Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция синтеза белков при тепловом шоке

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция синтеза белков при тепловом шоке"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ДЕНИСЕНКО Олег Николаевич'

УДК 547.963.3 РЕГУЛЯЩН СИНТЕЗА БЕЛКОВ ПРИ ТЕПЛОВОМ ГОКЕ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 1988

Работа выполнена в Институте белка АН СССР

Научный руководитель: член-корреспондент АН СССР,

доктор биологических наук Л.П.Овчинников

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В.А.Гвоздев

доктор биологических наук, профессор А.А.Нейфах

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии АН СССР

Защита состоится Ф « Аса<Т$_ 1988 г.

в час на заседании Специализированного ученого

совета Д.053.05.70 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова.

С диссертацией можно -ознакомиться в библиотеке Биологического- факультета МГУ.

Автореферат разослан "/£ " ^алЯ, 1988 г.

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

В.Н.Каграманов

' Актуальность проблеш. Биосинтез белка есть процесс, перевода^ информации, записанной в виде последовательности оснований в ДНК, в последовательность аминокислот. Этот процесс состоит из следующих "друг за другом этапов: тзанскрипции генов, процес-синга предшественников мРНК, транспорта зрелых мРНК из ядра в цитоплазму, трансляции мРНК. Регуляция биосинтеза белка в клетке может осуществляться на всех перечисленных этапах. Набор синтезируемых в клетке белков меняется в процессе клеточной дифференцировки по заданной программе, а также

зависит от условий окружающей среды: присутствия гормонов, изменения условий питания, изменения ионного состава среды и т.д. Молекулярные механизмы регуляции биосинтеза белка на'разных уровнях являются предметом интенсивных исследований в настоящее время..

Было обнаружено, что набор синтезируемых белков в клетках самых разных организмов сильно изменяется в ответ на повышение температуры: подавляется синтез ранее синтезировавшихся белков и начинается синтез небольшой группы новых белков, известных под названием белков теплового шока. Синтез этой группы белков может быть индуцирован рядом других воздействий: окисляющими агентами, веществами, нарушающими энергетический метаболизм, аналогами аминокислот, некоторыми вирусами и др. Поэтому белки теплового шока иногда называют стрессовыми белками. Свойства этих белков хорошо изучены, определены первичные структуры их генов. Однако, функции белков теплового шока в организме пока не ясны.

Тепловой шок оказался удобной моделью для изучения механизмов регуляции биосинтеза белка. Известно, что при повышении температуры останавливается транскрипция большинства генов, подавляется процессинг предшественников мРНК и трансляция предсущество-вавших мРНК. С другой стороны, индуцируется транскрипция генов белков теплового шока, транскрипты быстро попадают в цитоплазму и начинают эффективно транслироваться. В настоящее время идентифицированы нуклеотидные последовательности ДНК, отвечающие за активацию транскрипции генов белков теплового шока при повышении температуры, определены последовательности мРНК белков теплового шока, отвечающие за их преимущественную трансляцию.

В связи с тем, что синтез белков теплового шока можно вызвать не только повышением температуры, но и многими другими воздействиями, встаёт вопрос о количестве первичных мишеней в клетке и

пути педачи сигнала в ядро и на рибосомы.

С другой стороны известно, что некоторые воздействия могут активировать синтез только части белков теплового шока. Продукция белков теплового шока контролируется не только rfa стадиях транскрипции и трансляции, но и на стадии сплайсинга и, возможно, на стадии транспорта мРНК из ядра в цитоплазму. Это указывает на то, что синтез конкретных белков теплового шока может регулироваться разными механизмами.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование механизмов регуляции синтеза белков при тепловом шоке. В связи с этим были поставлены следующие задачи: а/ изучить влияние температуры на синтез алармонов (предполагаемых внутриклеточных сигналов для синтеза белков теплового шока); б/ исследовать влияние sh-восстанавливащих реагентов на синтез белков теплового шока; в/ исследовать влияние температуры на трансляцию различных мРНК дрозофилы в бесклеточной системе трансляции из ретикулоцитов кролика.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований показано, что при тепловом шоке в клетках дрожжей наряду с синтезом белков теплового шока накапливается алармон АрррА. Предполагается, что АрррА является внутриклеточным сигналом для синтеза белков теплового шока. Обнаружено, что sh-восстанавлива-ицие агенты - меркаптоацетат и N-метилмеркаптоацетамид - подавляют синтез некоторых белков теплового шока в клетках дрозофилы на стадии промежуточной между транскрипцией и трансляцией. Показано, что в бесклеточной системе трансляции из ретикулоцитов кролика при 43°С (температуре теплового .шока для кролика) транслируются только мРНК белков теплового шока дрозофилы, в то время как трансляция мРНК нормальных белков дрозофилы подавляется. Это свидетельствует о том, что трансляционный контроль, наблюдаемый в клетках дрозофилы, можно воспроизвести в столь гетероло-гичной бесклеточной системе. Установлено, что подавление синтеза нормальных белков дрозофилы в бесклеточной системе трансляции из ретикулоцитов кролика при 43°С осуществляется на стадии тер-минации или на последних шагах элонгации.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции Института белка АН СССР /Пущино,1587/, на первом координационном всесоюзном совещании по белкам теплового шока /Ленинград, IS87/, на заседании кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова /июнь 1987/. По теме

диссертации опубликовано три работы.

Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы "Тепловой шок и регуляция биосинтеза белков',' материалы и методы исследований, результаты, обсуждение результатов, выводы и список цитированной литературы /174 ссылки/. Работа изложена страницах машинописного тек-

ста, включает Т таблицу и рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ PI ОБСУЖДЕНИИ т я

5. Синтез диаденозин-5', 5'''-Р, Р -трифосфата /АрррА/ в дрожжах при тепловом шоке

Известно, что синтез белков теплового шока в клетках можно вызвать не только повышением температуры, но и многими другими воздействиями. Сюда входят окисляющие агенты и вещества, нарушающие энергетический метаболизм, переходные металлы, сульфгид-рильные реагенты, аналоги аминокислот, ингибиторы экспрессии генов, голодание по глюкозе, ионофоры, вирусные инфекции и др. /Hover L. et al., 19В4/' Такое разнообразие агентов ставит вопрос о количестве первичных мишеней в клетке и пути передачи сигнала в ядро и на рибосомы.В настоящее время можно выделить две гипотезы о едином сенсоре стрессового воздействия. Первая предполагает, что индупирукиие факторы приводят к накоплению "испорченных" белков /Hightower L.E., 1980/, которые через систему убиквитина включают гены белков теплового чока, Вторая гипотеза предполагает, что все индукторы теплового шока приводят к окислительному стрессу /Lee P.C. et al.,1983/.

Исследования, выполненные Ли и др. /Lee P.c. et al.,1933/ на E.coli и S.typhimurium, показали, что при тепловом шоке в клетках наряду с белками теплового шока накапливались зденилиро-ванные нуклеотиды ("алармоны"): АрррА, AppppA, ApppGpp, AppppG, ApppG. Накопление алармонов наблюдали и при воздействии на бактериальные клетки окисляющими агентами - индукторами теплового шока. Было предположено, что алармоны могут служить сигналом для синтеза белков теплового шока.

В настоящей работе исследовано влияние теплового шока на синтез алармонов-в эукариотическом организме - дрожжах.

Тепловой шок в дрожжах наблюдается при повышении температуры от 25°С до 41°С. Такое нагревание вызывает синтез целого ряда

новых белков (белков теплового шока) и приводит к подавлению синтеза ранее синтезированных белков (нормальных белков) (рис.1),

Рис.1. Влияние температуры на синтез белков в дрожжах. Клетки дрожжей инкубировали при 25 С /а/ и при 41 иС в течение 45 мш, затем в среду добавляли Р-^метионин и инкубацию продолжали при соответствующей температуре еще в течение 15 мин. Клеточные белки разделяли методом БСБ-электрофореза в ПААГе. Представлена авторадиограмма с гедя.

Сравнение [-'-'s]-меченных нуклеотидов из контрольных клеток (рис.2а) и из клеток, подвергнутых тепловому шоку (рис.26), обнаруживает появление дополнительного радиоактивного соединения (указано стрелкой на рис.26).

Соединение, появляющееся при тепловом шоке, мигрирует при тонкослойной хроматографии в первом направлении рядом с АДР, т.е. имеет то же количество отрицательных зарядов (три), что и АДР, однако, это соединение отстает от АДР при хроматографии во второй направлении. Такое поведение при хроматографии характерно для АрррА /Lee P.C. et al.,1983/.

Инкубация исследуемого соединения с фосфодиэстеразой змеиного яда в течение 30 мин приводит к появлению 5'АДР и 5'АМР

(рис.За). После инкубации в течение 4 часов исходное соединение полностью исчезает, большая часть метки находится в 5'АДР и 5'АМР, кроме того, появляется некоторое количество неорганического фосфата (рис.36). Наконец, после 20 часов инкубации радиоактив-

о -*-2Рнапр.

анных соедине-

Рис.2. Влияние температуры на набор

ний в дрожжах. Клетки дрожжей инкубировали сР^О^в течение ¿часов 15 МВД при 25 С /а/ и в течение 1,5 часов при 25°С и 45 мин при 41 С /б/. Клетки экстрагировали муравьиной кислотой, экстракты хроматографировали на пластинках с ГОИ-целлюлозой. Представлены авта^радиограммы с пластинок. Наверху справа показано расположение на хроматограмме ряда нуклеотидов.

V*«Л"''«.-

• УЦ

ШшшВШВт

ЗЗяЙЭЙ^

хроматограмм

ность обнаруживается в составе 5'АМР и неорганического фосфата (рис.Зв). Обработка указанного соединения периодатом приводит к его распаду, что говорит о том, что это рибо-, а не дезоксири-бо- производное (рис.Зг).

На основании полученных данных исследуемое соединение можно однозначно идентифицировать как рибодиаденозинтрифосфат А5'ррр5*А. Интересно, что в дрожжах, в отличие от бактерий, при тепловом яоке накапливается только один из алармонов - АрррА. Это наблю-. дение может облегчить поиск среди алармонов внутриклеточных индукторов синтеза белков теплового шока.

Зная, что концентрация АТР в клетках ЗмМ, можно вычислить внутриклеточную концентрацию АрррА по формуле: количество имп/ мин в пятне АрррА * ЗмМ / количество имп/мин в пятне АТР. За 45 мин инкубации клеток дрожжей при 41°С внутриклеточная концентрация АрррА возрастает до 30 мкМ.

В более поздних исследованиях других авторов была обнаружена корреляция синтеза (накопления) АррррА и белков теплового шока в клетках дрозофилы, в клетках S7T2 мыт и в клетках слизистого гриба Ph. polycephallum. С другой стороны, на цистах и личинках Artemia таковой корреляции не обнаружено.

При микроинъекции АррррА и АрррА в ооциты лягушки индукции синтеза белков теплового шока обнаружить не удалось /Guedon G.F. et al.,1987/. Однако, если после инъекции алармонов ооциты подвергали слабому тепловому шоку, то ошез некоторых BTHI усиливался по сравнению с неинъецированным контролем.

Принимая во внимание эти результаты, можно предположить, что алармоны сами по себе не являются индукторами синтеза белков теплового шок^ но могут модулировать их синтез.

2. Влияние меркаптоацетата на синтез белков теплового шока

Синтез всех белков теплового шока индуцируется при повышении температуры. При этом одни БТШ появляются при более низкой температуре, другие - при более высокой. Известно, что некоторые воздействия могут вызывать синтез только части белков теплового шока. Так, ювенильный гормон в куколках дрозофилы включает синтез только низкомолекулярных белков теплового шока. Это указывает на то, что синтез разных белков теплового шока может регулироваться различными механизмами. Известно, что синтез БТШ контролируется не только на стадиях транскрипции и трансляции, но и

на стадии спдайсинг'а /Yost H.I., Idndquist S., 1986/ и, ВОЗМОЖНО, на стадии транспорта мРНК из ядра в цитоплазму.

Выше упоминалось, что одна из гипотез предполагает, что все воздействия, индуцирующие тепловой шок, приводят к окислительному стрессу. В связи с этим в настоящей работе исследовано влияние SH-восстанавливающих реагентов на синтез белков теплового шока.

Индукция синтеза белков теплового шока в слюнных железах дрозофилы наблюдается при их нагревании от 25°С до 37°С. Это сопровождается подавлением синтеза всех ранее синтезированных белков (рис. 4).

25° 37° 25° 3?° 37° 37° 37° 37°

-бтшвз~

-БТШё 8 *

мерк а! ¡то- К -ме * и л -

ацетат меркапто-

- ацетамия

Рис.4. Влияние меркаптоацетата (ЮмМ) и н-метилмеркаптоацетамада (10 мМ) на синтез белков теплового шока в слюнных железах дрозофилы. Клетки прединкубировали в указанных условиях, а затем метили [ -"д-метионином в тех же условиях. Представлены авторадиограммы с гелей. *- клетки прединкубировали при 3"гС в течение 15 мин, затем в среду добавляли реагент и через 5 мин клетки метили [/->3 ] -метионином.

Добавление 10 мМ меркаптоацетата натрия в среду инкубации

шпосредственно перед повышением температуры изменяет набор синтезируемых белков: сильно подавляется синтез белка теплового шока с Мв 83 КДа (БТШ83) и несколько подавляется синтез БТШ 22-28. При 25°С меркаптоацетат также изменяет набор синтезируемых белков.' Общий синтез белка в клетках в присутствии меркаптоацетата падает в 2,5 раза при 37°С и в 1,2 раза при 25°С.

Меркаптоацетат может действовать на клетку либо как ингибитор метаболизма (например, как аналог ацетата), либо просто как восстановитель SH-групп. Для дискриминации этих возможностей в работе использован другой восстановитель SH-групп н-метилмеркап-тоацетамид. В концентрации ÎOmM это вещество полностью подавляет синтез БГШ83 и БТШ 22-28 (рис.4). Этот факт является доводом в пользу того, что именно восстановление SH-групп приводит к избирательному подавлению индукции БГШ83 и БТШ 22-28. Можно предположить, что синтез этих белков индуцируется окислительным стрессом.

Если меркаптоацетат или Н-метилмеркаптоацетамид добавить в среду инкубации через Ï5 мин после начала нагревания, то набор синтезируемых белков теплового шока не отличается от контроля (рис.4). Этот факт свидетельствует о том, что меркаптоацетат и Н-метилмдзсалтоацетамид не подавляют процесс трансляции мРНК.

При тепловом шоке в политенных хромосомах слюнных желез по-

Рис.5. Влияние меркаптоацетата на синтез белков теплового люка в клетках Е.coll.Клетки штамма PÏ3 прединкубировали в указанных условиях в течение 5 мин, затем метили L^ sj-метионином в течение Ï5 мин в тех же условиях. Образцы подвергали электрофорезу. Показана авторадиограмма с геля.

45 -

M кДа

33- -bon

— dna К

68 '

-CroEL

29 -

являются новые пуфы, в которых интенсивно синтезируются мРНК белков теплового шока. Добавление N-метилмеркаптоацетамида в среду инкубации сильно подавляет включение [Зн]уридина в пуф 63ВС (ген ВГШ83), но практически не влияет на мечение пуфа 67В (гены БГШ <2-28). Значит, N-метилмеркаптоацетамид подавляет транскрипцию гена ЕШ83 и не затрагивает транскрипции генов БГШ 22-28

Из представленных данных следует, что синтез БГШ83 подавляется на уровне транскрипции, а БГШ 22-28 на стадии промежуточной между транскрипцией и трансляцией: мРНК этих белков в присутствии восстановителей синтезируются, но не транслируются.

Известно, что мРНК ЬТШбЗ синтезируется в виде предшественника, содержащего интрон в 5'-концевой нетранслируемой области, а мРНК низкомолекулярных белков теплового шока синтезируются в виде удлиненных предшественников. Для транскриптов БГ!М) и БГШ68 удлиненных предшественников не обнаружено. Возможно, интенсивное восстановление SH-групп под действием меркаптоацетата и N-метилмеркаптоацетамида при тепловом шоке подавляет процессинг мРНК и, как следствие,.нарушается их транспорт из ядра в цитоплазму. Известно, например, что скорость транспорта мРНК глобина из ядра в цитоплазму зависит от редокс-состояния SH-групп ядерных белков.

Меркаптоацетат в концентрации 50-100мМ меняет набор и соотношение белков, синтезируемых в клетках E.coLi при тепловом шоке (рис.5). Одно из самых сильных изменений - подавление индукции ЬТШбО. Этот белок был идентифицирован ранее как GroEL. GroEL является одним из самых мажорных белков теплового шока в клетках Б.coli. Впервые он был обнаружен как хозяйский белок,строго необходимый для сборки головки фага лямбда.

Тот факт, что меркаптоацетат сильно подавляет индукцию БГШ83 у дрозофилы и GroEL у Е.соИ, позволяет высказать предположение о том, что белки являются функциональными аналогами. В пользу этого предположения можно привести следующие факты. В клетках E.coli обнаружен ген, гомологичный гену БГП183 дрозофилы. Этот ген кодирует белок с молекулярной массой 62 КДа. Оба белка образуют олигомеры: GroEL - семилучевую звезду (2x7 субъединиц), а БГШ63 - агрегаты. Любопытно, что GroEL катализирует сборку головки фага лямбда, а ЬТШВЗ образует комплексы с ррбО и рецептором стероидных гормонов.

рр601Аи рецептор стероидных гормонов после диссоциации из комплексов с НГШ83 активируются и приобретают сродство к мембране (ррбС>Т-или к ядру (рецептор стероидных гормонов). Возможно, ОгоЕЬ и БГШ83 нужны в клетке для сборки макромолекулярных комплексов.

- и -

3, Регуляция синтеза белков в бесклеточной системе трансляции при тепловом шоке

Известно, что при повышении температуры от 25°С до 37°С в клетках дрозофилы начинается эффективная трансляция вновь синтезированных мРНК белков теплового "гака. 3 течение 10-15 мин подавляется трансляция большинства предсуществовавших мРНК (нормальных мРНК) /Lind qui st s., 1986/. Нормальные мРНК при тепловом шоке не деградируют, их можно выделить из клеток в составе суммарного препарата цитоплазматических РНК и протранслировать в бесклеточной системе. После понижения температуры инкубации клеток до 25°С эти мРНК способны вновь транслироваться in vivo. Зти два факта явились четким указанием на существование в клетках механизма, обеспечивающего дискриминацию на уровне трансляции между мРНК белков теплового -дока и нормальны™ мРНК. Показано, что лидерные 5'-концевые последовательности мРНК БТШ70 и БТШ22 отвечают за преимущественную трансляцию этих мРНК в клетках при тепловом токе /ЫсСаггу T.G., Lindquist S., 1985/. Предполагается, что регуляция синтеза белков при тепловом -токе осуществляется на стадии инициации.

С другой стороны, анализ распределения полирибосом из клеток, подвергнутых тепловому иоку, обнаружил следующую картину. Сразу после повышения температуры до 37°С полирибосомы быстро распадаются, но затем постепенно восстанавливаются. Восстановленные полирибосомы содержат не только мРНК белков теплового шока, но и многие нормальные мРНК. На основании этого предполагается, что синтез белков при тепловом шоке регулируется не только на

Л Р1

Н I

о о

О <н £

О X S

К X

К S

ra s

о V,

я П

20 30

температура.

Рис.6. Зависимость скорости синтеза глобина в бесклеточной системе из ретикулоцитов от температуры. Бесклеточную систему, содержащую мРНК глобина кролика, инкубировали в течение часа при указанных температурах. Анализировали включениерс1 лейцина в белок в 5 мкл системы.

стадии инициации, но также на стадии элонгации.

В настоящей работе была исследована трансляция препарата РНК из эмбрионов дрозофилы, подвергнутых тепловому шоку, в бесклеточной системе из' ретикулоцитов кролика при двух температурах 34°С и 43°С (температура теплового шока для кролика).

Инкубация бесклеточной системы из ретикулоцитов кролика при температуре выше 40-42°С приводит к резкому снижению скорости биосинтеза белка (рис.6). В дальшйших экспериментах для изучения трансляционного контроля я выбрал 34°С как оптимальную температуру и 43°С как температуру теплового шока.

Далее было исследовано влияние температуры на синтез БГШ и нормальнцх белков дрозофилы в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика. Для трансляции использован препарат суммарной цито-плазматической РНК из эмбрионов дрозофилы, подвергнутых тепловому шоку. В таких препаратах присутствуют оба класса мРНК. Продукты трансляции этой РНК показаны на рис.7а. При оптимальной темпера-

34'

а

о л

2-,а 2со Рис.7. Влияние температуры на сш-' ' J тез белков дрозофилы в бескле-

точной системе из ретикулоцитов кролика /а/ и in vivo /6/. а/ -суммарный препарат цитоплазмати-ческои РНК из эмбрионов дрозофилы, подвергнутых тепловому шоку, "-бтш а з^ транслировали в бесклеточной сис-

-бтш теме из ретикулоцитов кролика при

-rrafis— в 34 С и 43 С в течение Г часа

б/ - слюнные железы дрозофилы метили [Зз^метионином при 2э С и 37 С. Образцы подвергали электрофорезу. Показаны авторадиограммы.

ллп 23.^ -5ТИ 2г-""

туре /34°С/ в системе синтезируются как нормальные белки, так и белки теплового шока. При 43°С синтез нормальных белков подавляется, а синтез белков теплового шока остается на прежнем уровне. Таким образом, дискриминацию в трансляции нормальных мРНК и мРНК белков теплового ;нока можно воспроизвести in vitro даже в столь гетерологичной системе.

43° 34° 43° 34°

яипоксигенаэа

глобин

суя ер- фракция фракпия I супор-

натлнг | рибосом рибосом | натант

Рис.8. Влияние температуры инкубации бесклеточной системы на наборы вновь синтезированных белков во фракциях рибосом и пострибосомного супернатанта. Бесклеточную систему трансляции, содержащую РНК дрозофилы /а/ или эндогенные мРг!:С /б/ инкубировали при 34 С или 43 С в течение I часа. Смесь разделяли на фракции рибосом и пострибосомного супернатанта. Образцы подвергали электрофорезу. Показаны авторадиограммы. на дорожку наносили 1/5 часть /а/ или 1/2 часть /о/ осадка рибосом и 1/10 часть /а/ или 1/35 часть /б/ объема супернатанта.

34 43 34° 43

Следует, однако, отметить, что синтез нормальных белков в в клетках дрозофилы при 37°С подавляется сильнее, чем это происходит в ретикулоцитной бесклеточной системе при 43°С (сравни рис.7а и 76). Дальнейшее повышение температуры инкубации бесклеточной системы /выше 43°С/ не увеличивает степень дискриминации, а ведет к пропорциональному подавлению синтеза всех белков.

Интересно, что скорость синтеза полифенилаланина на поли(У)-матрице в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика при 43°С в 3-5 раз выше, чем при 34°С. Можно предположить, что трансляция природных мРНК при 43°С подавляется либо на стадии инициации, либо на стадии терминации, или, наконец, на обеих стадиях одновременно. В том случае, если синтез нормальных белков дрозофилы в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика при 43°С избирательно подавляется на стадии терминации, можно ожидать, что завершенные полипептидные цепи будут находиться в ассоциации с рибосомами, но будут отсутствовать во фракции свободных белков. Анализ набора меченых белков из фракции рибосом и из фракции пострибосомного супернатанта показан на рис.8. После инкубации бесклеточной системы при 34°С во фракции свободных белков обнаруживаются как нормалные белки, так и БГШ. После инкубации бесклеточной системы при 43°С в этой фракции присутствуют только высокомолекулярные БГШ. С другой стороны, при обеих температурах во фракции рибосом среди меченых полипептидов видны как БГШ, так и многие нормальные белки.

В следующем эксперименте было исследовано влияние температуры на трансляцию эндогенных мРНК ретикулоцитов кролика in vitro. Основными продуктами трансляции эндогенных мРНК ретикулоцитов являются ofr и ^-глобины /505-У и липоксигеназа /около 496/. Бесклеточную систему, содержащую эндогенные мРНК, инкубировали при 34°С или 43°С, а затем фракционировали на рибосомный осадок и суперна-тант. Повышение температуры от 34°С до 43°С приводит к значительному угнетению белкового синтеза. Во фракции рибосом при обеих температурах обнаруживаются соизмерите количества зрелых липок-сигеназы и глобина. В супернатанте системы, инкубированной при 43°С, количество зрелого глобина сильно уменьшено по сравнению с контролем /34°С/, а липоксигеназа вообще не обнаруживается (рис.8). Таким образом, подобно нормальным белкам дрозофилы белки ретикулоцитов кролика, синтезированные при 43°С in vitro, задерживаются на рибосомах.

Риц.9. Хроматография меченых при 43 С полипептидов из фракции рибосом на ДЭАЭ-целлюлозе.р5з]меченые полипептиды из осадка рибосом (такого же, что и на рис.86 43 С) раствором, содержащим 4М мочевины и ЗМ ЫС1. Экстрагированный материал хромато-графировали на ДЭАЭ-52 в денатурирующих условиях.

на рибосомах при 43°С, экстрагировали из осадка рибосом и разделяли на свободные белки и пепти-дил-тРНК методом хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. В этих условиях свободные белки не задерживаются на смоле, а пептидил-тРНК адсорбируется и может быть элюирована буфером с повышенной ионной силой. Результат показан на рис.9. Практически весь меченый при 43°С белок из фракции рибосом ведет себя как пептидил-тРНК.

Таким образом, в опытах с бесклеточной системой трансляции показано, что при трансляции шоковых и нормальных мРНК при 43°С наблюдается избирательное подавление синтеза нормальных белков, в то время как белки теплового шока продолжают эффективно синтезироваться. Некоторое количество достроенных нормальных белков обнаруживается во фракции рибосом в виде гопщцил-тРНК и не появляется в супернатанте. Это говорит о том,что при тепловом шоке избирательное выключение синтеза нормальных белков происходит на стадии терминации или на последних шагах элонгации.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что в клетках дрожжей при тепловом шоке накапливается диаденозинтрифосфат. Показано, что при тепловом шоке внутриклеточная концентрация АрррА возрастает до 30 мкМ, Предполагается, что АрррА является сигналом для синтеза некоторых белков теплового шока.

2. Исследовано влияние зн-восстанавливанщих реагентов на синтез белков теплового шока в клетках дрозофилы. Показано, что меркаптоацетат и Н-метилмеркаптоацетамид избирательно подавляют

нсмзр фракции

Меченые белки, задержанные

индукцию синтеза ЕГШ83 и БГШ 22-28. Установлено, что синтез БГШ83 подавляется на стадии транскрипции, а синтез БГШ 22-28 на стадии промежуточной между транскрипцией и трансляцией.

3. Изучено влияния температуры на трансляцию мРНК из эмбрионов дрозофилы, подвергнутых тепловому шоку, в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика. Показано, что:

а/ при 34°Св бесклеточной систеце синтезируются как белки теплового шока, так и нормальные белки, б/ при 43°С (температуре теплового шока, для кролика) избирательно подавляется синтез нормальных белков на фоне продолжающегося синтеза белков теплового шока, в/ некоторое количество нормальных белков дрозофилы, синтезированных in vitro при 43°С, обнаруживается во фракции рибосом.

4. Исследовано влияние температуры на трансляцию эндогенных мРНК в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика. Показано, что синтез всех белков подавляется в 5-10 раз при повышении температуры до 43°С. Это подавление коррелирует с задержкой вновь синтезированных белков на рибосомах.

На основании данных, полученных в бесклеточной системе трансляции, предполагается, что синтез нормальных белков при тепловом шоке подавляется на стадии терминации или на последних шагах элонгации.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Денисенко О.Н. Синтез алармона А(5»)ррр(5')А в дрожжах при тепловом шоке. - Тез. докл. 4го симп. СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке", Киев, 1984.

2. Денисенко О.Н. Регуляция синтеза белков в бесклеточной системе при тепловом шоке. - Докл. АН СССР, 1987, т.297, с.725-727.

3. Penisenko O.N. Synthesis of diadenosine-5' ,5"'-P1 .^-triphosphate in yeast at heat shook. - FEBS Lett., 1984, v.178,

p.149-152.

T-04449 15.01.88 г. Зак.795Р Тир.125 экз. Уч.изд.л.-I.0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ НЦБИ