Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ локуса Delta у Drosophila virilis

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ локуса Delta у Drosophila virilis"

На правах рукописи

^5.113.15

2 8 кюн ?т

РЫБЦОВА Наталия Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛОКУСА БЕЬТА У ОКОБОРНИА УШИБ.

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2000

Работа выполнена в лаборатории нейрогенетики и генетики развития Института биологии гена РАН.

Научные руководители:

член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор Л. И. Корочкни.

доктор биологических наук, профессор М. Б. Евгеньев.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В. Г. Митрофанов, кандидат биологических наук М. И. Соколова.

Ведущая организация:

Ленинградский Государственный Университет, кафедра генетики и селекции.

Защита диссертации состоится «....Ф......года

в «....» часов на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва,ул. Вавилова,34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу 117984, Москва,ул. Вавилова,32.

Автореферат разослан «

.2000 года.

Ученый секретарь Диссертационного совет? канд. фарм. наук

Грабовская Л. С.

£ ом. о

^ ю V О ./3, д

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность задачи.

Развитие нервной системы дрозофилы контролируется многими системами генов. Генетический и молекулярный анализ известных нейрогенных и пронейральных генов Drosophila melanogaster позволил определить некоторые механизмы их функционирования (Campos-Ortega, 1995; Bray, 1998).

В раннем нейрогенезе активность пронейральных генов (таких, как гены achaete-scute комплекса, cut и др.) направляет развитие клетки по нейральному пути. Мутации по пронейральным генам обусловливают недоразвитие как периферической, так и центральной нервной системы дрозофилы. Функция нейрогенных генов {Notch, Delta, Serrate и др.), напротив, заключается в репрессии нейралыюго пути развития, мутации в них вызывают гипертрофию нервной ткани. Продукты многих из этих локусов контролируют экспрессию генов, участвуют в межклеточных взаимодействиях, определяя судьбу клеток (выбор клетками их пути развития) на разных этапах эмбриогенеза и метаморфоза дрозофилы (Rooke et al., 1998).

Особенно важную роль в нейрогенезе D. melanogaster играют гены так называемого Delta-Notch сигнального комплекса, продукты которых осуществляют индукцию и передачу сигнала латерального ингибирования (Muskavitch et al., 1994; Artavanis-Tsakonas et al., 1995). Генерируя такой сигнал, будущий нейробласт подавляет нейральный потенциал соседних клеток, которые в результате дифференцируются в эпидермобласты (предшественники эпидермальных клеток).

Одним из ключевых генов Delta-Notch сигнального комплекса является ген Delta (Dl). Гомозиготы по мутациям в гене DI, как и в других нейрогенных генах, погибают на эмбриональной стадии развития и характеризуются гипертрофией нервной системы и редукцией эпидермиса (Lehmann et al. 1983). Взрослые мухи, гетерозиготные по таким мутациям, имеют доминантный фенотип, проявляющийся в изменении глаз, щетинок, в утолщении жилок крыльев.

На основании характерного мутантного фенотипа у D.melanogaster было получено несколько £>/-мутаций, как спонтанных, так и

индуцированных (Lindsley et al., 1968; Lehmann et al., 1983), что позволило провести тщательный генетический и молекулярный анализ этого гена.

Ген Delta локализован в районе 92А2 на 3-й хромосоме D.melanogaster. Его регуляторная и кодирующая последовательности составляют примерно 30 т.п.о. (Vassin et al., 1987). Транскрипция гена Dl на ранних этапах эмбриогенеза дрозофилы активируется продуктами пронейральных генов achaete-scute (ÀS-C) комплекса, взаимодействующими со специфическими сайтами промотора Dl (Heitzler et al., 1996; Seugnet et al., 1997).

Продукт гена Dl D.melanogaster - трансмембранный белок-лиганд (Vassin et al., 1987; Kopczynski et al., 1988) - в процессе межклеточных взаимодействий передает сигнал трансмембранному рецептору — продукту локуса Notch (Lecourtois et al., 1995; Schroeter et al., 1998). Результатом взаимодействия белков Notch и Delta является адгезия клеток (Fehon et al., 1990). При активизации лигандом Notch-рецептора на поверхности клетки, белок Notch инициирует каскад внутриклеточных сигналов, регулирующих экспрессию некоторых генов, которые контролируют дифференцировку клеток на разных этапах развития дрозофилы (Lecourtois et al., 1998; Kidd et al., 1998).

Гены, участвующие в регуляции межклеточных взаимодействий у разных видов позвоночных и беспозвоночных, в высокой степени консервативны. Гомологи гена Dl найденьГу разных видов позвоночных и беспозвоночных: у C.elegans (Tax et al., 1994), y лягушек Xenopus (Chitnis et al., 1995), кур (Henrique et al., 1995,) мышей (Dunwoodie et al., 1997) и др., a также y человека (Laborda et al., 1993).

Исследование нейрогенных генов может помочь в решении практических медицинских проблем. Так, многие исследования указывают на связь Delta-Notch сигнального комплекса и болезни Альцгеймера. На мышиных эмбрионах было показано, что экспрессия генов Dill (Delta-like gene 1) и Noichl, которые контролируют сегментацию сомитов и развитие ЦНС, зависит от активности гена presenilin 1 (PSI) (Wong, 1997). Мутации в гомологичном человеческом гене обнаружены в 25% случаев ранней болезни Альцгеймера (Murrel et al., 1991; Donoviel et al., 1999). Гомологи генов presenilins y D.melanogaster также являются положительными регуляторами экспрессии генов Delta-Notch сигнального комплекса (Struhl et al., 1999).

Человеческие гомологи гена Notch обнаружены в большинстве тканей, главным образом в лимфоидных тканях, а также в эмбриональных селезенке, легких и стволе мозга. Предполагается, что Notch играет важную роль в нормальном функционировании лимфоцитов, а мутации в Notch могут обусловливать трансформацию или прогрессирование некоторых Т-клеточных неоплазм (Ellisen et al.,1991).

Наличие генов, гомологичных Delta и Notch D.melanogaster, у позвоночных, включая млекопитающих и человека (de la Pompa et al., 1997), показывает, что исследование этих генов имеет универсальное значение в определении всеобщих закономерностей развития и эволюции нервной ткани.

Поэтому несомненно интересным представляется сравнительное исследование организации гена DI у двух видов дрозофилы -D.melanogaster и D.virilis, дивергировавших около 60 млн. лет назад и относящихся к разным подродам рода D/osophila (Beverly et al., 1984).

При исследовании гибридного дисгенеза у Drosophila virilis М. Б. Евгеньевым с сотр. "(1997) было показано,- что в результате дисгенных скрещиваний происходит мобилизация нескольких транспозонов (таких, как Пенелопа, Улисс и др.), причем локус Delta относится к «горячим точкам» в геноме Drosophila virilis в процессе гибридного дисгенеза. Авторами была получена уникальная коллекция мутаций по локусу DI D.virilis, которая открывает широкие возможности для дальнейшего исследования семейства нейрогенов.

Цель и задачи исследования.

Основной целью настоящей работы являлся молекулярно-генетический анализ гена Delta у Drosophila virilis-. изучение его структуры и особенностей функционирования в сравнении с соответствующим геном D. melanogaster.

В ходе исследования предполагалось решение следующих экспериментальных задач:

1. Клонирование гена Delta Drosophila virilis.

2. Локализация гена Delta на политенных хромосомах D.virilis.

3. Секвенирование фрагментов ДНК, содержащих последовательности гена Delta Drosophila virilis, и сравнение структуры этого локуса с соответствующим локусом D.melanogaster.

4. Компьютерный анализ предполагаемого белкового продукта, кодируемого локусом Delta D.virilis.

5. Определение числа и размеров основных транскриптов гена Delta Drosophila virilis и сравнение транскрипционной активности этого локуса в эмбриогенезе D.virilis и D.melanogaster.

6. Изучение пространственно-временного распределения транскриптов гена Delta в эмбрионах Drosophila virilis на различных стадиях развития.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В работе впервые проведено молекулярное клонирование гена Delta Drosophila virilis, а также сравнительный анализ структуры и функционирования гена Dl у двух видов дрозофилы - D.melanogaster и D.virilis, дивергировавших около 60 млн. лет назад и относящихся к разным подродам рода Drosophila.

Из геномной библиотеки D.virilis был выделен клон (клон D15), содержащий последовательности, гомологичные нейрогенному локусу DI D.melanogaster. Методом in situ гибридизации ген Delta был локализован в районе 21F во 2 хромосоме D.virilis. В качестве зонда использовали клон D15. Проведенная локализация подтвердила и уточнила результаты цитогенетического анализа, при котором с использованием индуцированных хромосомных перестроек было показано, что локус Delta у D.virilis расположен в 21 секции второй хромосомы.

Было проведено рестриктное картирование клона D15 и определена зона D/-л о куса, соответствующие участки клона были секвенированы. Выявлена высокая гомология последовательности ДНК фрагмента клона D15 наибольшему экзону гена Dl D.melanogaster, содержащему половину всей кодирующей последовательности этого гена.

Компьютерный анализ последовательности ДНК исследуемого фрагмента клона D15 показал, что данный фрагмент кодирует часть

предполагаемого белка Delta D.virilis, гомологичного на 82% белку Delta D.melanogaster. Обнаружено четыре мажорных транскрипта локуса DI D.virilis: два зиготических и два материнских. Методом нерадиоактивной гибридизации in situ на целых эмбрионах показано сходство тканеспецифичности экспрессии гена DI у D.virilis и D.melancgaster на разных стадиях эмбрионального развития.

Были проанализированы несколько линий D.virilis с мутантным Delta фенотипом с помощью метода гибридизации in situ на политенных хромосомах. Было определено, что в дисгенной линии Dlm одна из копий мобильного элемента Пенелопы, активизирующегося в дисгенезе D.virilis, локализуется в том же районе хромосомы- 21F, где и ген Delta D.virilis. Результаты Саузерн-блот анализа показали, что в геномной ДНК то мух линии DlMB утрачен один сайт рестрикции по Xbal, присутствующий в локусе Delta у D.virilis дикого типа. Это позволило предположить, что у линии DlME Пенелопа могла встроиться непосредственно в ген Delta. Кроме того, методом нерадиоактивной гибридизации in situ показано нарушение пространственного паттерна экспрессии гена DI в Dlm-эмбрионах.

Дальнейшее исследование локуса Delta D.virilis с использованием мутантных линий позволит определить молекулярно-генетические механизмы регуляции его экспрессии и особенности функционирования этого локуса у D.virilis, что, в свою очередь, имеет существенное значение для лучшего понимания механизмов регуляции развития и дифференцировки эукариотических клеток.

Апробация работы:

Результаты работы были представлены на 16-й Европейской конференции по дрозофиле (Цюрих, Швейцария, 1999) и на конференции молодых ученых ИБГ РАН (Москва, 1999).

Публикации:

По теме диссертации опубликованы 2 печатные работы и одна принята в печать.

Структура н объем диссертации:

Диссертация изложена на страницах машинописного текста,

содержит .рисунков и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Библиография включает /^йюточкиков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Клонирование гена Delta D.virilis.

Для клонирования локуса Dl у Drosophila virilis была использована геномная библиотека из имаго D.virilis линии 160 в векторе лямбда DASH (Evgen 'ev at al. 1997). При скринировании библиотеки в качестве меченого зонда использовали к ДНК клон D.melanogaster, содержащий полную кодирующую последовательность гена Dl (Kopczynski et al., 1988). Выделено несколько геномных клонов D.virilis. Проведенный Саузерн-блот анализ этих клонов показал, что большинство из них очень слабо гибридизуются с зондом. Для дальнейшей работы был выбран клон D15, проявивший наиболее интенсивную гибридизацию и содержащий большую часть гена Dl D.virilis (14 т.п.о.).

Цитогенетическин анализ и локализация гена Dl на политенных хромосомах Drosophila virilis.

Локус Dl D.virilis был цитогенетически картирован с помощью различных хромосомных перестроек (Губенко и др., 1998). Анализ структуры политенных хромосом при перестройках показал, что у Dl -гетерозиготных особей разных линий по крайней мере один из разрывов расположен в районе 21Е-Н (рис.1). Более точное картирование локуса Dl в этой серии опытов оказалось невозможным в связи с тем, что эффекты разных аллелей Dl могли быть модифицированы гетерохроматизацией соответствующих районов хромосомы 2.

АВСБЕР в Н АВСОЕГ вН 1111111 А В С И Е Г ОН 1 1 I 1 1 1 1 |

| 1 1 1 1 1 1 1

20 20 21 4-теломера

21 22 22 центромера-

1п(2)Ш6 1п(2)017 1п(2)01ЕЕ

78е*

Т(2;3)01

Т(2;3)0122

Т(2;3)0118

Т(2;хц)В1а

Т(2;хц)01а

Т(2;хц)Ш°

Т(Х;2)ВВ

Т(У;2)01781

Т(2;3)015

БГ(2)ОГ

..л_

1:_

—*"240

Рис.1. Хромосомные перестройки, обнаруженные у £)/ - мутантов. Места разрывов обозначены на схематической карте районов дистального конца хромосомы 2, построенной на основе фотографической карты хромосом О-ушИэ (ОиЬепко ГБ., Evgen'ev М.В.,1984). В случае делеций (две БГ вверху) отсутствующий район хромосомы обозначен пунктирной линией, в случае инверсий и транслокаций (внизу) сплошной линией обозначены инвертируемые и транслоцируемые районы, а места разрывов хромосом указаны стрелками. Прерывистость сплошной линии (точки) обозначает неопределенность в идентификации точек разрыва в отдельных районах.

В связи с этим мы решили уточнить локализацию гена DI на цитологической карте с помощью метода гибридизации in situ.

Гибридизацию проводили, как описано (Lim, et al., 1993), на политенных хромосомах слюнных желез, приготовленных из личинок третьего возраста Drosophila virilis дикого типа. В качестве зонда для гибридизации использовали клон D15, содержащий большую часть гена DI D.virilis. Для идентификации районов хромосом пользовались фотографической картой хромосом D.virilis (Gubenko I.S., Evgen'ev М.В., 1984).

Рис.2. In situ гибридизация Dl-5 клона с хромосомами D.virilis. Стрелками отмечен район 21 F (виден сильно гибридизующийся диск), содержащий ген Delta (Dl).

Эксперименты по гибридизации in situ на политенных хромосомах позволили выявить единственный сайт гибридизации с этим зондом - в районе 21F (рис.2). На фотографической карте в этом районе идентифицирован один крупный диск, проксимальная часть которого иногда деконденсирована.

Сравнение нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена Dl у D.virtlis и D.melanogaster.

Клон D15 был картирован с использованием нескольких рестриктаз (рис.3). Рестриктные фрагменты клона D15 были субклонированы в плазмиду Bluescript (SK'). Несколько фрагментов были частично секвенированы, полностью секвенирован фрагмент "1,8" (Б15/1,8т,п.о./ Хва1), проявивший наиболее интенсивную гибридизацию с зондом - кДНК клоном, который содержит полную кодирующую последовательность гена Dl D.melanogaster (клон Dl 1 : Kopczynski et al., 1988).

Анализ нуклеотидной последовательности этого фрагмента по программе BLAST выявил высокую гомологию с мРНК гена DI D.melanogaster размером 2889 т.п.о. (в базе данных GenBank обозначена emb|Y00222|DMDELTA), которая соответствует кДНКовому клону D11 (рис.4), кодирующему белок Dl D.melanogaster (832 аминокислоты) (Kopczynski et al., 1988).

При сравнении нуклеотидной последовательности фрагмента "1,8" и гомологичного фрагмента кДНК D.melanogaster с рестриктной картой и схемой экзон-интронной организации локуса Dl D.melanogaster (Kopczynski et al., 1988; Haenlin et al., 1990), мы обнаружили, что данный фрагмент кДНК соответствует последнему (шестому) экзону этого локуса (рис.3).

Анализ трех возможных открытых рамок считывания в фрагменте "1,8" с помощью нескольких компьютерных программ (BLAST, GENSCAN, GeneFinder, GRAIL, ВСМ Search Launcher) позволил в одной из рамок предсказать белковую последовательность из 449 аминокислот, высокогомологичную (83%) белку Dl D.melanogaster (в базе данных GenBank обозначен етЬ!САА68369|(У0022ф2)) (рис.5), а именно его второй половине, содержащей трансмембранный домен, внутриклеточную часть, а также фрагмент внеклеточной части белка (Kopczynski et al., 1988).

Клон D15

(R) S Hd X H В X R R R (R)

i_i_i_''il_i_i_i_i

1 т.п.н.

D1 кДНК

ATG

P P RPK'R R B' R P

i i_41 i_i_i_i_l_

TAA

I

KP P R P P R

—lj_i_i i l_l_

3'

| PoIy(A)

AUG

UAA

5

Рис.3. Сравнение структуры клона D15 Drosophila virilis с локусом D! D.melanogaster.

A - Карта рестрикции клона D15 D.virilis. Б - Физическая карта локуса D! D.melanogaster и схема клона кДНК, содержащего полную кодирующую последовательность гена D! D.melanogaster (Kopczynski et al., 1989; Haenlin et al., 1990). Пунктирными линиями обозначены геномные сайты рестрикции, сохранившиеся в кДНК. Область гомологии последовательности кДНК с клоном D15 D.virilis показана толстыми линиями. Снизу приведена схема одного из мажорных транскриптов (мРНК 3,6 т.п.о.) локуса Dî D.melanogaster: черным цетом изображены экзоны, тонкой линией - интрокы. Два других мажорных транскрипта (не показаны) отличаются только длиной 3'-нетранслируемой части (Haenlin et al., 1990). Обозначения: Т-теломера, С -центромера; ATG (AUG) -предполагаемый старт-кодон, TAA (UAA) - стоп-кодон. Сайты рестрикции показаны вертикальными линиями: R -EcoRI; S - SacI; Hd - Hindlll; X - Xbal; В - BamHI; H - HincII; P - Pstl.

фрагмент "1,8" клона D15 D.virilis

l

X РН НРРВРР ТАА X

1396 2093 Î 2638 2889

кДНК Dl D.melanogaster

100 п.о.

I I I I I I I I I I I I I î î I I î I I

Рис.4. Схема нуклеотидной гомологии фрагмента "1,8" клопа D15 D.virilis (D15/1.8/Xbal) и кДНК гена Dl D.melanogaster. Гомологичные участки обозначены толстьми линиями. Нумерация нуклеотидов указана согласно данным компьютерной программы BLASTN. Показаны проценты идентичности нуклеотидных последовательностей. Представлены некоторые рестриктные сайты, рассчитанные по программе Webcutter (условные обозначения, как в рисунке 3). Единственный совпадающий сайт Hinc II показан стрелками. Отмечено расположение стоп-кодонов (ТАА).

Наибольшая рамка считывания исследуемой последовательности длиной 1885 п.о. заканчивается терминирующим кодоном ТАА в положении 1348 п.о. от начала фрагмента (рис.4). Длина кодирующей последовательности фрагмента "1,8" - 1347 п.о. (со 2 по 1348). Длина соответствующей части кДНК Dl D.melanogaster, начиная с 1396 нуклеотида до стоп-кодона (2638), равна 1243 п.о., т.е. на 104 п.о. меньше, чем кодирующая часть исследуемой последовательности D.virilis. С этим согласуется и тот факт, что внутриклеточный домен предполагаемого Dl-белка D.virilis на 35 аминокислот длиннее, чем у D1-белка D.melanogaster (рис.5).

Ж.

1348 m 1

89% I ! 92%

1885

emb|CAA68369|(Y00222) delta protein [Drosophila melanogaster] Length = 832

.1

Score = 715 bits (1825), Expect = 0.0

Identities = 349/450(77%), Positives = 378/450(83%), Gaps = 37/450(8%)

j iittitiiiti v.: 1 DDCVGHKCQMGGTCi DMLNQYRCQ

Lf|Ng+P£^"pg;-'SCQP+Gi^+i3P 'gi:+p"'+SE_NIDDC+GH+C+NG,GTCIDM+NOYRCQ m. :419 jEDflgfj^FC^^^

^ 3#P-7 ••> in,, iii

(182)'

v.: 61

CVPGKHG CSS+^lgb gLNNDgol рй^^рЩз+бШС S PC

m. :479 ¿УРбГНОТЯСЗВШШЩ^^^

' ллл ЭФР-8 iitiiniiiii ЭФР-9

(362) iiiiiiiiiiii ssssss&s

v. : 121 HNGGTCtWRTOSFECVCANGFRGKQCDEESyDSVSFDAHQYGATTQARADGLTNAQVVI.I

hnggtcmnrvnsfecvcaugfrgkqcdeesydsv+fdahqygattqaradgltnaqwli

m. :539 HNGGTCMKRVNSFECVCAHGFRGKQCDEESYDSVTFDAHQYGATTQARADGLTNAQWLI '""■'""" 5sssssss

(542) ****

V. г 181 AIFSVAMPLVAVIAACWFCMKRKRKRAQEKDDAEARKQNEQNAVATLHHNGSGVGVGVG A+FSVAMPLVAVIAACWFCMKRKRKRAQEKDDAEARKQNEQNAVAT+HHNGSGVGV

m. : 599 AVFSVAMPLVAVTAACWFCMKRKRKRAQEKDDAEARKQNEQNAVATMHHNGSGVGV---

TM ****

(722) ----

v.:241 VGGLPAGTLGVKRGSSGGLTFDNSNPNIIKNTWDKSVNNICASAAAAAAAAAAADECRMY L + +LG К GS+ GLTFD NPNIIKNTWDKSVNNICASAAAAAAAAAAADEC MY m. : 657 —ALASASLGGKTGSNSGLTFDGGNPNIIKNTWDKSVNNICASAAAAAAAAAAADECLMY

(902)

v.:301 SGALANYAAAADNNANSEFCGVGQIAPLQRAKSQKQLNTDPTLMHRASQLLSAGAGAAGA

G + A +NNANS+FC +APLQRAKSQKQLNTDPTLMHR S AG+ A G m. : 714 GG—YVASVADNNNANSDFC----VAPLQRAKSQKQLNTDPTLMHRGS---PAGSSAKG-

АЛЛ

(1082) ____

v.:361 AAAAAAAAAASAGSTKDYSASGAGTGASEGKGKRISVLGEGSYCSQRWPSLAAAGVAGAC

ASG G GA+E GKRISVLGEGSYCSQRWPSLAAAGVAGAC m. :764 -------------------ASGGGPGAAE—GKRISVLGEGSYCSQRWPSLAAAGVAGAC

(1261)

v. :421 SSQLMAAASATGS-GAATTQRT WCGTPHM 449(1348)

SSQLMAAASA G+ G A .QR+WCGTPHM m. :803 SSQLMAAASAAGTDGTAQQQRSWCGTPHM 832

Рисунок 5. (Подпись см. на след. стр.).

Наружная часть белка DI D.melanogaster содержит 9 доменов, гомологичных рецептору ЭФР (эпидермального фактора роста) позвоночных (Kopczynski et al., 1988). ЭФР-подобный домен - это последовательность из 30-40 аминокислот, в более или менее консервативном виде найденная в большом количестве различных, преимущественно животных, белков, участвующих в межклеточных взаимодействиях. ЭФР-домены служат для связывания белка D1 D.melanogaster с рецепторным белком Notch, который в своей наружной части имеет 36 таких доменов (Muskavitch, 1994; Artavanis-Tsakonas et al., 1995; Campos-Ortega, 1995; Bray, 1998).

Предполагаемый белок DI D.virilis содержит 3 домена, гомологичных 7-9-му ЭФР-повторам белка DI D.melanogaster, а также часть 6-го домена (рис.5). Все консервативные аминокислоты, присутствующие в этих ЭФР подобных доменах у разных протеинов и разных видов, сохраняются и в белке DI D.virilis.

Рис.5 (на стр. 12). Сравнение фрагмента предполагаемого белка Delta D.virilis с белком Delta D.melanogaster (программы BLASTP, BLASTX, GENESCAN, Search Launcher). Обозначения: v. - аминокислотная последовательность, соответствующая фрагменту "1,8" клона D15 D.virilis; т.- белок D1 D.melanogaster. ЭФР-подобные домены заштрихованы. Между последовательностями показаны идентичные и сходные (+) аминокислоты, причем консервативные аминокислоты, характерные для ЭФР-доменов, заштрихованы. Показана нумерация аминокислот, в скобках приведены соответствующие номера нуклеотидов (от начала фрагмента "1,8"). Трансмембранный домен (ТМ) выделен жирным шрифтом. Показаны предполагаемые (согласно программе PROSITE) сайты модификации белков: сайты фосфорилирования (л) - для протеин-киназы С; (.) - для цАМФ- и цГМФ- зависимой протеин-киназы; (&) - для тнрозин-киназы; (_) - для казеин-киназы II; (*) - сайт гликозилирования, (') - сайты гидроксилирования аспарагина и аспартата.

Область белка D1 D.virilis, содержащая ЭФР подобные домены, оказалась на 50-60% гомологичной соответствующим ЭФР-содержащим участкам из многих белков-гомологов Delta и Notch (C.elegans, улитки, лягушек, мышей, крыс, кур, человека и др.).

С помощью программы PROSITE во внутренней части белка Delta D.virilis выявлено несколько возможных сайтов модификации белка, содержащихся и в Delta D.melanogaster: сайты фосфорилирования, гликозилирования и гидроксилирования (рис.5).

Компьютерный анализ показал, что степень гомологии сравниваемых белковых фрагментов D.virilis и D.melanogaster гораздо выше, чем гомология соответствующих участков. ДНК (рис. 4 и 5). Учитывая, что виды группы virilis и вид D.melanogaster дивергировали от общих предковых форм дрозофилы около 60 млн. лет назад (Throckmorton, 1982; Beverly et al., 1984), наличие протяженных высоко-консервативных участков в белках D1 D.virilis и D.melanogaster может свидетельствовать о функциональной значимости этих участков.

Таким образом, первичный анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей фрагментов гена DI у D.virilis и D.melanogaster показал, что несмотря на изменчивость ДНК гена DI, его продукт консервативен. Отличие этих белков состоит в том, что внутриклеточная часть Dl-белка D.virilis на 35 аминокислот длиннее, чем у белка D1 D.melanogaster (рис.5).

Исследование транскрипционной активности локуса Delta D.virilis.

Известно, что ген DI D.melanogaster наиболее активно экспрессируется на ранних стадиях эмбриогенеза (Vassin et al., 1987; Kopczynski et al., 1988; Haenlin et al., 1990). Предварительные Нозерн-блот эксперименты с препаратами тотальной РНК D.virilis показали, что

максимальный уровень экспрессии локуса Delta D.virilis также приходится на эмбриональные стадии.

Дня более подробного изучения транскрипциошюй активности локуса Delta D.virilis мы провели Нозерн-блот гибридизационный анализ поли(А)+ РНК, выделенной из эмбрионов линии D.virilis дикого типа на разных стадиях эмбрионального развития: 0-3, 3-6 и 6-16 часов (рис.6). В качестве зонда мы использовали субфрагменг клона D15 D.virilis - "1,8", который высокогомологичен последнему, 6 экзону гена Delta D.melanogaster (Kopczynski et al., 1988; Haenlin et al., 1990), входящему в состав всех мажорных (транслируемых) мРНК этого локуса (рис.3). С помощью этого зонда мы предполагали обнаружить соответствующие транскрипты гена DI D.virilis.

Ген Delta D.melanogaster имеет несколько транскриптов: три мажорных (5,4; 4,5; 3,6 т.п.о.) и 5 минорных. Мажорные транскрипты кодируют один и тот же белок, структурно они отличаются только по длине З'-нетранслируемых частей (рис.3) и выявляются на разных стадиях эмбриогенеза D.melanogaster (Haenlin et al., 1990). Минорные транскрипты не транслируются, а вырезаются из первичной мРНК в процессе сплайсинга.

В отличие от D.melanogaster для локуса Delta D.virilis обнаружено не 3, а 4 мажорных (вероятно, транслируемых) транскрипта. Из них три мРНК - 5.7, 4.8 и 3.9 т.п.о. - по размеру похожи на мажорные транскрипты локуса Delta D.melanogaster (рис.6). Небольшая разница в размерах коррелирует с данными анализа последовательностей ДНК и белка Del D.virilis (рис.4,5).

Из трех мажорных транскриптов D.melanogaster один (5.4 т.п.о.) считается зиготическим, а два других, размером 4,6 и 3,6 т.п.о. материнскими (Haenlin et al., 1990). Интенсивность гибридизации зонда с мРНК D.virilis различается на разных стадиях развития эмбриона (рис.6.).

К 1 2 3

Ш Ш - 3,9

^Ц - 2,8

Рис.б. Транскрипция локуса Delta в раннем эмбриогенезе D.virilis. Нозерн-гибридизация эмбриональной РНК с геномным фрагментом "1,8" D.virilis, гомологичным наибольшему экзону гена Delta D.melanogaster. Этот экзоп входит в состав основных, транслируемых, транскриптов Delta D.melanogaster. Для фореза на каждую дорожку брали по 2 мкг поли(А)+ РНК, выделенной из " эмбрионов нескольких стадий: К (контроль) - эмбрионы D.melanogaster стадии 36 ч (на этой стадии видны два из трех основных транскриптов); эмбрионы D.virilis : стадий 0-3 ч (1), 3-6 ч (2) и 6-16 ч (3).

Количество транскрипта 5.7 т.п.о. постепенно возрастает и достигает максимума на стадии 6-16 ч. На ранней стадии 0-3 ч количество транскрипта 4.8 т.п.о. невелико, затем немного увеличивается и остается примерно на одинаковом уровне с 3 до 16 часов. Транскрипты D.virilis 3.9 и 2.8 т.п.о., вероятно, являются материнскими, поскольку максимальное количество их наблюдается на ранней стадии развития 0-3 ч, постепенно уменьшаясь и исчезая на поздних стадиях.

Таким образом, у D.virilis локус Delta кодирует, по крайней мере, два зиготических (5,7 и 4,8 т.п.о.) и два материнских (3,9 и 2,8 т.п.о.) мажорных транскрипта.

Локализация мРНК гена Delta D.virilis в эмбрионах на разных стадиях развития.

Для изучения пространственного распределения транскриптов гена Delta в эмбрионах D.virilis на разных стадиях развития и сравнения с паттерном эмбриональной экспрессии этого гена у D.melanogaster (Vassifl et al., 1987; Kopczynski et al., 1989; Haenlin et al., 1990) мы применили метод гибридизации in situ целых эмбрионов с нерадиоактивным (дигоксигениновым) зондом (Tautz et al., 1994). В качестве зонда использовали фрагмент клона D15 - "1,8", который кодирует примерно половину белка Delta D.virilis (рис.5).

Тргнскрипты гена Delta D.virilis первоначально обнаруживаются на стадиях синцитиальной бластодермы (4 стадия- здесь и далее указаны соответствующие стадии эбрионального развития D.melanogaster по Hartenstein, 1993), мРНК распределена диффузно по всему эмбриону. В начале стадии клеточной бластодермы (5 стадия), наблюдается накопление мРНК в нейрогенной эктодерме с двух боковых сторон эмбриона (рис.7: а,е), причем транскрипты локализуются в четырех доменах, сходно с экспрессией gap-генов (Lawrence, 1992; Корочкин, 1999).

В начале гаструляции (7 стадия) локализация транскриптов в нейроэктодерме становится метамерной (рис.7: б,ж). Транскрипты распределяются по семи поперечным полоскам подобно экспрессии pair-rule- генов. Аналогичный паттерн ранней эмбриональной экспрессии гена Delta описан у D.melanogaster. Предполагается, что у D.melanogaster экспрессия гена Delta напрямую ули опосредованно регулируется gap генами и pair-rule генами (Haenlin et al., ! -990).

Непосредственно перед сегрегацией нейробластов (предшественников нервных клеток) (стадия 8) метамерный паттерн локализации Delta мРНК исчезает, транскрипты распределяются в эмбрионах диффузно (на рисунке не показано).

Рис.7. Локализация Delta РНК в эмбрионах D.virilis методом нерадиоактивной in situ гибридизации. Зонд - геномный фрагмент "1,8", содержащий большую часть кодирующей последовательности гена Delta D.virilis. Ориентация эмбрионов: а-д -латеральный вид (передняя часть слева, дорзальная - сверху), е-к - дорзовентральный вид (передняя часть слева). На препаратах области гибридизации окрашены синим цветом, а на черно-белых фотографиях им соответствуют темные пятна. Фотографии были выполнены на микроскопе системы Nikon с применением компьютерной программы Vidcap-32. Маленькими стрелками указаны gap-gene-подобиыс (а) и pair-ги/е-^еие-подобные (б) участки экспрессии гена Delta. Обозначения: pi -процефалическис доли, cf- цефалическая борозда, hg -задняя кишка, ms - мезодерма, am - передний отдел средней кишки, рт - задний отдел средней кишки, NB -нейробласты, Ьг - мозг, пс - нервный ствол, ol - оптические доли, ер - эпидермальный клеточный слой, PNS - отдельные элементы периферической нервной системы.

С начала удлинения зародышевого листка (стадия 8-9) до его укорачивания (примерно 12 стадия) (рис.7: в-д; з,и) транскрипты Delta ткапливагатся в эптодермальных производных: переднем отделе средней шшки (am) и заднем отделе средней кишки (рт).

Во время сегрегации нейробластов (стадия 9-10) у D.virilis, как и у D.melanogaster (Kopczynski et al., 1989; Haenlin et al., 1990), вся 1ейроэктодерма содержит мРНК Delta (рис.7: в,з), причем снова четко различаются темно окрашенные полосы в сегментах. Кроме того, высокий фовень гибридизации наблюдается в мезодермальных и периферических жтодермальных слоях клеток.

Как известно, у D.melanogaster в эмбриональных сегментах гейробласты образуют своеобразные клеточные кластеры (Campos-Ortega, ¡995; Bray, 1998). В этих кластерах экспрессируются пронейральные гены ichaete-scute . комплекса (AS-C), играющие важную роль в (ифференцировке нейробластов (Heitzler et al., 1996). Сходство паттернов депрессии гена Delta и AS-С генов у D.melanogaster не случайно. )казалось, что транскрипция гена DI в нейроэктодерме дрозофилы в >аннем эмбриогенезе активируется продуктами AS-C генов (Kunisch et al., 994; Seugnet et al., 1997).

После сегрегации нейробластов, на стадии 11, гибридизация в егментах сохраняется и ясно видны отдельные нейробласты (рис.7: г,и). "ранскрипты Delta накапливаются в группах клеток латерального и ентрального эпидермиса, соответствующих развивающимся сенсорным рганам. На этой и более поздних стадиях (рис.7: д,к) заметное количество ~)elta мРНК наблюдается в головной части эмбрионов.

Полученные результаты показывают, что обнаруженные нами ранскрипты гена Delta, которые, по-видимому, кодируют оответствующий белок, локализуются в эмбрионах D.virilis в тех же рганах и тканях и на тех же стадиях развития, что и у D.melanogaster Vassin et al., 1987; Kopczynski et al., 1989; Haenlin et al., 1990). Характер аспределения транскриптов Delta в эмбриогенезе в разных типах клеток

отражает функцию продукта гена Delta, участвующего в межклеточных взаимодействиях, определяющих судьбу клеток на разных этапах развития дрозофилы.

Исследование /)е//д-мутантных линий D.virilis.

Для исследования функциональной значимости различных участков гена Delta у D.virilis представлялось интересным проанализировать ряд Delta-мутантных линий. В нашем распоряжении имелись две коллекции таких мутантов D.virilis-. линии с хромосомными перестройками, индуцированными рентгеновским облучением (рис. 1) (Губенко и др., 1995) и линии, полученные в результате дисгенных скрещиваний, при которых мобилизуется несколько транспозонов (Евгеньев и др., 1997).

Методом гибридизации in situ на политенных хромосомах было определено, что' Ь дисгенной линии одна из копий мобильного

элемента Пенелопы обнаруживается в том же районе хромосомы - 21F, где и ген Delta D.virilis. Результаты Саузерн-блот анализа (рис. 8) показали, что в геномной ДНК из мух линии DlMB утрачен один сайт рестрикции по

1 2 3 4 5 6

Xbal, присутствующий в локусе De'ta у D.virilis дикого типа.

Рис.8. Саузерн-блот гибридизация геномной ДНК из мух И.утШ с геномным фрагментом "1,8". Геномную ДНК из мутантных линий (1 и 4 - линия й1ЕЕ (см. рис.1), 2 и 5 - линия В1Ш) и мух дикого типа (3 и 6) расщепляли рестриктазами ХЬа1 (1-3) и ХЬа1+Нт<Ш1 (4-6).

Это позволило предположить, что у линии Dlm Пенелопа могла встроиться непосредственно в ген Delta. В отличие от данной дисгенной линии, в линии Dl^, где разрыв при инверсии произошел в районе хромосомы 21Е (рис. 1), структура гена D1 не повреждена, что подтверждает и Саузерн-анализ (рис. 8).

Методом нерадиоактивной гибридизации in situ было показано нарушение пространственного паттерна экспрессии гена DI в DlME -эмбрионах (рис. 9). На ранних стадиях развития этих эмбрионов транскрипты Delta локализуются неравномерно, тогда как в эмбрионах D.virilis дикого типа мы наблюдали метамерное распределение Delta мРНК в нейрогенаой эктодерме с двух- боковых сторон (рис.7: а,б,е,ж). По-видимому, последующая гипернейрализация £>/ш-гомозиготных эмбрионов приводит к их гибели. В некоторых Dlm -эмбрионах (вероятно, в гетерозиготных) мы наблюдали нормальный паттерн экспрессии гена DI на всех стадиях развития.

Рис. 9. Локализация Delta РНК в эмбрионах линии DlilB D.virilis методом нерадиоактивной in situ гибридизации. Зонд - геномный фрагмент "1,8", содержащий кодирующую последовательность гена Delta D.virilis. Ориентация эмбрионов: передняя часть слега, а -латеральный вид, б- дорзальньм вид.

Дальнейшее исследование локуса Delta D.virilis с использованием мутантных линий позволит определить молекулярно-генетические механизмы регуляции его экспрессии и дополнительные особенности функционирования этого локуса у D. virilis.

Выводы.

1. Клонирован и картирован участок ДНК размером 14 т.п.о., содержащий 3' область локуса Delta D. virilis.

2. Методом in situ гибридизации ген Delta был локализован в районе 21F во 2 хромосоме D.virilis. Проведенная локализация подтвердила и уточнила результаты цитогенетического анализа локуса Delta D.virilis, выполненного с использованием хромосомных перестроек.

3. ! Секвенирован фрагмент локуса Delta D.virilis, гомологичный последнему (шестому) экзону локуса Dl D.melanogaster.

4. Компьютерный анализ последовательности ДНК исследуемого фрагмента показал, что он кодирует примерно половину предполагаемого белка Delta D.virilis, гомологичного на 83% белку Delta D.melanogaster, причем исследуемая часть Dl-белка D.virilis на 35 аминокислот длиннее, чем у белка Dl D.melanogaster.

5. Определены размеры и количество мажорных транскриптов локуса Delta D.virilis. Установлено, что локус Delta D.virilis кодирует два зиготических (5,7 и 4,8 т.п.о.) и два материнских (3,9 и 2,8 т.п.о.) мажорных транскрипта, в отличие от соответствующего локуса D.melanogaster, где из трех мажорных транскриптов один (5.4 т.п.о.) считается зиготическим, а два других, размером 4,6 и 3,6 т.п.о., материнскими.

6. Анализ распределения мРНК Delta в эмбрионах методом нерадиоактивной гибридизации показал, что транскрипты гена Delta D.virilis локализуются в эмбрионах в тех же органах и тканях и на тех же стадиях развития, что и у D.melanogaster.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Губенко И.С., Рыбцова H.H., Зеленцова Е.С., Лезин Г.Т., Корочкин Л.И., Евгеньев М.Б. Локус Delta у Drosophila virilis: клонирование и хромосомная локализация.// Доклады Академии Наук. 1998. т.358. №4. с.567-569.

2. Rybtsova N.N., Gubenko I.S., Korochkin L.I., Evgen'ev M.B., Molecular and genetic structure and spatiotemporal expression pattern of Drosophila virilis Delta gene.// Abstract. 16th European Drosophila Research Conference. Zürich, 1999.

3. Рыбцова H.H., Зеленцова E.C., Лезин Г.Т., Корочкин Л.И., Евгеньев М.Б. Сравнение структуры и эмбриональной экспрессии локуса Delta у Drosophila virilis и Drosophila melanogaster. // Молекулярная биология (принято в печать).

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ИМБ РАН Зацепиной О.Г., Шостак Н.Г. и Зеленцовой Е.С. за помощь в работе, консультации и обсуждение полученных результатов.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рыбцова, Наталия Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Основные этапы раннего нейрогенеза дрозофилы.

1.1. Формирование нейрогенной закладки.

1.2. Дифференцировка нейробластов.

1.3. Дифференцировка клеток - предшественников сенсорных органов.

2. Гены, контролирующие развитие нервной системы дрозофилы.

3. Основные гены Delta-Notch сигнальной системы D. melanogaster.

3.1. Локус Notch.

3.2. Локус Delta.

3.3. Локус Serrate.

4. Участие Delta-Notch сигнальной системы в жизнедеятельности организмов.

4.1. Плейотропное действие генов Delta и Notch у D. melanogaster.

4.2. Гомологи генов Delta-Notch системы у других организмов.

4.3. Функции гомологов генов Delta и Notch.

5. Молекулярные механизмы Delta-Notch сигнализации.

5.1. Взаимодействие лиганда и рецептора.

5.2. Передача Delta-Notch сигнала в клетку.

5.3. Передача Delta-Notch сигнала из цитоплазмы в ядро.

6. Регуляция функционирования Delta-Notch сигнального пути.

6.1. Регуляция снаружи клетки.

6.2. Посттрансляционные модификации рецептора и лиганда.

6.3. Цитоплазматические факторы, влйяющие на активность Delta-Notch сигнального комплекса.

6.4. Ядерные эффекторы.

7. Филогенетический анализ DSL лигандов.

8. Значение группы Drosophila virilis для молекулярногенетических исследований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Клонирование гена Delta Drosophila virilis.

2. Цитогенетический анализ локуса Dl D. virilis.

3. Локализация гена DI на политенных хромосомах D. virilis.

4. Сравнение нуклеотидных последовательностей гена DI у D. virilis и D. melanogaster.

5. Сравнение аминокислотных последовательностей гена DI у D. virilis и D. melanogaster.

6. Консервативные и дивергированные домены некоторых белков, гомологичных белку Dl D. melanogaster.

7. Поиск предполагаемых сайтов модифицирования белка Delta D. virilis.

8. Исследование транскрипционной активности локуса Delta D. virilis.

9. Локализация мРНК гена Delta D. virilis в эмбрионах на разных стадиях развития.

10. Исследование £)е//а-мутантных линий D. virilis.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ локуса Delta у Drosophila virilis"

Развитие сложного многоклеточного организма из одной клетки - результат координированного взаимодействия многих систем генов. Центральным вопросом биологии развития является выяснение механизма взаимодействия в онтогенезе различных внутренних и внешних факторов, определяющих судьбу клеток. Каждая клетка неоднократно решает задачу выбора дальнейшего пути развития на разных этапах жизни, таких как пролиферация, миграция, рост, дифференцировка и клеточная смерть. Различные автономные и неавтономные клеточные факторы, межклеточные сигналы с разным диапазоном действия направляют развитие клетки в том или ином направлении. Часто для достижения определенных целей в разных аспектах жизни клетки организм использует одну и ту же сигнальную систему, и наоборот, одна программа развития может обеспечиваться взаимодействием разных сигнальных путей.

Центральную роль в определении судьбы клеток в локальных клеточных взаимодействиях играет Delta-Notch-смтнальпая система (или сигнальный путь). Так, многочисленные исследования по регуляции нейрогенеза у дрозофилы показали, что продукты нейрогенных (Notch, Delta, Suppressor of Hairless и др.) и пронейральных (achaete-scute комплекс и др.) генов, являющиеся компонентами Delta-Notch-сигнальной системы, осуществляют индукцию и передачу сигнала латерального ингибирования (Muskavitch et al., 1994; Artavanis-Tsakonas et al., 1995). В процессе латерального ингибирования предшественник нервной клетки подавляет нейральный потенциал соседних клеток, которые в результате дифференцируются в эпидермобласты (предшественники эпидермальных клеток). Впоследствии выяснилось, что Delta-Notch-сигнальная система контролирует выбор клетками их пути развития не только в нейрогенезе, но и во многих других процессах на разных этапах эмбриогенеза и метаморфоза дрозофилы (Artavanis-Tsakonas et al., 1999).

В последние годы исследования, касающиеся ^//я-М^с/г-сигнального пути, вызывают огромный интерес, поскольку ота система контролирует чрезвычайно широкий спектр клеточных процессов, таких как дифференцировка, пролиферация, апоптоз и др., у разных организмов. Гомологи генов Delta и Notch найдены у разных видов позвоночных и беспозвоночных: у C.elegans (Tax et al., 1994), у лягушек Xenopus (Chitnis et al.,1995), кур (Henrique et al., 1995,) мышей (Dunwoodie et al., 1997) и др., а также у человека (Laborda et al, 1993). Наличие генов, гомологичных Delta и Notch, у позвоночных, включая млекопитающих и человека, показывает, что исследование этих генов имеет универсальное значение в определении всеобщих закономерностей регуляции развития и функционирования эукариотических клеток.

Исследование нейрогенных генов может помочь в решении практических медицинских проблем. Обнаружено, что некоторые патологии у человека (болезнь Альцгеймера, синдром CADASIL, некоторые раковые опухоли) и других позвоночных связаны с мутациями в генах, гомологичных Delta и Notch, или с другими дефектами функционирования Delta-Notch-cnmajihtioro пути (Ellisen et al., 1991; Wong, 1997; Struhl et al., 1999).

В настоящее время определена общая схема Delta-Notch сигнализации, выявлены основные компоненты этой системы, а также постоянно пополняющийся набор внешних и внутриклеточных факторов, регулирующих ее функционирование. Тем не менее, остается еще много вопросов, касающихся структуры и взаимодействия всех этих компонентов. В частности, недостаточно понятен механизм взаимодействия лиганда (Delta) и рецептора (Notch), в результате которого последний активируется и передает сигнал внутрь клетки. Некоторые детали взаимодействия внутриклеточной части белка Notch, цитоплазматических и ядерных белков - участников Delta-Notch сигнализации также не ясны. Очень мало известно о том, что происходит с лигандом до и после его непосредственного взаимодействия с рецептором на поверхности клетки.

Пока ничего не известно также о механизмах работы внутренней, наиболее дивергированной, части белка Delta, хотя есть данные о том, что этот цитоплазматический домен важен для функционирования Delta-подобных лигандов (Chitnis et al., 1995; Henderson et. al. ,1997; Lissemore and Starmer, 1999).

Для решения вопросов функционирования различных генов и их продуктов весьма полезно сравнение структуры этих генов, а также особенностей их экспрессии и регуляции у эволюционно отдаленных видов.

Поэтому представлялось интересным сравнить организацию и экспрессию гена Delta у двух видов дрозофилы - D. melanogaster и D. virilis, дивергировавших около 60 млн. лет назад и относящихся к разным подродам рода Drosophila (Beverly et al., 1984). Двенадцать видов группы virilis издавна широко используются как удобный экспериментальный объект в различных эволюционных, цитогенетических, популяционных и биохимических исследованиях. Вид Drosophila virilis на основании анализа хромосом и ряда других морфологических и молекулярных признаков рассматривается как наиболее примитивная, по-видимому, предковая форма всей группы virilis (Throckmorton, 1982).

Эта группа привлекла наше внимание еще и потому, что в нашем распоряжении находилась уникальная коллекция мутаций в локусе Delta, который у Drosophila virilis является горячей точкой (hot spot) для транспозиции мобильных элементов (Evgen'ev et al., 1997). Использование этой коллекции открывает широкие возможности для дальнейшего исследования семейства нейрогенов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Рыбцова, Наталия Николаевна

выводы.

1. Клонирован и картирован участок ДНК размером 14 т.п.н., содержащий 3' область локуса Delta D.virilis.

2. Методом in situ гибридизации ген Delta был локализован в районе 21F во 2 хромосоме D.virilis. Проведенная локализация подтвердила и уточнила результаты цитогенетического анализа локуса Delta D.virilis, выполненного с использованием хромосомных перестроек.

3. Секвенирован фрагмент локуса Delta D.virilis, гомологичный последнему (шестому) экзону локуса Dl D.melanogaster.

4. Компьютерный анализ последовательности ДНК исследуемого фрагмента показал, что он кодирует примерно половину предполагаемого белка Delta D.virilis, гомологичного на 83% белку Delta D.melanogaster, причем исследуемая часть белка Dl D.virilis на 35 аминокислот длиннее, чем у белка D1 D.melanogaster.

5. Определены размеры и количество мажорных транскриптов локуса Delta D.virilis. Установлено, что локус Delta D.virilis кодирует два зиготических (5,7 и 4,8 т.н.) и два материнских (3,9 и 2,8 т.н.) мажорных транскрипта, в отличие от соответствующего локуса D.melanogaster, где из трех мажорных транскриптов один (5.4 т.н.) считается зиготическим, а два других, размером 4.6 и 3.6 т.н., материнскими.

6. Анализ распределения мРНК Delta в эмбрионах методом нерадиоактивной гибридизации показал, что транскрипты гена Delta D.virilis локализуются в эмбрионах в тех же органах и тканях и на тех же стадиях развития, что и у D.melanogaster.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рыбцова, Наталия Николаевна, Москва

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рефф Э., Роберте К., Уотсон Дж., Молекулярная биология клетки. // М.: Мир, 1994-1996, т. 1 -3.

2. Губенко И.С., Баричева Э.М. Модификация экспрессии признака Delta у Drosophila virilis. Эффект положения при транслокациях, дефишенси и дупликациях. // Генетика. 1982. Т.28. № 3. С.441-453.

3. Губенко И.С., Суббота Р.П. Особенности потомства облученных самцов из двух линий Drosophila virilis, различающихся по уровню генетической нестабильности. //Доклады Академии Наук, 1990. т. 312. № 6. с. 1501-1504.

4. Губенко И.С., Рыбцова Н.Н., Зеленцова Е.С., Лезин Г.Т., Корочкин Л.И., Евгеньев М.Б. Локус Delta у Drosophila virilis: клонирование и хромосомная локализация. //Доклады Академии Наук, 1998. т.358, №4 с.567-569.

5. Корочкин Л.И. Введение в генетику развития. //Москва. Наука,. 1999. 235 С.

6. Ahmad, I., Zagouras, P., and Artavanis-Tsakonas S. Involvement of Notch-1 in mammalian retinal neurogenesis-association of Notch-1 activity with both immature and terminally differentiated cells.// Mech. Development, 1995. V. 53, P .73-85.

7. Alexander M.L. The Genetics and Biology of Drosophila. /(M.Ashburner, E.Novitski Eds.).// Academic Press. New York, 1976. V.lc. P.1365-1427.

8. Artavanis-Tsakonas S., Rand M., Lake R. Notch signaling: Cell fate control and signal integration in development. // Science, 1999. V. 284. P. 770-776.

9. Artavanis-Tsakonas S., Matsuno K., Fortini M.E. Notch signalling.// Science, 1995. V.268. P. 225-232.

10. Ashburner M. Drosophila. A laboratory handbook. //Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, 1989. NY. 256 P.

11. Axelrod JD, Matsuno K, Artavanis-Tsakonas S, Perrimon N. Interaction between Wingless and Notch signaling pathways mediated by disheveled.// Science. 1996, V.271 P. 1826-1832.

12. Bang AG, Bailey AM, Posakony JW. Hairless promotes stable commitment to the sensory organ precursor cell fate by negatively regulating the activity of the Notch signaling pathway.// Dev Biol.,1995. V.172 P. 479-494.

13. Bettenhausen В., Hrabe de Angelis,M., Simon,D., Guenet,J.L. and Gossler,A. Transient and restricted expression during mouse embryogenesis of Dill, a murine gene closely related to Drosophila Delta. //Development, 1995, V.121, P.2407-2418.

14. Beverley S.M. Wilson A.C. Molecular evalution in Drosophila and the higher Diptera II. A time scale for fly evolution. //J. Mol. Evol., 1984. V. 21. P.l-13.

15. Bier E. Anti-neural-inhibition: a conserved mechanism for neural induction.// Cell. Review, 1997 V. 89 P.681-684.

16. Bishop SA, Klein T, Arias AM, Couso JP. Composite signalling from Serrate and Delta establishes leg segments in Drosophila through Notch.// Development, 1999 Jul, V.126, P.2993-3003.

17. Blanchet-Tournier M.F., Tricoire H., Busson D., Lamour-Isnard C. The segment-polarity gene fused is highly conserved in DrosophilaJ/GensA995.v. 19.p. 157-162.

18. Blaumueller C.M, Qi H.L., Zagouras P., and Artavanis-Tsakonas S. Intercellular cleavage of Notch leads to a heterodimeric receptor on the plasma membane.// Cell, 1997. V.90, P.281-291.

19. Bray S. Notch affair. //Cell, 1998. V. 93. P. 499-503.

20. Brennan K, Tateson R, Lewis K, Arias AM. A functional analysis of Notch mutations in Drosophila. //Genetics, 1997, SeP. V.147 P.177-188.

21. Burris P.A., Zhang Y., Rusconi J.C., Corbin V. The pore-forming and cytoplasmic domains of the neurogenic gene product, BIG BRAIN, are conserved between Drosophila virilis and Drosophila melanogaster. Gene. 1998. v. 206. p. 69-76.

22. Cabrera C.V. Lateral inhibition and cell fate during neurogenesis in Drosophila: the interactions between Scute, Notch and Delta.// Development, 1990. V.109, P.733-742.

23. Campos-Ortega J.A. Genetic mechanisms of early neurogenesis in Drosophila melanogaster. //Mol Neurobiol. 1995, V.10 №2 P. 75-89.

24. Campos-Ortega J.A. Celluar interactions during early neurogenesis of Drosophila melanogaster. IITINS, V.ll, No.9,1988, P.245-150.

25. Campos-Ortega J.A. Genetics of neurogenesis in Drosophila melanogaster.//TINS, V.8, No.6,1985, P.245-250.

26. Campos-Ortega, J. A. and Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaste.//. Springer-Verlag: Berlin, 1985.

27. Campuzano S, Modolell J. Patterning of the Drosophila nervous system: the Achaete-scute gene complex. Trends //Genet., 1992 Jun.V.8 P. 202-208. Review.

28. Casey P. J. Protein lipidation in cell signalling.// Science. 1995. V.268. P. 221-225.

29. Doherty, D., Feager G., Younger Sheperd S Jan L.Y. and Yan Y.N. Delta is a ventral dorsal signal complementary to Serrate, another Notch ligand, in Drosophila wing formation.// Genes and Dev., 1996. V. 10 P. 421-434.

30. Dominguez M, de Celis JF. A dorsal/ventral boundary established by Notch controls growth and polarity in the Drosophila eye. //Nature, 1998, Nov 19, V.396 P.276-278.

31. Donoviel, D.B., Hadjantonakis A., Ikeda M., Zheng H., Hyslop P., Bernstein A. Mice lacking both presenilin genes exhibit early embrionic patterning defects.//Genes and Development, 1999. V.13. P. 2801-2810.

32. Dorsky RI, Chang WS, Rapaport DH, Harris WA. Regulation of neuronal diversity in the Xenopus retina by Delta signalling. //Nature, 1997, V.385 P.67-70.

33. Dunwoodie S.L., Henrique D, Harrison S.M., Beddington R.S. Mouse D113: a novel divergent Delta gene which may complement the function of other Delta homologues during early pattern formation in the mouse embryo. //Development, 1997. V.124 P.3065-3076.

34. Ellisen L.W., Bird J., West D.C., Soreng A.L., Reynolds T.C., Smith S.D. and Sklar J.TAN-l, the human homolog of the Drosophila Notch gene, is broken by chromosomal translocations in T lymphoblastic neoplasms// Cell ,1991 V.66 №4, P.649-661.

35. Fanto M, Mlodzik M. Asymmetric Notch activation specifies photoreceptors R3 and R4 and planar polarity in the Drosophila eye. //Nature. 1999 V.397 P.523-6.

36. Fehon RG, Johansen K, Rebay I, Artavanis-Tsakonas S. Complex cellular and subcellular regulation of Notch expression during embryonic and imaginal development of Drosophila: implications for Notch function.//J Cell Biol., 1991. V.113 P.657-669.

37. Fehon, R.G., Kooh, P.J., Rebay, I., Regan, C.L., Xu, Т., Muskavitch, M.A. and

38. Artavanis-Tsakonas, S. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. //Cell, 1990. У. 61, P.523-534.

39. Fleming RJ, Gu Y, Hukriede NA. Serrate-mediated activation of Notch is specifically blocked by the product of the gene fringe in the dorsal compartment of the Drosophila wing imaginal disc.//Development, 1997 №15 P.2973-81.

40. Fleming RJ, Scottgale TN, Diederich RJ, Artavanis-Tsakonas S.The gene Serrate encodes a putative EGF-like transmembrane protein essential for proper ectodermal development in Drosophila melanogaster J'/Genes Dev. 1990 №12A P.2188-2201.

41. Fortini, M.E. and Artavanis-Tsakonas, S. The suppressor of Hairless protein participates in Notch receptor signaling. //Cell, 1994. V.79 P.273-282

42. Fortini, M.E. and Artavanis-Tsakonas, S. Notch-. Neurogenesis is only part of the picture. //Cell, 1993. 75 P. 1245-1247.

43. Fortini ME, Rebay I, Caron LA, Artavanis-Tsakonas S. An activated Notch receptor blocks cell-fate commitment in the developing Drosophila eye. //Nature, 1993 V.365 №6446 P.555-557.

44. Fransson L. Structure and function of cell associated proteoglican.// Trends Biochem. Sci., 1987, V.12p 406-411.

45. Gho M, Lecourtois M, Geraud G, Posakony JW, Schweisguth F. Subcellular localization of Suppressor of Hairless in Drosophila sense organ cells during Notch signalling. //Development. 1996, Y.122 P.1673-1682.

46. Ghysen A, Dambly-Chaudiere C. Genesis of the Drosophila peripheral nervous system. //Trends Genet., 1989 V.5 P.251-5. Review.

47. Go, M. J. and Artavanis-Tsakonas, S. A genetic screen for novel components of the Notch signaling pathway during Drosophila bristle development. //Genetics, 1998. V.150. №1 P.211-220.

48. Greenwald I. L\N-\HNotch signaling: lessons from worms and flies.//Genes Dev. 1998i1. N. 12, Р.1751-1762.

49. Gu, Y., Hukriede, N. A. and Fleming, R. J. Serrate expression can functionally replace Delta activity during neuroblast segregation in the Drosophila embryo.// Development, 1995. V.121: 855-865.

50. Gubenko, I.S, Evgen'ev M.B. Cytological and linkage maps of Drosophila virilis chromosomes. //Genetica. 1984. 65, P. 127-139.

51. Gubenko I.S., Subbota R.P., Semeshin V.F. Unusual Drosophila virilis stress-puff at 20CD: cytological localization of a heat sensitive locus and some peculiarities of the heat shock response. //Hereditas. 1991. V. 115. P. 283-290.

52. Hackel P.O., Zwick E., Prenzel N., Ullrich A. Epidermal growth factor receptors: critical mediators of multiple receptor pathways. //Curr. Opin. Cell Biol. 1999, V. 11. P. 184-189.

53. Haenlin M, Kunisch M, Kramatschek B, Campos-Ortega J.A .Genomic regions regulating early embryonic expression of the Drosophila neurogenic gene Delta.// Mech Dev., 1994, V. P.199-110

54. Haenlin M., Kramatschek В., Campos-Ortega J.A. The pattern of transcription of the neurogenic gene Delta, of Drosophila melanogaster. Development. 1990. No. 110, P.905-914.

55. Hardy J. and Israel A. In search of y-secretase.// Nature. 1999. V. 398. P. 466-467.

56. Hartenstein V, Younossi-Hartenstein A, Lekven A. Delamination and division in the Drosophila neurectoderm: spatiotemporal pattern, cytoskeletal dynamics, and common control by neurogenic and segment polarity genes. //Dev Biol., 1994, V.l65 P.480-499.

57. Hartenstein V. Atlas of of Drosophila Development. //Cold Spring Harbor Laboratory1. Press, 1993. 57 P.

58. Hartenstein, A.Y., Rugendorff, A., Tepass, U. and Hartenstein, V. The function of the neurogenic genes during epithelial development in the Drosophila embryo.// Development, 1992. V.l 16 P.1203-1220

59. Heitzler P, Simpson P.Altered epidermal growth factor -like sequences provide evidence for a role of Notch as a receptor in cellfate decisions.// Development. 1993. V. 117. P. 1113-1123.

60. Heitzler P, Simpson P. The choice of cell fate in the epidermis of Drosophila./ICe 11., 1991 Mar 22. V.64 P.1083-1092.

61. Heitzler P, Bourouis M, Ruel L, Carteret C, Simpson P. Genes of the Enhancer of split and achaete-scute complexes are required for a regulatory loop between Notch and Delta during lateral signalling in Drosophila. //Development, 1996 V 122 P.l61 -171.

62. Henderson S., Gao D. Christensen S., E., Kimble J. Functional domains of lag-2, a putative signaling ligand for LIN-12 and GLP-1 receptors in Caenorhabditis elegands. //Mol.Biol.Cell, 1997, V.8 P.1751-1762.

63. Henrique D, Hirsinger E, Adam J, Le Roux I, Pourquie O, Ish-Horowicz D, Lewis J. Maintenance of neuroepithelial progenitor cells by Delta-Notch signalling in the embryonic chick retina.// Curr Biol, 1997. V.7 P.661-670.

64. Hing H.K., Sun X., Artavanis-Tsakonas S. //Mech. Dev. 1994. V. 47. P. 261.

65. Hinz, U., Giebel, B. and Campos-Ortega, J.A. The basic-helix-loop-helix domain of Drosophila lethal of scute protein is sufficient for proneural function and activates neurogenic genes. //Cell, 1994. V.76 P. 77-87

66. Hirschberg C. and Snider M., Topography of glycosilation in the rough endoplasmic reticulum and Golgi apparatus.//Annu. Rev. Biochem. 1987. V.56. P.63-88.

67. Hukriede NA, Gu Y, Fleming RJ. A dominant-negative form of Serrate acts as a general antagonist of Notch activation. //Development. 1997. V. 124 P.3427-37.

68. Huppert SS, Jacobsen TL, Muskavitch MA. Feedback regulation is central to Delta

69. Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. //Development. 1997. V.124P.3283-3291.

70. Jacobsen T.L., Brennan K, Arias A.M., Muskavitch M.A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila J7 Development, 1998 Nov. V.125 P.4531-4540.

71. Jehn BM, Bielke W, Pear WS, Osborne BA. Cutting edge: protective effects of Notch-1 on TCR-induced apoptosis.// J Immunol. 1999.V. 162 P.635-8.

72. Jen W.C, Wettstein D., Turner D., Chitnis A., Kintner C. the Notch ligand, X-Delta-2, mediates segmentation of the paraxial mesoderm in Xenopus embryos.// Development. 1997. V. 124. P. 1169-1178.

73. Johnston S.H., Rauskolb C, Wilson R, Prabhakaran B, Irvine K.D., Vogt T.F. A family of mammalian Fringe genes implicated in boundary determination and the Notch pathway. Development. 1997 Jun, V.124 P.2245-2254.

74. Jonsson, F. and Knust, E. Distinct functions of the Drosophila genes Serrate and Delta revealed by ectopic expression during wing development.// Dev. Genes Evol., 1996. 206 P. 91-101

75. Joutel A., Corpechot C., Ducros A. NotchZ mutations in CADASIL, a hereditary adult-onset condition causing stroke and dementia.// Nature. 1996. V. 383. P. 707-710.

76. Kerszberg M., Changeux J.P. A simple molecular model of neurulation. //Bioessays, 1998 SeP.V.20 P.758-770.

77. Kidd S., Kelley M. R. and Young M. W. Sequence of the Notch locus of Drosophila melanogaster: relationship of the encoded protein to mammalian clotting and growth factors.// Mol. Cell. Biol. 1986. V.6 P. 3094-3108.

78. Kidd S., Lieber Т., Young M.W. Ligand-iduced cleavage and regulation of nuclear enry of Notch in Drosophila melanogaster embryos. //Genes Dev. 1998.12 P. 3728-3740.

79. Kim J., Irvine K. D., Carroll S. B. Cell recognition, signal induction, and symmetrical gene activation at the dorsal-ventral boundary of the developing Drosophila wing.

80. Cell, 1995.V.82 P.795-802.

81. Kimble J, Simpson P.The LIN-12/Notch signaling pathway and its regulation.//Annu Rev Cell Dev Biol. 1997; N.13 P.333-361.

82. Klambt C, Jacobs JR, Goodman CS. The midline of the Drosophila central nervous system: a model for the genetic analysis of cell fate, cell migration, and growth cone guidance. //Cell, 1991 Feb 22. V.64 P.801-815.

83. Klein, T. and Arias, A. M. Interactions among Delta, Serrate and Fringe modulate Notch activity during Drosophila wing development. //Development, 1998. V.125 P. 2951-2962.

84. Klueg, К. M., Parody, T. R. and Muskavitch, M. A. T. Complex proteolytic processing acts on Delta, a transmembrane ligand for Notch, during Drosophila development. //Mol. Biol. Cell,1998. V.9 P.1709-1723.

85. Knust E.,Schorans H., Grawe F., Campos-Ortega J. A. Seven genes of Enhancer of split complex of Drosophila melanogaster encode helix-loop-helix proteins.// Genetics. 1992. V. 132. P. 505-518.

86. Kopan R., Schroeter E.H., Weintraub H., Nye J.S.Signal transduction by activated mNotch: impotance of proteolytic processing and its regulation by the extracellular domain. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 1683-1688.

87. Kopan R., Turner D.L. The Notch pathway: democracy and aristocracy in the selection of cell fate. //Curr. Opin. Neurobiol. 1996. V.6 P. 594-601.

88. Kopczynski C.C., Muskavitch M.A.T. Complex spatio-temporal accumulation of alternative transcripts from the neurogenic gene Delta during Drosophila embriogenesis.// Development, 107,1989, P. 623-636.

89. Kunisch M, Haenlin M, Campos-Ortega JA Lateral inhibition mediated by the Drosophila neurogenic gene Delta is enhanced by proneural proteins.// Proc Natl Acad Sci USA, 1994, V.11,N.91 P.10139-10143.

90. Laborda J., Sausville E.A., Hoffman Т., Notario V. dlk, a putative mammalian homeotic gene differentially expressed in small cell lung carcinoma and neuroendocrine tumor cell line.// J. Biol. Chem, 1993. V.268 P. 3817-3820.

91. Lardelli,M., Dahlstrand,J. and Lendahl,U. The novel Notch homologue mouse Notch 3 lacks specific epidermal growth factor-repeats and is expressed in proliferating neuroepithelium //Mech. Dev. 1994. V.46, P. 123-136.

92. Lawrence P. The making of a fly. The genetics of animal design. //Oxford, Blackwell, 1992.

93. Lecourtois M, Schweisguth F Indirect evidence for Delta-dependent intracellular processing of Notch in Drosophila embryos. Curr Biol 1998 V.13 P.771-774

94. Lehmann R., Dietrich U., Jimenez F., Campos-Ortega J. A. et al. Mutations of early neurogenesis in Drosophila. Roux Arch. dev. Biol. ,1981. V.l90 P. 226-229.

95. Lehmann R., Jimenez F., Dietrich U., Campos-Ortega J.A. On the phenotype and development of mutants of early neurogenesis in Drosophila melanogaster. Roux's Arch. Dev. Biol. 192,1983, P. 62-74

96. Lecourtois M, Schweisguth F. The neurogenic suppressor of hairless DNA-binding protein mediates the transcriptional activation of the enhancer of split complex genes triggered by Notch signaling. Genes Dev. 1995;V.9 P.2598-2608.

97. Lendahl U. A growing family ofNotch ligands. BioEssays, 1998, v. 20. P. 103-107.

98. Lim, J.K. In situ hybridization with biotinylated DNA. 11 Dros. Inf. Serv. 1993, V.72,73-77.

99. Lindsley D.L., Zimm G. Genetic variations of Drosophila melanogaster. II Carnegie Inst. Wash. Publ., 1968. P.23-29.

100. Lindsell CE, Shawber CJ, Boulter J, Weinmaster G. Jagged: a mammalian ligand that activates Notchl. // Cell, 1995 Mar 24 V.80 P.909-917.

101. Lindsell CE, Boulter J, diSibio G, Gossler A, Weinmaster G. Expression patterns of Jagged, Deltal, Notchl, Notch2, and Notch3 genes identify ligand-receptor pairs that may function in neural development. Mol Cell Neurosci., 1996. V. 8 P. 14-27.

102. Lissemore JL, Starmer WT Phylogenetic analysis of vertebrate and invertebrate Delta/Serrate/LAG-2 (DSL) proteins. Mol Phylogenet Evol 1999 V.2 P.308-319

103. Long AD, Lyman RF, Langley CH, Mackay TF. Two sites in the Delta gene region contribute to naturally occurring variation in bristle number in Drosophila melanogaster. II Genetics, 1998. V.149 P. 999-1017.

104. Lukowitz W., Schroder C., Glaser G., Hulskamp M., Tautz D. Regulatory and coding regions of the segmentation gene hunchback are functionally concerved between Drosophila virilis и Drosophila melanogaster. II Mech. Dev. 1994. v. 45. p. 105-115.

105. Maine E.M., Lissemore J.L., Starmer W.T. A Phylogenetic analysis of vertebrate and invertebrate Notch-related genes. //Mol Phylogenet Evol. 1995. V. 4. P. 139-149.

106. Martin-Bermudo, M. D., Carmena A. and Jimenez, F. Neurogenic genes control gene expression at the transcriptional level in early neurogenesis and in mesectoderm specification. //Development, 1995. 121 P. 219-224

107. Matsuno K., Go M.J., Sun X., Eastman S., Artavanis-Tsakonas S. Suppressor of Hairless-independent events in Notch signaling imply novel pathway elements. // Development, 1997. V.124. P. 4265-4273.

108. Michael M.W., Bowtell D., Rubin J.M. Comparison of the sevenless genes of Drosophila virilis и Drosophila melanogaster. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. v.87. p. 5351-5353.

109. Modolell J., Campuzano S. The achaete-scute complex as an integrating device. Int. II J. Dev. Biol. 1998,42, P.275-282.

110. Moghal N., Sternberg P.W. Multiple positive and negative regulators of signaling by the EGF-receptor. //Curr. Opin. Cell Biol. 1999, V. 11. P. 190-196.

111. Murrel, J., Farlow M., Ghetti В., Benson M. A mutation in the amyloid precursor protein assosiated with hereditary Alzheimer's disease.// Science. 1991. V.254. P.97-99.

112. Muskavitch M.A.T. Delta-Notch Signaling and Drosophila II Cell Fate Choice. (Review) Develop.Biol. No.166,1994, P. 415-430.

113. Newfeld S.J., Smoller D.A., Yedvobnick B. Interspecific comparison of the unusually repetitive Drosophila locus mastermind. //J.Mol.Evol. 1991.V.32. p.415-420.

114. Oellers N, Dehio M, Knust E. bHLH proteins encoded by the Enhancer of split complex of Drosophila negatively interfere with transcriptional activation mediated by proneural genes. //Mol Gen Genet, 1994 Sep 1. V.244 P.465-473.

115. Pan D., Valentine S.A., Courey A.J. The bipartite Drosophila melanogaster twist promoter is reorganized in Drosophila virilis. // Mech Dev. 1994. v. 46. p. 41-53.

116. Pan, D. and Rubin, G. M. Kuzbanian controls proteolytic processing of Notch and mediates lateral inhibition during Drosophila and vertebrate neurogenesis. //Cell, 1997 V.90P. 271-280.

117. Panin VM, Papayannopoulos V, Wilson R, Irvine KD. Fringe modulates Notch-ligand interactions. //Nature, 1997 Jun 26. V. 387 P.908-912.

118. Parks, A. L., Klueg К. M., Stout J. R. and Muskavitch, M. A. Ligand endocytosis drives receptor dissotiation and activation in the Notch pathway. //Development. 2000. V. 127. P. 1373-1385.

119. Parks, A. L., Huppert, S. S. and Muskavitch, M. A. The dynamics of neurogenic signalling underlying bristle development in Drosophila melanogaster. //Mech. Dev., 1997. V. 63 P. 61-74

120. Parody, Т. and Muskavitch, M.A. The pleiotropic function of Delta during postembryonic development of Drosophila melanogaster. //Genetics, 1993.V.135 P.527-539.

121. Paulson D.F. Chromosomal deficiensis and embrionic development of Drosophila melanogaster. //Proc. Natl. Acad. Sci., V.23, 1937, P.133-137.

122. Pear WS, Aster JC, Scott ML, Hasserjian RP, Soffer B, Sklar J, Baltimore D. Exclusive development of T cell neoplasms in mice transplanted with bone marrow expressing activated Notch alleles.// J Exp Med., 1996 ;183 P.2283-2291.

123. Qi H, Rand MD, Wu X, Sestan N, Wang W, Rakic P, Xu T, Artavanis-Tsakonas S. Processing of the Notch ligand Delta by the metalloprotease Kuzbanian.// Science, 1999. V.283 P.91-94.

124. Rauskolb C, Correia T, Irvine K.D. Fringe-dependent separation of dorsal and ventral cells in the Drosophila wing. //Nature. 1999 V.401 P.476-480.

125. Rebay I., Fleming R.J., Fehon R.G., Cherbas L., Cherbas P., Artavanis-Tsakonas S. Specific EGF repeats of Notch mediate interactions with Delta and Serrate: implications for Notch as a multifunctional receptor. /Cell. 1991. V. 67. P. 687-699.

126. Robey E. Notch in vertebrates. //Curr. Opin. Genet. Dev. 1997. V. 7. P. 551 -557.

127. Rooke J., Xu Т., Positive and negative signals between interacting cells for establishing neural fate. //BioEssays 1998, V.20 P.209-214.

128. Rooke J, Pan D, Xu T, Rubin GM. KUZ, a conserved metalloprotease-disintegrin protein with two roles in Drosophila neurogenesis.// Science. 1996 V.273 P. 1227-1231.

129. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989.

130. Sanger F., Nicklen S. Coulson A.K. DNA sequencing with chain-termination ingibitors// Proc. Nat.Acad.Sci. USA.,1977 V.74.P.5463-5467.

131. Seugnet L., Simpson P., Haenlin M. Transcriptional regulation of Notch and Delta: requiment for neuroblast segregation in Drosophila. Development. 1997. v. 124 P. 2015-2025.

132. Shelly LL, Fuchs C, Miele L. Notch-1 inhibits apoptosis in murine erythroleukemia cells and is necessary for differentiation induced by hybrid polar compounds. J Cell Biochem, 1999. V.73 P.164-175.

133. Simpson P., Carteret C. 1990a. Proneural clusters: equivalence groups in the epithelium of Drosophila. //Development 110, P.927-932.

134. Simpson P. Lateral inhibition and the development of the sensory bristles of the adult peripheral nervous system of Drosophila.il Development, 1990b.V.l09 P.509-519.

135. Siren M. and Portin P. Interaction of Hairless, Delta, Enhancer of split and Notch genes of Drosophila melanogaster as expressed in adult morphology. //Genet. Res., 1989. V. 53 P. 23-26.

136. Skeath JB, Carroll SB. The achaete-scute complex: generation of cellular pattern and fate within the Drosophila nervous system.// FASEB J., 1994 Jul. V.8 P.714-721. Review.

137. Sun, X. and Artavanis-Tsakonas, S. Secreted forms of Delta and Serrate define antagonists of Notch signaling in Drosophila. //Development, 1997. V.l24 P. 34393448.

138. Sun, X., and Artavanis-Tsakonas, S., The intercellular deletions of Delta and Serrate define dominant negative forms of the Drosophila Notch ligands. //Development, 1996, V.122, p2465-2474.

139. Struhl G, Greenwald I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. //Nature, 1999. V.398 P.522-525.

140. Struhl G, Adachi A. Nuclear access and action of Notch in vivo. //Cell, 1998.V. 93 P.649-660.

141. Struhl G, Basler K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila.!1 Cell,1993. Feb 26.V. 72 P.527-540.

142. Struhl G, Fitzgerald K, Greenwald I. Intrinsic activity of the Lin-12 and Notch intracellular domains in vivo. //Cell, 1993.V.74 P.331-345.

143. Tautz D., Hulskamp M., Sommer R.J. Whole mount in situ hybridization in Drosophila. In: In Situ Hybridization. A Practical Approach. /Ed. D.G. Wilkinson.1994. P.61-73.

144. Tax, F.E., Yeargers, J.J. and Thomas, J.H. Sequence of C. elegans lag-2 reveals a cell signalling domain shared with Delta and Serrate of Drosophila. //Nature, 1994. V.368 P. 150-154

145. Technau G.M., Campos-Ortega J.A. Cell autonomy of expression of neurogenic genes of Drosophila melanogaster.// Proc. Natl. Acad. Sci., V.84,1987, P.4500-4504.

146. Throckmorton L.H. The virilis species grouP. In The genetics and biology of Drosophila.// Ashburner M., ed., Acad. Press, 1982, V. 36, P. 227-296.

147. Thomas, U., Speicher, S. A. and Knust, E. The Drosophila gene Serrate encodes an EGF-like transmembrane protein with a complex expression pattern in embryos and wing discs.// Development, 1991. V. 111 P.749-61.

148. Vassin H., Bremer K.A., Knust E., Campos-Ortega J.A. The neurogenic locus Delta, of Drosophila melanogaster, is expressed in neurogenic territories and encodes a putative transmembrane protein with EGF-like repeats.// EMBO J. No.6, 1987, P. 3431-3440.

149. Vassin H, Vielmetter J, Campos-Ortega J A. Genetic interactions in early neurogenesis of Drosophila melanogaster. J Neurogenet. 1985 Nov, V.2 P.291-308.

150. Vervoort M., Dambly-Chaudiere C.,Ghysen A.// Curr. Opin. Neur. 1997. V.7. P. 21-28.

151. Wadsworth,S.C., Vincent,W.S. III. and Bilodeau-Wentworth,D. A Drosophila genomic sequence with homology to human epidermal growth factor receptor.// Nature, 1985.V. 314, P. 178-180.

152. Welshons W. J., Keppy T. The recombinational analysis of aberrations and the position of the Notch locus on the polytene chromosome of Drosophila. //Molec. gen. Genet., 1981. V. 181 P.319-324.

153. Wong, P.C., Zheng H., Chen H., Becher M.,Sisinathsinghji D., Trumbauer M.,Chen H. Y., Price L., Van der Ploeg L., Sisodia S. Presenilin 1 is required for Notch 1 and Dll 1 expression in the paraxial mesoderm. //Nature. 1997. V. 387. P. 288-292.

154. Yochem,J., Weston,K. and Greenwald,I.The Caenorhabditis elegans I in-12 gene encodes a transmembrane protein with overall similarity to Drosophila Notch. //Nature, 1988.V. 335,547-550.

155. Zhou L., Boulianne G.L. Comparison of the neuralized genes of Drosophila virilis and D. melanogaster. Genome. 1994. v. 37. p. 840-847.