Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности стресс-реактивности у крыс с наследственной индуцированной стрессом артериальной гипертензией

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности стресс-реактивности у крыс с наследственной индуцированной стрессом артериальной гипертензией"

РГ6 од

- * СЕН 1997

На правах рукописи

ОСОБЕННОСТИ СТРЕСС-РЕАКТИВНОСТИ У КРЫС С НАСЛЕДСТВЕННОЙ ИНДУЦИРОВАННОЙ СТРЕССОМ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ

03.00.13 - физиология человека и животных 14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1997

Работа выполнена в Новосибирском ордена Трудового Красного Знамени Государственном университете Министерства общего и профессионального образования Российской Федерации, в Институте цитологии и генетики СО РАН и Институте физиологии СО РАМН, г. Новосибирск.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор АЛ. Маркель, академик РАМН Г.С. Якобсон

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, М.П. Мошхин,

дрктор медицйнских наук А.Я. Тернер

Ведущее учреждение: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, С-Петербург

Зашита диссертации состоится.

_заседании диссертационного совета Д 001.14.01. по защите

диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте физиологии СО РАМН по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии СО РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук """/"С!. - А.Г.Елисеева.

Актуальность темы. Гипертоническая болезнь человека, или эссенциальная гипертония, развивается как правило при наличии соответствующей предрасположенности, поэтому для изучения данной патологии особый интерес представляют полученные на животных, и, в частности, на крысах, модели наследственной гипергензии (Smirk, Hall, 1958; Dahl et al., 1962; Okamoto, Aoki, 1963; Ben-Ishay et al., 1972; Dupont et al., 1973; Bianchi et al., 1974; Okamoto, 1974; Rapp, Dcne, 1985). В 1985 г. в Институте цитологии и генетики СО РАН получена новая экспериментальная модель - линия крыс с наследственной, индуцированной стрессом артериальной гипертензией (линия НИСАГ) (Марксль, 1985). Эта линия представляет особый интерес, так как селекционным критерием при ее создании служила реакция артериального давления в условиях эмоционального стресса, являющегося одним из основных факторов формирования гипертонической болезни человека (Шхвацабая, 1985; Айвазян и соавт., 1986, Шаляпина и соавг., 1990). Селекция на повышение артериального давления при эмоциональном стрессе, в процессе которой была получена линяя крыс НИСАГ, в конечном итоге является отбором по уровню стресс-реактивности. Следовательно, у крыс данной линии можно ожидать наличие широкого спектра разнообразных изменений, так или иначе связанных с системой стрессовых реакций.

За прошедшие 11 лет была проделана большая работа по изучению основных физиологических- систем у крыс линии НИСАГ. Однако остались мало исследованными особенности реагирования эндокринной системы на физический (физиологический, гуморальный) и эмоциональный виды стресса, разница между которыми подчеркивается многими авторами (Бьюрстедг, 1970; Левандер, 1970; Леви, 1970). Наряду с этим, при изучении эндокринной системы у крыс линии НИСАГ основное внимание уделялось гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и симпато-адреналовой системам, хотя известно, что параллельно с последней активируется ваго-инсулярный аппарат (Гельгорн, 1948) а также повышается активность ренина плазмы, что демонстрирует взаимосвязь симпато-адреналовой и ренин-ангиотензин-альдостероновой систем, имеющих непосредственное отношение к регуляции артериального давления (Шхвацабая, 1972). Кроме того, совершенно не изученной оказалась стрессовая реакция на молекулярном уровне (синтез стрессовых белков, или белков теплового шока), в то время как в литературе имеются данные о повышенной термочувствительности животных-гипертоников (крыс и мышей) (Malo et al., 1988; Hamet et al., 1990a), которая сопровождается измененной экспрессией гена основного стрессового белка HSP70 (Hamet et al., 1990b).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение системы стрессовых реакций у крыс линии НИСАГ, причем планировалось проведение исследований на разных уровнях функционирования; организменном (эндокринные реакции) и молекулярном (синтез стрессовых белков). Были определены следующие задачи:

о

1. Исследовать некоторые параметры эндокринной системы (содержание кортикостерона, альдостерона и инсулина) у крыс линии НИСАГ в отсутствие стрессорной стимуляции.

2. Исследовать функциональное состояние эндокринной системы крыс линии НИСАГ при разных видах стресса: комбинированном (иммобилизация + нагревание), иммобилизационном, тепловом и циркуляторном, обусловленном нарушением кровообращения после введения адреналина.

3. Определить содержание главного стрессового белка НвР70 в норме и после теплового стресса и провести сравнительный анализ его изоформного состава.

4. Исследовать полиморфизм гена, кодирующего основной стрессовый белок №Р70 у крыс НИСАГ, по сравнению с нормотензивными крысами линии Вистар.

Научная' новизна. В работе впервые проведена сравнительная оценка реакций гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) при эмоциональном (иммобилизационный) и физическом (тепловой и циркуляторный) видах стресса и их комбинации (комбинированный стресс). Было установленно, что физический и комбинированный стрессы, в отличие от эмоционального, у крыс линии НИСАГ сопровождаются более значительным повышением уровня кортикостерона, что демон$трирует наличие дифференциальной чувствительности данной системы к разным видам стресса.

В работе впервые было исследовано состояние эндокринной системы при циркуляторном стрессе, вызванном введением адреналина и моделирующем экспериментальный инфаркт миокарда, что ведет к нарушениям циркуляции крови и, как следствие этого, ухудшению кровоснабжения органов и тканей. Впервые было установлено, что циркуляторный стресс у крыс линии НИСАГ вызывает более глубокое падение артериального давления, сопровождающееся более значительным повышением уровней альдостерона, кортикостерона и инсулина, чем у крыс контрольной линии Вистар.

Впервые была исследована термочувствительность крыс линии НИСАГ и было показано, что повышенная термочувствительность крыс НИСАГ сопровождается сниженным содержанием основного белка теплового шока Н5Р70 при тепловом стрессе. Впервые был проведен сравнительный анализ изоформного состава белков ШР70, синтезируемых в миокарде крыс линии НИСАГ и крыс контрольной линии, который показал, что наличие артериальной гипертензии сочетается с изменением характера индукции и механизмов экспрессии генов, кодирующих белки семейства Н8Р70.

Впервые проведен анализ полиморфизма гена, кодирующего основной стрессовый белок Н8Р70. Исследование полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена кзр70 не выявило связи особенностей стресс-реактивности крыс линии НИСАГ со структурой гена Ьхр70, что свидетельствует о том, что неадекватность функции системы стрессовых белков у крыс НИСАГ скорее всего обусловлена нарушением процессов регуляции синтеза ШР70.

Теоретическая н практическая значимость. Имеющиеся к настоящему гсрсмени работы по состоянию эндокринной системы при артериальной гипертонии, воспроизведенной на животных разных генетических линий, полученных путем направленной селекции по уровню артериального давления, принесло немало важных результатов, тем не менее вопрос о первичности или вторичности эндокринных изменений при эссенциальной гипертензии остается открытым и служит предметом продолжающихся дисскуссий, которые имеют не только чисто теоретический характер, т.к. проецируются непосредственно на область медицины. Кроме того, в связи с тем, что обнаружен факт генетической гетерогенности артериальной гипертензии встает вопрос о специфических изменениях эндокринной системы при разных формах повышения артериального давления. Полученные результаты дают возможность проанализировать состояние эндокринной системы у крыс линии НИСАГ при разных (физический и эмоциональный) видах стресса и выявить роль каждой из компонент в патогенезе артериальной гипертензии. Изучение динамики изменения уровней гормонов при циркуляторном стрессе также имеет практическое значение, т.к. адреналин, введением которого и вызывается данный вид стресса , является одним из гормонов, уровень которых во многом определяет ответную реакцию организма. Но при сильных и частых стрессах может происходить избыточная секреция адреналина и адаптивные реакции могут перерастать в патологические. Исследование системы стрессовых белков дает возможность выявления биохимических маркеров стресс-устойчивости и предрасположенности к артериальной гипертонии.

Апробация работы. Представленные в работе данные обсуждались на 8-м международном симпозиуме SHR and Related Studies (Kyoto, Japan, October, 1994) на отчетной сессии НИИ кардиологии Томского научного центра СО РАМН (Томск, октябрь , 1994); на научной конференции молодых физиологов и биохимиков (Санкт-Петербург, сентябрь, 1995); на научной конференции, посвященной памяти и 90-летию со дня рождения профессора В.А. Пегеля (Томск, декабрь, 1996); на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАМН (Новосибирск, февраль, 1997).

Публикаиии. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 241 источник. Работа изложена на 130 страницах, содержит 10 рисунков и 10 таблиц.

Автор выражает большую благодарность научному сотруднику НИИ медицинской генетики СО РАМН (г. Томск) A.B. Замотринскому за помощь в проведении двумерной) белкового электрофореза. Исследование полиморфизма длин рестрикционных фрашеитов гена hsp70 проводилось совместно с сотрудниками лаб. структуры генома ИЦиГ СО РАН В.А. Адаричевым и A.A. Кривенко. Автор выражает особую благодарность руководителям работы д.б.н., профессору Аркадию Львовичу Маркелю и академику РАМН Григорию Семеновичу Якобсону.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОПЫ.

Исследования проводили на взрослых (5-6 месяцев) самцах линии НИСАГ (Наследственная, индуцированная стрессом артериальная гипертензия) 30-35 поколений селекции. В качестве контроля использовали самцов нормотензивной линии крыс Вистар, из которых путем селекции была получена линия НИСАГ. Артериальное давление измеряли непрямым методом (tail-cuff method) (Pfeffer et al., 1971)."

Иммобилизационный стресс создавали путем помещения интактных бодрствующих животных на 30 мин в узкие клетки-цилиндры, размеры которых соответствовали размерам тела крыс, так чтобы они не могли в них развернуться.

Для создания комбинированного стресса использовали иммобилизацию интактных бодрствующих животных, в вышеописанной клетке-цилиндре, которая находилась на подогреваемой до 40°С платформе. Параллельно производили измерение АД и взятие крови. Плазму хранили при -20°С.

Для проведения теплового стресса крыс наркотизировали нембуталом из расчета 0.1 мл 5% р-ра на 100 г веса и на 1 час помещали в термостат с температурой 43°С. По окончании всей процедуры брали кровь из хвоста (1 мл) в пробирки с гепарином.

Циркушггорный стресс воспроизводили путем однократной . инъекции адреналина в дозе 0.2 мл 0.1% р-ра на 100 г веса тела подкожно наркотизированной крысе (эфирный рауш-наркоз). Вскоре после инъекции развивалась картина так называемого адреналинового инфаркта миокарда (эта модель воспроизводит метаболические нарушения с последующей мелкоочаговой некротизацией, возникающей при чрезмерной активации СНС в состоянии стресса).

Для определения концентрации 11-ОКС в плазме крови после иммобилизационного, комбинированного и теплового стрессов использовали флюорометрический метод (Усватова, Панков, 1968). Измерение уровня кортикосгерона в плазме крови после циркуляторного стресса проводилось методом конкурентного белкового связывания (Murphy, 1967) в модификации A.A. Тинникова и Н.М. Бажан (1984). Содержание альдостерона и инсулина в плазме крови определяли радиоиммунологическими методами. С этой целью были использованы стандартные наборы реактивов фирм Amersham (Великобритания), Sca-Irc-Sorin (Франция).

Для количественной оценки синтеза основного белка теплового шока HSP70 проверили эксперименты in vitro с использованием кратковременных клеточных культур лимфоцитов. Для мечения белков использовали [3Н] -изолейцин (подробно методика описана в соответствующем разделе). Для сравнительного анализа изоформного состава белков HSP70 использовали тепловой стресс in vivo, который воспроизводили в соответствии с методом Currie et al. (1988). Крыс забивали декапитацией, быстро извлекали сердце, промывали буфером Krebs-Henselcit, используя метод Langetidorff (Currie et al., 1988). Сразу же после перфузии около 250-300 мг миокарда желудочков помещали в 1 мл образцового буфера для

экстракции белков. Полученные пробы использовались сразу же для белкового электрофореза или замораживались при -70°С.

Электрофоретическое разделение белков проводили согласно методике Laemmli (1970) в 10% акриламидном геле при постоянной силе тока в 10 мА. Денситометрию флюорограмм проводили на приборе MPF-4 (Hitachi, Япония). Содержание белка HSP70 определяли в процентах к общему белковому синтезу (отношение площади пика HSP70 к суммарной площади пиков денситограммы).

Идентификацию и определение характеристик изоформ HSP70 в миокарде проводили при помощи двумерного электрофореза в системе О' Farrell с некоторыми модификациями (Замотринский, Шишкин, 1991). Гели окрашивали азотнокислым серебром по методу Morrisey (1981). Идентификацию и характеристику изоформ HSP70 осуществляли по молекулярному весу и изоэлектрической точке.

Для анализа генов, кодирующих белок HSP70, в качестве зонда использовали плазмиду pUC18, содержащую 5'-концевую часть гена hsp70 крысы, представляющую собой лидерную последовательность данного гена (Lisowska et al., 1990). ДНК из печени крыс выделяли с использованием протеиназы К и процедуры экстракции фенолом (Маниатис и соавт., 1984). Ддя рестрикции ДНК применяли эндонуклеазу Bam Н I (НПО "Фермент", Литва). Блот-гибридизацию проводили по Саузерму (Маниатис и соавт., 1984). Авторадиографию фильтров осуществляли при -50°С с двумя усиливающими экранами на пленке РМ-1 (¿вема, СССР).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Сгьюденга и критерия Фишера (Лакин, 1980; Плохинский, 1970).

g РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Измерение АД у исследуемых крыс подтвердило полученные ранее данные (Маркель, 1985). Значения АД в покос у крыс линии НИСАГ составляли 1б8.9±1.7 мм рт. ст. (п=157), у крыс Вистар 118.0±б.0 (п=283) (р<0.001) (рис.1). В условиях комбинированного стресса значения АД составляли: у крыс НИСАГ- 195.9±2.1 мм рт. ст., у крыс Вистар - 127.0±8.0 мм рт. ст. (р<0.001).

Эндокринная система интактных крыс НИСАГ характеризуется следующими особенностями (табл.).

Таблица. Некоторые характеристики эндокринной системы у крыс линий Вистар и НИСАГ в покое.

Линия Кортикостерон мкг% Альдостерон нмоль/л Инсулин, мкед/мл

Вистар 10.611.8 (п=10) 1.0+0.1 (п=10) 29.113.0 (п=10)

НИСАГ 9.3+1.4 (п=1б) 1.510.02 (п=10) (р<0.001) 14.513.4 (п=10) (р<0.01)

Интактпыс крысы НИСАГ не отличаются от крыс Вистар но содержании) коргикостсропа в плачме периферической крови, но имеют достоверно более высокую концентрацию альдостсропа. Такое изменение эндокринной фупкшш можно рассматривать как один ич патогенетических механизмов формирования пшертенчивиого статуса крыс НИСАГ. Ичвсстно, что усиление минералокортиколдной функции может быть причиной некоторых форм артериальной пшертенчии как у человека (Алмазов и еоавт., 1992). так и у экспериментальных животных (Куимов. Якобсон, 1992). Низкая бачальиая концентрация инсулина у крыс НИСАГ также согласуется с имеющимися представлениями об эндокринных сдвигах при артериальной пшертенчии (Постной. 1975). Это может бьггь обусловлено повышением симпатического тонуса у крыс НИСАГ (Шорин и еоавт., 1990) и нодашкиисм секреции инсулина через а-адрснорсцспторы. Ранее было обнаружено понижение толерантности к глюкозе у крыс данной линии (Шорин и еоавт., 1990) и это, наряду с уменьшением концентрации инсулина в нлачме крови, давало основание считан,, что для крыс линии НИСАГ характерно наличие склонности к сахарному диабету инсулинзависимого типа. Эго хороню согласуется с клиническими наблюдениями о неслучайном сочетании гипертонической болеши с сахарным диабетом (Древаль и еоавт., 1995; Barnctt, 1994).

Таким обратом крысы линии НИСАГ характеризуются усилением бачалыюй секреции альдостсропа и угнетением функции островковога аппарата поджелудочной железы. Это состояние эндокринной системы может быть связано с одной из основных характеристик крыс линии НИСАГ - их повышенной стресс-чувствительностью, и эти эндокринные особенности Moiyr вносить свой вклад в формирование гипертенчивцого статуса.

Многие авторы (Бьюрстсдт, 1970: Лсвапдср. 1970: Леви, 1970) подчеркивают разницу между эмоциональным и физическим (фичиологичсским. ^моральным, системным) стрессом. Физический стресс является следствием чершчшдх повреждений или изменений организма. При чисто эмоциональном стрессе организм имеет дело лишь с сш налами о возможных изменениях млн повреждениях, и реакция во многом определяется субьсктивной оценкой этих сигналов, так как повреждения как таксики о изначально нет, но оно может появиться в результате развертывания самой стрсс-рсакшш (Вальдман и еоавт., 1979; Симонов, 1981). Поскольку при выведении данной линии крыс эмоциональный стресс (ограничение подвижности) сочетался с i силовым (физическим) стрессом, то представляло ишсрсс изучение особенностей реакции ГГНС на физический и эммопжленпый стрессоры, а также на их сочетание -комбинированный стресс.

При комбинированном стрессе (иммобилизации + нафсманис) выраженная активация ГГНС наблюдается у крыс обеих линий, но у крмс-шнсртнимш повышение уровня коргикостсропа было более сушсственным (77.2+2.7 (п=17) мкг% - НИСАГ, 61.1±5.7 (n=ll) mki% - Висгар). Эго, наряду с изменением АД, указывает па то, что у крыс НИСАГ при комбинированном стрессе, который

о

использовался и качестве стрессора при проведен»» селекции, происходят более значительные изменения шмеостатических параметров, что ведет к усилению ответной реакции пи данный вид стресса.

Для выяснения вклада такого компонента комбинированного стресса, как иммобилизации, животных помещали в тесные клетки-цилиндры, но не подофсвали. Уровень кортикоетсрона при атом стрессе также повышался у крыс обеих линий, по у крыс НИСАГ он был достонерно ниже (21.2+1.8 (п =9) мк!%), чем у крыс Вистар (33.9+4.7 (п=9) мк1%). Таким образом, в ходе экспериментов было обнаружено, что ГТНС у крыс липки НИСАГ па комбинированный и иммобилизанионный стрессы реагирует различным образом, что может указывать на значительный вклад тепловою воздействия в наблюдаемые различия.

Поскольку незначительный подшрев животных при комбинированном стрессе может вносить существенный вклад в активацию ГТНС у крыс-гипертоников, а в литературе имеются данные о повышенной тсрмочувствитслыюсти как людей-, так н животных-гипертоников (Наше! с1 а!., 1990), то для того чтобы выяснит!., насколько подвержены действию высоких температур крысы с разными показазателями АД, был использован умеренный тепловой стресс.

Время, мин.

Рис.1. Изменение температуры тела при тепловом стрессе у крыс линий НИСАГ и Вистар. * - р < 0.05 ; ** - р < 0.01.

Анализ значений температуры тела крыс, подвергнутых тепловому стрессу, показал, что крысы линии НИСАГ более чувствительны к нафсванию, чем крысы линии Вистар (рис.1). Двухфакторный дисперсионный анализ показал, что на величину температуры тела в ходе теплового стресса оказывает влияние не только

время нахождения животных в условиях повышенной температуры (Р=184.05, <1Г=б/267, р<0.01), но и их принадлежность к определенной линии (Р=31.19, с11=1/2б7, р<0.01). В первые 20 минут после помещения животных в термостат различий в росте температуры тела у крыс НИСАГ и -Вистар не наблюдалось, однако, в следующие 10 минут температура тепа у крыс НИСАГ была достоверно выше, чем у крыс Вистар и эта разница сохранялась на протяжении всего опыта. Тем не менее, достоверных межпинейных различий в содержании кортикостерона при тепловом стрессе выявлено не было, хотя у НИСАГ этот показатель выше, чем у Вистар (66.8123.5 (п=10) мкг% - НИСАГ и 48.318.7 (п=8) мкг% - Вистар) (рис.1). Таким образом, повышенная гормональная реакция крыс НИСАГ при комбинированном стрессе связана, очевидно, с сочетанным действием таких факторов как иммобилизация и нагревание.

Таким образом, особенности реакции ГГНС у крыс линии НИСАГ во многом определяются характером стрессора : глюхокортикошшый ответ на эмоциональный стресс, связанный с иммобилизацией, понижен, в то время как комбинированный (иммобилизация + нагревание) и сопровождается более сильной активацией ГГНС.

0 1 2 3 7 14 21

Сутки

Рис.2. Изменение артериального давления у крыс линий НИСАГ и Вистар при циркуляторном стрессе, вызванном метаболическими изменениями в миокарде после введения адреналина.

** - р < 0.01; * - р < 0.05 - различия с базальным уровнем у крыс линии НИСАГ.

## - р < 0.011 # - р < 0.05 - различия с базальным уровнем у крыс линии Вистар.

Анализ электрокардиограмм, регистрируемых у крыс в разные сроки после введенния адреналина (Якобсон и соавт., 1995), показал, что у крыс линии НИСАГ адреналин вызывал более выраженные повреждения миокарда и это, очевидно, было

причиной довольно существенного снижения АД (рис.2). Данная картина соответствует тому, что часто наблюдается в клинической практике в случае развития острого инфаркта миокарда на фоне гипертонической болезни (Куимов, Якобсон, 1992). Скорее всею, такое резкое снижение АД У крыс НИСАГ является

ч б-

|||| 012 3

21 Сутки

8-

4

2-

0

Рис.З. Изменение уровня альдостерона в плазме крови крыс линий НИСАГ и Вистар при циркуляторном стрессе, вызванном метаболическими изменениями в миокарде после введения адреналина. *** - р < 0.001; ** - р < 0.01; * - р < 0.05 - межлинейные различия. ### - р < 0.001; ## - р < 0.01; # - р < 0.05 - различия с базальным уровнем.

основной причиной существенного повышения концентрации альдостерона в плазме крови, особенно в первые дни после введения адреналина (рис.3). Уровень альдостерона увеличивается почти в 4 раза, хотя к 14-му дню отмечается не только нормализация данного показателя, но и достоверное уменьшение по сравнению с исходным уровнем (р<0.001). К 21-му дню вновь происходит незначительное повышение концентрации альдостерона. Такая динамика скорее связана с временным истощением системы синтеза данного гормона. При этом АД у крыс линии НИСАГ также возвращается к исходному гипергензивному уровню. У нормотензивных крыс Вистар некоторое понижение АД было отмечено в 1-й и 14-й дни после инъекции адреналина. При этом существенных изменений в концентрации альдостерона у крыс данной линии не наблюдалось.

Реакция глюкокортикоидов у крыс НИСАГ несколько запаздывает, т.е. регистрируется только на 3-й, 7-й и 14-й дни (рис.4). Уровень кортикостерона на 3-й день увеличивается более чем в 2 раза, что, вероятнее всего, связано с состоянием хронического стресса, обусловленного очаговыми процессами в миокарде крыс

= НИСАГ. У крыс Вистар некоторое повышение глюкокортикоидов отмечено только на 21-й день (р<0.01).

**

т

НИСАГ Вистар

1001

зоJ-1 I I I

0 12 3

7

14

21 Сутки

Рис.4. Содержание кортикостерона в плазме крови у крыс линий НИСАГ и Вистар при циркуляторном стрессе, вызванном метаболическими изменениями в миокарде после введения адреналина. ** - р < 0.01 ; * - р < 0.05 - межлинейные различия. ## - р < 0.01; # - р < 0.05 - различия с базальным уровнем.

Довольно парадоксально выглядят изменения концентрации инсулина в плазме крови у крыс линии НИСАГ. Состояние хронического стресса, связаного с повреждением миокарда, должно сопровождаться угнетением функции инсулин-продуцирующих клеток, однако, здесь мы наблюдаем противоположное явление (рис.5). В первые сутки после введения адреналина концентрация иммунореахтивного инсулина в плазме крови крыс НИСАГ увеличивается более, чем в 4 раза. Затем она несколько снижается, но остается выше базального уровня практически на протяжении всего срока наблюдения, лишь на 21-й день статистически значимых отличий по отношению к базальному уровню обнаружено не было. Очевидно для объяснения такого феномена требуются дополнительные исследования. В качестве рабочей гипотезы можно предположить, что увеличение уровня инсулина у крыс НИСАГ может быть связано с активацией рспаративных процессов, которые должны компенсировать выраженные у крыс этой линии деструктивные последствия действия адреналина. Кроме того адреналин может повышать концентрацию глюкозы в крови, а это, в свою очередь, сопровождается повышением уровня инсулина. Менее выраженный повреждающий эффект адреналина у крыс Вистар и, соответственно, меньшая степень напряжения

анаболических реакций не приводят к существенной мобилизации инсулярного аппарата.

10-

— НИСАГ

— Вистар

0 12 3

7

14

21 Сутки

Рис.5. Изменение уровня инсулина в плазме крови крыс линий НИСАГ и Вистар при циркуляторном стрессе, вызванном метаболическими изменениями в миокарде после введения адреналина. *** - р < 0.001; ** - р < 0.01; * - р < 0.05 - межлинейные различия. " ### - р < 0.001; ## - р < 0.01; # - р < 0.05 - различия с базальным уровнем.

Результаты, полученные в ходе исследования эффектов введения адреналина, продемонстрировали, что надпочечники крыс НИСАГ достаточно чувствительны к стрсссирутошим воздействиям, и различия их реакции на разные виды стресса связаны очевидно с особенностями регуляции функции всей ГГНС.

Пониженная устойчивость крыс НИСАГ к воздействиям, способным нарушить температурный гомсостаз, также как и другие признаки, свидетельствующие о повышенной стресс-реактивности крыс данной линии (Марксль, 1986; Шорип и соавт., 1990), заставляют обратить внимание на функцию сгресс-шшупирусммх белков (белки теплового шока).

В исследованиях, проведенных in vitro на лимфоцитах крыс НИСАГ и Вистар, нами показано, что при температуре инкубационной среды 43°С способность к синтезу основного белка теплового шока HSP70 у гипертензивных крыс НИСАГ достоверно ниже, чем у крыс Вистар и составляет 6.76Ю.48 % (п=5) -для НИСАГ* и 8.40±0.39 % (п=5) - для Вистар. Это указывает на нарушения процесса синтеза HSP70 в условиях стресса, и может быть одной из причин понижения порога ci рссс-рсактшшости крыс НИСАГ. Аналогичные данные были получены при исследовании других линий крыс и мышей, для которых характерно наличие артериальной шнертоппи. (Malo ct al., 1988; Hamct ct al., 1990; Hamet,

1992; Tremblay et al., 1992; Haraet et al., 1992a). Наши результаты, как и литературные данные, подтверждают мнение о том, что генетические механизмы, определяющие стресс-устойчивость той или иной линии животных, могуг быть связаны с механизмами экспрессии генов hsp70 (Малышева и соавт., 1994).

Дня изучения характера накопления и изоформного состава синтезируемых HSP70 исследовали миокард стрессированных животных. Дня этого наркотизированных животных помещали в термостат и выдерживали 15 мин при значениях ректальной температуры в 42°С. На рис.6 представлены результаты исследования характера накопления и изоформного состава синтезируемых в миокарде крыс линий Вистар (фотографии фрагментов гелей верхнего ряда) и НИСАГ (фотографии нижнего ряда). Картины электрофоретического разделения являлись высоковоспроизводимыми и представленью фотографии отражают типичную картину двумерного алекрофореза.

В отсутсвии стресса миокард нормотензивной линии крыс не содержит определяемых количеств индуцибельных HSP70. Среди белков этого семейства обнаруживается только конститутивный белок HSC73 (рис.6 фото1, волнистая стрелка). Накапливающиеся в ранние сроки (3 часа) после воздействия теплового стресса индуци больные изоформы обнаруживаются в виде нескольких фракций с молекулярной массой около 71-72 кДа и изоэлектрофокусируюшихся в интервале градиента pH 5.7-5.9. Картина состава индуцибельных изоформ, накапливающихся в миокарде крыс линии Вистар спустя 48 часов после действия теплового стресса представлена на рис.6 фотоЗ. Окраска нитратом серебра выявляет присутствие среди миокардиальиых белков изоформ HSP70 с pi 5.8-5.9 (указаны на фото стрелками вверх) и, дополнительно накопление еще'не менее двух индуцибельных фракций с pi около 6.0-6.2 (указаны на фото стрелками вниз) и молекулярной массой 71-72 кДа. Представленность индуцибельных фракций с pi 6.2 и 5.8 примерно одинакова, остальные индунибсльныс фракции менее представлены (минорные фракции).

Дальнейшее увеличение сроков восстановления не приводило к накоплению в миокарде крыс дополнительных изоформ. Таким образом, состав индуцибельных HSP70 представлен как минимум пятью фракциями, имеющими молекулярную массу 71-72 кДа и изоэлсктрические точки в интервале фадиента pH 5.7-6.2. В ответ на действие теплового стресса накопление данных белков имеет двухфазный характер, сначала накапливаются более кислые HSP70 , а затем более щелочные представители семейства. Миокард нсстрсссированпых крыс Вистар не содержит индуцибельных HSP70.

В отличие от крыс Вистар миокард крыс линии НИСАГ даже в отсутствие стрессорной стимуляции содержит индунибсльныс HSP70. На рис.6 фото 4 показано присугсвие изоформ HSP70 с pi 6.0-6.2 и с pi 5.8 в виде количеетвено выраженных фракций. Спектр конститутивно синтезируемых изоформ индуцибельных HSP70 в миокарде нестрсссированных крыс линии НИСАГ, в основном, соответсвует спектру индуцибельных HSP70[ в миокарде крыс линии Вистар спустя 48 часов после теплового шока. Тепловой стресс стимулирует

накопление всех конститутивно присутствующих изоформ ШР70 в миокарде крыс НИСАГ (рис.6 фото 5). Однако, в отличии от крыс линии Вистар в миокарде крыс линии НИСАГ в ранние сроки восстановления после действия теплового стресса наблюдается стимуляция синтеза и накопление более щелочных изоформ ШР70 с р1 6.0-6.2, выраженное накопление последних в миокарде крыс Вистар обнаруживается только спустя 48 часов после теплового стресса. Спустя 48 часов после действия гипертермии миокард крыс линии НИСАГ содержит индуцибельные ШР70 сходного состава, что и миокард крыс линии Вистар (рис.6 фото б).

ММ кОа

Р1

СЕ> СГ> СХ>

6.2 6.0 5.8 5.6

*

72 __ Ф*

68 _

СЕ) СЕ) СО

-О-в- . 'О •

Рис. 6. Структура изоформного состава НЗР70, синтезируемых в миокарде крыс линий Вистар и НИСАГ в норме и после теплового стресса. Представлены фотографии фрагментов гелей соответствующих областей расположения Н5Р70 на электрофореграммах. Фотографии верхнего ряда - профиль миокардиапьных белков крыс линии Вистар, нижнего ряда - линии НИСАГ. Фотографии 1 и 4 - белки миокарда нестрессированных крыс. 2 и 5 - структура накапливающихся ШР70 в миокарде крыс спустя 3 часа после действия теплового стресса, 3 и 6 - то же после 48 часов. Волнистой линией указано местоположение конститутивного Н5Р70 -Н5С73. Прямыми линиями - местоположение индуцибельных Н5Р70. -

Таким образом, сравнительный анализ изоформного состава быков Н5Р70, синтезируемых в миокарде крыс линий НИСАГ и Вистар, показал, что наличие

артериальной гипертензии сочетается с изменением характера индукции и механизмов экспрессии генов основного стрессового белка HSP70. У крыс НИСАГ экспрессия индуцибельных HSP70 имеет конститутивный характер, а это укачивает на то, что состояние покоя является относительным для миокарда крыс-гипертоников, вынужденного работать в условиях повышенною АД, что само по себе является стрессом. Возможно, что напряженность молекулярных систем стресса в состоянии покоя и недостаточно быстрая экспрессия HSP70 при действии дополнительных стрессоров является одной из причин низкой устойчивости сердечно-сосудистой системы и, как следствие, всего организма к повреждениям, вызываемым стрессом, в том числе температурным.

1 2 3 тпн

- - - 15

ф. 8.0

• • 4.4

** • 3.3

Рис.7. Рсзультагы Сини гибридизации ДНК крыс линий НИСАГ, Внстар и БНИ зондом в области разделения I -• 1.5 тпн.

1 - Вистар. 2 - ЗНИ, 3-НИСАГ.

Проведенный нами анализ генов, кодирующих основной стрессовый белок Н5Р70, показал наличие полиморфизма длин рестрикционных фрагменюв (ПДРФ). (рис.7). Гибридизация ливерной последовательности гена к.чр70 с геномной ДНК крысы дает следующую картину: у крыс линии Вистар обнаружены 2 фрагмента длиной 3300 и 4400 пн, в то время как у крыс линии НИСАГ в процессе селекции произошла фиксация только одного фрагмента длиной 4400 пн. Исследование ПДРФ у |ипертензивных крыс 5НЯ выявило фрагмент длиной н 3300 пн. В литературе (Нате1 е1 а1., 1У92Ь) имеются данные о спяш -лого аллсля с гипертензивным статусом крыс, в го время как аллель 4400 пн Пыл обнаружен у

крыс WKY с нормальным артериальным давлением. Обнаружение фрагмента длиной в 4400 пи у крыс НИСАГ в атом плане является неожиданным и свидетельствует о том, что неадекватность функции системы стрессовых белков у крыс НИСАГ скорее всего обусловлена не изменением структурного гена hsp70, а нарушением процессов рефляции сю экснрссии. Это можно рассматривать в качестве одного из биохимических маркеров предрасположенности к артериальной тпертопни.

Давая общую оценку полученным ранее и приведенным в данной работе материалам, прежде всего следует обратить внимание на широкий спектр изменений стресс-реактивности у крыс линии НИСАГ. Эти изменения затрагивают все уровни реагирования: от системного до клеточного. Данные факты можно рассматривать как подтверждение гипотезы о том, что в основе отмеченных изменений лежат особенности функционирования центральных механизмов регуляции стрессовой реакции у крыс линии НИСАГ. Выводы.

1. Анализ некоторых параметров эндокринной системы у крыс линии НИСАГ, при сравнении с крысами Вистар, в покое выявил следующие особенности:

а) концентрация альдостерона в плазме крови крыс-гипертоников повышена;

б) концентрация инсулина в плазме крови, напротив, понижена;

в) достоверных межпинейных различий в содержании кортикостерона не обнаружено.

2. Особенности реакции ГГНС у крыс НИСАГ во многом определяются характером

стрессора :

а) глюкокортикоидный ответ на эмоциональный стресс, связанный с иммобилизацией, понижен; 5

б) комбинированный стресс (иммобилизация + нагревание) сопровождается повышенной глюкокортикоидной реакцией;

в) при тепловом стрессе достоверных межлинейных различий в содержании кортикостерона не обнаружено.

3. У крыс линии НИСАГ введение адреналина вызывает более сильные изменения циркуляции и выраженные эндокринные реакции. Это проявляется:

а) в резком снижении артериального давления;

б) в значительном повышении уровней альдостерона, инсулина и кортикостерона.

4. Крысы линии НИСАГ более чувствительны к воздействию теплового стресса, чем крысы линии Вистар, о чем можно судить по изменению температуры тела.

5. У крыс линии НИСАГ обнаружена недостаточность индукции основного стрессового белка HSP70 в условиях инкубации лимфоцитов in vitro при температуре 43°С.

6. Сравнительный анализ изоформного состава белков HSP70, синтезируемых в миокарде крыс линий НИСАГ и Вистар, показал, что наличие артериальной

гипертензии сочетается с изменением характера индукции и механизмов экспрессии генов основного стрессового белка Н8Р70.

7. Исследование гена Лур70 не выявило связи особенностей стресс-реактивности со структурой гена Ыр70. Таким образом, неадекватность функции системы стрессовых белков у крыс НИСАГ скорее всего обусловлена нарушением процессов регуляции синтеза белка Н5Р70.

8. У крыс НИСАГ отмечается широкий спектр изменений стресс-реактивности, затрагивающий все уровни реагирования от организменного до клеточного. В основе отмеченных изменений, по-видимому, лежат особенности функционирования центральных механизмов стрессовой реакции.

9. Крысы линии НИСАГ представляют собой новую оригинальную модель артериальной гипертензии человека, открывающую возможность исследования механизма действия различных факторов среды и, что особенно важно, проведения доклинических испытаний новых антигипертензивных препаратов.

1. Петрова Г.В. Исследование функции гена теплового шока HSP70 у крыс с наследственной артериальной гипертезией (линия НИСАГ) // Актуальные проблемы кардиологии. Тезисы докл. отчета, иаучн. сессии Томского НИИ кардиологии. Томск, 1994.-Ч.З.-С. 238-239.

2. Markel A.L., Maslova L.N., Adarichev V.A., Petrova G.V., Jacobson G.S. Stress-responsiveness in hypertensive ISIAH rat strain // Clin. Experim. Pharmacol. Physiol.-1994.-Suppl.l.-S.13.

3. Петрова Г.В. Характеристика стресс-реакции у крыс с наследственно-обусловленной артериальной гипертензией (линия НИСАГ) // Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций. Материалы конф. молодых физиол. и биохим. Санкт-Петербург, 1995.-С. 149.

4. Якобсон Г.С., Антонов А.Р., Петрова Г.В., Маслова JI.H., Маркель А_П. Особенности изменения эндокринных функций у гипертензивных крыс линии НИСАГ после воздействия адреналином // Бюлл. Эксперим. Биол. Мед.-199б.-Т.122, № 5, С. 495-498.

5. Петрова Г.В., Кривенко А.А. Сравнительная оценка устойчивости крыс гипертензивной линии НИСАГ и нормотензивной линии Вистар к тепловому стрессу // В кн.: Механизмы адаптации организма. Томск, 1996.- С. 34-35.

6. Кривенко А.А., Петрова Г.В., Остапчук Я.В. Полиморфизм гена белка теплового шока у крыс с наследственной, индуцируемой стрессом артериальной гипертензией //В кн.: Механизмы адаптации организма. Томск, 1996.-С. 17-18.

7. Петрова Г.В., Адаричев А.А., Кривенко А.А., Дымшиц Г.М., Маркель АЛ., Якобсон Г.С. Содержание основного белка теплового шока HSP70 у крыс с наследственной, индуцируемой стрессом артериальной гипертензией // Бюлл. Эксперим. Биол. Мед. (принято % печати). .