипции генов hsp90 или снижение

активности их белкового продукта приводят к многочисленным фенотипическим нарушениям и в большинстве случаев отбраковываются (Rutherford, 1998).

Выводы

1.Структура кластера и промоторных областей генов hspAl высококонсервативна у млекопитающих. Такая консервативность, возможно, определяется гомойотермностью или необходимостью поддержания структуры хроматина в области генов главного комплекса гистосовместимости.

2.Показана дупликация гена hsp83 с образованием тандемного повтора у видов, относящихся к семейству Stratiomyidae. Кодирующие области генов hsp83 двукрылых характеризуются более высокой скоростью эволюционных изменений по сравнению с генами hsp70.

З.Обнаружена значительно более высокая транскрипционная активность промоторов генов hspAIA и hspAlL верблюда по сравнению с соответствующими генами человека при нормальных условиях. При тепловом шоке разница сохраняется для конститутивного гена hspAIL, но практически исчезает для гена hspAIA. Частично эти различия объясняются наличием вставки длиной 100 п.о. между генами hspAJA и hspAIL человека.

4.Активность промоторов генов hsp70 D. melanogaster и S. singularior отличается в 10 и более раз в клетках D. melanogaster Schneider 2, что объясняется отсутствием в структуре промоторов hsp70 S. singularior функциональных GAGA-элементов.

5.Промоторы генов hsp83 проявляют большую консервативность и универсальность по сравнению с промоторами hsp70 у насекомых, относящихся к отряду двукрылых.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Астахова Л.Н.. Зацепина О.Г., Евгеньев МБ., Гарбуз Д.Г. Сравнительный анализ эффективности промоторов генов теплового шока у двух видов двукрылых. Мол. Биол. 2014. 48 (3). С. 436-443.

2. Astakhova L.N.. Zatsepina O.G., Przhiboro А.А., Evgen'ev M.B., Garbuz D.G. Novel arrangement and comparative analysis of hsp90 family genes in three thermotolerant species of Stratiomyidae (Diptera). Insect Molecular Biology 2013. 22: P. 284-296.

3. Garbuz D.G., Astakhova L.N.. Zatsepina O.G., Arkhipova I.R., Nudler E., Evgen'ev M.B. Functional organization of hsp70 cluster in camel (Camelus dromedarius) and other mammals. PLoS One. 2011. 6 (11): e27205.

Тезисы конференций

4. Астахова JI.H. Разнообразие молекулярных механизмов термальной адаптации на основе генов БТШ70 у видов, обитающих в контрастных температурных условиях. БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА: 16-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых (Пущино, 16-21 апреля 2012 года). С. 92-93.

5. Астахова Л.Н. Структура промоторов генов БТШ70 и тонкая регуляция их экспрессии у видов с различной термальной адаптацией. ЛОМОНОСОВ-2013: XIX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых (Москва, 8-13 апреля 2013 года). С. 223.

6. Astakhova L.N.. Zatsepina O.G., Evgen'ev М.В., Garbuz D.G.. The structure and fine tuning of hsp70 promoters in different animal species with contrasting thermal habitats. 38 Federation of European Biochemical Societies CONGRESS 2013 "Mechanisms in Biology" (St. Petersburg, Russia, july 6-11, 2013). P. 216-217.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Астахова, Любовь Николаевна, Москва

Федеральное государственноое бюджетноое учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук

04201457997

равах рукописи

Астахова Любовь Николаевна

ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА У ОРГАНИЗМОВ С РАЗЛИЧНОЙ ТЕРМАЛЬНОЙ АДАПТАЦИЕЙ

Специальность: 03.01.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель к. б. н., с.н.с. Гарбуз Д.Г.

Москва, 2014 г.

Оглавление

Список сокращений 5

Введение 6

Глава 1. Обзор литературы 9

1.1. Основные аспекты адаптации организмов к неблагоприятным условиям окружающей среды 9

1.2. Классификация и функции БТШ 11

1.3. Структура и эволюция генов ТШ 20

1.4. Экспрессия генов ТШ и ее регуляция 27

1.5. Участие БТШ в адаптации к экстремальным условиям 38

1.6. БТШ в медицине 42 Глава 2. Материалы и методы 46

2.1. Материалы 46

2.1.1. Геномная фаговая библиотека 46

2.1.2. Насекомые, условия обитания и теплового шока 46

2.1.3. Штаммы Е. соИ 46

2.1.4. Ферменты рестрикции 46

2.1.5. Зонды 47

2.1.6. Линии эукариотических клеток, условия культивирования и

ТШ 47

2.2. Методы: 47

2.2.1. Скрининг геномной фаговой библиотеки 47

2.2.2. Выделение ДНК бактериофага X 48

2.2.3. Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами 48

2.2.4. Электрофорез ДНК 48

2.2.5. Построение рестриктных карт рекомбинантных фагов 49

2.2.6. Включение радиоактивной метки в ДНК 49

2.2.7. Перенос и гибридизация по Саузерну 49

2.2.8. ПЦР-анализ 50

2.2.9. Выделение фрагментов ДНК из геля 50

2.2.10.Клонирование фрагментов ДНК 51

2.2.11. Трансформация компетентных клеток 51

2.2.12.Выделение плазмидной ДНК 51

2.2.13. Секвенирование ДНК 52

2.2.14. Анализ последовательностей 52

2.2.15.Выделение фракции лимфоцитов из крови верблюда 52

2.2.16.Выделение тотальной РНК 52

2.2.17.5' - и З'-RACE анализ и ПЦР с обратной транскрипцией 53

2.2.18. Электрофорез РНК 53

2.2.19.Нозерн-гибридизация 53

2.2.20. Двумерный электрофорез белков по О'Фарреллу 54

2.2.21. Диск-электрофорез белков с ДДС-Na (по Лэммли) и окрашивание гелей по Кумасси G-250 54

2.2.22.Идентификация белков методом пептидного фингерпринтинга 55

2.2.23.Экспрессия и очистка белка GAF 55

2.2.24.Получение белковых экстрактов 56

2.2.25. Анализ связывания факторов транскрипции с элементами теплового шока (EMSA) 56

2.2.26. Получение репортерных конструкций 5 6

2.2.27. Трансфекция плазмид и измерение интенсивности люминесценции 57

Глава 3. Результаты исследования 58

3.1. Клонирование и анализ структуры кластера генов hsp70Al у верблюда Camelas dromedarius 58

3.2. Дифференциальный анализ экспрессии генов hsplA, hspAlB и hspAlL 62

3.3. Клонирование и анализ структуры кластера генов hsp83 у S. singularior и О. pardalina 64

3.4. Сравнение последовательностей генов hsp83 и hsp70 у Stratiomys singularior и Stratiomys japónica 79

3.5. Анализ экспрессии генов hsp83 у S. singularior и О. pardalina 70

3.6. Сравнительный анализ структуры промоторных областей

генов группы hspAl верблюда и других видов млекопитающих 72

3.7. Сравнение активности промоторов hsp70 С. dromedarius и Н.

sapiens в культуре клеток НЕК293 74

3.8. Сравнительный анализ структуры промоторных областей

генов hsp70 и hsp83 S. singularior и О. pardalina 77

3.9. Сравнение активности промоторов hsp70 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток D. melanogaster Schneider2 81

3.10. Эффект вставки GAGA-сайтов в промотор гена hsp70S3 82

3.11. Сравнение активности промоторов hsp83 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток Schneider2 84

Глава 4. Обсуждение результатов 86

Выводы 90

Список литературы 91

Приложение 109

Благодарности 114

Список сокращений

а.о. аминокислотные остатки

АДФ аденозиндифосфат

АТФ аденозинтрифосфат

БОЕ Бляшкообразующая единица

БТШ (HSP) белки теплового шока (heat shock proteins)

ДДС-Na додецилсульфат натрия

дНТФ дезоксинуклеотидтрифосфат

ДТТ дитиотреитол

ИЛ Интерлейкин

кБТШ (HSC) конститутивные белки теплового шока (cognate heat shock proteins)

n.o. (bp) пара оснований (base pair)

ПААГ полиакриламидный гель

ПЦР (PCR) полимеразная цепная реакция (polymerase chain reaction)

т.п.о. (kb) тысяча пар оснований (kilobase)

Трис (Tris) трис(гидроксиметил)аминометан

ТШ тепловой шок

ФНО Фактор некроза опухоли

ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия

ЭР эндоплазаматический ретикулум

BiP immunoglobulin heavy chain-binding protein

GAF GAGA-фактор

GRP glucose-regulated protein

HR hydrophobic repeats

HSE Heat shock element

HSF Heat Shock Factor

MHC major histocompatibility complex

ORF Open reading frame

RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction

TEMED Н,Н№,>Г-тетраметилэтилендиамид

UTR untranslated region (нетранслируемая область)

Введение

Белки теплового шока (БТШ или Hsp - Heat shock proteins) являются одним из основных факторов, обеспечивающих адаптацию организмов к неблагоприятным условиям среды обитания. Эти белки обеспечивают фолдинг новосинтезированных полипептидов, транспорт белков через мембраны, а также участвуют в регуляции сигнальных путей, контролируя активность многих протеинкиназ и факторов транскрипции. Защитная функция БТШ в условиях стресса основана на их способности восстанавливать структуру денатурированных белков и препятствовать образованию белковых агрегатов. БТШ делятся на группы в соответствии с их молекулярными массами. Гены, кодирующие БТШ, были названы генами теплового шока (далее "гены ТШ"). Условно выделяют две группы этих генов: индуцируемые и конститутивные. В нормальных условиях экспрессия индуцируемых генов находится, как правило, на низком уровне, а при стрессе возрастает многократно (в десятки и сотни раз). Конститутивные гены по структуре гомологичны индуцируемым на 50 -75%, они стабильно транскрибируются в нормальных условиях, а при стрессе уровень их экспрессии увеличивается незначительно.

Индуцируемый характер экспрессии генов ТШ у всех исследованных в этом плане эукариот определяется наличием в составе регуляторной области выше ТАТА-бокса консервативных последовательностей, названных HSE (heat shock elements) (Tian et al. 2010). С этими последовательностями связывается транскрипционный фактор HSF (Heat Shock Factor), активирующийся при различных видах стресса (Morimoto 1998). Таким образом считается, что в плане структуры генов и регуляции экспрессии система ответа на тепловой шок характеризуется значительной эволюционной консервативностью. При этом основные работы, позволяющие сделать такой вывод, проводились на небольшом количестве модельных лабораторных видов. На природных популяциях, обитающих в условиях, контрастных по температурному режиму, данный вопрос изучен недостаточно. У млекопитающих особый интерес в плане структуры и регуляции экспрессии представляет кластер генов hsp70 (группа hspAl), находящийся в локусе главного комплекса гистосовместимости (МНС - major histocompatibility complex) и состоящий из трех генов: двух индуцируемых и одного с конститутивным характером экспрессии. Представляло интерес провести сравнение структуры и уровня активности промоторов кластера генов hspAl у видов

млекопитающих, живущих в разных климатических зонах и в разной степени подверженных стрессовым воздействиям окружающей среды. В качестве вида, наиболее устойчивого к неблагоприятным климатическим условиям, был выбран верблюд Сате1ш с1готес1апш (дромадер). Отличия в структуре и уровне экспрессии генов кзр70 верблюда и других млекопитающих могут иметь важное адаптивное значение.

Значительный интерес представляет сравнение структуры и характера экспрессии генов ТШ у насекомых, обитающих в неблагоприятных условиях окружающей среды. К настоящему моменту достаточно полно изучен ответ на ТШ у видов семейства БгояоркИа. Данных по адаптации диких популяций видов двукрылых, обитающих в контрастных условиях окружающей среды, гораздо меньше. Объектами нашего исследования стали два вида семейства Зйгайот^ёае, БКаНотуз йт^агюг и Охусега раЫаНпа. Личинки & 51щи1апог разиваются в прибрежной зоне гиперсалинных озер Крыма, температура которых летом может достигать 40°С. Средой обитания личинок О. рагйаИпа являются холодные родниковые воды (4 - 5°С). Сопоставление данных, полученных на этих видах, может дать информацию об эволюционных изменениях структуры и регуляции экспрессии генов ТШ в ходе адаптации организмов к неблагоприятным условиям среды обитания.

Цель работы

Определение закономерностей в эволюционных изменениях структуры и геномной организации генов, относящихся к группам кзр70 и кяр83, у организмов с различным уровнем термальной адаптации. Сравнительный анализ структуры промоторов и поиск регуляторных последовательностей и транскрипционных факторов, отвечающих за различия в регуляции экспрессии генов кзр70 и кярвЗ у организмов, относящихся к разным филогенетическим группам и обитающих в контрастных климатических условиях.

Задачи исследования

1. Исследовать структуру кластера МНС-ассоциированных генов hsp70 верблюда С. dromedarius. Провести сравнительный анализ структуры и геномной организации генов hsp70 С. dromedarius и других видов млекопитающих.

2. Клонировать и секвенировать гены hsp83 и описать их геномную организацию у двух контрастных в отношении условий обитания видов двукрылых -S. singularior и О. pardalina. Сравнить структуру генов hsp83 S. singularior, О. pardalina и других видов двукрылых.

3. Провести сравнительный анализ структуры регуляторных областей генов hsp70 верблюда С. dromedarius и других видов млекопитающих. Сравнить активность промоторов генов группы hspAl С. dromedarius и Н. sapiens в культуре клеток НЕК293.

4. Проанализировать структуру, характер взаимодействия с транскрипционными факторами и уровень транскрипционной активности регуляторных областей генов hsp70 S. singularior и D. melanogaster.

5. Провести сравнительный анализ структуры регуляторных областей генов hsp83 S. singularior, О. pardalina и других видов двукрылых. Сравнить активность промоторов генов hsp83 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток D. melanogaster Schneider 2.

Глава 1. Обзор литературы 1.1. Основные аспекты адаптации организмов к неблагоприятным условиям окружающей среды

Адаптация организмов к неблагоприятным условиям окружающей среды происходит на разных уровнях. На организменном проявляется за счет поведенческих реакций, морфологических и физиологических изменений. На молекулярном и клеточном уровнях одним из наиболее изученных механизмов адаптации стала система генов теплового шока. Эта система активизируется при повышении температуры на 5 - 15°С выше физиологической нормы (тепловой шок, ТШ) (Heat Shock: from Bacteria to Man, 1982). Продукты экспрессии этих генов - белки теплового шока (сокращённо БТШ или HSP - heat shock proteins) - при воздействии различных стрессовых факторов выполняют в клетке защитные функции, препятствуя денатурации и агрегации белков. Синтез БТШ был показан для разных классов организмов: дрожжей, моллюсков, насекомых, рыб, амфибий, пресмыкающихся и др. (Feder, 1999).

Известно, что при тепловом шоке и многих других видах стресса (гипоксии, воздействии на клетку тяжелых металлов и др.) клеточные белки подвергаются денатурации. При этом гидрофобные областц белковых молекул, в норме обращенные внутрь их структуры, экспонируются в водную среду цитоплазмы. Белки «слипаются» друг с другом гидрофобными участками, образуя нерастворимые агрегаты. Это приводит к нарушению функций большинства клеточных систем и гибели клетки. Было показано, что некоторые БТШ неспецифически взаимодействуют с гидрофобными участками денатурированных белков, способствуя восстановлению их нормальной вторичной и третичной структуры. Благодаря способности связываться с гидрофобными участками денатурированных и вновь синтезируемых белков БТШ (и в первую очередь БТШ70) получили название «молекулярные шапероны» (от французского «chápenme» - компаньонка, дуэнья) (Lindquist, 1986).

Так же при стрессе происходит фрагментация комплекса Гольджи и эндоплазматического ретикулума (ЭР), уменьшение числа митохондрий и лизосом (Welch, 1985), нарушение белок-липидного соотношения из-за повреждения мембранных структур (Vigh, 2007), падение уровня АТФ (Patriarca, 1990). В

цитоскелете наблюдается агрегация формирующих филаменты белков. Это приводит к делокализации органелл и нарушению внутриклеточного транспорта (Toivola. 2010; Richter, 2010) (рис 1). При значительных повреждениях наблюдается остановка клеточного цикла (Lindquist. 1980) и даже гибель клетки по пути апоптоза или некроза.

Рис 1. Влияние теплового шока на эукариотическую клетку. Нормальная эукариотическая клетка (слева) в сравнении с клеткой, подвергнутой тепловому шоку (справа).

При тепловом шоке и некоторых других видах стресса одновременно с активацией генов ТШ в клетках происходит репрессия практически всех остальных генов (Лозовская. 1984). Однако не происходит репрессия рибосомных и гистоновых генов (хотя сплайсинг их РНК подавляется при ТШ). С той же интенсивностью, что и до начала воздействия, продолжается транскрипция тРНК и РНК, кодируемых митохондриальным геномом (Rubin. 1975).

При тепловом шоке подавляется сборка малых ядерных рибонуклеопротеидов (sn-RNP) и, следовательно, сплайсинг пре-мРНК. Это не сказывается на экспрессии генов Till, т.к. большинство из них не содержит интронов, и их транскрипты не подвергаются сплайсингу (Southgate, 1985). БТШ после ТШ поступают в ядро клетки и частично связываются с хроматином, особенно с областью ядрышкового организатора, предохраняя его от повреждений (Velazquez, 1984).

При ГШ блокируется трансляция клеточных матриц за счёт изменений в аппарате инициации трансляции: происходит активация протеинкиназы R (PKR. double stranded RNA-activated protein kinase) и протеинкиназы HR1 (heme regulated

inhibitor of translation). Они фосфорилируют а-субъединицу эукариотического фактора инициации трансляции eIF2 (Sheikh, 1999). После фосфорилирования eIF2a оказывается неспособной к обмену ГДФ на ГТФ с участием фактора eIF2B, образуя с ним прочный комплекс. Уровень фосфорилирования eIF2a во время ТШ повышается в 2 - 3 раза (Мепоп, 1995). Также проиходит дефосфорилирование eIF4E-связывающих белков, которые блокируют взаимодействие кэп-узнающего фактора eIF4E с eIF4G (но не с кэпом) (Vries, 1997).

Через 5 - 10 минут после повышения температуры разрушаются присутствующие в цитоплазме старые полисомы, а на поступивших из ядра мРНК ТШ формируются новые. Некоторые дошоковые полисомы сохраняются в цитоплазме, однако трансляция на них блокируется. При снижении температуры до физиологической нормы на них возобновляется синтез нормальных белков (Kruger, 1981). Избирательность трансляции при тепловом шоке обусловливается изменениями в белковом аппарате трансляции и структурой 5'-нетранслируемого лидера мРНК ТШ.

Давно известно, что БТШ позволяют клеткам адаптироваться к действию высокой температуры (до определённого предела), а также других повреждающих факторов. Было показано, что предварительный умеренный ТШ позволяет клеткам в дальнейшем переносить более жёсткое тепловое воздействие, без предварительного шока являющееся летальным. Этот феномен получил название индуцируемой термоустойчивости (Patriarca, 1990). Ряд экспериментальных данных свидетельствует в пользу того, что индуцируемая термотолерантность развивается за счёт накопления БТШ (Ульмасов, 1993; Bettencourt, 2008).

1.2. Классификация и функции БТШ

Общепринятой является классификация БТШ по их молекулярной массе. Это обосновано тем, что электрофоретические фракции БТШ разных организмов приблизительно соответствуют друг другу по молекулярной массе. Каждое семейство БТШ является продуктом группы родственных генов, поэтому степень гомологии между отдельными представителями семейства часто весьма высока. Многие члены БТШ консервативны, однако их спектр значительно варьирует в зависимости от вида организма и от действующего фактора (Маргулис, 2000). На данный момент

выделяют следующие семейства БТШ: низкомолекулярные БТШ (нмБТШ), семейство БТШ40, БТШ60, БТШ70 - самое многочисленное семейство, БТШ90, БТШ 100 (Lindquist, 1986).

Низкомолекулярные БТШ (нмБТШ)

К нмБТШ относят БТШ с молекулярной массой от 12 до 43 кДа, а-А- и а-В-кристаллины. Гомология между белками этой группы составляет около 40%. Они имеют консервативный а-кристаллиновый домен, который состоит из 80-100 а.о. в С-концевой области, образующих 9 ß-складчатых структур (Ни, 2007). На N-конце многих нмБТШ найден консервативный SRLFDQFFG-регион, играющий большую роль в стабильности структуры а- и ß-кристаллинов (Pasta, 2003).

Взаимодействуя своими ß-складчатыми структурами, нмБТШ способны образовывать с соседними мономерами гомо- и гетероолигомерные комплексы с молекулярными массами 200-400 кДа, обладающие шаперонной активностью (Ganea,

2001). При повышении температуры эти комплексы диссоциируют и в виде димеров нмБТШ взаимодействуют с денатурированными белками, образуя массивные гранулы. При этом они экранируют гидрофобные участки денатурированных белков, препятствуя их от агрегации, и передают их БТШ70 (Гусев, 2002).

Основным функцией нмБТШ считается стабилизация поврежденного стрессом актинового цитоскелета фосфорилированной формой белка БТШ27 (Гусев,

2002). Благодаря своей способности образовывать массивные мультимерные структуры а-кристаллины формируют основу хрусталика глаза (Horwitz, 1976). Для нмБТШ характерен высокий уровень экспрессии на определенных стадиях развития и в определенных тканях (Гусев, 2002).

Конститути