Сравнительный анализ структуры и экспрессии генов hsp70 у видов Dropsophila с различной термальной адаптацией

Гарбуз, Давид Григорьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительный анализ структуры и экспрессии генов hsp70 у видов Dropsophila с различной термальной адаптацией
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ структуры и экспрессии генов hsp70 у видов Dropsophila с различной термальной адаптацией"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта

на правах рукописи

Гарбуз Давид Григорьевич

Сравнительный анализ структуры и экспрессии генов Нэр70 у видов Вго$орМ1а с различной термальной адаптацией

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2004 г.

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных основ эволюции Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Научный руководитель

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник О. Г. Зацепина Научный консультант

доктор биологических наук, профессор М. Б. Евгеньев Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Б. А. Маргулис доктор биологических наук, профессор В. Л. Карпов

Ведущая организация: Институт биологии развития РАН

Защита диссертации состоится часов

на заседании Диссертационного совета Д 002 235. 01 при Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, 32. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан

«*#» 200 У г.

Учёный секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Для современной биологии значительный интерес представляют молекулярные механизмы адаптации организмов к неблагоприятным условиям среды обитания. Среди прочих факторов окружающей среды наибольшее воздействие на организм оказывают изменения температуры. Изменения температурного режима являются также удобным экспериментальным воздействием для изучения механизмов адаптации. Повышение температуры на 5 — 15°С выше физиологической (тепловой шок, ТШ) вызывает у всех изученных организмов (от Е. coli до человека) активацию группы генов, названных генами теплового шока. Белки теплового шока (сокращённо БТШ) при воздействии различных стрессовых факторов выполняют в клетке защитные функции, препятствуя денатурации и агрегации белков. Считается, что основную защитную функцию выполняет семейство белков массой 70 кДа (БТШ70 или HSP70 - heat shock proteins). Работы, позволившие сделать такой вывод, проводились в основном на клеточном уровне. Вопрос об участии БТШ70 в адаптации на уровне целого организма остаётся спорным. С этой точки зрения представляет интерес эволюция генов, кодирующих белки семейства БТШ70, их структура и характер экспрессии у близкородственных организмов, резко различающихся по климатическим условиям среды обитания и характеризующихся разным уровнем естественной термальной адаптации. Удобной модельной системой для изучения структуры и эволюции генов ТШ являются различные виды Drosophila. Ранее гены ТШ были подробно исследованы у D. melanogaster. Для настоящей работы были выбраны несколько видов Drosophila, относящихся к филаде virilis, с мало изученной системой ответа на ТШ. Данные виды распространены в различных климатических поясах и, соответственно, должны отличаться по приспособляемости к воздействию высоких температур. Сравнивали пары видов, контрастные по уровню термальной адаптации: D. virilis — D. lummei и D. novamexicana — D. texana. Данные пары видов способны скрещиваться в лабораторных условиях с получением частично фертильного потомства. D. virilis является, по-видимому, предковым видом всей группы видов virilis, у которых хорошо изучены кариотип и филогенетические отношения. Время дивергенции видов D. virilis - D. lummei составляет ~ 4 - 5 млн. лет. Это позволяет с высокой уверенностью утверждать, что изменения в структуре и характере экспрессии генов ТШ у данных видов связаны с формированием термальной адаптации, а не обусловлены случайными изменениями в ходе дивергентной эволюции. Группа virilis является одной из наиболее древних групп подрода Drosophila, что позволяет подробно изучить все этапы эволюции генов hsp70 путём изучения их структуры и сравнения со структурой аналогичных генов других видов (D. melanogaster).

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение структуры и экспрессии генов hsp70, характера их экспрессии и участия в формировании естественной термальной адаптации у близкородственных организмов на примере видов филады virilis и некоторых других представителей рода Drosophila. Были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить термоустойчивость видов D. virilis, D. lummei, D. texana и D. novamexicana, а так же реципрокных гибридов между D. virilis и D. lummei.

2. Изучить динамику экспрессии генов hsp70, особенности её регуляции на разных уровнях реализации генетической информации и уровень накопления БТШ70 у видов группы virilis, контрастных по температурным условиям среды обитания.

3. Клонировать гены hsp70 D. virilis и D. hiirimei, опред^дстБ пих^ ОТклеотидную

I БИБЛИОТЕКА J ■ 1

последовательность, определить общую структуру кластера и число копий генов hsp70 D. virilis и D. lummei.

4. На основании сравнения структуры генов hsp70 и паттерна БТШ70 D. virilis и D. lummei с данными, полученными для других видов Diptera, определить общее направление эволюции генов hsp70 в данной группе и их участие в термальной адаптации.

Научная новизна и практическое значение работы.

Впервые подробно охарактеризована система генов hsp70 у видов, резко различающихся по термоустойчивости (D. virilis и D. lummei). Изучены динамика ДНК-связывающей активности транскрипционного фактора теплового шока (HSF — heat shock factor) при ТШ у этих видов, транскрипция и трансляция генов hsp70, а также уровень накопления БТШ70 у разных линий D. virilis, D. lummei, D. texana и D. novamexicana. Методом двумерного электрофореза и Вестерн-блоттинга изучены паттерн и серологические свойства БТШ70 вышеперечисленных видов. На основании серологических свойств, построения пептидных карт и сопоставления полученных данных с соответствующими данными по БТШ70 других видов две группы БТШ70 видов филады virilis классифицированы по своей гомологии с БТШ70 и БТШ68 D. melanogaster. Показана более интенсивная экспрессия низкомолекулярных БТШ у всех изученных термоадаптированных видов и линий Drosophila. Впервые клонированы гены hsp70 D. virilis и D. lummei, определена их нуклеотидпая последовательность. Изучена структура кластера генов hsp70 D. virilis и D. lummei. Определено число копий генов hsp70у разных линий D. virilis и D. lummei. Впервые показаны внутривидовые различия в числе копий генов hsp70 у разных природных линий видов группы virilis. В области 3'-фланкирующей последовательности генов hsp70 D. virilis и D. lummei обнаружены повторяющиеся последовательности, возможно, сыгравшие важную роль в эволюции всего локуса генов hsp70 и оказывающие значительное влияние на их экспрессию. Сделаны выводы о направлении, механизме и характере изменений в числе копий и структуре кластера генов hsp70 в ходе эволюции рода Drosophila и участия в них повторяющихся последовательностей. Сделан вывод о существовании дополнительных молекулярных механизмов термальной адаптации, помимо кинетики синтеза и накопления БТШ70.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на 6-й Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (29 июня - 5 июля 2003 г., Санкт-Петербург -Москва), 11-й Международной Конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» в сессии «Молекулярные и клеточные аспекты биологии стресса» (6-10 октября 2003 г., Санкт-Петербург) и 1-м Международном Конгрессе по роли ответа на стресс в биологии и медицине (Квебек, Канада, 2003).

Объём и структура диссертации

Диссертация состоит из 7-и разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 2 таблиц и

рисунков. Библиография включает источников.

Результаты

Виды и линии Drosophila

В работе были использованы виды Drosophila группы virilis, различающиеся по географическому распространению и температурному режиму среды обитания. D. virilis характеризуется тропическим и субтропическим распространением. D. lummei обитает преимущественно в северных районах, доходя до Полярного круга в Финляндии. D. novamexicana распространена в жарких аридных областях Северной Америки (южные штаты США). D. texana распространена в области с более мягким климатом (Техас и др. штаты США). В качестве наиболее термоустойчивого вида из всех изученных на сегодняшний день использовалась D. mojavensis, встречающаяся в Сонорской пустыне (Аризона и Мексика). Все использовавшиеся в работе линии были получены из коллекции Института биологии развития РАН им. Н. К. Кольцова Подробнее о происхождении видов и линий, использованных в работе, см. таблицу 1.

Определение базальной термоустойчивости видов и линий группы virilis

Для определения внутривидовых и межвидовых различий по термоустойчивости попарно сравнивали, разные линии видов D. virilis и D. lummei. Адаптация вида или популяции к определённому температурному режиму описывается способностью особей переносить в течение короткого времени интенсивный тепловой шок и пороговой температурой окружающей среды, при которой возможно размножение. Ранее было показано (Zatsepina О. G. et al, 2001), что термоустойчивая линия D. melanogaster из Центральной Африки (обозначается как «Т») характеризуется как способностью размножаться при более высоких температурах, так и более высокой устойчивостью к кратковременному экстремальному тепловому шоку по сравнению с линией Oregon R (в дальнейшем OR). Соответственно, представляло интерес сравнение видов группы virilis по этим двум показателям. Параметры термоустойчивости D. mojavensis были подробно исследованы в работе Krebs R. (1999).

Линия 200 D. lummei оказалась неспособной к размножению при температуре 32°С.

Вид Линия. Географическое LT50, °С Т

происхождение, широта критическая

D. virilis 9 Батуми, Грузия (42°Ы) 41,3 42,5

101 Япония (~ 32-36°М) 41,2 42,5

160- Япония (~ 32 -36°Ы) 40,8 41,5

1433 Южная Англия (53°>Г) 41,1 42,0

T-53 Ташкент, Узбекистан (41 "Л) 41,2 42,5

T-61 Ташкент, Узбекистан (41°М) 41,1 42,0

T-40 Ташкент, Узбекистан (41 °М)

D. lummei 200 Москва (55°Ы) 40,1 41,0

202 Краснодар (45°Ы) 40,1 41,0

207 Краснодар (45°Ы) 40,1 41,0

1102 Финляндия (60°Ы) 39,9 41,0

1109 Финляндия (60°Ы) 40,2 41,0

D. texana 423 Техас, США (32°Ы) 40,0 41,0

D. novamexicana 424 Невада, США 32 - 37°1Ч) 40,8 42,0

D. mojavensis Мексика (30°Ы) 41,8 43,5

Таблица 1. Значения LT50 и критической температуры для разных видов Drosophila.

Рис. 2. Индуцированная термоустойчивость у Б. ¡ыттгг и Б. уМя. Указаны температура предварительного ТШ и время восстановления. Представлен процент выживших мух через 2 суток после ТШ.

Линия 9 Б. \iiriKs, напротив, сохраняла фертильность при 32°С на протяжении четырёх поколений (после чего опыт был прекращён). Для определения устойчивости к кратковременному интенсивному тепловому шоку использовали мух из популяции, поддерживаемой при 25°С. Определяли ЦГ50 (значение температуры, при 30-минутном воздействии которой выживает 50% особей) и критическую температуру (при 30-минутном воздействии которой выживает менее 1% мух). Число выживших мух определяли через 48 часов после ТШ. Из рисунка 1 видно, что все изученные линии Б. ¡ытт^ характеризуются значительно меньшей термоустойчивостью, чем линии Б. утИз. Значительных внутривидовых различий по термоустойчивости как для Б. ¡ытт^, так и

для D. virilis обнаружено не было. У D. lummei значение LT50 оказывается ниже только для линии 1102, что, впрочем, коррелирует с её северным происхождением. У D. virilis более низкое значение LT50 по сравнению с остальными линиями показывает линия 160, что, возможно, объясняется наличием ряда маркерных мутаций в её генотипе. В целом значения и LT50 и критической температуры для D. virilis на 1,0 - 1,5°С выше, чем для D. lummei (см. таб. 1). D. novamexicana - вид, обитающий в условиях аридной зоны, проявляет более высокую термоустойчивость, чем D. texana и схож по этому показателю с D. virilis.

Определение индуцированной термоустойчивости у видов и линий группы virilis

Известно, что предварительный тепловой шок низкой интенсивности (35 — 37°С) приводит к повышению термоустойчивости, то есть увеличению количества выживших особей после сильного ТШ, и повышает на 1,0 - 1,5°С критическую температуру выживания (индуцированная термотолерантность, Feder M. Е., 1999). В наших экспериментах мы подвергали мух предварительному ТШ интенсивностью 35,0, 36,0 и 37,0°С в течение 30 мин. Тепловой шок высокой интенсивности давали через 1 час, 3 часа или сразу после предварительного ТШ. Неожиданные результаты были получены для D. lummei (линии 200, 202 и 1102): число выживших мух увеличивалось не более, чем на 10 - 15% (предварительный ТШ 35°С), а при предварительном ТШ 36°С и/или увеличении периода времени до критического ТШ термоустойчивость мух, напротив, снижалась (на 20 — 30%). Значение LT50, определяемое по графику зависимости числа выживших мух от температуры критического ТШ, для D. lummei увеличивается не более чем на 0,2 -0,3°С (рис. 2). D. lummei - первый изученный вид Drosophila, у которого практически отсутствует индуцируемая термоустойчивость. Данный факт представляет большой интерес и заслуживает дальнейшего изучения.

Для D. virilis были получены ожидаемые результаты. Высокая индуцированная термоустойчивость выражается в достоверном увеличении числа выживших особей после интенсивного ТШ. Максимальное развитие индуцированной термоустойчивости у линии 9 наблюдается после предварительного ТШ 37,0°С. Для линии 160 значение предварительного ТШ, обусловливающего максимальную индуцированную термоустойчивость, составляет 36,0°С. Таким образом, исходя из величины предварительного ТШ и данных по накоплению БТШ70 (см. ниже), можно предположить, что у D. virilis индуцированная термоустойчивость обусловливается индукцией и накоплением БТШ, предохраняющих клетки от более интенсивного ТШ.

Определение термоустойчивости реципрокных гибридов D. virilis и D. lummei

Гибриды были получены путём реципрокного скрещивания мух 9-й линии D. virilis и 200-й линии D. lummei. Представляло интерес сравнить термоустойчивость родительских линий D. virilis и D. lummei с термоустойчивостью межвидовых гибридов для того, чтобы определить доминирование термоустойчивого или термочувствительного фенотипа. Представлялось возможным также наличие материнского эффекта цитоплазмы D. virilis, при котором гибриды, полученные скрещиванием в направлении $D. virilis x SD. lummei, и унаследовавшие митохондриальный геном от более термоустойчивого вида D. virilis, могли показывать более высокую термоустойчивость по сравнению с потомством обратного скрещивания QD. lummei х virilis. Были получены гибриды в обоих направлениях, после чего поколение Fi было подвергнуто анализу на базальную и индуцированную термоустойчивость. Не удалось обнаружить сколько-нибудь

выраженного материнского эффекта цитоплазмы D. virilis. Гибриды в обоих направлениях показывали приблизительно одинаковую базальную термоустойчивость. LT50 гибридов (40,6°С) на 0,5°С выше, чем 200-й линии D. lummei и на 0,7°С ниже, чем 9-й линии D. virilis. В отличие от D. lummei гибриды проявляют достоверную индуцированную термотолерантность при действии предварительного ТШ, однако увеличения индуцируемой термоустойчивости гибридов $ D. virilis x <5 D. lummei по сравнению с обратным направлением скрещивания не обнаружено. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о промежуточной по сравнению с родительскими видами базальной и индуцированной термоустойчивости гибридов Ft.

Изучение общего белкового синтеза при ТШ у D. virilis и D. lummei

Важнейшим показателем степени воздействия теплового шока на организм является уровень синтеза белка в клетках. Для определения воздействия ТШ на общий белковый синтез были поставлены эксперименты по включению 335-метионина в общий пул синтезируемых белков в клетках слюнных желёз личинок третьего возраста. В эксперименте использовались линия 9 D. virilis и линия 200 D. lummei, как наиболее типичные для своих видов по термоустойчивости. Полученные результаты суммированы на рис. 3. Наиболее существенным результатом является наблюдаемое восстановление белкового синтеза у D. virilis и резкое падение белкового синтеза у D. lummei после интенсивного теплового шока (40,0 — 41,0°С). При 41,0°С интенсивность включения метки в клетках D. lummei падает практически до нуля, что согласуется с данными по накоплению БТШ70 (см. ниже) и выживаемости.

Накопление БТШ70 при тепловом шоке

Исходя из имеющихся литературных данных (Feder M. Е., 1999), предполагали, что у терморезистентных видов Drosophila будет обнаружена корреляция между повышенной термоустойчивостью и уровнем накопления БТШ70. Для проверки этой гипотезы мы провели иммуноблоттинг белков, выделенных из мух исследуемых видов и линий, с использованием моноклональных антител 7FB, узнающих только индуцибельный БТШ70 и антител 7.10.3, реагирующих со всеми членами семейства БТШ70 (рис. 4). Мух подвергали ТШ продолжительностью 30 минут с последующим восстановительным периодом продолжительностью 1 и 3 часа, после чего выделяли белковые экстракты для иммуноблотгинга. Выяснилось, что положительная корреляция между содержанием

БТШ70 и терморезистентностью до известной степени наблюдается в пределах филады virilis. Накопление БТШ70 у D. virilis (линия 9) значительно превышает уровень БТШ70 при соответствующих температурах у D. lummei (линия 200), a D. novamexicana накапливает БТШ70 в количествах, вдвое больших, чем D. texana при 37,5°С. Линия 200 D. lummei,

Рис. 3. Интенсивность включения 358-метионина в общий пул клеточных белков при ТШ разной интенсивности. По оси абсцисс - температура ТШ и время восстановления.

Рис. 4. Количественный анализ накопления индуцибельной формы БТШ70 у имаго разных видов и линий филады virilis в зависимости от температуры. Значения даны относительно концентрации БТШ70 у OR при 37,5°С после 1 часа восстановления.

полученная из ареала с умеренным климатом (Подмосковье), характеризуется более низким уровнем БТШ70 по сравнению с линиями 202 и 207 с южным ареалом распространения (юг России). Особенно заметной разница в накоплении БТШ70 между парами контрастных по термоустойчивости видов становится при температурах, близких к критическим (40 - 41°С). При интенсивном ТШ синтез и накопление БТШ70 практически полностью прекращаются у D. lummei и D. texana, но сохраняются на достаточно высоком уровне у D. virilis и D. novamexicana. Эти показатели хорошо соотносятся с данными по термоустойчивости и включению радиоактивной метки в общий пул синтезируемых белков (рис. 3). С другой стороны, линии 1433, Т53 и Т61 D. virilis, практически не отличающиеся по термоустойчивости от линии 9 D. virilis, характеризуются пониженным накоплением и меньшим числом изоформ БТШ70 (см. ниже). Температура максимальной индукции БТШ70 у термоадаптированных видов с южным ареалом распространения (D. virilis и D. novamexicana) выше на 1,0°С, чем у D. lummei и D. texana, и составляет 38,5°С. У термоустойчивой линии Т D. melanogaster уровень накопления БТШ70 после ТШ интенсивностью 37,5°С почти в 2 раза ниже, чем у стандартной линии OR (рис. 4). У D. mojavensis, наиболее термоустойчивого вида Drosophila, накопление БТШ70 значительно ниже, чем у OR, даже при максимальном уровне индукции (39,0°С, Krebs R., 1999). По нашим данным, все линии D. virilis и изучаемая линия D. novamexicana также характеризуются более низким уровнем накопления БТШ70 по сравнению с OR (см. рис. 4). OR при этом является наиболее термочувствительной линией из всех изученных (критическая температура выживаемости составляет 40,0°С). Таким образом, во многих случаях наблюдается отрицательная корреляция между содержанием БТШ70 при умеренных тепловых шоках (37 — 38°С) и термоустойчивостью вида или линии. Однако при более высоких температурах все линии термоадаптированных видов накапливают БТШ70 в количествах, многократно превышающих накопление при тех же температурах у термочувствительных видов. Кроме того, максимум индукции БТШ70 у D. virilis, D. novamexicana и D. mojavensis сдвинут в сторону более высоких температур по сравнению с D. lummei, D. texana и OR

(см. рис. 4). Таким образом, можно сделать вывод о преимущественной защитной роли БТШ70 именно при высоких субкритических температурах.

Определение кинетики индукции мРНК БТШ70

Представляло интерес сопоставить данные по накоплению БТШ70 и кинетике синтеза мРНК БТШ70. Сравнивали 200-ю линию Б. 1ытте1 и линии 9 и 160 Б уЫЫ (см. рис. 5). Видно, что у Б. 1ыттв1 полностью прекращается синтез мРНК БТШ70 при 40,0 и 41,0°С. Восстановление транскрипции происходит только через час после ТШ интенсивностью 40,0°С. Включение метки в общий пул синтезируемых белков и накопление БТШ70 при» этом крайне незначительно даже после 3-х часов восстановительного периода (см. выше), У Б. уЫЫ 9 синтез мРНК БТШ70 сохраняется как при 40,0, так и при 41,0°С. Б. утШ 160 также синтезирует мРНК БТШ70 при« субкритических температурах, причём в количествах, значительно превышающих количество мРНК у 9-й линии.

Таким образом, через час после ТШ (40,0°С) у линии 200 Б. 1ыттв1, наблюдается уровень транскрипции, сравнимый с линиями 9 и 160 Б. утШ, при следовом накоплении БТШ70. Следовательно, низкий синтез БТШ70 у Б. 1ыттв1 при сублетальных температурах объясняется подавлением трансляции мРНК ТШ.

Рис. 5. Уровень индукции* мРНК БТШ70 при различных значениях ТШ. 1 - 25°С, 2 -31,5°С, 3 - 37,5°С, 4 - 40,0°С, 5 - 41,0°С, 6 - 40,0°С, 1 час восстановления. Внизу — гибридизация с зондом к гену актина Б. melanogaster.

Исследование ДНК-связывающей активности HSF

Индукция экспрессии генов ТШ на уровне транскрипции происходит за счёт связывания, транскрипционного фактора (HSF) с определённой нуклеотидной последовательностью (Heat Shock Element, HSE) в составе промотора В нормальных условиях HSF Drosophila находится в неактивной форме в виде мономера. При ТШ происходит тримеризация HSF; тример обладает ДНК-связывающей активностью (V. Zimarino, 1990). Температуру тримеризации • HSF определяли методом связывания и торможения в геле фрагмента ДНК, содержащего последовательность HSE. Из рис. 6 видно, что у D. lummei (линия 200) комплекс HSF-HSE образуется при 31°С, а у D. virilis (линия 160) — при 32°С. Это различие сопоставимо с данными по термальной адаптации исследуемых видов. При температурах 37,5 — 40,0°С существенной разницы ДНК-связывающей активности HSF не наблюдается. Следует отметить тот факт, что при 40 и 41°С у D. lummei связывание HSF с ДНК имеет место, а транскрипции генов hsp70 не происходит. По-видимому, при столь высокой температуре ДНК-связывающая активность HSF сохраняется, но происходят нарушения других компонентов аппарата

транскрипции. Транскрипционная активность генов к8р70 восстанавливается только через 1 час после ТШ 40°С (см. выше). Сходный характер связывания ШБ с ЖЕ при более низких температурах позволяет предположить, что разница в накоплении мРНК БТШ70 и белкового продукта у исследуемых видов объясняется не структурой и/или особенностями активации ЖБ, а структурой промотора либо разницей в числе копий генов кsp70.

Х>. \irUis 9 £>. 1итте1 200

Рис. 6. Изменение ДНК-связывающей активности ЖБ в зависимости от температуры у Б. утШ и Б. ¡итшв1. 1 - 25°С, 2 - ЗО°С, 3 - 31°С, 4 - 32°С, 5 -37°С, 6 - 39°С, 7 - 41°С. Область связывания с

ДНК-фрагментом отмечена стрелкой.

Анализ паттерна БТШ70 и динамики синтеза отдельных групп БТШ

Белки разделяли методом двумерного электрофореза и детектировали окрашиванием азотнокислым серебром, по включению радиоактивного метионина, либо с помощью иммуноблоттинга. Паттерн БТШ70 OR описан в работе Craig Е., 1986. Паттерн линии Т существенно отличается от паттерна OR — обнаруживается дополнительный белок с изоэлектрической точкой, равной изоэлектрической точке БТШ70, и с меньшей молекулярной массой. У D. mojavensis в группе БТШ70 обнаруживаются три белка с разными изоэлектрическими точками и одинаковой молекулярной массой, один из которых, возможно, является гомологом БТШ68 D. melanogaster. Паттерн БТШ70 разных линий и видов внутри филады vinlis имеет сходные характеристики, сильно отличаясь, однако, от паттерна D. melanogaster и D. mojavensis. У всех исследованных видов и линий группы virilis индуцибельные БТШ70 делятся на две группы, различающиеся по молекулярной массе и изоэлектрической точке, причём каждая группа может включать несколько изоформ. Молекулярные массы белков, входящих в каждую группу, были определены методом электрофореза по маркеру как 70 и 72 кДа. Интересно, что по характеру взаимодействия с различными моноклональными антителами белки с молекулярной массой 72 кДа напоминают БТШ68 D. melanogaster. Дополнительные изоформы БТШ70 обнаруживаются у линий 9, 160 и 101 D. virilis по сравнению с 200-й линией D. lummei, а также у D. novamexicana по сравнению с D. texana, что может свидетельствовать в пользу гипотезы об увеличении числа копий генов hsp70 у этих линий. В целом можно сказать, что практически каждая исследованная линия D. virilis и D. lummei имеет индивидуальный паттерн БТШ70 (см. рис. 7, 8). У гибридов D. virilis 9 х D. lummei 200 присутствуют все изоформы родительских линий, причём одна из них является общей, а две другие - уникальными для каждой родительской линии. Паттерн и серологические свойства конститутивных БТШ70 одинаковы у всех рассматриваемых видов, что, очевидно, говорит об их более высокой эволюционной консервативности. Схемы паттерна БТШ70 исследованных видов и линий приведены на рис. 8.

Кроме БТШ70, была изучена также экспрессия других семейств БТШ у видов группы virilis. У всех термоустойчивых линий наблюдается повышенная экспрессия

БТШ40 и низкомолекулярных БТШ при высоких температурах - 40 и 41°С: наблюдается интенсивное включение 358-метионина в данные группы БТШ. Это было показано на примере линий 9,101, 160,1433, Т53 и Т61 D. virilis, D. novamexicana и D. mojavensis (см. рис. 7). У Б. 1итте1 (линии 200,202,207,1102 и 1109), Б. texana и Б. melanogaster (линия ОЯ) включение метки в низкомолекулярные БТШ и БТШ40 происходит со значительно более низкой интенсивностью. Увеличение уровня экспрессии БТШ40 и низкомолекулярных БТШ у видов, обитающих в жарком климате и подверженных

72. 70-

D. virilis 9 101 160 1433 Т-53

м « Со • » • О • - в ©о* в • о о • • • О •

D. Itmmei 200

202

207

1102

1109

72. 70-

• в • о • в • в •• в

СО о С* О • о • • о • во ®

D. mojavensis Oregon R

T D. texana D. novamexicana

72-> 70—>

о о в • о • о

е©э • Ся О о 8» • о • СО в

-r—i—г

63 6 1 5 75 5 6 5 4 636 1 5755654 636 1 5.755654 636 1 5755654 6361 5755654

Рис. 8. Схема паттерна и серологические свойства БТШ70 разных видов БговоркПа. Указаны значения градиента рН и молекулярные массы в кДа. а - БТШ70, □ - БТШ68, В -Н8С70.

действию более высоких температур, может играть важную роль в формировании термальной адаптации.

Идентификация белков методом построения пептидных карт

Двумерный электрофорез и Вестерн-блоттинг показывают наличие у всех изученных видов филады virilis белка, обладающего теми же серологическими свойствами, что и БТШ68 D. melanogaster. Этот белок, однако отличается от БТШ68 по молекулярной массе (72 кДа вместо 68 кДа у D. melanogaster) и обладает другим значением изоэлектрической точки (5,75 вместо 6,3 у D. melanogaster). Для того, чтобы классифицировать две группы БТШ70 видов филады virilis, был предпринят анализ пептидных карт белков, относящихся к обеим группам. Белки очищали иммунопреципитацией на антителах 7.10.3, разделяли на двумерном электрофорезе и обрабатывали модифицированным трипсином. Определение молекулярных масс пептидов было выполнено компанией Ciphergen Biosystems. Белки идентифицировали, сравнивая полученный набор пептидов с базами данных по известным белкам. Подтвердилось, что белок с массой 70 кДа и изоэлектрической точкой ~ 6,1 у видов филады virilis является гомологом БТШ70 £>. melanogaster, а белок с массой 12 кДа и изоэлектрической точкой ~ 5,75 гомологичен БТШ68 (см. рис. 8).

Рестрикционный и Саузерн-анализ генов hsp70Б. утШ Исходя из данных Вестерн-блоттинга, представляло интерес определить структуру кластера генов hsp70 у используемых в работе видов и линий, контрастных по термоустойчивости, и ответить на вопрос: коррелирует ли повышенный синтез БТШ70 при тепловом шоке у некоторых линий D. virilis с увеличением числа копий гена hsp70 или изменениями в их структуре? Был проведён Саузерн-анализ геномной ДНК разных линий В. \irilis и D. lummei. При обработке ДНК всех линий В. \irilis рестриктазой ХЪа\ образуются три фрагмента ДНК длиной 3, 4 и 10 т. п. н., гибридизующие как с 5'-, так и с З'-фрагментом гена hsp70В. melanogaster, мечеными 32Р (рис. 9). Таким образом, сайты

Рис. 10. Саузерн-анализ геномной ДИК из разных линий Б. утШ и Б. Шшшег (гибридизация с 5'-фрагментом гена hsp70Б. melanogaster. a:\-D. \irilis 9;2 — Б. \irilis 160; 3-Б. \irilis 1433, 4 - Б. утШ Т-53; 5 - Б. утШ Т-40; 6:\-Б. 1ыттв1 200; 2 - Б. 1иттв1 202; 3 - Б . 1итт& 207; 4 - Б. 1итт& 1102; 5 - Б. 1итт& 1109; 6 - Б. \irilis 160. Указана длина фрагментов в т.п.н.

ХЬа\ расположены за пределами структурной части генов Няр70. Фрагменты длиной 4 т. п. н. у разных линий Б. утШ характеризуются различной интенсивностью, что позволяет предположить наличие разного числа копий данных фрагментов и, соответственно, входящих в их состав генов к$р70у разных линий.

При совместной обработке ДНК рестрикгазамиХЬЛ иАсс1, а такжеХЬа\ и ШгиЛИ

Рис. 11. Саузерн-анализ геномной ДНК из разных линий D. virilisи D. lummei. Рестрикция Xba I/Bam Ш. гибридизация с З'-фрагментом гена hsp70D. melanogaster. \-D. virilis 9; 2 - D. virilis 160; 3 - D. virilis 1433,4 - D. virilis T-53; 5 - D. virilis Т-40.Указана длина фрагментов в т.п.н.

обнаруживается полиморфизм Abfll-фрагментов длиной 4 т. п. н. по сайтам АсеI и Hindm (рис. 9). Анализ гибридизации полученных фрагментов с зондами к 5'- и З'-участкам гена hsp70 D. melanogaster позволяет сделать вывод о локализации сайтов за пределами

кодирующей последовательности генов hsp70 на расстоянии ~ 500 н. п. от одного из сайтов XbaI. Таким образом, показан высокий межлинейный полиморфизм фланкирующих последовательностей генов hsp70 по сайтам Xbal, Accl и HindSSL внутри вида D. virilis. Фланкирующие последовательности разных генов hsp 70 одной и той же линии также полиморфны по сайтам Accl и HindSSL.

Другие результаты были получены при Саузерн-анализе геномной ДНК D. virilis с использованием рестриктаз Sac! и ВатШ. При совместной рестрикции ферментами XbaVSacl и ХЬаУВатШ (рис. 10) не обнаруживается межлинейного и межгенного полиморфизма по сайтам Sad и ВатШ. в случае D. virilis. Фрагменты рестрикции ХЬаУВатШ (рис. И) по-разному гибридизуют с 5'- и З'-фрагментом гена hsp70, что говорит о локализации сайтов рестрикции внутри кодирующей

последовательности. Характер гибридизации с зондом к 5'- и З'-фрагментам гена hsp70 свидетельствует о консервативности сайтов ВатШ и сайта Xbal, расположенного в области 5'-фланкирующей последовательности генов и, напротив, о

полиморфизме по сайтам Xbal З'-фланкирующих последовательностей. Фрагменты, получаемые при совместной рестрикции ферментами XbaVSacl и ХЬаУВатШ ДНК разных линий гибридизуют с различной интенсивностью, что снова заставляет

предположить о разном числе копий генов hsp70 у разных линий.

Определение числа копий гена hsp70у разных линий D. virilis HD. hltnmei

Для проверки гипотезы о наличии разного числа копий гена hsp70 у разных линий внутри вида D. virilis было проведено измерение интенсивности гибридизации меченого зонда из гена hsp70D. lummei с фрагментами, получаемыми при обработке геномной ДНК разными рестрикгазами (метод определения числа копий гена по Саузерну). Рестрикция для анализа проводилась ферментами Xbal, ХЬаУАсс! и XbaUHindlH (рис. 9). Интенсивность гибридизации измерялась путём денситометрирования радиоавтографов. В качестве внутреннего стандарта, относительно которого рассчитывается интенсивность гибридизации, при рестрикции Xbal использовались уникальные фрагменты длиной 10 и 3 т. п. н., содержащие одну копию гена hsp70, а в случае рестрикции по ХЬаУАсс! — фрагменты длиной 5 и 3 т. п. н. (уникальные фрагменты были выбраны, исходя из рестриктной карты кластера генов hsp70 160-й линии D. virilis, полученной на основании анализа рекомбинантных фагов - см. рис. 15). Таким образом, отпадала необходимость в нанесении известной концентрации плазмидной ДНК с клонированной последовательностью hsp70. Интенсивность гибридизации зонда с Xbal'фрагментами длиной 4 т. п. н. по отношению к стандарту у 160-й линии составляет 5:1, т. е. в составе данных фрагментов предположительно находятся 5 копий гена. Это же отношение у

1 2 3 4 5

4-JJ

<—зл

Рис. 12. Интенсивность гибридизации разных фрагментов геномной ДНК с РСЯ-фрагментом гена/нр70 Д /итте/. □ -ЛМ-фрагмент (10 т. п. н.), □ -ЛМ-фрагмент (4 т. п. н.), □ -Л2>а1-фрагмент (3 т. п. н.).

других линий Б. утШ составляло 4:1 у линий 9 и Т-40,3,5:1 у линии 1433 и 2,5:1 у линии Т-53 (рис. 12, 13). Была определена также интенсивность гибридизации зонда с отдельными фрагментами, получаемыми при рестрикции ХЬаУЛсЛ и ХЬаМШпсИII (см. рис. 12). Данные коррелируют с результатами, полученными для рестрикции по ХЬа1. При суммировании полученных данных было определено количество генов, входящих в состав всех образующихся фрагментов рестрикции у шести исследуемых линий. Число копий гена hsp70 у различных линий Д \irilis приводится в таблице 2. Расчеты проводились на основе большого статистического материала (не менее десяти опытов). Внутривидовые различия в числе копий Изр70 у Г)го5орМ1а обнаруживаются впервые.

Большой интерес представляло сравнение числа копий и структуры генов /«р70 Д мгНю и Б. lummei. Рестрикция и гибридизация геномной ДНК выявляют разительные различия в структуре кластера генов hsp70 Б. lummei по сравнению с Б. утШ. При рестрикции ХЬа1 у всех линий Б. lummei образуются четыре фрагмента длиной 2,8, 3,2, 4,5 и 10 т. п. н. (рис. 9). У 200-й линии все четыре фрагмента с одинаковой интенсивностью гибридизуются с 5'-фрагментом гена hsp70 Б. melanogasteг, у остальных линий фрагмент длиной 4,5 т. п. н. гибридизуется более интенсивно. Гибридизация с зондами к разным участкам гена показывает, что сайты ХЬа\, как и в случае Д \irilis, расположены за пределами кодирующей последовательности. А2>й1-фрагменты Д 1итте1, как и Д у/л'/и, полиморфны по сайтам Асс1 и НтЛИ (рис. 9). ИзЯфрагмента длиной 2,8 т. п. н. при рестрикции Асс\ вырезается участок длиной ~ 1,6 т. п. н. Оба эти фрагмента не гибридизуются с зондом к 3'-кодирующей части гена

(рис. 14). Таким образом, данная копия hsp70, по всей видимости, представляет собой псевдоген и функционально неактивна. У линий 202 и 1102 (рис. 9) при рестрикции ХЬаМАсЛ образуется дополнительный фрагмент длиной 3,5 т. п. н. Это свидетельствует о наличии у линий 202 и 1102 дополнительной копии гена по сравнению с 200-й линией. Из полученных результатов видно, что кластер генов /)5/?70 у Д 1итте1 в целом имеет совершенно другую структуру, чем у Д \irilis. Количество копий генов Азр70 у Д 1итте1 на основании Саузерн-анализа и денситометрии радиоавтографов было определено как 4 у 200-й линии и 5 копий у линий 202 и 1102. У всех трёх линий Л7>йГфрагмент длиной 2,8 т. п. н. не гибридизуется с зондом из З'-участка гена 1ир70 Д melanogaster, что, по-видимому, характеризует входящую в его состав копию как функционально неактивную и позволяет утверждать, что она образовалась ещё до расселения Д ¡иттег по разным

Рис. 13. Денситограммы Саузерн-гибридизации геномной ДНК разных линий > £>. \irilis с РСЯ-фрагментом гена Изр70 й. Ыттеи

географическим областям и дивергенции исследуемых нами линий. Таким образом, был показан высокий внутривидовой и межвидовой рестрикционный сайт-полиморфизм кластера генов полиморфизм, однако, обнаруживается только по рестрикционным сайтам, находящимся во фланкирующих последовательностях генов. Сайты ВатШ.; расположенные внутри кодирующей области, у Б. утИя консервативны как в разных копиях гена внутри линии, так и у разных линий. У И. 1итте1 консервативность этих сайтов нарушена При совместной рестрикции у всех линий

Iиттег образуются четыре, а при рестрикции - три гибридизующих фрагмента (рис. 10). Размер фрагментов свидетельствует о том, что два гена /ир70 И. ¡иттег не содержат в своём составе сайта

Вид Линия • Число копий Ыр70

£). угпШ 9 6-

160 7

101 7

1433 6

Т40 6

Т53 5*

Т61 5

0.1итте1 200 4*

202 5»

1102 5*

Таблица 2. Число копий гена Ыр70 у разных линий Б. гтНз и 0.1иттеи * - одна из копий, по-видимому, функционально • неактивна.

Определение структуры кластера генов Н$р 70О. ппШ и О. Ытте1 на основе рекомбинантных фагов

В работе М. Б. Евгеньева с соавторами (Evgen,ev М. В. е! а1, 1978) гены \tsp7Q О. \vrilis были локализованы в одном диске в локусе 29С. Исходя из этого, мы предполагали, что у И. утШ и £>. 1итте1 гены к8р70 организованы в виде одного кластера, как, например, у Д. ашагга. Для проверки этой гипотезы, а также для определения нуклеотидной последовательности генов к$р70 и прилегающих последовательностей были получены геномные библиотеки на основе вектора ХОАЗН. Для получения библиотек использовалась ДНК линии 160 />. уяНи и линия 200 А ¡иттег. Для скрининга фаговых библиотек использовались фрагменты полноразмерного гена /кр70 Д.

клонированного в плазмиду (любезно предоставлена

Университет г. Чикаго). Были построены подробные рестриктные карты отобранных

Рис. 14. Гибридизация ДНК из Б. 1ыттв1 (линия 200), рестрикция ХЬа1: 1-е 5'-фрагментом, 2-е З'-фрагментом гена hsp70 Б. melanogaster. Стрелкой указано положение фрагмента длиной 2,8 т.п.н., не гибридизующегося с З'-фрагментом гена Няр70.

фагов (см. рис. 15). Фрагменты, полученные при расщеплении фаговой ДНК различными рестриктазами, были переклонированы в фагемиды рВ1ие8спр1 8К*. На основании рестриктных карт и данных по гибридизации фрагментов рестрикции с зондами к различным участкам генов Н8р70 и фланкирующих последовательностей были сделаны выводы о перекрывании рекомбинантных фагов, взаимной ориентации генов Н8р70 и расстояниях между ними. Как следует из анализа фагов, гены Н8р70 160-й линии Б. утШ организованы в виде кластера в числе 7-и копий. Шесть генов расположены в тандемной ориентации на расстоянии 4,8 т. п. н. один от другого (считая границами ТАТА-бокс и сигнал полиадепилирования ААТААА), а седьмая копия имеет обратную ориентацию и расположена на расстоянии ~ 1,5 т. п. н. от соседней (см. рис. 15). Таким образом, два гена Н8р70 у линии 160 Б. утШ образуют инвертированный повтор, что характерно для всех изученных на сегодняшний день видов Бrosopkila. Было подтверждено наличие рестрикционного сайт-полиморфизма в 3-фланкирующих областях генов ksp70 Б. утШ по сайтам Асс1, ИтШи и ХЬа1. Все гены ksp70 Б. уirШs содержат в составе кодирующей последовательности сайт ВатШ; гены ksp70a, ksp70Ь, ksp70d, ksp70e и ksp70g содержат сайт ИтйШ. в З'-фланкирующей последовательности. Таким образом, рестриктная карта кластера генов к8р70 Б. жпШ, построенная на основании анализа рекомбинантных фагов, соответствует данным Саузерн-анализа геномной ДНК. У 200-й линии Б. lыmmei так же, как и у Б. утШ, два гена к8р70 расположены в виде инвертированного повтора. Однако следующая копия расположена от них на расстоянии 5,5 т. п. н., превышающем расстояние между инвертированным повтором и следующей за ним копией у Б. утШ. Данная копия, вероятно, делегирована по 3'-концу, как было показано Саузерн-гибридизацией геномной ДНК. Анализ фагов не мог дать однозначного ответа на этот вопрос, так как данная копия в составе фага ограничена сайтом по которому произошло клонирование, на

расстоянии ~ 1,6 т. п. и. от сайта ХЬа1. Четвёртая копия, как и две копии, входящие в инвертированный повтор, является полноразмерной, но не содержит сайта Расстояние до этой копии (более 6 т. п. н.) точно установить не удалось, так как между соответствующими фагами отсутствует перекрывание (см. рис. 15). Обнаруживается значительный рестрикционный сайт-полиморфизм последовательностей, фланкирующих гены Таким образом, можно сделать вывод, что кластер генов

имеет совершенно различную структуру, что выражается в разном числе копий, большими расстояниями между тандемно ориентированными генами у £). 1итте1 и различиями в структуре межгенных участков. Кроме того, одна из копий в составе кластера генов Ъяр70 Д ¡иттег, как это следует из Саузерн-анализа геномной ДНК, является псевдогеном с делецией З'-участка. С другой стороны, у Д. 1итте1 имеются два гена в составе инвертированного повтора, сходного по своей структуре с инвертированным повтором генов /ир70 £). хгпШ. Гены, находящиеся в составе инвертированного повтора у Л. /мтюе/, содержат сайты ВатШ, так же, как их гомологи у О. \irUis. Ген не содержит сайта ВатШ, как видно и из рестрикции геномной

ДНК. Таким образом, и в случае совпадают результаты анализа геномной ДНК

и рекомбинантных фагов.

X X

Ь> а

X XXX

ХНН НВХ л лил -ч 11 пл ; Ц л л л л л л

«'h'I'II КУЧМ17Ц11 W

S R bar S OR S ORR A S OR R A S OR AR SORRA S ORRS O^R í HBX

тЭДва

ХНН SR В AR ;s OR

¡HBÍHAAf* В/РнаЧГ H B',_,

•'n1.'.'"1'^ |V'V ц И

D.Mrilis 1601

4 т.п.н.

TÍC

S ORR

4 т.п.н. 2.8 i m.n.H.

1 nlilil.

S OR R A SO X X HX X HHX *

SORRAS OR R A SOR

А -Accl S- ■Sacb

В -ВатШ L -Salí

Н -Hindlll О -Xhol

R - ЕсоШ X -Xbal

AR S 0;RR ASORROSlR

: л

: I >

: x x xx x н itIaiib I I вн I

ro s' i

10 т.п. h.

4 т.п.н. 4 тли. 4 m.n.4.

ПГ

R R A S OIROS1!

D. lummei 200

HORH

iQ-

JL,

RO S XO

X S XS В X X В ¡ h'i

-n-11 i ffr1 BU

SS RO S XO

11 i m ir

гй2

чр!7 ?

I I I ITI Jl" I 111

RO S XO r X SL

3 т.п.н.

| S XS B X X в

jtuT4H

O R R O

щ n

■fu

ir w

O > R R O

2-Sm.n.H. 4.2 т.п. H..

1 1Г

н HS

10 т.п.н.,

Qza

Рис. 15. Структура рекомбинантных фагов X и кластеров генов hsp70 В. утШ 160 и Д 1иттв1 200. Красными стрелками выделены гены серыми прямоугольниками

выделены Л2><ат1-фрагменты, нефункциональная копия у В. Шттв1 отмечена затемнённым прямоугольником. Подробнее см. в тексте.

Как следует из рестрикгной карты кластера генов hsplO, при расщеплении геномной ДНК D. virilis рестриктазой ВатШ должны образовываться два фрагмента, гибридизующие с зондом к 5'-фрагменту гена hsp70. Один из этих фрагментов, размером ~ 4 т. п. н., относится к инвертированному повтору, тогда как другой, размером ~ 7 т. п. н., образуется при рестрикции остальных 5-и копий, расположенных в тандемной ориентации. Был клонирован фрагмент £coRI, размером 1,2 т. п. н., из фага№1 (D. virilis 160), содержащий межгенную последовательность из инвертированного повтора, и участки, гомологичные нетранслируемому 5'-участку генов hsp70. Путём Саузерн-гибридизации данного фрагмента с геномной ДНК, обработанной ВатШ, было подтверждено наличие инвертированного повтора в составе ßamHI-фрагмента длиной 4 т. п. н. у разных линий D. virilis и D. lummei. Таким образом, инвертированный повтор является эволюционно консервативной структурой, сохраняющейся у разных видов филады virilis, вида Drosophila и отряда Díptera (Konstantopoulou I., 1998, Bettencourt В. R., 2001).

Определение нуклеотидной последовательности генов hsp 70 и прилежащих геномных участков D. lummei И D. virilis

Для более детального анализа кластера генов hsp70 была полностью определена нуклеотидная последовательность части генов hsp70 и прилежащих участков D. virilis 160

клонированных в составе

рекомбинантных фагов. Фрагменты, содержащие гены hsp70, были переклонированы в фагемиду pBluescript SK*. Были полностью секвенированы 6 копий гена hsp70D. virilis и один ген (hsp70d) D. lummei. Частично секвенированы гены hsp70d D. virilis и гены hsp70a, hsp70b и hsp70c D. lummei. Результаты сиквенса и трансляции белковых продуктов опубликованы в базе данных GenBank NCBI под номерами AY445083, AY445084. AY445085. AY445086. AY445087. AY445088. AY445089. AY445090. AY445091. AY445092 и AY445093.

Шесть полностью секвенированных копий генов- hsp70 D. virilis высоко консервативны и содержат всего 5 замен на всём протяжении кодирующей последовательности. Из них три замены приходятся на незначащий третий нуклеотид в мультикодирующих кодонах и две — приводят к замене аминокислотного остатка в последовательности кодируемого белка. По сравнению с генами hsp70 D. virilis, ген hsp70d D. lummei содержит 33 нуклеотидных замены в составе кодирующей последовательности, из которых 28 являются незначащими, а 5 приводят к замене аминокислотного остатка, и делецию 9-и пар оснований после 1456-го нуклеотида относительно старта транскрипции. В области 5'-фланкирующей последовательности гены hsp70D. virilis и D. lummei различаются по 17-и позициям, и ген hsp70dD. lummei содержит 15-нуклеотидную вставку в положении 86-го нуклеотида выше старта транскрипции. В области 3'-фланкирующей последовательности наблюдается более выраженная дивергенция как между генами D. virilis и D. lummei, так и между разными копиями D. virilis, выражающаяся в наличии нуклеотидных замен и делеций. В 3'-фланкирующей последовательности генов hsp70g D. virilis и hsp70d D. lummei обнаружена специфичная 24-нуклеотидная последовательность, не встречающаяся в составе других генов. Нуклеотидная последовательность кодирующей части генов hsp70 D. virilis и D. lummei на 80% гомологична генам hsp70 D. melanogaster, между аминокислотными последовательностями белковых продуктов наблюдается 91% гомология. В области З'-фланкирующей последовательности всех генов hsp70D. virilis и D. lummei обнаружена повторяющаяся последовательность, по данным J. Vieira, представляющая собой фрагмент LTR-содержащего ретроэлемента JEM (J. Vieira, частное

Рис. 17. а - Саузерн-гибридизация геномной ДНК с зондом к hsp70. Рестрикция Neil. 1 —D. lummei 1102,2 - D. lummei 200, 3 - D . virilis 9, 4 - D. virilis Т-53. б - то же,

гибридизация с зондом к JEM.

сообщение). Данный мобильный элемент в настоящее время является функционально неактивным и относится к эволюционно древним последовательностям. Был проведён Саузерн-анализ геномной ДНК D. virilis и D. lummei на содержание последовательностей, гомологичных JEM. Как видно из рисунка 16, у D. virilis данные повторы локализованы преимущественно в области генов hsp70, о чём свидетельствует наличие фрагментов, одинаково гибридизующих как с зондом к hsp70, так и к JEM. В случае D. lummei повтор, очевидно, помимо локуса hsp70 распространён по всему геному. Повторяющиеся последовательности, в том числе мобильные элементы, могут играть важнейшую роль в эволюции, в частности способствовать изменению числа копий генов путём неравного кроссинговера и/или внутрихромосомной рекомбинации.

Обсуждение результатов

При исследовании механизмов адаптации на филогенетически неродственных видах возникает вопрос: действительно ли обнаруженные различия в системах защиты организма обусловлены адаптацией к тем или иным факторам окружающей среды, или являются побочным результатом дивергентной эволюции между видами? Для того, чтобы ответить на этот вопрос настоящее исследование проводили на близкородственных видах и линиях внутри видов, полученных из контрастных по термоустойчивости природных популяций, изменения в системе ответа на тепловой шок у которых должны в первую очередь иметь адаптивное значение.

Для настоящей работы были выбраны несколько видов характеризующихся различной степенью термальной адаптации и различной филогенетической близостью. Основное внимание уделялось контрастным по температурным условиям обитания видам, относящимся к группе virilis. Группа virilis является одной из наиболее древних с эволюционной точки зрения групп подрода Drosophila (считается, что дивергенция предковых форм видов группы virilis от внегруппового вида, в качестве которого предполагается D. robusta, произошла 30 - 35 миллионов лет назад). Для исследования были выбраны пары видов D. virilis — D. lummei и D. novamexicana — D. texana. Внутри видов D. virilis и D. lummei были выбраны несколько линий, имеющих различное географическое происхождение. Сравнение внутривидовых линий и близкородственных видов позволяет наблюдать конкретные адаптивные изменения в системе ответа на ТШ, тогда как сравнение структуры генов

близких к общим предковым формам с

эволюционно «молодыми» видами, относящимися к группе melanogaster, предоставляет возможность более широко изучить все основные этапы эволюции генов hsp70. Как наиболее термоустойчивый вид Drosophila, для изучения динамики синтеза БТШ70 использовалась D. mojavensis (группа repleta).

При сравнении видов Д virilis и Д lummei, а также видов D. novamexicana и Д. texarta у некоторых линий наблюдается положительная корреляция между повышенной термоустойчивостью и увеличением продукции БТШ70 после ТШ средней интенсивности 37,5 - 38,5°С. Однако большинство линий D. virilis и Д lummei, рассмотренных в данной работе, а также Д mojavensis и Д melanogaster характеризуются отрицательной корреляцией между накоплением БТШ70 и термоустойчивостью (Krebs R., 1999, Zatsepina О. G. et al., 2001). Таким образом, многочисленные данные свидетельствуют о наличии у Drosophila дополнительных молекулярных механизмов формирования термальной адаптации.

Более однозначные результаты были получены при изучении синтеза и регуляции экспрессии БТШ70 при значениях ТШ, близких к критическим (40,0 — 41,0°С). По данным Вестерн-блоттинга и исходя из анализа белков, меченых 358-метионином, все без исключения линии используемых в данной работе термоустойчивых видов (Д mojavensis, D. virilis и Д novamexicana) характеризуются высоким уровнем накопления БТШ70 через 3 часа восстановительного периода после интенсивного ТШ (см. рис. 3 - 5). Напротив, у Д lummei, Д texana и Д. melanogaster наблюдается отчетливое подавление синтеза БТШ70 после ТШ при температурах выше 39°С. Кроме того, у термоадаптированных видов температура максимальной индукции БТШ70 выше, чем у термочувствительных (38,5°С у Д virilis и Д. novamexicana, 39,5°С у Д. mojavensis, и 37,5°С у Д lummei, D. texana и Д melanogaster). Исходя из данных по индукции мРНК БТШ70 и Вестерн-блоттинга, можно сделать вывод, что репрессия синтеза БТШ70 при субкритическом ТШ у Д. lummei происходит за счёт инактивации аппарата транскрипции и трансляции. ДНК-связывающая активность HSF Д. lummei сохраняется при 40,0 и 41,0°С (рис. 6), следовательно подавление синтеза мРНК происходит за счёт нарушения функций других компонентов транскрипционного комплекса. Транскрипция мРНК у Д lummei восстанавливается в течение 1 часа после ТШ 40,0°С, однако синтеза БТШ70 при этом не происходит, что говорит о нарушениях механизма трансляции. Инактивация транскрипции генов hsp70 может обусловливаться денатурацией и агрегацией белков аппарата транскрипции и/или нарушением фосфорилирования HSF, являющегося необходимой стадией его активации.

Таким образом, есть основания утверждать, что в случае изученных видов Drosophila семейство БТШ70, очевидно, играет основную роль в защите клеток от повреждения преимущественно при температурах, близких к критическим. У видов, обитающих в жарких климатических поясах и адаптированных к воздействиям высоких температур, синтез БТШ70 при интенсивном тепловом шоке обеспечивается, по-видимому, за счёт более высокой устойчивости компонентов аппарата транскрипции генов ТШ и транспорта/трансляции их мРНК к повреждающему воздействию высокой температуры. Протекция белковых факторов транскрипции и трансляции может осуществляться с участием низкомолекулярных БТШ или трегалозы, являющейся важным защитным компонентом клетки (Chen Q. et al., 2002). БТШ70, быстро накапливаясь в клетке, предотвращает агрегацию белков и необратимые изменения в клетках. У термочувствительных видов факторы, необходимые для экспрессии генов ТШ, оказываются более чувствительными к действию высокой температуры: при субкритических значениях ТШ происходит резкое угнетение транскрипции и трансляции мРНК ТШ, так что синтез БТШ70 практически отсутствует. В результате в клетке накапливаются денатурированные белки, и происходит их необратимая агрегация, приводящая к гибели клетки. Таким образом, молекулярные механизмы, определяющие устойчивость к ТШ, являются многокомпонентными и требуют участия множества факторов. Динамика транскрипционного аппарата и транспорта мРНК в цитоплазму

может играть важную роль в термальной адаптации (Zatsepina О. G., 2000, Evgen'ev M., 1979). Возможно, термочувствительность аппарата транскрипции у D. lummei объясняет также наблюдаемое нами отсутствие у этого вида индуцируемой термотолерантности. Данная проблема нуждается в более подробном изучении.

На существование- дополнительных механизмов термоустойчивости косвенно указывают результаты двумерного электрофореза белков, меченых 358-метионином. Как. видно из рисунка 7, термоустойчивые виды (D. mojavensis, D. virilis и D. novamexicana) при интенсивном тепловом шоке показывают значительно более высокий уровень включения метки в группу низкомолекулярных БТШ (БТШ23 - 27) и группу белков с массой ~ 40 кДа, возможно, относящихся к семейству J-белков (БТШ40). БТШ23 - 27 и БТШ40! могут играть важную - роль в формировании термальной * адаптации. Низкомолекулярные БТШ способны напрямую взаимодействовать с денатурированными, белками, предохраняя их от агрегации, а БТШ40 является необходимым кофактором для БТШ70 (Cheetham M. Е., 1994).

Методом двумерного электрофореза и Вестерн-блоттинга были изучены паттерн и серологические свойства БТШ70 видов группы virilis и вида D. mojavensis. Виды группы, virilis имеют однотипный паттерн БТШ70, состоящий из двух групп белков, отличающихся по молекулярной массе, изоэлектрической точке и серологическим свойствам. Число изоформ в каждой группе у всех изученных линий D. virilis и D. lummei индивидуально (см. рис. 8). Это свидетельствует о высокой вариабельности БТШ70 даже внутри одного вида Drosophila. Молекулярные массы индуцибельных БТШ70 видов группы virilis были определены как 70 и 72 кДа, причем белки с массой 72 кДа по своим серологическим свойствам напоминают БТШ68 D. melanogaster. Такая классификация подтвердилась при определении молекулярных масс пептидов, получаемых при гидролизе белков модифицированным трипсином. Различия в электрофоретической подвижности гомологичных белков у разных видов могут объясняться двумя причинами — разницей в аминокислотной последовательности белка или же посттрансляционными, модификациями. Для ответа на этот вопрос потребуется секвенирование белка и/или кодирующей последовательности гена. Однако можно- сделать вывод, что гены, кодирующие БТШ68, дивергировали от семейства БТШ70 на ранних этапах эволюции Drosophila, предшествуя появлению видов группы virilis.

Различия в количестве БТШ70 при температуре максимальной индукции у разных линий D. virilis и D. lummei могут объясняться несколькими причинами: изменениями в структуре промотора либо различным числом копий гена hsp7O. Методом Саузерн-анализа было определено число копий hsp70 у 7-и линий D. virilis и 3-х линий D. lummei. Обнаружена строгая корреляция между числом копий гена hsp70 и продукцией БТШ70 у D. virilis и D. lummei. Показано, что одна из копий у D. lummei лишена ~ 200 н. п. с 3'-конца (по данным Саузерн-анализа геномной ДНК) и, вероятно, является функционально неактивной Эта копия присутствует у разных линий з D. lummei и, соответственно, образовалась до их географического расселения. Внутривидовые различия в числе копий гена hsp70 у линий, полученных из природных популяций, обнаружены впервые. Интересен факт, что линия OR D. melanogaster по количеству синтезируемого БТШ70 более чем в два раза превосходит 160-ю линию D. virilis, несмотря на то, что имеет всего 5 копий гена hsp70(Feder M., 2001). Вероятно, столь значительная разница в накоплении БТШ70 объясняется более высокой активностью промотора hsp70 D. melanogaster, либо более эффективной трансляцией мРНК.

Гены hsp70D. virilis и D. lummei были локализованы с помощью гибридизации in situ в локусе 29С в одном диске. Как в случае D. virilis, так и в случае D. lummei две копии расположены в виде инвертированного повтора, тогда как остальные копии находятся в

тандемной ориентации (рис. 15). Первичная структура кодирующей последовательности генов hsp70D. virilis и D. lummei крайне консервативна (5 нуклеотидных замен в генах D. virilis и 33 замены в гене hsp70dD. lummei), что предполагает поддержание первичной структуры генов за счёт механизма генетической конверсии (Ish-Horowicz D., 1981). Очевидно, З'-границей конверсии служит область сигнала полиаденилирования, так как 3'-фланкирующая последовательность разных генов характеризуется меньшей степенью гомологии и включает множественные замены и делеции. Это видно по наличию рестрикционного полиморфизма по сайтам рестриктаз Hindlll, Accl и Xbal, расположенных в области З'-фланкирующей последовательности. 5'-фланкирующие последовательности, напротив, консервативны почти в той же степени, что и кодирующие последовательности, что должно объясняться необходимостью сохранения структуры промотора для эффективной транскрипции генов. Интересно, что на протяжении 130 п. н. выше ТАТА-бокса генов hsp70 D. virilis была обнаружена всего одна каноническая HSE-последовательность. Возможно, это объясняет менее интенсивную экспрессию БТШ70 у D. virilis по сравнению с D. melanogaster, гены hsp70 которой содержат в составе промотора 4 HSE на протяжении 120-и п. н выше ТАТА-бокса.

Кластер генов hsp70 D. lummei отличается от кластера D. virilis по числу и расположению тандемно ориентированных копий, находящихся у D. lummei на больших расстояниях друг от друга и от гена hsp70b в составе инвертированного повтора (рис. 15). Т. к. Саузерн-анализ показывает наличие двух копий в виде инвертированного повтора с консервативной структурой у всех линий D. virilis и D. lummei, следует вывод, что в ходе эволюции группы virilis изменялось число тандемно ориентированных копий. Общая схема предполагаемой эволюции кластера генов hsp70 Drosophila приведена на рисунке 17. D. pseudoobscura, один из предковых видов рода Drosophila, имеет единственный локус, содержащий два гена hsp70 в виде инвертированного повтора (В. Bettencourt, unpublished data). Из этого следует вывод, что дополнительные копии hsp70 D. virilis (hsp70c - g) образовались в ходе тандемных дупликаций. В ходе дивергенции видов D. virilis - D. lummei, по-видимому, произошла потеря части тандемно ориентированных копий и увеличение длины межгенных участков между ними, возможно за счёт амплификации повторяющихся последовательностей, обнаруженных нами в 3'-фланкирующих областях генов hsp70 (у D. melanogaster таким образом увеличилось расстояние между генами hsp70Ba и hsp70Bb за счёт встраивания так называемых сф-элементов). Особи с уменьшенным числом копий генов - hsp70 у D. lummei не выбраковывались в ходе естественного отбора, т. к., будучи обитателями- зон с умеренным климатом, не подвергались воздействию высоких температур. Эта гипотеза подтверждается наличием в З'-фланкирующей последовательности генов hsp70gD. virilis и hsp70d D. lummei специфичной' 24-нуклеотидной последовательности, не встречающейся в составе других генов. Возможно, гены hsp70g D. virilis и hsp70dD. lummei являются гомологами, и в ходе эволюции D. lummei были делегированы копии hsp70c -fD. virilis. Возможным механизмом увеличения или уменьшения числа копий генов hsp70 может являться неравный кроссинговер и/или делеции вследствие рекомбинации между гомологичными участками одной хромосомы. В случае кластера генов hsp70 D. lummei рекомбинация могла происходить по гомологичным последовательностям повторов в З'-фланкирующей последовательности, которые, по мнению J. Vieira, являются древними мобильными элементами. В последнее время было получено множество данных об участии мобильных элементов в эволюции генов hsp70 (Zatsepina О. G. et al., 2001, Maside X., 2002). Мобильные элементы способны оказывать заметное влияние на интенсивность экспрессии генов hsp70 (Zatsepina О. G. et al., 2001).

Возможно, данная работа - ещё одно подтверждение важной роли мобильных элементов в эволюционном процессе.

Эволюция кластера генов hsp70 у других групп Drosophila (в частности, группы melanogaster) до определённого момента шла также путём тандемной дупликации генов (субгруппы ananassae, montium), а затем амплификации предкового инвертированного повтора у субгруппы melanogaster (рис. 17). Шесть видов этой группы (I), elegans, D. ficusphila, D. eugracilis, D. lucipennis, D. takahashii, D. orend) содержат два инвертированных повтора по две копии в каждом в составе локусов 87А7 и 87С1. Наконец, у D. melanogaster наблюдается тандемная дупликация генов и встраивание элементов в локусе 87С1.

Участие генов hsp70 в формировании термальной адаптации на уровне целого организма до сих пор остаётся спорным. Большинство термоустойчивых видов характеризуются повышенной экспрессией БТШ70 (Feder M. Е., 1999). С другой стороны, термоустойчивые разновидности Drosophila показывают значительно более низкий уровень экспрессии БТШ70, чем термочувствительная линия D. melanogaster Oregon R. Как показывают исследования М. Feder с соавторами (Feder M. Е., 1996), увеличение продукции БТШ70 при гипертермии путём трансформации дополнительными копиями гена hsp70 увеличивает выживаемость личинок непосредственно после ТШ, однако приводит к дефектам в развитии и высокой смертности на последующих стадиях развития. Этот эффект может объясняться влиянием БТШ70 на процессы апоптоза при развитии. Таким образом, дальнейшее увеличение числа копий гена hsp70 и продукции БТШ70 у Drosophila приводят к нарушениям развития и должны выбраковываться в процессе отбора. Очевидно, уровень экспрессии БТШ70 у Oregon R является

максимально допустимым, и адаптация к более высоким температурам, возможно, идёт с участием БТШ40 и низкомолекулярных БТШ, а также ферментов обмена трегалозы или других молекулярных механизмов. Адаптивная роль БТШ70 сохраняется при значениях теплового шока, близким к критическим. При этом экспрессия БТШ70 у термоустойчивых видов при жёстком ТШ обеспечивается за счёт более высокой устойчивости аппарата транскрипции, транспорта мРНК и трансляции, которая, в свою очередь, может зависеть от уровня трегалозы, БТШ40 и/или низкомолекулярных БТШ.

Выводы

1. Показано, что южные виды D. virilis и D. novamexicana характеризуются более высокой базовой и индуцируемой термоустойчивостью по сравнению с D. lummei и D. texana, обитающих в условиях умеренного климата. Обнаружено практически полное отсутствие индуцируемой термоустойчивости у D. lummei.

2. Показано, что все термоадаптированные виды Drosophila характеризуются повышенным синтезом БТШ70 и низкомолекулярных БТШ при значениях ТШ, близких к критическим. Напротив, у D. lummei наблюдается подавление синтеза БТШ70 при температуре 40,0°С. Установлено, что подавление синтеза БТШ70 у D. lummei вызвано низкой термоустойчивостью аппарата транскрипции и трансляции.

3. Изучен паттерн БТШ70 видов Drosophila группы virilis. Показано наличие двух групп БТШ70 с молекулярной массой 70 и 72 кДа и различными значениями изоэлектрической точки; белок 70 кДа гомологичен БТШ70, а белок с массой 72 кДа гомологичен БТШ68 D. melanogaster.

4. Изучена структура кластера генов hsp70 D. virilis и D. lummei. Показано наличие в кластере генов hsp70 D. virilis и D. lummei двух копий в виде инвертированного повтора, как структуры, эволюционно консервативной у отряда Diptera, и различного числа тандемно ориентированных копий у разных линий.

5. Клонированы гены hsp7O D. virilis и D. lummei. Определена их нуклеотидная последовательность, включая кодирующий участок, 5'- и 3'-фланкирующую последовательность. В составе 3'-фланкирующей последовательности обнаружен повтор, возможно, являющийся древним мобильным элементом. Высказана гипотеза о его участии в тандемных дупликациях и/или делениях генов hsp70D. virilis и D. lummei.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Zatsepina О. G., Velikodvorskaia V. V., Molodtsov V. В., Garbuz P.. Lerman D. N., Bettencourt B. R., Feder M. E. and Evgenev M. B. A Drosophila melanogaster strain flom sub-equatorial Africa has exceptional thermotolerance but decreased Hsp70 expression. The Journal of Experimental Biology, 2001,204,1869-1881

2. Молодцов В. Б., Великодворская В. В., Гарбуз Д. Г.. Зацепина О. Г., Евгеньев М. Б. Анализ белков теплового шока и терморезистентной линии Drosophila melanogaster. Известия Академии наук, Серия биологическая, 2001,5,522 - 532

3. Гарбуз Д. Г.. Молодцов В. Б., Великодворская В. В., Зацепина О. Г., Евгеньев М. Б. Эволюция ответа на тепловой шок внутри рода Drosophila. Генетика, 2002, 38, 8, 1097 -1109

4. P. G. Garbuz. О. G. Zatsepina, M. E. Feder, М. В. Evgen'ev. Evolution oftermotolerance and the heat-shock response: evidence from inter/intra specific comparison and interspecific hybridization in the Drosophila virilis species group. I/ Thermal phenotype. The Journal of Experimental biology, 2003,206,2399 - 2408

5. Гарбуз Д. Г.. Евгеньев М. Б., Зайцев С. Ю. Молекулярный анализ ответа на тепловой шок у видов Drosophila с различной термальной адаптацией. Материалы методической и научной конференции МГАВМиБ им. К. И. Скрябина, 2001, 121

6. Гарбуз Д. Г.. Евгеньев М. Б., Зеленцова Е. С, Великодворская В. В., Зацепина О. Г. Эволюция генов БТШ70 Drosophila virilis. Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 2003, 7, 2, 42 (Материалы 11-й Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы»)

7. М. В. Evgenev, О. G. Zatsepina, D. Garbuz, D. Lerman, V. Velikodvorskaya, E. Zelentsova and Martin E. Feder. Evolution of thermotolerance and the heat-shock response system in the virilis species group of Drosophila. First International Congress on Stress Response in Biology and Medicine. Quebec. Canada. 2003,20

8. Evgenev M. В., Zatsepina O. G., Garbuz P.. Lerman D. N., Velikodvorskaya V., Zelentsova E. and Feder M. E. GenBankNCBI. 2003, АУ445083 - AY445093

»-3439

Отпечатано в ООО «Реглант» Тираж 100 экз. Заказ № 280. 115230. г. Москва, Электролитный проезд, ЗБ. тел.: 317 7009,317 6863

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гарбуз, Давид Григорьевич

Список используемых сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Экспрессия генов теплового шока: общие аспекты

1.2. Классификация и функции БТШ

1.3. Регуляция экспрессии генов ТШ

1.4. Изменения в аппарате транскрипции и трансляции при ТШ

1.5. Функции БТШ в апоптозе

1.6. Структура и эволюция генов ТШ

1.7. БТШ в адаптации организмов к неблагоприятным условиям среды обитания

1.8. БТШ в медицине и экологии

2. Материалы и методы

2.1. Материалы 51 2.1.1 Линии и виды ЭгоБорИИа

2.1.2. Штаммы Е. соИ

2.1.3. Клоны /75р70 В. melanogaster

2.1.4. Ферменты рестрикции

2.1.5. Олигонуклеотиды для анализа связывания факторов транскрипции с элементами ТШ

2.1.7. Антитела

2.2. Методы

2.2.1. Условия содержания дрозофил

2.2.2. Условия теплового шока

2.2.3. Определение базальной и индуцибельной термоустойчивости

2.2.4. Включение метионина -358 в белки

2.2.5. Подсчёт общего включения метионина- 8 в белки

2.2.6. Диск-электрофорез белков с ДЦС-Иа (по Лэммли)

2.2.7. Двумерный электрофорез белков по О'Фарреллу

2.2.8. Иммуноблоттинг

2.2.9. Иммунопреципитация

2.2.10. Очистка белков методом препаративного электрофореза

2.2.11. Обработка белка модифицированным трипсином для построения пептидных карт

2.2.12. Анализ связывания факторов транскрипции с элементами ТШ

2.2.13. Включение радиоактивной метки в ДНК

2.2.14. Выделение геномной ДНК

2.2.15. Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами

2.2.16. Электрофорез ДНК

2.2.17. Перенос и гибридизация по Саузерну

2.2.18. Определение числа копий гена по Саузерну

2.2.19. Выделение тотальной РНК

2.2.20. Электрофорез РНК

2.2.21. Нозерн-гибридизация

2.2.22. Получение геномных фаговых библиотек

2.2.23. Скрининг фаговых геномных библиотек

2.2.24. Выделение ДНК бактериофага X

2.2.25. Построение рестриктных карт рекомбинантных фагов

2.2.26. Выделение фрагментов ДНК

2.2.27. Клонирование фрагментов ДНК

2.2.28. Трансформация компетентных клеток

2.2.29. Выделение плазмидной ДНК

2.2.30. Секвенирование ДНК 63 3. Результаты

3.1. Определение базальной термоустойчивости у видов и линий группы хтШ

3.2. Определение индуцированной термоустойчивости у видов и линий группы \irilis

3.3. Определение термоустойчивости реципрокных гибридов

И. \irilis и И. 1иттег

3.4. Изучение общего белкового синтеза при ТШ у £). \irilis и И. 1итте

3.5. Накопление БТШ70 при тепловом шоке

3.6. Определение кинетики индукции мРНК БТШ

3.7. Исследование ДНК-связывающей активности ИББ

3.8. Анализ паттерна БТШ70 и динамики синтеза отдельных групп БТШ методом двумерного электрофореза

3.9. Идентификация белков по молекулярным массам пептидов

3.10. Рестрикционный и Саузерн-анализ генов Ыр70 В. \irilis

3.11. Определение числа копий гена 1гзр70 у разных линий Б. \irilis и \ummei

3.12. Определение структуры кластера генов /ир70 £>. \irilis и О. 1итте1 на основе рекомбинантных фагов X

3.13. Определение нуклеотидной последовательности генов Ъзр70 и прилежащих участков 0.1итте1 и А \irilis

4. Обсуждение результатов

5. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительный анализ структуры и экспрессии генов hsp70 у видов Dropsophila с различной термальной адаптацией"

Для современной биологии значительный интерес представляют молекулярные механизмы адаптации организмов к неблагоприятным условиям среды обитания. Среди прочих факторов окружающей среды наибольшее воздействие на организм оказывают изменения температуры. Изменения температурного режима являются также наиболее удобным экспериментальным воздействием для изучения механизмов адаптации. Повышение температуры на 5 - 15°С выше физиологической (тепловой шок, ТШ) вызывает у всех изученных организмов (от Е. coli до человека) активацию группы генов, названных генами теплового шока. Белки теплового шока (сокращённо БТШ или HSP - heat shock proteins) при воздействии различных стрессовых факторов выполняют в клетке защитные функции, препятствуя денатурации и агрегации белков. Считается, что основную защитную функцию выполняет семейство белков массой 70 кДа (БТШ70 или HSP70). Работы, позволившие сделать такой вывод, проводились в основном на клеточном уровне. Вопрос об участии БТШ70 в адаптации на уровне целого организма остаётся спорным. С этой точки зрения представляет интерес эволюция генов, кодирующих белки семейства БТШ70, их структура и характер экспрессии у близкородственных организмов, резко различающихся по климатическим условиям среды обитания и характеризующихся разным уровнем естественной термальной адаптации. Удобной модельной системой для изучения структуры и эволюции генов ТШ являются различные виды Drosophila. Ранее гены ТШ были подробно исследованы у D. melanogaster. Для настоящей работы были выбраны несколько видов Drosophila, относящихся к филаде virilis, с мало изученной системой ответа на ТШ. Данные виды обитают в различных климатических поясах и, соответственно, должны отличаться по приспособляемости к воздействию высоких температур. Сравнивали пары видов, контрастных по уровню термальной адаптации: D. virilis - D. lummei и D. novamexicana - D. texana. Данные пары видов способны скрещиваться в лабораторных условиях с получением частично фертильного потомства. D. virilis является предковым видом всей группы видов virilis, у которых хорошо изучены кариотип и филогенетические отношения. Время дивергенции видов D. virilis - D. lummei составляет ~ 4 — 5 млн. лет. Это позволяет с высокой уверенностью утверждать, что изменения в структуре и характере экспрессии генов ТШ у данных видов связаны с формированием термальной адаптации, а не обусловлены случайными изменениями в ходе эволюционной дивергенции. Группа virilis является одной из наиболее древних групп подрода Drosophila, что позволяет изучить возможные этапы эволюции генов hsp70 путём изучения их структуры и сравнения со структурой генов других видов (D. melanogaster). Целью данной работы являлось изучение структуры генов hsp70, характера их экспрессии и значимости в формировании естественной термальной адаптации у близкородственных организмов на примере видов филады virilis и некоторых других представителей рода Drosophila. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить термоустойчивость видов D. virilis, D. lummei, D. íexana и D. novamexicana, а также реципрокных гибридов D. virilis x D. lummei.

3. Клонировать гены hsp70 D. virilis и D. lummei, определить их нуклеотидную последовательность, определить общую структуру кластера и число копий генов hsp70 D. virilis и D. lummei.

4. На основании сравнения структуры генов hsp70 и паттерна БТШ70 D. virilis и D. lummei с данными, полученными для других видов Díptera, определить общее направление эволюции генов hsp70 в данной группе и их участие в термальной адаптации.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гарбуз, Давид Григорьевич

5. Выводы

1. Показано, что южные виды D. virilis и D. novamexicana характеризуются более высокой базовой и индуцибельной термотолерантностью по сравнению с D. lummei и D. texana, обитающих в условиях умеренного климата. Обнаружено практически полное отсутствие индуцируемой термоустойчивости у D. lummei.

4. Изучена структура кластера генов hsp70 D. virilis и D. lummei. Показано наличие в кластере генов hsp70 D. virilis и D. lummei двух копий в виде инвертированного повтора, как структуры, эволюционно консервативной у отряда Díptera, и различного числа тандемно ориентированных копий у разных линий.

5. Клонированы гены hsp70 D. virilis и D. lummei. Определена их нуклеотидная последовательность, включая кодирующий участок, 5'- и 3 '-фланкирующую последовательность, в составе 3'-фланкирующей последовательности обнаружен повтор, возможно, являющийся древним мобильным элементом. Высказана гипотеза о его участии в тандемных дупликациях и/или делециях генов hsp70 D. virilis и D. lummei.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гарбуз, Давид Григорьевич, Москва

1. Ritossa F. A new puffing pattern induced by heat shock and DNP in Drosophila. Experientia, 1962,18: 571-573

2. Маргулис Б. А., Гужова И. В. Белки стресса в эукариотической клетке. Цитология, 2000,42 (4): 323 342

3. Rubin D. М., Mehta A. D., Zhu J., Shoham S., Chen X., Wells Q. R, Palter К. B. Genomic structure and sequence analysis of Drosophila melanogaster HSC70 genes. Gene, 1993, 128(2): 155-1634. http://flvbase.bio.indiana.edu/

4. Ульмасов X. А., Каррыева Б. Ч., Караев К. Стрессовые белки и адаптация. Ашхабад, «Ылым», 1993: 212

5. Лозовская Е. Р., Евгеньев М. Б. Тепловой шок у дрозофилы и регуляция активности генома. Молекулярная биология, 1984,20: 142 185

6. Bonner J. J., Berninger M., Pardue M. L. Transcription of polytene chromosomes and of the mitochondrial genome in Drosophila melanogaster. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 1978,42 (2): 803 814

7. Rubin G. M., Hogness D. S. Effect of heat shock on the synthesis of low molecular weight RNAs in drosophilia: accumulation of a novel form of 5S RNA. Cell, 1975, 6 (2): 207-213

8. Bonner J. J., Pardue M. L. Polytene chromosome puffing and in situ hybridization measure different aspects of RNA metabolism. Cell, 1977,12 (1): 227-234

9. Belikov S. V., Karpov V. L. Mapping Protein-DNA Interaction with CIS-DDP: Chromatine Structure of Promoter Region of D. melanogaster HSP70 Gene. Biochem. Mol. Biol. Int., 1996,38 (5): 997 1002

10. O'Brien Т., Lis J. T. RNA polymerase II pauses at the 5' end of the transcriptionally induced Drosophila hsp70 gene. Mol. Cell. Biol., 1991, 11 (10): 5285-5290

11. Lee H., Kraus K. W., Wolfner M. F., Lis J. T. DNA sequence requirements for generating paused polymerase at the start of hsp70. Genes. Dev. 1992,6 (2): 284 295

12. Shopland L. S., Hirayoshi K., Fernandes M., Lis J. T. HSF Access to Heat Shock Elements In Vivo Depends Critically on Promoter Architecture Defined by GAGA-factor, TFIID, and RNA-polymerase II Binding Sites. Genes Dev., 1995,9 (22): 2756 2769

13. Wilkins R. C., Lis J. T. Dynamics of potentiation and activation: GAGA factor and its role in heat shock gene regulation. Nucleic Acids Res. 1997,25 (20): 3963 3968

14. Kruger C., Benecke B. J. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs in heterologous and homologous cell-free systems. Cell, 1981, 23 (2): 595-603

15. Lindquist S. Translational efficiency of heat-induced messages in Drosophila meJanogaster cells. J. Mol. Biol., 1980,137 (2): 151 158

16. Venetianer A., Dubois Marie-Francoise, Nguyen Van Trung, Bellier S., Seo S. J., • Bensaud Oliver. Phosphorilation State of the RNA Polymerase II C-terminal Domen

17. CTD) in Heat Shocked Cells. Possible Involvement of the Stress-Activated Mitogen-Activated Protein (MAP) Kinases. The European Journal of Biochemistry, 1995, 233 (1): 83-92

18. Patriarka E. J., Maresca B. Acquired thermotolerance following hsp synthesis prevents impairment of mitochondria ATP-ase activity at elevated temperatures in Saccharomyces cerevisiae. Exp. Cell. Res., 1990,190: 57-64

19. Johnson R. N., Kucey B. L. Competitive inhibition of hsp70 expression causes thermosensitivity. Science, 1988,242: 1551 1554

20. Craig E. A., Jacobsen K. Mutations of the heat inducible 70 kilodalton genes of yeast confer temperature sensitive growth. Cell, 1984, 38 (3): 841 849

21. Lewis M. J., Pelham H. R. Involvement of ATP in the nuclear and nucleolar functions of the 70 kd heat shock protein. EMBO J., 1985,4 (12): 3137-3143

22. Pelham H. R. Speculations on the functions of the major heat shock and glucose-regulated proteins. Cell, 1986,46 (7): 959 961

23. Н. Б. Гусев, Н. В. Богачева, С. Б. Мартсон. Структура и функции малых белков теплового шока (sHsp) и их взаимодействие с белками цитоскелета. Биохимия, 2002, 67 (5): 613-623

24. Martin Haslbeck, Stefan Walke, Thusnelda Stornier, Monika Ernsperger, Helen E. White, Shaoxia Chen, Helen R. Saibil and Johannes Buchner. HSP27: a Temperature-regulated Chaperone. EMBO Journal, 1999, 18 (23): 6744 6751

25. Kelley W. L. The J-domain family and the recruitment of chaperone power. Trends Biochem. Sei., 1998,23:222 22728. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/iguide/human/

26. Cheetham M. E., Jackson A. P., Anderton В. H. Regulation of 70-kDa heat-shock-protein ATPase activity and substrate binding by human DnaJ-like proteins, HSJla and HSJlb. Eur. J. Biochem., 1994,226 (1): 99 107

27. Flaherty К. M., DeLuca-Flaherty С., McKay D. В. Three-dimensional structure of the ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein. Nature, 1990,346 (6285): 623 -628

28. Flajnik M. F., Canel C., Kramer J., Kasahara M. Which came first, MHC class I or class II? Immunogenetics, 1991, 33 (5 6): 295 - 300

29. Welch W. J., Feramisco J. R. Rapid purification of mammalian 70,000-dalton stress proteins: affinity of the proteins for nucleotides. Mol. Cell. Biol., 1985,5 (6): 1229 1237

30. Welch W. J., Feramisco J. R. Nuclear and nucleolar localization of the 72,000-dalton heat shock protein in heat-shocked mammalian cells. J. Biol. Chem., 1984, 259 (7): 4501-4513

31. Knowlton AA, Grenier M, Kirchhoff SR, Salfity M. Phosphorylation at tyrosine-524 influences nuclear accumulation of HSP72 with heat stress. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol., 2000,278 (6): H2143 2149

32. Houry W. A. Chaperone-assisted protein folding in the cell cytoplasm. Curr. Protein Pept. Sei., 2001,2 (3): 227 244

33. Mathias Gebauer, Matthias Zeiner and Ulrich Gehring. Interference between proteins ap46 and Hop/p60, which bind to different domains of the molecular chaperone hsp70/hsc70. Mol. Cell. Biol., 1998,18(11): 6238 6244

34. Craig E., Ziegelhoffer T., Nelson J., Laloraya S., Halladay J. Complex multigene family of functionally distinct Hsp70s of yeast. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 1995,60:441-449

35. Lars Ditzel, Jan Lowe, Daniela Stock, Karl-Otto Stetter, Harald Huber, Robert Huber and Stefan Steinbacher. Crystall Structure of the thermosome, the Archaeal chaperonin and homolog of CCT. Cell, 1998,93: 125 138

36. Gupta R. S. Phylogenetic analysis of the 90 kD heat shock family of protein sequences and an examination of the relationship among animals, plants, and fungi species. Mol. Biol. Evol., 1995,12 (6):1063-73

37. Lees-Miller S. P, Anderson C. W. Two human 90-kDa heat shock proteins are phosphorylated in vivo at conserved serines that are phosphorylated in vitro by casein kinase II. J. Biol. Chem., 1989,264 (5): 2431 -2437

38. Obermann W. M., Sondermann H., Russo A. A., Pavletich N. P., Hartl F. U. In vivo • function of Hsp90 is dependent on ATP binding and ATP hydrolysis. J. Cell. Biol., 1998,143(4): 901-910

39. Yolanda Sanchez, John Taulien, Katherine A. Borkovich and Susan Lindquist. Hspl04 is required for tolerance to many forms of stress. The EMBO Journal, 1992,11 (6): 2357-2364

40. Susan Lindquist and Gina Kim. Heat-shock protein 104 expression is sufficient for thermotolerance in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996,93: 5301 5306

41. Vogel J. L., Parsell D. A., Lindquist S. Heat-shock proteins Hspl04 and Hsp70 reactivate mRNA splicing after heat inactivation. Curr Biol., 1995,5 (3): 306 317

42. Eric C. Schirmer, John R. Glover, Mike A. Singer and Susan Lindquist. HSPlOO/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions. TIBS, 1996, 21: 289-296

43. Prodromou C., Roe S. M., O'Brien R., Ladbury J. E., Piper P. W., Pearl L. H. Identification and structural characterization of the ATP/ADP-binding site in the Hsp90 molecular chaperone. Cell, 1997, 90 (1): 65 75

44. Craig E. A., Jacobsen K. Mutations of the heat inducible 70 kilodalton genes of yeast confer temperature sensitive growth. Cell, 1984,38 (3): 841 849

45. Washburne, and Elizabeth A. Craig. The Translation Machinery and 70kd Heat Shock Protein Cooperate in Protein Synthesis. Cell, 1992,71: 97 105

46. Ku Z., Yang J., Menon V., Thomason D. B. Decreased Polysomal HSP70 May Slow Polypeptide Elongation During Skeletal Muscle Atrophy. American Journal of Physiology, 1995,268(6): 1369-1374

47. Walter Neupert, Franz-Ulrich Hartl, Elizabeth A. Craig, and Nikolaus Pfanner. How Do Polypeptides Cross the Mitochondrial Membranes? Cell, 1990,63: 447 450

48. Minet E., Mottet D., Michel G., Roland I., Raes M., Remade J., Michiels C. Hypoxia-inducible Activation of HIF-1: Role of HIF-l/HSP90-alpha Interaction. FEBS Letters, 1999,460 (2): 251 256

49. Guillermo Garcia-Gardena, Roger Fan, Vijay Shah, Raffaella Sorrentino, Giuseppe Cirino, Andreas Papapetropoulos, William C. Sessa. Dinamic Activation of Endotelial Nitric Oxide Sinthase by HSP90. Nature, 1998,392: 821 824

50. Kang J., Kim T., Ko Y. G., Rho S. B., Park S. G., Kim M. J., Kwon H. J., Kim S. Heat shock protein 90 mediates protein-protein interactions between human aminoacyl-tRNA synthetases. J. Biol. Chem., 2000,275 (41): 31682 31688

51. Xu Y., Singer M. A., Lindquist S. Maturation of the tyrosine kinase c-src as a kinase and as a substrate depends on the molecular chaperone Hsp90. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999,96(1): 109-114

52. Xu Y, Lindquist S. Heat-shock protein hsp90 governs the activity of pp60v-src kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. US , 1993, 90 (15): 7074 7078

53. Pratt W. B., Scherrer L. C., Hutchison K. A., Dalman F. C. A model of glucocorticoid receptor unfolding and stabilization by a heat shock protein complex. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol., 1992,41 (3 8): 223 - 229

54. Nagata Y. et al. The Stabilization Mechanism of Mutant-type p53 by Impaired Ubiquitination: the Loss of Wild-type p53 Function and the HSP90 Assotiation. Oncogene,• 1999,18 (44): 6037-6049

55. Railson J. E, Lawrence K., Buddie J. C., Pennica D., Latchman D. S. Heat shock protein-56 is induced by cardiotrophin-1 and mediates its hypertrophic effect. J. Mol. Cell. Cardiol. 2001, 33 (6): 1209- 1221

56. Hamman B. D., Hendershot L. M., Johnson A. E. BiP Maintains the Permeability Barrier of the 3P Membrane by Sealing the Lumenal End of the Translocon Pore Befor and Early in Translocation. Cell, 1998,92 (6): 747 758

57. Ferreira L. R., Norris K„ Smith T„ Hebert C., Sauk J. J. HSP47 and Other 3P-resident Molecular Chaperones Form Heterocomplexes with Each Other and with Collagen Type IV Chains. Connect Tissue Research, 1996,33 (4): 256 273

58. Jeffrey Melnick and Yair Argon. Molecular Chaperones and the Biosintesis of Antigen Receptors. Immunology Today, 1995,16 (5): 243 250

59. Bercovich B., Stancovski I., Mayer A., Blumenfeld N., Laszlo A., Schwartz A. L., Ciechanover A. Ubiquitin-dependent degradation of certain protein substrates in vitro requires the molecular chaperone Hsc70. J Biol Chem., 1997,272 (14): 9002 9010

60. Hohfeld J. Regulation of the heat shock conjugate Hsc70 in the mammalian cell: the characterization of the anti-apoptotic protein BAG-1 provides novel insights. Biol. Chem., 1998,379 (3): 269-274

61. Jiang J., Ballinger C. A., Wu Y., Dai Q., Cyr D. M., Hohfeld J., Patterson C. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for• ubiquitylation. J. Biol. Chem., 2001,276 (46): 42938-42944

62. Raynes D. A., Guerriero V. Jr. Inhibition of Hsp70 ATPase activity and protein renaturation by a novel Hsp70-binding protein. J. Biol. Chem., 1998, 273 (49): 32883 -32888

63. Bond U., Schlesinger M. J. The chicken ubiquitin gene contains a heat shock promoter and expresses an unstable mRNA in heat-shocked cells. Mol. Cell. Biol., 1986, 6 (12): 4602-4610

64. Segal G., Ron E. Z. Regulation of heat-shock response in bacteria. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1998,851: 147-151

65. Jachansan Amin, Jayakumar Ananthan, Richard Voellmy. Key Features of Heat Shock Regulatory Elements. Molecular and Cellular Biology, 1988, 8 (9): 3761 3769

66. Jachansan Amin, Ruben Nestril, Paul Schiller, Michel Dreano and Richard Voellmy. Organization of the Drosophila melanogaster hsp70 heat shock regulation unit. Mol. Cell. Biol., 1987,7 (3): 1055 1062

67. Mariann Bienz and Hugh R. B. Pelham. Heat shock regulatory elements function as an inducible enhancer in the Xenopus hsp70 gene and when linked to a heterologous promoter. Cell, 1986,45:753 760

68. R. I. Morimoto. Regulation of the Heat Shock Transcription Response: Cross Talk Between a Family of HSFs, Molecular chaperones, and negative regulators. Genes and Development, 1998,12: 3788 3796

69. C. Wu. Heat Shock Transcription Factors: Structure and Regulation. Annual Review of the Cellular and Development Biology, 1995,11: 441 469

70. Loones M. T., Rallu M., Mezger V. Morange M. HSP Gene Expression and HSF2 in Mouse Development. Cell. Mol. Life Science, 1997,53 (2): 179-190

71. Vincenzo Zimarino, Charles Tsai and Carl Wu. Complex modes of heat shock factor activation. Mol. Cell. Biol., 1990,10 (2): 752 759

72. J. Timothy Westwood and Carl Wu. Activation of Drosophila heat shock factor: conformational change associated with a monomer-to-trimer transition. Mol. Cell. Biol., 1993,13 (6): 3481 -3486

73. Gallo G. J., Schuetz T. J., Kingston R. E. Regulation of heat shock factor in Schizosaccharomyces pombe more closely resembles regulation in mammals than in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol., 1991,11 (1): 281 288

74. Yanhong Shi, Paul E. Kroeger, Richard Morimoto. The Carboxyl-Terminal Transcription Domen of Heat Shock Factor 1 Is Negatively Regulated and Stress Responsive. Molecular and Cellular Biology, 1995,15 (8): 4309-4318

75. Jiangying Zou, Yongle Guo, Toumy Guettouche, David F. Smith, and Richard Voellmy. Repression of Heat Shock Transcription Factor HSF1 Activation by HSP90 (HSP90 Complex) that Forms a Stress-Sensitive Complex with HSF1. Cell, 1998, 94: 471 -480

76. Sridhar K. Rabindran, Raymond I. Haroun, Joachim Clos, Jan Wisniewski, Carl Wu. Regulation of heat shock factor trimer formation: role of a conserved leucine zipper. Science, 1993,259:230-234

77. Andras Orosz, Jan Wisniewski and Carl Wu. Regulation of Drosophila heat shock factor trimerisation: global sequence requirements and independence of nuclear localization. Mol. Cell. Biol., 1996, 16 (12): 7018 7030

78. Yanhong Shi, Dick D. Mosser, and Richard I. Morimoto. Molecular Chaperones as HSF1 -specific Transcriptional Repressors. Genes and Development, 1998,12: 654 — 666

79. И. JI. Степаненко. Интерференция генных сетей апоптоза и ответа на тепловой шок. Молекулярная биология, 2001,35 (6): 1063 1071

80. Carina I. Holmberg et al. Phosphorylation of serine 230 promotes inducible transcriptional activity of heat shock factor 1. The EMBO Journal, 2001, 20 (14): 3800 -3810

81. Kiang J. G., Gist I. D., Tsokos G. C. Cytoprotection and Regulation of Heat Shock Proteins Induced by Heat Shock in Human Breast cancer T47-D Cells: Role of Ca2+.i and Protein Kinases. FASEB Journal, 1998,12 (14): 1571 1579

82. Donald A. Jurivich, Christine Pachetti, Lin Qiu and Joseph F. Welk. Salicilate triggers heat shock factor differently than heat. J. Biol. Chem., 1995, 270 (41): 24489 -24495

83. Dooha Kim et al. A Constitutive Heat Shock Element-binding Factor Is Immunologically Identical to the Ku Autoantigen. The Journal of Biological Chemistry, 1995,270(25): 15277-15284

84. Nussenzweig A., Chen C., da Costa Soares V., Sanchez M., Sokol K., Nussenzweig M. C., Li G. C. Requirement for Ku80 in growth and immunoglobulin V(D)J recombination. Nature. 1996,382 (6591): 551-555

85. Scott R. Peterson, Carl Wu et al. Stimulation of the DNA-dependent Protein Kinase by RNA Polymarase II Transcriptional Activators Proteins. The Journal of Biological Chemistry, 1995,270 (3): 1449 1454

86. Douglas B. Jacoby and Pieter C. Wensink. Yolk Protein Factor 1 Is a Drosophila Homolog of Ku, the DNA-binding Subunit of a DNA-dependent Protein Kinase from Humans. The Journal of Biological Chemistry, 1994,269 (15): 11484 11491

87. Richard Y. Liu, Peter M. Corry, Yong J. Lee. Potential Involvement of a Constitutive Heat Shock Element Binding Factor in the Regulation of Chemical Stress-induced HSP70 Gene Expression. Molecular and Cellular Biochemistry, 1995, 144: 27 -34

88. Shao-Hua Yang, Dooha Kim et al. Modulation of Thermal Induction of HSP70 Expression by Ku Autoantigen or Its Individual Subunits. Molecular and Cellular Biology, 1996, 16(7): 3799-3806

89. Dan Tang, Yue Xie, Meijuan Zhao, Mary Ann Stevenson, Stuart K. Calderwood. Repression of the HSP70B promoter by NFIL6, Ku70 and MAPK involves three Complementary mechanisms. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000,208:280 285

90. Transcription Factor 1 Binds Selectively in Vitro to Ku Protein and the Catalytic Subunit of the DNA-dependent Protein Kinase. J. Biol. Chem., 1997,272 (41): 26009 26016

91. Cotto J. J., Morimoto R. I. Stress-induced activation of the heat-shock response: cell and molecular biology of heat-shock factors. Biochem Soc Symp. 1999,64: 105 118

92. Bevilacqua A., Fiorenza M. T., Mangia F. Developmental Activation of an Episomic HSP70 Gene Promoter in Two-cells Mouse Embryos by Transcription Factor Spl. Nucleic Acids Res., 1997,25 (7): 1333- 1338

93. William D. Morgan et al. Two Transcriptional Activators, CCAAT-Box-Binding Transcription Factor and Heat Shock Factor, Interact with a Human HSP70 Gene Promoter. Molecular and Cellular Biology, 1987,7 (3): 1129 1138

94. Agoff S. N., Hou G., Linzer D. I., Wu B. Regulation of the Human HSP70 Promoter by p53. Science, 1993,259 (5091): 84-87

95. Masako Tanabe et al. The Mammalian HSF4 Gene Generates Both an Activator and a Repressor of Heat Shock Genes by Alternative Splicing. The Journal of Biological Chemistry, 1999,274 (39): 27845 27856

96. J. Timothy Westwood, Joachim Clos, Carl Wu. Stress-induced Oligomerization and Chromosomal Relocalization of Heat-shock Factor. Nature, 1991,353: 822 827

97. Jin Huang and Lex H. T. Van der Ploeg. Maturation of polycistronic pre-mRNA in Trypanosoma brucei: analysis of /ram-splicing and Poly(A) addition at nascent RNA transcripts from the hsp70 locus. Mol. Cell. Biol., 1991, 11 (6): 3180 3190

98. M. Saeed Sheikh and Albert J. Fornace Jr. Regulation of Translation Following Stress. Oncogene, 1999,18: 6421 6128

99. Menon V., Thomason D, B. Heat-down Tilt Increases Rat Cardiac Muscle eIF2a Phosphorilation. American Journal of Physiology, 1995,269 (3): 802-804

100. Duncan R. F., Cavener D. R., Qu S. Heat Shock Effects on Phosphorilation of Protein Sintesis Initiation Factor Proteins eIF4E and eIF2-alpha in Drosophila. Biochemistry, 1995,34 (9): 2985 2997

101. Vries R. G. et al. Heat Shock Increases the Assotiation of Binding Protein-1 with Initiation Factor 4E. The Journal of Biological Chemistry, 1997,272 (52): 32779 32784

102. Cuesta R, Laroia G, Schneider RJ. Chaperone hsp27 inhibits translation during heat shock by binding eIF4G and facilitating dissociation of cap-initiation complexes. Genes Dev. 2000,14 (12): 1460 1470

103. Nicola К. Gray and Marvin Wickens. Control of translation initiation in animals. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 1998, 14: 399 458

104. Andrew Yueh and Robert J. Schneider. Translation by ribosome shunting on adenovirus and hsp70 mRNAs facilitated by complementarity to 18S rRNA. Genes Dev., 2000,14:414-421

105. McMullin T. W., Hallberg R. L. Effect of heat shock on ribosome structure: appearance of new ribosome associated protein. Mol. Cell. Biol. 1986, 109:2527-2535

106. Hallberg R. L and Hallberg E. M. Heat shock in Tetrahymena induces the accumulation of a small RNA homologous to eukaryotic 7SL RNA and E. coli 4,5S RNA. In: Stress induced proteins. Alan Liss Inc., New York. 1989: 107 116

107. П. M. Чумаков. Функция гена p53: выбор между жизнью и смертью. Биохимия, 2000,65 (1): 34-47

108. Li S., Chien S., Branemark P. I. Heat Shock-induced Necrosis and Apoptosis in Osteoblasts. J. Orthop. Res., 1999, 17 (6): 891 899

109. E. B. Lasunskaia, 1.1. Fridlianskaia, I. V. Guzhova, V. M. Bozhkov, B. A. Margulis. Accumulation of Major Stress Protein 70kDa Protects Myeloid and Lymphoid Cells from Death by Apoptosis. Apoptosis, 1997,2: 156 163

110. Ahn J. H., Ко Y. G., Park W. Y., Kang Y. S., Chung H. Y., Seo J. S. Suppression of Ceramide-mediated Apoptosis by HSP70. Mol. Cells, 1999, 9 (2): 200 206

111. Brar В. K. et al. Heat Shock Proteins Delivered with a Virus Vector Can Protect Cardiac Cells Against Apoptotic as Well as Against Thermal or Hypoxic Stress. The Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 1999,31 (1): 135 46

112. Wagstaff M. J. et al. Protection of Neuronal Cells from apoptosis by HSP27 Delivered with a Herpes Simplex Virus-based vector. The Journal of Biological Chemistry, 1999,274(8): 5061-5069

113. Schett G. et al. Activation of Fas Inhibits Heat-induced Activation ofHSFl and Up-regulation ofHSP70. FASEB Journal, 1999, 13 (8): 833-42

114. Dick D. Mosser, Antoine W. Caron, Lucie Bourged, Claude Denis-Larose, Bernard Massie. Role of the Human Heat Shock Protein HSP70 in Protection Against Stress-Induced Apoptosis. Molecular and Cellular Biology, 1997, 17 (9): 5317 5327

115. Kumar Y, Tatu U. Stress protein flux during recovery from simulated ischemia: Induced heat shock protein 70 confers cytoprotection by suppressing JNK activation and inhibiting apoptotic cell death. Proteomics. 2003,3 (4): 513 526

116. Gabai V. L., Meriin А. В., Yaglom J. A., Volloch V., Sherman M. Y. Role of HSP70 in Regulation of Stress-kinase JNK: Implications in Apoptosis and Aging. FEBS Letters, 1998,438 (1-2): 1-4

117. Mosser D. D., Caron A. W., Bourget L., Meriin А. В., Sherman M. Y., Morimoto R. I., Massie B. The chaperone function of hsp70 is required for protection against stress-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 2000,20 (19): 7146 7159

118. Maria Jaattela, Dorte Wissing, Klaus Kokholm, Tuula Kallunki and Mikala Egeblad. HSP70 Exerts its Anti-apoptosic Function Downstream of Caspase-3-like Proteases. The EMBO Journal, 1998,17 (21): 6124 6134

119. Chen Y. C., Lin-Shiau S. Y., Lin J. K. Involvement of Heat-shock Protein 70 and p53 Proteins in Attenuation of UVC-induced Apoptosis by Thermal Stress in Hepatocellular Carcinoma Cells. Photochem. Photobiology, 1999,70 (1): 78 86

120. И. В. Гужова, Б. А. Маргулис. Индукция и накопление БТШ70 приводят к формированию его комплексов с другими клеточным белками. Цитология, 2000, 42 (7): 647-652

121. И. В. Гужова, Е. Б. Ласунская, К. Нильссон, 3. А. Дариева, Б. А. Маргулис. Влияние теплового шока на процессы дифференцировки и апоптоза в клетках U-937. Цитология, 2000,42 (7): 653 657

122. Patrick Mehlen, Klaus Schulze-Osthoff, and Andre-Patrick Arrigo. Small Stress Proteins as Novel Regulators of Apoptosis. The Journal of Biological Chemistry, 1996,271 (28): 16510-16514

123. Andre-Patrick Arrigo, Patrick Mehlen et al. Small Stress Proteins as Novel Negative Regulators of Programmed Cell Death. In: Molecular chaperones and heat shock response. Cold Spring Harbor, New York, 1998:21

124. Gonin Sandeline, Vincenzo Zimarino and Andre-Patrick Arrigo. Decreased oxidative stress mediated nuclear insolubilization of p53 and HSF by hsp27 expression. In: Molecular chaperones and heat shock response, 1998, Cold Spring Harbor, New York: 84

125. Jaattela M. Escaping Cell Death: Survival Proteins in Cancer. Exp. Cell Res., 1999, 248(1): 30-43

126. Hunt C., Morimoto R. I. Conserved features of eukaryotic hsp70 genes revealed by comparison with the nucleotide sequence of human hsp70. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82 (19): 6455-6459

127. Lindquist S., Craige E. A. A heat shock proteins. Ann. Rev. Genet., 1988, 22: 631667

128. Southgate R., Mirault M., Ayme A., Tissieres A. Organization, sequences and induction of heat shock genes. In: Changes in eukaryotic gene expression in response to environmental stress, Academic Press, New-York, 1985: 3-30

129. Southgate R, Mirault M., Ayme A., Tissieres A. Organization, sequences and induction of heat shock genes. In: Changes in eukaiyotic gene expression in response to environmental stress, Academic Press, New-York, 1985: 3-30

130. Heschl M. F., Baillie D. L. Characterization of the hsp70 multigene family of Caenorhabditis elegans. DNA, 1989, 8 (4): 233 243

131. Maside X., Bartolome C., Charlesworth B. S-element insertions are associated with the evolution of the Hsp70 genes in Drosophila melanogaster. Curr. Biol., 2002, 12 (19): 1686-1691

132. Leigh Brown A. J., Ish-Horowicz D. Evolution of the 87A and 87C heat-shock loci in Drosophila. Nature, 1981,290 (5808): 677 682

133. Holmgren R., Livak K., Morimoto R. I., Frend R., Meselson M. Studies of cloned sequences from four Drosophila heat shock loci. Cell, 1979, 18: 1359 1370

134. Konstantopoulou I., Nikolaidis N., Scouras Z. G. The hsp70 locus of Drosophila auraria (montium subgroup) is single and contains copies in a conserved arrangement. Chromosoma, 1998, 107 (8): 577 586

135. Bettencourt B. R., Feder M. E. Hsp70 duplication in the Drosophila melanogaster species group: how and when did two become five? Mol. Biol. Evol., 2001,18 (7): 1272 -1282

136. Benedict M. Q., Cockburn A. F., Seawright J. A. The Hsp70 heat-shock gene family of the mosquito Anopheles albimanus. Insect. Mol. Biol., 1993,2 (2): 93-102162. http://www.ncbi.nih.gov/PMGifs/Genomes/6239.html

137. Hart C., Zhao K., Laemmli U. The scs' boundaiy element: characterization of boundary element-associated factors. Mol. Cell. Biol., 1997, 17: 999 1009

138. David J. Glass, Ramona I. Polvere and Lex H. T. Van der Ploeg. Conserved sequences and Transcription of the hsp70 gene family in Trypanosoma brucei. Mol. Cell. Biol., 1986,6 (12): 4657 4666

139. Michael L. Muhich and John C. Boothroyd. Synthesis of Trypanosome hsp70 mRNA is resistant to disruption of trans-splicing by heat shock. J. Biol. Chem., 1989, 264 (13): 7107-7110

140. Russnak R. H, Candido E. P. Locus encoding a family of small heat shock genes in Caenorhabditis elegans: two genes duplicated to form a 3.8-kilobase inverted repeat. Mol. Cell. Biol., 1985, 5 (6): 1268 1278

141. Ingolia T. D., Craig E. A. Four small Drosophila heat shock proteins are related to each other and to mammalian alpha-crystallin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, 79 (7): 2360-2364

142. Shapira M. and Pinelli E. Heat-shock protein 83 of Leishmania mexicana amazonensis is an abundant cytoplasmic protein with a tandemly repeated genomic arrangement. Eur. J. Biochem., 1989, 185:231 236

143. Benedict M. Q., Levine B. J., Ke Z. X., Cockburn A. F., Seawright J. A. Precise limitation of concerted evolution to ORFs in mosquito Hsp82 genes. Insect. Mol. Biol., 1996,5(1): 73-79

144. Milner С. M., Campbell R. D. Structure and expression of the three MHC-linked HSP70 genes. Immunogenetics, 1990,32 (4): 242 251

145. Milner С. M., Campbell R. D. Polymorphic analysis of three MHC-linked HSP70 genes. Immunogenetics, 1992, 36 (6): 357 — 362

146. Walter L., Rauh F., Gunther E. Comparative analysis of the three major histocompatibility complex-linked heat shock protein 70 (hsp70) genes of the rat. Immunogenetics, 1994,40:325-330

147. Salter-Cid L.} Kasahara M., Flajnik M. F. Hsp70 genes are linked to the Xenopus major histocompatibility complex. Immunogenetics, 1994,39 (1): 1 7

148. Busseau I., Pelisson A., Bucheton A. I elements of Drosophila melanogaster generate specific chromosomal rearrangements during transposition. Mol. Gen. Genet., 1989,218 (2): 222-228

149. Евгеньев M. Б., Мнджоян E. И., Зеленцова E. С., Шостак H. Г., Лёзин Г. Т., Великодворская В. В., Полуэктова Е. В. Мобильные элементы и видообразование. Молекулярная биология, 1998,32 (1): 184 192

150. Lerman D. N., Michalak P., Helin А. В., Bettencourt B. R., Feder M. E. Modification of Heat-Shock Gene Expression in Drosophila melanogaster Populations via Transposable Elements. Mol. Biol. Evol., 2003,20 (1): 135 144

151. Baumann P., Moran N. A. Non-cultivable microorganisms from symbiotic associations of insects and other hosts. Antonie Van Leeuwenhoek, 1997,72 (1): 39 48

152. Feder M. E., Hofmann G. E. Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology. Annu. Rev. Physiol., 1999, 61: 243-282

153. Evgen'ev M., Levin A., Lozovskaya E. The analysis of a temperature-sensitive (ts) mutation influencing the expression of heat shock-inducible genes in Drosophila melanogaster. Mol. Gen. Genet., 1979,176 (2): 275-280

154. Walter J. Gehring and Rudiger Wehner. Heat shock protein synthesis and thermotolerance in Cataglyphis, an ant from the Sahara desert. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1995,92:2994-2998

155. Ulmasov H. A., Karaev K. K., Lyashko V. N., Evgen'ev M. B. Heat-shock response in camel (Camelus dromedarius) blood cells and adaptation to hyperthermia. Comp. Biochem. Physiol. B., 1993,106 (4): 867 872

156. Zatsepina O. G., Ulmasov K. A., Beresten S. F., Molodtsov V. B., Rybtsov S. A., Evgen'ev M. B. Thermotolerant desert lizards characteristically differ in terms of heat-shock system regulation. J. Exp. Biol., 2000,203 (6): 1017 1025

157. Lei Huang, Nahid F. Mivechi, Demetrius Moskophidis. Regulation and function of the major stress-induced hsp70 molecular chaperone in vivo: analysis of mice with targeted gene disruption of hsp70.1 or hsp70.3. Mol. Cell. Biol., 2001,21: 8575 8591

158. Heino R., Lumme J. Inheritance of cold shock tolerance in hybrids of Drosophila xirilis and Drosophila lummei. Genetica, 1989,79: 17 25

159. Stratman R., Markow T. A. Resistance to thermal stress in desert Drosophila. Functional Ecology, 1998, 12: 965 970

160. Martin E. Feder. Necrotic fruit: a novel model system for thermal ecologists. J. Therm. Biol., 1997,22 (1): 1 9

161. Krebs R. A., Feder M. E. Deleterious consequences of Hsp70 overexpression in Drosophila melanogaster larvae. Cell Stress Chaperones, 1997,2 (1): 60 71

162. Krebs R. A. A comparison of Hsp70 expression and thermotolerance in adults and larvae of three Drosophila species. Cell Stress Chaperones, 1999,4 (4): 243-249

163. Hottiger Т., Boiler Т., Wiemken A. Rapid changes of heat and desiccation tolerance correlated with changes of trehalose content in Saccharomyces cerevisiae cells subjected to temperature shifts. FEBS Lett., 1987,220 (1): 113 115

164. Chen Q., Ma E., Behar K. L., Xu Т., Haddad G. G. Role of trehalose phosphate synthase in anoxia tolerance and development in Drosophila melanogaster. J. Biol. Chem., 2002,277 (5): 3274-3279

165. Diamant S., Eliahu N., Rosenthal D., Goloubinoff P. Chemical chaperones regulate molecular chaperones in vitro and in cells under combined salt and heat stresses. J. Biol. Chem., 2001,276 (43): 39586-39591

166. Sophia Ekengren and Dan Hultmark. A family of Turandot-volated genes in the • humoral stress response of Drosophila. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001,284: 998-1103

167. Clark T. G., Abrahamsen M. S., White M. W. Developmental expression of heat shock protein 90 in Eimeria bovis. Mol. Biochem. Parasitol. 1996,78 (1 2 ): 259 - 263

168. Michael L. Muhich and John C. Boothroyd. Synthesis of Trypanosome hsp70 mRNA is resistant to disruption of /гаш'-splicing by heat shock. J. Biol. Chem., 1989, 264 (13): 7107-7110

169. Neumann S., Ziv E., Lantner F., Schechter I. Regulation of HSP70 gene expression during the life cycle of the parasitic helminthes Schistosoma mansoni. Eur. J. Biochem., 1993,212 (2): 589-596

170. Salotra P., Chauhan D., Ralhan R., Bhatnagar R. Tumour necrosis factor-alpha induces preferential expression of stress proteins in virulent promastigotes of Leishmania donovani. Immunol. Lett., 1995,44 (1): 1 5

171. Lyons R. E., Johnson A. M. Heat shock proteins of Toxoplasma gondii. Parasite Immunol., 1995, 17 (7): 353-359

172. Biswas S., Sharma Y. D. Enhanced expression of Plasmodium falciparum heat shock protein PFHSP70-I at higher temperatures and parasite survival. FEMS Microbiol. Lett., 1994,124 (3): 425-429

173. Martinez J., Perez Serrano J., Bernadina W. E., Rodriguez-Caabeiro F. Influence of parasitization by Trichinella spiralis on the levels of heat shock proteins in rat liver and muscle. Parasitology, 1999,118 (2): 201-209

174. Wiesgigl M., Clos J. Heat shock protein 90 homeostasis controls stage differentiation in Leishmania donovani. Mol. Biol. Cell, 2001,12 (11): 3307 3316

175. Morgan R. W., Christman M. F., Jacobson F. S., Storz G., Ames B. N. Hydrogen peroxide-inducible proteins in Salmonella typhimurium overlap with heat shock and other stress proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1986, 83 (21): 8059 8063

176. Hanawa T., Fukuda M., Kawakami H., Hirano H., Kamiya S., Yamamoto T. The Listeria monocytogenes DnaK chaperone is required for stress tolerance and efficient phagocytosis with macrophages. Cell Stress Chaperones., 1999,4 (2): 118 128

177. Han G. M., Lin H., Head M., Jin M., Blank M., Goodman R. Application of magnetic field-induced heat shock protein 70 for presurgical cytoprotection. J. Cell. Biochem. 1998,71:577-583

178. Naveed N. Panjwani, Lana Popova, and Pramod K. Srivastava. Heat Shock Proteins gp96 and hsp70 Activate the Release of Nitric Oxide by APCs. The Journal of Immunology, 2002:2997 3003

179. Thalia Becker, F.-Ulrich Hartl, and Felix Wieland. CD40, an extracellular receptor for binding and uptake of Hsp70-peptide complexes. The Journal of Cell Biology, 2002, 158 (7): 1277-1285

180. O'Farrell P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem., 1975,250: 4007 4021

181. Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., «Мир», 1984: 480

182. Sinibaldi R. М. and Storti R. V. One- and two-dimensional polyacrylamide gel analysis of the heat shock proteins of the virilis group of Drosophila. Biochem. Genet. 1982,20:791-807.

183. Evgen'ev M. В., Kolchinski A., Levin A., Preobrazhenskaya A.L., Sarkisova E. Heat-shock DNA homology in distantly related species of Drosophila. Chromosoma, 1978,68 (4): 357-365

184. Throckmorton L. H., The virilis species group. The genetics and biology of Drosophila. London, Academic Press, 1982, 3B: 227 297

Информация о работе

Гарбуз, Давид Григорьевич
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Сравнительный анализ структуры и экспрессии генов hsp70 у видов Dropsophila с различной термальной адаптацией - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы