Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Феногенетический анализ стерильности гибридов Drosophila virilis х Drosophila lummei.

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Феногенетический анализ стерильности гибридов Drosophila virilis х Drosophila lummei."

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н. К. КОЛЬЦОВА

РГ 6 од

Н4 фйлх руЬткм

.3 УДК 575.17.858. + 576.311.

Фалилеева Людмила Ивановна

ФЕНОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СТЕРИЛЬНОСТИ ГИБРИДОВ ОговорЬПа ^гШэ х ОговорИНа 1итте1.

03.00.15.'- генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в лаборатории генетики Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН (директор - академик РАН Н.Г.Хрущов)

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор В.Г.Митрофанов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, академик Л.И.Корочкин

кандидат биологичеких наук, А.Г.Имащева

Ведущее учреждение: Институт эволюционных проблем и экологии РАН.

Защита состоится 29 мая 1996 года в часов на заседании Специализированного совета Д002.85.01. по защите диссертаций при Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН. (117334 Москва, ул. Вавилова, 26).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБР РАН. Автореферат разослангода.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Е.В.Волин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Бведенме

Среди разнообразных изолирующих барьеров стерильность гибридных самцов занимает особое место - как самый распространенный механизм изоляции между видами. Более половины всех межвидовых скрещиваний в роде Drosopbäа дают стерильных самцов и фертильных самок.

При всем обилии работ по этой проблеме, до настоящего времени неизвестно, сколько генов в каждом конкретном случае участвует в видообразовании. Разрешение этого вопроса требует детального генетического и молекулярного изучения генов, вызывающих репродуктивную изоляцию. Исследования гибридной стерильности у дрозофилы лачались очень давно и сейчас проводятся во многих научных лабораториях, но до сих пор очень мало известно о числе и локализации генов, вызывающих репродуктивную изоляцию между видами.

На первой стадии характеристики генов стерильности многие авторы пытались картировать гены с большим влиянием на мужскую гибридную стерильность (Coyne & Charlesworth, 1989;, Pantazidis & Zouros, 1988; Orr, 1989). Однако, используемые виды или мало изучении генетически, или плохо скрещиваются между собой. Картирование и характеристика этих генов невозможны без набора мутаций - маркеров, делеций, хромосом - балансеров.

Актуальность проблемы:

Поставленная в диссертации проблема лежит на стыке эволюционной генетики и генетики развития и представляет большой интерес в плане изучения генетических механизмов репродуктивной изоляции и видообразования. Показано, что гибридная стерильность является результатом взаимодействия частей генома Drosophila viril is с частями генома Drosophila lummei, причем, признаки со стороны D. virilis у гибридов наследуются рецессивно.

Проблема видообразования является одной из основных в биологин, особенно те моменты, которые касаются начальных этапов видообразования. При изучении репродуктивной изоляции большую трудность представляет стерильность гибридов первого поколения или плохая скрещиваемость изучаемых видов. Мы в своей работе использоаали виды Drosophila группы virilis по ряду причин. Во-первых, по сравнению с другими группами рода Drosophila эти виды хорошо скрещивактгся между собой в лабораторных условиях, и многие межвидовые гибриды дают потомство, что позволяет проводить генетический анализ. Во-оторых, имеется большое число линий, маркированных видимыми мутациями по различным хромосоллам, что также дает широкие возможности для

генетического анализа; в-третьих, у гибридов группы virilis стерильность проявляется обычно не в первом гибридном поколении (как, например, в группе melanogasier), а в последующих, что значительно облегчает генетический анализ.

Сперматогенез у Drosophila melanogast^r хорошо изучен с помощью электронного микроскопа, однако у видов Drosophila группы virilis сперматогенез изучен только с помощью светового микроскопа, и в общих чертах он имеет сходство с таковым у D. melanogaster. Строение сперматозоидов у стерильных гибридов изучено нами с помощью электронного микроскопа впервые. Детальное изучение нормального строения сперматозоидов необходимо знать, чтобы иметь образец для сравнения с ним различных нарушений, влияющих на сперматогенез. Однако, настоящее исследование преследует более узкую цель - изучение строения хвостового отдела сперматозоида ■ у нормальных плодовитых самцов D. virilis и у стерильных гибридов D. virilis х D. lummei, ведь именно последние стадии дифференцировки спермиев нарушаются чаще всего у стерильных сямцоа дрозофилы (Castrillon et а!., 1993; Hackstein et. al., 1990). Обычной причиной стерильности самцов является неподвижность сперматозоидов. Морфологические основы стерильности в целом и неподвижности сперматозоидов в частности изучены очень слабо. Поэтому одной из наших задач было изучение морфологии неподвижных сперматозоидов. Для этого мы провели электронно-микроскопическое исследование хвостового отдела сперматозоидов. Мы надеялись обнаружить нарушения, которые можно было связать с неподвижности) сперматозоидов и стерильностью самцов.

Научная новизна и практическая значимость работы; Для более точной локализации генов, ответственных за проявление стерильности гибридов D. virilis х D. lummei, была использована новая мутация - .vermilion (которая получена в нашей лаборатории), маркирующая участок Х-хромосомы, примыкающий к инверсии 1п(1)а+Ь с дисталыюго конца, в дополнение к этому, мы привлекли для анализа еще несколько маркеров на Х-хромосоме: apricot - примыкает к инверсии с проксимального конца, Ъем1ех - располагается в границах инверсии, и yellow ■ - маркирует дистальный конец. Достаточно большой набор маркеров позволил, в отличие от предыдущих работ (Огг & Coyne, 1989; llcikkinen & I.iimme, 1991) по этой проблеме, более точно локализовать гены, вызывающие стерильность гибридных самцов, в районе локуса vermilion Х-хромосомы.

Kjx>Me того, была использована линия 160 D. virilis, имеющая маркеры по всем аутосомам: bgp;cJ;pegl (2;3;4;5;6). У гибридов I). virilis х D. lummei описан уникальный механизм изоляции, связанный с элиминацией хромосомы 6 в первом поколении гибридов. При скрещивании самок D. virilis с самцами D. lummei у гибридов F1 элиминируется хромосома 6. Этот процесс зависит от температуры: если

:

первые деления дробления гибридного эмбриона проходят при + 17°С, то хромосома 6 О. 1итте1 элиминируется, и все скоби и ее у г только хромосому 6 О. Ч1гйк. При температуре +25°С элиминация происходит с меньшей частотой (20-30%) и на ¡азных стадиях развития, поэтому псе особи мозаичны по этому признаку, остальные хромосомы остаются п гетерозиготном состоянии. Существование этого механизма показывает, тто оба вида дивергирополи по такому важному признаку, как стабильность генома в развитии (Соколов, 1959; Сидорова, 1974). Именно с перестройкой митотического процесса било сиязано приспособле1те к новой нише у О. 1итта, если принять общепризнанную концепцию о том, что О. югНЬ - кредковый вид всей группы. В результате, происходит не только выброс хромосомы 6, но и возрастает, по сравнению с контролем, доля стерильных самцов. Мы покязялн, каким образом совмещаются два механизма: элиминация хромосом и гибридная стерильность. Использовали разные температурные условия для изучения взаимодействия хромосом: найдены усилители (локализованы на хромосомах 3 и 5) и сутгрессоры (на хромосоме 4) гибридной стерильности.

Наряду с генетическими методами были проведены электронно-микроскопические исследования строения сперматозоидов. Впервые признак - стерильность самцов связан со строением промежуточного отдела хвоста сперматозоидов гибридов й. штИи х О. 1иттеи Обнаружены нарушения структуры побочного ядра и разрушение плазматической мембраны сперматозоидов стерильных гибридов. Впервые описано тонкое строение жгутиков сперматозоидов О. уМи и гибридов О. х О.

1шпгпег.

Практическое значение работы состоит в возможности применения полученных результатов по локализации генов, связанных с гибридной стерильностью, для клонирования генов и дальнейших молекулярно-генетических исследований.

Цель и задали работы: Целью нашей работы является локализация генов, влиякнцих на гибридную стерильность самцов дрозофилы группы ухп1и и электронно-микроскопическое исследование морфологии хвостового отдела сперматозоидов стерильных гибридных самцов и плодовитых самцов О. гггйи. Нами были поставлены следующие задачи:

1. Генетический анализ стерильности гибридов Э. т/п/и х О. 1итта, который позволил нам локализовать гены, ответственные за проявление стерильности самцов - гибридов между двумя близкородегаенными пилами О. viг£?15 и И. \ummei с точностью до хромосомы, а также ум шить локализацию "генов стерильности", локализованных на Х-хромосоме.

2. Особенностью механизмов репродуктивной изоляции у пило» дрозофилы згой группы является то, что они проявляются не только и первом поколении гибридов, но и п последующих, поэтому нашей задачей

з

также было изучение проявления признака - гибридной стерильност в ряду нескольких последовательных поколений гибридов D. virilis х D. lummei.

3. Изучить роль хромосомы 6 в формировании стерильности, т. к. ранее было показано, что хромосома 4 (которая соотвествует хромосоме 6 D. virilis) участвует в развитии стерильности межвидовых гибридов дрозофилы группы melanogaster (Orr, 1991).

4. Изучить строение сперматозоидов стерильных гибридов D. virilis х D. lummei и "плодовитых самцов D. virilis с помощью электронного микроскопа, т. к. ■ признак стерильности связывают с неподвижностью спермиев.

Апробация работы: Основные материалы диссертации докладывались на коллоквиумах лаборатории генетики и научных конференциях ИБР им. Н.К.Кольцова РАН (1994 - 1996гг.), на конференции "Применение современных достижений генетики в решении вопросов таксономии и филогенеза животных" в Институте общей генетики (апрель, 1994). По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы, еще 2 статьи готовятся к печати.

Структура U объем работы: Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы, иллюстрирована 21 рисунками и 11 микрофотографиями. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав изложения собственных результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 126 источников.

Материал и методы.

В рибогс использовали дна близких вида Drosopbila: D. virilis, Sturtevant и D. lummei, Hackman. Оба вида имеют одинаковое число хромосом (пять пар палочковидных . и одну точечную), которые отличаются наличием инверсий. X-хромосома О. lummei несет две перекрывающиеся инверсии ln(])ai-b, расположенные в проксимальной трети хромосомы. Хромосомы 2, 3, 5, и 6 также имеют видоспецифические инверсии (Полуэктова и др., 1991). D. virilis считается предковым видом по отношению ко всем остальным видам группы и хорошо скрещивается с другими видами, особенно в качестве материнского родителя. О. lummei скрещивается с D. virilis в обоих направлениях лучше многих других видов группы virilis и даст плодовитых гибридов. Гибриды D. virilis х О. lummei среди членов этой группы являются наиболее жизнеспособными и фертильными, и, кроме того, у них имеется широкий спектр мутаций, позволяющий маркировать все аутосомы и, особенно иоловую хромосому. .

Б настоящей работе использовались следующие линии: Линия Н9 P. virilis имела рецессивные маркеры в аутосомах: broken (Ъ, 2-143-5) -хром<к-ома 1, gapped (gp, 3-119.0) - хромосома 3, cardinal (cd, 4-32.2) - хромосома 4, р€мЬ (рс, 5-20.),0) - хромосома 5.

Линия 160 D. virilis имела рецессивные маркеры во !кчх аутосом>х; broken (Ь, 2-143 5) - хромосома 2, gapped (gp, 3-119) - хромосома 3, Ciin'nal (cd, -1-32.2) - хром£хж>ма 4, peach (ре, 5-203.0) - хромосома 5, flossy (я1, 6-1.3) - хромскома 6. Линяя D. virilis 111, у которой мпркир .ьлна Х-хрол«хома: yellow (у, 1-2.9), Сч\и!ех (Вх, 1-94.5), apricot (ар, 1-136.0).

Линия D. virilis N3, несущая те же Эркеры, что и линия 111, а также а дополнение к ним-, gjpjvd (gp, 3-119) - хромосома 3, scarlet (st, 5-67.5) - хромосома 5. Линия 167 D. virilis, имеющая доминантный лиркер во второй хромосоме ÍV/M (П1, 245.0).

Линия 0. lutnmei 200 дикого типа.

Линия D. lummei 206 несла рецессивную мутацию vermilion (у, 1-25.5) s Х-хромосоме.

Все линии получены из коллекции лаборатории генетики lV"7Hiyju биологии развития Н.К. Кольцова, а лчния N3 цслучсна путем скр^ч'чтчния 111 и 110 japped (gp, 3-119.); scarlet (st, 5-o7.5)l линий,- Расположение Мутаций ня карте хромосом взяты для D. virilis из литературных источников (Alexander, 1976; Губенко, 1983).

Методика проведения каждого генетического опыта описывается перед изложением результатов в соответствующих разделах.

Для статистической обработки результатов использовали модификацию метода анализа факториалъных экспериментов (Snedecor & Cochran, 1982); для оценки достоверности различий между экспериментальнми данными использовали критерий Стыодента.

Приготовление препаратов длч электронной микроскопии проводили следующим образом: семенники са.«цов D. viriíú 149 линии и гибридных FbI стерильных самцов выделяли на предметном етткле с помощью препаровальных игл в капле физиологического раствора Рингера (140 шМ NaCI, 5mM KCl, 2mM CaC12; Ashburnrr, 1989) и быстро переносили в 2570-ный глютаральдегидный (глютаральдегид фирмы Serva) фиксатор Кариокжого (lOimovsky, 1965), приготовленный па 0.1 M Na -какодилатном буфере, píÍ 7.4 (Fluca). После фиксации в течение 2 часов трижды по 5 минут промывали 0.1 M Na - канидилатным буфером. Латем фиксировали в течение часа в 2%-ном растворе тегырехокиси осмич на 0.1 M Na - какодилатном бу*{>ере, рН 7.4 (фиксатор Палэда), после чего трижды по 20 минут отмывали в 0.1 M Na -какодилатном буфере. Все процедуры фиксации и отмывки проводили при -t-4"C (Уикли, 1975). »'

Затем образцы обезвоживали в серки спиртов . ( от 50% АО 100%-ной концентрации), в каждом по 15 минут, после чего четыре раза по 15 минут отмывали » абсолютном ацетоне. После отмывки образцы помещали в смесь смолы (зралдит M (Serva) - 20 мл, эттон 812 (Fluca) - 25 мл, DDSA (Fluca) - 60мл, DMP -30 (Finca) -1.5% - 2.5%) и абсолютного ац«"гош (1:1) для пропитки на один час, после чего переносили образцы а смесь смолы и оставляли на ночь (для шиякм брллн смесь: яраллит M - 20 мл. эгюн 812 - 25 мл. DDSA - (Омл, DMP-30 - 1 5% - 2 57.) ГЬ*лг этого образцы переносили в желатиновые капсулы с помощью пастеровской пипетки и заливали свежей смолой, капсулы оставляли на двое суток для полимерииции iiput 60°С. Методики взяты по Уикли (Í975).

Ультратонкие срезы делали на ульгратоме LKB-1II, Швеция, после чею проводили контрастирование срезов семенников дрозофилы на сеточках. Сначала контрастировали срезы на поверхности капли 4%- ною р-ра ураичлацетата (Fluca) на Na-ацетат-уксусном буфере pH 5.2 на парафильме срезами вниз, во влажной камере при + 60°С 30 минут (буфер готовится следующим образом: смешивается 10.5 мл 0.2М р-рв уксусной кислоты и 39.5 мл 0.2М р-ра ацетата натрия).

После отмывки в трех сменах дистиллированной воды контрастировали цитратом свинца по Рейнольде у при комнатной температуре, промывали в трех сменах воды, высушивали на воздухе (Reynolds, 1963). Цитрат свинца по Рейнолдсу готовится следующим образом; нитрата свинца (Fluca) - 1.33 г., цитрата натрия NajC^HjOj X 2i 1¿0 (Fluca).- 1.76 г., H^O без CÖ2 - 20 мл, перемешивают суспензию на мешалке в течение 30 мин, затем постепенно добавляют IM NaOH до растворения осадка (10 - 15 мл) и доводят объем до 50 мл. Хранится р-р без доступа COj в посуде из темного стекла. Срезы просматривали «а электронном микроскопе JEM 100 СХ -II, Япония.

Съемку производили на сверхконтрастные диапозитивные фотопластинки

Результаты исследований и обсуждение.

1. Влияние аутосом на фертильность гибридных самцов.

Мы провели опыты по уточнению того, какая из хромосом имеет наибольшее влияние на стерильность гибридов D. virilis X D. luminei. Для этого мы использовали линии видов D. virilis 149 и D. lummei 200. Для получения самцов, гомозиготных и гетерозиготных по разным хромосомам D. virilis, скрещивания проводили следующим образом: самок D. virilis линии 149, гомозиготных по рецессивным маркерам (b%p;cd;pe), скрещивали массово с самцами линии 200 D. lummei. Гибридных гетерозиготных самцов Fl скрещивали с самками D. virilis маркерной линии 149. Для изучения влияния на фертильность гибридных самцов хромосом 2 - 5 и Y из потомства от этого скрещивания (Fol) отбирали особей шестнадцати классов и определяли их стерильность стандартным методом по подвижности спермиев: семенники зрелых самцов в возрасте 6-7 суток выделяли на предметном стекле в капле физиолотческого раствора Рингера и накрывали покропным стеклом, после чего препарат рассллатривали с помощью фазо во-контрастного микроскопа JENA, Karl Zeiss при xlOO и х200 - кратном увеличении. Самцов, у которых обнаруживали подвижные спермии, считали фертилышми. Самцов, у которых не находили ' подвижных спермиев, считали стерильными. Скрещивания проводили при +25°С и при + 17°С. В качестве контроля брали самцов исходных родительских линий й гибридных самцов Fl. Результаты представлены на рисунках 1 а) и б).

На рис 1 а) можно упидеть, что наибольшее влияние на стерильность самцов при +25°С оказывают хромосомы 2, 3 и 5 (92% стерильных самцов с фенотипом Ь, gp, ре). Доля стерильных самцов с хромосомами 2 и 5 D. virilis составляла 87%, а с хромосомами 3 и 5 О.

а)

6)

Рис. 1. Процент стерильных самцов Рв1 от скрещивания <} О. \агШз х Э. \ririlis х о*П. ]иттеО_ в зависимости от фенотипа. Различия между контролем и опытом достоверны: р < 0.001.

\irHis - 83%. Все остальные сочетания хромосом О. гггйЬ дакгг 30 - 40 % стерильных самцов в каждом фенотипическом классе. Следует иметь в

виду, что все остальные хромосомы гибридов находятся в гетерозиготном состоянии: одна из хромосом - от О. ?1гШз, а другая - от О. 1итте1 . Во всех классах прослеживается закономерность: несовместимость гомозиготных аутосом и' X - хромосомы И. с У-хромосомой Э.

1иттег. Б качестве контроля мы взяли самцов Г1, которые несут ту же

а)

6)

2x3

2x4 3x4 2*3x4

2x5 3x5 2x3x5 ' 4x5 2x4x5 3x4x5 2x3x4x5

-9,85 " e,25i

""в.75[ -1,65'

'-3,43 " -2,63]

I

-3 48 3.481 ~ -9,78' " 14,93j

1,4! -¿.05!

Ваисмодойстомя хромосом 2-5 при +25" С

2 -23,7]

3 -в. 5 3x3x4x5

2x3 9 1' 2*4x5

4 -13,4' "

2«4 76 2x3x5

3x4 •12,8 2x5

2x3x4

5 -13.2; 2x3x4

2x5 ~ -2,4' 2*4

3x5 -8.4! 2*3

2x3x5 3,3

4x5 181! 2

2x4x5

3x4x5 2.3*

2x3x4x5 7.6

В»*ммодвйст>мя хромосом 2-5 при +17' С

-га -2с -и -id -5

Рис. 2. Взаимодействия хромосом у гибридов у D. virilis X D. virilis X if D. lummei) при температуре +17°С и +25°С.

самую Y-хромосому I), lummei (8% стерильных самцов), что недостоверно отличается от доли стерильных самцов у родительских видов.

На рис. 2 а) представлены результаты, полученные с помощью модифицированного метода анализа факториальных экспериментон, позволяющего выявить индивидуальный вкл;и каждой из аутосом в исследуемый признак. Наибольший вклад в исследуемый признак вносит хромосома 2; хромосомы 3 И 5 являются усилителями, а хромосома 4 -сунрессором. .'Ни данные показывают, что эпистатические взаимодействия xjximocom играКг г важную роль в формировании гибридной стерильности.

При -Н7"С (рис. 1 й) доли стерильных самцов в каждом фенопшическол» классе отличилась от таковой яри температуре +25"С.

Как показано на рис. 1 6), максимальная доля стерильных самцов была в следующих фенотипических классах: Ъ, ^, «/, ре (77%), Ь, сс1, ре (75%), ь, gp, ре (66%), Ъ, сА (56%), Ь, (64%), сё, ре (66%), что свидетельствует о взаимодействия хромосом 2, 3, 4, 5 и У-хромосомы, и эти взаимодействия отличаются от такопых в эксперименте при +25°С. В первом и во втором скрещивании самцы имели У-хромосому О. 1шпте1, Х-хромосому - от О. \'!гйи, здесь можно проследить закономерность, характерную для всех скрещиваний: несовместимость гомозиготных хромосом О. у/п?« с У-хромосомой О. 1иттп, причем,' чем больше гомозиготных х[х)/лосом О. \4tilis содержит геном гибридов, тем больше доля стерильных самцов.

На рис. 2 б) представлены результаты анализа факториальных з~сперт!м.ептоп при +17"С. Закономерность вза;йлсдей_таия хромосом та же, что и при +25°С, хотя относительный индивидуальный вклад каждой из хромосом изменился. Наибольший вклад в исследуемый признак в данном опыте вносит хромосома 2, затем 5 и 4, также достаточно большой коэффициент при взаимодействии хромосом 3 и 5, 3 и 4. Такое изменение картины стерильности самцов при изменении температуры свидетельствует об адаптивном значении этого признака. Очевидно, в процессе дивергенции этих видов менялся и характер адаптации нового производного вида.

Скрещивания между самками О. 1иття линии 206 и самцами О. У(п& 167 линии (рис. 3) мы использовали для характеристики роли второй хромосомы в проявлении стерильности самцов - гибридов О. \ЧгИи х О. 1итте1 в ряде последовательных поглотительных скрещиваний. В .каждом поглотительном скрещивании мы использовали самцов, несущих мутацию 01, которая является рецессивной деталью в гомозиготном состоянии Таким образом мы пытались заместить как можно больше хромосом О. хромосомами О. 1шпта, оставив хромосому 2 в

гетерозиготном состоянии. В каждом гибридном поколении анализировали стерильность самцов с помощью уже описанного выше метода вплоть до Б4 поколения. Скрещивания проводили при +25°С. При поглотительных скрещиваниях от Р1 до Р4 поколения доля стерильных самцов возрастает от 8 процентов до 62 процентов соответственно. При этом, если сравнивать классы мух, несущих одну хромосому 2 от О. \'1гШ$, а другую хромосому 2 от О. 1чтт&, то можно заметить, что доля стерильных самцов меньше, когда они имектг одну хромосому 2 от О. viri¡is, а другую -от О. 1итте%, т. е. . в гетерозиготе, чем в случае, когда они имеют гомозиготную хромосому 2 й. 1итте1, таким образом, мы можем сравнить вклад хромосом 2 от разных видов в гибридную стерильность. Разница в процентах стерильных самцов с фенотипом 01 и нормальным фенотипом является примерным вкладом хромосомы 2 О. Ьипта в признак. Увеличсчше доли стерильных самцов от первого поколения гибридов до четвертого, скорее всего, можно объяснить переходом других аутосом в

- Влияние второй хромосомы на стерильность гибридов при поглотительных скрещиваниях 0.1итте1 х р.утНв.

F1 01 F1 ♦ F2DI 7,7 33,3 "31/1

F2 + F3 DI 37,» 40 ----

F3 ♦ . F4+ ____ 42,2 62,1

- РЗй! —?. им ТГ' Г """""Д!

м 01 рва ,,!

----

0 20 40 60 80

--------

Рис 3. Доля стерильных самцов FbI от скрещивания ^ D. lummei х

virilis DI в ряду поглотительных скрещиваний.

Различия между контролем и опытом достоверны: *** р < 0.001.

гомозиготное состояние (обе от D. lummei), однако, в данном скрещивании этот процесс проконтролировать мы не можем из-за отсутствия маркеров в аутосомах, кроме второй.

В скрещиваниях D. melanogaster х D. svmdans было показано, что стерильность гибридов зависит от небольшого участка хромосомы 4 D, simulaos (Огг, 1991). Хромосоме 4 группы melanogaster соответствует хромосома 6 группы virilis Для оценки роли хромосомы 6 мы проводили скрещивания между самками D. virilis 160 линии и самцами линии 200 D. lummei при +17°С. Гибридные эмбрионы развивались сначала при -Н7°С, затем, после появления личинок, пробирки переносили в термостат с - температурой +25°С. При температуре +17°С происходит элиминация хромосомы 6 D. lummei в первом делении митоза практически у всех особей, в результате, у гибридных гетерозигот проявляется рецессивный признак glossy (Сидорова, 1973). Как показано на рис. 4 , доля стерильных самцов F1 с фенотипом glossy составляла в нашем опыте 96 %, что значительно больше, чем у контрольных самцов F1 (9 %), имеющих 1етерозиготные хромосомы 6: одна - от D. virilis, другая - от D. lummei. Таким образом, по результатам дайною скрещивания можно сделать заключение, что хромосома 6 D. virilis в гемизиготном состоянии при взаимодействии с гетерозиготными остальными хромосомами, а также с Y-xjwmocomoh D. lummei приводит к почти полной стерильности салщов уже в первом поколении гибридов.

glossy норма

Ш'

[РРядЛ

50

100

Рис. 4. Процент стерильных самцов F1 от скрещивания j D. virilis х ¿ТУ. lumrnei. п опыте по сравнению с контролем. Различия между кошелем и опытом достоверны: *** р < 0.001.

2. Роль взаимодействий X и Y хромосом в развитии гибридной стерильности.

Мы провели генетический анализ с целью оценить роль участков X-хромосомы в развитии гибридной стерильности самцов. Мы использовали для анализа мутацию, которая была получена в нашей лаборатории впервые у D. lumrnei - vermilion, а также маркеры D. virilis: apricot -примыкает к инверсии с проксимального конца, Beadex -располагается в границах инверсии, vermilion - примыкает к инверсии с дистального конца, и yellow - маркирует дисталышй конец. Мы полагали, что мутации v и ар маркируют границы видоснецифической инверсии iiil(arb) I). lumrnei, мутация у - дистальпын конец Х-хромосомы, а йл пеинвертированный участок Х-хромосомы D. virilis Для получении потомства 1'1 ставили скре|цинания реципрокно. Для оценки вклада V хромосом U. virilis и D. lumrnei, а также участков X - хролюсомы с помощью того же метода, что и в первом опыте, анализировали стерильность самцов Fnl и F2 (двенадцать классов). Скрещнь.:ния П|ХЮОДНЛИ при + 25"С и при + 17°С.

Как видно из данных рис. 5 а), слабее всего выра;кена стерильность у самцов, несущих маркеры только or U. virilis. Добавление одною лишь участка v от D. lumrnei почти на 10% увеличивает долю стерильных самцов. Эту особенность данного участка можно проследить практически для всех сочетаний участков Х-хромосом virilis и luiumei. М противоположном направлении скрещивания (рис. 5 6) действует проксимальный участок Х-хромосомы D. virilis, меченый мутацией ар. Этот район Х-хромосомы частично восстанавливает фертильность самцов даже в сочетании со значительными по протяженности участками X-хромосомы D. lumrnei. Наибольший вклад в стерильность гибридных самцов вносят участки, включающие «идоспецифическую инверсию 1ч1 (а+Ь) и дисталышй конец Х-хромосомы 0. lumrnei.

и

а)

/

б)

Рис. 5. Процент стерильных самцов Рв1 от скрещивания^^ О. уЫШ X 1ишше1) х сГВ. утНя и реципрокного скрещивания в зависимости от сочетания различных участков Х-хромосомы. Различия между контролем и опытом достоверны: ** р < 0.01.

В анализирующем скрещивании, где родительские самки взяты от О. ■шйк (рис. 5 а), четко видно, что самый высокий уровень стерильности (около 80%) отмечен у самцов, Х-хромосома которых состоит из дисгальной части Х-хромосомы О. -пгйЬ и средней и проксимальной частей Х-хромосомы О. 1иттп (фенотипы у, V, + и уу). Высока стерильность самцов V, которые несут не только видоспецифическую инверсию, но и прилегающий маркированный мутацией V участок Х-хромосомы О. lu.mm.ei. В то же время, почти вся Х-хромосома О. Ытпш, за исключением, возможно, самого дистального участка вызывает почти полную стерильность гибридных самцов при наличии У-хромосомы й. тгйк.

Сходные результаты получены и в' реципрокном анализирующем скрещивании (рис 5 б), где цитоплазма яйца получена от П. Ыттеи В следующих фенотипических классах: у, V, + и уу доля стерильных самцов 80 - 90 % в присутствии У-хромосомы О. тпгйи. Результаты реципрокных скрещиваний свидетельствуют о том, что стерильность гибридных самцов не зависит от материнского эффекта.

Для выяснения роли У-хромосом и X - У взаимодействия были получены гибриды Р2. В скрещивании 5 (^ Э. тгйх х с? П. 1итте1) х ( у

12

„X.__ V ♦ УУ- .1 уяр 83,33 82,29 33.33 " 83,1 81.34 36) 58 ууар Емшвпннп

Вхар уВхар ууар ууВхар 34,88 25,85 36,84 ч 35,24 0 20 40 60 80 100

4 I 4

V 74,49 80 ууар ЕЕмЗаа

•Р 53,85

88,241

УГ__ У'Р____ уар 83,7«! 31,25; 25 29,03!

УВ*»Р уВхар ууар 33,08! 41,38 45,45 0 20 40 60 80 100

ууВхар 36,07,

Рис. 5. Процент стерильных самцов F2 от скрещивания у Г' virilis х ti* Г). liniiniei) х D. viiilis x i/D. Iiunniei) (ii) и рециирохпш-.-) скрещивания (г) в зависимости от сочетания различных у ¡л-, гкои I-хромосомы.

Различия между контролем и опытом достоверны: "* р < 0.U!.

D. virilis х <í D. hítnmei) самцы Г2 несли Y-хромосому L), пшсmr, ;i цитоплазму - от D. virilis (рис. 5 в). Анями вттцх>го поколения a.Mijoi <п скрещивании D. virilis х D. lummci дал несколько иные результат. Здесь гораздо большее влияние на проявление стерильности оказывает участок Х-хромосомы D. lummei, маркированный мутацией v. Сохраняется и влияние участка от D. virilis, маркированного ар, как фактора, стабилизирующего и усиливающего фертильность гибридных самцов /V-" самцов второго поколения характерно общее снижение стерильности, особенно для тех классов, которые в Ful имеют самый высокий уровень пенетрантности этого признака. Доля стерильных самцов всех фенотипичсеких классов значительно меньше, чем в FbI и не превышает 70%. Эти данные показывают, что при взаимодействии Y-хромосомы О. liimmei с различными участками Х-х|Х).млч1мы I). virilis доля стерильных самцов значительно меньше, чем в скрещиваниях, где гибриды несут Y-

хромосому от D. virilis, особенно заметна эта разница для классов у, v, + и yv.

Однако, в F2 от скрещивания <¡>(§D. lummei х ¿Ь. virilis) х ó(oD. lummei х <$D. virilis) результаты практически сходны с данными по анализирующим скрещиваниям (рис. 5 г). Здесь Y-хромосома D. virilis в сочетании почти со всеми участками Х-хромосомы D. lummei дает самый высокий уровень стерильности самцов (50-92%). Таким образом, основным фактором, вызывающим стерильность самцов в этом эксперименте, является Y-хромосома D. virilis и ее взаимодействия с X-хромосомой и аутосомами. В этом скрещивании некоторые классы потомков исключены из анализа из-за малочисленности (вследствие низкой жизнеспособности). В качестве контроля в данном опыте мы взяли самцов F1, несущих Y-хромосому D. lummei и Х-хромосому D. virilis, среди которых доля стерильных самцов составляла 9 %.

3. Электронно-микроскопическое исследование хвостового отдела сперматозоидов у D. virilis и у стерильных гибридов D. virilis х D. lummei.

В задачу нашего исследования также входило изучение строения сперматозоидов стерильных самцов-гибридов D. virilis х D. lummei и сравнение его со строением спермиев у плодовитых самцов родительского вида D. virilis с помощью электронного микроскопа.

Здесь стоит коротко напомнить об основных событиях, происходящих во время сперматогенеза. Сперматогенез - процесс превращения диплоидных мужских половых клеток в гаплоидные, свободные и дифференцированные клетки - сперматозоиды. В сперматогенезе можно выделить четыре периода; размножение, рост, созревание и спермиогенез (формирование спермиев) (Burgos, Fowcett, 1955; Fowcett, 1961 ; Klasterska & Ramel, 1990 a; b; Lindsley & Tokuyasu, 1980).

Процессы, происходящие во время мейоза D. virilis и D. lummei, описаны на уровне светового микроскопа (Klasterska & Ramel, 1990 а; b), хотя сперматогенез у D. virilis описан только с помощью светового микроскопа, основываясь на этих работах и работах по сперматогенезу у D. melanogaster, а также на наших собственных данных, можно сделать выводы, что последовательность и суть событий те же самые, что и для D. melanogaster, отличия могут быть лишь в йаких-то деталях и во времени протекания различных стадий.

В спермиогенезе большинства типов животных митохондрии испытывают изменения ультраструктуры и расположения их внутри клетки. Не является исключением в этом отношении и D. virilis. У D. virilis все митохондрии скапливаются в одном месте, сливаются и образуют крупный зачаток побочного ядра. Зачаток побочного ядра разделяется пополам, половинки отходят друг от друга и вытягиваются вдоль

ку

мс

/

пя

ок

Рис. 6. Схематическое изображение поперечного среза промежуточного отдела хвоста нормального сперматозоида О. унШб. Показаны две части побочного ядра (ПЯ), содержащего кристаллоподобную ультраструктуру (КУ); показан осевой'комплекс сократимых фибрилл (ОК), мембрана сперматозоида (МС).'

промежуточного отдела сиерматиды. В одном из зачаткоз формируется кристаллоподобная ультраетруктура и постепенно заполняет побочное ядро, о то время, как другой зачаток уменьшается в размер. Как можно увидеть на рис. 6 (сделан по лшкрофотографии), на поперечном срезе хвост сперма-гиды имеет форму, близкую к овальной (стадия индивидуали.иуии). Крупный зачаток побочного ядра у О VI гШь на поперечном срезе имеет почти правильную круглую форму, по краям заполненную однородной плотной массой, состоящей из множества маленьких глобул. Центральная часть крупного зачатка побочного ядра заполнена структурой, состоящей из более крупных глобул, плотно упакованных в виде кристаллической решетки. Предполагается, что производные митохондрий игрангг роль в уитоплазматической наследственности и передают зиготе по наследству митохопдриальные нуклеиновые кислоты сперматозоида (Гогот, 1973).

Как большая, так и меньшая часть побочного ядра окружены собственной мембраной, а также эти две производных имеете с комплексом сократимых фибрилл окружены мембраной хвостового отдела сперматиды. Мембрана плотная, ровная, имеет лишь небольшие выступы

Рис. 7. Схематическое изображение поперечного среза промежуточного отдела хвоста аномального неподвижного сперматозоида гибрида О. у1гШб х Э. 1итте1. Показаны две части побочнсго ядра (ПЯ), содержащего кристаллоподобную ультраструктуру (КУ), которая нарушена и сдвинута по направлению к жгутику в сравнении с 6. уйШб; показан осевой комплекс сократимых фибрилл (ОК), мембрана сперматозоида (МС), которая имеет неправильную форму и в некоторых местах нарушена (НМ). Также, имеются нарушения мембраны побочного ядра (НМПЯ).

и тесно прилегает к производным побочного ядра и комплексу сократимых фибрилл. Также, как и у большинства видов животных, плазллалемма сперматозоида D. viräis имеет асимметричное строение (Данилова, 1978). Асимметрия плазматической мембраны выражается в том, что два электронно-плотных слоя мембраны различны по толщине. Наружный слой плазматической мембраны у D. virüis более темный и превышает по ширине внутренний. На срезах, сделанных через сперматиды в стадии элонгации, видны цитоплазматические синцитиальные мостики, которые позже,«на стадии индивидуализации, исчезают.

При сравнении структуры сперматид гибрида FbI от скрещивания ^ (<} D. virilis х <? D. lummet) x <? D. virüis на стадии индивидуализации (рис. 7, сделан по микрофотографии) можно заметить, что имеются множественные нарушения плазматической мембраны сперматид, мембрана неправильной формы и во многих местах прерывается, особенно это заметно в отношении наружного, более толстого, слоя мембраны. Побочное ядро (ПЯ) сперматид гибридов также отличается < т

побочного ядра сперматид О. \nrilis. Кристаллическая ультраструктура и этом случае разрыхлена, занимает меньший, чем у О. уггИи, объем, располагается несимметрично внутри ПЯ и сдвинута к краю большей части ПЯ, которая прилшкает к комплексу сократимых фибрилл. Также, нарушена оболочка ПЯ: во многих местах она прерывается или отсутствует вообгце. Матрикс, состоящий из множества мелких глобул, распределен внутри ПЯ неравномерно. Такие серьезные множественные нарушения ультрастуктуры сперматид, скорее всего, являются основной причиной стерильности изученных нами гибридов.

Основной структурой сперматозоидов, с которой связывают подвижность, является осевой фибриллярный комплекс. Осевой комплекс состоит у Б. из двух центральных микротрубочек. - фибрилл

(центральные фибриллы имеют вид плотных трубочек, в центре которых расположены еще более плотные одиночные фибриллы), окруженных девятью периферическими парными фибриллами - дублетами, связанными с дополнительными фибриллами - микротрубочками, которые заключают внутри себя плотные одиночные фибриллы. Формулу аксонемы можно записать в этом случае таким образом: 9 + 9(2) + 2. Дополнительные фибриллы также имеют две ручки, расположенные с внешней стороны фибриллярного комплекса и отходящие в разные стороны от фибриллы. Центральные фибриллы связаны между собой двумя дугами, называемыми центральной оболочкой. От центральных фибрилл к дублетам идут темные радиальные тяжи, или лучи Афцелиуса. У О. утШ, также, как и у П. те1апо$1К(ег (Токиуави, 1974 а) нами была обнаружена особая ультраструктура радиальных лучей: на внутреннем конце луча располагаются две головки из более плотного (более темного на микрофотографии), чем окружающий матрикс, вещества.

Периферические парные фибриллы, соединенные в виде восьмерок, состоят из двух субфибрилл А и Б. Одна из них, субфибрилла А, округлая, она расположена ближе к центральной оси жгутика и снабжена двумя короткими отростками - ручками, которые состоят из белка - линейна, обладающего АТФазной активностью. Субфибрилла Б имеет вид полукольца. Каждая фибрилла представляет собой длинную тонкую микротрубочку, стенки которой состоят из продольно ориеттфованных филаментов, состоящих из белковых глобул (РегоШ, 1969). Субьединицы в стенках субфибрилл хорошо видны на поперечных ультратонких срезах. У О. у/п&, также, как и у О. теХапо^^ег, между девятью дополнительными фибриллами располагаются довольно крупные темные структуры, называемые некоторыми авторами интерсателлитными телами (Данилова, 1978).

Ультраструктура комплекса сократимых фибрилл стерильных гибридов^ О. х <? О. 1итты) х О О. чтИ<, практически ничем не

отличается от таковой у I). Нарушений ультра структуры комплекса

сократимых фибрилл у гибридов Рв1 О. и'гйи х Л П. 1итят) х </ О.

мы не обнаружили.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основываясь на результатах нашей работы, можно сделать заключение, что гибридная стерильность является результатом взаимодействия отличающихся частей генома гибридов О. Г(/Ии х О. 1иттег, полученных ими от разных видов. Такими основными элементами генома являются: половые хромосомы, хромосомы 2 и 6, остальные хромосомы усиливают или сугтрессируют действие основных элементов. Нами проведена локализация генов стерильности на Х-хромосоме. Следует иметь в виду , что мы имеем дело не с мутациями, вызывающими сетрильносгь, а с генетическими системами, каждая из которых обеспечивает нормальное течение сперматогенеза у своего вида. Поэтому, при рассмотрении этих взаимодействий в онтогенетическом плане следует .ггметить, что события, приводящие к нарушению сперматогенеза, имеют место при детерминации гаметогенеза. Элементы генома от разных видов взаимодействуют некоординированно, что приводит к нарушению сперматогенеза у гибридов. В современной литературе это явление получило особое название - "геномная несовместимость

Что касается дивергенции этих двух видов, мы установили, что стерильность проявляется уже в первом поколении гибридов, в отсутствии хромосомы 6 Б. 1иттех, в то время как вообще гены Б. тпгйк, связанные с изоляцией, являются рецессивными по отношению к генам О. Ыттеи Хотя полная элиминация хромосом происходит при +17°С, этот изолирующий механизм должен действовать в природных условиях, поскольку температуры ниже +20°С являются характерными для нормального развития О. 1гтта в природе. Б. 1иттег является типичным обитателем умеренных широт, тогда как П, тгйк является тропическим видом. Таким образом, этот механизм изоляции возник в результате адаптации О. Ьшпта к пониженным температурам. Что касается стерильности, то этот механизм изоляции также действует в первом поколении в результате элиминации хромосомы 6, несмотря на то, что гены стерильности рецессивны и не должны действовать в первом поколении. Вполне возможно, что стерильность также появилась в результате адаптации нового вида к услввиям среды. Таким образом, между й. п'гйк и О. 1иттп уже в первом поколении действуют два механизма постзиготической изоляции: стерильность и элиминация хромосом.

Электронно-микроскопические исследования строения хвостового отдела сперматозоида стерильных салщов-гибридов О. х Б. 1иттег показало, что геномная несовместимость у гибридов приводит к нарушениям структуры формирующихся сперматозоидов и, в результате, к

их неподвижности, причем признак - стерильность гибридов - впервые связан с ультраструк-турой сперматозоидов.

ВЫВОДЫ.

1. Проведен генетический анализ гибридов между БгозорЬИа \nrihs и I~)гозорЬйа 1итта> и сделана локализация генов, вызывающих стерильность у гибридов, с точностью до хромосомы, а на X - хромосоме - с точностью до локуса.

1.1. В результате генетического анализа установлено, что главными в проявлении х-ибридной стерильности являются половые хромосомы, хромосомы 2 и 6, а хромосомы 3, 4 и 5 являются модификаторами этого эффекта, причем, выявлено, что хромосомы 3 и 5 являются усилителями, а 4 - супрессором при развитии гибридной стерильности.

1.2. Установлено, что хромосома 6 V. в гемизиготиом состоянии при взаимодействии с остальными гетерозиготными хромосомами гибридов Г1 О. тгИк х О. Ыпигш приводит почти к полной стерильности гибридов.

1.3. Установлено, что гены гибридной стерильности Х-хромосомы, кроме видоспецифической инверсии 1п1(а+Ь) О. 1иттп, локализованы также в районе мутации уегтйюп. :

2. Проведен электронно-микроскопический анализ строения хвостового отдела поздних сперматид у нормальных самцов Ц тгп/« и у стерильных гибридов О. у«гйм х О. 1иттН.

2.1. Стерильность является результатом нарушения структуры хвостовою отдела сперматозоидов гибридов О. у/гйз у I). 1ипитч. Установлено, что стерильность шбридов Рв1 О. У1гИк х О. Ьиптм, как результат неподвижности спермиев, проявляется по причине множесч пенных нарушений строения плазматической мембраны спермиев, а -1ак;лс мембраны и внутренней структуры побочного ядра.

3. Мы установили, что стерильность проявляется уже в первом поколении гибридов, в отсутствии хромосомы 6 О. 1иттп, в то время, ьак пообнк гены О. связанные с изоляцией, я ил я юте ч рецессивными по отношению к тепам П. 1итта. Стерильность, как механизм изоляции, также действует в первом поколетш в результате элиминации хромосомы 6. Таким образом, между Г). у/п7;Ч и П. 1итте/ уже н первом поколении действуют дна механизма ностэиготической изоляции: стерильность и элиминация хромосом.