Анализ транскрипции суффикса-короткого ретроэлемента из генома D. Melanogaster

Кретова, Ольга Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ транскрипции суффикса-короткого ретроэлемента из генома D. Melanogaster
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ транскрипции суффикса-короткого ретроэлемента из генома D. Melanogaster"

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ.В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

КРЕТОВА Ольга Валерьевна

АНАЛИЗ ТРАНСКРИПЦИИ СУФФИКСА -КОРОТКОГО РЕТРОЭЛЕМЕНТА ИЗ ГЕНОМА О.МЕ1ЛУОСАЗТЕЯ

Специальность 03.00.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2006

Работа выполнена в лаборатории организации генома Института молекулярной биологии им, В.А.Энгельгардта РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Н.А.Чуриков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Д.А.Крамеров (Институт молекулярной биологии РАН)

кандидат биологических наук

А.И.Калмыкова (Институт молекулярной генетики РАН) Ведущая организация : Институт биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится —2006 г. в на заседании

Диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул.Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН

Автореферат разослан —2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета А Кандидат химических наук ^-лУ

рицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Существует две точки зрения на роль мобильных элементов в геномах эукариот.

Одна из них предполагает, что они являются геномными паразитами и клетка вынуждена защищаться от них и их нежелательной экспрессии. Согласно другой, мобильные элементы привносят в геном повторяющиеся последовательности, необходимые для образования гетерохроматиновых областей, а также различные регуляторные последовательности, находящиеся в их составе, такие как промоторы, инсуляторы и другие, которые клетка использует для регуляции своих генов. Обе точки зрения подкреплены фактами. С одной стороны, накопление мобильных элементов может причинить вред хозяйской клетке, а с другой стороны они могут использоваться клеткой для регуляции работы генов и служить материалом и фактором эволюции.

В геноме дрозофилы обнаружено более десяти семейств LINE и только один короткий ретроэлемент (SINE) - суффикс. Поэтому исследование свойств суффикса, в частности, его транскрипции и возможного происхождения, представляет большой интерес. Ранее по поводу происхождения коротких ретроэлементов в разных геномах было высказано два предположения. Согласно первому из них, ДНК-интермедиаты обратной транскрипции LTR-содержащих ретроэлементов, использующих в качестве праймера тРНК, были внедрены в 3' концевые области LINE (Ohshima et al., 1996). Вторая гипотеза, подкрепленная некоторыми экспериментальными данными, предполагает, что при обратной транскрипции РНК LINE обратная транскриптаза "перепрыгивает" на тРНК или на 5S РНК матрицы (Szafranski et al, 2004). Но полной ясности в этом вопросе пока нет.

Транскрипция мобильных элементов часто осуществляется в двух противоположных направлениях — или из-за присутствия внутренних смысловых и антисмысловых промоторов, как в случае с F-элементом (Minchiotti and Di Nocera, 1991), или в результате инсерции мобильного элемента в различных ориентациях так, что его транскрипция попадает под контроль какого-то внешнего промотора.

Тем самым появляется возможность образования дсРНК и, следовательно, запуска РНК-интерференции.

Сама РНК-интерференция, регулирующая экспрессию многих генов, тоже может регулироваться, что впервые обнаружено в ходе настоящей работы. Недавно обнаружено, что паттерн экспрессии miPHK меняется как в развитии, так и во время физиологических процессов (Не and Наппоп, 2004). Это согласуется с нашими данными о регуляции РНК-интерференции. В пользу возможности регуляции РНК-интерференции также свидетельствуют недавние данные о ее ингабировании в растениях (Baulcombe and Molnar, 2004). Данные о регуляции РНК-интерференции в животных клетках важны как с фундаментальной, так и с прикладной точки зрения, так как в настоящее время активно ведутся исследования по использованию РНК-интерференции в генотерапии различных болезней человека.

Цель и задачи исследования

F-элемент и суффикс - первый известный пример родства LINE/SINE (Tchurikov et al, 1986; Di Nocera and Casari, 1987), 3' область F-элемента соответствует короткому ретроэлементу суффиксу. Позже были описаны многочисленные примеры пар LINE/SINE в разных геномах (Okada N. Et al, 1997).

Целью настоящей работы было изучение на разных стадиях развития транскрипции короткого ретроэлемента - суффикса - из генома Drosophila melanogaster. Были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ транскриптов с обеих цепей суффикса на разных стадиях развития дрозофилы и сравнить их с соответствующими паттернами транскрипции F-элемента.

2. Выяснить, имеет ли F-элемент 3'-концевой промотор, с которого мог бы исходно транскрибироваться суффикс.

Научная новизна и практическая ценность работы

Обнаружены смысловые и антисмысловые транскрипты суффикса и F-элемента

на всех стадиях развития дрозофилы. Впервые обнаружено, что РНК-интерференциия регулируется в развитии. Обнаружен промотор РНК-полимеразы II на 3'-конце F-элемента, по силе сопоставимый с промотором LTR-содержашего ретроэлемента дрозофилы burdock. Впервые показано, что короткие ретроэлементы

(SINE) могут происходить из родственных им длинных элементов (LINE) путем транскрипции их З'-концевых областей с помощью РНК полимеразы II с внутренних промоторов.

Обнаружено, что суффикс-специфическая РНК-интерференция сопровождается деградацией 3'-концевой области мРНК F-элемента, соответствующей суффиксу и содержащей последний домен обратной транскригггазы, стоп-кодон, сигнал и сайт полиаденилирования. Таким образом, SINE-специфическая РНК-интерференция приводит к сайленсингу родственного LINE. Известно, что мРНК нередко содержат последовательности SINE в 5'- и З'-некодирующих областях. На основании этих фактов предложена модель концертной регуляции генов. Согласно данной модели в результате SINE-специфической РНК-интерференции может одновременно выключаться экспрессия разных генов.

Данные о регуляции РНК-интерференции свидетельствуют о том, что при наличии дцРНК не всегда следует ожидать безусловного сайленсинга соответствующих генов. Это необходимо учитывать при использовании РНК-интерференции для целей генной терапии, направленной на сайленсинг генов, вовлеченных в развитие той или иной патологии.

Апробапия диссертации

Данные, представленные в работе, докладывались на симпозиуме "Molecular

Evolution" (Сорренто, 13-16 июня, 2002), на XIX International Congress of Genetics (Мельбурн, Австралия, 6-11 июля, 2003), на рабочих совещаниях CRDF: "Design of DNA constructs for silencing of HIV-1 genes" (Москва, 16 августа, 2004) и "Use of RNA Interference for Development of Efficient AIDS Therapies" (Москва, 15 ноября, 2004), a также были представлены на 7-ой международной энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (Суздаль, Россия, 28 ноября - 2 декабря, 2004).

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 80 страницах, содержит 20 рисунков, состоит из введения,

обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения и выводов. Список литературы цитирует 169 работ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Паттерны транскрипции суффикса и F-элемента различны

Транскрипты с обеих цепей суффикса и F-элемента анализировали методом Нозерн-гибридизации на препаратах РНК, полученных на разных стадиях развития дрозофилы, и in situ гибридизации на препаратах семенников и яичников. Ниже представлены результаты гибридизации пары идентичных блот последовательно с 32Р-мечеными РНК-зондами, соответствующими смысловым и антисмысловым цепям суффикса и F-элемента (рис. 2).

| | Суффикс (0,35 тан) <-►

Р-элемент(1,5 тпн)

Рис.1. Области F-элемента, клонированные в составе pGEM-векторов для синтеза 32Р-меченых РНК-зондов

Зонды синтезировали с помощью РНК-полимеразы Т7 на субклонированных в pGEM-векторах соседствующих областей F-элемента, содержащих область суффикса или рядом расположенную 1,5 тпн область F-элемента (рис.1). Гибридизацию и отмывку проводили в жестких условиях. В предварительных экспериментах было выяснено, что в данных условиях сигнал от дивергированных копий суффикса (например, в Doc-элементе) не замечается.

Сначала проводили гибридизацию с суффикс-мечеными пробами (смысловыми и антисмысловыми, рис.2, левая половина).

32 Р- виЩ 38 32 Р- виЯЬс, 8

Е Ь Р I El.PI

300-

ЬатсНр!»

Ь ТВ». *

-г ' ■ >

ашмаж

Р-Яа$

Е I. Р I Е Ь Р I

мме

ЬгтоДО

Рис.2. Гибридизация с згР-мечеными суффикс-специфическими и К-элемент-специфическими РНК-пробами. Количества РНК на дорожках оценены с помощью гибридизации с гр49-зондом. в-смысловая РНК, а$ - антисмысловая РНК. Препараты поли(А)" -и поли(А)+РНК ("-" и "+" - на старте дорожек) выделяли из эмбрионов, личинок, куколок и имаго (Е, Ь, Р, I, соответственно). Указан транскрипт длиной около 300 н. Справа нанесены позиции РНК-маркеров ("Реди1аЬ") в нуклеотидах.

Суффикс-специфическая антисмысловая РНК-проба (аэРНК) выявляет яркую полосу длиной около 3000 нуклеотидов как в поли(А)+, так и в поли(А)- препаратах РНК, полученных на разных стадиях развития дрозофилы. Суффмкс-специфическая смысловая РНК-проба (бРНК) выявляет в основном полиаденилированные транскрипты, что, видимо, отражает наличие суффикса в некоторых генах и(или) синтез антисмысловых транскриптов Б-элемента.

Те же блоты гибридизовали повторно. Перед этим меченую РНК после первой гибридизации полностью удаляли (кипячением в 0,05% БББ), что контролировали с помощью радиоавтографии. Вторую гибридизацию проводили в прежних условиях, но с пробами, соответствующими Б-элементу. Результаты гибридизации приведены на рис.2 (правая половина).

При сравнении результатов гибридизаций с суффикс- и Р-специфическими аяРНК-пробами хорошо видно, насколько различны паттерны гибридизации последовательностей, расположенных в соседствующих фрагментах Р-элемента.

Одно яркое отличие заключается в том, что смысловые транскрипты F-элемента в основном полиаденилированы. Другое отличие состоит в том, что только слабая полоса длиной около 4700 пн, заметная на оригинальных радиоавтографах и соответствующая полноразмерной мРНК F-элемента, обнаруживается суффикс-специфической 32Р-меченой asPHK. Эта полоса является самой яркой на блоте, гибридизованной с F-специфической asPHK (рис.2).

Заметно различаются и паттерны гибридизаций смысловых суффикс- и F-элемент -специфических РНК-проб, детектирующих антисмысловые транскрипты.

Паттерны экспрессии обоих элементов также анализировали методом гибридизации in situ на препаратах герминативных органов дрозофилы. Для этого яичники и семенники, полученные из взрослых мух той же линии, что использовалась для анализа транскрипции методом Нозерн-гибридизации, гибридизовали с DIG-мечеными смысловыми и антисмысловыми суффикс- и F-элемент специфическими РНК-пробами - теми же последовательностями, что были взяты в качестве зондов для Нозерн-гибридизации (рис.1).

Яичники

Рис.3. F-э. содержащие транскрипты яичниках

F-элемент-

семенниках. А,С и

В,В- гибридизация с антисмысловой и смысловой F-элемент специфической РНК-пробой,

Семенники

соответственно. 1 -локализация

ющих клеток; 2 — транскрипция в соматических фолликулярных клетках, покрывающих ооцит. СиО - стрелками показана локализация транскриптов в цистах, образованных первичными сперматоцитами.

транскриптов в

цитоплазме пита-

Рис.4. Суффикс-

содерзкащие

транскрипты в яичниках и семенниках. А,С и B,D -

гибридизация с

ашисмысловой и

смысловой суффикс-

специфической РНК-пробой, соответственно. Обозначения такие же, как на рис.3.

При анализе in situ гибридизаций (рис. 3 и 4) видно, что смысловые и антисмысловые транскрипты каждого элемента в герминативных органах мух имеют сходную локализацию: в яичниках они обнаруживаются в цитоплазме питающих клеток (nurse cells) и в соматических фолликулярных клетках; в семенниках видны в виде цист, образованных первичными сперматоцитами, в апикальной части семенников, содержащей стволовые герминативные клетки, они отсутствуют. Если сравнивать между собой in situ паттерны как смысловых, так и антисмысловых транскриптов суффикса и F-элемента в яичниках, то можно заметить некоторые различия, хотя и не так ярко выраженные, как в случае Нозерн-гибридизации. Видно, что обе цепи суффикса активнее экспрессируются в цитоплазме питающих клеток, чем в соматических фолликулярных клетках, а обе цепи F-элемента - наоборот (части А и В рис. 3 и 4).

2. Обнаружен короткий транскрипт суффикса в куколках

На рис. 2. виден короткий поли(А)+ смысловой транскрипт суффикса длиной около 300 н. Он соответствует ожидаемой длине полноразмерной РНК, синтезируемой на транскрипционно активной копии суффикса, и обнаруживается только в куколках. Интересно, что он обнаружен только в одной из нескольких

Семенники

к?1 - < - j

лабораторных линий, исследованных нами. На рис. 7 (см. ниже) 300 н транскрипт (как в поли(А)+, так и в поли(А)" препаратах РНК) виден еще в мухах, и в культуре клеток Schneider 2.

3. Обе цепи суффикса и F-элемента транскрибируются

На рис. 2. видно, что гибридизуются обе суффикс-специфические 32Р-РНК-гтробы. Это свидетельствует о том, что на всех стадиях развития дрозофилы присутствуют смысловые и антисмысловые суффикс-специфические РНК.

Гибридизация in situ с DIG-мечеными суффикс- и F-элемент-специфическими РНК-пробами подтверждает данные, полученные с помощью Нозерн-анализа -смысловые и антисмысловые транскрипты этих элементов распределены сходно ( рис. 3 и 4).

4. Суффикс-специфические siPHK обнаружены только в куколках

Таким образом, в клетке могут образовываться дцРНК, способные запускать механизм специфической деградации родственных последовательностей с помощью РНК-интерференции. Для проверки возможности запуска РНК-интерференции мы провели поиск продуктов РНК-интерференции с помощью Нозерн-блот-гибридизации. Препараты тотальных РНК дрозофилы, соответствующие разным стадиям ее развития, фракционировали в 15% акриламидных денатурирующих гелях и переносили на фильтр HybondN+ с помощью электроблоттинга. В качестве маркеров длины использовали 25- и 14-нуклеотидные 32Р-меченые run-off транскрипты, синтезированные на pGEM-1 векторе, переваренном рестргостазами Smal или EcoRl, с помощью РНК-полимеразы Т7.

М Е 1_ Р I

^ ^ — 1 23 -

Рис. 5 Анализ миРНК. В качестве маркера (М) использовали 32Р-меченые 25- и 14-нуклеотидные РНК. На дорожке М представлено фракционирование смеси исходных меченых РНК с деградированной 25-нуклеотидной РНК. Указаны размеры РНК в нуклеотидах. Количество РНК на дорожках оценено с помощью гибридизации с 5,8Б РНК, имеющей длину 123 нуклеотида

На рис. 5. представлены результаты блот-анализа. Гибридизацию проводили с тотальной РНК, полученной на разных стадиях развития дрозофилы. В качестве зонда использовали 32Р-меченую суффикс-специфическую антисмысловую РНК. Видно, что только на стадии куколок обнаружены з1РНК (малые интерферирующие РНК) длиной 21-25 нуклеотидов, что характерно для РНК-интерференции. Причем это не связано с тем, что препарата РНК куколок было нанесено больше. Как следует из рис. 5, количества РНК, оцененные гибридизацией с 5,88 рибосомной РНК, примерно одинаковы на всех дорожках. Эти результаты были получены в экспериментах с различными препаратами тотальной РНК. Хотя $РНК и аэРНК присутствуют на всех стадиях развития дрозофилы, продукты РНК-интерференции обнаружены только на одной из них - на стадии куколок.

Так как суффикс локализован на 3'-конце Р-элемента, то можно предположить, что в результате суффикс-специфической РНК-интерференции в куколках могут существовать транскрипты Б-элемента, лишенные 3'-концевой области.

5. Обнаружены транскрипты Е-элемента без области суффикса

Для проверки вышеуказанного предположения был использован З'ЯАСЕ-подход. Для клонирования 3'-концов транскриптов Р-элемента, не имеющих суффикса и лишенных поли(А)-хвоста, поли(А)-последовательность была добавлена на З'-конец поли(А)" РНК куколок с использованием поли(А)-полимеразы из дрожжей (рис. 6, А) А

«—— ААААА ро!у(А)-ро1утегазе

. ААААА . 11111

ЯТ-РСГ?

Р+зиГПх

(ЗАСЗСАСААТСААА. . . АОСАаССГОСАСАСССАССССААССАССТАвССССА. . З'сОЫА-З

ОАСЗСАСААТСААА...АвСааааааааааааааааааааааааааааа 3'сОЫА-5

(ЗА(ЗСАСААТСААА. . .АвСААССаааааааааааааааааааааааааааа 3'сОЫА-16

(ЗАС5САСААТСААА. . . А6СААСС!ГГСАСАС6Саааааааааааааааааааа. .

Рис. 6. Схематически представлена процедура З'-КАСЕ (А) и клоны, гибридизующиеея с Е-элемент-специфической пробой (В). До многоточия приведена последовательность Р-элемента, после многоточия - суффикса. Курсивом показан НшЦП-сайт на 5'-конце суффикса, строчными буквами - добавленнаяс помощью поли(А)-полимеразы поли(А)-последовательность.

Специфический праймер для обратной транскрипции (5' ОАССАСААТСАААОАТТСТСАОААССАТСА 3') соответствовал области 120 пн выше от последовательности суффикса в Б-элементе. Клонирование ПЦР-продуктов проводили в рис 12 векторе по ЕсоМ-втаГ сайтам. Для со1опу-гибридизации в качестве зондов использовали меченые Р-элемент-специфические олигонуклеотиды, соответствующие области 80 пн выше от последовательности суффикса в Р-

элементе, и суффикс-специфические пробы. Отбирали клоны, гибридизующиеся только с F-элемент специфической пробой.

В результате были отобраны 3 клона, в которых отсутствует суффикс. Найдено, что последовательность суффикса отсекается в трех разных, но близкорасположенных местах в самом начале его последовательности в мРНК F-элемекта (рис. 6, В).

Тот же самый подход был применен к поли(А)" препаратам РНК, выделенными из эмбрионов, личинок и взрослых мух. Но в этих случаях были получены только те транскрипты F-элемента, которые содержали полную суффикс-последовательность и поли(А)-хвост. Эти данные заставили вернуться к результатам Нозерн-гибридизации, представленным на рис. 2. При гибридизации с антисмысловой F-специфической РНК при длительной экспозиции заметен полноразмерный смысловой транскрипт F-элемента на дорожке, содержащей поли(А)" РНК куколок. Вместе с результатами 3'RACE анализа это свидетельствует о том, что РНК-интерференция запускается на стадии куколок и в результате образуются 3'-усеченные копии F-элемента. 6. Паттерн транскрипции суффикса изменился в ходе длительного ведении изучаемой линии дрозофилы

Линию Oregon, на которой изучали транскрипцию суффикса и F-элемента (Oregon 01),

продолжали вести, и спустя 5 лет после получения первых паттернов экспрессии (рис. 2) снова был проведен Нозерн-блот анализ транскриптов суффикса в куколках и имаго. Кроме того, исследовали транскрипцию суффикса в культуральных клетках дрозофилы Schneider 2. На рис. 7 показаны результаты этого эксперимента. Электрофорез проводили в 6% полиакриламидном геле. После электроблоттинга блоту гибридизовали со смысловой и антисмысловой 32Р-мечеными суффикс-специфическими РНК-пробами. Прежде всего обращает на себя внимание полоса размером около 300 н, присутствующая теперь как в поли (А)+, так и в поли(А)" препаратах РНК во всех исследуемых образцах - в куколках, имаго и культуре клеток, соответствующая по длине полноразмерной копии суффикса. Она очень яркая в смысловых транскриптах и менее выражена в антисмысловых. На Нозернах, представленных на рис. 2 (левая половина), в этой области видна "смазанная" вниз

полоса, так как гибридизация проводилась после электрофореза в агарозном геле. Тогда она была обнаружена только в полиаденилированных транскриптах и только на стадии куколок. В поли(А)+ препаратах РНК куколок и поли(А)" мух видна

3,Р-суффнкс-ас

nt.

32Р-суффнк~с-с

kyitn.tkii """ sriiimjd».- ? + - + . + . тот.

5001 ЗОО . 200.

Рис. 7. Гибридизация двух идентичных половин одной б% ПААГ-блогы с 33Р-мечеными суффикс-специфическими РНК-пробами (смысловой и антисмысловой, с и ас). Препараты полн(А)- и поли(А)+ РНК выделялись из куколок и мух линии Oregon 01 (обозначения и "+" на старте дорожек), а также из культуры клеток дрозофилы Schneider 2 (нанесена также и тотальная РНК — тот. на старте). Показаны позиции РНК-маркеров ("Pequlab"). Красная стрелка указывает на 300 н транскрипт. Рамкой выделена "лестница" из низкомолекулярных транскриптов.

"лестница" из низкомолекулярных транскриптов (ниже 200 н) - как в смысловых, так и в антисмысловых транскриптах. Предполагается, что эти полосы соответствуют промежуточным продуктам деградации мРНК в процессе РНК-интерференции, которые, по-сравнению с данными, полученными ранее для этой же линии (рис. 5), теперь обнаруживаются и в имаго. Хотя паттерны экспрессии изменились с течением времени, нельзя не заметить симметрию в распределении смысловых и антисмысловых транскриптов - также, как и на "старых" Нозернах. 7. F-элемент имеет З'-концевой внутренний промотор

Для того, чтобы выяснить, имеет ли F-элемент З'-концевой промотор, с которого мог бы исходно транскрибироваться суффикс, мы предприняли поиск промоторной

активности во фрагментах ДНК, расположенных на границе Б-элемента и суффикса. На рис. 8 показаны фрагменты ДНК, которые были выбраны для поиска в них промоторной активности.

HiMIM F element J

(3159. .3443) (3159..3363) С (3159..3293) С (3293-3363) (3363..3443)

285 205 135 70-HIII

Рис. 8. Фрагменты ДНК Р-элемента, выбранные для поиска промоторной активности. Стрелка показывает позицию НшПП сайта, расположенного в 5' концевой области суффикса. Слева указаны границы фрагментов ДНК согласно нумерации копии Б-элемента Р\у (АС#М17214). Справа приведены обозначения фрагментов (цифры указывают длины фрагментов в пн). Белые прямоугольники соответствуют областям Р-элемента, а зачерненные - областям суффикса

Эти фрагменты клонировали в векторе, содержащем репортерный ген

люциферазы.

Д . to-imfy ЗМС

pGL3-ad3'

p-hsp-liRL-acti

Рис. 9. Векторы, сконструированные для поиска промотора: А - вектор, содержащий ген люциферазы светлячка (Fire fly), создан на базе вектора pGL3-Enhancer (Promega), в который была вставлена область З'-трейлера и поли(А)-сайта из гена актина 5С дрозофилы (3'act-5C) в достроенный до тупого сайт ХЬа\ исходного вектора. Полученный вектор, названный pGL3-act-3', использовался для клонирования фрагментов, указанных на рис. 8. Плюс цепи фрагментов вставляли перед геном lue (позиции вставок указаны стрелкой) по сайтам Kpnl-Bglll вектора. Для сравнительной оценки силы промоторов в одной из конструкций перед геном lue вставили промотор bsp70 дрозофилы. В - вектор для контроля трансфекции, создан на базе вектора phRL-null (Promega), содержащий ген люциферазы коралла (Renilla reniformis). В данный вектор были вставлены промотор hsp70 дрозофилы и область 3'act-5C. Данный вектор был назван phsp-hRL-act3'.

Данный вектор (рис. 9, А) позволяет заметить даже слабые промоторы, поскольку он практически не имеет фоновой активности люциферазы. В нем в качестве

репортерного гена использовался ген люциферазы светлячка (Fire fly). Для контроля эффективности трансфекции культуральных клеток дрозофилы Schneider 2 был сконструирован другой вектор, содержащий ген люциферазы из коралла (Renilla), находящийся под контролем промотора hsp70 дрозофилы (рис. 9, В). В оба вектора были вставлены фрагменты, содержащие сигналы и сайты полиаденилирования дрозофилы из гена act-5C. Длины волн биолюминесценции, наблюдаемой при экспрессии данных люцифераз, различаются. Поэтому в одной пробе можно количественно, с высокой чувствительностью и воспроизводимостью оценить экспрессию конструкций.

В экспериментах по котрансфекции в семи независимых экспериментах выявили минимальный промотор длиной 205 пн, расположенный на стыке F элемента и суффикса. Он содержит 124 пн из F элемента и 81 пн из 5' концевой области суффикса (рис. 8) и способен запускать экспрессию люциферазы светлячка.

Сравнительную силу данного промотора оценивали по активности неиндуцированного теплом промотора hsp70 в том же векторе. Оказалось, что выявленный промотор имеет около 3% активности промотора hsp70. Ни один из фрагментов, соответствующих только суффиксу или F элементу, не обладает способностью транскрибировать репортерный ген (рис. 10).

4,0-

з.о-

о г— о.

J 2,0-] а?

1.0-

285 205 135 70-HIII 80

Рис. 10. Результаты экспериментов по котрансфекции. Приведены данные относительной активности в % к активности неиндуцированного промотора Ьяр70. Числа на оси абсцисс соответствуют фрагментам, выбранным для поиска промоторной активности (рис. 8).

Таким образом, на стыке F элемента и суффикса имеется внутренний промотор, с которого может происходить синтез суффикс-специфических коротких транскриптов.

Так как F-элемент в данной области не имеет мотивов, характерных для промотора РНК-полимеразы III, было предположено, что с этого промотора работает РНК-полимераза II.

Известно, что промоторы РНК-полимеразы II активизируются энхансерами. Поэтому было решено проверить, усиливает ли какой-либо 91/с-действующий энхансер транскрипцию с обнаруженного нами промотора. Для этого мы вставили энхансер из LTR-содержащего ретротранспозона дрозофилы copia, enh(copia), в конструкцию, содержащую минимальный 205 пн промотор (рис. 11).

Рис. 11 Конструкции, созданные для оценки влияния энханссра из мобильного элемента copia на уровень транскрипции с З'-концевого промотора F-элемента. Стрелкой вплотную к гену luc-firefly показано положение тестируемого промотора (рис. 9, А). Вторая стрелка указывает на место инсерции энхансера из copia - данный фрагмент был вставлен в сайт BamHl вектора p-205-GL3-act3\ а также векторов p-135-GL3-act3' и p-70-HIII-GL3-act3' (рис. 8).

В экспериментах по трансфекции культуры клеток дрозофилы Schneider 2 конструкциями enh(copia)-205 мы обнаружили 3-кратное усиление экспрессии гена люциферазы светлячка (рис. 12).

«ООО -

3SOO -

fb SOOO -

1 2800-

es 2 ООО

э 1600

Ê ¡Г 1000-

LTR

enh-205

205

-r

enh-135 enh-70-HIM

Рис. 12. Влияние энхансера из мобильного элемента copia на уровень транскрипции с 3'-концевого внутреннего промотора F-элемента 205 пн. Для сравнения приведены результаты экспериментов по трансфекции конструкциями, в которых действие этого же энхансера было направлено на 5'- и 3'-части промотора (соответственно, enh-135 и enh-70-НШ). Для сравнительной оценки силы 205 пн промотора использовали конструкцию с промотором из ретротранспозона burdock (LTR).

Уровень транскрипции с данного внутреннего З'-концевого промотора низок, но усиленный энхансером из copia, он сопоставим с уровнем транскрипции промотора из LTR-ретротранспозона дрозофилы burdock (репейник). Конструкция, содержащая LTR burdock, была использована в аналогичных экспериментах для оценки силы обнаруженного нами промотора. Как и ожидалось, экспрессия гена люциферазы светлячка не была обнаружена в экспериментах по трансфекции конструкциями enh(copia)-\35 или enh(copia)-70-НП1, содержащими 5' или 3' участки обнаруженного промотора. Только конструкция, содержащая минимальный (205 пн) промотор, отвечает на воздействие энхансера.

Предположение об участии РНК-полимеразы II в работе данного промотора было независимо подтверждено в экспериментах с а-аманитином (рис. 13). Видно, что при добавлении а-аманитина до концентрации 5-10 мкг/мл наблюдается существенное ингибирование синтеза транскриптов репортерного гена с минимального промотора.

Вместе с предыдущими результатами эти данные убедительно свидетельствуют о том, что Б-элемент действительно обладает внутренним 3'-концевым промотором РНК-полимеразы II, и что этот промотор может обеспечивать синтез коротких транскриптов суффикса и, как возможное следствие, интеграцию новых его копий в геном дрозофилы.

Концентрация а-аманитина (ng/ml)

Рис. 13. Результаты эксперимента по влиянию а-аманитина на экспрессию конструкции enh(copia)-205 в культуре клеток Schneider 2. После добавления полной среды в ходе трансфекции к клеткам был добавлен а-аманитин (водный раствор, фирмы Boehringer) до концентрации 5 мюг/мл и 10 мкг/мл. 10* означает, что а-аманитин (до концентрации 10 мкг/мл) был добавлен не сразу, а спустя 16 час инкубации при 25°С. Интенсивность свечения во всех четырех случаях измерялась через 48 час после трансфекции.

8. Старт транскрипции суффикса с З'-концевого промотора в Г-элементе совпадает с началом суффикса

Для поиска возможного старта транскрипции суффикса были проведены эксперименты по удлинению суффикс-специфического праймера на матрице поли(А)-содержащей РНК, выделенной из куколок, где ранее были обнаружены короткие транскрипты суффикса (рис. 2).

На рис. 14 приведены результаты такого эксперимента. Согласно этим данным, имеются основной и минорный старты транскрипции. Они находятся в пределах

обнаруженного нами внутреннего промотора. Позиция основного старта соответствует ранее описанной границе отдельных копий суффикса (Tchurikov et al., 1986).

, _ ACGT-j л Рис- Определение старта

l¿ О 4 транскрипции суффикса с 3'-

, - ка ч1 концевого промотора в F-

элементе. Праймер,

' • комплементарный плюс цепи

..' ™ ■ ч суффикса (5'

' '' CGCTAGGTGGTTGGGGTGCG

, < 3'), метили по 5'концу Т4-

полинукпеотид-киназой, ^ 1 * отжигали с препаратами РНК,

> i выделенными из куколок, и

удлиняли в реакции с обратной * 4 транскриптазой M-MLV

' , 0 (Promega). Приведены

» • •*»■ ^ " ' результаты двух

, - , ' экспериментов: с препаратами

[ " ' * 4 . ' поли(А)+РНК (дорожки 2 и 3) и

L ¿ ■ ' \ - ' поли(А)-ГНК (дорожки 1 и 4,

i & - . А ■ • фа.. негативный контроль). Рядом

' L \ -г;'* , представлен сиквенс 3'

! 4 ~~ , концевой области F-элемента с

Í , „ * * is i • этого же праймера. Основной и

минорный старт-сайты указаны стрелками. Ниже представлен текст минимального промотора длиной 205 пн.

Последовательность суффикса 31SS gcgagc^á|:aaagattccgagíat:catc¿c:cggggcaccg;ggt=cgr.r.c:ggagt показаны заглавными буквами. aaa¿catccaaagaqac|ttaaatatl;cesttsfotafeaacgca Чывд «.t a*g?aas Основной СТарТ транскрипции L » . _ находится на 11 пн выше

HindlII сайта, соответствуя ccHnarsrcrccsKS 33íi началу суффикса.

Рамки показывают два блока, напоминающие последовательности TATA - в положении -29 и -40 от основного старта транскрипции, а также тетрануклеотид СААТ - в положении -123.

Этот факт также свидетельствует о возможном происхождении суффикса из активной копии F-элемента, с 3' концевого внутреннего промотора последнего, обнаруженного в данной работе. Этот промотор не имеет типичных TATA и СААТ элементов, часто встречающихся перед эукариотическими стартами транскрипции в положении от -25 до -30 и от -60 до -80, соответственно.

8. Суффикс - представитель семейства SINE, а не ¿'-усеченная копия F-элемента

8.1. Обратная транскриптаза F-элемента обладает высокой процессивностью

Известно, что обратная транскрипция LINE может обрываться в случайных местах, что приводит к образованию так называемых "усеченных" с 5'-конца копий (5'-truncated copies). Но частота, с которой в геноме встречаются 5'-усеченные копии, для разных не-содержащих LTR ретроэлементов (LINE) весьма различна - это связано, скорее всего, с разной процессивностью обратных транскриптаз этих элементов. Например, полноразмерными являются только треть всех копий многочисленного семейства L1 в геноме человека (Kazazian and Moran, 1998) и только половина R2-элементов из генома дрозофилы (Jakubczak et al., 1992). Что же касается 112-элемента из В. mori, то для него, наоборот, вообще не найдено 5'-truncated копий (Burke et al., 1999).

Дня анализа процессивности обратной транскриптазы F-элемента в секвенированном геноме дрозофилы с помощью программы BLAST мы провели поиск гомологий к разным областям полноразмерного F-элемента. Были обнаружены 124 полноразмерные копии. Поиск гомологий к З'-области, расположенной сразу выше области суффикса (рис. 1), выявляет 168 копий, а к самому концу F-элемента, т.е. к суффиксу — 180 копий. Таким образом, около 70% от общего числа копий F-элемента по результатам анализа эухроматической порции генома D. melanogaster являются полными. Если верно предположение, что частота 5'-усеченных копий LINE непосредственно коррелирует с процессивностью их обратной транскриптазы, то 70% полноразмерных копий от общего числа копий F-элемента свидетельствуют о довольно высокой процессивности обратной транскриптазы F-элемента.

8.2. Инсерции суффикса могут сопровождаться образованием дупликаций сайтов-мишеней

Ранее (Tchurikov et al., 1986) при клонировании первых пяти практически идентичных копий элемента дупликации сайта-мишени по флангам выявлены не были. Такие примеры - отсутствие дупликаций сайтов-мишений по краям инсерций коротких ретроэлементов —известны (Kajikawa and Okada, 2002). При анализе нуклеотидных баз данных нам удалось обнаружить (рис. 15) пример инсерции суффикса с образованием дупликации длиной 11 пн.

cacacgcttoacacecacccc. . gcaargtaaaataaaaaaaaa

AC093497 M003S32 AF175684

П13067

Рис. 15. Последовательность одной и той же области генома в составе разных клонированных фрагментов. Слева приведены номера обнаруженных в базах данных последовательностей. В скобках указаны номера нуклеотидов в данных фрагментах. В трех первых случаях последовательность содержит консервативную копию суффикса (выделена как вставка). HindIII-сайт затенен, точкой обозначена замена А на С, дупликации сайта-мишени выделены прямоугольниками). В последнем случае показана та же геномная последовательность, но без суффикса.

Возможно, что в геноме дрозофилы преобладают инсерции суффикса без дупликаций сайтов-мишений, хотя встречаются и классические "кососрезанные" примеры.

Таким образом, обнаружение в разных линиях дрозофилы копий суффикса, имеющих одинаковую длину (Tchurikov et al., 1986; Кретова и др., 2002), его коротких транскриптов, внутреннего промотора на стыке F-элемента и суффикса, а также того, что суффикс более транскрипционно активен, чем F-элемент, убедительно свидетельствуют в пользу того, что большая часть копий суффикса в геноме дрозофилы соответствует копиям SINE, а не "усеченным" копиям F-элемента. Тот факт, что паттерны транскриптов суффикса и F-элемента отличны друг от друга, также подтверждает эту точку зрения, свидетельствуя о транскрипционной самостоятельности суффикса. 9. Суффикс участвует в РНК-интерференции

При анализе результатов Нозерн-гибридизации виден сложный паттерн довольно длинных транскриптов, как смысловых, так и антисмысловых, соответствующих суффиксу и F-элементу (рис. 2.). Следовательно, суффикс активно транскрибируется и его транскрипция регулируется в развитии. Только в куколках изучаемой нами линии удалось обнаружить короткий полиаденилированный транскрипт, который, как мы предполагаем, может являться транскриптом с мастер-копии, т.е. с

транскрипционно-активной копии элемента. Все другие суффикс-содержащие транскрипты длиннее. Таким образом, суффикс в основном транскрибируется в различных местах генома в составе более протяженных последовательностей РНК, и только незначительная часть транскриптов суффикса соответствует F-элементу. Как смысловые, так и антисмысловые транскрипты суффикса присутствуют в препаратах РНК, полученных на разных стадиях развития дрозофилы. Как следует из данных in situ гибридизации в герминативных тканях мух, паттерны смысловых и антисмысловых транскриптов обоих элементов практически совпадают. Эти данные не позволяют точно сказать, находятся ли смысловые и антисмысловые транскрипты элементов в клетке в одном и том же компартменте. Только в этом случае могут образоваться двухцепочечные РНК. Ответ на этот вопрос можно получить с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии, используя меченные разными флуоресцентными метками смысловые и антисмысловые РНК-пробы элементов. Обнаруженные нами суффикс-специфические siPHK и 3 'RACE-клоны F-элемента, лишенные 3'-конца, свидетельствуют о том, что по-крайней мере в некоторых клетках куколок РНК, содержащие суффикс, подвергаются деградации с помощью РНК-интерференции. Следовательно, в этих клетках суффккс-содержащие транскрипты формируют дцРНК, запускающие РНК-интерференцию. Деградация 3'-концевой области транскрипта F-элемента, точно соответствующая суффиксу, приводила бы к потере этим транскриптом части кодирующей области, сигнала и сайта полиаденилирования, то есть вызывала бы сайленсинг F-элемента. Таким образом, суффикс может играть роль в регуляции экспрессии F-элемента в некоторых тканях и органах куколок, т.е. он может служить инструментом, позволяющим клетке осуществлять сайленсинг F-элемента, в состав которого суффикс входит. На этом основании можно предположить, что и экспрессия других генов, содержащих суффикс в 5' или 3' некодирующих областях, как описано ранее (Tchurikov et al., 1982; Tchurikov et al., 1986), может регулироваться сходным образом.

10. РНК-интерференция регулируется в развитии

Как транскрипция каждой цепи суффикса, так и деградация этих транскриптов с помощью РНК-интерференции регулируется в развитии. Первый тип регуляции

приводит к разным транскрипционным паттернам элемента на разных стадиях развития. Второй - к характерному паттерну суффикс-специфических siPHK, которые обнаруживаются только на стадии куколок, несмотря на то, что смысловые и антисмысловые РНК элемента присутствуют также в эмбрионах, личинках и в имаго, причем в эмбрионах и имаго даже в больших, чем в куколках, количествах. Можно предположить, что в эмбрионах и у взрослых мух в каких-то органах и тканях существует негативная регуляция механизма РНК-интерференции с помощью неизвестных пока еще факторов. С другой стороны, смысловые и антисмысловые транскршгга на этих стадиях развития дрозофилы могут находиться или в разных клетках, или в разных компартментах одной и той же клетки и поэтому неспособны образовывать дцРНК. Аргументом в пользу регуляции РНК-интерференции служит найденный на стадии куколок короткий полиаденилированный транскрипт суффикса. Он обнаруживается, хотя в куколках имеются продукты РНК-интерференции - суффикс-специфические siPHK, свидетельствующие о протекании РНК-интерференции. То же касается и других транскриптов суффикса, наблюдаемых на рис. 2. Можно предположить, что существуют некие факторы, которые защищают РНК-мишень от деградации, направляемой комплементарной siPHK посредством РНК-интерференции. В результате некоторые транскрипты-мишени выживают. Однако не исключено, что активно транскрибируемая "sourse сору" и суффикс-специфические siPHK находятся в разных клетках или разных компартментах одной клетки.

11. Модель концертной регуляции работы генов с помощью SINE

Возможно, что обнаруженные нами продукты суффикс-специфической РНК-интерференции — siPHK и транскрипты F-элемента, лишенные области суффикса, -есть результат защиты клетки от РНК-ретроэлементов.

Симметричная транскрипция SINE

Ч Ifr- SINE в мРНК

-[=□►

X—

РНК-интерференция

X X „ -X

РНК-интерференция и концертный сайленсинг

Рис. 16. Схема, иллюстрирующая концертную регуляцию экспрессии генов, содержащих в 5'- или З'-некодирующих областях последовательность одного и того же SINE, а -транскрипты обеих цепей SINE могут образовывать дцРНК, запускающую РНК-интерференцию; б - последовательности SINE в разных мРНК являются мишенями РНК-интерференции. в - в результате РНК-интерференции последовательности мРНК теряют функционально важные области и способность транслироваться, что приводит к одновременному сайленсингу всех генов, помеченных данным SINE.

Аналогично можно предположить, что наличие коротких ретроэлементов в 3' некодирующих областях различных мРНК, что было показано для Alu-последовательностей из генома человека (Rubin et al., 1980), дает возможность клетке одновременно выключать определенные группы генов с помощью SINE-специфической РНК-интерференции (рис. 16). В этом случае SINE не должны рассматриваться как эгоистический компонент генома, но как биологически значимый, используемый на уровне РНК в качестве инструмента РНК-интерференции.

12. Гипотеза о происхождении SINE с помощью РНК полимеразы II, стартующей с внутреннего промотора на 3' конце LINE

Для объяснения происхождения тРНК-гомологичных SINE из 3' концевых областей LINE были предложено две гипотезы. По одной из них тРНК-гомологичный участок, содержащий промотор РНК-полимеразы III и происходящий из промежуточной стадии обратной транскрипции ретровирусов или LTR-содержащих ретротранспозонов (strong-stopflHK-npoflyicr), каким-то образом интегрирует в область 3' конца LINE (Ohshima et al., 1996).

Другая гипотеза предполагает, что последовательности тРНК или малой рРНК, также содержащей промотор РНК-полимеразы III, могли появиться в результате того, что обратная транскриптаза, синтезировав некую часть кДНК на матрице РНК LINE, затем "перепрыгнула" на другой транскрипт, синтезированный РНК полимеразой III - на тРНК или малую рРНК (Szafranski, 2004).

Полученные нами данные позволяют предполагать, что может существовать и третий механизм происхождения SINE - с помощью РНК полимеразы II, стартующей с внутреннего промотора на 3' конце LINE. Известно, что транскрипты SINE, образующиеся с помощью РНК-полимеразы хозяина, внедряются в различные места его генома, используя при этом эндонуклеазу и обратную транскриптазу родственного LINE. Возможно, что транскрипция копий SINE с внутреннего промотора осуществляется не всегда, а зависит от места внедрения (Ullu et al., 1985). Поэтому лишь небольшая часть копий данного элемента — или даже одна активная копия ("копия-источник" - "source сору") может транскрибироваться и давать новые транскрипты для возможных ретропозиций. Неактивные в ретропозициях копии дивергируют, и наличие таких в разной степени измененных копий данного элемента - "ископаемых реликтов" - отражает прошлые волны его ретропозиций. (Matera et al., 1990; International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome, 2001). Ранее изучение копий суффикса, расположенных в секвенированной эухроматической части генома дрозофилы, позволило выявить около 13 волн его ретропозиций (Кретова и др., 2002).

До сих пор имелись данные, согласно которым только РНК полимераза III хозяина ответственна за транскрипцию активных копий SINE. Представленные в настоящей работе данные позволяют считать, что хозяйская РНК полимераза II также может транскрибировать короткие ретроэлементы — но в этом случае матрицей служит не сама копия SINE, а активная копия родственного ему LINE, содержащая внутренний промотор в 3' концевой области. Известно, что LINE, равно как и LTR-содержащие элементы, транскрибируются РНК полимеразой П хозяина, а также содержат элементы, регулирующие ее активность. Т.е. для РНК полимеразы II и аппарата ее регуляции LINE являются "узнаваемыми" элементами генома. Наши данные свидетельствуют о том, что внутренние промоторы LINE могут располагаться и в их 3' частях. Поэтому в клетке могут появляться короткие транскрипты для возможных ретропозиций, т.е. может происходить синтез de novo коротких ретроэлементов. Интересно, что область обнаруженного нами внутреннего промотора F-элемента своей большей частью соответствует последовательности, кодирующей два последних консервативных домена обратной транскриптазы (Кретова и др., 2002; Xiong, 1990). Это еще один пример функциональной пластичности ДНК.

Таким образом, F-элемент может являться первичным источником образования транскриптов суффикса и обеспечивать суффикс необходимиыми для его транспозиции ферментами, а суффикс, в свою очередь, может вызывать сайленсинг F-элемента в куколках. Вероятно, такое сотрудничество позволяет данной паре LINE/SINE поддерживать себя в геноме, не вызывая гибель хозяина.

Выводы

1. Смысловые и антисмысловые транскрипты суффикса и р-элемента выявляются на всех стадиях развития дрозофилы

2. Паттерны транскрипции Р-элемента и суффикса резко различаются. Суффикс экспрессируется гораздо активнее Р-элемента. Основная часть транскриптов суффикса происходит с его отдельных (не в составе р-элемента) копий.

3. В герминативных тканях дрозофилы - семенниках и яичниках - паттерны смысловых и антисмысловых транскриптов суффикса совпадают. Следовательно, имеется потенциальная возможность образования 2х-цепочечных молекул РНК и запуска РНК-интерференции на всех стадиях развития дрозофилы.

4. Суффикс-специфические siPHK обнаружены только в куколках, несмотря на то, что смысловые и антисмысловые транскрипты суффикса обнаружены на всех стадиях развития. Обнаруженный паттерн суффикс-специфических siPHK свидетельствует о том, что РНК-интерференция регулируется в развитии.

5. На стадии куколок обнаружены транскрипты F-элемента, лишенные области суффикса. Предполагается, что суффикс-специфическая РНК-интерференция приводит к деградации области суффикса, содержащей часть открытой рамки считывания, сигнал и сайт полиаденилирования, и, следовательно, к сайленсингу F-элемента в некоторых тканях и органах куколок.

6. Обнаружен внутренний промотор РНК-полимеразы II в 3'-концевой области F-элемента. Транскрипция с этого промотора усиливается под действием энхансера и ингибируется а-аманитином. Предположено, что исходно короткий ретроэлемент суффикс мог быть образован путем транскрипции с 3'-концевого внутреннего промотора F-элемента.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кретова О.В., Соколова М.А.,.Чуриков H.A. Анализ копий суффикса -короткого ретроэлемента дрозофилы - и кодируемого им белкового домена. Генетика. 2002; 38(8): с. 1090-1096.

2. Кретова О.В., Чуриков H.A. РНК-интерференция регулируется в развитии: анализ экспрессии суффикса - короткого ретроэлемента дрозофилы. Генетика. 2003; 39(2): с. 300-304.

kwWqOl/

3. Tchurikov NA, Chernov BK, Golova YB, Zhimulev IF, Zykov I A. SuUR protein binds to the boundary regions separating forum domains in Drosophila melanogaster. J Biol Chem. 2004; 279(12): p. 11705-10.

4. Кретова O.B., Чуриков H.A. О возможности происхождения короткого ретроэлемента дрозофилы — суффикса — от родственного длинного ретроэлемента - F-элемента. ДАН, 2005; 403(6): с. 824 - 828.

5. Tchurikov N.A., Sokolova М.А., Kretova О. V. Analysis of a short retroelement -suffix — and its role in evolution. Symposium on Molecular Evolution, Sorrento, Italy, June 13-16,2002; p. 92.

6. Tchurikov N.A., Kretova O.V. RNA interference is developmental^ regulated: analysis of expression of suffix - a short Drosophila retroelement. XIX Int.Congress of Genetics, Melbourne, July 4-11, 2003; p. 57.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 24.08.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,75. Тираж 70 экз. Заказ 572.

119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к. Тел. 939-3890,939-3891. Тел7Факс 939-3891.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кретова, Ольга Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Задачи исследования

1.3. Научная новизна результатов исследования

1.4. Практическая ценность

1.5. Апробация работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. МОБИЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ У ДРОЗОФИЛЫ

2.1. Классификация

2.2. Ретроэлементы

- LTR-содержащие элементы

- LTR-несодержащие элементы

2.3. F-элемент

- транскрипция F-элемента

2.4. SINE

2.5. Пары LINE/SINE

ГЛАВА И. СУФФИКС - ПРИМЕР НЕОБЫЧНОГО SINE

2.6. Некоторые свойства суффикса

2.7. Гомология с F-элементом и другими LINE дрозофилы

2.8. Места интеграции в геноме

ГЛАВА III. РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ - ОДИН ИЗ МЕХАНИЗМОВ

ПОСТТРАНСКРИПЦИОННОГО САЙЛЕНСИНГА

2.9. Малые РНК

2.10. Механизм и ферменты

- процессинг dsPHK предшественников

- объединение в эффекторный комплекс, осуществляющий РНК сайленсинг

- разрезание мРНК и репрессия трансляции

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Линии Drosophila melanogaster

3.2. Штаммы E.coli

3.3. Используемые праймеры

3.4. Стандартные молекулярно-биологические методы

- создание векторов для эффективной экспрессии в культуре клеток дрозофилы

- приготовление компетентных клеток и трансформация

- отбор клонов и выделение плазмидной ДНК

- выделение плазмидной ДНК для сиквенса и трансфекции в культуру клеток дрозофилы

- синтез Р-эонда без использования праймеров методом cool PCR

- конструкции для поиска промоторной активности

- секвенирование по Сенгеру 37 3.5.3'RACE

3.6. Выделение тотальной, поли(А)+ и поли(А)" РНК из эмбрионов, личинок, куколок и имаго дрозофилы

3.7. Нозерн-блоттинг и гибридизация

3.8. Трансфекция ДНК-конструкций в культуру клеток Schneider 2 дрозофилы

3.9. Primer-extention

3.10. ПААГ-электрофорез и электроблоттинг для анализа siPHK 41 3.11 In situ гибридизация с DIG-мечеными РНК-пробами на терминальных тканях дрозофилы

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Паттерны транскрипции суффикса и F-элемента различны

4.2. Обнаружен короткий транскрипт суффикса в куколках

4.3. Обе цепи суффикса и F-элемента транскрибируются

4.4. Суффикс-специфические siPHK обнаружены только в куколках

4.5. Обнаружены транскрипты F-элемента без области суффикса

4.6. Паттерн транскрипции суффикса меняется со временем

4.7. F-элемент имеет 3'-концевой внутренний промотор

4.8. Старт транскрипции суффикса с 3'-концевого промотора в F-элементе совпадает с началом суффикса

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. Суффикс - представитель семейства SINE, а не 5'-усеченная копия F-элемента

5.1.1. Обратная транскриптаза F-элемента обладает высокой процессивностью

5.1.2. Инсерции суффикса могут сопровождаться образованием дупликаций сайтов-мишеней

5.2. Суффикс участвует в механизме РНК-интерференции

5.3. РНК-интерференция регулируется в развитии

5.4. Модель концертной регуляции работы генов с помощью SINE

5.5. Гипотеза о происхождении SINE с помощью РНК полимеразы И, стартующей с внутреннего промотора на 3' конце LINE

6. ВЫВОДЫ

7.ЛИТЕРАТУР А

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

LINE - long interspersed nucleotide element - длинные диспергированные повторы SINE - short interspersed nucleotide element - короткие диспергированные повторы PR-IN-RT-RH - домены в открытой рамки считывания для гена pol в геноме ретровирусов и ретротранспозонов, соответственно имеющие протеазную, интегразную активности, активность обратной транскриптазы, активность РНК-азы Н ORF - открытая рамка считывания LTR - long terminal repeat - длинный концевой повтор bp - пар оснований kb - тысяч пар оснований тРНК - транспортная РНК рРНК - рибосомная РНК dsPHK - двухцепочечная РНК

RISC - RNA induced silencing complex - РНК зависимый комплекс репрессии siPHK - short interfering RNAs - малые интерферирующие РНК

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ транскрипции суффикса-короткого ретроэлемента из генома D. Melanogaster"

Существует две точки зрения на роль мобильных элементов в геномах эукариот. Одна из них предполагает, что они являются геномными паразитами и клетка вынуждена защищаться от них и их нежелательной экспрессии. Согласно другой, мобильные элементы привносят в геном повторяющиеся последовательности, необходимые для образования гетерохроматиновых областей, а также различные регуляторные последовательности, находящиеся в их составе, такие как промоторы, инсуляторы и другие, которые клетка использует для регуляции своих генов. Обе точки зрения подкреплены фактами. С одной стороны, накопление мобильных элементов может причинить вред хозяйской клетке, а с другой стороны они могут использоваться клеткой для регуляции работы генов и служить материалом и фактором эволюции.

В геноме дрозофилы обнаружено более десяти семейств LINE и только один короткий ретроэлемент (SINE) - суффикс. Поэтому исследование свойств суффикса, в частности, его транскрипции и возможного происхождения, представляет большой интерес. Ранее по поводу происхождения коротких ретроэлементов в разных геномах было высказано два предположения. Согласно первому из них, ДНК-интермедиаты обратной транскрипции LTR-содержащих ретроэлементов, использующих в качестве праймера тРНК, были внедрены в 3' концевые области LINE (Ohshima et al„ 1996). Вторая гипотеза, подкрепленная некоторыми экспериментальными данными, предполагает, что при обратной транскрипции РНК LINE обратная транскриптаза "перепрыгивает" на тРНК или на 5S РНК матрицы (Szafranski et al, 2004). Но полной ясности в этом вопросе пока нет.

Транскрипция мобильных элементов часто осуществляется в двух противоположных направлениях - или из-за присутствия внутренних смысловых и антисмысловых промоторов, как в случае с F-элементом (Minchiotti and Di Nocera, 1991), или в результате инсерции мобильного элемента в различных ориентациях так, что его транскрипция попадает под контроль какого-то внешнего промотора. Тем самым появляется возможность образования дсРНК и, следовательно, запуска РНК-интерференции.

Molnar, 2004). Данные о регуляции РНК-интерференции в животных клетках важны как с фундаментальной, так и с прикладной точки зрения, так как в настоящее время активно ведутся исследования по использованию РНК-интерференции в генотерапии различных болезней человека.

1.2. Задачи исследования

F-элемент и суффикс - первый известный пример родства LINE/SINE (Tchurikov et al, 1986; Di Nocera and Casan, 1987), 3' область F-элемента соответствует короткому ретроэлементу суффиксу. Позже были описаны многочисленные примеры пар LINE/SINE в разных геномах (Okada N. et al, 1997).

2. Выяснить, имеет ли F-элемент 3'-концевой промотор, с которого мог бы исходно транскрибироваться суффикс.

1.3. Научная новизна результатов исследования

Обнаружены смысловые и антисмысловые транскрипты суффикса и F-элемента на разных стадиях развития дрозофилы. Впервые обнаружено, что РНК-интерференции регулируется в развитии. В результате поиска промоторной активности во фрагментах ДНК, расположенных на границе F-элемента и присутствующего на его 3'-конце суффикса, обнаружен внутренний промотор, по силе сопоставимый с промотором LTR-содержащего ретропозона дрозофилы burdock, и впервые показано, что короткие ретроэлементы (SINE) могут происходить из родственных им длинных элементов (LINE) путем транскрипции их З'-концевых областей с помощью РНК полимеразы II с внутренних промоторов, расположенных на стыке LINE-SINE.

1.4. Практическая ценность

Обнаруженная в работе суффикс-специфическая РНК-интерференция дает возможность предположить наличие концертного механизма регуляции работы генов, в результате действия которого клетка, за счет присутствия диспергированных копий суффикса на З'-концах некоторых генов, имеет возможность одновременно выключать интерференции свидетельствуют о том, что не всегда следует ожидать безусловного сайленсинга соответствующих генов, что необходимо учитывать при решении задач генной терапии, направленной на сайленсинг генов, вовлеченных в развитие той или иной патологии.

1.5. Апробация работы

Данные, представленные в работе, докладывались на симпозиуме "Molecular Evolution" (Сорренто, 13-16 июня, 2002), на XIX International Congress of Genetics (Мельбурн, Австралия, 6-11 июля, 2003), на рабочих совещаниях CRDF: "Design of DNA constructs for silencing of HIV-1 genes" (Москва, 16 августа, 2004) и "Use of RNA Interference for Development of Efficient AIDS Therapies" (Москва, 15 ноября, 2004), a также были представлены на 7-ой международной энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (Суздаль, Россия, 28 ноября - 2 декабря, 2004). другие трудились, а вы вошли в труд их." (Ев. от Иоанна, гл. 4, 38)

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ВВЕДЕНИЕ

Огромное число людей, избравших сферой своей деятельности науку о живом, исследуют окружающую природу в ее поражающем воображение разнообразии. И это совсем нелегкий труд.

Требуются усилия многих и многих, каждого в своей области, чтобы стал более или менее понятен какой-либо механизм функционирования живого организма. Прорываясь через бесконечное число ошибок, научный мир вырывает крупицы знания, которые остаются по-прежнему бесконечно, пренебрежительно малым перед непознанным. Жизнь во всех ее проявлениях всегда будет оставаться тайной для человека. И все-таки научная деятельность привлекает людей - стремление к познанию даровано человеку Творцом.

Поражает обилие статей в научных журналах по молекулярно-биологической тематике. Конечно, требуется неординарное умение отделять пшеницу от плевел, схватывать главное, чтобы быть в курсе современного состояния интересующей тематики, и не только ее, а и многих смежных дисциплин. В действительно океане научных статей компетентный ученый должен выбирать ключевые, основополагающие, несущие новое знание. К сожалению, автор еще недостаточно преуспел в этом, а вернее, совсем неопытен и растерян в подборе литературы. Поэтому я с благодарностью читала обзорные статьи, помогающие систематизировать разрозненные результаты.

Проблемы, связанные с эпигенетической регуляцией работы генов, с генным сайленсингом, основанном на РНК-интерференции, являются сейчас теми, что находятся в центре усиленного внимания молекулярно-биологической науки.

Мобильные элементы, в силу присутствия в них различных регуляторных последовательностей, рассматриваются как эпигенетические метки. А возможность образования двухцепочечных РНК мобильного элемента из-за транскрипции или с двух разнонаправленных внутренних промоторов, или в разных направлениях с внешних промоторов в месте внедрения делает мобильные элементы активными участниками РНК-интерференции.

Таким образом, вряд ли мобильные элементы, в частности, LINE и SINE, должны рассматриваться как какой-то эгоистический компонент генома. Их регуляторная составляющая, важная для всего генома, доминирует над функцией самоподдержания.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кретова, Ольга Валерьевна

6. выводы

В результате изучения транскрипционной активности короткого ретроэлемента суффикса - из генома ИгозорЬИа melanogaster установлено, что:

1. Смысловые и антисмысловые транскрипты суффикса и Р-элемента выявляются на всех стадиях развития дрозофилы

4. Суффикс-специфические siPHK обнаружены только в куколоках, несмотря на то, что смысловые и антисмысловые транскрипты суффикса обнаружены на всех стадиях развития. Обнаруженный паттерн суффмкс-специфических в1РНК свидетельствует о том, что РНК-интерференция регулируется в развитии.

5. На стадии куколок обнаружены транскрипты Р-элемента, лишенные области суффикса. Предполагается, что суффикс-специфическая РНК-интерференция приводит к деградации области суффикса, содержащей часть открытой рамки считывания, сигнал и сайт полиаденилирования, и, следовательно, к сайленсингу Р-элемента в некоторых тканях и органах куколок.

6. Обнаружен внутренний промотор РНК-полимеразы II в 3'-концевой области Б-элемента. Транскрипция с этого промотора усиливается под действием энхансера и ингибируется а-аманитином. Предположено, что исходно короткий ретроэлемент суффикс мог быть образован путем транскрипции с 3'-концевого внутреннего промотора Р-элемента.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кретова, Ольга Валерьевна, Москва

1. Колесников А.В., Чуриков Н.А., Пономаренко Н.А. (1995). Ретропозон дрозофилы -суффикс- имеет древний домен и в разной ориентации выполняет некодирующие и кодирующие функции в ядре и цитоплазме. Доклады Академии Наук 345 (3), 410-414.

2. Кретова О.В., Соколова М.А., Чуриков Н.А. (2002).Генетика 38.1090 -1096.

3. Чуриков Н.А. (2005). Молекулярные механизмы эпигенетики. Обзор. Биохимия, 70,493 -513.

4. Чуриков Н.А., Эбралидзе А.К., Полукарова Л.Г. (1987). Молекулярно-генетическое изучение локуса cut Drosophila melanogaster. Генетика, т. XXIII, № 10, 1807-1822.

5. Чуриков Н.А. (1996). Роль ретроэлементов в эволюции: анализ суффикс-элемента из генома дрозофилы. Цитология и генетика 30 (1), 14-22.

6. Чуриков Н.А., Дмитриев С.Е., Краснов А.Н., Соколова М.А. (1998). Анализ копий суффикса короткого ретроэлемента дрозофилы - в районах гетерохроматина. Доклады Академии Наук 360(1), 124-127.

7. Ashburner. (1989). Drosophila. A laboratory handbook. Cold Spring Harbor, N.Y.

8. Basyuk, E., Suavet, F., Doglio, A., Bordonne, R. & Bertrand, E. (2003). Human let-7 stem-loop precursors harbor features of RNase III cleavage products. Nucleic Acids Res. 31,6593-6597.

9. Batzer M.A., Deininger P.L.(2002). Alu repeats and human genomic diversity. Nat Rev Genet. 3(5):370-9.

10. Baulcombe, D.C., and Molnar, A. (2004). Crystal structure of pl9~a universal suppressor of RNA silencing. Trends Biochem. Sci. 29,279-281.

11. Beall, E., and D. Rio. (1996). Drosophila IRBP/Ku p70 corresponds to the mutagen-sensitive mus309 gene and is involved in P-element excision in vivo. Genes Dev 10,921-33.

12. Berg, D. E., and M. Howe, (1989). Mobile DNA. American Society for Microbiology, Washington D.C.

13. Bibillo A., Eickbush TH. (2002). The reverse transcriptase of the R2 non-LTR retrotransposon: continuous synthesis of cDNA on non-continuous RNA templates. J.Mol.Biol. 316,459-473.

14. Bibillo, A and Eickbush, T (2002). High processivity of the reverse transcriptase from a non-long terminal repeat retrotransposon. J. Biol. Chem. 277,34836-845

15. Bohnsack, M. T., Czaplinski, K. & Gorlich, D. (2004). Exportin 5 is a RanGTP-dependent dsRNA-binding protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs. RNA 10,185-191.

16. Boutet, S. et al. (2003). Arabidopsis HEN1: A genetic link between endogenous miRNA controlling development and siRNA controlling transgene silencing and virus resistance. Curr. Biol. 13,843-848.

17. Brodsky L.I., Vassiliev A.V. et al. (1992). Amer. Mathem. Soc. DIMACS 8,127-140.

18. Bucheton, A., R. Paro, H.M. Sang, A. Pelisson, and D.J.Finnegan. (1984). The molecular basis of I-R hybrid dysgenesis: identification, cloning and properties of the I factor. Cell 38, 153-163.

19. Burke, W. D., Malik, H. S., Jones, J. P., and Eickbush, T. H. (1999). The domain structure and retrotransposition mechanism of R2 elements are conserved throughout arthropods. Mol. Biol. Evol. 16,502-511

20. Caceres M, Puig M, Ruiz A. (2001). Molecular characterization of two natural hotspots in the Drosophila buzzatii genome induced by transposon insertions. Genome Res. 11, 1353-1364

21. Caizzi R, Caggese C, Pimpinelli S. (1993). Bari-1, a new transposon-like family in Drosophila melanogaster with a unique heterochromatic organization. Genetics 133,335-345.

22. Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q. & Hannon, G. J. (2002). The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem-cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16,2733-2742.

23. Caudy, A. A., Myers, M., Hannon, G. J. & Hammond, S. M. (2002). Fragile X-related protein and VIG associate with the RNA interference machinery. Genes Dev. 16,2491-2496.

24. Caudy, A. A. et al. (2003). A micrococcal nuclease homologue in RNAi effector complexes. Nature 425,411-414.

25. Cavarec, L., S. Jensen, J. Casella, S. Cristescu and T. Heidmann (1997). Molecular cloning and characterization of a transcription factor for the copia retrotransposon with homology to the BTB-containing lola neurogenic factor. Mol Cell Biol 17,482-94.

26. Conte, C., Dastugue, B., and Vaury, C. (2002) Mol. Cell.Biol. 22,1767-1777.

27. Contursi, C., Minchiotti, G., and Di Nocera, P. P. (1993). Functional dissection of two promoters that control sense and antisense transcription of Drosophila melanogaster F elements. J. Mol. Biol. 234,988-997.

28. Contursi C., Minchotti G., Di Nocera P.P. (1995). Identification of sequences which regulate the expression of Drosophila melanogaster Doc elements. J Biol Chem. 3; 270(44), 26570-6.

29. Cost G. J., Feng Q., Jacquier A. and Boeke J. D. (2002). Human LI element target-primed reverse transcription in vitro The EMBO Journal, 21,5899-5910.

30. Dawid, I.B., Long, E.O., Di Nocera, P.P., Pardue, M.L. (1981). Ribosomal insertion-like elements in Drosophila melanogaster are interspersed with mobile sequences. Cell 25(2), 399— 408.

31. Deininger PL, Batzer MA. (2002). Mammalian retroelements. Genome Res. 12(10), 1455-65.

32. Di Nocera, P. P., and I. Dawid. (1983). Interdigitated arrangement of two oligo(A)-terminated DNA sequences in Drosophila. Nucleic Acids Res. 11,5475-5482.

33. Di Nocera, P.P., M.E. Digan, and I.B. Dawid. (1983). A family of oligo-adenylated transposable sequences in Drosophila melanogaster. J. Mol. Biol. 168,715-728.

34. Di Nocera P P and G Casari. (1987). Related polypeptides are encoded by Drosophila F elements, I factors, and mammalian LI sequences.Proc Natl Acad Sci USA. 84(16): 58435847.

35. Di Nocera, P. P. (1988). Close relationship between non-viral retroposons in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 16,4041-4052.

36. Doench, J. G., Petersen, C. P. & Sharp, P. A. (2003). siRNAs can function as miRNAs. Genes Dev. 17,438-442.

37. Domnguez A., Albornoz J. (1996). Rates of movement of transposable elements in Drosophila melanogaster. Mol Gen Genet 251,130-138.

38. Elbashir, S. M., Lendeckel, W. & Tuschl, T. (2001). RNA interference is mediated by 21 and 22 nt RNAs. Genes Dev. 15,188-200.

39. Elbashir, S. M., Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W. & Tuschl, T. (2001). Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. EMBO J. 20,6877-6888.

40. Engels, W., (1989). P elements in Drosophila melanogaster, pp. 437-484 in Mobile DNA, edited by D. Berg, and M. Howe. American Society for Mickrobiology, Washington DC.

41. Fawcett, D. H., Lister, C. K., Kellett, E., and Finnegan, D. J. (1986). Transposable elements controlling I-R hybrid dysgenesis in D. melanogaster are similar to mammalian LINEs. Cell 47(6), 1007-1015.

42. Finnegan, D. J. (1990). Transposable elements and DNA transposition in eukaryotes. Curr. Opin. Cell Biol. 2,471-477.

43. Freund R, Meselson M. (1984). Long terminal repeat nucleotide sequence and specific insertion of the gypsy transposon. Proc Natl Acad Sci USA 81,4462-4464.

44. Gerasimova TI, Ilyin YV, Mizrokhi LJ, Semjonova LV, Georgiev GP (1984) Mobilization of the transposable element mdgA by hybrid dysgenesis generates a family of unstable cut mutations in Drosophila melanogaster. Mol Gen Genet 193,488-492.

45. Gil A, Proudfoot NJ. (1984). A sequence downstream of AAUAAA is required for rabbit beta-globin mRNA 3"-end formation. Nature. Nov 29-Dec 5;312(5993), 473-4.

46. Green MM (1988) Mobile DNA elements and spontaneous gene mutation. In: Lambert ME, McDonald JF, Weistein IB (eds). Eukaryotic transposable elements as mutagenic agents. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 41-50.

47. Gitlin, L. & Andino, R. (2003). Nucleic acid-based immune system: the antiviral potential of mammalian RNA silencing. J. Virol. 77,7159-7165.

48. Hammond, S. M., Bernstein, E., Beach, D. & Hannon, G. J. (2002). An RNA-directed nuclease mediates posttranscriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature 404,293-296.

49. Hammond, S. M., Boettcher, S., Caudy, A. A., Kobayashi, R. & Hannon, G. J. (2001). Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science 293, 1146— 1150.

50. Han, M. H., Goud, S., Song, L. & Fedoroff, N. (2004). ThcArabidopsis double-stranded RNA-binding protein HYL1 plays a role in microRNA-mediated gene regulation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 1093-1098.

51. Harada K, Yukuhiro K, Mukai T (1990). Transposition rates of movable genetic elements in Drosophila melanogaster. Proc NatlAcad Sci USA 87,3248-3252.

52. He, L., and Hannon, G.J. (2004). MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat. Rev. Genet 5,522-531.

53. Hoch, M., C. Schroder, E. Seifert, and H. Jackie. (1990). Cis-acting control elements for Kru'ppel expression in the Drosophila embryo. EMBO J. 9,2587-2595.

54. Hunter, C., Sun, H. & Poethig, R. S. (2003). The Arabidopsis heterochronic gene ZIPPY is an ARGONAUTE family member. Curr. Biol. 13,1734-1739.

55. Jakubczak, J. L., Y. Xiong, and T. H. Eickbush. (1990). Type I (Rl) and type II (R2) ribosomal DNA insertions of Drosophila melanogaster are retrotransposable elements closely related to those of Bombyx mori. J. Mol. Biol. 212:37-52.

56. Jakubczak JL, Burke WD, Eickbush TH. (1991). Retrotransposable elements R1 and R2 interrupt the rRNA genes of most insects. Proc Natl Acad Sci USA 88,3295-3299.

57. Jakubczak, J. L., Zenni, M. K., Woodruff, R. C., and Eickbush, T. H. (1992). Turnover of R1 (type I) and R2 (type II) retrotransposable elements in the ribosomal DNA of Drosophila melanogaster Genetics 131,129-142.

58. Juarez, M.T., Kui, J.S., Thomas, J., Heller, B.A., and Timmermans, M.C. (2004). microRNA-mediated repression of rolled leafl specifies maize leaf polarity. Nature 428, 84-88.

59. Kajikawa M and Okada N. (2002). LINEs Mobilize SINEs in the Eel through a Shared 3' Sequence. Cell, Nov 1;111(3), 433-44.

60. Kaufman, P., and D. Rio. (1992). P element transposition in vitro by a cut-and-paste mechanism and uses GTP as a cofactor. Cell 69,27-39.

61. Kazazian, H., and Moran, J. (1998) The impact of LI retrotransposons on the human genome. Nat. Genet. 19,19-2

62. Kazazian HH. (2000). LI retrotransposons shape the mammalian genome. Science 18, 289(5482), 1152-3.

63. Kennedy, S., Wang, D. & Ruvkun, G. (2004). A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature 427,645-649.

64. Kerber B., Fellert S., Taubert H., and Hoch M. (1996). Germ line and embryonic expression of Fex, a member of the Drosophila F-element retrotransposon family, is mediated by an internal cis-regulatory control region. Mol Cell Biol. 16(6), 2998-3007.

65. Khvorova, A., Reynolds, A. & Jayasena, S. D. (2003). Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell 115,209-216.

66. Kim, A., C. Terzian, P. Santamaria, A. Pelisson, N. Purdqhomme et al. (1994). Retroviruses in invertebrates: the gypsy retrotransposon is apparently an infectious retrovirus of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A 91,1285-9.73

67. Kim, J. et al. (2004). Identification of many microRNAs that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101,360-365.

68. Knight, S. W. & Bass, B. L. (2002). The role of RNA editing by ADARs in RNAi. Mol. Cell 10,809-817.

69. Ma, J. B., Ye, K. & Patel, D. J. (2004). Structural basis for overhang-specific small interfering RNA recognition by the PAZ domain. Nature 429,318-322.

70. Mandal PK., Bagchi A., Bhattacharya S. (2004). An Entamoeba histolytica LINE/SINE pair inserts at common target sites cleaved by the restriction enzyme-like LINE-encoded endonuclease. Eukaryot Cell 3(1), 170-9.

71. Martinez, J., Patkaniowska, A., Urlaub, H., Luhrmann, R. & Tuschl, T. (2002). Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell 110,563-574.

72. Martinez, J. & Tuschl, T. (2004). RISC is a 5-phosphomonoester-producing RNA endonuclease. Genes Dev. 18,975-980.

73. Martinez, J. & Tuschl, T. (2004). RISC is a 5'-phosphomonoester-producing RNA endonuclease. Genes Dev. 18,975-980.

74. Martin, S.L. and Bushman, F.D. (2001) Nucleic acid chaperone activity of the ORF1 protein from the mouse LINE-1 retrotransposon. Mol. Cell. Biol. 21,467-475.

75. Matera A. G., U Hellmann, and C W Schmid (1990). A transpositionally and transcriptionally competent Alu subfamily. Mol Cell Biol. 10(10), 5424-5432.

76. Meister, G. et al. (2004). Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Mol. Cell 15, 185-197.

77. Minchiotti, G., and Di Nocera, P. P. (1991). Convergent transcription initiates from oppositely oriented promoters within the 5' end regions of Drosophila melanogaster F elements. Mol. Cell. Biol. 11,5171-5180.

78. Minchiotti, G., Contursi, C., Graziani, F., Gargiulo, G., and Di Nocera, P. P. (1994). Mol. & Gen. Genet. 245,152-159.

79. Mizrokhi, L. J., Georgieva, S. G., and Ilyin, Y. V. (1988). jockey, a mobile Drosophila element similar to mammalian LINEs, is transcribed from the internal promoter by RNA polymerase II. Cell 54,685-691.

80. Montgomery M.K., Fire A. (1998). Double-stranded RNA as a mediator in sequence-specific genetic silencing and co-suppression. Trends Genet. 14(7), 255-8.

81. Mourelatos, Z. et al. (2002). miRNPs: a novel class of ribonucleoproteins containing numerous microRNAs. Genes Dev. 16,720-728.

82. Nykänen, A., Haley, B. & Zamore, P. D. (2001). ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107,309-321.

83. O'Hare K, Chadwick BP, Constantinou A, Davis AJ, Mitchelson A, Tudor M.A (2002). 5.9-kb tandem repeat at the euchromatin-heterochromatin boundary of the X chromosome of Drosophila melanogaster. Mol Genet Genomics 267,647-655.

84. O'Hare, K., Alley, M. R. K., Cullingford, T. E., Driver, A., and Sanderson, M. J. (1991) Mol. & Gen. Genet. 225, 17-24.

85. Ohshima K., Hamada M., Terai Y., Okada N. (1996). The 3" ends of tRNA-derived short interspersed repetitive elements are derived from the 3' ends of long interspersed repetitive elements.Mol. Cell. Biol.16,3756 3764.

86. Okada, N. (1991). SINEs. Curr. Opin. Genet. Dev. 1,498-504.

87. Okada N. Hamada M. Ogiwara I., Ohshima K. (1997). SINEs and LINEs share common 3" sequences: a review.Gene 31 ;205(1-2), 229-43.

88. Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H. & Siomi, M. C. (2004). Distinct roles for Argonaut proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev. 18,1655-1666.

89. Olsen, P. H. & Ambros, V. (1999). The lin-4 regulatory RNA controls developmental timing in Caenorhabditis elegans by blocking LIN-14 protein synthesis after the initiation of translation. Dev. Biol. 216,671-680.

90. Pardue Ml, Dawid IB. (1981). Chromosomal locations of two DNA segments that flank ribosomal insertion-like sequences in Drosophila: flanking sequences are mobile elements. Chromosoma 83(1), 29-43.

91. Petrov DA, Hartl DL. (1998). High rate of DNA loss in the Drosophila melanogaster and Drosophila virilis species groups. Mol Biol Evol. 15(3), 293-302

92. Pham, J. W., Pellino, J. L., Lee, Y. S., Carthew, R. W. & Sontheimer, E. J. A. (2004). Dicers-dependent 80S complex cleaves targeted mRNAs during RNAi in Drosophila. Cell 117,83-94.

93. Plasterk, R.H. (2002), RNA silencing: the genome's immune system. Science 296,1263-1265.

94. Priimagi, A. F., Mizrokhi, L. J., and Ilyin, Y. V. (1988) The Drosophila mobile element jockey belongs to LINEs and contains coding sequences homologous to some retroviral proteins. Gene (Amst) 70,253-262.

95. Provost, P. et al. (2002). Ribonuclease activity and RNA binding of recombinant human Dicer. EMBO J. 21,5864-5874.

96. Rio, D. (1991). Regulation of Drosophila P element transposition. Trends Genet 7,282-7.

97. Rio, D., and G. Rubin. (1988) Identification and purification of a Drosophila protein that binds to the terminal 31-base-pair inverted repeats of the P transposable element. Proc Natl Acad Sei U S A 85,8929-33.

98. Roignant, J. Y. et al. (2003). Absence of transitive and systemic pathways allows cell-specific and isoformspecific RNAi in Drosophila. RNA 9,299-308.

99. Rubin, C. M., Houck, C. M., Deininger, P. L., Friedmann, T. Schmid, C. W.(1980) Partial nucleotide sequence of the 300-nucleotide interspersed repeated human DNA sequences. Nature 284:372-374.

100. Sasaki, T., Shiohama, A., Minoshima, S. & Shimizu, N. (2003). Identification of eight members of the Argonaute family in the human genome. Genomics 82,323-330.

101. Saxena, S., Jonsson, Z. 0. & Dutta, A. (2003). Small RNAs with imperfect match to endogenous mRNA repress translation: implications for off-target activity of siRNA in mammalian cells. J. Biol. Chem 278,44312-44319.

102. Schramke, V., and Allshire, R. (2004). Those interfering little RNAs! Silencing and eliminating chromatin. Current Opinion in Genetics & Development, 14,174-180.

103. Schwarz, D. S., Tomari, Y. & Zamore, P. D. (2004). The RNA-induced silencing complex is a Mg2-dependent endonuclease. Curr. Biol. 14,787-791.

104. Schwarz, D. S. et al. (2003). Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 115, 199-208.

105. Schwarz, D. S., Hutvagner, G., Haley, B. & Zamore, P. D. Evidence that siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila and human RNAi pathways. Mol. Cell 10,537-548

106. Seggerson, K., Tang, L. & Moss, E. G. (2002). Two genetic circuits repress the Caenorhabditis elegans heterochrony gene lin-28 after translation initiation. Dev. Biol. 243,215-225.

107. Sharp, P.A. (1999). RNAi and double-strand RNA. Genes Dev.13,139-141.

108. Siebel, C., A. Admon and D. Rio. (1995). Soma-specific expression and cloning of PSI, a negative regulator of P element pre-mRNA splicing. Genes Dev. 9,269-283.

109. Sijen, T. et al. (2001). On the role of RNA amplification in dsRNA-triggered gene silencing. Cell 107,465-476/

110. Simmer, F. et al. (2002). Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12,1317-1319.

111. Stein, P., Svoboda, P., Anger, M. & Schultz, R. M. (2003). RNAi: mammalian oocytes do it without RNAdependent RNA polymerase. RNA 9,187-192.

112. Sun, F.L., Haynes, K., Simpson, C.L., Lee, S.D., Collins, L., Wuller, J,, Eissenberg, J.C., and Elgin, S.C.R. ((2004). Cis-Acting determinants of heterochromatin formation on Drosophila melanogaster chromosome four. Mol. Cell. Biol., 24,8210-8220.

113. Szafranski K, Dingermann T, Glockner G, Winckler T. (2004). Mol Genet. Genomics. 271(1), 98-102.

114. Tabara, H., Yigit, E., Siomi, H. & Mello, C. C. (2002). The dsRNA binding protein RDE-4 interacts with RDE-1, DCR-1, and a DExH-box helicase to direct RNAi in C. elegans. Cell 109, 861-871.

115. Tahbaz, N. et al. (2004). Characterization of the interactions between mammalian PAZ PIWI domain proteins and Dicer. EMBO Rep. 5,189-194.

116. Tchurikov N.A., Ebralidze A.K., Georgiev G.P. (1986). The suffix sequence is involved in processing the 3' ends of different mRNAs in Drosophila melanogaster. EMBO J. 9, 23412347.

117. Tchurikov NA, Naumova AK, Zelentsova ES, Georgiev GP. (1982). A cloned unique gene of Drosophila melanogaster contains a repetitive 3' exon whose sequence is present at the 3' ends of many different mRNAs. Cell 28(2), 365-73

118. Truett MA, Jones RS, Potter SS. (1981). Unusual structure of the FB family of transposable elements in Drosophila. Cell 24,753-763.

119. Tonkin, L. A. & Bass, B. L. (2003). Mutations in RNAi rescue aberrant chemotaxis of ADAR mutants. Science 302,1725.

120. Tuschl, T. (2002). Expanding small RNA interference. Nat. Biotechno. 20,446-448.

121. Ullu, E., and C. Tschudi. (1984). Alu sequences are processed 7SL RNA genes. Nature (London) 312,171-172.

122. Ullu E., Weiner A.M. (1985). Upstream sequences modulate the internal promoter of the human 7SL RNA gene. Nature 318(6044):371-4.

123. Vargason, J. M., Szittya, G., Burgyan, J. & Hall, T. M. (2003). Size selective recognition of siRNA by an RNA silencing suppressor. Cell 115,799-811.

124. Varmus, H., and P. Brown. (1989). Retroviruses, pp. 53-108 in Mobile DNA, edited by D. Berg, and M. Howe. American society for microbiology, Washington DC.

125. Vassaman, D. M., B. A. Dombroski, J. V. Moran, M. L. Kimberland, T. P. Naas, R. J. DeBerardinis, A. Gabriel, G. D. Swergold, and H. H. Kazazian, Jr.(1997). Many human LI elements are capable of retrotransposition. Nat. Genet. 16,37-43.

126. Vaury C, Abad P, Pelisson A, Lenoir A, Bucheton A. (1990). Molecular characteristics of the heterochromatic I elements from a reactive strain of Drosophila melanogaster. J Mol Evol. Nov;31(5):424-31.

127. Vazquez, F., Gasciolli, V., Crete, P. & Vaucheret, H. (2004). The nuclear dsRNA binding protein HYL1 is required for microRNA accumulation and plant development, but not post-transcriptional transgene silencing. Curr. Biol. 14,346-351.

128. Vella, M.C., Choi, E.Y., Lin, S.Y., Reinert, K., and Slack, F.J. (2004). The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes Dev. 18,132-137.

129. Voinnet, O. (2001). RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet 17, 449-459.

130. Wassenegger, M. & Pelissier, T. (1998). A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol.Biol. 37,349-362.

131. Waterhouse, P. M., Wang, M. & Finnegan, E. J. (2001). Role of short RNAs in gene silencing. Trends Plant Sci.6,297-301.

132. Waterhouse PM, Wang MB, Lough T. (2001). Gene silencing as an adaptive defence against viruses. Nature 14;411(6839), 834-42.

133. Wei,W., Gilbert,N., Ooi, S.L., Lawler, J.F., Ostertag, E.M., Kazazian, H.H., Boeke, J.D. and Moran, J.V. (2001). Human LI retrotransposition: cis preference versus trans complementation. Mol. Cell. Biol. 21,1429-1439.

134. Wilder J, Hollocher H. (2001). Mobile elements and the genesis of microsatellites in dipterans. Mol Biol Evol.18,384-392.

135. Williams, R. W. & Rubin, G. M. (2002). ARGONAUTE1 is required for efficient RNA interference in Drosophila embryos. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99,6889-6894.

136. Xie, Z. et al. (2004). Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol. 2, E104.

137. Xiong Y, and.Eickbush T. H (1990). Origin and evolution of retroelements based upon their revese transcriptase sequences. The EMBO Journal 9(10), .3353-3362.

138. Xiong Y. and Eickbush T. H. (1988). Similarity of reverse transcriptase-like sequences of viruses, transposable elements, and mitochondrial introns. Mol Biol Evol. 5(6), 675-90.

139. Ye, K., Malinina, L. & Patel, D. J. Recognition of small interfering RNA by a viral suppressor of RNA silencing. Nature 426, 874-878.

140. Yi, R., Qin, Y., Macara, I. G. & Cullen, B. R. (2003). Exportin-5 mediates the nuclear export of premicroRNAs and short hairpin RNAs. Genes Dev. 17,3011-3016.

141. Yoshioka, K., H. Kanda, H. Akiba, M. Enoki and T. Shiba. (1991). Identification of an unusual structure in the Drosophila melanogaster transposable element copia: evidence for copia transposition through an RNA intermediate. Gene 103,179-84.

142. Zamore, P.D. (2002). Ancient pathways programmed by small RNAs. Science 296,1265-1269

143. Zhang X, EickbushTH. (2005). Characterization of Active R2 Retrotransposition in the rDNA Locus of Drosophila simulans. Genetics 170(1), 195-205.

144. Zhang, H., Kolb, F. A., Brondani, V., Billy, E. & Filipowicz, W. (2002). Human Dicer preferentially cleaves dsRNAs at their termini without a requirement for ATP. EMBO J. 21, 5875-5885.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Кретова, Ольга Валерьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Анализ транскрипции суффикса-короткого ретроэлемента из генома D. Melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы