Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Белки теплового шока Arabidopsis thaliana

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Белки теплового шока Arabidopsis thaliana"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО 31ШМПГ ИНСТИТУТ ®ШОЛОГШ РАСТЕНИИ пм.К.А.ШИРЯЗЕВА

IIa правах рухсошса

КЛЮЕВА Наталия Ерьовна

БЕШ1 ТЕПЛОВОГО ШОШ. AIUBUJOTSIS THALIAITA (03.00.12 - фкшологпя растений)

Автореферат дяссортащш но сопскшшэ ученой стопени кандидата биологических паук

Москва - 1992

Работа вшюлнвна в Ордена Трудового Красного Зшдзш Институте фззкологии растений ип К.А.Тшдарязева РАН

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор О.Н.Кулаова

Сфпциашшэ ошюнэнты - академик Бштехнологпче отсой Акадешз

доктор биологических наук Ц.в.Шзшиши

доктор биологических наук Н.А.Гупплавсжая

Ведущее учревденнэ - Ыосковскей ГооударотвенныЯ Ишгверситет

ш. 13.В.Ломоносова, биологической факультет.

Защита состоится " ¿Г " ишя 1982 г. в " /3 " часов на заседании Специализированного совета по присугдениэ ученой степени кандидата биологических наук К.002.46.01 при Кнотитуто физиологии растений ш. К.¿.Тимирязева РАН во адресу: Москва, 127276, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией шшо ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений ш К.А.Тимирязева РАН.

• Автореферат разослан *И>" ^ ^^ 1992 г.

Ученый секретарь Опециалиаированного совета канд. бкол. наук

Л.И.Сергеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.В на о толще о время уделяется много внимания проблеме реакции растений на стрессовые условия среда и, в частности, тепловой шох.В начале 1980-шс годов было показано, что в ответ на повышение температуры окружащей среда в растениях активируется или индуцируется экспрессия набора генов, результатом чего является синтез нового класса белков- белков теплового шока(БТШ)(Вашей е^ а1, 1980).

Феномен ответа на тепловой шок, вклтапцнй активацип или индукции гонов ВТШ, накопление шоковых мРНК, изменение трансляционной спещфгпюстп полисом и синтез набора белков теплового шока интансг"чо изучается в последние года (Войшков к др., 1986, Нешапп в* а1, 19аэ, БоЫоа1пбвг, 1990). Высокая консервативность основных БТШ у растений, енвотшх и ипфоорганизмов (воы.оа1пзег, 1990), а такко пшсаплизапциеся данные о роли, выполняемой ими во время теплового шока в клетках, ведут к заключению о большой физиологической значимости их синтеза для поддержания жизнедеятельности организмов в условиях экстремально высоких тешератур среды п восстановления функций после сшшэпия температуры. Очевидно, нсследова-./э этого явления особенно ваяно для растений в связи с задачами растениеводства. Шесте с тем изучение БТШ растений существенно отстает от исследований в этой .области на микроорганизмах п шзогннх.

Изучение локализации БТШ в мотках растений в связи с их вероятными функциями привело к представлению об обратимой ассоциации некоторых БТШ при повышении температуры о рядом органелл клеток (Ооорог & Но, 1987, Напв11о14 й Кэу, 1933, Шшз11а11 0t а1, 1990), О такса о включении нх в состав так называемых "гранул теплового шока" -специфических структур, форшрущихся в цитоплазме растительных клеток в ответ на тепловой шок (Кешшт вг а1, 1984, Хохлова и др, 1937). По-видимому, изучение организации и локализации БТШ, а та:ске их взаимодействия с другими компонентами клеток чрезвычайно панно для выяснения их ролл в клетках.

При анализа экспрессии БТШ в клетках растений особенный интерес представляют виды, удобные для работы в генетическом отношении, что позволяет изучать организагга и регуляции генов БТШ. К таким растениям относится вид АгаЬ1(Ьрв1в ЪЬаНапа (Ь.) НоупЬ ИЗ семайотва крестоцветных, обладаиций малым размером, генома и быстрой сменой поколений. Преимуществом этого растения является такае возмонность изучения разнообразных мутантов, в том числе по генам, изменявшим

гормональный статус растений (Pruitt & Meyerowitz, 1986). Изучение ответа на тепловой шок A.thallana монет иметь особую актуальность для получения стресс-резистентных генотипов растений и дальнейшей генно-инженерной г^ооты.

Целью нашей работы была качественная и количественная характеристика системы експрессии белков теплового шока у ArabidopBie thaliana и разработка подходов к анализу состояния белков теплового шока в клетках, что является необходимым этапом при выяснении их функциональной роли. В_зааачу_работы входило:

1) Исследовать условия и закономерности синтеза БТШ в листьях ArabidopeiB thaliana.

2) Провести сравнительное изучение системы синтеза БТШ у растений дгаого типа и у нечувствительного к этилену мутанта eti5.

3) Выяснить участие различных уровней регуляции в экспрессии БТШ.

4) Провести анализ БТШ листьев A.thallana в неденатурируицих условиях и охарактеризовать полипе птидный состав белковых комплексов.

Научная новизна и практическая значимость работа.

Охарактеризован синтез БТШ в клетках корней и листьев Arabidopeio thaliana в шибком диапазоне температур п продолжительности их действия и дана его количественная оценка. Обнаружена зависимость продолжительности синтеза БТШ от величины действующей температуры. Это позволяет сделать заключение о значении накопления БТШ в клетках для определения дозы температурного воздействия и величины физиологического ответа на него, что важно для жизнедеятельности клеток в период стресса, а такие при восстановлении. Эти данные позволяют создать модельную систему оценки интенсивности температурного воздействия на растителыша ткани, которая мохгэт иметь практическое значение.

Получена сравнительная характеристика ответа ва тепловой шок нормальных растений A.thallana и мутанта eti5, нечувствительного к действию этилена. Показано, что отоутотвий чувотвительнооти к втнлвну приводит к снижению термоустойчивости мутантных растений. Вместе с тем TI6 обнаружено различий в наборе и динамике синтеза БТШ мевду нормальными и мутантными растениями, что позволяет заключить, что этилен не принимает участия в передаче температурного сигнала на синтез БТШ. Полученные результаты вносят вклад в развитие теоретических представлений о роли фитогормовов в реакции растений на стресс.

С использованием шгибиторного анализа показано, что в регуляции синтеза БТШ принимают участие различные уровни экспрессии гег -а: низкомолекулярные КПЗ синтезируются за счет индукции активности их генов , т.е. на уровне транскрипции, тогда как в регуляции синтеза высокомолекулярных БТШ принимают участив как транскрипционный, так и трансляционный уровни контроля.

Проведено выделение и фракционирование водорастворимых белков А,ШаНапа методом, позволяющим анализировать высокомолекулярные белковые комплексы в неденатурироввнном состоянии. Впервые показано, что БТШ в клетках при тепловом шоке присутствуют в составе высокомолекулярных белковых комплексов. Наиболее представленный в количественном отношении в листьях АЛ11а11ала при тепловом шоче комплекс с молекулярной массой порядка 700 кД содержит белы, относящиеся к семейству БТШ 70.

Полученные рг 'льтагы имеют значение для разработки теоретических основ устойчивости растений к неблагоприятным температурным условиям среда. Проведенные исследования динамики синтеза БТШ в клетках являются перспективными с точки зрения развития новых методов оценки растительного материала на устойчивость к действию высоких температур. Апробация работа. Результаты работы дожжены на И Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной метки (Петрозаводск,1988), конкурсе работ молодых ученых ШР АН СССР (1990), И Европейском Конгрессе по биологии клетки (Флоренция, Италия, 1990). Публикации. По теыэ диссертации опубликовано 8 печатных работ. Структура и обьем диссертации.' Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, нзлокения полученных результатов и их обсуадения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа излокена на страницах машинописного текста, содеркит ' таблицы, рисунков. Список цитируемой литературы вклшает наименований, из которых

на английском языке.

ОБЪЕКТ И МЕТОЛУ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования и постановка опытов.В опытах использовали растения АгаЬ1(1ор01я «шИапа (Ь. ЖеупЪ. расы ЕпМге1т, которые выращивали на ага-рпзованной (0,6 % агара) среде Кноппа при 23°С,длительности овэтового дня 16 часов, освещенности Р000 лк. Взрослые растения в стадии бутонизации получали через 3-4 недели после посадка. Такие использовали мутант ьи5, полученный от проф. М.Холла (Великобритания), который отличается от дикого типа отсутствием чувствительности к этилену.

- б -

НАВЕСКА ЛИСТЬЕВ

ГШОГШТ

Состав буфера -

0,065 М трис-HCl pH 6,8, О,Б Ж 2-меркаптоэтанол, 16% глицерин г% ддс

Супернатант 12000 g

^—мвтанол:1лорофоры(1:1)

Белковая фракция

—ацетон (60 X)

Осадок белков

-растворение в буфер© 100°С Б мин

Очищенная белковая фракция

ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях

Состав буфера -

0,065 U трис-HOl pH 6,8, 0,Б * 2-ыеркаптоэтанод, *I5S глицерин

Супэрнатант 12000 q

ПААГ - бЛ91строфорэз в нэденатурлрувдих условиях

Рис. I. Схема водаленил в анализа балков us листьев A. thai lana в денатурирувднх условиях (А) ив условиях, сохранявших нативние белкоше кошлексы (5).

Анализ, полулоптвдного спектра белков. 5-7 изолированных роаэточнш листьев инкубировали прп различных температурах в течение 2-8 часов. С сштезе белка судили по включению в него in vtvo -^в-иагпошна г последние 1-2 часа опыта. Белок выделяли по (Key, 1981) с моди$икацияю1 (см. рис.1 А). Для определения количества Э5В-кэтюнина, поступившего в листья за время инкубации, аа бумажные ф&льтры наносил! по 3 мкл гомогената и просчитывали радиоактивность в голуольно?. сцинтилляторв.

Одномерный влектрофорез проводили в градиенте концентраций ПААГ пс Лэшгаа (Laenmll,- 1970). Гели окрашивали Кумасси 0-250 и обрабатывал! по (Bonner & laskey, 1974). Высушенные гели экспонировали с пленко!

HI-D при -70°, флюорограммы сканировали на денситометре "Docaga". Двумерный электрофорез проводили по (O'íarrel, 1978). Белки разделяли в первом направлении при +4°С (6800 v4). Электрофорез во втором направлении, окраску и процвссирование гелей производили как длл одномерного электрофореза.

Анастз .белков в пативном состоянии. I г листьев инкубировали при различит тешгаратурах в течение 2-8 ч, в последние 2 ч в присутствии ^s-мзгионша. Схема выделения белка приведена на рис.1 Б. Одномерный электрофорез проводили в отсутствие ДДС в течение 18 ч при +4°С.

Содержание белка определяли по (Esen, 1978), радиоактивность белковых фракций - по (Wans & Novalli, 1960).

Электрошрвнос и щмуноблоттшг белков. Белки переносили полусухи* методом в приборе líultifor II Uovablot на нитроцеллшозную мембрану(0,2--0.4 ш)в трис-глициновон буфере (39 мМ глицин,46 мМ трис,20 % метанол 0,0376 % ДЦС) в течение 1,5 ч при плотности тока 0,8 'мА/см". Белки окрашивали Ponoeau S по (Salinovioh ta Montolaro, 19S6). Иммуноблоттпнг С антителами против БТШ 70 из суспензионной культуры клеток томата, про-доставленника пш проф. К-Д.НЬ2мапнон (Германия), проводили в буфере Трнс-HOl, pH 7,4 с 140 tóJ NaCl и 0,1 % Гвин-20. В качестве вторичных антител использовали, ¡леченный пероксидазой Protein G. Субстратом пороксидазной реакции для проявления комплекса Protein G - антитело -БТШ 70 была nopoicicb водорода, а хромогэном - хлоронвфтол.

• РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЗДЕНИЕ

Общая_характеристика 'экспрессии БТШ у ArabidopolB thaliana.

Тешэратурная зависимость синтеза белка и экспрессии БТШ в листьях А. thaliana принципиально сходна с известными для других растений (Войт-ков H др., IS8S, Хохлова п др., 1987, КапаЪш at al, 1934, Kimpel й Key , 1965). lía рис.I приведена флюорограмма. белков из листьев A.thaliana после их разделения в ПААГ-элвктрофорезэ. Листья инкубировали I ч при 23 или 37°С в присутствии 3°з-ыетионша. Тепловой шок приводит it резкому изменению спектра синтезпруешх полипоптпдов. К груше высокомолекулярных (ЕШ1) БТШ относятся балка с мол. массами 140,96,91,85,80, 72-74 кД, а к группе низкомолекулярннх (1Ш) БТШ - 22-20,19-18 кД. Синтез ШШ БТШ составляет 33,Б%, а ШИ БТШ - 16,4S от общего синтеза бежа в клэтках в изученных условиях. Но характеру индукции тепловш шоком была выделены нндуцнб^льшо БТШ (18-19, 20-22, 96, 140 кД), ко-которне нэ выявлялись при нормальной температуре, и конститутивные БТШ (72-74,80„85,91 :<<£), osares которых (или их аналогов) происходил upa нормально;! тешэратурэ с но усиливался гешшны шохсн.

Рис. I СЬяюорограмиа меченых аов -метионином белков листьов А.ШаИапч после ИХ инкубации в течение I ч при 23°С (I) и

и 37 С (2). Градиент ШГ 7 - 202. Пробы выравнены по радиоактивности ( 20000 иш). Справа приведены молекулярные массы ЕТШ, слава - маркеров.

кД

Г Г

Ьо»

К

к

А

О

-X

94

67

43

30

20,1 Н,4

5

г*, : - *—140

Ы 85

«»1 «г^ '^80 «¡«а.« 72-74 64

% г

/

• -

о • " «—

,22 1-20 *С1

Рпо. 2. флюорограммы двумерного ПААГ- влектрофорева белков ив листьев АгаЫЛорв1а НшПапа после инкубации в течение I ч при 23°С(А) н 37°С(Б) в присутствии ао8- мэтионнна (100 ыкКи/ш1). Изоэлэктрофокусирование по (0'Раггв1, 1978) в градиенте рН З.Б-Ю. ДДС-ПААГ-элэктрофорез во втором направлении как на рио.1. Черными стрелками показаны изоформы БТШ, индуцируемые тепловым шоком, белыми - изоформы, синтез которых усиливается при тепловом июне. Пробы выравнены по белку (200 мкг). Справа приведены молекулярные массы белков теплового ьока, слева -маркеров.

Олворограшы двумерного ПААГ-электрофорпза этих еэ белков приведены па рас. 2. Груша ИИ БТШ фокусируется в виде 8 пятон, значите -мю различающихся по заряду. БТШ 72-74 п 85 кД представлены несколькими пзофорташ в виде полос, растянутых в направлении изофокусирования. Зависимость доза-эффект в спнтозе БТШ. Интенсивность синтеза БТШ в листьях А. 1;11а11апа зависела кок от величины температуры, так и от продолкительностп оо действия. В интервале 34 - 37°С синтез полного спектра БТШ продолжался том дольпо, чем Ешае была температура: при 34°С - в точение I ч, при 37°С - до 12 часов нагревания (рис.3). Прекращение синтеза БТШ после I часа нагрева при 34°С сопровождалось синтезом полппептидов, блпзготх по мол. массам к полппептидам, синтезируемом при 23°0. Это позволяет предполагать, что синтез БТШ при 34°0 в течение I часа достаточен для адаптивных перестроек в метках. 151 не обнаружили прэкрацвшя синтеза БТШ в тачание 12 часов нагревания при 37°С. Ио-вчдш;ому, адаптация к нагреву "листьев АЛЬяНопа, вырагащаяся в прекращения синтеза БТШ я восстановлении синтеза белков, по спектру полэкуляртшх масс сходного с порлальпы?.!, происходит прз 34°С, по но при 37°0. Нш нродставляотся, что обпаругонная закономерность даот в ругат исслодоватолш хорошую иодель для изучения адаптшашх пзростроок. гслоток в разлпчшх условиях нагревания.

а и

м о

ПАЯ

40

30

20

10

т

\

J_и

4

врет,

б

часа

ю

Рпс.З. Интенсивность синтеза фршсцип белков теплового шока в листьях АгаЬ1(1орв1в thaIiana при 34(1) и 37°0(2) в зашсймости от времени нагревания, п последний чао инкубации листьев добавляли ааВ- метюшпн (40 мкКи/мл) > Количественная оценка интенсивности синтеза БТШ была проведена денситомэтрировашем флоорограмм Овлков после их разделения в ДДС-ПААГ-элокгрофэрезе.

Опыта с импульсной меткой белков в течение I ч при 37°0 с последующим переносом листьев на 7 ч в условия 23 шш 37°С но обнаружили существенных изменений в радиоактивности БТШ за исследуемый период. Несмотря на многократные промывки листьев, ыы нэ мокем исключить того, что некоторое количество меченого ыетпонина сохраняется в клетках и продолжает включаться в белок. Вместе с тем известно, что матрицы БТШ нестабильны при нормальной температура (Nover et al, 1984, Kimpal & Key, 1985), поэтому сохранение высокой радиоактивности БТШ при 23°С нельзя объяснить продолкащимся синтезом и следует признать их стабильность.

Это позволяет ожидать существенное накопление БТШ в клетках листьев i.thailana при 37°С, когда синтез отшс белков продолжается с высокой интенсивностью в течение 12 часов опыта и значительно меньшее их накопление при 34°С, когда их синтез продолжается в течение I часа. Это делает вероятным представление о том, что чем больше "температурная нагрузка" на клетки, которая складывается из величины и длительности действия температуры, тем большее количество БТШ должно синтезироваться. В связи с данными о функционировании белков семейства БТШ 70 в клетках как "шаперонов", контактирувдих со многими полипептидами клеток и влиящих на их ковформацшо, чрезвычайно интересно предложение рассматривать белки семейства БТШ 70 как клеточный термометр (Craig t, Оговв, 1991). В втом'случае истощение пула свободных БТШ 70 при тепловом шоке за счет увеличения их связывания о другими белками ШЕет быть причиной авторегуляторногс механизма контроля их синтеза.

Ответ на тепловой .шок.мутанта Arabidopale thailana eti5. Как известно, в ответе растений на стресс большую роль играют фотогормони. В частности, известно, что существенную роль в ответах растений на экстремальные воздействия играет этилен. В связи с этим представлялось интересным изучить реакцию на тепловой сок мутвпта A. thai lana, лишенного чувствительности к этилену, которые были любезно предоставлены нам профессором М. Холлом (Prof. u.Hall, Абэриствио, Великобритания). Поскольку в качестве критерия повреждаемости растений неблагоприятными внешними воздействиями часто используется величина вкхода электролитов из клеток, в начале работы мы использовали этот подход для анализе термочувствительности мутанта eti5 в сравнении с диким типом. В предварительных опытах было показано, что листья контрольных растений теряют 60% электролитов при температуре 46°С за I час. Эту температуру мы выбрали для сравнения выхода апктрочитов из

тлстьбв контрольных растений л цутаята oti5. Полученные данные показывают, что по выбранному критерии мутант sti5 значительно менее устойчив к действии теплового шока, чем растения дгкого типа (табл.1).

Таблица X. Выход олектролитов из листьев ArabidopsiB thaliana дикого типа л мутанта et!5 при нагревании в течение I ч при 46°С.

Тип растения Выход электролитов в среду, % от полного выхода

Дикий тип 15,36 -1,33

oti5 43,63 - 2,42

Примечание. Приведено среднее значение п стандартное отклонение

На уровне активности белок-сннтезирущей снстеш, а такта наборч синтезируемых БТШ п температурной зависимости пх синтеза мутант не отличался от дикого типа. Это позволяет заключить, что этилен на участвует в системе передачи температурного сигнала па синтез БТШ. Еместо с тем очевидно, этилен-зависимые процессы необходимы на последугщих этапах проявления тер*орезистентностп растений п это ставит эадачу изучения этих процессов.

Гакшл образом повыпенная тергорезистентность дикого типа растевпЗ A.thaliana по сравнению с мутантом eti5 проявляется не на уровне синтеза белков теплового шока, а на иных уровнях, которые включает в себя устойчивость мембран и нувдаются в дальнейшем изучении. Влияние ингибиторов синтеза РНК и белка на синтез белка при тепловом шоке в листьях ArabtdopstB thaliana. Особый интерес представляет вопрос о том, на каких уровнях осуществляется регуляция включения синтеза БТШ при тепловом шоке. Как правило, для этого используются методы оценки количества патриц в клетках (нозврн-гибрвдизвция) п способности клеток к их трансляции (сравнение трансляции in vivo и tit vitro (Eanzynaki et nl, 1983, Kinpol & Key, 1990). Другим ВОЗМОЖНЫМ подходом является ингибиторный анализ. Флюорограмма белков из листьев Arabidcpeis, инкубированных при 23 и 37°С в течение 2 ч в присутствии ингибиторов транскрипции - о£-аманитина и кордицепина (рис.4), покаЕЫвает, что, не оказывая воздействия на синтоз белков при 23°С, кордиценин и ct-аманитин сникают синтез отдельных БТШ. Действующие концентрации о<.-аманитина (ЮОмкг/мл) и кордицепина (200 мкг/мл) быт подобраны в предварительных опытах. Под действием ингибиторов синтеза

u; f

•ь!» f * —♦

Sr»•■ и

- 140

!i ! • /9б

"»"M" : *s Y2

H !?

ti t , f-e = ^ - - -22

" " ¿20 :—i 9

'43 30

ti'í. • íií/ «3-Й ~ , _ _

20.i 1 . • fe!:; *! ríl

u r «16 I

14.4 • v «a "

i .1 2, $5 5

Рпс.4. Влияние cí-амашгша и кордицешша па синтез балка в листьях A.thaliana при тепловой иона. Листья шкубпровалп пря 23°С(1-3) и 37°С (4-6) на вода (1,4) п растворах сС-аьшнитина (100 шсг/мл)(2,Б),и кордицешша (200 шсгДш) (3,6) в течение 2 ч в присутствии ■ эвв-«8тпонина (40 мкКи/мл). Правздеиа флзосрограша бзлков после электрофореза в ПААГ, градиент. 7-20 ¡G. На треки нашсено ю 40000 шаг. Слева приведены молекулярные массы маркерных белков, справа - белков теплового шока в кД.

РНК синтез НШ БТШ прекращался пракгнчеаси полностью, что говорит об индукции их синтеза у АЛЬяНапа на транскрипционном уровне п хорошо согласуется с данными, полученными на многих других объектах. Среда. ВШ БТШ были белки, синтез которых не изменялся (91 кД). подавлялся (86,72-74 кД), а также усиливался под действием -шанитша п кордицепина (80, 64 кД). Это подчеркивает различный вклад транскрипции в регуляцию синтеза отдельных БТШ. Вопрос об усилении синтеза отдельных БТШ под действием ингибиторов транскрипции требует специального изучения. Такая ситуация возможна, когда ингибиторы подавляют синтез матриц Оэлков, препятствующих частичному протеолизу более высокомолекулярных БТШ или сами активируют их распад.

Цаклогокснвдц (10 шсгЛал) - ингибитор трансляции па 80 в-рпбосомах сильно угпотал сиптез всех белков как прл нормальной температуре, Tait so как п сиптез БТШ при 37°С. Это говорят о том, что у A.t.iallana, кал п у шогпх других объектов, синтез БТШ происходит в цитоплазматическом ксдаартменте. В соответствии с этим хлоромфенпкол (ЮОшаУмл) пэ оказывал заметного действия на спектр сшгезируешх прп тепловом шока БТШ, но сингал синтез большой субъедлшщц РБФК. Ш обнарупшш активацию под действием хлорамфенякола синтеза БТШ 72-74, что могат быть слэдствпем дополнительного стрессового эффекта хлоре?,фзншсола, указания на который есть и в литература (líovor ot al, 1984). Нативныо высокомолекулярные ВТШ-содеряащие комплексы ArabidopnlB thallana. Анализ полшептидного состава фракции БТШ при тепловом шоке разной длительности и интенсивности является общепринятым катодом изучения влияния гипертершш на экспрессию гено?:а растений п других организмов. Позволяя изучать изменения спектра вновь спнтозируеша полшептидов, он но дает представления о реальном состоянии п локализации БТШ в мопсах. Моаду том дашше подобного рода чрезвычайно вазш для выяснения мохашз?.:ов функционирования БТШ in vivo.

Известно, что прл тепловом шояэ БТШ обнаруживаются в различных ко'шартшнтах клеток - ядро, шиюхопдриях, хлоропластах, - п прп спшлвнш! температуры диссоциируют л равноыэрно распределяется и цитоплазма (líovor ot al, 1S84, Hanofiold & Key, 1988, Earshall ot al, 1990). Предполагается, что прп высокой температуре БТШ п гомологичные пм белки выполняет в органэллах фушщпп "патронов", подцерзпвяя копформацпв различных балков. Более того, >шогпмп работаш показало образование прп тепловом поко в цитоплазма растительных клеток спецпфзческих структур - гранул теплового иока, вклшащпх в себя БТШ (líovor et al, 1983, Iíoumam ot al, 1984, Хохлова П др., IS87, líovor ot al., 1989), фупкцш которых, вероятно, зшигочаатся в сохраненпп не транслируема во время теплового пока uPHH (líovor ot al, 1989). Поэтому большой ппторос, па нал взгляд, вызывает анализ балков теплового пока в состоянии, наиболее близкой к пх состоянию in vivo. В связи о этим ш попользовали метода выделения п анализа белков па листьов Arabidopolo thal lana d педонатурирущих условиях. Для фракционирования в ПААГ на основании предварительных опытов был выбран градиент ПААГ Б-2Б», позволяющий получать оптимальное разделение белков о молекулярными массами выше 100 кД (рис.5).

Анализ в недвнатурирулцих условиях меченых продуктов белкового синтеза листьев A.thaliana в условиях теплового шока выявил

- н -

Рис. Б.

©лшрограша меченых звб-мотеониеои шсокошлекулярншс белков ез листьев Arabidopoio thaliisna, епнтоаированшх. оа 2ч (1,3) п 8ч (2,4) инкубации листьов при 23 (1,2) и 37°С (3,4) в присутствии Э0Б- метшнина (100 ыкКи/ил). Бол1Ш разделены в недэ-иатурирупцих условиях, градиент 1ШГ 6-25S, на треки нанесено по 50 икг Солка. Справа указаны молекулярные масса БТШ, олова - маркеров.

существенное отличие от тех типичных картин разделения БТШ, которые наблюдаются при пх анализе в денатурируема: условиях (ср. рис. I и Б). Бтп различия нозеоляш ааклнчнть, что в клатках пешшептада БТШ содержатся главным образом в состава белковых комплексов с шлекулярными массами от 100 до 800 кд.

Сравнение белковых спектров после ишеубопдн лиотьев в течение 2 и 8 ч при 37°С (рис. Б) показывает, что набор меченых высокомолекулярных комплексов изменяется о течением времени нагревания, причем после 8 часов нагревания метка активно включается в большое число высокомолекулярных белковых комплексов. Среда них хорошо вырагон высокомолекулярный комплекс о ориентировочной мол.массой 700 кД. Включение матки в состав етого белкового кошлэкса происходит при 23°С, значительно усиливается после 2 ч нагревания при 37°С и наиболее интенсивно происходит шало 8 ч теплового пока. Существенно, что 3°Б-мэ тионин активно включался в состав этого комплекса не только в листьях, но и в корнях A.thaliana. В связи о этим возникла необходимость выяснить, какие ез известных БТШ входят в его состав. Схема его выделения и результате анализа приведены на рис. 6, Первоначально было проведено двумерное фракционирование ®°в-меченых белков супернатанта 12000 g нз листьев к. thalaina, инкубированных в течение 8 ч при 37°С. В первом направлении «елки разделяли в неденатурирующих условиях, во втором - бэлки трека, вырезанного на геля первого направления, разделяла в присутствии додецилсульфата натрйя. Результаты этого опыта приведенн на рас.S До Шсокомолекуляриый белковый комплекс (700 кД) в' результате двушрного

669

430 232 но 94

il v'

if о

Í4

H

î> f." °<>

П

3

O :

навеска листьев

I

шяяшат

супернатанг 12000 а

ШАГ - олектрофороз в педенатурнрущих условиях ц-оэ направление)

_I_!_, В

Элащя из зош гэлл в области иол.масс 700 цЦ

ДПД-ПАЛГ-олоктрофороз (2-оо направление)

ДЦС-ПААГ-электрофорэз

94 •

-О

Элоктрошзроноо болков па нитроцэллнлознуэ мембрану

15"1уноОлоттицг о взтптолиа против БТШ 70

"■¡в

1

К (

30 • (

¿¿»Л 1

94 '

67 • • —

I •

43 • •

О

70

30 •

1

РЯО.

А.

Б.

6. Схема шделэння н результаты анализа содержащего БТШ 7 белкового комплекса из листьев А.1;11яИвпа. Листья инкубировав в присутствии 8-мвтиошша (40 мкКи/мл)(А) 8 ч при 37 С Электрофорез в первом направлении проводили в неденатурирупци условиях как на рис.Б, ДДС-ПААГ-злекгоофорез как на рио.1. I - суиернатант 12000 а (40000 имп). Слева - молекулярные массы маркеров, справа - БТШ 70.

Белки супернатанта 12000 е (I) и элюата из зоны геля в области дал.масс 700 кД (2) были перенесены на нитроцеллюлознув мембран п проведен иммувоблот с антителами против БТШ 70. Слева ~ мол. массы маркеров, справа- БТШ 70.

фракционирования давал меченое пятно в области молекулярных масс 60-70 кД. Характер распределения метки в пятне заставляет предполагать частичный протеолиз белка, по. молекулярной массе близкого БТШ 72-74. Результаты иммуноблоттинга белков, влюированных из зоны геля первого направления в области молекулярных асс 700 кД, с антителами против БТШ 70 (выделенными из суспензионной культуры клеток томата д-ром К.-Д.Нойманном, Германия) приведены на рис. 6 Б. Среди полшептидов, влшрованных из зоны геля, содержащей интересующий нас высокомолекулярный комплекс, с антителами гибридизовалась полоса (дублет) в районе 70 кД. Центрифугирование супернатанта (12000 g) при 160 тыс. g в течение I ч не привело к осаздению комплекса 700кД. Это позволяет предположить его существование в растворимом или слабо связанном с мембранами состоянии In vivo.

Таким образом нашими данными показано, что высокомолекулярный белковый комплекс из листьев A.thaliana с молекулярной массой порядка 700 кД в условиях теплового кока содержит в своем составе белок теплового шока из семейства БТШ 70. Этот комплекс существует в метках в растворимом или слабо связанном с мембранами состоянии.

ЗАКЛШЕНИЕ

Изучение ответа ArabidjopeiB thaliana на тепловой шок на уровне синтеза белка показало, что продолжительность синтеза БТШ в клетках растений зависит от величины действующей температуры. Это позволяет предположать вазшую функциональную роль БТШ в клетках при тепловом воздействии, которая мокет состоять как в защите компонентов клеток от повреждения, так и в определении величины температурного воздействия и соответствующего физиологического ответа.

С применением ингибиторного анализа показано, что вкспрессия разных представителей БТШ регулируется на уровнях транскрипции и трансляции. Высокомолекулярные БТШ синтезируются как в результате включения транскрипции их генов при тепловом шоке, так и с матриц, запасенных в цитоплазме. Синтез низкомолекулярных БТШ регулируется исключительно на уровне транскрипционной активации их генов.

Сникение чувствительности растений к этилену, вызванное мутацией в оистеме его рецепции, приводило к снижению устойчивости растений к высоким температурам, что выражалось в увеличении выхода электролитов из клеток при нагревании, но не было связано с экспрессией и динамикой синтеза БТШ. По-видимому, этилен не может, рассматриваться как вторичный мессендар в передаче температурного сигнала на синтез БТШ,

о изменение терлоустойчивости мутвнтних растений опосредовано механизмами, не связанными с синтезом белков теплового шока.

Методом электрофореза в неденатурирующих условиях БТШ листьев Arabidopeio thaliana были обнаружены в составе высокомолекулярных белковых комплексов, спектр которых изменяется в зависимости от продолжительности нагревания листьев. Состав высокомолекулярного комплекса с приблизительной мол.массой 700 кД был изучен с помощью двумерного электрофореза и агаоции из геля. С применением антител к БТШ 70 было показано, что в него входят белки, относящиеся к семейству БТШ 70. Высокомолекулярный комплекс с молекулярной массой 700 кД присутствовал во фракции выделенных белков в растворенном или слабо связанном с мембранами состоянии. Полученные данные ставят задачу изучения функциональной активности высокомолекулярных белковых комплексов, содержащих БТШ, в клетках растений.

вывода

1. Охарактеризован синтез белков теплового шока в листьях Arabidopaio thaliana п дана его количественная оценка при различных температурах.

2. Обнаружены существенные различия в дкнампко синтеза БТШ при 34 п 37°С, что дает основу для создания биологической модели действия теплового шока различной интенсивности на растения.

3. Проведено сравнительное научение терлочувствительности портальных растений A. thaliana п мутанта oti5, не чувствительного п этилену. Показано, что потеря чувствительности к этпену сопровождается сшившем термореэистентностп.

4. Получепа сравнительная характеристика синтеза БТШ у мутанта eti5 и растений A.thaliana дикого типа, в результате чего не обнаружено различий в наборе и динамике синтеза БТШ, что позволяет заключить, что этилен не принимает участия в передаче температурного сигнала на синтез БТШ.

Б. С использованием ингибиторного анализа показано, что регуляция синтеза низкомолекулярных БТШ происходит преимущественно на транскрипционном уровне, тогда как в регуляции синтеза высокомолекулярных БТШ принимают участив как транскрипционный, так и трансляционный уровни контроля.

6. Сравнительный анализ белков теплового шока при электрофорезе в денатурирующих и не денатурирующих условиях позволил обнарувить, что БТШ в клетках содерватся главным образом в составе водорастворимы!

белковых кошшксов.

7. Показало, что наиболее активно синтеапрувдийся в лестып a. thai lana пря те пловом шоке белковый комплекс о молекулярной шшоо" порядка 700 кД содержит белки, относящиеся к семейству БТШ 70. .

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Клюева H.D. Белки теплового сока растенкй//"Проблош1 современной биологии: Тр. 17 науч.конф.иол. ученых бгал.фак. ЫГУ, Цосква, 22-25 аир. 1986 4,1" U. I98S. С. 205-209 (Рукопись деп. в ВИШИ 12.09.86 ü 6642-В).

2. Клюева H.D. Синтез белков теплового шока у Arabidopaio thallana/VTeancu докл. И Всесовз. конф. молодых ученых со физколопш растительной клетки (Петрозаводск, 18-22 апреля 1988 г.) U. 1983. С.72.

3. Клюева H.D., Самохвалов II.U. Сайтов белков теплового eoîcû у ArabidopsiB thai1апа//йззиология растений. 1990. Т.37.В.4. С.739-747

4. Kluava H.ïu. Eulaeva O.K. LavelB of regulation of HBP synthesis In Arabidopeia thaliana. Third European Congress on Oall Biology. Abstraots.//Oell Biology. International reports. Plrenze, Italy.

1990.- P.

Б. Уохлова В.A., Порфврова С.А., Клюева H.D. Исследование транскрипционного и трансляционного уровня регуляции синтеза белков теплового шока и их локализации в клетках растений// Второй съезд Всесоюзного общества йиаиологов растений. Уинск. Тезисы докладов. Ногаева. 1990. - 0.95.

6. If.Yu.Kluava. Beat ehook response of Arabidopsis thalicna at tho lovol of . protein synthosis/ZPlant metaboliea regulation. V-th International youth eyrapoulum on plant metabolism regulation. Sofia.

1991.- P. 355-358.

7. N.Kluava, 0.Eulaeva. Study of heat shook proteins -oohtalnlng oomplexea in Arabidopsio thaliana//Robertaon Symposiua on ArabidopsiB thailana and raoleoular basis of Plant Biology, 30 Sapt-

1 Oot 1991. Canberra. 1991.

8. Порфорова С.А., Клюева К.Ю., Хохлова В.А., Кулаева О.Н. Влияние ингибиторов синтеза РНК я белка на формирование цятоплазматических гранул, спнтев и локализацию белков теплового шока в ¿слетках листьев Arabldopoie thaliana. I. Гранулы теплового шока/Лйшология растений. 1992. t.38. B.I. с. 159-164. '