Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гормональная и антиоксидантная системы при ответе растения на тепловой шок

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Веселов, Александр Павлович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О РОЛИ ГОРМОНАЛЬНОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМ В ОТВЕТЕ РАСТЕНИЯ НА ВОЗДЕЙСТВИЕ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ

1Л. Стресс, как общий неспецифичный защитный ответ и его особенности у растений.

1.2. Регуляторные функции и участие фитогормонов в реакциях стресса.

1.3. Система окислительного гомеостаза у растений, её взаимодействие с фитогормонами.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2Л. Объекты исследований и постановка опытов.

2.2. Определение содержания фитогормонов в тканях.

2.3. Анализ продуктов перекисного окисления липидов и компонентов антиоксидантной системы.

2.4. Выделение везикулярной фракции плазмалеммы и определение Н+-АТФазной активности.

2.5. Оценка уровня экспрессии гена супероксиддисмутазы.

2.6. Выделение хроматина и определение ассоциированной с ним протеинкиназной активности.

2.7. Определение активности протеиназ.

2.8. Выделение и характеристика структуры полисом.

2.9. Компьютерный анализ математической модели.

2.10. Статистическая обработка данных.

Глава 3. ОТВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА ТЕПЛОВОЙ ШОК ФИТОГОРМОНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ

3.1. Изменения в фитогормональном балансе при продолжительном тепловом шоке и в период его последействия.

3.2. Быстрые ответные реакции ИУК и АБК.

Глава 4. ФОРМИРОВАНИЕ ОТВЕТА НА ТЕПЛОВОЙ ШОК АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ

4.1. Активация перекисного окисления липидов и ответные реакции антиоксидантной системы при тепловом шоке.

4.2. Регуляторное влияние липопероксидации на активность Н - АТФазы плазмалеммы.

Глава 5. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ И АКТИВНОСТЬ АССОЦИИРОВАННЫХ С ХРОМАТИНОМ ПРОТЕИНКИНАЗ

5.1. Активация при тепловом шоке экспрессии гена супер-оксиддисмутазы и регуляторное влияние на неё ИУК.

5.2. Влияние теплового шока и фитогормонов на активность ассоциированных с хроматином протеинкиназ.

Глава 6. АКТИВНОСТЬ ПРОТЕИНАЗ И СОСТОЯНИЕ ЦИТОПЛАЗМАТИ-ЧЕСКОЙ БЕЛОКСИНТЕЗИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ В УСЛОВИЯХ ТЕПЛОВОГО ШОКА

6.1. Изменения состава и активности протеиназ.

6.2. Состояние структуры цитоплазматической белоксинтезирующей системы.

Глава 7. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ ФОРМИРОВАНИЯ ОТВЕТНЫХ РЕАКЦИЙ ФИТОГОРМОНАЛЬНОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМ ПРИ ТЕПЛОВОМ ШОКЕ РАСТЕНИЙ

7.1. Построение и анализ модели.

7.2. Сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гормональная и антиоксидантная системы при ответе растения на тепловой шок"

Актуальность проблемы. В связи с обострением экологического кризиса большое значение приобретает задача повышения устойчивости растений к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, в частности, высоких температур. Для успешного решения этой проблемы крайне важно выяснение механизмов формирования защитных ответных реакций, определение функциональной роли участвующих в них физиологических систем растения (Kimpel, Key, 1985; Пахомова, 1995). Известно, что у живых организмов под влиянием самых разнообразных неблагоприятных внешних факторов происходит интенсивное развитие окислительных процессов, для сдерживания которых необходимо быстрое и значительное увеличение антиоксидантных ресурсов клеток (Барабой, 1991; Весапа е.а., 1998; Zhou, Leul, 1999; Mac Carroñe, 2000). Это требует достаточно глубоких переключений во всем клеточном метаболизме. Вероятно, формирование такой защитной реакции у растений должно происходить при участии фитогормонов, являющихся одними из основных регуляторов жизнедеятельности у растений (Полевой, 1982; Zeevaart, Creelman, 1988; Abeles, Morgan, Salveit, 1992). В свою очередь, изменения в фитогормональной системе могут быть инициированы окислительными процессами, высокочувствительными к воздействию среды, такими как перекисное окисление липидов (Мерзляк, 1989; Kovalczyk, Bandurski, 1991). Всё это позволяет предположить, что между фитогормональной и антиоксидантной системами при развитии ответа на тепловой шок должна существовать функциональная сопряженность. К настоящему времени выполнен ряд работ, посвященных изучению изменений, происходящих в фитогормональном балансе и прооксидантно - антиоксидантном равновесии у растений при различных видах стресса (Кузнецов, 1992; Ефремов и др., 1992; Кулаева, 1994; Moons е.а., 1995; Шакирова и др., 1995; Кудоярова, 1996; Лукаткин, 1998; Е1-Епапу, 2000; Тарчевский, 2000). Однако, в большинстве экспериментов определения динамики содержания фитогормонов и активности компонентов антиоксидантной защиты проводились только при продолжительных экспозициях теплового шока, их быстрые ответные реакции на гипертермию практически не исследовались. Также недостаточно изучено протекание при тепловом шоке ряда клеточных процессов, участвующих в формировании ответа на высокотемпературное воздействие фи-тогормональной и антиоксидантной систем. Это работа транспортных АТФаз, поддерживающих общий гомеостаз клеток (Полевой, Саламатова, 1989; Michelet, Boutry, 1995; Палладина, 1999) экспрессия генов антиокси-дантных ферментов (Bowler е.а., 1989; Zhu, Scandalios, 1994; Scandalios, 1997); активность протеинкиназ, осуществляющих модификацию регуля-торных факторов генома (Селиванкина и др., 1988;Ballas.e.a., 1995; Stone, Walker, 1995); протеолитические процессы (Блехман, Шеламова, 1992) и состояние цитоплазматического белоксинтезирующего комплекса (Айтхо-жин и др., 1989; Дунаева, Бочарова, Клячко, 1993; Кузнецов, Старостенко, 1994; Аксенова и др., 1999), влияющие на эффективность генной регуляции системы антиоксидантной защиты. Наконец, является открытым вопрос о совместимости ответа растительного организма на стрессовые воздействия с принципом гомеостатирования (Веселова, Веселовский, Чер-навский, 1993). В связи с этим представляется актуальным проведение экспериментальных исследований и теоретического анализа регуляторных закономерностей формирования ответных реакций на тепловой шок систем, связанных с регуляцией и поддержанием окислительного гомеостаза клетки в условиях высокотемпературного стресса.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы состояла в определении механизмов формирования и регуляторных функций ответных реакций фитогормональной и антиоксидантной систем при тепловом шоке растений.

Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику содержания в тканях растений основных групп фитогормонов при продолжительных экспозициях теплового шока, выявить быстрые ответные реакции ИУК и АБК на гипертермию.

2. Определить изменения, происходящие при тепловом шоке в окислительном гомеостазе растений и влияние на него фитогормонов; проверить возможность регуляторного воздействия перекисного окисления ли-пидов (ПОЛ) на активность НГ-АТФазы плазмалеммы в связи с инициацией ответа фитогормональной и антиоксидантной систем на тепловой шок.

3. Исследовать влияние гипертермии и фитогормонов на экспрессию гена фермента антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазы (СОД) и активность ассоциированных с хроматином протеинкиназ.

4. Определить уровень развития при тепловом шоке протеолитиче-ских процессов и состояние цитоплазматической белоксинтезирующей системы, как факторов, определяющих возможность увеличения пула ан-тиоксидантных ферментов за счет активации их биосинтеза.

5. Разработать и исследовать математическую модель формирования ответных реакций фитогормональной и антиоксидантной систем растения на тепловой шок.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Фитогормональная и антиоксидантная системы функционируют при тепловом шоке у растений как единый авторегуляторный комплекс, обеспечивающий поддержание окислительного гомеостаза в условиях гипертермии.

• Ответ фитогормональной системы на тепловой шок включает в себя два типа реакций. Для продолжительной гипертермии характерны гормональные перестройки, создающие условия для торможения роста и жизнедеятельности растений. Быстрые ответные реакции ИУК и АБК состоят в обратимом выходе этих фитогормонов из конъюгированных форм.

• При тепловом шоке в клеточных мембранах происходит быстрая активация ПОЛ, в ответ на которую у растений формируются защитные реакции, осуществляемые при участии фитогормонов и приводящие к увеличению антиоксидантного потенциала, возвращающего ПОЛ к уровню нормы. Один из механизмов инициации ответа клетки на развитие окислительных процессов может состоять в регуляторном воздействии ПОЛ на НГ-АТФазу плазмалеммы.

• Повышение антиоксидантного потенциала растений при тепловом шоке связано с активацией экспрессии гена СОД, происходящей, по-видимому, при участии ИУК и ассоциированных с хроматином протеин-киназ. Уровень протеолитической активности и структура цитоплазмати-ческой белоксинтезирующей системы в течение первых двух часов гипертермии сохраняются близкими к пределам нормы, что делает возможным эффективное увеличение пула антиоксидантных ферментов за счет активации их биосинтеза.

• Моделью формирования ответных реакций фитогормональной и антиоксидантной систем растений на тепловой шок, может служить схема авторегуляции на основе механизма возвратного триггера.

Научная новизна. В работе впервые сформулировано представление о взаимодействии фитогормональной и антиоксидантной систем, как целостного авторегуляторного комплекса, осуществляющего формирование защитных реакций в ответ на развитие окислительных процессов при тепловом шоке у растений.

Впервые обнаружены явления быстрого колебательного "всплеска" уровня активной формы ИУК и увеличения содержания свободной АБК на ранних стадиях теплового шока растений. Выяснен механизм этих процессов, состоящий в быстром высвобождении фитогормонов из конъюгатов.

Установлено, что при тепловом шоке происходит активация ПОЛ в мембранах и повышение уровня антиоксидантной защиты.

Впервые выявлено регуляторное влияние ПОЛ на активность Н^-АТФазы плазмалеммы.

Впервые обнаружена активация экспрессии гена СОД при тепловом шоке и показана её чувствительность к регуляторному воздействию ИУК.

Впервые выявлен временный подъем при тепловом шоке ассоциированной с хроматином протеинкиназной активности.

Определена степень изменений при гипертермии у растений уровня протеолитической активности, и состояния цитоплазматической белоксин-тезирующей системы.

Разработана и проанализирована новая математическая модель, объясняющая закономерности формирования ответных реакций антиокси-дантной и фитогормональной систем растений при тепловом шоке.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты важны для понимания принципов и механизмов формирования ответных реакций теплового шока, позволяющих растению противостоять неблагоприятному воздействию повышенной температуры. Данные о механизмах участия фитогормонов и антиоксидантов в регуляции метаболизма при тепловом шоке позволяют наметить пути для поиска новых методов повышения теплоустойчивости растений. Разработанная математическая модель может быть применена для проведения компьютерных экспериментов в исследованиях развития теплового шока и его последействия у растений. Основные выводы и результаты работы используются в учебном процессе на биологическом факультете Нижегородского госуниверситета при чтении спецкурсов: "Регуляция метаболизма", "Геном растений", "Рост и развитие растений" и "Экологическая биохимия". Работа выполнялась в рамках программы НИР Минобразования России, тема: "Физиологические и биохимические механизмы устойчивости растений к воздействию температуры и химических соединений" (номер госрегистрации 01.9.80004930), поддержана грантами Минобразования России (проекты КЦФЕ 131-101-71 и 97-0-10.0-163) и МЦПФИН (проект 99-4-03).

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Всесоюзной конференции "Геном растений" (Черновцы, 1983), 16-м конгрессе FEBS (Москва, 1984), конгрессе по проблемам физиологии и биохимии растений (Кишинев, 1994), II съезде Общества физиологов растений республики Беларусь (Минск, 1995), Int. Symp. on Stress and Inorganic Nitrogen Assimilation & the 2nd FOHS Biostress Symp. (Москва, 1996), Int. Conf. on Problems of Plant Growth and Development (Vilnius, 1997), 2-м съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), 3-м симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997), IV симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1997), конференции, посвященной 130-летию кафедры физиологии и биохимии растений СпбГУ (С. Петербург, 1998), V конференции "Биоантиок-сидант" (Москва, 1998), 4-й, 5-й и 6-й Международных конференциях "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1997, 1999, 2001), III и IV съездах Общества физиологов растений России (С. Петербург, 1993, Москва, 1999), 3-й конференции "Иммуноанализ регуляторов роста в решении проблем физиологии растений, растениеводства и биотехнологии" (Уфа, 2000), выездной сессии ОФР РАН по проблемам биоэлектрогенеза и адаптации у растений (Н. Новгород, 2000), 3-м съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001), Международной конференции "Актуальные вопросы экологической физиологии растений в 21 веке" (Сыктывкар, 2001).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (шесть глав), заключения, выводов и списка литературы (473 работ, в том числе 253 иностранных). Работа изложена на 255 страницах, содержит 51 рисунок и 6 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Веселов, Александр Павлович

ВЫВОДЫ

1. Реакции фитогормональной и антиокеидантной систем растений при тепловом шоке, формируются в ответ на активацию под влиянием гипертермии опасных для растительных клеток процессов, таких как ПОЛ, и направлены на поддержание клеточного гомеостаза, в частности, проокси-дантно-антиоксидантного равновесия, в условиях неблагоприятного воздействия среды.

2. При продолжительном тепловом шоке перестройки в фитогормо-нальном балансе состоят в уменьшении содержания ИУК, зеатина, продукции этилена и накоплении АБК. Однако, направленность происходящих изменений на разных стадиях развития ответной реакции может быть различной. Снижению уровня ИУК и зеатина в тканях обычно предшествует некоторое повышение концентрации этих фитогормонов, особенно значительное для ауксина, что может иметь сигнальное или регуляторное значение в механизмах ответа растения на тепловой шок. При коротких экспозициях воздействия повышенной температуры у растений происходит колебательный "всплеск" содержания свободной ИУК в тканях и начинается накопление АБК. Колебательное увеличения концентрации активной ИУК, вероятно, является одной из первичных реакций теплового шока, связанной с запуском защитных механизмов и индукцией синтеза АБК. Регуляторные функции АБК, по-видимому, проявляются на последующих стадиях теплового шока. Основной механизм быстрого повышения содержания активных форм ИУК и АБК при тепловом шоке состоит в высвобождении их из конъюгатов. Этот процесс играет более существенную роль в регуляции уровня активной ИУК по сравнению с АБК.

3. Под влиянием воздействия высокой температуры в мембранах растений происходит быстрое увеличение интенсивности ПОЛ, сопровождающееся активацией антиоксидантной системы. Повышение уровня АО-защиты, в свою очередь, приводит к подавлению процессов липоперокси-дации, восстановлению нарушенного прооксидантно - антиоксидантного равновесия. Активность в тканях одного из антиоксидантных ферментов -СОД увеличивается под влиянием экзогенной ИУК и это свидетельствует о возможном участии данного фитогормона в регуляции уровня СОД у растений. Повышение уровня ПОЛ в плазмалемме при тепловом шоке оказывает регуляторное воздействие на активность ее Н^АТФазы, что может служить одним из механизмов инициации ответа растений, том числе, фи-тогормональной и антиоксидантной систем, на гипертермию.

4. В условиях теплового шока у растений усиливается экспрессия гена СОД. Экзогенная ИУК не стимулирует экспрессию этого гена при обычной температуре, но ускоряет его активацию под влиянием гипертермии. Это свидетельствует о генетически детерминированном механизме повышения уровня СОД у растений при тепловом шоке и подтверждает предположение об участии ИУК в регуляции этого процесса. Воздействие на растение повышенной температуры вызывает быстрое временное повышение уровня ассоциированной с хроматином протеинкиназной активности. Аналогичным образом ассоциированные с хроматином протеинкиназы активируются фитогормонами, причем наиболее сильный стимулирующий эффект оказывает ИУК. Полученные результаты указывают на возможность функционирования протеинкиназо - зависимых механизмов фитогормональной регуляции переключений в геноме, связанных с активацией экспрессии генов антиоксидантных ферментов (СОД) в условиях теплового шока.

5. При тепловом шоке у растений изменяется соотношение активности тиоловых и металлопротеиназ; в цитоплазматическом белоксинтези-рующем аппарате увеличивается доля моносом в полисомных комплексах. Тем не менее, изменения протеолитической активности и структуры цито-плазаматического белоксинтезирующего аппарата в течение достаточно продолжительного времени гипертермии (2 часа) не выходят за пределы физиологической нормы. Это делает возможным эффективное увеличение уровня антиоксидантной защиты при тепловом шоке за счет активации биосинтеза антиоксидантных ферментов.

6. Формирование ответных реакций фитогормональной и антиоксидантной систем растений на тепловой шок осуществляется по принципу авторегуляции на основе механизма возвратного триггерного переключателя. В неблагоприятных условиях среды, способствующих развитию окислительных процессов, происходит быстрая активация синтеза компонентов антиоксидантной защиты, возможно, за счет отключения некоторых других биосинтетических процессов; после прекращения влияния стрессирующего фактора клеточный метаболизм автоматически возвращается в обычный режим. Сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными показало хорошее соответствие предсказаний модели с наблюдавшейся в опытах динамикой развития ответа фитогормональной и антиоксидантной систем на тепловой шок. Это свидетельствует о правомерности положенных в основу модели предположений относительно характера взаимодействия и функций исследовавшихся систем в ответных реакциях теплового шока у растений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая полученные результаты, можно заключить, что ответ фито-гормональной и антиокеидантной систем на тепловой шок представляет собой комплекс взаимосвязанных реакций, в результате которых сдерживается развитие опасных для клеток окислительных процессов. Под влиянием гипертермии происходит быстрое повышение уровня ПОЛ в мембранах, что активирует Н^-АТФазу плазмалеммы и сопровождается высвобождением активной ИУК из конъюгатов. Ауксиновый "всплеск" оказывает, по-видимому, при участии протеинкиназ, регуляторное воздействие на геном и, в частности, стимулирует экспрессию гена СОД. Это приводит к усилению антиокеидантной защиты, и способствует нормализации состояния окислительного гомеостаза клеток. Математическое моделирование показало, что закономерности формирования ответных реакций фитогор-мональной и антиокеидантной систем растения на тепловой шок соответствуют принципам работы авторегуляторного механизма на основе возвратного триггера.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Веселов, Александр Павлович, Нижний Новгород

1. Аверьянов A.A. Активные формы кислорода и иммунитет растений // Усп. совр. биол. 1991. - Т. 111. - Вып. 5. - С. 722-734

2. Аверьянов A.A., Лапикова В.П., Николаев О.Н., Степанов А.И. Зависящая от активированного кислорода защита риса от пирикуляриоза с помощью рибофлавина и розеофлавина // Биохимия. 2000. - Т. 65. - Вып. 11. - С. 1530-1537.

3. Александров В .Я., Денько Е.И., Ломагин А.Г. Изменения во времени теплоустойчивости фототаксиса хлоропластов и движения цитоплазмы в растительных клетках после теплового шока // Физиол. раст. -1990. Т. 37. - Вып.1. - С. 133 -141.

4. Алесенко А. В., Пальмина Н. П. Роль липидов в функциональной активности и биосинтезе ДНК в нормальных и опухолевых клетках // В кн.: Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии / Под ред. А. И. Журавлева. М.: Наука, 1982. - С. 84-89.

5. Андреев И. М. Роль механических свойств мембран в динамике поведения мембранных систем в растительных клетках // Физиол. раст. 1993. - Т. 40, № 3. - С. 475-484.

6. Арапова Г.С., Еремин А.Н., Метелица Д.И. Роль апобелка в каталитической пероксидазной функции ферритина // Биохимия. 1997. - Т. 62.-Вып. 12.-С. 1655-1665.

7. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. М.: Наука, 1975. - 328 с.

8. Аршавский И.А. Физиологические механизмы и закономерности индивидуального развития. М.: Наука, 1982. - 269 с.

9. Барабой В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов // Усп. совр. биол. 1991. - Т. 111. - Вып. 6. - С. 923-931.

10. Блехман Г.И., Шеламова H.A. Синтез и распад макромолекул в условиях стресса // Усп. совр. биол. 1992. - Т. 112. - Вып.2.- С. 281-294.

11. Блехман Г.И., Шеламова H.A. Синтез и распад макромолекул в условиях стресса // Усп. совр. биол. 1992 . - Т. 112 , № 2 . - С. 281-297.

12. Болдырев A.A. Определение неорганического фосфата // Транспортные аденозинтрифосфатазы. Современные методы исследования / Под ред. А.А.Болдырева. -М.: Изд-во МГУ, 1977. С. 179-181.

13. Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. Л.: Наука, 1987. - 230 с.

14. Бурлакова Е. Б., Архипова Г. В., Голощапов А. Н., Молочкина Е. М., Хохлов А. Г. Мембранные липиды как переносчики информации // Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии / Под ред. А. И. Журавлева. М.: Наука, 1982. - С. 74-83.8.