Особенности функциональных взаимодействий SCS- и SCS'-инсуляторов, а также промоторов соседних коэкспрессирующихся генов дрозофилы

Леман, Дмитрий Всеволодович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности функциональных взаимодействий SCS- и SCS'-инсуляторов, а также промоторов соседних коэкспрессирующихся генов дрозофилы
ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Особенности функциональных взаимодействий SCS- и SCS'-инсуляторов, а также промоторов соседних коэкспрессирующихся генов дрозофилы"

На правах рукописи

УДК 575.22:577.218

Jituikfb

ЛЕМАН ДМИТРИИ ВСЕВОЛОДОВИЧ

Особенности функциональных взаимодействий SCS- и SCS'-инсуляторов, а также промоторов соседних коэкспрессиругощихся генов дрозофилы

Специальность 03.01.07 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2014

005550180

Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук

Научный руководитель: Георгиев Павел Георгиевич, академик,

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Глазков Михаил Васильевич, доктор

биологических наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук, руководитель группы структурно-функциональной организации эукариотических хромосом

Шпиз Сергей Григорьевич, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетнки Российской академии наук, научный сотрудник лаборатории исследования геномных повторов эукарнот

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук

Защита состоится «£.?» 2014 года в тУ часов на заседании диссертационного

совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения наук» Института биологии гена Российской академии наук по адресу:

hltp://vvw\v.gcncbiology.ш/disscrtation/Dis-Lernan-14-03-2014.pdf

Автореферат разослан: «Я?) » Ол^С'Л-Л 2

2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета _

канд. фарм. наук Грабовская Л.С.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Геном эукариот является сложноорганизованной системой, координированная работа которой необходима для осуществления всех этапов передачи и реализации генетической информации. Последовательная активация и инактивация генов происходит, в том числе и благодаря четкой и скоординированной во времени и пространстве регуляции всех этапов транскрипции. В этом процессе необходимо особо отметить важность цис-регуляторных элементов генома, под строгим контролем которых происходит правильная и своевременная активация/репрессия генов высших эукариот. За счет взаимодействия специфичных транскрипционных белковых факторов, на которых собираются особые регуляторные белковые комплексы, с промоторами генов и дисталыю-расположенными элементами (энхансерами и сайленсерами) происходит включение или выключение промоторов генов.

Энхансеры эукариот не обладают специфичностью действия и взаимодействуют с промотором вне зависимости от положения относительно направления старта транскрипции мишеневого гена. Часто энхансер и промотор гена находятся на расстоянии десятков тысяч пар нуклеотидов друг от друга, кроме того, между геном и энхансером может располагаться ген с другой программой экспрессии, и гены могут перекрываться. Следовательно, клетки эукариот должны были выработать механизмы, определяющие специфичность действия энхансера. Существуют экспериментальные доказательства того, что в процессе активации энхансер и промотор физически сближаются в пространстве, а расположенный между ними участок ДНК выпетливается. Однако механизм и движущая сила такого явления остаются слабо изученными.

Помимо эихансеров в геноме существует другой класс регуляторных элементов — сайленсеры. Сайленсерные элементы репрессируют транскрипцию генов, и, подобно энхансерам действуют вне зависимости от их положения относительно направления транскрипции гена и не обладают специфичностью действия.

Влияние на транскрипционный статус гена оказывают упаковка ДНК в хроматин, а также формирование внутри ядра определенных хромосомных территорий, содержащих регуляторные белковые комплексы. Одним из уровней осуществления координированной регуляции транскрипции является организация генов в независимые кластеры (домены) с одинаковыми профилями экспрессии. Формировашге независимых функциональных доменов подразумевает наличие дополнительных регуляторных элементов, защищающих от позитивного или негативного влияния окружающего хроматина и участвующих в координации энхансер-промоторных взаимодействий. Принято считать, что эту функцию выполняют инсуляторы.

Инсуляторы — это цис-регуляторные элементы, которые блокируют промотор гена от действия энхансера, если располагаются между ними, а также ограничивают распространение репрессионных сигналов, индуцированных действием сайленсеров или гетерохроматином. При этом инсуляторы не влияют

непосредственно на активность энхансера, сайленсера и промотора: энхансер (сайленсер) сохраняет способность влиять на незаблокированный промотор, а промотор может быть активирован (репрессирован) другим энхансером (сай-ленсером).

На современном этапе развития молекулярной генетики идентификация последовательностей, вовлеченных в регуляцию транскрипции, выяснение их основных свойств и функциональной роли в поддержании экспрессии генов является одной из важнейших задач. Это определяет актуальность подобных исследований в настоящее время.

Цель и задачи исследования

Основной целью данной работы явилось изучение свойств SCS- и SCS'-инсуляторов и взаимодействия между промоторами соседних генов yellow и CG3777 у Drosophila melanogaster.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать в трансгенных линиях дрозофилы способность SCS- и SCS'-инсуляторов функционально взаимодействовать друг с другом на расстоянии, на котором эти инсуляторы находятся in vivo.

2. Проверить SCS- и SCS'-инсуляторы на промоторную активность в трансгенных линиях дрозофилы и 82-клетках.

3. Выяснить, входят ли в состав SCS-инсулятора активные сигналы полиаденилирования.

4. Исследовать функциональное взаимодействие между промоторами генов yellow и CG3777 в трансгенных линиях дрозофилы.

Научная новизна и практическая ценность работы

В работе были исследованы фрагменты SCS- и SCS'-инсуляторов, и было показано, что взаимодействие между SCS и SCS' усиливает энхансер-блокирующую активность SCS'-инсулятора. Установлено, что на концах SCS- и SCS'-инсуляторов находятся промоторы, которые активны в эмбриональных S2-клетках. Несмотря на то, что энхансер-блокирующая активность SCS-инсулятора была продемонстрирована в трансгенных линиях D. melanogaster, промоторы генов CG312U и Cad87A, которые его фланкируют, практически не работают в глазах. Таким образом, активность промоторов не определяет функциональность инсуляторов. Впервые было показано в последовательности SCS-инсулятора наличие активных сигналов полиаденилирования, работающих как в 82-клетках, так и в глазных имагинальных дисках. Выявлено функциональное взаимодействие промоторов соседних генов yellow и CG3777. Результаты данной работы расширяют представление о регуляторных элементах с энхансер-блокирующими и промоторными свойствами и позволяют по-новому оценить функциональное значение инсуляторов и промоторов в геноме.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на XIX международной конференции «JIOMOHOCOB-2012» (Москва, 9-13 апреля, 2012).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы. Из них статей — 2, тезисов устных и стендовых сообщений — 1.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 70 страницах, включает 16 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 139 источников.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследование свойств SCS- и SCS'-инсуляторов

Исследования SCS- и SCS'-инсуляторов неоднократно проводились на трансгенах Drosophila melanogaster, с использованием в качестве репортерных или селекционных маркеров кодирующие части генов mini-white и yellow (Kellum et el. 1992, Caí et el. 1995, Vazquez et el. 1994, Kuhn el el. 2003, Majumder et el. 2003, Göhl et el. 2011). Ген mini-white представляет собой эндогенный ген white, у которого частично делетирован первый длинный интрон. Ген white активно экспрессируется в глазах под контролем тканеспецифичного энхансера и определяет степень пигментации глаз. При этом пигментация глаз прямо коррелирует с уровнем экспрессии гена white, что значительно облегчает анализ экспрессии гена. Как и у эндогенного гена white на 3' конце mini-white расположен эндогенный инсулятор Wari (Chetverina et el. 2008). Ген yellow экспрессируется в кутикулярных структурах личинки и имаго и находится под контролем нескольких тканеспецифичных энхансеров (Geyer and Corees, 1987; Martin et al, 1989). В данной работе уровень экспрессии обоих генов оценивался фенотипнчески по пигментации глаз, тела, крыльев и щетинок.

1.1. Исследование функционального взаимодействия между SCS- и SCS'-инсуляторами

SCS и SCS' - это первые описанные инсуляторы, которые были обнаружены на границе домена, состоящего из двух генов теплового шока (Kellum and Shedl., 1991, 1992; Udvardy et el., 1985) (Рис. 1).

Ранее было показано, что SCS- и SCS'- инсуляторы взаимодействуют друг с другом in vivo и in vitro (Blanton et el. 2003). На основе этих результатов была предложена модель, согласно которой взаимодействие между этими инсуляторами обеспечивает формирование независимого домена транскрипции. Однако функциональная роль этих взаимодействий и предложенная модель не имели экспериментального подтверждения.

Рисунок 1. Цитогенетический локус 87А7 хромосомы 3 Drosophila melanogaster. Область размером б 15 т.п.н. содержит 6 генов (серые стрелки): гены Iisp70, транскрибируемые в разных направлениях, Cad87A, CG3I211.CG3281 и aurora. Точечные линии указывают на место расположения инсуляторов SCS (993 п.н.) и SCS' (500 п.н.). Черные стрелки обозначают позиции промоторов аиг и CG312I1. Белые - позиции промоторов Cad87A и CG3281. Zw5-caÜTbi SCS-инсулятора обозначены белым овалом. Сайты связывания белка BEAF32 в пределах SCS' показаны черными прямоугольниками.

Для этих целей использовалась модельная система с двумя репортерными генами mini-white и yellow. Поскольку одна копия SCS полностью блокирует активность энхансеров yellow и mini-white, более слабый SCS' был встроен между этими энхансерами и геном yellow. SCS инсулятор, фланкированный 1ох-сайтами для сайт-специфической рекомбиназы CRE, расположили с 3'-конца гена mini-white вместо Wari-инсулятора. Индукция сайт-специфической рекомбинации между lox-сайтами позволяет in vivo вырезать участок между этими сайтами, что дает возможность проанализировать экспрессию репортерных генов, как в присутствие, так и в отсутствие исследуемого элемента в одном и том же месте генома.

В результате в созданной нами конструкции SCS- и SCS'-инсуляторы образовали домен (9226 п.н.), длина которого соответствовала интактному расстоянию между этими элементами в геноме Drosophila melanogaster (Udvardy et el. 1985).

В 14 полученных трансгенных линиях наблюдаемые уровни экспрессии генов yellow и mini-white демонстрировали частичную активность энхансеров (Рис. 2а). При делеции SCS пигментация глаз увеличилась у семи трансгенных линий, а пигментация тела и крыльев - у девяти. Таким образом, присутствие SCS частично усилила энхансер-блокирующую активность SCS'-инсулятора.

yellow

s 4 i г 1 jot

4 8 2 14

tO 4 9/14

14 12/14

14 0/14

S.....4.....3 2.....1.....N/T

4 8 2 14

2 9 1 2 9/14

11 3 12/14

11 3 0/14

5 4 3 j 1 NfT

3 13 18 7 9 2 16/18 12 6 18/18 12 6 0/18

Рисунок 2. Исследование функционального взаимодействия между инсулятором (a) SCS' или (б-в) Zw5-caiÎTaMH и SCS-инсулятором. На схемах трансгенных конструктов гены white и yellow показаны белым и черным прямоугольниками, соответственно, с черными стрелками, указывающими на направление транскрипции. SCS'- и SCS-инсуляторы обозначены маленькими серым и белым прямоугольниками. Zw5-caiiTbi показаны маленькими белыми овалами. Знак Д обозначает делецию Wari-инсулятора на З'-конце white. Черные стрелки, направленные вниз, определяют сайты для рекомбиназ FLP (fit) и CRE (1ох). Черный круг -энхансер глаз, а два белых - энхансеры тела и крыльев yellow. В нижней части схемы колонки «white» и «yellow» обозначают количество трансгенньгх линий с различной степенью пигментации глаз и производных кутикулы. N показывает количество линий, где мухи приобретали новый фенотип после удаления (Д) соответствующих последовательностей ДНК, а Т обозначает общее количество линий, участвующих в эксперименте.

Однако в трансгенных линиях дрозофилы четыре сайта связывания Zw5 только слабо блокировали активность энхансеров генов yellow и white. Было решено проверить, будет ли SCS способствовать усилению энхансер-блокирующей активности Zw5-cafiTOB.

Вместо SCS'-инсулятора между энхансерами и промотором yeliow были встроены четыре и восемь 7ш5-сайтов (Рис. 26,в). Как видно из приведенных результатов, восемь Zw5-caiïroB обладают более выраженным энхансер-блокирующим эффектом по сравнению с четырьмя. Как и предполагалось, делеция SCS-инсулятора значительно повышала экспрессию yellow и mini-white, доказывая наличие функционального взаимодействия между SCS и Zw5-сайтами.

white

K|> ККр К TOp Ор ТЖ Ж СЖ 6 N/T

riE.vejscs'YW{5csj 5 3 3 3 14

MEyem'YVm; 2 6 3 2 1 9/14

Ï (Aiscs'YWiscs) 2 7 14 14/14

4\!S«W'M} 1 6 3 4 2/14

»«5,s _^ _». scs

fit f7i

Kp k'Kji k' TOp Oj! ТЖ Ж СЖ li N/T

2 4 5 3 14

Li^aS* 14 13 5 10/14

W.\ÏKvr4W/SSCS) 2 5 5 2 14/14 4

4>,;z«6"YWiA! 2 4 S 3 2/14

ïwSs8 I--> ,-SCS

■'Ь- Ш

Кр КК> К ТОрОр ТЖЖС'ЖК N/T

piEyeîZï.i^'Wtes) ™ S 6 5 1 18

M&'eizw5"5YW(A} 2 5 2 8 2 1 14/18 es) 1 8 S 3 12/18

HiawJ^V^A) 1 8 6 2 1 1/18

1.2. Тестирование SCS- и SCS'-инсуляторов на промоторную активность в эмбриональных 82-клетках

Ранее, в генсше Drosophila melanogaster на концах последовательностей SCS- и SCS'-инсуляторов были картированы последовательности потенциальных промоторов (Avramova et el. 1999, Hogga et el. 2002, Kuhn et el. 2003).

Для подтверждения этого факта была разработана система детектирования промоторной активности в эмбриональной клеточной линии S2 Drosophila на основе плазмидного вектора рАс5. l/V5-HisB (далее рАс), содержащего кодирующую часть гена Firefly luciferase (далее Flue). Предварительно из вектора был удален промотор actin 5С Drosophila. SCS- и SCS'-инсуляторы были встроены в рАс перед кодирующей областью гена Flue в прямой и обратной ориентациях (Рис. За).

Рисунок 3. Тестирование SCS- и SCS'- инсуляторов на промоторную активность. На схеме кодирующая часть люциферазы FIuc показана черным прямоугольником со стрелкой, указывающей на направление транскрипции. Белым прямоугольником обозначен SV40-терминатор «term». Толстая серая стрелка указывает на сайт инсерции А.г/;70-промотора, а также SCS- и SCS'-инсуляторов (а). Данная система позволяет последовательно измерять активности Fluc и RIuc. Отношение активностей люцифераз Fluc/Rluc в исследуемых плазмидах показана на гистограмме (б).

Для контроля эффективности трансфекции помимо исследуемых плазмид 82-клетки котрансфецировались плазмидой pAcRluc, в которой встроена кодирующая часть гена Renilla luciferase (далее Rluc) под контролем промотора actin 5С. При добавлении соответствующего субстрата (для каждой люциферазы свой) происходит химическая реакция с образованием квантов света, которые можно детектировать, определяя количество фермента каждого

типа. Кроме того, возможно последовательное измерение количества люцифераз при одновременном присутствии их в одной пробе. Эффективность транскрипции определялась отношением значений Flue к Rluc. Фоновый уровень определялся по уровню люминесценции нетрансфецированных клеток.

В результате было показано, что на обоих концах SCS- и SCS'-инсуляторов находятся промоторы (Рис. 36), которые способны запускать транскрипцию в 82-клетках.

1.3. Обнаружение функционального сигнала полиаденилирования в последовательности SCS-инсулятора

Согласно данным секвенирования, в центральной области SCS содержатся два сигнала полиаденилирования, которые, в свою очередь, могут принимать участие в терминации транскрипции (Рис. 4а).

Рисунок 4. Тестирование SCS-инсулятора в 82-клетках на наличие терминирующей активности. На схеме SCS-инсулятора (PvuII-PvuIl фрагмент) Zw5-caiiTbi показаны белым прямоугольником. Найденные в последовательности SCS сайты полиаденилирования обозначены маленькими серыми кружками со знаком «+», который указывает на прямое направление транскрипции. Фрагмент Hpal-Ndel индицирует границы элемента, используемого для исследования терминирующей активности SCS (а). На схеме трансгенного конструкта кодирующие части генов Renilla (Rluc) и Firefly (Flue) показаны белым и черным прямоугольниками со стрелками, указывающими на направление транскрипции. Небольшими белыми прямоугольниками обозначены SV40-TepMHHarop «term», актиновый промотор «promoter» и 1RES из гена грг «1RES». Толстая стрелка указывает на сайт инсерции SCS (Hpal-Ndel фрагмент) и 5У40-терминатора (б).

Для исследования данного вопроса была разработана бицистронная модель, где гены люцифераз Flue и Rluc находятся под контролем общего промотора actin 5С Drosophila. Между люциферазами был встроен сайт внутренней инициации трансляции гена reaper дрозофилы (1RES) со стороны 5'-конца гена Flue. Предполагалось, что если сигнал полиаденилирования функционален, то с промотора actin 5С будет продуцироваться только моноцистронная мРНК гена Rluc. Если же сигнал не активен либо слаб, то будет синтезироваться длинная бицистронная мРНК, которая будет служить матрицей для синтеза обеих люцифераз. Таким образом, отношение значений люминесценции Fluc/Rluc позволяет оценить количество длинных бицистронных мРНК к общему объему всех мРНК, синтезированных с конструкта.

Тестируемый центральный (392 п.н. Hpal-Ndel) фрагмент SCS был встроен между кодирующей частью Rluc и 1RES в прямой и обратной ориентациях. В качестве контроля был взят 8У40-терминатор, встроенный по тому же сайту, что и фрагмент SCS-инсулятора (Рис. 46). В результате центральный фрагмент SCS, ориентированный в прямом положении, продемонстрировал сильную терминирующую активность, что согласуется с наличием двух активных сигналов полиаденилирования. Итак, SCS-инсулятор может участвовать в терминации транскрипции в S2-клетках.

1.4. Тестирование SCS-инсулятора на терминирующую активность в глазных имагинальных дисках Drosophila melanogaster

В свете результатов, полученных на 82-клетках, SCS, помимо функциональных промоторов, также содержит активные сигналы полиаденилирования в центральной части своей последовательности. Исходя из этих данных, мы решили проверить данный участок на терминирующую активность на модели в глазных имагинальных дисках Drosophila.

С этой целью была использована конструкция, содержащая UAS-промотор, состоящий из минимальной ТАТА-последовательности из промотора гена hsp70 и пяти сайтов связывания дрожжевого активатора GAL4, спейсер (2.5 т.п.н.) из гена LacZ, ген mini-white с удаленными промотором и Wari-инсулятором, а также ген yellow, расположенный в качестве селекционного маркера с 3'-конца гена mini-white. Тестируемый элемент встраивался между спейсером и кодирующей частью гена mini-white. Ранее в лаборатории был обнаружен 1RES в гене mini-white, который запускает трансляцию с внутренних сайтов мРНК (Silicheva et el. 2010). Поэтому по уровню пигментации глаз после индукции GAL4 можно судить о способности тестируемого элемента обрывать транскрипт, синтезируемый с UAS-промотора (Рис. 5).

Фрагмент SCS-инсулятора Hpal-Ndel, фланкированный 1ох-сайтами узнавания для рекомбиназы CRE, был встроен перед геном mini-white в двух противоположных направлениях. Во всех полученных трансгенных линиях пигментация глаз у мух соответствовала полному отсутствию экспресии mini-white независимо от ориентации исследуемого фрагмента (Рис. 5).

irUASiscsind)dVW I +GAL4 jfUAS iÀïdWY ^+GAL4

white

Kp ККр КTOpOpТЖ ЖСЖ Б NIT

5 5

2 3 5/5

1 4 1/5

2 3 5/5

СВм

rUAS(scs!>")dWY +GAL4 fUAS(A)dWY 4GAL4

ШШШУ* white

Kp ККр к TOp Op ТЖ Ж OK Б N/T

4 4

3 1 4/4

4 0/4

3 1 4/4

Рисунок 5. Тестирование центрального 392 пл. (Hpal-Ndel) фрагмента SCS (SCSm), встроенного в (а) прямой и в (б) обратной ориентации, на способность терминировать транскрипцию в глазах. UAS-промотор показан белым прямоугольником «UAS». «+GAL4» обозначает индукцию экспрессии white GAL4 активатором. Гены white и yellow показаны белым и черным прямоугольниками, соответственно. Черные горизонтальные стрелки указывают на направление транскрипции с промоторов UAS и yellow. Знак Д означает, что промотор white был предварительно удален из конструкции. SCS-инсулятор показан небольшим белым прямоугольником. Вертикальные черные стрелки, направленные вниз, являются сайтами узнавания для рекомбиназы CRE (lox). N показывает количество линий, где мухи приобретали новый фенотип после удаления (Д) соответствующих последовательностей ДНК, а Т обозначает общее количество линий, участвующих в эксперименте.

Так, в линиях, в которых SCS был встроен в прямой ориентации, экспрессия mini-white (Рис. 5а) была заметно ниже по сравнению с линиями, содержащими SCS в противоположной ориентации, где пигментация глаз приближалась к фенотипу дикого типа (красная окраска) (Рис. 56). Такой результат подтверждает наличие в составе SCS-инсулятора сигнала полиаденилирования, функционально активного в трансгенных линиях Drosophila.

1.5. Тестирование SCS-инсулятора на промоториую активность в глазных имагинальных дисках Drosophila melanogaster

Для изучения промоторной активности SCS в трансгенных линиях Drosophila melanogaster последовательность SCS разделили на два фрагмента, которые включали часть промотора CG31211 (516 п.н. SCSA) и часть промотора Cad87A (477п.н. SCSB) (Рис. 6). Оба фрагмента были встроены между 1ох-сайтами перед геном mini-white. Фланкированный frt-сайтами энхансер глаз и пять сайтов связывания для G А Ь4-активатора были расположены выше

фрагментов SCS-инсулятора. В предыдущих работах, энхансер глаз успешно выполнял функцию промотора, запуская транскрипцию mini-white в глазах.

а v^'-w.....3—«

m m Жх юл .

whtt&

Кр К Кр К Тор Ор ТЖ Ж СЖ Б N/T

¡г ( Ее }G4 (scsA)d WYR 11 11

+GAL4 11 0/11

r ÎA)G4(scsA}dWYR 11 0/11

WGA4 ' 11 0/11

£fEe)G4(A)dWYR 7 4 7/11

*»+GAL4 1 в 4 11/11

r(A}G4(A)dWYR I]

Wîai к 11 0/11

Кр KKp К I Op Op ТЖ Ж СЖ К N/T

- ( Ee)G4(scs8)d WYR 13 7 11

-+GAL4 16 4 11/11

(4}G4(scsB)dWYR 1 8 2 6/11

¡C+GAL4 1 8 2 0/11

MEe)G4(A)dWYR 14 6 11/11

-+GÀL4 2 4 5 11/11

11 5/11

« en

Рисунок 6. Тестирование промоторов генов (a) CG31211 и (б) Cad87A в глазах. SCSA соответствует фрагменту SCS (516 п.н.), включающему промотор гена CG31211. SCSB соответствует фрагменту SCS (477 п.н.), содержащему промотор гена Cad87A. Серая звезда является четырьмя сайтами связывания для САЬ4-акгиватора. «+GAL4» обозначает индукцию экспрессии white САЬ4-акгиватором. Гены white и yellow показаны белым и черным прямоугольниками, соответственно. Черная горизонтальная стрелка указывает на направление транскрипции с промотора yellow. Знак Д означает, что промотор white был предварительно удален из конструкции. SCS-инсулятор показан небольшим белым прямоугольником. Вертикальные черные стрелки, направленные вниз, являются сайтами узнавания для рекомбиназ FLP (frt) и CRE (lox). N показывает количество линий, где мухи приобретали новый фенотип после удаления (Д) соответствующих последовательностей ДНК, а Т обозначает общее количество линий, участвующих в эксперименте.

Полученные трансгенные линии, содержащие фрагмент SCSA, имели фенотип «белые глаза», подтверждая предыдущие результаты об отсутствии активации промотором CG31211 гена mini-white. Индукция энхансера глаз G Л L4 - а кт и в а' го р о м увеличила пигментацию глаз только после удаления SCSA из конструкции, что подтверждает роль обнаруженных сигналов полиаденилирования в прерывании транскрипции гена mini-white (Рис. 6а).

Далее, мы проанализировали трансгенные линии, содержащие фрагмент SCSB. Во всех полученных линиях исследуемые мухи имели пигментированные глаза, что подтверждает способность промотора Cad87A запускать транскрипцию гена mini-white (Рис. 66). Делеция энхансера глаз приводила к уменьшению степени пигментации глаз в большинстве анализируемых линий. Возможно, этот эффект можно объяснить слабой стимуляцией промотора Cad87A энхансером глаз. При этом ни СтАЬ4-активатор, ни энхансер глаз не способны эффективно стимулировать промотор Cad87A.

2. Дистальное взаимодействие промоторов соседних генов CG3777 и yellow

В последние годы появляется все больше данных, согласно которым промоторы генов, обладающих сходным профилем экспрессии, могут взаимодействовать. Однако функциональная роль таких взаимодействий остается неизвестной. В данной работе было изучено функциональное взаимодействие между промоторами ко-экспрессирующихся генов yellow и CG3777.

Ген yellow D. melanogaster определяет пигментацию личинок и имаго. Максимальный уровень экспрессии гена yellow детектируется на поздней эмбриональной, ранней личиночной и средней куколочной стадиях. Исследование супернестабильных мутаций в гене yellow позволило ранее продемонстрировать, что промотор соседнего гена CG3777 может стимулировать yellow в щетинках, когда находится от него на расстоянии 35 т.п.н. (Pomerantseva et el. 2006). Кроме этого, на модели в трансгенных линиях было показано, что промотор CG3777 способен функционировать в качестве инсулятора, блокируя активацию yellow энхансерами, стимулирующими экспрессию гена в теле и крыльях.

2.1. Промоторы генов CG3777 и yellow функционально взаимодействуют друг с другом

Для исследования способности промоторов генов yellow и CG3777 функционально взаимодействовать друг с другом на больших дистанциях использовалась неспособность САЬ4-активатора стимулировать транскрипцию с промотора yellow в том случае, если его сайты связывания находятся за 3'-концом гена (Erokhin et el. 2011). Опираясь на этот факт, промотор CG3777, фланкированный frl-сайтами для сайт-специфической рекомбиназы FLP, был встроен в двух противоположных ориентациях за десятью сайтами связывания для САЬ4-активатора (Рис. 7).

В результате трансформации конструкции, в которой промоторы генов yellow и CG3777 были сонаправленны друг другу, в эмбрионы Drosophila было получено 10 трансгенных линий (Рис. 7а). Во всех линиях мухи имели желтые тело и крылья, а также окрашенные щетинки, что связано с наличием в конструкции только одного энхансера, активирующего экспрессию гена yellow в щетинках (Geyer et el. 1987). Индукция СА1.4-активатором привела к значительному увеличению уровня пигментации крыльев (до 4-5 баллов) и тела

(до 3 баллов). При удалении промотора CG3777 ОАЬ4-активатор переставал стимулировать промотор yellow. Полученные данные демонстрируют способность GAL4-aicmBaTopa стимулировать промотор гена yellow только в присутствии промотора CG3777.

В случае расположения промотора CG3777 в обратном направлении относительно промотора yellow наблюдался противоположный эффект (Рис. 76): GAL4 не стимулировал промотор гена yellow ни в исходных, ни в производных трансгенных линиях, где промотор CG3777 был делетирован.

n-YG4(Pr) I*» +GAL4 ^ YG4(A)

о/ю

rVG4(Pr) I*-* +GAL4 YVG4(A) +GAL4

О/б

Рисунок 7. Тестирование характера взаимодействия между промоторами генов CG3777 и yellow. Промотор гена CG3777 обозначен белым квадратом «Рг». Черные стрелки указывают на направление промоторов генов yellow и CG3777. Черные маленькие прямоугольники на концах конструкций являются последовательностями Р-элемента. Вертикальные черные стрелки являются сайтами узнавания для рекомбиназы FLP (frt). Знак Д указывает на делению промотора CG3777. «+GAL4» означает индукцию ОАТ4-активатором. N показывает количество линий, где мухи приобретали новый фенотип после удаления (Д) промотора гена CG37777, а Т обозначает общее количество линий.

Согласно полученным данным промоторы генов CG3777 и yellow способны функционально взаимодействовать друг с другом и наблюдаемый эффект взаимодействия зависит от взаимной ориентации данных промоторов друг относительно друга.

2.2. Результат взаимодействия между промоторами генов CG3777 и yellow зависит от их взаимного расположения

В геноме Drosophila промоторы CG3777 и yellow сонаправленны и находятся на расстоянии порядка 80 т.п.н. друг от друга (Рис. 8). Для более точного воспроизведения нативной конфигурации промоторов этих генов в геноме, была создана конструкция (Рис. 9а), в которой промоторы CG3777 и yellow располагались сонаправленно относительно друг друга. При этом десять сайтов GAL4 были встроены выше промотора CG3777, под контроль которого размещали ген mini-white, а за ним был встроен полный ген yellow. Между 3 'концом гена mini-white и энхансерами тела и крыльев гена yellow, был встроен SV40-TepMHHaTop.

10 тпн

170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 i 1

I-1-1-1-|-1-1-1-1-1 Х-хромосома

-i-г~

75000 пн

173736

CG3777

261105

yellow

ЕьЕ

Еьг

Рисунок 8. Схема расположения генов CG3 777 и yellow в геноме D. melanogaster.

Этот шаг был осуществлен для обеспечения эффективной терминации транскрипции гена mini-white, чтобы исключить возможное влияние транскрпции на активность энхансеров. Как и в предыдущем эксперименте, промотор CG3777 был фланкирован frt-сайтами. Для выяснения позитивного/негативного влияния промотора CG3777 на экспрессию yellow был использован укороченный вариант энхансера, определяющий полноценную экспрессию гена yellow в крыльях и очень слабую - в теле. В результате было получено девять трансгенных линий, содержащих единичную копию конструкции.

Полученные трансгенные линии имели пигментацию глаз в диапазоне от светло-желтых до оранжевых, а стимуляция САЬ4-активатором приводила к усилению экспрессии гена mini-white в глазах. Делеция промотора CG3777 приводила к фенотипу «белые глаза», подтверждая способность промотора CG3777 запускать транскрипцию гена mini-white в глазах. Большая часть трансгенных линий имела слабый уровень пигментации в теле и нормальный уровень пигментации в крыльях, экспрессия в которых находилась под контролем полноценного энхансера (данные не приведены). Введение GAL4-активатора никак не повлияло на пигментацию тела и крыльев (Рис. 9а).

Возможно, отсутствие эффекта функционального взаимодействия между промоторами генов yellow и CG3777 объясняется эффективным взаимодействием промотора гена yellow с энхансерами, в результате взаимодействие между промоторами оказывается заблокированным. Для проверки этой гипотезы энхансеры тела и крыльев были удалены из конструкции (Рис. 96). В результате промоторы CG3777 и yellow оказались разделены только кодирующей частью гена mini-white длиной в 6 т.п.н.

white

Кр ККр К ТОр Ор тж Ж СЖ Б К/т

G4{Pr)WEyV +GA14 3 4 2 G4(A)WEyY +GAL4

2 2 3 2 9 9/9 9 9/9 1 8 9/9

ye How

5 4 3 2 1 Я/Т

117 9

117 0/9

з 2 1 m

4 6 10

4 6 0/10

fir fn

Кр ККр К ТОр Op ТЖ Ж СЖ В N/T

4 2 3

10 10/10 7 10/10 7 10/10

yellow I-»

fit

Кр K'K'p К ТОр Op ТЖ Ж СЖ Е N/T

f(Pr)WG4Y +GAL4 (A)WG4Y V +GAL4

3 2

1 3 2

6 6/6 6/6 6/6

5 4

«321 NT

6 6

5 1 5/6

6 0/6

S 1 6/6

Рисунок 9. Исследование характера взаимодействия между промоторами генов CG3777 и yellow. Ориентационно-зависимое функциональное взаимодействие промоторов генов CG3777 и yellow, а - конструкция G4(Pr)WEyY; б - конструкция G4(Pr)WY; в - конструкция (Pr)WG4Y. Остальные обозначения такие же, как и в предыдущих рисунках.

В семи из десяти отобранных трансгенных линий пигментация глаз варьировала от желтого до оранжевого цвета, и после удаления промотора CG3777 глаза становились белыми. В этих трансгенных линиях экспрессия mini-white находилась под контролем промотора CG3777. Остальные три линии имели коричневые и красно-коричневые глаза, и делеция промотора CG3777 только частично снижала их пигментацию (Рис. 96). Вероятно, в этих линиях экспрессия mini-white находилась не только под контролем промотора CG3777, но и выше расположенного промотора, рядом с которым произошла инсерция конструкции.

В отличие от промотора гена white, который полностью инактивируется проходящей через него транскрипцией (Silicheva et el. 2010), промотор CG3777

оказался менее чувствительным. Введение САЬ4-активатора значительно усиливало пигментацию глаз, что связано со стимуляцией рядом расположенного промотора CG3777. Однако GAL4 не стимулировал промотор гена yellow (рис. 96). При сонаправленном расположении промоторов CG3777 и yellow на расстоянии 6.5 т.п.н. друг от друга, ОАЬ4-активатор стимулирует только рядом расположенный промотор CG3777.

Таким образом, при расположении сайтов связывания для GAL4-активатора рядом с промотором гена CG3777, промотор гена yellow не может быть активирован на дистанции в случае сонаправленных промоторов. Для дальнейшего исследования значения взаимной ориентации промоторов при их функциональном взаимодействии, сайты связывания для САЬ4-активатора были встроены за геном mini-white в непосредственной близости от промотора гена yellow (Рис. 9в). В этой конструкции GAL4-cafiTbi связывания находились на расстоянии 5 т.п.н. от промотора CG3777 и на расстоянии 700 п.н. от промотора yellow.

В результате трансформации было получено шесть трансгенных линий. У всех шести линий пигментация глаз была представлена в диапазоне от желтых до оранжевых. Делеция промотора CG3777 полностью инактивировала ген mini-white. Неожиданно индукция ОАЬ4-активатором приводила к сильной стимуляции экспрессии гена mini-white и слабой - гена yellow. В производных трансгенных линиях, в которых промотор CG3777 был удален, GAL4 начинал гораздо сильнее стимулировать экспрессию гена yellow (Рис. 9в). Таким образом, промотор CG3777 негативно влиял на способность GAL4 стимулировать промотор гена yellow. В данной кофигурации в используемой модельной системе промотор CG3777 способен супрессировать активность промотора гена yellow.

III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

3.1. Новые свойства SCS- и SCS'-инсуляторов

Эксперименты, проведенные на трансгенных линиях, в очередной раз доказали, что SCS является одним из сильнейших инсуляторов Drosophila, в то время как SCS' проявляет крайне слабую инсуляторную активность. Согласно существующим представлениям, инсуляторы SCS и SCS' находятся на границах домена, состоящего их двух генов теплового шока 70. Считается, что взаимодействие между инсуляторами обеспечивает независимость этого домена от влияния окружающего хроматина и расположенных рядом с ним регуляторных элементов. Однако экспериментальных данных подтверждающих эту модель, не существовало. В настоящем исследовании был впервые продемонстрирован эффект усиления инсуляторной активности инсулятора SCS' при наличии инсулятора SCS на расстоянии 9 т.п.н. Таким образом, в результате взаимодействия между SCS- и SCS'-инсуляторами действительно возможно формирование инсуляторного домена, в котором SCS-инсулятор способен усиливать активность SCS'-инсулятора.

Ранее было показано, что SCS-инсулятор содержит один сайт связывания для белка Zw5, мультиплицированный сайт связывания которого

функционирует как средний по силе инсулятор (Kyrchanova et el. 2008). В данной работе нами показано, что четыре или восемь сайтов связывания белка Zw5 могут частично блокировать энхансеры генов yellow и white. Инсуляторная активность сайтов связывания Zw5 значительно усиливается в присутствии SCS-инсулятора, что можно объяснить формированием хроматиновой петли между Zw5, связанным с SCS-инсулятором, и Zw5 на своих сайтах узнавания. Блокирование активности энхансера в результате пространственного сближения инсуляторов SCS и SCS' или Zw5-cai(TOB можно объяснить образованием петли хроматина между этими последовательностями в конфигурации, препятствующей энхансер-промоторным взаимодействиям. Кроме того, взаимодействие между двумя инсуляторами может способствовать кооперативному привлечению инсуляторных белков к сайтам их связывания, усиливая тем самым энхансер-блокирующую активность.

Наличие на концах последовательностей инсуляторов SCS и SCS' промоторов, активно работающих в 82-клетках, не противоречит известной модели, согласно которой промоторы, как и инсуляторы, в определенном контексте могут эффективно блокировать активность энхансеров. Однако нами было показано, что исследуемые промоторы крайне слабо функционируют в глазном имагинальном диске. В то же время именно с использованием репортерного гена white была продемонстр1грована инсуляторная актвиносгь SCS- и SCS'-инсуляторов (Shedl et el., 1992). Таким образом, промоторы не являются ключевыми элементами в реализации активности SCS- и SCS'-инсуляторов.

Как было показано ранее, транскрипция, индуцируемая с промотора Сас1Н7Л из последовательности инсулятора SCS, встроенного в регуляторный участок б/7/югах-комплекса, может оказывать влияние на активность энхансеров, стимулирующих транскрипцию генов Abd-A и Abd-B (Hogga et el. 2002). В наших экспериментах промотор Cad87A запускал экспрессию mini-white в глазах на слабом уровне, и ни энхансер глаз, ни ОАЬ4-активатор не усиливали такую транскрипцию. Можно предположить, что промотор Cad87A имеет организацию, отличную от обычных зависимых от РНК-полимеразы II промоторов, которые эффективно стимулируются ОАЬ4-активатором.

Согласно данным FlyBase, ген CG31211, маркирующий второй конец SCS-инсулятора, должен активно транскрибироваться в глазах. Однако полученные на трансгенах результаты не подтвердили способность промотора CG31211 запускать транскрипцию mini-white в глазах. Вероятно, в последовательности SCS отсутствуют некоторые регуляторные элементы, необходимые для активности этого промотора в данном паттерне.

Известно, что практически весь геном транскрибируется и огромный процент синтезированных транскриптов можно отнести к классу длинных некодирующмщ РНК (Birney et el. 2007, Kapranov et el. 2007). Недавние публикации на эту тему выдвигают предположение, согласно которому большая

часть таких некодирующих РНК играет важную роль в регуляции транскрипции (Wang et el.2011). Следовательно, функциональное разделение двух близко расположенных доменов подразумевает наличие на границе этих доменов сильного терминирующего сигнала, обеспечивающего эффективную терминацию транскрипции. В данной работе в последовательности SCS-инсулятора были обнаружены активно функционирующие сигналы полиаденилирования. Следует отметить, что SFl-инсулятор, обнаруженный в регуляторной области Antennapedia {Ant) комплекса Drosophila (Beloserov et el. 2003), также содержит функциональный сигнал полиаденилирования. Таким образом, можно предположить, что элементы, способствующие обрыву транскриптов, часто располагаются внутри последовательности инсуляторов, и, возможно, играют важную роль в их активности.

3.2. Функциональные взаимодействия промоторов yellow и CG3777

В настоящей работе было использовано свойство ОАЬ4-актпватора стимулировать промотор гена yellow только в том случае, если сайты связывания для ОАЬ4-активатора находятся не далее 1 т.п.н. от промотора гена. Например, GAL4 не способен стимулировать ген yellow, если сайты для его связывания находятся с 3'-стороны гена (Erokhin et el. 2011). В результате, если два элемента, окружающие ген, способны функционально взаимодействовать друг с другом, то происходит сближение САЬ4-активатора с транскрипционным комплексом, собранным на промоторе на расстоянии 5 т.п.н. от GAL4-canroB, и, как следствие, стимуляция транскрипции. Таким образом, полученные с использованием данной модельной системы результаты предполагают наличие взаимодействия между промоторами генов yellow и CG3777.

При этом изменение расположения промоторов друг относительно друга приводит к исчезновению эффекта функционального взаимодействия в используемой нами модельной системе. Таким образом, можно сделать вывод, что промоторы генов CG3777 и yellow способны функционально взаимодействовать друг с другом на больших расстояниях, и данный эффект носит ориентационно-зависимый характер.

В геноме D. melanogaster гены CG3777 и yellow соседствуют друг с другом и имеют сходный профиль экспрессии. Нами была создана модельная система, приближенная к геномному относительному расположению промоторов этих генов у D. melanogaster. Однако в данном случае нам не удалось детектировать эффект функционального взаимодействия. Возможно, промотор CG3777 в определенном контексте способен функционировать в качестве инсулятора, блокируя активацию yellow энхансерами. Стоит отметить, что инсуляторная активность была недавно продемонстрирована для ряда промоторов D. melanogaster. Инсуляторными свойствами, например, обладают промоторы генов Abd-B, Ubx, Antp (Chopra et el.2009). Кроме того, в ряде работ было показано, что ряд инсуляторных белков дрозофилы, CP 190, dCTCF, Mod(mdg4) и BEAF32, часто ассоциируются с областями промоторов

различных генов (Smith et el. 2009, Bartkuhn et el. 2009, Jiang et el. 2009, Bushey et el. 2009, Nngre et el. 2010).

Поэтому вероятным объяснением полученных результатов является предположение, согласно которому промоторы генов CG3777 и yellow в используемых нами трансгенных системах всегда функционально взаимодействуют друг с другом, однако в одних случаях эффект данного взаимодействия выражается в стимуляции транскрипции гена yellow, а в других — в блокировании энхансеров. Перемещение сайтов связывания GAL4-активатора в нашей модельной системе за 3'-конец гена mini-white привело к неожиданным результатам: при введении G АЬ4-ак'шкатора происходила сильная активация транскрипции гена mini-white, управляемого промотором CG3777, в то время как yellow транскрибировался крайне слабо. Удаление же промотора CG3777 приводило к значительному усилению уровня экспрессии гена yellow. Вероятным объяснением данных результатов является модель, по которой в результате взаимодействия между изучаемыми промоторами формируется петля определенной конфигурации, в которой G А Ь4-активатор оказывается приближен к промотору CG3777, что приводит к его активации. Одновременно происходит частичная инактивация промотора гена yellow. Возможно, последовательность промотора CG3777 является более предпочтительной для взаимодействия с САЬ4-активатором по сравнению с последовательностью промотора yellow, однако экспериментальных данных, подтверждающих эту гипотезу, пока нет.

Таким образом, полученные данные демонстрируют, что взаимное расположение взаимодействующих промоторов друг относительно друга играет важную роль в процессе проявления результирующего эффекта. Выяснение молекулярного механизма данного явления межпромоторных взаимодействий требует проведения дополнительных исследований.

IV. ВЫВОДЫ

1. Продемонстрировано, что SCS-инсулятор усиливает способность SCS'-инсулятора блокировать энхансеры в трансгенных линиях дрозофилы. Таким образом, впервые показано наличие функционального взаимодействия между SCS- и SCS'-инсуляторами.

2. Показано, что инсуляторы SCS и SCS' на концах своих последовательностей содержат функциональные промоторы, активно работающие в эмбриональных 82-клетках, но не в глазных имагинальных дисках трансгенных линий дрозофилы. Таким образом, активные промоторы не играют ключевой роли в реализации активности SCS- и SCS'-инсуляторов.

3. Впервые найдены функциональные сигналы полиаденилирования в последовательности SCS-инсулятора.

4. Продемонстрировано наличие функционального взаимодействия между промоторами ко-экспрессирующихся генов yellow и CG3777 в трансгенных линиях дрозофилы. Впервые показано, что результат функционального

взаимодействия (активация или репрессия транскрипции) зависит от взаимной ориентации взаимодействующих промоторов.

V. СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах:

1. Д.В. Леман. А.Ф. Паршиков, П.Г. Георгиев, О.Г. Максименко. Функциональное взаимодействие между промоторами соседних генов yellow и CG3777 у Drosophila melanogaster. Генетика. 2012, т. 48, № 12, с. 1357-1363.

2. Kyrchanova О., Leman Р.. Parshikov A., Fedotova A., Studitsky V., Maksimenko О., Geogiev P. New Properties of Drosophila ses and ses' Insulators. PloS ONE. 2013. 8(4): e62690.

Тезисы конференций:

1. Д.В. Леман, А.Ф. Паршиков, П.Г. Георгиев, О.Г. Максименко. Функциональное взаимодействие между промоторами соседних генов yellow и CG3777 у Drosophila melanogaster. XIX международная конференция «ЛОМОНОСОВ-2012». Москва, 9-13 апреля, 2012.

Подписано в печать 25.04.2014. Формат 60 х 84 '/16. Объем 1,5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 5.

Отпечатано в типографии ОАО ЦНИИС.

129329, Москва, Кольская 1 Тел.: 8-499-180-94-65

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Леман, Дмитрий Всеволодович, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА РОССИЙСКОЙ

АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи УДК 575.22:577.218

0420145ТБТ1

JIemah Дмитрий Всеволодович

Особенности функциональных взаимодействий SCS- и SCS'- инсуляторов, а также промоторов соседних коэкспрессирующихся генов дрозофилы

Специальность 03.01.07 - молекулярная генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Академик, д.б.н., профессор Георгиев П.Г.

Москва 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.................................................4

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................6

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................11

ГЛАВА I. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА.......................................11

1.1 Основные принципы организации хроматина в ядре клетки.............................11

1.2 Доменная организация хроматина.............................................................12

1.3 Топологические ассоциированные домены (ТАД)........................................14

1.4 Механизмы образования хроматиновых доменов.........................................15

ГЛАВА II. ЦИС-РЕГУЛЯТОРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ. ОБЩИЕ СВОЙСТВА ИНСУЛЯТОРОВ И ПРОМОТОРОВ..............................................................16

2.1 Цис-действующие регуляторные элементы....................................................16

2.2 Барьерные инсуляторы и промоторы...........................................................21

2.3 Энхансер-блокирующие инсуляторы и промоторы........................................23

2.4 Белки инсуляторов Drosophila melanogaster................................................25

2.5 Энхансер-блокирующие инсуляторы и хроматиновые петли............................26

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................................................29

2.1 Генетические методы................................................................................29

2.1.1 Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе...........................29

2.1.2 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных

линий....................................................................................................29

2.1.4 Генетические скрещивания..................................................................31

2.2 Биохимические методы.........................................................................33

2.2.1 Работа с бактериальным штаммом E.coli DH5a.........................................33

2.2.2 Работа с ДНК....................................................................................34

2.3 Создание трансгенных конструкций.........................................................37

3 РЕЗУЛЬТАТЫ......................................................................................42

Часть I: Исследование SCS- и SCS'-инсуляторов...............................................42

3.1 Исследование функционального взаимодействия между SCS- и SCS'-инсуляторами..........................................................................................42

3.2 Тестирование SCS- и SCS'-инсуляторов на промоторную активность в эмбриональных 82-клетках.........................................................................45

3.3 Обнаружение функционаьного сигнала полиаденилирования в последовательности SCS-инсулятора.............................................................................47

3.4 Тестирование SCS-инсулятора на терминирующую активность в глазных имагинальных дисках Drosophila melanogaster.................................................48

3.5 Тестирование SCS-инсулятора на промоторную активность в глазных

имагинальных дисках Drosophila melanogaster................................................50

Часть И: Дистальное взаимодействие промоторов CG3777 и yellow.....................52

3.6 Промоторы генов CG3777 и yellow функционально взаимодействуют друг с другом..................................................................................................52

3.7 Результат взаимодействия между промоторами генов CG3777 и yellow

зависит от их взаимного расположения.........................................................54

4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................58

4.1 Новые свойства SCS- и SCS'-инсуляторов.................................................58

4.2 Функциональные взаимодействия промоторов yellow и CG3777..........................60

ВЫВОДЫ..............................................................................................62

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................63

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

DRE - DNA replication-related element- последовательность 5'-TATCGATA-3' в составе некоторых промоторов генов

BRE - TFIIB recognition element - элемент, узнаваемый транскрипционным фактором TFIIB

МТЕ - motif ten element - мотив длиной 10 п.н. Inr - initiator element - инициаторный элемент.

DPE - downstream promoter element - элемент, находящийся после старта транскрипции.

ТАТА-бокс - коровая последовательность большинства промоторов

ANT-C - antennapedia комплекс

ftz - ген fus hi tarazu

Scr - ген Sex combs reduced

mod(mdg4) - ген modifier of mdg4

Abd-B - ген Abdominal-B

hsp70 - ген heat shock protein 70

Hox - гомеозисный ген

Ey - энхансеры тела и крыльев гена yellow

Ее - энхансер глаз гена white

TFIIC - transcription factor IIC - транскрипционный фактор TFIIC TFIIB - transcription factor IIB - транскрипционный фактор TFIIB TADs - topologically associating domains PRE - polycomb responsible element Pc - белки семейства Polycomb

CTCF - белковый фактор связывающийся с последовательностью СССТС Mod(mdg4) - белок, кодируемый геном mod(mdg4) GAF (GAGA assotiated factor) - транскрипционный фактор GAGA СР190 - белок centrosomal protein 190

Su(Hw) - белок suppressor of Hairy-wing, кодируется геном su(hw) BEAF - белок boundary-element-associated factor

USF1 - белок upstream transcription factor 1

VEZF1 - белок vascular endothelial zinc finger 1

IGF2 - белок insulin-like growth factor 2

HP1 - белок heterochromatin protein 1

NELF - белок negative elongation factor

ApoA (1,4) - белок аполипротеин A (1,4)

CDH8 - белок Cadherin-8, кодируемый геном CDH8

Zw5 - белок zeste-white 5

frt - f lipase recombination target - последовательности, являющиеся сайтами для сайт-

специфической рекомбиназы FLP

FLP - flipase - сайт-специфическая рекомбиназа Flp

lox - locus of crossing over (x) - последовательности, являющиеся сайтами для сайт-специфической рекомбиназы Сге

CRE - causes recombination — сайт-специфическая рекомбиназа Сге LCR - locus control region ICR - imprinting control region Fab7 - frontabdominal-7

SF1 - инсулятор, обнаруженный между генами Scr-ftz

Su(Hw) инсулятор - инсулятор Suppressor of Hairy-wing (второе название gypsy) SCS - specialized chromatin structure, специализированные структуры хроматина SINE - short interspersed repeated sequences Wari - w/n'te-abutting resident insulator IRES - internal ribosome entry site

DamID - DNA adenine methyltransferase identification protocol SV40 - simian vacuolating virus 40

HS - hypersensitive - сайт гиперчувствительности к ДНКазе I

UAS - upstream activating sequence

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

п.н. - пар нуклеотидов

т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

м.п.н. - миллион пар нуклеотид

Введение

Актуальность проблемы

Геном эукариот является сложноорганизованной системой, координированная работа которой необходима для осуществления всех этапов передачи и реализации генетической информации. Последовательная активация и инактивация генов происходит, в том числе и благодаря четкой и скоординированной во времени и пространстве регуляции всех этапов транскрипции. В этом процессе необходимо особо отметить важность цис-регуляторных элементов генома, под строгим контролем которых происходит правильная и своевременная активация/репрессия генов высших эукариот. За счет взаимодействия специфичных транскрипционных белковых факторов, на которых собираются особые регуляторные белковые комплексы, с промоторами генов и дистально-расположенными элементами (энхансерами и сайленсерами) происходит включение или выключение промоторов генов.

Помимо энхансеров в геноме существует другой класс регуляторных элементов - сайленсеры. Сайленсерные элементы репрессируют транскрипцию генов, и, подобно энхансерам действуют вне зависимости от их положения относительно направления транскрипции гена и не обладают специфичностью действия.

Влияние на транскрипционный статус гена оказывают упаковка ДНК в хроматин, а также формирование внутри ядра определенных хромосомных территорий, содержащих регуляторные белковые комплексы. Одним из уровней осуществления координированной регуляции транскрипции является организация генов в независимые кластеры (домены) с одинаковыми профилями экспрессии. Формирование независимых функциональных доменов подразумевает наличие дополнительных регуляторных элементов, защищающих от позитивного или негативного влияния окружающего хроматина и участвующих в координации энхансер-промоторпых взаимодействий. Принято считать, что эту функцию выполняют инсуляторы.

Инсуляторы - это цис-регуляторные элементы, которые блокируют промотор гена от действия энхансера, если располагаются между ними, а также ограничивают распространение репрессионных сигналов, индуцированных действием сайленсеров или гетерохроматином. При этом инсуляторы не влияют непосредственно на активность энхансера, сайленсера и промотора: энхансер (сайленсер) сохраняет способность влиять на незаблокированный промотор, а промотор может быть активирован (репрессирован) другим энхансером (сайленсером).

Цель и задачи исследования

В работе были поставлены следующие задачи:

2. Проверить SCS- и SCS'-инсуляторы на промоторную активность в трансгенных линиях дрозофилы и 82-клетках.

3. Выяснить, входят ли в состав SCS-инсулятора активные сигналы полиаденилирования.

Научная новизна

В работе были исследованы фрагменты SCS- и SCS'-инсуляторов, и было показано, что взаимодействие между SCS и SCS' усиливает энхансер-блокирующую активность SCS'-инсулятора. В результате взаимодействия между SCS- и SCS'-инсуляторами формиуется инсуляторный домен, в котором SCS-инсулятор способен усиливать активность SCS'-инсулятора. Установлено, что на концах SCS- и SCS'-инсуляторов находятся промоторы, которые активны в эмбриональных 82-клетках. Несмотря на то, что энхансер-блокирующая активность SCS-инсулятора была продемонстрирована в трансгенных линиях D.melanogaster, промоторы генов CG31211 и Cad87A, которые его фланкируют, практически не работают в глазах. Таким образом, активность промоторов не определяет функциональность инсуляторов. Впервые было показано в последовательности SCS-инсулятора наличие активных сигналов полиаденилирования, работающих как в 82-клетках, так и в глазных имагинальных дисках. Выявлено функциональное взаимодействие промоторов соседних генов yellow и CG3777, а также показано, что взаимодействие носит ориентационно-зависимый характер.

Теоритеческая и практическая значимость

Результаты данной работы расширяют представление о регуляторных элементах с энхансер-блокирующими и промоторными свойствами и позволяют по-новому оценить функциональное значение инсуляторов и промоторов в геноме. Обнаруженные в последовательности SCS инсулятора активно функционирующие сигналы полиаденилирования позволяют предположить, что элементы, способствующие обрыву транскриптов, часто располагаются внутри

последовательности инсуляторов, и, возможно, играют важную роль не только в их активности, но и в организации доменной структуры хроматина.

Личный вклад соискателя

Диссертационная работа основана на собственных данных, полученных в период 2010-2013 гг. Автором были созданы трансгенные конструкты и было продемонстрировано наличие функционального взаимодействия между промоторами ко-экспрессирующихся генов yellow и CG3777 в трансгенных линиях D. melanogaster. Автором были обнаружены функциональные сигналы полиаденилирования в последовательности SCS-инсулятора, также было показано, что инсуляторы SCS и SCS' содержат на концах своих последовательностей функциональные промоторы, активно работающие в эмбриональных 82-клетках, но не в глазных имагинальных дисках. Автором был произведен генетический анализ трансгенных линий D. melanogaster и было показано, что SCS-инсулятор усиливает энхансер-блокирующую активность SCS'-инсулятора.

Методология и методы исследования

Работа выполнена на высоком научном уровне с использованием современного оборудования и методов молекулярной генетики, молекулярной биологии и биохимии. За время выполнения диссертационной работы был освоен и использован широкий спектр методов, включающих методики молекулярного клонирования, ведения эукариотических культур клеток, работы с ДНК, CHIP методики и др.

Основные положения, выносимые на защиту

1. SCS-инсулятор усиливает способность SCS'-инсулятора блокировать энхансеры в трансгенных линиях дрозофилы.

2. Центральная часть последовательности SCS-инсулятора содержит активные сигналы полиаденилирования, которые соответствуют функциональным терминаторам транскрипции.

3. Инсуляторы SCS и SCS' на концах своих последовательностей содержат функциональные промоторы, активно работающие в эмбриональных 82-клетках, но не в глазных имагинальных дисках трансгенных линий дрозофилы.

4. Промоторы ко-экспрессирующихся генов дрозофилы CG3777 и yellow функционально взаимодействуют друг с другом на больших расстояниях. В зависимости от ориентации исследуемых регуляторных элементов происходит либо активация, либо репрессия транскрипции.

Степень достоверности и апробация результатов

Цели, поставленные в работе достигнуты, достоверность полученных результатов не вызывает сомнений, результаты исследований были опубликованы в рецензируемых научных журналах (Генетика, PlosOne) и доложены на международной конференции (XIX международная конференция « ЛОМОНОС ОВ-2012»).

Публикации в научных журналах:

1. Д.В. Леман, А.Ф. Паршиков, П.Г. Георгиев, О.Г. Максименко. Функциональное взаимодействие между промоторами соседних генов yellow и CG3777 у Drosophila melanogaster. Генетика. 2012, т. 48, № 12, с. 1357-1363.

2. Kyrchanova О., Leman Р., Parshikov A., Fedotova A., Studitsky V., Maksimenko О., Geogiev P. New Properties of Drosophila ses and ses' Insulators. PloS ONE. 2013. 8(4): e62690.

Материалы конференций:

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА

1.1. Основные принципы организации хроматина в ядре клетки

Расположение хромосом в ядерном пространстве не случайно; эксперименты наглядно продемонстрировали, что в клетках высших эукариот генетический материал индивидуальных хромосом занимает определенные ограниченные в пространстве территории (Lanctot et el., 2007; Misteli, 2007; Rajapakse and Groudine, 2011). У низших эукариот (например, у дрожжей) хромосомные территории не имеют строгих пространственных координат в ядре, хромосомы самоорганизуются за счет теломер, взаимодействующих с ядерным матриксом, сближения центромер друг с другом и кластеризацией рибосомальных генов в нуклеолусе (Wong et el., 2012; Tjong et el., 2012; Zimmer and Fabre, 2011). В геноме мух и млекопитающих хромосомные территории локализованы на периферии ядра, где они находятся в тесном контакте с ядерной ламиной и белковыми компонентами ядерной оболочки (Guelen et el., 2008; Kind and van Steensel, 2010). Считается, что многие активно транскрибируемые ко-регулируемые гены часто собираются в так называемых «транскрипционных фабриках», в то время как неактивные участки генома локализуются в особых ядерных тельцах (Eskiw et el., 2010; Bantignies et el., 2011; Cheutin and Cavalli, 2012) (Рис. 1).

Поскольку каждая хромосома имеет свою собственную территорию, то возникает следующий вопрос, каким именно образом происходит организация этих хромосомных территорий, и, следовательно, расположенных в ней генов, в трехмерном ядерном пространстве: случайно или же имеется определенная закономерность в выборе координат (Misteli, 2007). Расположение хромосом и отдельных генных локусов сильно отличаются друг от друга в зависимости от типа клеток, более того они подвержены существенным перестановкам в процессе эмбрионального развития, старения, а также при появлении различных патологий (Sanyaletel., 2012). '

1.2. Доменная организация хроматина

Структурная и функциональная организация хроматина не ограничивается хромосомными территориями. Обнаружение различных белков, связывающихся непосредственно с хроматином, а также детальное картирование модификаций гистонов и метилированны�

Информация о работе

Леман, Дмитрий Всеволодович
кандидата биологических наук
Москва, 2014
ВАК 03.01.07

Диссертация

Особенности функциональных взаимодействий SCS- и SCS'-инсуляторов, а также промоторов соседних коэкспрессирующихся генов дрозофилы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Особенности функциональных взаимодействий SCS- и SCS'-инсуляторов, а также промоторов соседних коэкспрессирующихся генов дрозофилы - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы