Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика белка, кодируемого АБК-регулируемым геном A14g01870 Arabidopsis thaliana

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Характеристика белка, кодируемого АБК-регулируемым геном A14g01870 Arabidopsis thaliana"

На правах рукописи

Барташевич Дарья Александровна

Характеристика белка, кодируемого АБК-регулируемым гепом At4g01870 Arabidopsis thaliana

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 АВГ 2014

Москва-2014

005551935

005551935

Работа выполнена в лаборатории экспрессии генома растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва.

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Кузнецов Виктор Васильевич

Официальные оппоненты: Соловьев Александр Александрович,

доктор биологических наук, профессор,

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева,

заведующий кафедрой генетики и сельскохозяйственной биотехнологии.

Шепеляковская Анна Олеговна,

кандидат биологических наук,

филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г. Пущино, старший научный сотрудник.

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, биологический факультет, г. Москва

Защита состоится 21 октября 2014 г. в 11.00 ч. на заседании Совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 002.210.01 по специальности 03.01.0S - "Физиология и биохимия растений" (Биологические науки) при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (495)9778018, электронная почта: m-azaTkovich@ippras.ru; ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии паук, г. Москва.

0 августа Автореферат разослан «Аз» сентября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Азаркович Марина Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Абсцизовая кислота (АБК) регулирует многие аспекты роста и развития растений, в том числе опадание листьев, клубнеобразование, повышение устойчивости семян к высушиванию и переходу к состоянию покоя, синтез запасных белков и липидов семян, процесс старения и многие другие. Помимо функционирования в нормальных условиях, АБК вовлечена в формирование ответа растений на действие различных стрессовых факторов, таких как засуха, засоление, пониженная температура (Finkelstein et al., 2002). К настоящему времени выявлено большое количество АБК-связывающих белков, вовлеченных в сигналинг и метаболизм гормона, а признанными рецепторами АБК являются белки семейства PYR/PYL/RCAR (Joshi-Saha et al., 2011). Однако, несмотря на обилие данных, до сих пор окончательно не изучен механизм действия АБК, в частности, при формировании ответных реакций при действии неблагоприятных внешних факторов. Очевидно, что в основе физиологических ответов лежат изменения в экспрессии стресс-регулируемых генов, участвующих в адаптации растений к неблагоприятным факторам. Важная роль АБК показана в контроле пост-транскрипционного метаболизма РНК (Kuhn and Schroeder, 2003). Установлена ключевая роль РНК-связывающих белков (РСБ) в регуляции экспрессии генов и адаптации растений к стрессам (Arabrosone et al., 2012; Lorcovic, 2009), Причем, некоторые гены, кодирующие РСБ, являются АБК-регулируемыми (Li et al., 2002; Riera et al., 2006). В нормальных условиях РСБ участвуют в контроле различных физиологических процессов и вовлечены в процес-синг пре-мРНК, транспорт, стабильность и деградацию транскриптов, а также их трансляцию (Macknight et al., 1997; Jung et al., 2013). У Arabidopsis thaliana обнаружено более 200 РНК-связывающих белков, некоторые из них могут оказывать влияние на биосинтез АБК посредством участия в регуляции синтеза или метаболизма мРНК, другие РСБ вовлечены в сигналинг АБК (Xiong et al., 2001). Однако, несмотря на большой объем имеющихся данных, изучение новых РНК-связывающих белков, которые, в частности, могут иметь отношение к метаболизму или сигналингу АБК, представляет значительный интерес.

Л з

q (У ) H

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении свойств белка, кодируемого АБК-регулируемым геном At4g0l870 Arabidopsis thaliana. Для достижения этой цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Получить полноразмерный рекомбинантный белок At4g01870 и политональные антитела к нему

2. Изучить экспрессию гена At4g01870 у растений A. thaliana при оптимальных условиях роста и развития, а также при действии экзогенной АБК и абиотических стрессов

3. Исследовать АБК-связывающие свойства белка At4g01870 и определить положение сайта связывания с гормоном

4. Получить и отобрать чистые линии растений A. thaliana, несущие инсерцию в гене At4g0l870, и провести их морфофизиологический анализ

5. Изучить РНК-связывающие свойства белка At4g01870

6. Изучить способность At4g01870 к образованию белковых комплексов

7. Определить внутриклеточную локализацию белка At4g01870

Научная новизиа работы. Впервые охарактеризован ранее неизвестный белок, кодируемый АБК-регулируемым геном At4g01870 у Arabidopsis thaliana.

Впервые была изучена экспрессия гена At4g01870 у A. thaliana и продемонстрирована положительная регуляция экспрессии At4g01870 на уровне мРНК и белка в ответ на действие экзогенной АБК и абиотических стрессоров (гипотермия и засоление).

Впервые показано наличие у белка At4g01870 АБК-связывающих свойств in vitro и определено положение сайта связывания АБК. С помощью биоинформационных подходов предсказана пространственная структура белка, установлено, что At4g01870 не имеет структурного сходства с некоторыми известными АБК-связывающими белками (PYR1, FCA и CHLH).

Впервые охарактеризован инсерционный мутант A. thaliana по гену At4g01870. Показано, что мутация не влияет на рост и развитие растений и на их чувствительность к экзогенной АБК.

Установлено наличие у белка At4g01870 РНК-связывагащих свойств in vitro.

Показано, что белок At4g01870 функционирует в цитоплазме клетки и не является компонентом белкового комплекса, АБК не влияет на его формирование в выбранных условиях проведения эксперимента.

Практическое значение работы. Результаты, полученные в диссертационной работе, имеют фундаментальное и прикладное значение. Данные могут быть использованы при подготовке лекционного материала по курсам физиологии и биохимии растений. Обнаружение новых РНК-связывающих белков, которые, в частности, могут иметь отношение к метаболизму или сигналингу АБК, а также участвовать в контроле стрессового ответа, позволит углубить понимание механизмов регуляции экспрессии генов и формирования устойчивости растений к абиотическим стрессорам. Полученные данные в дальнейшем могут быть полезны при создании растений, устойчивых к неблагоприятным внешним факторам, с применением генно-инженерных подходов.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были представлены на III Всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (Москва, 2010), VII Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международной научной школе «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции» (Нижний Новгород, 2011), Международной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Томск, 2011), Plant Biology Congress 2012 (Фрайбург, Германия, 2012), II(X) Международной Ботанической конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2012), Международной конференции студентов, аспирантов, молодых ученых «Ломоносов 2013» (Москва, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из которых 2 - статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их

обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 28 рисунков; список литературы включает 228 наименований, из которых 220 - на иностранном языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований являлись растения дикого типа Arabidopsis thaliana экотипа Columbia-0 и инсерционный мутант Л. thaliana по гену At4g01870.

Условия выращивания растений. Растения выращивались в климатической камере при +23°С, интенсивности освещения 100 мкмоль квантов/(м с) и фотопериоде 16 ч - день, 8ч- ночь в почве, смешанной с перлитом, либо в стерильных условиях на агаризованной среде Vi Мурасиге-Скуга. Перед посадкой семена стратифицировали в течение 3 суток при +4°С, возраст растений определяли в сутках с момента прорастания. Для проведения экспериментов по изучению экспрессии гена At4g01870 в условиях абиотических стрессов и при обработке гормоном растения выращивали до возраста 7 дней, после чего проростки переносили на свежую среду, содержащую АБК (10'7 М) или NaCl (100 мМ), либо выращивали при +4°С.

Морфофизиологический анализ мутантных растений. Анализировали следующие морфофизиологические показатели: скорость прорастания семян, продолжительность основных стадий жизненного цикла, диаметр розетки, количество листьев на растение, длина корней, длина цветоноса, количество стручков на растение. Также оценивали прорастание семян, рост гипокотилей и удлинение корней мутантных растений в присутствии АБК (10'5, 10"6 и 10'7 М).

Выделение ДНК из растительных тканей и ПЦР проводили в соответствии с (Маниатис и др., 1984).

Выделение суммарной РНК проводили с помощью TRIZOL (Life Technologies, www.lifetechnologies.corn). Качество РНК оценивали спектрофотометрически по соотношению показателей OD26o/28o и OD26o/23o> а также с помощью электрофореза в агарозном геле в денатурирующих условиях.

Содержание транскриптов определяли с помощью ПЦР после обратной транскрипции. Синтез кДНК осуществляли согласно рекомендациям фирмы-производителя (Fermentas).

Электрофоретнческое разделение нуклеиновых кислот проводили в агароз-ном геле в соответствии с (Маниатис и др., 1984). Результаты визуализировали с помощью сканирования гелей на Phosphoimager Typhoon Trio+ (GE HealthCare, США).

Выделение суммарного белка из растений A. thaliana проводили с использованием экстракционного буфера, содержащего 100 мМ NaCl, 50 мМ трис-HCl (pH 7.4), 1 мМ ФМСФ и 2 мМ ßME. Концентрацию белка определяли методом с использованием бицинхониновой кислоты (Stoscheck, 1990).

Электрофоретнческое разделение белков проводили в 10% ПАА-геле согласно (Laemmli, 1970), разделение белковых комплексов в нативных условиях осуществляли в градиенте плотности ПААГ в соответствии с системой Орнстейна-Дэвиса (Davis, 1964, Ornstein, 1964).

Иммунизацию кролика и получение поликлональных антител против полноразмерного рекомбинантного белка проводили в соответствии с (Егоров, 1991). Выделение IgG из полученной сыворотки осуществляли на ProteinG-Sepharose (Sigma-Aldrich, США). Фракцию специфических к At4g01870 IgG выделяли с использованием CNBr-активированной сефарозы 4В (Sigma-Aldrich, США), коньюгирован-ной с очищенным рекомбинантным белком.

Вестерн-блот проводили согласно Timmons and Dunbar (1990), содержание белка At4g01870 анализировали с помощью первичных поликлональных антител против At4g01870 и вторичных коммерческих антител, конъюгированных с флуоресцентным красителем (Медгамал, Россия). Полученные результаты визуализировали посредством сканирования мембран на Phosphoimager Typhoon Trio+ (GE Healthcare, США).

Иммуноферментный анализ проводили в соответствии с (Егоров, 1991).

Выделение протопластов из суспензионной культуры клеток A. thaliana осуществляли согласно (Cocking, 1960).

Трансформацию протопластов проводили в соответствии с (Chen et al., 2006). Флуоресцентная микроскопия. Использовали люминесцентный микроскоп Karl Zeiss (Германия). Для детекции GFP использовали эмиссионный фильтр 508 нм, для детекции автофлуоресценции протопластов - 560 нм.

Биоинформационные методы. Последовательность гена и используемых векторов были получены из базы данных NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Подбор прайме-ров, поиск открытых рамок считывания и их трансляцию, а также моделирование экспрессионных векторных конструкций осуществляли с помощью программы VectorNTI (Invitrogen). Поиск РНК-связывающих последовательностей осуществляли с использованием Интернет-ресурса www.bioinfo.ggc.org. Изучение доменной структуры белка, определение его внутриклеточной локализации и физико-химических характеристик проводили с помощью Интернет-ресурса EXPASY (www.expasy.org). Предсказание третичной структуры белка проводили с помощью веб-сервера Phyre2 (www.sbg.bio.ic.ac.uk), для сравнительного анализа пространственных структур белков использовали сервер iPBA (www.dsimb.insenn.fr).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Биоинформацнонный анализ. Было показано, что в геноме A. thaliana ген At4g01870 представлен одной копией и не содержит интронов. Размер гена составляет 2071 п.о., длина кодирующей области - 1956 п.о. (www.ncbi.nlm.nih.gov). Нуклеотид-ная последовательность гена была транслирована с помощью программы VectorNTI, размер белка составлял 652 а.о., его молекулярный вес - 72,81 кДа. Анализ профиля гидропатии At4g01870 (Kyte, Doolittle, 1982) показал, что исследуемый белок не содержит гидрофобных регионов и характеризуется как растворимый. Кроме того, было обнаружено, что At4g01870 не содержит последовательности сигнального пептида, биоинформационный анализ показал вероятность (80%) цитоплазматической локализации изучаемого белка (www.expasy.org), что согласуется с полученными экспериментальными данными.

Было также показано, что для белка At4g01870 высока вероятность фосфори-лирования и N-ацилирования (www.expasy.org), важнейших биохимических реакций, влияющих на структуру белка, функциональную активность и способность взаимодействовать с другими белками.

Показано, что At4g01870 содержит То1В-домены, характерные для бактериальных белков, являющихся частью Tol-Pal системы и вовлеченных в поддержание целостности внешней мембраны и транспорт токсинов белковой природы - колицинов (Cao Z., Klebba, 2002; Walburger, 2002). Кроме того, белок содержит N-концевой домен DPPIV - сериновой экзопептидазы человека, вовлеченной в иммунную регуляцию, передачу сигналов и апоптоз.

2. Получение полноразмерного рекомбинантного белка и поликлональных антител к нему. С целью получения поликлональных антител к белку At4g01870 и изучения его свойств была создана экспрессионная конструкция на основе вектора pQE32 (Qiagen), содержащая полную последовательность гена и последовательность 6хIiis, необходимую для последующей очистки рекомбинантного полипептида от бактериальных белков.

Рекомбинантный белок был получен с помощью гетерологической системы экспрессии в клетках Е. coli (штамм M15). Очистку белка проводили на Ni-NTA се-фарозе (Qiagen) в нативных условиях. Молекулярный вес полученного белкового продукта гена At4g01870 составлял около 72 кДа, что соответствовало расчетному (рис. 1).

Рис. 1. ДСН-ПААГ фракций после хроматографи-ческой очистки рекомбинантного белка на Ni-NTA сефарозе: M - маркер, 1 - неочищенный лизат, 2 -фракция несвязавшегося со смолой белка, 3,4 - отмывка, 5 - элюция.

Были получены поликлональные антитела против А14§01870 с помощью иммунизации кроликов. С применением аффинной хроматографии была выделена фракция ^О, специфически взаимодействующая с белком At4g01870.

3. Экспрессии гена Л/^07870 у растений А. thalia.no. Изучение экспрессии гена на уровне мРНК проводили с помощью метода ОТ-ПЦР, на уровне белка - вес-терн-блот анализа с полученными антителами против At4g01870.

С целью изучения динамики содержания мРНК и белка у растений А. IИаИапа в онтогенезе суммарные РНК и белок выделяли из листьев 1, 2, 3, 4 и 5-недельных растений А. ЛаИапа. Было показано, что на уровне мРНК у растений в изучаемом возрастном диапазоне экспрессия гена At4g01870 не изменяется. Также не было обнаружено достоверных отличий в содержании белка А14£01870 (рис. 2а).

Рис. 2. Экспрессия гена Лt4g01870: а -динамика накопления мРНК и белка, кодируемых геном А14%01870, в онтогенезе, где 1-5 - возраст растений, недели; б -распределение мРНК и белка At4g01870 в различных органах А. ¡ИаЧапа: Л - лист, С - стебель, Ц - цветок, К - корень.

Для изучения экспрессии гена Ас4ё01870 в различных органах А. ЛаИапа суммарные РНК и белок выделяли из листьев, стеблей, цветков и корней 4-недельных растений, выращенных в почве. Было обнаружено, что мРНК и белок преимущественно накапливались в корнях и цветках, их содержание в листьях и стебле было значительно ниже (рис. 26). Вполне вероятно, что подобное распределение продуктов гена At4g01870 может быть связано с возможным участием белка А14§01870 в регуляции процессов, связанных с ростом и развитием растений.

В экспериментах по изучению суточной динамики накопления мРНК и белка, кодируемых геном At4g01870, использовали 7-дневные проростки А. ЛаНапа. Расте-

(а) 1 2 3 4 5

— — —

•■Ж,:,.;,:-.

л с ц К

— -"'Г «Х

■ • ¡111

ЫЪ

мРНК ШЪ

мРНК

ния выращивали в стерильных условиях в течение 16 ч на свету при +22 С, после чего в одном случае растения в течение 8 ч находились в темноте при той же температуре

(контроль), в другом - темновой пе-

0

Время, ч 12 16 20 24 28

мРНК ШЬ

16 ч-свет, +22°С, 8 ч - темнота, +22°С

мРНК

белок

Рис. 3. Суточная динамика содержания мРНК и белка, кодируемых геном А14ё01870.

0 4 8 12

—п — -

Н20

:

Время, ч 24 48 72

мРНК 1иЬ

Рис. 4. Влияние АБК и абиотических стрессов (засоление, гипотермия) на экспрессию гена At4g01870 у 7-дневных проростков А. гИаИапа.

риод проходил при +12 С.

Было обнаружено, что на уровне белка в обоих вариантах изменений не наблюдалось. Содержание мРНК незначительно повышалось после 8 ч инкубации растений в темноте, после чего возвращалось к исходному уровню у контрольных растений. При сочетании темноты и пониженной температуры наблюдалась сходная тенденция, однако в этом случае содержание транскрип-тов было выше, чем в первом (рис. 3), действие пониженной температуры приводило к активации экспрессии гена At4g01870.

При обработке растений абс-цизовой кислотой наблюдалось повышение содержания транскриптов гена А14$01870, которое достигало максимального значения спустя 8 ч инкубации, а затем постепенно снижалось. Однако в течение первых 24 ч инкубации растений на АБК-содержащей среде изменений содержания белка не происходило. Белок

начинал накапливаться на вторые сутки после обработки гормоном, и его накопление продолжалось до 72 ч (рис. 4).

В условиях засоления и при действии пониженной температуры также наблюдалась сходная тенденция - содержание мРНК увеличивалось спустя 8 ч после начала действия стрессоров и затем возвращалось к исходному уровню. Аккумуляция белка происходила только на вторые сутки у растений в условиях засоления и на третьи -при действии пониженной температуры (рис. 4).

4. АБК-связывающие свойства белка At4g01870. Для изучения способности At4g01870 связывать АБК использовали два подхода - аффинную хроматографию и иммуноферментный анализ (ИФА). Полученный с помощью экспрессии в клетках Е. coli полноразмерный очищенный рекомбинантный белок был нанесен на колонку, содержащую АБК-сефарозу. После инкубации смолу промывали 20 мМ ФСБ, после чего проводили элюцию 0,2 М NaOH. Все полученные фракции наносили в лунки поли-стеролового планшета для проведения прямого ИФА с антиидиотипическими антителами против АБК (АТа-и против АБК), узнающими белки, которые способны связывать АБК. В качестве отрицательного контроля использовали неиммунную сыворот-

0,4 -г Т 0,07

0,35-- А --0,06

"" Л1МЫ.ПН // \\ --0,05

_ 0,25

I 0,2

3 0,15

0,04 0,03 0,02

0,1 —^ |------—■____ ' s

o,oi в

_____ _ _ ________о

О Т Т I Т 1 Т-1-1-1-1— Т т т т т о

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Номер фракции

Рис. 5. АБК-связывающие свойства белка At4g01870. Аффинная хроматография и иммуноферментный анализ с использованием АТа-и против АБК. 1 - АТа-и против АБК, 2 - профиль элюции, ОП 280 нм, 3 - неиммунная сыворотка. Левая ось ординат: результаты ИФА с АТа-и к АБК (ОП 490 нм). Правая ось ординат: профиль элюции с АБК-сефарозы (ОП 280 нм). Ось абсцисс: номера фракций, собранных после проведения аффинной хроматографии. 1 - 6 фракции - промывка смолы 20 мМ фосфатным буфером (рН 7.2), 7-16 фракции - элюция 0.2 М NaOH.

ку. Белок, связавшийся с АБК-сефарозой, элюировался щелочью практически в одной фракции и узнавался АТа-и против АБК (рис. 5). что говорит об его обратимом связывании с АБК. Неиммунная сыворотка не взаимодействовала с элюированным с колонки белком. Полученный результат говорит о том. что происходило специфичное связывание АБК с белком.

Специфичность связывания рекомбинантного белка с АБК доказывали также экспериментами с использованием конкурентной системы ИФА.

Очищенный рекомбинантный белок был иммобилизован на планшете, к нему добавляли АТа-и против АБК и свободный гормон в разных концентрациях - от 10"7 до 10"5 М. АТа-и и АБК конкурировали за связывание с иммобилизованным на план-

(а)

ц 8 с а

« О СП О

ч> т я н с О

(б)

2,5 2,0 • 1,5 -1,0 ■ 0,5 -0,0 ■

10-5 10-6 10-7 0 неим.сыв.

Концентрация АБК, М

о ■а-

1,0

0,5 -

н с О

0,0

0,5 1 2 неим.сыв.

Количество белка, мкг

Рис. 6. АБК-связывающие свойства белка А14§01870. Конкурентная система вытеснения: а - белок сорбирован на планшете для ИФА, за взаимодействие с ним конкурируют АТа-и против АБК и абсцизовая кислота; б - комплекс АБК-овальбумин сорбирован на планшете, за связывание с АБК конкурируют рекомбинантный белок At4g01870 с антителами против АБК.

шете белком. На это указывает уменьшение взаимодействия белка с АТа-и про тив АБК в присутствии АБК, причем это уменьшение было пропорционально концентрации гормона, что говорит о специфичности связывания белка с АБК (рис. 6а).

В другой постановке эксперимента с иммобилизованной на планшете АБК, связанной с овальбумином, взаимодействовали антитела против АБК и рекомбинантный белок At4g01870, очищенный на Ni-NTA сефарозе (рис. 66). Увеличение количества белка от 0,5 до 2 мкг вызывало уменьшение взаимодействия антител с АБК вследствие конкурентного взаимодействия АБК с белком, и степень уменьшения этого взаимодействия зависела от концентрации белка. Это также подтверждает специфичность взаимодействия белка и АБК. Полученные результаты свидетельствуют о том, что белок At4g01870 является АБК-связывающим.

5. Локализация АБК-связывающего сайта белка At4g01870. Были получены N-, С-концевые и центральная области белка (18, 17 и 38 кДа соответственно) с помощью гетерологической системы экспрессии в клетках Е. coli. Положение сайта связывания белка с гормоном определяли с помощью вестерн-блот анализа с АТа-и против АБК. Было показано, что антитела взаимодействуют только с N-концевой областью белка, при этом положительных сигналов в вариантах, соответствующих С-концевому и центральному регионам не наблюдалось. В вариантах с отрицательными контролями. в качестве которых использовали неиммунную сыворотку и АТа-и против зеатина. также взаимодействие с полипептидами обнаружено не было (рис. 7), что доказывает специфичность связывания АТа-и против АБК с N-концевой областью

1 2 3 1 2 3 1 2 3

АТа-и против АБК неиммунная сыворотка АТа-и против зеатина

Рис. 7. Определение положения АБК-связывающего сайта белка At4g01870. Вестерн-блот анализ с АТа-и против АБК: 1 - Ы-концевая область белка, 2 - центральная область белка. 3 — С-концевая область белка.

белка и позволяет сделать вывод о том, что за связывание белка с АБК отвечает N-концевая область.

6. Пространственная модель белка At4g01870. Предсказание третичной структуры белка At4g01870 проводили с помощью гомологического моделирования на основе множественного выравнивания с использованием сервера Phyre2

f \\ un.sbs.bio.ic.ac.uk).

Модель At4g01870 была построена для 93% аминокислотных остатков белка с достоверностью предсказания 90% и представляла собой структуру, подобную двум шести-лопастным p-пропеллерам, образованным N-и С-концевыми областями белка, соединен-

Рис. 8. Пространственная ных центральным регионом (рис. 8). структура At4g01870.

7. Сравнительный анализ пространственных структур At4g01870 п АБК-связывающих белков - PYR1, FCA и CHLH in silico. Для выяснения того, является ли At4g01870 новым АБК-связывающим белком, не имеющим сходства с известными АБК-связывающими белками, был проведен биоинформационный анализ по сравнению пространственных структур At4g01870 и одного из белков - рецепторов АБК PYR1, а также РНК-связывающего белка FCA и Н-субъединицы Mg- хелатазы CHLH, для которых ранее было продемонстрировано наличие АБК-связывающих свойств.

Данные о структуре рецептора АБК PYR1 были получены из Protein Data Base (PDB code 3k90). В связи с тем, что для других АБК-связывающих белков, выбранных для анализа, кристаллографические работы не проводились, и в PDB отсутствует информация об их структурах, для FCA и CHLH были спроектированы модели их белковых молекул. Сравнительный анализ третичных структур белков проводили с помощью сервера iPBA (www.dsimb.inserm.fr). Применяемый подход основан на сравнении локальных конформаций двух белков, структурно сходные участки оцениваются с помощью выравнивания их структур. На основании полученных данных по срав-

(а)

(б)

Рис. 9. Наложение пространственных структур АБК-связывающих белков РУШ, РСА и СНЬН (зеленый) на трехмерную модель А14§01870 (красный) (а -в соответственно).

нению структур А14§01870 и РУЯ1, РСА, СНЬН можно заключить, что At4g01870 не имеет структурного сходства с этими АБК-связывающими белками (рис. 9) и является новым, уникальным АБК-связывающим белком.

8. Морфофизиологические характеристики инсерционного мутанта по гену Семена растений, несущих вставку Т-ДНК в гене At4g01870, были получены из банка семян АВЯС (США). Были отобраны растения, гомозиготные по вставке, отбор чистых линий мутантных растений проводили с помощью ПЦР с использованием праймеров. приходящихся на область гена, зону слияния Т-ДНК и гена, а также на область Т-ДНК.

Анализ растений показал, что инсерционный мутант не имеет фенотипических нарушений и не отличается от растений дикого типа в росте и развитии. В биологических тестах по изучению определяемых АБК физиологических ответов, таких как удлинение корней, рост гипокотилей и прорастание семян, достоверных отличий в ре-

акции на АБК у мутантных и контрольных растений также обнаружено не было, что делает маловероятным участие белка At4g01870 в передаче сигнала АБК. Однако наличие еще двух генов-гомологов у А. ЛаИапа - А1^21670 и А11§21680, белковые продукты которых, возможно, выполняют сходную функцию, может вызывать компенсаторный эффект, чем и может быть объяснено отсутствие различий у контрольных и мутантных растений.

9. РНК-связывающие свойства белка А14§01870. Биоинформационный анализ позволил выявить в аминокислотной последовательности At4g01870 области, потенциально способные связываться с РНК. Наличие РНК-связывающих свойств у белка А14д01870 доказывали с помощью аффинной хроматографии и метода с применением вестерн-блота. Суммарную РНК А. ЖаНапа (10 мг) иммобилизовали на 1 мл СЫВг-активированной 4В-сефарозы (Sigma-Aldrich, США). Очищенный рекомби-нантный белок А14я01870 инкубировали с «пришитой» к смоле РНК в течение ночи при +4°С и постоянном перемешивании, после чего колонку трижды промывали 5 объемами 20 мМ фосфатного буфера (рН 7.2) и проводили элюцию 1 объемом 1 М ЫаС1. Полученные фракции были проанализированы с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях (рис. 10а). При этом было обнаружено, что ре-

(«0

М I 2 3 4

■мишииимм

М

(б)

2 3 4 5 6 7

■Н1

Рис. 10. РНК-связывающие свойства белка At4g01870: а - ДСН-ПААГ фракций белка, собранных после аффинной хроматографии на РНК-сефарозе: М -маркер, 1 - фракция несвязавшегося с РНК белка, 2, 3 - отмывка, 4 - элюция; б

- вестерн-блот анализ после проведения реакции связывания рекомбинантного белка At4g01870 с суммарной РНК, выделенной из листьев А. <ИаИапа: 1 - К-(отрицательный контроль) ДНК, выделенная из листьев арабидопсис, 2 - К-тРНК дрожжей, 3 - К- овапьбумин, 4-7

- суммарная РНК А. ¡ИаИапа - 1, 5, 10, 20 мкг соответственно.

комбинантный белок связывается с РНК.

Для подтверждения этого результата был применен другой подход. Суммарную РНК A. thaliana наносили на нитроцеллюлозную мембрану в количестве 1, 5, 10 и 20 мкг, мембрану инкубировали с очищенным рекомбинантным белком в буфере, содержавшем 20 мМ Трис (рН 7.4), 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМ DTT и 100 мкг/мл овальбумин, затем трижды промывали тем же буфером и проводили вестерн-блот анализ с поликлональными антителами против At4g01870. В качестве контролей использовали ДНК A. thaliana, тРНК дрожжей (Serva) и овальбумин. Для дополнительного контроля специфичности связывания мембрана с нанесенной РНК была проинкубирована непосредственно с антителами без инкубации с белком. Положительные сигналы наблюдались только в вариантах, соответствующих РНК A. thaliana, что доказывает специфичность связывания белка с РНК (рис. 106), в совокупности полученные результаты свидетельствуют о наличии у белка At4g01870 РНК-связывающих свойств.

10. Способность белка At4g01870 к комплексообразованию изучали с помощью вестерн-блот анализа с антителами против At4g01870 после электрофоретиче-ского разделения белковых комплексов в нативных условиях.

Было показано, что антитела взаимодействуют с белковым продуктом, молекулярный вес которого составляет около 72 кДа, что соответствует мономерной форме

Рис. 11. Способность белка At4g01870 к образованию белкового комплекса: М - маркер, 1 - растворимая фракция суммарного белка А. ЛаИапа, ПАА-гель (5 - 15%), окрашенный Соотазз1е-К250, после электрофоретического разделения белковых комплексов в нативных условиях (система Орнстейна-Дэвиса), 2 - вестерн-блот с антителами против At4g01870 после электрофоретического разделения белковых комплексов в нативных условиях.

белка At4g01870 (рис. 11).

кДа М 1 2

В связи с наличием у белка АБК-связывающих свойств и АБК-регулируемой природой кодирующего его гена было предположено, что АБК может являться фактором, необходимым для формирования белкового комплекса.

Для выяснения этого в эксперимент были включены образцы белка, выделенные из предварительно обработанных гормоном растений А. ГИаНапа. При этом, однако, наблюдалось только количественное изменение содержания белка в ответ на обработку растений АБК, в выбранных условиях проведения эксперимента сборки комплекса не происходило (рис. 12).

Рис. 12. Влияние АБК на способность белка At4g01870 к образованию белкового комплекса: 1 -контроль - без обработки растений АБК, 2-5 - 8, 24, 48 и 72 ч инкубации 7-дневных растений А. ¡ИаНапа на АБК-содержащей среде (10"7 М) соответственно.

11. Внутриклеточная локализация белка At4g01870. Была получена экспрес-сионная конструкция на основе вектора рСХ-БО серии 2еЬа1а, содержащая последовательности генов А14$01870 и которую использовали для транзиентной трансформации этиолированных протопластов, выделенных из суспензии клеток А. ¡ИаИ-

сгр-лн^ото

Рис. 13. Внутриклеточная локализация белка А14§01870.

вРР

ana. Визуализацию результатов проводили с помощью флуоресцентной микроскопии. Было обнаружено, что белок At4g01870 преимущественно локализован в цитоплазме клетки (рис. 13). Результаты проведенного биоинформационного анализа подтверждают полученные экспериментальные данные, отсутствие в последовательности белка сигнального пептида и трансмембранных регионов также свидетельствуют о цитоплазматической локализации At4g01870.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе впервые охарактеризован неизвестный ранее белок At4g01870 A. thaliana, кодируемый геном-гомологом АБК-регулируемого AAI (L. luteus). С применением гетерологичной системы экспрессии в клетках Е. coli был получен полноразмерный рекомбинантный белок At4g01870 и высокоспецифические поликлональные антитела к нему.

Было обнаружено, что экспрессия гена At4g01870 положительно регулируется абсцизовой кислотой и индуцируется абиотическими стрессорами (гипотермия, засоление) как на уровне мРНК, так и белка.

Показано, что белок At4g01870 способен связываться с АБК in vitro. С применением аффинной хроматографии, а также прямой и конкурентной систем ИФА было продемонстрировано, что At4g01870 обратимо и специфически взаимодействует с АБК, причем за связывание с гормоном отвечает его N-концевая область. С применением биоинформационных подходов была предсказана третичная структура белка At4g01870. Сравнительный анализ пространственных моделей At4g01870 и АБК-связывающих белков PYR1, FC А и CHLH показал, что At4g01870 не имеет структурного сходства с этими белками, на основании чего было сделано заключение о том, что At4g01870 является новым, уникальным АБК-связывающим белком.

АБК-регулируемая природа гена At4g01870 и наличие у кодируемого им белка АБК-связывающих свойств позволяет предполагать возможное участие At4g01870 в сигналинге гормона. Однако поздняя аккумуляция белка при действии экзогенной АБК и стрессовых факторов, в ответе на которые принимает участие гормон, а также

отсутствие различий у инсерционного мутанта по гену At4g01870 и растений дикого типа в реакциях на АБК делают маловероятным участие белка, по крайней мере, в первых этапах передачи гормонального сигнала. В то же время важно отметить, что фенотипическое проявление инактивации гена At4g01870 может маскироваться присутствием у А. thaliana двух других гомологов - Atlg21670 и Atlg2I680 при условии, что белковые продукты этих генов выполняют сходные с At4g01870 функции. По-видимому, At4g01870 вовлечен в формирование ответных реакций растений на действие абиотических стрессоров.

Было продемонстрировано, что белок At4g01870 способен связываться с РНК. С помощью двух различных подходов было доказано специфическое взаимодействие At4g01870 с суммарной РНК А. thaliana, что дает основание для предположения о возможном участии At4g01870 в регуляции пост-транскрипционного метаболизма РНК в качестве РСБ.

Обнаружено, что белок At4g01870 локализован в цитозоле клетки и функционирует в форме мономера. Кроме того, показано, что АБК не является фактором, необходимым для сборки белкового комплекса, в выбранных условиях проведения эксперимента, вероятно, взаимодействие белка с АБК требуется для иного проявления его функциональной активности.

На основании приведенных в данной работе результатов можно заключить, что белок, кодируемый АБК-регулируемым геном At4g01870, участвует в посттранскрипционном контроле экспрессии генов посредством регуляции метаболизма РНК и вовлечен в формирование ответных реакций растений на действие стрессовых факторов.

ВЫВОДЫ

1. Экспрессия гена At4g01870 положительно регулируется АБК и индуцируется абиотическими стрессами. Активация экспрессии как на уровне мРНК, так и белка предполагает возможное участие продукта гена At4g01870 в формировании ответных реакций на действие стрессоров, в ответе на которые принимает участие АБК

2. Белок At4g01870 способен специфически связывать АБК in vitro. Он является новым АБК-связывающим белком, поскольку не имеет структурного сходства с известными АБК-связывающими белками

3. Инактивация гена At4g01870 у A. thaliana не приводила к морфофизиологи-ческим нарушениям, мутанты не отличались по реакции на АБК от растений дикого типа, на основании чего можно предположить, что белок At4g01870, вероятно, не принимает участия в передаче сигнала АБК. Однако наличие еще двух генов-гомологов At4g01870 у A. thaliana - Atlg21670 и Atlg21680, белковые продукты которых, возможно, выполняют сходную функцию, может вызывать компенсаторный эффект

4. Наличие РНК-связывающих свойств у At4g01870 делает вероятным участие белка в регуляции пост-транскрипционного метаболизма РНК

5. Белок At4g01870 функционирует в цитоплазме клетки в форме мономера, АБК не влияет на его способность к комплексообразованию в выбранных условиях проведения эксперимента

6. Совокупность полученных данных позволяет заключить, что белок At4g01870, вероятно, принимает участие в пост-транскрипционном контроле экспрессии генов посредством регуляции метаболизма РНК и формировании ответных реакций растений на действие стрессовых факторов

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Бапташевнч Д.А. Влияние теплового стресса на экспрессию генов пластома ячменя. Сборник тезисов 61-й студенческой научной конференции им. Н.И.Вавилова, Москва, 2008, с. 24.

2. Гущин В.А., Корнеева В.А., Филиппенко Е.В., Бапташевич Д.А.. Кузьменков П.В., Зубкова Н.К. Мелафен - нанорегулятор роста, влияющий на интенсивность транскрипции генов пластома при деэтиоляции. Сборник тезисов 61-й студенческой научной конференции им. Н.И.Вавилова, Москва, 2008, с. 52.

3. Бапташевнч Д.А. Молекулярные механизмы адаптации хлоропластов к тепловому шоку: экспрессия генов пластома. Тезисы Международной конференции студентов, аспирантов, молодых ученых «Ломоносов 2008», Москва, 2008, с. 180.

4. Бапташевнч Д.А., Демиденко A.B., Кузнецов В.В. Разработка гетерологиче-ской системы для экспрессии генов-гомологов CIP2.1 из A. thaliana - At4g01870 и Atlg2l670 и получение полноразмерных белковых продуктов. Тезисы докладов Ш-го Всероссийского симпозиума «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности», Москва, 2010, с. 21.

5. Баоташевич Д.А.. Демиденко A.B. Использование транзиентной экспресси-онной системы в листьях Nicotiana tabacum L. для экспрессии гомолога С1Р2.1 из А. thaliana (Atlg21670). Материалы докладов VII Съезда Общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международной научной школы «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции», Нижний Новгород, 2011, ч. I, с. 77.

6. Ефимова М.В., Кравцов А.К., Бапташевнч Д.А.. Карначук P.A., Ковтун И.С., Кузнецов В.В. Сравнительный анализ транскрипции хлоропласта ого генома Аг-abidopsis thaliana зависимости от эндогенного уровня брассиностероидов. Материалы докладов VII Съезда Общества физиологов растений России «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международной научной школы «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции», Нижний Новгород, 2011, ч. I, с. 247.

7. Демиденко A.B., Бапташевнч Д.А. Продукты генов Atlg21670 и At4g01870 A. thaliana - возможные участники передачи сигнала фитогормона АБК. Тезисы докладов Международной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Томск, 2011, с. 56.

8. Демиденко A.B., Бапташевнч Д.А. Продукты генов Atlg21670 и At4g01870 A. thaliana - возможные участники передачи сигнала фитогормона АБК. Вестник ТГУ, 2011, № 3 (15), с. 143 - 146.

9. Ефимова М.В., Кузнецов В.В., Кравцов А.К., Барташевич Д.А.. Карначук Р.А., Ковтун И.С., Кузнецов Вл.В. Особенности экспрессии пластидного генома и развития растений Arabidopsis thaliana с нарушенным синтезом брассиностероидов. Физиология растений, 2012, т. 59, № 1, с. 1-8.

10. D.Bartashevich. N.Karavaiko, A.Demidenko, E.Pojidaeva, V.Kusnetsov. The study of ABA-binding proteins from Arabidopsis thaliana encoded by homologues of CIP2.1 gene from Lupinus luteus. Plant Biology Congress 2012 abstract book, Freiburg, Germany, 2012, p.760.

11. Барташевич Д.А.. Каравайко H.H., Кудрякова H.B. Новые АБК-связывающие белки у Arabidopsis thaliana. Тезисы II(X) Международной Ботанической конференции молодых ученых, Санкт-Петербург, 2012, с. 57.

12. Барташевич Д.А. Выяснение роли АБК-связывающих белков, кодируемых генами-гомологами CIP2.1 из генома Arabidopsis thaliana, в ответе растений на стрессовое воздействие. Тезисы Международной конференции студентов, аспирантов, молодых ученых «Ломоносов 2013», Москва, 2013, с. 299.

Подписано в печать:

12.08.2014

Заказ № 10153 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru