Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Устойчивость и адаптация к тепловому шоку культур клеток Arabidopsis thaliana и Thellungiella salsuginea при действии фторида натрия

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Устойчивость и адаптация к тепловому шоку культур клеток Arabidopsis thaliana и Thellungiella salsuginea при действии фторида натрия"

На правах рукописи

Пуляевская Мария Александровна

УСТОЙЧИВОСТЬ И АДАПТАЦИЯ К ТЕПЛОВОМУ ШОКУ КУЛЬТУР КЛЕТОК ARABIDOPSIS THALIANA И THELLUNGIELLA SALSVGINEA ПРИ ДЕЙСТВИИ ФТОРИДА НАТРИЯ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

!1 8АВГ2011

Иркутск, 2011

4852182

Работа выполнена в лаборатории фитоиммунологии Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Евгений Геннадьевич Рихванов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Плешанов A.C. кандидат биологических наук Кирильчик C.B.

Ведущая организация:

ФГОУ ВПО Иркутская государственная сельскохозяйственная академия

Защита диссертации состоится «06» сентября 2011 г. в 13.30 ч на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Факс (3952)510754, e-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского институт физиологии и биохимии растений СО РАН.

Текст автореферата размещен на сайте Института: www.sifibr.irk.ru

Автореферат разослан «.?/» ¿-¿¿g/U£.2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 003.047.01 П 0

кандидат биологических наук Г.П. Акимов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Фтор является одним из компонентов атмосферных выбросов промышленных предприятий. Действие фтора на растения проявляется в угнетении роста, продуктивности, морфоструктурных изменениях. На клеточном уровне фтор подавляет активность ряда ферментов, нарушает метаболические процессы и целостность мембран (Михайлова и др., 2006; Kamaluddin, Zwiazek, 2003). Известно, что комбинированный эффект антропогенного загрязнения и различных естественных стрессовых воздействий представляет большую угрозу для устойчивого земледелия (Tomanek, 2010). Так показано, что атмосферное загрязнение фтором приводит к повышению чувствительности растений к другим биотическим и абиотическим воздействиям: поражению патогенными микроорганизмами (Reynolds, Laurence, 1988; Doley et al., 2004) и насекомыми (Рожков и Массель, 1982), а также повышенной температуре (Wiebe, Poovaiah, 1973). Механизм такого действия фтора не известен. Показано, что в ответ на повышение температуры в клетках растений синтезируются белки теплового шока (БТШ) (Kotak et al., 2007; Maimbo et al., 2007). Именно БТШ защищают растения от гибели при тепловом шоке, а также при других стрессах (Ogawaetal., 2007; Kanzaki et al., 2003). В активации экспрессии генов БТШ важную роль играет функциональное состояние митохондрий. Нарушение их активности во время теплового стресса в результате обработки митохондриальными ингибиторами подавляет активацию экспрессии БТШ (Rikhvanov et al., 2005; Rikhvanov et al., 2007; Федосеева и др., 2008). В то же время известно, что фтор аккумулируется в митохондриях растений и нарушает их активность (Miller, 1993). Таким образом, представляется крайне важным изучить влияние фтора на синтез БТШ растений при тепловом стрессе.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение влияния фторида натрия на развитие адаптивной реакции к тепловому шоку в культурах клеток Arabidopsis thaliana и Thellungiella salsuginea в зависимости от его способности модулировать функции митохондрий.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Сравнить устойчивость культур клеток A. thaliana и T. salsuginea^ действию фторида натрия и хлорида натрия;

2. Изучить влияние фторида натрия на дыхательную активность и изменение потенциала на внутренней митохондриальной мембране при тепловом стрессе;

3. Изучить влияние фторида натрия на индукцию синтеза БТШ и развитие индуцированной термотолерантности после теплового стресса;

4. Определить влияние конститутивной экспрессии HSP101 на устойчивость культуры клеток A. thaliana к действию фторида натрия.

Научная новизна. В результате проведенной работы впервые изучен механизм ингибирующего действия фторида натрия на адаптивную реакцию клеток растений к тепловому шоку. Обработка NaF подавляет развитие индуцированной термотолерантности, ингибируя синтез БТШ при тепловом стрессе в культурах клеток A. thaliana и Т. salsuginea. Подавление синтеза БТШ в результате обработки

з

NaF коррелирует с его способностью ингибировать повышение потенциала на внутренней митохондриальной мембране. В то же время, конститутивная экспрессия HSP101 в культуре клеток A. thaliana повышает их устойчивость к отрицательному действию фторида натрия. Также впервые проведено сравнение устойчивости к действию фторида натрия культур клеток A thaliana и Т. salsuginea.

Теоретическая и практическая ценность работы.

Полученные результаты вносят вклад в понимание механизмов устойчивости растений к комбинированному воздействию повышенной температуры и фторида натрия. Впервые показана способность фторида натрия ингибировать развитие адаптивной реакции растений в ответ на повышение температурыв результате подавления синтеза БТШ. Материалы диссертации могут быть использованы для оценки экологических и экономических последствий антропогенного загрязнения в условиях изменения климата, а также в сельскохозяйственной практике, при создании новых сортов растений, при разработке курсов лекций по экологии, агрономии и физиологии растений.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были представлены на Всероссийской научной конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010), VII Съезде общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011), а также на научной сессии СИФИБР СО

РАН (Иркутск, 2010).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных работы, в том числе 1 статья в рецензируемом журнале «Физиология растений».

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзор литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования обсуждения, выводов, списка цитированной литературы и приложений. Списо цитированной литературы включает 241 работу, из них 59 отечественных и 18 зарубежных авторов. Работа изложена на 134 страницах, содержит 17 рисунков, таблицу и 3 приложения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. Культуру, клеток Arahidopsis thaliana (L.) Heyn (рас Columbia) получили и культивировали как описано Rikhvanov с соавт. (2007) Культуру клеток Tellungiella salsuginea получили и культивировали как описан Гамбург с соавт. (2011). Использовали культуру клеток трансгенных линий А thaliana (L.) Heyn (раса Nossen) с экспрессией HSP101 в смысловой антисмысловой ориентации под промотором CaMV 35S, а также линш трансформированной вектором без целевого гена (Queitscli et al., 2000). Дл экспериментов использовали 8-дневную культуру, выращенную при 26 °С н роторном шейкере при 130 об/мин в темноте, что соответствовало второй половин логарифмической фазы роста. 8-дневные проростки A. thaliana (L.) Heyn (рас Columbia) выращивали при 26 °С на среде Мурасиге - Скуга.

Обработка клеток. Обработку клеток суспензионных культур производил путем добавления концентрированных растворов действующих веществ культуральную среду. Для создания теплового стресса культуры клето

4

нкубировали на водяном термошейкере Elpan 357 (Польша) и минитермошейкере S-100 («BioSan», Латвия).

Оценка ростовой активности культур клеток. Культуры клеток по 10 мл ассевали в конические колбы объемом 50 мл, обрабатывали необходимыми онцентрациями веществ и инкубировали при 26 °С 10 суток. Результаты оценивали о сырой и сухой массе отфильтрованной культуры клеток.

Оценка жизнеспособности. Определение жизнеспособности клеток роводили с использованием метода восстановления 2,3,5-грифенилтетразолиум лорида (ТТХ) (Еникеев и др., 1995). Число живых и мертвых клеток определяли по крашиванию красителями флуоресцеиндиацетататом (FDA) (Adam, Duncan, 2001) и ропидий йодидом (PI) (Riccardi, Nicoletti, 2006), соответственно.

Выделение белка. Для выделения тотального белка культуры клеток астирали с кварцевым песком в жидком азоте (Побежимова и др., 2004; Rikhvanov t al., 2007). Количество белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1957).

Белковый электрофорез с ДЦС-Na. Электрофорез белков в ПААГ с ДДС-Na фоводили в блоках полиакриламидного геля в модифицированной системе аэммли (Laemmli, 1970), используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN III lectrophoretic Cell фирмы BIO-RAD (США).

Вестерн-блоттинг. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану "Sigma", США) проводили в специальном приборе для блоттинга ("BIO-RAD", ITIA) (Побежимова и др., 2004; Rikhvanov et al., 2007). Иммуноблоттинг проводили соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя с соответствующими нтителами против HsplOl, HspóO и Hspl7.6 ("Agrisera", Швеция).

ОТ-ПЦР-анализ. Тотальную РНК выделяли из культуры клеток A. thaliana с омощью набора SV Total RNA Isolation System ("Promega", USA). Синтез кДНК роводили с помощью набора REVERTA ("АмплиСенс", Москва), используя равное оличество тотальной РНК. Последовательности праймеров были выбраны с омощью програмы Vector NTI на основе кДНК последовательностей целевых генов www.arabidopsis.org). Амплификацию проводили с использованием амплификатора [aster cycler gradient thermocycler ("Eppendorf')- Равный объем ПЦР-продуктов азделяли в 1,5 % агарозном геле.

Определение дыхательной активности. Поглощение кислорода клетками егистрировали полярографически с платиновым электродом закрытого типа электрод Кларка) в ячейке объемом 1,4 мл на полярографе ОН-105 (Венгрия) Трушанов, 1973). Скорость поглощения кислорода выражали в нмолях юглощенного кислорода в мин на г сырого веса с учетом растворимости кислорода

- воде (Побежимова и др., 2004).

Микроскопия. Микроскопический анализ клеток проводили с спользованием инвертированного флуоресцентного микроскопа AxioObserverZl Германия) с цифровой монохромной камерой AxioCamMRm3 и пакетом фограммного обеспечения для захвата и анализа изображений "AxioVisionRel.4.6".

- работе были использованы следующие фильтры: Filter set 15 (ЕХВР 546/12, BSFT 580, EMLP 590) и Filter set 10 (ЕХВР 450-490, BSFT 510, EMBP 565).

Статистическая обработка данных. Биологическая повторность экспериментов была 3-16 кратная. В каждом варианте опыта использовалось по 2-4

5

колбы. Результаты повторностей совпадали. Представлены данные одного характерного эксперимента. Полученные данные обработаны статистически: рассчитаны средние арифмитические значения и их стандартные отклонения (Лакин, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Влияние хлорида натрия и фторида натрия на рост культур клеток

А. thaliana и Т. salsuginea 1

Известно, что растения Т. salsuginea отличаются повышенной устойчивостью к засолению и другим стрессовым воздействиям (Kant et al., 2008; Amtmann, 2009; Носов и др, 2010). Чтобы сравнить действие хлорида натрия на рост культур клеток А. thaliana и Т. salsuginea в среду инкубации добавляли NaCl в концентрациях 0-200 мМ. Культуры клеток инкубировали в течение 10 суток при 26°С, затем определяли сырую и сухую массу клеток. Как видно из рис. 1, добавление NaCl в зависимости1 от концентрации подавляло рост обеих культур клеток, определяемой по сырой массе. Аналогичные результаты были получены при определении сухой массы (данные не представлены). В высоких концентрациях (100 и 200 мМ) каких либо1 различий по способности NaCl ингибировать рост не наблюдалось. В диапазоне] концентраций 10-50 мМ культура клеток А. thaliana была более устойчива к действию агента. Следовательно, используемая в данной работе культура клеток Т. salsuginea не отличается повышенной устойчивостью к засолению по сравнению с! культурой клеток А. thaliana.

Для изучения влияния фторида натрия на рост, культуры клеток А. thaliana и Т. salsuginea обрабатывали NaF в концентрации 0-10 мМ и спустя 10 суток инкубирования при 26 °С определяли сырую массу. Как следует из рис. 2J

негативное действие NaF на рос: культур клеток А. thaliana и Т. salsuginea проявлялось уже is концентрации 1 мМ. Повышение концентрации NaF привело в дальнейшему снижению роста V полному его подавлению при 10 мМ! Рост культуры клеток Т. salsuginea быг несколько более устойчив к действии: NaF в диапазоне концентраций от 1-3 мМ. Тем не менее, начиная с концентрации NaF 7,5 мМ, различий г~ устойчивости к NaF между fleyMi культурами клеток не было выявлено! Наиболее сильное ингибировани: роста наблюдалось при концентрации фторида натрия 10 мМ. Аналогичны; результаты были получены ripi определении сухой массы (данные н< представлены).

Культуры клеток обрабатывали №С1 в концентрациях 0-200 мМ. Сырую массу клеток определяли на 10 день инкубации при 26 °С. п=4.

2. Влияние фторида натрия на

жизнеспособность культур клеток А. гкаИапа и Т. заЬщтеа и проростков А. /кацапа

Для определения влияния фторида натрия на жизнеспособность, клетки обрабатывали 10 мМ в течение 0-24 ч, затем определяли жизнеспособность по восстановлению ТТХ (Еникеев и др., 1995). Результаты показали, что обработка ШР в течение 24 ч в концентрации 10 мМ не влияла на жизнеспособность клеток А. ¡каНапа. но несколько подавляла жизнеспособность Т. яаЫщтеа (рис. За). Повышение концентрации ЫаР до 20 мМ привело к постепенному снижению жизнеспособности культур клеток Грис. 36). Инкубация 24 ч в присутствии 20 мМ №Р снизила уровень кизнеспособности относительно контроля до 34 % у А. гкаИапа, и до 53 % у Г. •¡акщтеа. Таким образом, снижение жизнеспособности у культур клеток А. ¡ИаНапа 4 Т. salsuginea при кратковременном воздействии фторида натрия происходит при концентрации 20 мМ.

в 120 |

* юо

г

ж

Ь 80

I 60

Ц 40

\ 20 1

Л о

@Л. ИшЯапа □ Г. за1$и%Ьш

О 1 2,5 5 7,5 10 Концентрация МаГ: мМ

Рис. 2. Влияние >1аР на рост культур клеток Л. Г каНапа и Т. salsuginea. Культуры клеток обрабатывали Кар в концентрациях 0-10 мМ. Сырую массу клеток определяли на 10 день инкубации при 26 °С. п=4.

20 -

>< 100 -

§ 2 а 80 -

т -

£

о 40 -

5 &

- 20 •

ей 0 ■

О 3 6 24 Время обработки, ч

I вы. ЙюНапа РГ. гш'я^шед I

>С

С *

120 100 ви

| I 60

5 а

%■ 40 -

а-

20 ■

О

4

■ь

0 3 6 24 Время обработки, ч

| ША. ¡каНапа □ Т. тЫщтеа \

Рис. 3. Влияние №Р на жизнеспособность культур клеток А. ¡каНапа и Т. $аЬщ1пеа.

Культуры клеток обрабатывали в концентрации 10 (а) и 20 мМ (б) >*1аР. Способность восстанавливать ТТХ определяли спустя 0-24 ч инкубации при 26 °С. п=6.

/

Следующей задачей было проверить, насколько полученные на культуре клеток данные справедливы для проростков. Для этого 8-ми дневные проростки А. гЪаИапа обрабатывали в концентрации 0-30 мМ в течение 24 ч, затем отмывали от агента и инкубировали на свежей среде дополнительно 48 ч. Обработка Ка1; в I концентрации 10 мМ не сопровождалась значительным сокращением числа живых проростков (рис. 4а) и снижением автофлуоресценции хлоропластов (рис. 46). Увеличение числа мертвых проростков и снижение автофлуоресценции наблюдалось при действии 20 мМ фторида натрия и выше (рис. 4а, б). Эти данные согласуются с результатами, полученными на культуре клеток.

100 п

EX Н

С о

й е-

40 20 0

0 10 20 30 Концентрация NaF, мМ

1 t

2 и

§ I

а. я

& 5 а.

1800 1500 1200 900 600 300 О

Л

О 10 20 30 Концентрация NaF, мМ

Рис. 4. Влияние фторида натрия на жизнеспособность проростков А. МаНапа.

8-ми дневные проростки обрабатывали N3? в концентрации 10, 20 и 30 мМ в течение 24 ч. Результаты фиксировали на 2 день инкубации в отсутствии КаБ. (а) подсчет живых проростков (п=50), (б) автофлуоресценция хлоропластов (п=100).

3. Влияние фторида натрия на индуцированную термотолерантность и экспрессию БТШ при тепловом стрессе

Известно, что предварительная обработка умеренно высокими температурами, индуцирует толерантность к последующему более жесткому тепловому^ воздействию. Это явление называется индуцированная термотолерантность и является важнейшим защитным механизмом при температурных стрессах (Карпец, Колупаев, 2009; Richter et al., 2010; Saidi et al., 2011). Способность противостоять' летальному тепловому шоку во многом определяется синтезом БТШ (Mayer, 2010). -Целью следующей серии экспериментов было изучение влияния фторида натрия на индуцированную термотолерантность и синтез БТШ в культурах клеток A. thaliana и Т. salsuginea. Для этого, прежде всего, необходимо было определить, не влияет ли NaF на жизнеспособность клеток при мягком тепловом стрессе, ö качестве дополнительного контроля использовали ингибитор IV комплекса ЭТИ азид натрия (NaN3). Клетки инкубировали при 26 и 37 °С (120 мин) в присутствии 20мМ NaF или 50 мкМ NaN3, отмывали от веществ и определяли их жизнеспособност1 спустя 48 ч инкубации при 26 °С. Результаты показали (рис. 5), что кратковременная

обработка №Р или Ка]Ч3 не имела самостоятельного отрицательного воздействия на жизнеспособность клеток А. ЛаНапа и Т. заЬи&пеа.

Рис. 5. Влияние фторида натрия на жизнеспособность культур клеток А. ¡ИаИапа (а) и Т. закщтеа (б) при мягком тепловом стрессе. Клетки инкубировали при 26 или 37 °С (120 мин) в отсутствии (К26, К37) или присутствии 20 мМ или 50 мкМ №N3 (Аз). Жизнеспособность определяли по восстановлению ТТХ спустя 48 ч инкубации при 26 °С. п=6.

| Для изучения влияния фторида натрия на индуцированную термотолерантность клетки А. ЛаНапа и Т. яа1зщ1пеа инкубировали 120 мин при 26 'С и 37 "С в присутствии 20 мМ затем клетки отмывали от агента и после восстановительного периода (120 мин, 26 °С) подвергали действию жесткого

26 с 37 с 50"С

26 С 37 С

50°С

Рис. 6. Влияние фторида натрия на индуцированную термотолерантность культур клеток A. thaliana (а) и Т. salsuginea (б). Клетки инкубировали при 26 °С или 37 °С (120 мин) в отсутствии (К26, К37) или присутствии 20 мМ NaF или 50 мкМ NaN3 (Аз), отмывали, инкубировали 120 мин при 26 °С, затем подвергали жесткому тепловому шоку (50°С 10 мин). Спустя 48 ч инкубации при 26 °С определяли жизнеспособность по восстановлению ТТХ. п=6.

теплового шока (50 °С, 10 мин). В качестве сравнения использовали NaN3. Как видно из рис. 6а и 66, жесткий тепловой шок приводил к значительному снижению жизнеспособности контрольных клеток. Предварительная инкубация в условиях теплового стресса (37 °С) вызывала развитие индуцированной термотолерантности и защищала клетки от гибели. Обработка 20 мМ NaF при 26 °С существенно не влияла на способность культур клеток противостоять повреждающему действию теплового шока. Однако, присутствие NaF при 37 °С практически полностью подавляло протекторный эффект теплового стресса на жизнеспособность обеих культур клеток. Обработка NaN3 также снижала жизнеспособность клеток, однако, в меньшей степени, чем NaF. Таким образом, фторид натрия, также как и азид натрия, подавляет развитие индуцированной термотолерантности в культуре клеток А. thaliana и Т. salsuginea.

Развитие устойчивости к жесткому тепловому шоку во многом определяется повышением уровня синтеза HsplOl (Queitsch etal., 2000; Kotak et al., 2007) и низкомолекулярных БТШ, к которым относятся белки Hspl7.6 (Косаковская, 2008). В следующей серии экспериментов проверили способность фторида натрия подавлять индукцию синтеза БТШ при тепловом стрессе. Для этого культуры клеток A. thaliana и Т. salsuginea обрабатывали в присутствии 20 мМ NaF, 50 мкМ NaN3 и 2 мкМ антимицина А (ингибитор III комплекса ЭТЦ) при 26°С и 37°С (120 мин). По результатам иммуноблотинга с соответствующими антителами видно, что при обычной температуре инкубации в клетках A. thaliana экспрессии HsplOl и Hspl7.6 (класс II) не происходило (рис. 7а). Тепловой стресс (37 °С, 120 мин) активировал экспрессию HsplOl и Hspl7.6 (класс И). Фторид натрия практически полностью ингибировал индукцию синтеза HsplOl и Hsp 17.6 в условиях теплового стресса. Подобный эффект, но в меньшей степени, наблюдался при обработке азидом натрия и аитимицином А.

Как следует из рис. 76, антитела, полученные против БТШ A. thaliana, также хорошо реагировали с БТШ Т. salsuginea. Эффект исследуемых веществ на синтез БТШ при тепловом стрессе в культуре клеток Т. salsuginea был аналогичным. Присутствие антимицина А, азида натрия и фторида натрия ингибировало

26Т 374" 26"С 37°С

К NaF Аз АА К NaF Аз АА к NaF Аз АА К NaF Аз АА

.. — I Tsp 101 --. .....

i—i- —iwHir I IspeO

Я* *НВ» Н«р17.6 II

Рис. 7. Влияние фторида натрия на синтез БТШ в клетках А. ¡ЪаИапа (а) и Т. salsuginea (б) при мягком тепловом стрессе.

Представлены результаты иммуноблоттинга. Клетки инкубировали при 26 °С или 37 "С (120 мин) в присутствии 20 мМ КаР, 50 мкМ КаИз (Аз) и 2 мкМ антимицина А (А А) или их отсутствии (К).

ю

индукцию синтеза Нзр101 и Няр17.6 при 37 °С.

Для изучения влияния фторида натрия на экспрессию

генов БТШ,

эксперимент

использованием

анализа. В

Дополнительного

использовали

провели с

ОТ-ПЦР-качестве контроля салициловую

кислоту, которая также ингибирует активность

митохондрий (Norman et al., (2004) и подавляет индукцию синтеза БТШ при тепловом 'стрессе (Павлова и др., 2009). (Культуру клеток А. thaliana инкубировали в присутствии 20 мМ NaF или 1 мМ

26"С 37°С К CK NaF К CK NaF

HSP101 HSP17.6-CI HSP17.6-CII HSP60 ACT2

Рис. 8. Влияние фторида натрия на экспрессию генов БТШ в клетках А. thaliana при мягком тепловом стрессе.

Представлены результаты ОТ-ПЦР. Клетки инкубировали при 26 °С или 37 °С (120 мин) в присутствии 20 мМ NaF или 2 мМ салициловой кислоты (CK) или их отсутствии (К).

салициловои кислоты в течение 120 мин при 26 °С и 37 °С (рис. 8). Индуцированная тепловым стрессом экспрессия генов HSP101 и HSP17.6 (класс I, II) подавлялась в присутствии 20 мМ NaF. Аналогичное действие проявила и салициловая кислота. Экспрессия HSP60 и контрольного гена АСТ2 практически не менялась.

120 -,

5

с. X 100 -

а d «о -

2 EJ*

U 60 -

в С

S £ 40 ■

р ¿0 -

0 -

NaF

АА

И-СТК П + СГК

Рис. 9. Влияния фторида натрия на интенсивность поглощения кислорода клетками А. thaliana (а) и Т. salsuginea (б).

Клетки инкубировали 120 мин при 26 °С в присутствии 20 мМ NaF, 50 мкМ NaN3 (Аз), 2 мкМ антимицина А (АА) или в их отсутствие (К). Для измерения активности альтернативной оксидазы добавляли 2 мМ салицилгидроксамовой кислоты (СГК). п=6.

и

К 26

NaF 26 CP 26

К 37

NaF 37 CP 37

ш щ ш щ «л Щ

г ш я

DIC

Таким образом, фторид натрия подавляет экспрессию генов БТШ при тепловом стрессе (рис. 7, 8), что сопровождается ингибированием индуцированной термотолерантности (рис. 6).

4. Влияние фторида натрия на дыхание и потенциал на внутренней митохондриальной мембране

Подавляющее действие фторида натрия на развитие индуцированной термотолерантности и экспрессию БТШ при тепловом стрессе было аналогичным ранее описанному эффекту митохондриальных ингибиторов и разобщителей (Rikhvanov et al., 2007; Федосеева и др., 2008). Далее мы изучили действие фторида

натрия на функции митохондрий. В серии следующих экспериментов определяли скорость поглощения кислорода клетками. Для этого, клетки инкубировали 120 мин в присутствии 20 мМ NaF, 50 мкМ NaN3 или 2 мкМ антимицина А. Для подавления альтернативной оксидазы (АО) использовали 2 мМ салицилгидроксамовой кислоты (СГК). В обычных условиях АО не функционирует (Меденцев, 1999; Vanlerberghe, Mcintosh, 1997). Соответственно, добавление СГК не влияло на скорость поглощения кислорода клетками обеих культур в отсутствии исследуемых веществ (рис. 9а, б). Присутствие NaN3 и антимицина А снижало поглощение кислорода клетками. Добавление СГК совместно с указанными способствовало сокращению дыхания. В случае NaF, была получена совершенно иная картина. Фторид натрия также ингибировал дыхание клеток. Однако, комбинированная

обработка NaF и СГК не привела к еще большему сокращению скорости поглощения кислорода. Таким образом, фторид натрия в концентрации 20 мМ ингибирует дыхательную активность культур

Рис. 10. Влияние ЫаР на п^Ду у культуры клеток А. ¡каИапа.

Микрофотография клеток (а) и статистический обсчет данных (б). Клетки инкубировали 120 мин при 26°С или 37°С в присутствии 20 мМ ЫаР или 5 мкМ СССР (СР) или их отсутствии (К). Далее окрашивали КМ в течение 10 мин. Масштабный отрезок равен 20 мкм. 01С -дифференцоинно-интерфереционный контраст. п=100.

веществами дальнейшему интенсивности использования

клеток A. thaliana и Т. salsuginea в течение 120 мин, не активируя при этом альтернативный путь дыхания.

Ранее показано, что тепловой стресс 37 °С вызывает значительное повышение потенциала на внутренней митохондриальной мембране (mtA\|/) в клетках А. thaliana, что сопровождается активацией экспрессии БТШ. Митохондриальные ингибиторы и разобщители, способные подавлять повышение mtAiy при тепловом стрессе препятствовали развитию индуцированной термотолерантности и индукции синтеза БТШ (Rikhvanov et al., 2007). Чтобы изучить действие фторида натрия на изменение mtAy при мягком тепловом стрессе, клетки инкубировали 120 мин при 26 °С или 37 "С с добавлением 5 мкМ JC-1 в течение 10 мин. JC-1 при повышении потенциала на митохондриальной мембране меняет спектр испускания с зеленого на красный (Salvioli et al., 1997) (рис. 10а). Тепловой стресс значительно повышал mtAiy (рис. 106). Присутствие 5 мкМ СССР практически полностью блокировало гиперполяризацию внутренней митохондриальной мембраны. Точно к такому же результату, но в меньшей степени, приводила обработка 20 мМ NaF. Таким образом, фторид натрия способен подавлять пйДу при тепловом стрессе (рис. 10), что коррелирует с ингибированием экспрессии БТШ (рис. 7, 8) и подавлением

ё 120

£ 100

X

t =? 80

о fe

<Ü £60

5 í

о ñ 40

(J 20

m

:

□

К NaF К NaF К NaF

antisense vector

. 100 р

х 80

2 =

I 60 I

1" 40

I 20 §

0

n

К NaF' К NaF К NaF

tmtisensc veclor

Рис. 11. Влияние конститутивной экспрессии HSP101 на устойчивость трансгенных линий A. thaliana к действию фторида натрия. Трансгенные линии A. thaliana обрабатывали 24 ч при 26°С в присутствии 20 мМ NaF или его отсутствии (К). Жизнеспособность определяли по восстановлению ТТХ (а) (п=6), окрашиванию FDA (б) и PI (в) (п=10). В каждом образце было просчитано от 1000 до 2000 клеток.

развития индуцированной термотолераитности (рис. 6).

5. Влияние конститутивной экспрессии HSP101 на устойчивость культуры клеток A. thaliana к действию фторида натрия

Известно, что БТШ защищают клетки от гибели при жестком тепловом шоке. В то же время, искусственное повышение уровня БТШ способствует большей устойчивости клеток растений к действию патогенов (Kumaretal., 2009) и окислительному стрессу (Banzet, 1998). В связи с этим, мы изучили устойчивость культуры клеток A. thaliana к действию фторида натрия в зависимости от присутствия HSP101. Для этого использовали трансгенные линии A. thaliana расы N6ssern с конститутивной экспрессией HSP101 в смысловой {sense), антисмысловой {antisense) ориентации, а также линию, трансформированную плазмидой без целевого гена {vector). Культуры клеток обрабатывали 20 мМ NaF в течении 24 ч. Регистрацию жизнеспособности трансгенных линий при действии NaF проводили по восстановлению ТТХ, а также окрашиванию живых и мертвых клеток красителями FDA и PI, соответственно.

Как и ожидалось, обработка 20 мМ NaF приводила к значительному снижению способности клеток восстанавливать ТТХ (рис. 11а). При этом снижалось количество клеток, окрашиваемых FDA (рис. 116) и повышалось количество клеток, окрашиваемых PI (рис. 11 в). Снижение жизнеспособности наблюдалось у всех трех исследованных линий. В то же время, все три использованных метода определения жизнеспособности показали, что линия sense более устойчива к действию фторида натрия, чем линии antisense и vector. При изучении морфологии клеток определено, что имеющиеся в контрольных образцах мертвые клетки в некоторой степени характеризуются конденсацией протопласта и отставанием плазмалеммы от клеточной стенки (табл. 1). Присутствие NaF приводило к гибели клеток, однако увеличение числа мертвых клеток не сопровождалось увеличением числа клеток с конденсацией протопласта. Таким образом, конститутивная экспрессия HSP101 повысила устойчивость клеток A. thaliana к действию фторида натрия.

Таблица 1

Отставание протопласта от клеточной стенки в клетках трансгенных линий А.

thaliana при действии фторида натрия

Sense Antisense Vector

контроль NaF контроль NaF контроль ,_ NaF

ЧИСЛО просчитанных клеток 1679 1698 1724 1819 1501 1947

число мертвых клеток 137 681 96 1461 165 1560

число клеток с конденсацией протопласта 31 32 34 40 15 32

% клеток с конденсацией протопласта 23 4,7 35,4 2,7 9 2,05

6. Изучение параметров развития гибели клеток при обработке фторидом I натрия

Известно, что при действии фторида натрия в клетках животных развивается программированная клеточная смерть (ПКС) (Agarwal et al., 2009). О развитии ИКС в клетках растений в присутствии фтора на данный момент данных нет. В клетках растений ПКС часто сопровождается развитием гибели во времени (Vacca et al., 2004; Rikhvanov et al., 2007). Для изучения гибели клеток при действии фторида натрия, клетки обрабатывали 20 мМ NaF 24 и 48 ч, после чего их отмывали от агента, ресуспендировали на свежей среде и дополнительно инкубировали еще 24 ч при 26 °С (этап восстановления). Обработка фторидом натрия в течение 24 ч снижала уровень жизнеспособности клеток (рис. 12а, б). Увеличение времени обработки до 48 ч привело практически к полной потере жизнеспособности обеих культур. Дополнительная инкубация клеток в отсутствие фторида натрия не влияла на способность клеток восстанавливать ТТХ после 24 и 48 ч. Таким образом,

120

К 100

р м

о i 80

в i

i о s 50

а ь 40

О Ш 20

П

я

К 24

48 24 48

€-=>

т 24 ч

Рис. 12. Действие КаР на жизнеспособность А. ЛаНапа (а) и Т. salsuginea (б). Культуры клеток обрабатывали 20 мМ ЫаР. Спустя 24 или 48 ч клетки отмывали от действия агента, переносили на свежую среду для восстановления жизнеспособности. Способность восстанавливать ТТХ определяли спустя 24 ч инкубации в стандартных условиях. + 24 ч - этап восстановления. п=6

обработка фторидом натрия в концентрации 20 мМ культур клеток растений в течение 24 ч характеризуется достаточно быстрым и необратимым подавлением жизнеспособности и отсутствием развития гибели со временем.

Известно, что одним из признаков развития ПКС в культуре клеток является конденсация протопласта с отставанием плазмалеммы от клеточной стенки (Reape et al., 2008). Как следует из табл. 1, гибель клеток трансгенных линий A. thaliana, вызванная действием 20 мМ NaF, в течение 24 ч не сопровождается конденсацией протопласта.

Развитие ПКС в клетках растений приводит к активации экспрессии генов метакаспаз, родственных каспазам животных (Sanmartín et al., 2005). Чтобы выяснить, вызывает ли фторид натрия активацию экспрессии генов метакаспаз, культуру клеток A. thaliana обрабатывали 120 мин при 26 °С и 37 °С в присутствии

20 мМ NaF или 1 мМ салициловой кислоты.

Результаты ОТ-ПЦР анализа свидетельствуют о том, что NaFi не изменял уровень экспрессии! генов метакаспаз ни при 26 °C,i ни при 37 °С, в отличие от салициловой кислоты,I

вызывающей увеличение!

экспрессии МСЗ при обычной температуре инкубации (рис. 13). Экспрессия контрольного; гена АСТ2 оставалась неизменной во всех вариантах1 эксперимента.

Таким образом, гибель, индуцируемая фторидом1

натрия, не имеет временной1 динамики, и не сопровождается активацией экспрессии

метакаспаз.

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что Т. salsuginea, близкий родственник A. thaliana, отличается устойчивостью к засолению (Amtmann, 2009). Показано, что растения Т. salsugineä-обладают повышенной способностью расти при действии хлорида натрия, чем; растения А. thaliana (Inan et al., 2004; Ghars et al., 2007). Однако, проведенные р данной работе эксперименты по изучению влияния хлорида натрия на рост не выявили повышенной устойчивости культуры клеток Т. salsuginea по сравнению с культурой клеток А. thaliana (рис. 1). Возможно, причины различий между1 полученными результатами и литературными данными заключаются в том, чтс семена, из которых была получена культура клеток Т. salsuginea не относятся к солеустойчивому экотипу. Хотя показано, что суспензионная культура клеток Т salsuginea (экотип Yakutsk) была более устойчива к действию хлорида натрия, ntj сравнению с культурой клеток A. thaliana (Носов и др, 2010), нельзя исключать, чтг солеустойчивость, проявляемая на уровне целого растения, не всегда сохраняется Hi уровне культуры клеток.

Аналогичным образом, не было обнаружено существенных различий в рост« культур клеток Т. salsuginea и A. thaliana в присутствии фторида натрия (рис. 2)| Если в диапазоне концентраций NaF от 1 до 5 мМ рост культуры клеток Т salsuginea подавлялся несколько слабее, то при дальнейшем повышений концентрации наблюдалась примерно одинаковая степень подавления роста обего культур клеток. Таким образом, проведенное сравнение действия NaF и NaCl ш рост культур клеток А. thaliana и Т. salsuginea не выявили сверхустойчивости Т salsuginea к действию фторида и хлорида натрия.

2б°С

37'С

К CK NaF К CK NaF

MCI MC2 МСЗ MC4 MC7 MC9 ACT2

Рис. 13. Действие на экспрессию генов метакаспаз в культуре клеток А. /ЬаНапа. Представлены результаты ОТ-ПЦР-анализа. Клетки инкубировали при 26 и 37 °С 120 мин в присутствии 20 мМ или 2 мМ салициловой кислоты (СК) или их отсутствии (К).

Различные виды растений обладают разной устойчивостью к действию фторидов. Добавление 2,5 мМ NaF в среду культивирования каллусных штаммов Larix sibirica и Larix gmelinii вызывало остановку роста (Матяшенко и др., 2005). Однако, обработка NaF в концентрации 50-100 мМ проростков солеустойчивого вида Salicornia brachiata Roxb не только не вызывала задержки роста, но даже его стимулировала. Только повышение концентрации NaF до 150 мМ несколько ингибировало накопление сырой биомассы S. brachiata и приводило к появлению некрозов на листьях (Reddy, Kaur, 2008). При изучении действия фтора на томаты и овес оказалось, что рост томатов подавлялся, если концентрация ионов F" в растворе превышала 1,5 мМ, тогда как для подавления роста овса требовалась более высокая концентрация фтора - 5,1 мМ (Stevens et al., 1998). Обработка фторидом натрия в диапазоне концентраций от 0 до 10 мМ не влияла на сухую массу листьев проростков миндаля, но несколько снижала массу корней (Elloumi et al., 2005). Результаты проведенных экспериментов показали, что обработка фторидом натрия культур клеток A. thaliana и Т. salsuginea в концентрации 1 мМ NaF имела заметное отрицательное влияние на накопление сырой массы, а практически полное подавление роста обеих культур клеток отмечено при концентрации 10 мМ NaF (рис. 2).

Несмотря на то, что NaF в концентрации 10 мМ значительно ингибировал рост обеих культур клеток (рис. 2), обработка NaF в этой концентрации в течение 24 ч при 26 °С не влияла на жизнеспособность клеток (рис. За) и проростков (рис. 4) А. thaliana. Некоторое снижение жизнеспособности при тех же условиях эксперимента наблюдалось в случае культуры клеток Т. salsuginea (рис. 36). Возможно, подавление фтором физиологических процессов может приводить к торможению роста и не вызывать при этом непосредственной гибели культуры клеток. Это предположение подтверждается другими авторами. Обработка 10 мМ NaF проростков осины в течение 5 недель ингибировала рост листьев на 67 %, но при этом жизнеспособность, измеряемая по выходу электролитов, снижалась всего лишь на 30 %, а содержание хлорофилла, которое часто используется как показатель жизнеспособности, наоборот повышался (Kamaluddin, Zwiazek, 2003). Обработка проростков сосны фторидом натрия в диапазоне концентраций от 1 до 10 мМ в течение 7 дней подавляла их рост. После первого дня обработки наблюдалось снижение скорости дыхания, фотосинтеза, снижалось содержание воды и количество углеводов. Однако на седьмой день обработки ряд физиологических параметров, например, фотосинтез, восстанавливался до контрольного уровня (Zwiazek, Shay, 1988).

Значительное снижение жизнеспособности культур клеток после 24 ч обработки фторидом натрия наблюдалось при концентрации 20 мМ (рис. 36). Обработка 20 мМ NaF также приводила к гибели проростков A. thaliana (рис. 4). Таким образом, фторид натрия оказывает практически одинаковое действие на жизнеспособность культуры клеток и проростков A. thaliana (рис. 3,4).

Известно, что одним из проявлений отрицательного действия фтора на растения является его способность влиять на дыхание. В зависимости от вида и возраста растения, концентраций фтора и времени его обработки, рН культуральной среды и взаимодействия с другими минеральными элементами фтор может вызывать или ингибирование, или усиление дыхания (Miller, 1993^. Обработка NaF приводила к значительному подавлению дыхания (рис. 9). Подобным образом,

дыхание подавлялось при действии классических митохондриальных ингибиторов III и IV комплексов дыхательной цепи, азида натрия и антимицина А. Однако, если добавление СГК, ингибитора АО, значительно усиливало ингибирующии эффект антимицина А и NaN3, то в случае фторида натрия аддитивного действия СГК не наблюдалось. АО катализирует окисление убихинола и восстановление кислорода до воды, минуя III и IV комплексы дыхательной цепи (Vanlerberghe, Mcintosh. 1997). Полученные данные указывают, что подавление поглощения кислорода при действии фторида натрия не связано с ингибированием III и IV комплексов. Это позволяет предполагать, что NaF ингибирует дыхание на этапе, который предшествует убихинолу. Известно, что фторид натрия может ингибировать активность ряда митохондриальных и гликолитических ферментов растений, таких как сукцинатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа, энолаза и других (Miller, 1993). Вероятно, в результате нарушения функционирования какого-либо из этих ферментов и подавляется дыхание в культуре клеток при обработке фторидом натрия.

Регуляция экспрессии генов БТШ у всех эукариот осуществляется в результате связывания транскрипционного фактора теплового шока (Hsf, heat shock factor) с элементами теплового шока (HSE, heat shock element), расположенными в промоторе соответствующих генов (Kotak et al., 2007). У растений экспрессию БТШ, помимо Hsf, регулируют и другие транскрипционные факторы, такие как WRKY25 (Li et al., 2009), DREB2A и DREB2C (Lim et al., 2007). Принято считать, что экспрессия генов БТШ активируется в результате появления в клетке денатурированных белков, которые и активируют Hsf (Schoffl et al., 1998). Однако анализ физиологического действия различных соединений показал, что во многих случаях при активации экспрессии генов БТШ в клетке не наблюдается денатурации клеточных белков (Finka et al., 2011). Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о влиянии на экспрессию генов БТШ активных форм кислорода (АФК) и внутриклеточного кальция, уровень которых повышается при тепловом стрессе (Kotak et al., 2007; Saidi et al., 2011).

Согласно современным представлениям, функции митохондрий растений не ограничиваются исключительно окислительным фосфорилированием. Митохондрии играют важную роль в развитии ПКС у растений и животных, а также участвуют в восприятии и проведении сигнала при стрессовом воздействии, модулируя гомеостаз АФК и внутриклеточного кальция (Sweetlove et al., 2007). Показано, что при мягком тепловом стрессе в растениях арабидопсиса усиливается поглощение кислорода и возрастает mtAvy, что сопровождается усилением экспрессии генов, кодирующих ряд БТШ (Rikhvanov et al., 2007). В соответствии с этими результатами, мягкий тепловой стресс при 37 °С вызывал повышение mtAy в культуре клеток A. thaliana, а добавление NaF и протонофора СССР, это повышение ингибировало (рис. 10). Митохондриальные ингибиторы подавляют повышение mtAy при мягком тепловом стрессе. При этом наблюдается ингибирование тепловой индукции синтеза БТШ и развития индуцированной термотолерантности (Rikhvano et al., 2007). Поэтому не удивительно, что обработка NaF при 37 °С подавляла гиперполяризацию митохондриальной мембраны (рис. 10) и способность клеток А. thaliana и Т. salsuginea синтезировать HsplOl и Hspl7.6 (рис. 7 и 8) и индуцировать термотолерантность при мягком тепловом стрессе (рис. 6).

Наибольшее влияние на развитие индуцированной термотолерантности А. thaliana оказывает белок HsplOl, относящийся к семейству CIp/Hsp 101 (Queitsch et al., 2000; Kotak et al., 2007). Ранее показано, что введение гена HSP101 A. thaliana в клетки табака повышает их способность расти в присутствии фторида калия (Еникеев и др., 2010). Результаты данной работы подтверждают, что конститутивная экспрессия HSP101 защищает культуру клеток A. thaliana от гибели, индуцированной обработкой NaF (рис. 11). Таким образом, функционирование шаперона HsplOl может предотвращать клетки растений от гибели не только при тепловом шоке, как это показано ранее (Queitsch et al., 2000; Kotak et al., 2007), но и при воздействии фторида натрия.

Известно, что фторид натрия индуцирует ПКС в культуре клеток млекопитающих (Не, Chen., 2006; Karube et al., 2009). Одним из основных признаков ПКС у растений является развитие процесса во времени. Например, жесткий тепловой шок не приводит к мгновенной гибели клеток A. thaliana (Swidzinski et al., 2002; Rikhvanov et al., 2007) и табака (Vacca et al., 2004). Прогрессивное снижение жизнеспособности клеточных культур наблюдается во время последующей инкубация при обычной температуре. Однако, как следует из рис. 12, количество мертвых клеток после обработки 20 мМ NaF в течение 24 ч не увеличивалось, если их дополнительно инкубировали еще 24 ч уже в отсутствие вещества.

Наиболее близкими родственниками каспаз животных у растений являются метакаспазы. Экспрессия некоторых из них возрастает при развитии ПКС у растений (Sanmartín et al., 2005). Полученные ранее результаты (Павлова, 2010) показали, что салициловая кислота, которая является индуктором ПКС у растений, вызывает экспрессию гена метакаспазы МСЗ в культуре клеток A. thaliana. Этот результат нашел подтверждение и в данной работе. В то же время, кратковременная обработка фторидом натрия не приводила к активации экспрессии этого гена (рис. 13). Также гибель клеток, вызванная фторидом натрия, не сопровождалась конденсацией протопласта с отставанием плазмалеммы от клеточной стенки (табл. 1).

В целом полученные результаты подтверждают наличие положительной корреляции между повышением mtA\|/ при мягком тепловом стрессе и индукцией синтеза БТШ у растений. Результаты настоящей работы также показывают, что NaF, являющийся одним из компонентов атмосферных выбросов, может подавлять адаптивную реакцию растений на тепловое воздействие, ингибируя активацию экспрессии генов БТШ. Таким образом, загрязнение окружающей среды фторидами может представлять собой большую угрозу для растений, особенно в условиях резкого повышения температуры.

ВЫВОДЫ

1. Использованная в работе культура клеток Т. salsuginea не обладает повышенной устойчивостью к засолению, по сравнению с культурой клеток А. thaliana.

2. Фторид натрия в концентрации 10 мМ полностью подавляет рост культур клеток A. thaliana и Т. salsuginea.

3. Фторид натрия в концентрации 20 мМ вызывает гибель культур клеток А. thaliana и Т. salsuginea и проростков A. thaliana. Гибель суспензионных культур клеток не развивается во времени и не сопровождается активацией генов метакаспаз.

19

4. Фторид натрия подавляет адаптивную реакцию культуры клеток на повреждающий тепловой шок, что выражается в ингибировании повышения потенциала на внутренней митохондриальной мембране, синтеза белков теплового шока и развития индуцированной термотолерантности.

5. Конститутивная экспрессия HSP101 повышает устойчивость культуры клеток A. thaliana к действию фторида натрия.

6. Негативное действие фторида натрия проявляется не только в непосредственном угнетении роста и жизнеспособности, но и в подавлении адаптивного механизма к тепловому шоку.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Пуляёвская М.А.. Рихванов Е.Г., Гамбург КЗ., Русалева Т.М., Варакина H.H. Фторид натрия ингибирует защитную реакцию культуры клеток Arabidopsis thaliana на тепловой шок // Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды: Материалы Всероссийской научной конференции. - Иркутск: Изд-во НЦ PBX ВСНЦ СО РАМН, 2009. - С. 394-397.

2. Пуляёвская М.А.. Гамбург К.З., Русалева Т.М., Варакина Н.Н, Степанов A.B., Рихванов

Е.Г. Фторид натрия подавляет развитие индуцированной термотолерантности у культуры клеток Арабидопсиса // Растение и стресс: Всероссийский симпозиум. - М.: Изд-во Московской Федерации профсоюзов, 2010. - С. 291-292.

3. Пуляёвская М.А., Степанов A.B., Рихванов Е.Г. Конститутивная экспрессия AsplOl способствует повышенной устойчивости культуры клеток арабидопсиса к действ» фторида натрия // Растение и стресс: Всероссийский симпозиум. - М.: Изд-во Московской Федерации профсоюзов, 2010. - С. 292-293.

4. Пуляёвская МА.. Гамбург К.З., Русалева Т.М., Варакина Н.Н, Степанов A.B., Рихвано

Е.Г. Влияние фторида натрия на развитие индуцировашюй термотолерантиости культуры клеток Теллуигиелла // Физиология растений - фундаментальная основ экологии и инновационных биотехнологий: Материалы докладов VII Съезда обществ физиологов растений России. В 2-х ч. — Нижний Новгород: Изд-во Нижегородског государственного университета им. НИ. Лобачевского, 2011. - Ч. 2. - С. 580.

5. Пуляёвская М.А.. Варакина H.H., Гамбург К.З., Русалева Т.М., Степанов A.B., Войнико

В.К., Рихванов Е.Г. Фторид натрия подавляет синтез БТШ в культуре клето Arabidopsis thaliana, подвергнутых воздействию теплового стресса // Физиолога растений. - 2011. - Т. 58, №4. - С. 533-541.

Подписано в печать 20.07.11. Формат 210x1471/16. Бумага писчая белая. Печать |ЩО.Усл.печ.л.1.6. Отпечатано в типографии Академкопия. Тираж 100 экз. Заказ № 102

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пуляевская, Мария Александровна, Иркутск

61 11-3/1105

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК СИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РАН

На правах рукописи

Пуляевская Мария Александровна

УСТОЙЧИВОСТЬ И АДАПТАЦИЯ К ТЕПЛОВОМУ ШОКУ КУЛЬТУР КЛЕТОК АКАВЮОРЗН ТНАЫАШ И ТНЕЬЬиШЖЬЬА БАЬЗиСШЕА ПРИ ДЕЙСТВИИ ФТОРИДА НАТРИЯ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

к.б.н. Рихванов Евгений Геннадьевич

Иркутск, 2011

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.......................................................................5

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................-.............9

1.1. Антропогенное загрязнение окружающей среды фтором..................................9

1.1.2. Естественные источники поступления фтора в окружающую среду.........9

1.1.3. Антропогенное поступление фтора в окружающую среду.........................9

1.1.4. Влияние фтора на окружающую среду........................................................10

1.1.4.1. Атмосферное загрязнение.......................................................................10

1.1.4.2. Загрязнение водных объектов................................................................11

1.1.4.3. Загрязнение почв......................................................................................12

1.2. Экологические последствия загрязнения фтором.............................................15

1.2.1. Влияние фтора на здоровье человека...........................................................15

1.2.2. Экологические последствия влияния фтора на растения...........................15

1.3. Механизмы токсичного действия фтора на растения.......................................18

1.3.1. Проникновение фтора в растение и его аккумуляция................................18

1.3.1.1. Проникновение фтора из атмосферы.....................................................19

1.3.1.2. Поступление фтора из почвы.................................................................19

1.3.1.3. Аккумуляция фтора растениями............................................................21

1.3.2. Поступление и накопление фтора в клетке.................................................22

1.3.3. Основы токсичности фтора...........................................................................24

1.4. Влияние фтора на растения.................................................................................25

1.4.1. Влияние фтора на рост растений..................................................................25

1.4.2. Влияние фтора на жизнеспособность растений..........................................26

1.4.3. Видимые повреждения, вызываемые действием фтора.............................27

1.4.4. Клеточные и структурные изменения при действии фтора.......................27

1.4.5. Влияние фтора на ферментативную активность.........................................28

1.4.6. Влияние фтора на фотосинтез.......................................................................29

1.4.7. Влияние фтора на дыхание............................................................................30

1.4.8. Влияние фтора на другие процессы.............................................................31

1.4.10. Программированная клеточная смерть......................................................32

1.4.9. Влияние фтора на восприятие растениями действия биотических и абиотических факторов...........................................................................................34

1.4.9.1. Свет...........................................................................................................34

1.4.9.3. Дефицит воды...........................................................................................35

1.4.9.4. Другие элементы и токсиканты..............................................................35

1.4.9.5. Биотические взаимодействия.................................................................36

1.4.9.2. Температура.............................................................................................37

1.5. Стрессовые белки и адаптация к действию высоких температур...................39

1.5.1. Явление индуцированной термотолерантности..........................................39

1.5.2. Белки теплового шока....................................................................................40

1.5.2.1. Семейство БТШ 100 (С1р/№р100).........................................................42

1.5.2.2. Регуляция экспрессии БТШ....................................................................44

1.5.3. Роль митохондрий в синтезе БТШ...............................................................46

1.6. Обоснование выбора объекта исследования..................................................49

1.6.1. Лгаб/с/орзгя &аНапа.....................................................................................49

1.6.2. Тке11и^ие11а ваЬщтеа..............................................................................49

1.7. Выводы из обзора литературы.........................................................................50

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................................................53

2.1. Объект исследования...........................................................................................53

2.2. Температурные обработки...................................................................................54

2.3. Обработка клеток фторидом натрия, ингибиторами и разобщителями ЭТЦ 54

2.4. Оценка ростовой активности культур клеток....................................................55

2.5. Определение жизнеспособности клеток............................................................55

2.6. Изучение развития индуцированной термотолерантности..............................55

2.7. Выделение тотального белка...............................................................................56

2.8. Электрофорез в ПААГе с ДДС-Ыа......................................................................56

2.9. Вестерн-блоттинг..................................................................................................57

2.10. Использованные антитела.................................................................................58

2.11. ОТ-ПЦР-анализ...................................................................................................58

2.11.1. Выделение РНК............................................................................................58

2.11.2. Денатурирующий РНК электрофорез........................................................59

2.11.3. Синтез кДНК.................................................................................................59

2.12. Определение дыхательной активности............................................................60

2.13. Микроскопические методы (флуоресцентная и световая микроскопия).....60

2.14. Статистическая обработка данных...................................................................60

3. РЕЗУЛЬТАТЫ..................................................................................61

3.1. Влияние хлорида натрия на рост культур А. ЛаНапа и Т. заЬщтеа.............61

3.2. Влияние обработки фторидом натрия нарост культур клеток А ЛаИапа и Т. яа1$щ1пеа......................................................................................................................63

3.3. Влияние фторида натрия на жизнеспособность культур клеток ЛаЫапа и Т. $аЫи%теа и проростков А. МаИапа............................................................................66

3.3.1. Влияние фторида натрия на жизнеспособность культур клеток А. ЛаНапа и Т. 8аЬщ1пеа...........................................................................................................66

3.3.2. Влияние фторида натрия на жизнеспособность проростков А. 1каИапа.. 68

3.4. Изучение параметров развития гибели культур клеток при обработке фторидом натрия..........................................................................................................71

3.5. Влияние фторида натрия на индуцированную термотолерантность и экспрессию БТШ в культурах клеток А ЛаНапа и Т. заЬщгпеа при мягком тепловом стрессе..........................................................................................................77

3.5.1. Влияние кратковременной обработки фторидом натрия на жизнеспособность культур клеток.........................................................................77

3.5.2. Влияние фторида натрия на развитие индуцированной термотолерантности.................................................................................................80

3.5.3. Влияние фторида натрия на синтез БТШ....................................................82

3.5.4. Действие фторида натрия на экспрессию генов БТШ при мягком тепловом стрессе культуры клеток А. ЛаНапа......................................................85

3.6. Влияние фторида натрия на функции митохондрий культур клеток А гкаНапа и Т. БаЬщтеа...............................................................................................................86

3.6. Влияние фторида натрия на функции митохондрий культур клеток А ЛаЫапа и Т. закщгпеа...............................................................................................................87

3.6.1 Изменение интенсивности поглощения кислорода в присутствии фторида

натрия........................................................................................................................87

3.6.2. Влияние фторида натрия на изменение потенциала внутренней митохондриальной мембраны культуры клеток А гкаИапа при мягком тепловом стрессе......................................................................................................90

3.7. Влияние конститутивной экспрессии ШР101 на устойчивость культуры клеток А ЛаЫапа к действию фторида натрия.........................................................92

4. ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................................98

4.1. Культура клеток Т. яак^гпеа не отличается от культуры клеток А МаНапа по устойчивости к хлориду натрия и фториду натрия............................................98

4.2. Сравнение влияния фторида натрия на рост и жизнеспособность культур клеток Т. яаЬщтеа и А. гкаИапа и проростков А ЖаИапа...................................101

4.3. Параметры гибели культур клеток при обработке фторидом натрия...........104

4.4. Фторид натрия ингибирует развитие индуцированной термотолерантности и

синтез БТШ в клеточных культурах при мягком тепловом стрессе....................107

4.1.5. Влияние конститутивной экспрессии НБРЮ! на устойчивость к фториду натрия..........................................................................................................................111

ВЫВОДЫ.....................-...................................................-...............112

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................113

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АА - антимицин А

АО - альтернативная оксидаза

АФК - активные формы кислорода

БТШ - белки теплового шока

ДДС-Na - додецилсульфат натрия

ИУК - индолилуксусная кислота

нмБТШ - низкомолекулярные белки теплового шока

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ПААГ - полиакриламидный гель

ПДК - предельно допустимая концентрация

ПКС - программируемая клеточная смерть

СГК - салицилгидроксамовая кислота

СК - салициловая кислота

ТТХ - 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид

ЭТЦ - электронтранспортная цепь

СССР - карбонил-цианид ш-хлорфенилгидрозон

JC-1 - 5,5',6,6'-тетрахлор-1,1 ',2,2'-тетраэтилбензимидазоло-карбоцианин HSE - цис-элемент теплового шока (от англ. heat shock element) Hsfs - транскрипционные факторы теплового шока (от англ. heat shock transcription factors)

Hsp - белок теплового шока (от англ. heat shock protein) FDA - флуоресцеин диацетат

MAP - протеникиназы, активирующиеся при митозе (от англ. mitogen activated protein)

МС - метакаспаза

MOPS - морфолинпропансульфокислота

mtA\|/ - потенциал на внутренней митохондриальной мембране

PI - пропидий йодид

Sb - буфер для образца (от англ. sample-buffer)

WIPK - протеинкиназа, индуцируемая поранением (от англ. wound-induced protein kinase)

ВВЕДЕНИЕ

Фтор является одним из основных компонентов атмосферных выбросов промышленных предприятий. На расстоянии 200 м от промышленных предприятий уровень фтора в листьях пшеницы может составлять 500 частей на миллион в расчете на сухую массу или около 3 мМ в расчете на сырую. При этом его концентрация в цитоплазме может превышать 75 мМ. Газообразный фтор в виде HF, как правило, проникает в растения через устьица. По мере их контакта с HF накопление фтора идет почти с линейной скоростью. HF при физиологических значениях рН находится в диссоциированной и недиссоциированной форме. Диссоциированные в водной фазе ионы фтора посредством транспирационных токов транспортируются по апопласту мезофильных клеток в верхушку и края листа (Miller, 1993). Поэтому поражения фтором часто характеризируются появлением апикальных некрозов (Михайлова и др., 2006). С другой стороны, HF лучше проникает через липидные мембраны, чем ионы фтора, и подвергается диссоциации в клеточных компартмен-тах, где наблюдается градиент рН. Поэтому F" в клетке, как правило, концентрируется в митохондриях и хлоропластах, где значение рН составляет соответственно 7.8 и 8.0 (Miller, 1993). Фтор может подавлять рост, не вызывая видимых симптомов повреждения. Подавление роста фтором может достигаться за счет его воздействия на различные физиологические процессы, такие как: фотосинтез, дыхание, метаболизм углеводородов и липидов (Miller, 1993) и водный транспорт (Kamalud-din, Zwiazek, 2003). В результате растительность, подверженная влиянию фторсо-держащих выбросов, характеризуется снижением темпов роста, урожайности, мор-фоструктурными изменениями ассимилирующей фитомассы, в том числе уменьшением массы, длины, объема и поверхности побегов, увеличением дефолиации крон деревьев и развитием апикальных некрозов (Михайлова и др., 2006).

Показано, что атмосферное загрязнение фтором может приводить к повышению чувствительности растений к повышенной температуре (Wiebe, Poovaiah, 1973). Механизм такого действия фтора остается неизвестным.

В ответ на постепенное повышение температуры, а также другие абиотические и биотические воздействия в клетках растений синтезируются белки теплового шока (БТШ) (Kotak et al., 2007; Maimbo et al., 2007). Искусственное изменение уровня БТШ влияет на устойчивость растений не только к повреждающему тепловому шоку, но и к засолению и осмотическому стрессу (Ogawa et al., 2007), а также к инфекции патогенными микроорганизмами (Kanzaki et al., 2003). Вероятно, в регуляции экспрессии БТШ существенную роль играет функциональное состояние митохондрий. Ранее было показано, что тепловая обработка при 37°С клеток Arabidopsis thaliana вызывает повышение потенциала на внутренней митохондри-альной мембране (mtA\|/) (Rikhvanov et al., 2007). Гиперполяризация сопровождалась активацией синтеза HsplOl и Hspl7.6 и развитием индуцированной термотолерантности к жесткому тепловому шоку при 50°С, а присутствие митохондриаль-ных ингибиторов и разобщителей, способных подавлять повышение mtA\|/, блокировало синтез БТШ и снижало развитие индуцированной термотолерантности. Это дает основание предполагать, что митохондрии, посредством изменения mtAi|/, участвуют в регуляции экспрессии БТШ (Rikhvanov et al., 2007).

Поскольку отрицательное действие фтора заключается в том числе, и в его способности влиять на энергетический метаболизм растений (Miller, 1993), представляет интерес выяснить, как фтор может повлиять на способность растений синтезировать стрессовые белки и адаптироваться к экстремальным изменениям температуры.

Удобной моделью для изучения механизмов действия абиотических факторов на растения является культура клеток Arabidopsis thaliana (Hunter, Bomblies, 2010; Bomblies, Weigel, 2010). Во-первых, A. thaliana является наиболее изученным растительным объектом. Геном A. thaliana полностью рашифрован, разработаны молекулярно-биологические, генетические и биохимические методы для анализа экспрессии генов и физиологических реакций на внешнее воздействие. Во-вторых, использование культуры клеток позволяет получить в короткий срок относительно

гомогенную биомассу клеток, что исключительно важно для воспроизводимости экспериментов. Однако, А. thaliana, как объект исследования, относительно чувствителен к внешнему воздействию, хотя широко используются генетические способы повышения его устойчивости. Близким родственником А. thaliana является Thel-lungiella salsuginea. Не смотря на высокую степень идентичности геномов (Inan et al., 2004), Т. salsuginea отличается гораздо большей устойчивостью к засолению и ряду других стрессовых воздействий (Amtmann, 2009). Приняв во внимание высокую степень родства двух видов А. thaliana и Т. salsuginea и повышенную устойчивость рода Thellungiella к стрессовым факторам, предполагалось, что имеющаяся в нашем распоряжении культура клеток Т. salsuginea будет отличаться по устойчивости к фтору в сравнении с А. thaliana.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Антропогенное загрязнение окружающей среды фтором 1.1.2. Естественные источники поступления фтора в окружающую среду Фтор широко распространен в природе. На его долю приходится 0,095 % от общей массы земной коры. Первым крупным природным источником неорганических фторидов является выветривание из фторсодержащих минералов (Camargo, 2003; Weinstein, Davison, 2004). Наиболее богатыми фтором из них являются криолит и флюорит, менее - фторапатит, биотит, мусковит (Власюк, 1969; Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989). На втором месте источником поступления в окружающую среду природного фтора стоят фторсодержащие комплексы, преимущественно HF и SiF2, выносимые из материнской породы в атмосферу вулканическими газами, и содержащими до 2,5 % фтора (цит. по Шелепова, Потатуева, 2003; Symonds et al., 1988, цит. по Camargo, 2003). Вынос фтора в океан осуществляется речными стоками (цит. по Шелепова, Потатуева, 2003) Свою роль в поступлении фтора на поверхность земли играют наводнения (цит. по Weinstein, Davison, 2004). Из почв, водоемов и атмосферного воздуха часть фтора также захватывается биомассой за счет деятельности микроорганизмов, растений и животных. Массовая доля фтора в ней оценивается равной 1,4-10"4 % (Добровольский, 1983, цит. по Гладушко, 1991). 1.1.3. Антропогенное поступление фтора в окружающую среду На ускорение миграции и накопления фтора в окружающей среде существенное влияние оказывает хозяйственная и промышленная деятельность человека. Так, доля природных источников фтора составляет 38,5 %, а техногенных - 61,5 %. поступающего в глобальный цикл фтора (Гладушко, 1991). Основным источником пополнения запасов фтора являются промышленные предприятия по производству алюминия, эмалей, стекла, различных химикатов, стали, кирпича, керамики, фосфорных удобрений. Фосфорные удобрения являются наиболее распространенным поставщиком фтора. С фосфорными удобрениями в почвы попадает от 9 до 430 тыс. т фтора (цит. по Шелепова, Потатуева, 2003). Фтористые соединения в коли-

честве 0,36-1,08 т/ сутки поступают в атмосферу от суперфосфатных заводов. Количество фторидов в атмосфере также увеличивается вследствие сжигания фторсо-держащего топлива - угля, дерева, нефти, торфа за счет содержания в них фторидов от 4 до 30 мг/кг (ВОЗ, 1989). За счет деятельности заводов по производству алюминия в атмосферу выбрасывается 20 - 40 кг фтора при производстве одной тонны алюминия. Выбросы �