Молекулярный анализ области LCR в локусе cut Drosophila melanogaster

Сосин, Дмитрий Витальевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярный анализ области LCR в локусе cut Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный анализ области LCR в локусе cut Drosophila melanogaster"

003165321

На правах рукописи

СОСИН ДМИТРИЙ ВИТАЛЬЕВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ ОБЛАСТИ LCR В ЛОКУСЕ cut Drosophila melanogaster

Специальность 03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 з MAP 2008

Москва 2008

Работа выполнена в Лаборатории организации генома Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН (Москва)

Научный руководитель

Доктор биологических наук, профессор Н А Чуриков

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук А В Белявский

Кандидат биологических наук Ю Я Шевелев

Ведущая организация

Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им Н К Кольцова РАН

Защита состоится «2.?»марта 2008 года в 41 час на заседании Диссертационного совета Д 002.235 01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им ВА Энгельгардта РАН по адресу 119991, г Москва, ул Вавилова, д 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан «Мхузе. .2008 ]

Ученый секретарь Диссертационного совета, Кандидат химических наук

Крицын

1. Актуальность проблемы

Элементы генома, оказывающие дистантное влияние на транскрипционную активность изучаются более 10 лет, однако их механизм действия остается во многом не выясненным В настоящее время, известно, по крайней мере, четыре типа последовательностей участвующих в дистантной регуляции активности генов энхансеры, сайленсеры, инсуляторы и промотор-нацеливающие последовательности Ткань-специфические энхансеры, сила воздействия которых на транскрипцию гена-мишени зависит от числа их копий, выделяют в особый класс элементов дистантной регуляции, называемых локус-контролирующими районами (LCR) Согласно наиболее распространенной и экспериментально обоснованной точке зрения, воздействие элементов дистантной регуляции на ген-мишень осуществляется через образование петлевых структур, сближающих тот или иной регуляторный элемент с промоторной областью гена-мишени Тем не менее, имеющиеся данные не позволяют сделать однозначных выводов относительно функциональной принадлежности известных элементов дистантной регуляции в живой клетке

Обнаружение и исследование дистантных регуляторных элементов генома в значительной степени осложнено из-за удаленности этих участков ДНК от своих генов-мишеней [Bondarenko et al, 2003] В настоящее время для молекулярного анализа таких последовательностей используются многоступенчатые биохимические и молекулярно-биологические методы, что затрудняет интерпретацию получаемых данных Как следствие, появилось множество противоречивой информации относительно механизмов работы инсуляторов [Celniker and Drewell, 2007], сайленсеров [Fitzgerald and Bender, 2001, McCall et al, 1996, Boivm and Dura, 1998] и других регуляторных элементов генома По этой причине, создание эффективных модельных систем, адекватно отражающих реальные транскрипционные механизмы в живой клетке, является важной частью подобных исследований

Обнаруженные на сегодня элементы дистантной регуляции транскрипционной активности обладают ярко выраженными самостоятельными функциями Тем не менее, есть целый ряд указаний на возможности координированной работы таких элементов Результатом этой совместной работы могут быть совершенно новые, ранее не наблюдавшиеся регуляторные эффекты [Lin et al, 2004] Исследование принципов совместной работы различных регуляторных элементов ДНК важно как с точки зрения понимания фундаментальных принципов, лежащих в основе функционирования генома, так и с медицинской и биотехнологической точек зрения

Селекторный локус дрозофилы cut является удобным модельным объектом для исследования дистантных взаимодействий Длина данного локуса составляет более 200 т п н из которых около 120 т п н приходится на регуляторную часть [Johnson et al, 1979, Чуриков и др 1986] Продукт локуса содержит гомеодомен и сочетает в себе функции репрессора и активатора транскрипции ряда генов [Nepveu, 2001] Участие этого белка в регуляции активности таких генов как dPCNA [Seto et al, 2006] и его аналога у млекопитающих делает понятным, почему выключение локуса приводит к появлению деталей [Tchunkov et al, 1989]

Известно, что большую часть генома эукариотических организмов составляют некодирующие последовательности, функциональное значение которых удается выяснить лишь в некоторых случаях [Polyakov et al, 2006] По этой причине поиск регуляторных последовательностей, расположенных в некодирующих областях представляет собой сложную и трудоемкую задачу

Большое количество мутаций в регуляторной части локуса cut, описанных в литературе имеют самые разнообразные фенотипические проявления [Чуриков и др, 1998] Таким образом, эта богатая информация может быть использована для поиска важных, с точки зрения регуляции транскрипции, участков генома Особый интерес представляют мутации связанные с инсерциями в регуляторную часть локуса различных мобильных генетических элементов (МГЭ) Известно, что в составе МГЭ обнаружены почти все известные типы элементов дистантной регуляции транскрипции [Ратнер, 2000] С этой точки зрения МГЭ представляют собой удобный природный инструмент поиска и анализа генетически важных областей ДНК Инсерция мобильного элемента gypsy, содержащего инсулятор, перед недавно описанной областью LCR, удаленной от промотора на 80 т п н приводит к появлению жизнеспособных мутантов [Чуриков и др, 1998] В то же время встраивание мобильного элемента burdock между доменом, содержащим LCR и промотором, приводит к выключению транскрипционной активности всего локуса до физиологически незначимого уровня и гибели эмбрионов на ранних стадиях развития [Tchunkov et al, 1989] Этот факт является крайне интересным, т к показывает, что генетически сложный локус, работа которого обнаруживается на всех стадиях жизненного цикла, может зависеть от короткой последовательности удаленной от промотора на очень большое расстояние Недавно, в составе LCR была обнаружена область, способная связываться с ядерными белками [Чуриков и др , 1998] Принадлежность этого фрагмента ДНК, названного SaulO, к тому или иному типу регуляторных последовательностей ранее

не исследовалась Тем не менее эта задача представляется крайне важной, т к позволит выяснить природу этого жизненноважного района локуса

2. Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось выявление возможных механизмов действия жизненно важной области LCR локуса cut дрозофилы Были поставлены следующие задачи 1 Используя генетические конструкции на базе плазмидных векторов, разработать надежную тест-систему, позволяющую количественно оценивать влияние элементов дистантной регуляции дрозофилы на транскрипцию репортерного гена 2 Провести количественную оценку связывания ядерных белков imago дрозофилы с Saul 0 областью локуса cut 3 С помощью разработанной тест-системы выяснить функциональные свойства области SaulO, входящей в состав LCR локуса cut исследовать влияние SaulO на экспрессию репортерного гена в присутствии энхансера из мобильного элемента copia, а также исследовать влияние инсулятора gypsy на эффекты, вызываемые Sau 10

3. Научная новизна результатов исследования.

На базе плазмидного вектора pGL3-Enchancer (Promega, АСШ4797) создана простая и эффективная система для функционального анализа дистантных элементов генома в культуральных клетках дрозофилы В данной системе испытана изучаемая область LCR локуса в присутствии энхансера мобильного элемента copia и инсулятора gypsy Впервые проведен количественный анализ связывания SaulO области LCR локуса cut с ядерными белками Согласно полученным данным до 95% меченой ДНК SaulO, вошедшей в гель, участвует в образовании комплексов с широко представленным в клетках имаго дрозофилы ядерными белками В соответствии с нашими расчетами, на одну клетку дрозофилы приходится примерно 230 белковых молекул, способных специфически взаимодействовать с областью SaulO Эти данные согласуются с информацией о том, что для генов, кодирующих гомеодоменные белки характерна PcG/TrxO зависимая транскрипция, в геноме D melanogaster обнаружено более 200 генов, являющихся мишенями для белков группы Polycomb

В результате исследования данной короткой регуляторной области гомеотического гена cut обнаружено, она сочетает противоположные свойства эффективного сайленсера и

активатора транскрипции Для таких коротких регулягорных элементов предложено название «оксюморон»

Найденные в составе оксюморона локуса cut функциональные консенсусные последовательности для связывания белков групп полюсомб и триторакс объясняют ранее описанную способность локуса к его периодической активации в процессе онтогенеза [Иванов и Чуриков, 2001] Впервые описано присутствие функционально активных PRE и TRE последовательностей в пределах одного короткого (268 н п ) фрагмента ДНК На основе полученных данных, предложена модель, объясняющая механизм работы обнаруженного оксюморона в присутствии активного энхансера и инсулятора Данная модель описывает возможные механизмы взаимодействия между оксюмороном и другими элементами дистантной регуляции транскрипции (энхансером и инсулятором) через образование петлевых структур

4. Практическая ценность.

Разработанная модельная система может быть эффективно использована как при исследовании индивидуальных элементов генома, влияющих на транскрипцию, так и в исследованиях, изучающих взаимодействие нескольких различных регуляторных элементов Полученные данные позволяют приступить к детальному исследованию белковых факторов, взаимодействующих с регуляторной областью SaulO (оксюмороном) Уникальные свойства обнаруженного оксюморона могут быть использованы в биомедицинских целях, в том числе при создании конструкций в которых необходимо переключать активность гена-мишени

5. Апробация работы.

Работа апробирована на лабораторном семинаре в Лаборатории организации генома ИМБ РАН им В А Энгельгардта Результаты работы были представлены

1) на Международной конференции «Experimental Biology 2006», посвященной 100-летию журнала J Biol Chem, Сан Франциско, США, 1-5 апреля 2006 года,

2) на 8-ой Международной Энгельгардтовской конференции, Сергиев-Посад, Россия, 19 -24 августа 2006 года,

3) на Межинститутском семинаре «Хромосома», Москва, Россия, 21 марта 2007 года

4) на конференции по программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Москва, Россия, 2 апреля 2007 года,

5) приняты для представления на 20-ом Международном генетическом конгрессе, Берлин, Германия, 12-17 июля 2008 года

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи

6. Структура и объем работы

Диссертация изложена на 90 страницах, содержит 15 рисунков и 2 таблицы, состоит из вводной части, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения и выводов Список литературы цитирует 154 работы

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Ядерные белки, взаимодействующие с Sau 10 богато представлены в ядре.

Фрагмент SaulO, величиной 268 bp, находится в проксимальной части LCR и содержит протяженную область, с которой, по данным торможения ДНК в геле и футпринтинга, взаимодействуют ядерные белки [Кретова и Чуриков, 2005] Тем не менее, в данной работе впервые был проведен количественный анализ, показавший, что белки, взаимодействующие с SaulO присутствуют в ядерном экстракте в большом количестве По данным количественного анализа, полученным с помощью фосфоимеджера, до 95% меченой ДНК, находящейся в инкубационной смеси участвует в образовании ДНК-белковых комплексов (рис 1)

Исходя из предположения, что белковые молекулы, участвующие в реакции торможения связываются с фрагментом SaulO в молярном соотношении 1 1, мы рассчитали какое количество белковых молекул специфично связывающихся с SaulO, приходится на одну клетку тела имаго дрозофилы

В экспериментах с максимальной долей связавшихся молекул, мы использовали 5 75 fmol ДНК SaulO, то есть 3462298484 молекул на одну экспериментальную точку Фрагмент SaulO инкубировали с таким количеством белкового экстракта, которое содержится в 5,34 мухах Геном дрозофилы составляют примерно 180x103 тпн в гаплойдном наборе, то есть масса ДНК в одной клетке - это примерно 0,388 pg Принимая количество ДНК в одной мухе за 1 |ig, находим, что приблизительное число клеток в одной взрослой особи

дрозофилы составляет 2577489. Следовательно, в одной экспериментальной точке было использовано количество экстракта, содержащееся в 2577489x5,34=13763791 клетках. Как было сказано выше, в оптимальных условиях до 95% меченых фрагментов SaulO участвуют в образовании ДНК-белковых комплексов, то есть на одну клетку взрослой особи дрозофилы приходится (3462298484*0,95)/13763791 = 239 молекул белка, специфично взаимодействующих с ДНК SaulO.

12 3 4

Рисунок 1 Фрагмент SaulO в экспериментах по торможенню ДНК в геле активно связывается с ядерными белками. Положение ДНК-белкового комплекса указано стрелкой. 1 - 4 - независимые эксперименты

Известно, что для гомеодоменных генов и локусов, к которым относится и локус cut характерна PcG/TrxG-зависимая транскрипция. С этой точки зрения, нам было интересно проследить, как именно соотносятся полученные нами данные с общим числом функциональных генов дрозофилы, чья транскрипционная активность регулируется белками групп Poiycomb и Trithorax.

В геноме дрозофилы обнаружено по крайней мере 167 копий консенсусных последовательностей PRE/TRE, причем около 50% из них расположены в гомеотических генах [Tolhuis et al., 2006]. Не вполне ясно, какая часть из этих последовательностей является функциональной в мухах. Одним из указаний на функциональность PRE/TRE последовательностей является обнаружение в непосредственной близости от них белков, относящихся к группам Poiycomb и Trithorax [Tolhuis et al., 2006]. Согласно данным хроматиновой иммунопрецилетации одного из недавних исследований, в районе 149

предполагаемых PRE, обнаруживаются, по крайней мере, 2 белка, входящих в состав PRC1 комплекса [Schwartz et а], 2006]

Используя программу protein blast (http//www nebí nlm nih gov/BLAST/) мы провели поиск консенсусных аминокислотных последовательностей гомеодомена в составе известных белков дрозофилы Согласно полученным нами данным геном дрозофилы кодирует по крайней мере 97 уникальных белков, содержащих гомеодомен Таким образом, при подтверждении предположения о возможности взаимодействия PcG и/или ТгхО белков с фрагментом Sau 10, можно сделать вывод о том, что число белковых молекул (комплексов), специфично взаимодействующих с PRE и/или TRE примерно соответствует числу генов, экспрессия которых регулируется белками групп Polycomb и Tnthorax

2. Энхансер элемента copia усиливает экспрессию репортерного гена.

Для функционального анализа последовательностей ДНК использовался плазмидный вектор p-hsp-GL-3- act3' созданный в нашей лаборатории ранее на базе промышленного вектора pGL3-Enchancer (Promega, АСШ4797) Другой вектор, p-hsp-hRL-act3' использовался для нормализации данных свечения люциферазы светлячка, т е служила для выравнивания эффективности трансфекции в разных экспериментальных точках Ранее в составе et6 области локуса cut было обнаружено несколько ткань-специфических энхансеров [Jack et al, 1991] Предполагая, что фрагмент Sau 10, входящий в состав et6, также может содержать один или несколько энхансеров, мы использовали для проверки работоспособности предложенной нами репортерной конструкции, хорошо охарактеризованный энхансер мобильного элемента copia [Cavarec et al, 1994] В геноме D melanogaster содержится от 10 до 50 копий мобильного элемента copia, относящегося к семейству вирусоподобных ретротранспозонов Клеточные линии D Melanogaster, такие как Schneider 2, не содержат сильного активатора энхансера данного мобильного элемента То есть в клеточной линии Schneider 2, энахансер мобильного элемента copia способен увеличивать экспрессию репортерного гена только в несколько раз, а не в 100-700 раз как в клетках, экспрессирующих специфический активатор энхансера copia

Для нашего исследования мы выбрали именно такой слабый энхансер, т к использование сильного энхансера могло бы существенно повлиять на физиологическое состояние клеток и усложнить интерпретацию получаемых данных Об этом в частности

свидетельствует тот факт, что клеточная линия DH 33, ведущая происхождение из клеток D.hydei экспрессирует гомеодоменный белок, являющийся сильным активатором энхансера а мобильного элемента copia, но сам мобильный элемент copia в геноме этих клеток отсутствует.

Как и ожидалось, в использованных нами репортерных конструкциях активность энхансера из мобильного элемента copia привела к примерно 10 кратному увеличению экспрессии репортерного гена (см. рис 2).

(а) 1600000 1400000

3 1200000

Et)

>, 10DOQOQ-■w

ю 800000 600000 -

® 400000■ ф

° 200000 0

enh(copia)-hsp

Рисунок 2 Приведены данные влияния епЬ(сор1а) на экспрессию гена люцнферазы светлячка, находящегося под контролем не индуцированного теплом промотора Ьзр70.

Таким образом, полученные данные подтвердили возможность использования подобных конструкций для функционального анализа элементов дистантной регуляции транскрипционной активности.

3. SaislO является эффективным сайленсером

На первом этапе функционального анализа, фрагмент Saul0 был клонирован в базовый вектор перед промотором hsp70 на расстоянии 2215 bp от него, в той же ориентации относительно промотора, что и в самом локусе cut (все генетические конструкции

полученные в данной работе приведены на рис. 4. Полученную конструкцию использовали для экспериментов по трансфекции клеток Schneider 2 совместно с контрольной конструкцией, содержащей ген люциферазы коралла, обрамленный теми же промотором и областью 3'act-5C [Кретова и Чуриков, 2005].

Как было сказано выше, область et6 локуса cut содержит энхансеры [Jack et al., 1991]. Поэтому мы ожидали, что изучаемый фрагмент - SaulO - окажет примерно такое же влияние на экспрессию гена люциферезы светлячка, как и энхансер элемента copia -enh(copia). Как видно из данных, приведенных на рис. 3, эффект оказался обратным.

(б)

250000 -

й 200000 -и

^ 150000

<у

M -H tu

I 100000

5 50000

Рисунок 3 Приведены данные влияния фрагмента 8аи10 на экспрессию гена люциферазы светлячка, находящегося под контролем не индуцированного теплом промотора Ь5р79.

Если через 48 часов после трансфекции enh(copia) усиливает экспрессию репортерного гена примерно в 10 раз, то. неожиданно для нас, фрагмент SaulO вызывает ее подавление - в 4-5 раз. Известно, что эпигенетический сайленсинг в генах, содержащих гомеодомен, к которым относится и Cut, во многих случаях осуществляется белками группы Polycomb.

1С

hsP iuc Fife fly S'ef"50

2 С зС

enh

hsP lue Fire fly 3'act-5C

hsi> lue fire fly3'ast-5C

e-h

S-h

Sau enh

hsP lue Fife fly 3 act'SC

S-e-h

Sau enh

hsp lue Fire fly3'act-SC

ф " ^

S-e-h

hsP lue Fife fly 3'set-5C

e-g-h

Sau enh

7 С

Sau enh

-Ok- -

Sau Sau enh - "К.- -

hsP lue Fire %3'®t-5C

j S-e-g-h

grasy

T hsP lue fire «уЗ'эй-ЗС

gypsy

1 hso lue Fife fly 3^d"5c

ииишвф ч

S-e-g-h

S-S-e-s-h

10Ç

hsp lue Renifla 3'aci-5C

p-enh-hsp-Renilla-3'act-5C

Рисунок 4 Генетические конструкции, использованные в экспериментах по ко-трансфекции. Схематически, не в масштабе, показаны вставки Sau 10 в двух ориентациях, энхансера элемента copia (enh) и инсулятора gypsy в прямой ориентации. Сокращенное название конструкций, приведенное справа, основана на последовательности элементов в ней. Обозначения: S, SaulO; е, enh(copia); g, инсулятор gypsy, h, промотор bsp70. Ориентация SauIO показана стрелкой. Правильность генетических конструкций, подтверждена секвенированием.

При этом, белки из группы trithorax обычно оказывают противоположный эффект на те же самые гены, то есть являются активаторами транскрипции. Хотя известно всего несколько консенсусных последовательностей (PRE/TRE) для связывания с указанными группами белков, мы сочли целесообразным провести поиск таких последовательностей в составе Saul0 фрагмента.

4. SaulO содержит консенсусные последовательности для связывания как активаторов, так и ингибиторов транскрипции

Поиск консенсусных последовательностей в составе SaulO проводился с использованием компьютерной программы Cister (http://zlab.bu.edu/~mfrith/cister.shtml). Известно [Ringrose et al., 2004; Dejardin et al., 2004], что консенсусная последовательность для связывания

P.GTTAAC. . TAT'AATT GYPSY

^ACGTT TTTGTGAGCG CATTTATTGA GTAITTTATT AATTTCAACT STGCAA AAACACTCGC GTAAATAACT CATAAAATAA TTAAAGTTGA

7441 GATCGATGAG CTTGCCGCCT GTTACAATTG CCGCTCTTTT TCCTCGTTTA ACTGCTGGTC CTAOCTACTC GAACGGCGGA CAATGTTAAC GGCGAGAAAA AGGAGCAAAT TGACGACCAG

7501 fflTfflfSWG CGTGAAATCG GAATAGGGGG TCTI)SAGA|ST GGCGWHTTT3AATGAACT AAAAATTAAC GCACTTTAGC CTTATCCCCC AGAACTCTCA CCGCAAAAAA ACTTACTTGA

7561 таЯЗЭТЯо GTAATGGACC CTTTGCGGCG TGCITAjAACA AjTTCTTGTAA AGACAATAAG ААТТТААА^Й ^f^C^'SSjlGAAACGCCGC ACGAATTTGT TAAGAACATT TCTGTTATTC

7621 (ЛЖИ^! AAATAACTAA AAAAGACTGC TCGAACTATG ACAGCGTCTT AATATCGGCC CAAAGTIAAT TTTAITGATT TTTTCTGACG AGCTTGATAC TGTCGCAGAA TTATAGCCG3

7681 TTATCTTTAA ATATTCpAGR] TT^A^TC AATAGAAATT TATAAGCTCT AACTCTAG

Рисунок 5 Мотивы, характерные для PRE/TRE, найденные во фрагменте SaulO. Представлена последовательность фрагмента (область 7441 - 7708 в последовательности AC U96440), а также выше расположенная область внедрения элемента gypsy в мутантах cut. Мотив РНО затенен. Последовательности GAGA и ААСАА, характерные для TRE, взяты в рамки, а области олиго(Т) указаны черными линиями.

белка РНО имеет вид CNGCCATNDNND (обозначения согласно UIPAC). Мы нашли такую последовательность во фрагменте SaulO, которая, как ранее было показано, связывается с ядерными белками (рис 1). Интересно, что в SaulO имеются также три последовательности GAGA, с которыми потенциально может взаимодействовать GAGA-фактор, последовательность ААСАА, с которой могут связываться белки trx [Dejardin et al, 2004] и шесть поли(Т)-мотивов, также характерных для PRE/TRE [Ringrose et al.,

7381 ATCGATTGTT TAGCTAACAA

TGCA ÜCGT

2004] Не исключено, что фрагмент Sau 10 является мишенью белков обеих групп -репрессоров и активаторов транскрипции в локусе Экспрессия локуса cut необходима на ранних стадиях развития и позже - при развитии имаго Поэтому наличие мотивов, характерных для репрессоров (PcG) и активаторов (txr), может быть связано с активацией транскрипции локуса на определенных этапах раннего и позднего развития, а также его сайленсингом на ряде других стадий В культуральных же клетках Schneider 2 данный фрагмент проявляет свойства сайленсера

Полученные нами данные убедительно свидетельствуют о том, что фрагмент Sau 10 является эффективным сайленсером Можно полагать, что этот элемент, может обеспечивать связывание белков PcG и вызывать дистантно сайленсинг локуса cut Вопрос о согласованности механизмов действия белков групп поликомб и триторакс до настоящего времени остается открытым Тем не менее, в большинстве случаев наблюдается пространсвенное разобщение PRE и TRE последовательностей, участвующих в регуляции активности одного и того же гена В случае SaulO эти элементы расположены в непосредственной близости друг от друга, при чем и PRE и TRE в составе SaulO по всей видимости являются функциональными В частности об этом свидетельствуют полученные нами данные о том, что фрагмент SaulO является эффективным сайленсером и активатором транскрипции Мы предлагаем называть такие короткие фрагменты, сочетающие в себе противоположные свойства активаторов и сайленсеров, "оксюморонами" В локусе cut оксюморон расположен на расстоянии около 96 и 73 kb от известных промоторов [Чуриков с соавт, 1998] Можно полагать, что этот элемент может обеспечивать специфическое связывание комплексов белков PcG или trx и вызывать дистантно сайленсинг или активацию транскрипции в локусе cut Дальнейшее изучение обнаруженного нами оксюморона и его взаимодействий с другими дистантно действующими регуляторными последовательностями - инсуляторами и энхансерами -позволит ответить более детально на ряд вопросов о его роли в регуляции локуса cut В частности, интересно выяснить, какие эпигенетические механизмы вовлечены в переключение активностей активатор-сайленсер в оксюмороне'' Так же важно выяснить -какие другие регуляторные последовательности, расположенные на границах и внутри форум-доменов, обеспечивают правильную экспрессию транскрипционных территорий и, следовательно, дифференцировку и поддержание ее состояния, а также эктопическое спаривание хромосом и репликацию

5. В сочетании с эихансером, SaulO является активатором транскрипции

Для анализа возможности взаимодействия обнаруженного сайленсера с другими регуляторными элементами, ЭаиЮ был клонирован во Рэе1 сайт, расположенный в 3.34 т.п.н. выше промотора в конструкцию, содержащую энхансер (Э-е-Ь). Вопреки ожидаемым результатам, добавление сайленсера в обеих ориентациях привело не к подавлению активности гена, а к заметному ее усилению независимо от полярности сайленсера.

1200000

юооооо -

800000

200000 J

e-hsp

S-e-h

Рисунок 6 Приведены сравнительные данные, показывающие влияние на экспрессию гена люциферазы светлячка одиночного энхансера (е-Ь5р), а таюке энхансера в сочетании с фрагментом вачМ (Б-е-Л) в двух ориентациях (ориентация указана стрелкой).

Таким образом, обнаруженные нами в составе SaulO TRE последовательности, по всей вероятности, являются функционально активными. В литературе, механизм взаимодействия белков группы trithorax с промоторами или энхансерами не описан, по этому для построения модели взаимодействия этих элементов между собой было принято решение ввести в конструкцию еще один регуляторный элемент, а именно инсулятор gypsy.

6. Введение инсулятора подавляет активность энхансера

Видно, что введение инсулятора gypsy между энхансером и промотором в несколько раз ослабляет влияние энхансера (см. конструкции e-hsp и e-g-h на рис.7).

700000 -600000 -500000 400000 -300000 200000 100000-

e-hsp

e-g-h

Рисунок 7 Приведены сравнительные данные, показывающие влияние на экспрессию гена лгациферазы светлячка одиночного энхансера (e-hsp), а также энхансера в сочетании с иисулятором gypsy.

Хотя этот результат достаточно очевиден и не несет принципиально новой информации, он, тем не менее, еще раз демонстрирует адекватность данных, получаемых при использовании созданной нами системы функционального анализа регуляторных элементов генома.

Таким образом, разработанная нами модель для изучения PRE/TRE последовательностей, инсуляторов, промоторов, энхансеров и других регуляторных элементов очень удобна и имеет преимущества по сравнению с обычно используемым подходом, связанным с получением трансгенных линий дрозофилы. Во-первых, трансгенный подход не может учесть влияние неизвестных инсуляторов, энхансеров, сайленсеров и других регуляторных элементов в сайтах интеграции конструкции, которые могут оказывать влияние на полученные результаты, но не могут быть приняты во внимание в расчетах и моделях. Использованная в данной работе система позволяет быстрее получать результаты, имеет большую чувствительность и позволяет количественно оценивать эффекты. Недостаток этой системы состоит в том, что она связана с культуральными клетками, в которых, возможно, не "работают" некоторые тканеспецифические элементы.

7. SaulO-актнватор обладает полярностью действия

Две последние конструкции, указанные на рис. 8, содержат фрагмент SaulO, энхансер и инсулятор. Видно, что фрагмент SaulO усиливает экспрессию гена lue. Причем, SaulO в обратной ориентации оказывает более сильный эффект, восстанавливая уровень экспрессии репортерного гена до уровня, наблюдаемого в присутствии только одного энхансера (конструкция e-hsp). Таким образом, SaulO-активатор обладает полярностью действия. Инсулятор gypsy препятствует прохождению сигнала от SaulO-акгиватора и энхансера к промотору, когда SaulO находится в прямой ориентации. Когда же SaulO находится в обратной ориентации, тот же сигнал активации достигает промотора, не встречая инсулятора.

700000-,

e-hsp e-g-h S-e-g-h S-e-g-h

Рисунок 8 Сравнительные данные, показывающие влияние на экспрессию гена люциферазм светлячка одиночного энхансера (e-hsp), энхансера в сочетании с инсулягором gypsy (e-g-h), а также энхансера, инсулятора и фрагмента SaulO присутствующих в одной конструкции. Ориентация SaulO в указана стрелкой.

8. Кооперативный эффект SaulO

Интересно, что две копии SaulO, вставленные в прямой ориентации, значительно усиливают экспрессию репортерного гена по сравнению с одной копией (рис. 9).

То есть при анализе активности Saul0 в качестве активатора, обнаруживается кооперативный эффект действия, характерный для TRE и PRE. Этот факт еще раз подтверждает, что функциональная активность Saul0 обусловлена присутствием в его составе именно этих последовательностей.

Полярность действия SaulO-активатора следует также из данных сравнения экспрессии двух последних конструкций на рис. 9: две копии SaulO в прямой ориентации в конструкции S-S-e-g-h обеспечивают примерно такой же уровень экспрессии, как и одна его копия в конструкции S-e-g-h, где SaulO присутствует в обратной ориентации.

700000 -

600000 -

S-e-g-h

S_-e-g-h

S-S-e-g-h

Рисунок 9 Сравнительные данные, показывающие влияние на экспрессию гена люциферазы светлячка энхансера в присутствии инсулятора (е^-Ь), энхансера в присутствии инсулятора и БаиМ (8-е-й-Ь), а также энхансера, инсулятора и двух копий Яаи 10 в прямой ориентации. Ориентации ! 0 указаны стрелками.

Таким образом, результаты этих экспериментов позволяют сделать вывод о том, что один и тот же фрагмент SaulO, имеющий длину 268 bp, содержит последовательности, способные в зависимости от окружающих их последовательностей, либо репрессировать, либо активировать транскрипцию рядом расположенных генов. Наличие активного энхансера функционально переключает данный фрагмент, и он из репрессора становится активатором. Полученные данные свидетельствуют о том, что инсулятор gypsy в изучаемых нами мини-хромосомах, которые образуются после доставки кольцевых генетических конструкций в клетки, способен ослабить эффекты как энхансера так и Sau 10-активатора.

Интересно отметить, что во всех конструкциях, содержащих 2 и более копий Saul О, встраивание в плазмиду всегда происходило только в прямой ориентации. По всей видимости, эта особенность Saul 0 связана со специфическими физическими характеристиками данного фрагмента ДНК.

Взаиморасположение Saul0 и энхансера в наших конструкциях скорее всего исключает транскрипционный механизм (или трекинг-модель) действия энхансера на SaulO. Действительно, транскрипционная модель предполагает продвижение комплекса хеликазы, модифицирующего гистоны, или транскрипцию РНК полимеразой II от энхансера к промотору. В наших же конструкциях энхансер расположен между промотором и SaulO.

Рисунок 10 Предлагаемая модель взаимодействия энхансера с оксюмороном и промотором в присутствии инсулятора. а - расположение элементов в конструкции в-е-ц-й. б - образование петель фибриллами хроматина при сближении энхансера с оксюмороном и промотором. Показано, что сигнал активации от энхансера и оксиморона к промотору не проходит через петлю, содержащую инсулятор, но проходит в противоположном направлении.

Sypsy

(б)

Поэтому мы полагаем, что белковые комплексы, расположенные на энхансере, связываются с некоторыми белками, узнающими Saul 0, образуя петлю в фибрилле хроматина и способствуя связыванию с ним других белковых комплексов - активаторов Полученные нами данные свидетельствуют в пользу образования трех петель, образующихся при сближении областей энхансера, SaulO и промотора (рис 10) Инсулятор в конструкции S-e-g-h блокирует передачу сигнала активации транскрипции от энхансера и SaulO-активатора через петлю, в которой находится инсулятор, но не препятствует прохождению этого сигнала в противоположном направлении

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1 Bondarenko, V А , Liu, Y V, Jiang, Y I, and Studitsky, V M (2003) Communication over a large distance enhancers and insulators Biochem Cell Biol 81,241-251

2 Boivin, A, and Dura, J M (1998) In vivo chromatin accessibility correlates with gene silencing in Drosophila Genetics 150,1539-1549

3 Cavarec, L, Jensen, S, and Heidmann, T (1994) Identification of a strong transcriptional activator for the copia retrotransposon responsible for its differential expression in Drosophila hydei and melanogaster cell lines Biochem Biophys Res Commun 203,392-399

4 Celmker, S E, and Drewell, R A (2007) Chromatin looping mediates boundary element promoter interactions Bioessays 29(1), 7-10

5 Dejardin, J, and Cavalli, G (2004) Chromatin inheritance upon Zestemediated Brahma recruitment at a minimal cellular memory module EMBO J 23,857-868

6 Fitzgerald, D P, and Bender, W (2001) Polycomb group repression reduces DNA accessibility Mol Cell Biol 21, 6585-6597

7 Jack, J, Dorsett, D , Delotto, Y, and Liu, S (1991) Expression of the cut locus m the Drosophila wing margin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer Development 113(3),1Ъ5-1А1

8 Johnson, T К, and Judd, В H (1979) Analysis of the cut locus of Drosophila melanogaster Genetics 92,485-502

9 Lin, Q, Chen, Q, Lin, L, and Zhou, J (2004) The Promoter Targeting Sequence mediates epigenetically heritable transcription memory Genes Dev 18(21), 2639-2651

10 McCall, К, and Bender, W (1996) Probes of chromatin accessibility m the Drosophila bithorax complex respond differently to Polycomb-mediated repression EMBO J 15, 569-580

11 Nepveu, A (2001) Role of the multifunctional CDP/Cut/Cux homeodomam transcription factor m regulating differentiation, cell growth and development Gene 270(1-2), 1-15

12 Polyakov, V Y , Zatsepma, О V , Kireev, I I, Prusov, A N , Fais, D I, Sheval, E V, Koblyakova, Y V , Golyshev, S A , and Chentsov, Y S (2006) Structural-functional model of the mitotic chromosome Biochemistry (Mosc) 71(1), 1-9

13 Ringrose, L , Ehret, H, and Paro, R (2004) Distinct contributions of his tone H3 lysine 9 and 27 methylation to locus-specific stability of polycomb complexes Mol Cell 16, 641653

14 Seto, H, Hayashi, Y, Kwon, E , Taguchi, O , and Yamaguchi, M (2006) Antagonistic regulation of the Drosophila PCNA gene promoter by DREF and Cut Genes Cells 11(5), 499-512

15 Tchunkov, N A, Gerasimova, T I, Johnson T К , Barbakar, N I, Keiraor, A L, and Geogiev, G P (1989) Mobile elements and transposition events in the cut locus of Drosophila melanogaster Mol Gen Genet 219,241-248

16 Иванов, H E и Чуриков H А Локусконтролирукяций район ( LCR) из локуса Cut дрозофилы активирует репортерный Lac-Z ген периодически ДАН, 2001, том 378 №3 С 394-397

17 Кретова О В, Чуриков НА О возможности происхождения короткого ретроэлемента дрозофилы - суффикса - от родственного длинного ретроэлемента -F-элемента ДАН 2005 том 403 №6 С 824-828

18 Ратнер, В А, Васильева, JIA Мобильные генетические элементы (МГЭ) «Эгоистическая ДНК» или функциональная часть генома'' // Современные концепции эволюционной генетики / / Ред В К Шумный, A JI Маркель Новосибирск ИЦиГ СО РАН, С 128-150 (2000)

19 Чуриков НА, Кензиор АЛ, Трубецкая Н,В и др 1986 Молекулярное клонирование локуса cut Drosophila melanogaster Докл АН СССР Т 286 №5 С 1257-1260

20 Чуриков НА, Павлова ГВ, Корочкин ЛИ и др 1998 Обнаружение протяженного белок-связывающего домена в йб-энхансерной области локуса cut дрозофилы Докл АН Т 363 №6 С 835-838

Выводы.

1 Создана эффективная система для функционального анализа элементов генома дрозофилы, участвующих в дистантной регуляции экспрессии генов Данная система использует репортерный ген люциферазы светлячка и позволяет исследовать свойства как индивидуальных сайленсеров, энхенсеров и инсуляторов, так и их комбинации для изучения механизмов регуляции активности гена

2 В локусе cut дрозофилы обнаружен новый регуляторный элемент длинной 268 н п , сочетающий в себе функции сайленсера и активатора Короткие последовательности ДНК (около 300 н п), сочетающие в себе указанные функции, предложено называть оксюморопами Мы полагаем, что способность оксюморона локуса cut к сайленсенгу и активации транскрипции связана с обнаруженными в его составе мотивами, характерными для PRE и TRE (Polycomb Response Elements и Tnthorax Response Elements)

3 Оксюморон локуса cut обладает свойством активатора в обеих ориентациях, причем, сила SaulO-активатора в обратной ориентации примерно в два раза больше, чем в прямой

4 Инсулятор gypsy в любой ориентации ослабляет как сайленсерную, так и ахтиваторную активность оксюморона локуса cut

5 Эффективность работы оксюморона локуса cut в качестве активатора зависит от числа его копий Две копии оксюморона в прямой ориентации увеличивают его активаторную активность примерно в два раза по сравнению с конструкциями, содержащими его одну копию в прямой ориентации

6 Предложена модель, описывающая поведение оксюморона из локуса cut дрозофилы в конструкциях, содержащих активный энхансер и инсулятор gypsy Модель предполагает, что переключение сайленсер-активатор происходит при взаимодействии оксюморона с энхансером

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи:

1 Сосин Д В , Кретова О В , Чуриков Н А Изучение локус контролирующего района (LCR) дрозофилы с помощью репортерных конструкций, экспрессирующих люциферазу ДАН, 2006, 409 С 832-836

2 Sosm D V , Kretova О V , Tchunkov N A The identification of a silencer element in the cut locus of Drosophila melanogaster located 73 and 96 kb upstream from the promoters of the locus Dros Inf Serv, 2006, 89 p 3-7

3 Чуриков H A , Сосин Д В , Кретова О В , Моисеева Е Д Функциональный анализ последовательностей LCR из локуса cut дрозофилы ДАН, 2007,415 С 1-5

Тезисы:

Tchunkov N A, Sosin D V, Petyovka N V Role of Paramyosin B (PrmB) in organization of dynamic chromosomal structures and transcription binding of PrmB within locus control region of D melanogaster cut locus Experimental Biology, San Francisco, April 1-5 2006

Sosin D V , Kretova O V, Tchunkov N A Analysis of sequences from LCR of Drosophila cut locus and from burdock element inserted in some cut mutants revealed new functionally active silencer and insulator The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, Buran Conference Center, Moscow Region, August 19-24,2006

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИДМ00510от01 12 99г Подписано к печати 31 012008 г Формат60x90 1/16 Услпечл 1,5 Тираж 100экз 3аказ035 Тел 939-3890 ТелУФакс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им МВ Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сосин, Дмитрий Витальевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Раздел I ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Актуальность проблемы

2. Цель и задачи исследования

3. Научная новизна результатов исследования

4. Практическая ценность

• 1 , I

5. Апробация работы

6. Структура и объем работы

Раздел II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Введение

2. Дистантная регуляция активности генов у дрозофилы

2.1. Инсуляторы дрозофилы

2.1.1. Характерные особенности

2.1.2. Элементы ses и ses' локуса теплового шока HSP

2.1.3. Инсуляторы ретровируса gypsy

2.1.4. Инсулятор в локусе гена NOTCH

2.1.5. Инсуляторы комплекса биторакс

2.2. Промотор-нацеливающие последовательности

2.3. Энхансеры дрозофилы

2.3.1 Общие свойства эукариотических энхансеров

2.3.2 Механизм действия эукариотических энхансеров на примере 23 гена Abdominal-B Drosophila melanogaster.

2.4. Polycomb и Tri thorax зависимая транскрипция

2.4.1. Сравнение механизмов эпигенетического сайленсенга у 24 Засскаготусез сегеч'тае и Ъго$орМ1а melanogaster

2.4.2. Сборка и распространение комплексов модифицирующих 26 хроматин у Засскаготусея евгвутае

2.4.3. Сборка Рев белковых комплексов на генах-мишенях у 27 дрозофилы и позвоночных

2.4.4. Сборка 1гхС белковых комплексов на генах-мишенях у 30 дрозофилы и позвоночных

2.4.5. Посттрансляционные хроматиновые метки связанные с Рев 33 и ^хв белками

2.4.6. Возможный механизм PcG опосредованного сайленсенга

2.4.7. Возможный механизм trxG опосредованной активации 39 транскрипции

2.4.8. Связь между сайленсингом и РНК интерференцией у 40 дрозофилы

2.4.9. Распространенность в геноме и биологическая роль PcG 41 белков

3. Дистантная регуляция активности генов в селекторном локусе cut

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярный анализ области LCR в локусе cut Drosophila melanogaster"

7. SaulO-активатор обладает полярностью действия 64

8. Кооперативный эффект Saul0 65

Раздел V ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 67

1. Использование репорте рных конструкций является новым 67 удобным и подходом для исследования механизмов дистантной регуляции транскрипции.

2. SaulO является молекулярным переключателем, сочитающим 67 функции сайленсера и активатора транскрипции

3. Поведение SaulO в присутствии инсулятора и энхансера 68 указывает на наличие третичных петлевых структур.

Раздел VI ВЫВОДЫ 70

Раздел VII СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 71

БЛАГОДАРНОСТИ 90

Список сокращений.

Abd-A Abdominal-A

Abd-B Abdominal-B

BEAF-32 boundary element associated factor of 32 kDa bit транспозон bluetail

СЫР метод хроматиновой иммунопреципетации

СММ Cellular Memory Module (Клеточные Модули Памяти)

Esc Extra sex combs

E(z) Enhancer of zeste fa swb facet straw berry

Fab Front-abdominal

FISH метод флуоресцентной in situ гибридизации

HLH-zip белки, содержащие мотив «лейциновая молния»

НР1 гетерохроматиновый белок 1

HS сайт гиперчувствительности к ДНКазе I iab infra-abdominal

Mod(mdg4) Modifier of mdg4

MTB Malignant Brain Tumor

ORC origin recognition complex

Pc Polycomb

PcG polycomb group

Ph Polyhomeotic

Pho Pleiohomeotic

PRC Polycomb Repressive Complex (Поликомб-Подавляющий Комплекс)

PRE Polycomb Response Elements

Psc Posterior sex combs

PSS pairing-sensitive silencing

PTS promoter-targeting sequence (промотор-нацеливающая последовательность)

Sir silent information regulator

SPB scs binding protein

Su(Hw) Suppressor of Hairy-wing

Su(z) 12 Supressor of zeste 12 trxG trithorax group

TRE Trithorctx Response Elements

Ubx Ultrabithorax zw5 zeste-white 5

БК базовый комплекс PRC1 кДа килодальтон

МГЭ мобильные генетические элементы и.о. пар оснований т.п.н. тысяч пар нуклеотидов

ПС парасегмент

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Сосин, Дмитрий Витальевич

4. Заключение

Исследования последних лет позволили сделать значительный прогресс в понимании важной роли некодирующих последовательностей ДНК в регуляции транскрипционной активности генома. Помимо функций компартментализации [Grimaud et al., 2006], то есть разделения внутриядерного пространства на относительно независимые функциональные блоки, некодирующая ДНК принимает непосредственное участие в регуляции генетической активности внутри этих блоков.

Большинство элементов, участвующих в регуляции транскрипции удалены от своего гена-мишени на значительное расстояние [Bondarenko et al., 2003Ь]. Очевидно, такое пространственное разобщение позволяет, вовлекать в регуляцию транскрипции значительно большее число регуляторных элементов, чем при тандемном расположении в непосредственной близости от промотора. То есть, с одной стороны, последовательное взаимодействие различных регуляторных элементов (разобщение по времени действия) позволяет не перегружать область промотора множеством белковых факторов, а с другой, позволяет использовать функции некоторых регуляторных элементов более рационально. То есть, один и тот же регуляторный элемент может принимать участие во взаимодействиях с несколькими другими регуляторными элементами. Примером такого взаимодействия могут служить PTS, способные нацеливать сразу несколько энхансеров на один и тот же промотор [Lin et al., 2004].

Модель взаимодействия элементов дистантной регуляции с геном-мишенью через образование хроматиновых петель [Cleard et al., 2006; Dean, 2004], является наиболее обоснованной и распространенной на сегодняшний день. Тем не менее, четкие данные о существовании таких петлевых структур для большинства регуляторных элементов отсутствуют. Интерпретация данных, полученных с помощью современных методик исследования трехмерной структуры генома, таких как ЗС и ChIP связана с большим количеством ошибок и противоречий [Petruk et al., 2006; Papp and Muller, 2006]. Хотя возможности для косвенного анализа механизмов взаимодействия различных регуляторных элементов далеко не исчерпаны, не вызывает сомнений необходимость создания новых эффективных подходов для обнаружения и анализа функций элементов генома, участвующих в дистантной регуляции.

Раздел III Материалы и методы

I. Биологические материалы

В экспериментах по клонированию использовался штамм E.coli JM103. Для функционального анализа последовательностей ДНК использовался плазмидный вектор p-hsp-GL-3- act3' (рис 5а) созданный в нашей лаборатории ранее на базе промышленного вектора pGL3-Enchancer (Promega, AC#U4797).

p-hsp-GL3-act3'

Рисунок 5 Базовый (а) н век-гор нормализации (б), использовавшиеся в работе (пояснения в тексте).

Другой вектор, р-Изр-Ы^Ь- ас13' (рис. 56) использовался для нормализации данных свечения люциферазы светлячка, т.е. служила для выравнивания эффективности трансфекции в разных экспериментальных точках.

fue - Renilla 3'act-5C

p-hsp-hRL-act3'

2. Использованные праймеры

Для клонирования во Fsel сайт вектора p-hsp-GL-3-3'act, расположенный в 3.34 т.п.н. выше промотора Saul 0 фрагмент нарабатывали с помощью праймеров, содержащих искусственные Fsel сайты: 5' cccggccggccGATCGATGAGCTTGCCGCCTG 3' 5' cccggccggccGATCTCAATCTCGAATATTTAAAGATA 3'

В некоторые генетические конструкции, на расстоянии 2.841 т.п.н. выше промотора, вставляли энхансер из мобильного элемента copia, который активен в культуральных клетках дрозофилы - enh(copia) [Cavarec et al., 1994].

В ряде конструкций в Kpnl сайт вставляли инсулятор gypsy, наработанный с помощью праймеров, содержащих искусственные сайты Kpnl: 5' cccggtaccTGGCCACGTAATAAGTGTGCG 3' 5' cccggtaccGTTGTTGGTTGGCACACCACAA 3'

3. Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе

В работе были использованы две линии дикого типа Oregon RC, имеющие лабораторное наименование Oregon 00 и Oregon 01. Первая линия была предоставлена Корочкиным Л.И., вторая - Шостак Н.Г.

4. Торможение в геле

5. Выделение ядерных белковых экстрактов из мух

800 мг мух усыпляли диэтиловым эфиром и гомогенизировали в 7 мл PBS (125 мМ NaCl, 25 мМ NaPC>4 (рН=7.2), 0.25 мМ PMSF и 0.25 мМ aprotenin) в Даунсе со слабопритертым пестиком. Полученный гомогенат фильтровали через капрон* в 10 мл пробирку и центрифугировали 5' при 3000 rpm на К23 (Janetzki). К полученному осадку клеток добавляли 7 мл PBS, ресуспендировали на вортексе и повторяли центрифугирование. После удаления супернатанта в пробирку добавляли 2.5 мл RSB (10 мМ Tris-HCl (рН=7.6), 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 0.25 мМ PMSF и 0.25 мМ aprotenin), содержащего 0.5%Triton Х100. Осадок клеток мягко ресуспендировали пипетированием и гомогенизировали* в Даунсе с плотно притертым< пестиком. Полученный раствор центрифугировали 10' при 4000 rpm на К23 (Janetzki). Далее клеточные ядра в осадке отмывали 2.5 мл RSB и> центрифугировали в двух 1.5 мл пробирках 5' при 13000 rpm на Eppendorf 5414. К осадку ядер добавляли 0.8 мл RSB, содержащего 0.35М NaCl. Для экстракции ядерных белков ресуспендированный осадок инкубировали 30' при постоянном помешивании и центрифугировали 20' на Eppendorf 5414 при 13000 rpm. Супернатант отбирали в отдельную пробирку и добавляли глицерин (до конечной концентрации. 20%). Гомогенизированный раствор фасовали по 50 мкл в 0.5 мл пробирки и замораживали в жидком азоте.

6. Выделение плазмидной ДНК из Ё.соН

об/мин). Вскрытие клеток и лизис ядер осуществляли последовательно раствором глюкозы (50мМ глюкоза; 25мМ Трис-HCl, pH 7,5; ЮмМ ЭДТА) и щелочным раствором (0,2MNaC)H; 1% SDS). От ДНК E.coli и дебриса избавлялись осаждением 7,5М раствором ацетата аммония с последующим центрифугированием Юмин при 13 тыс.об./мин на minispin (Eppendorf). Для осаждения плазмидной ДНК (и РНК) пользовались изопропанолом, очистку от РНК проводили дважды 2М ацетатом аммония. Осадок плазмиды отмывали 3 раза соленым спиртом (70% этанол, 0,1М NaCl) и растворяли в 25мкл ТЕ-буфера (0,1мМ ЭДТА; 1мМ Трис-HCl, pH 7,5).

7. Приготовление компетентных клеток и трансформация

8. Отбор клонов

9. Синтез 32Р-эонда без использования праймеров методом cool PCR

по 200 мкМ каждого dXTP, кроме dATP

NEST-буфер 0, IM NaCl 0,25% SDS ЮмМ Трис-HCl 25мМ ЭДТА

10. Секвенирование по Сенгеру

6 мкл смеси 1 следующего состава: 2 мкл/пробу 5хБуфера для отжига — 260 мМ Трис-НС1, рН 8,8; 26 мМ Г^СЬ; 2 мкл/пробу 5хБуфера для мечения - 1,5 мкМ раствор (каждого) ёСТР, с!СТР и сПТР, приготовленных в 50 мМ ЫаС1; 0,7 мкл/пробу^ а32Р-с!АТР; 1,3 мкл/пробу НгО

2 мкл смеси 2 следующего состава: 2 мкл/пробу 5хБуфера для Тяд-полимеразы — БСА в концентрации 2,5 мг/мл в 50% глицерине; 0,5хБуфер для отжига (см. выше) и 0,3 мкл/пробу Тад-полимеразы (5 ед./мкл).

11. Нормализация плазмидиых конструкций по концентрации

Перед трансфекцией препараты плазмид нормализовали по концентрации ДНК. Для этого использовали два подхода: 1) нормализацию с использованием Саузерн блоттинга и 2) нормализацию по бромистому этидию с последующей компьютерной обработкой изображения с помощью программы Quantity One (Bio-Rad).

Для предварительного определения концентраций, 10-20 ng плазмиды в 0,1хТЕ (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА) рестриктировали BamHI эндонуклеазой. Далее фрагменты ДНК разделяли в 0.8% агарозном геле. По фотографии линейных форм концентрации плазмид определяли более точно и на основании этих данных готовили аликвоты для трансфекции.

11.1. Нормализация с использованием Саузерн блоттиига

10 г^ плазмиды, содержащей необходимую вставку, рестиктировали по ВашШ сайтам. Помимо рестриктированной плазмиды со вставкой, каждая проба содержала 10 гщ рестриктированной по ВашНГ сайту плазмиды р11С12. Линейная форма р1ЛС12 служила в качестве внутреннего контроля эффективности переноса каждого образца ДНК при блоттинге. После разделения фрагментов ДНК в 0.8% агарозном геле, гель помещали в раствор для блоттинга (69 г ШС1, 8 г ЫаОН до 800 мл сШ^О) и инкубировали 40' с покачиванием.

Из НуЬопсШ вырезали фильтр, выступающий за края геля на 0.5 см с каждой стороны. После этого фильтр кипятили в сИгО до полного смачивания и помещали его в раствор для блоттинга на 5'. Гель переносили в блотницу. Сверху на гель последовательно укладывали фильтр, стопку фильтровальной бумаги (0.5 см), стопку полотенец и небольшой груз. Открытые участки ванночки (без геля) полностью закрывали полиэтиленовыми спейсерами.

Блоттинг проводили до полного всасывания буфера (800 мл) из нижней ванночки, заменяя при необходимости верхние смоченные слои фильтровальной бумаги на новые (но не более 2-х суток). По окончанию блоттинга фильтровальную бумагу удаляли и булавкой обкалывали на фильтре границы геля и границы дорожек. Фильтр выдерживали 5' в 2хЭ8С (3 М ЫаС1, 0.3 М МазСбНз07Х 5.5Н20) и сушили на минимальном расстоянии под лампой 60ЧУ 15 минут. Далее проводили пришивание ДНК к фильтру облучением под УФ лампой в течение 7'.

11.2. Нормализация по бромистому этидию

Для проверки объективности получаемых данных, для нормализации концентраций плазмидных конструкций использовали альтернативный метод. 10ng плазмиды, содержащей необходимую вставку, рестиктировали по BamHI сайтам и разделяли фрагменты ДНК в 0.8% агарозном геле. Далее гель фотографировали и оценивали концентрации плазмид, используя компьютерную программу Quantity One (Bio-Rad). Согласно полученным данным, этот метод нормализации оказался более эффективным, т.к. давал более воспроизводимые результаты оценки количества ДНК, чем метод, предполагающий использование Саузерн блоттинга.

12. Трансфекция

Раздел IV Результаты

1, Ядерные белки, взаимодействующие с SaulO богато представлены в ядре

Фрагмент SaulO, величиной 268 Ьр, находится в проксимальной части LCR и содержит протяженную область, с которой, по данным торможения ДНК в геле и футпринтинга, взаимодействуют ядерные белки [Кретова и Чуриков, 2005]. Тем не менее, в данной работе впервые был проведен количественный анализ, показавший, что белки, взаимодействующие с SaulO присутствуют в ядерном экстракте в большом количестве. По данным количественного анализа, полученным с помощью фосфоимеджера, до 95% меченой ДНК, находящейся в инкубационной смеси участвует в образовании ДНК-белковых комплексов (рис 6).

Рисунок 6 Фрагмент ЗаиЮ в экспериментах по торможению ДНК в геле активно связывается с ядерными белками. Положение ДНК-белкового комплекса указано стрелкой. 1 - 4 - независимые эксперименты

Исходя из предположения, что белковые молекулы, участвующие в реакции торможения связываются с фрагментом БаиЮ в молярном соотношении 1:1, мы рассчитали какое количество белковых молекул специфично связывающихся с БаиЮ, приходится на одну клетку тела имаго дрозофилы.

В экспериментах с максимальной долей связавшихся молекул, мы использовали 5,75 йпо1 ДНК ЭаиЮ, то есть 3462298484 молекул на одну экспериментальную точку. Фрагмент

Saul 0 инкубировали с таким количеством белкового экстракта, которое содержится в 5,34 мухах. Геном дрозофилы составляют примерно 180x103 т.п.н в гаплойдном наборе, то есть масса ДНК в одной клетке - это примерно 0,388 pg. Принимая количество ДНК в одной мухе за 1 |ig, находим, что приблизительное число клеток в одной взрослой особи дрозофилы составляет 2577489. Следовательно, в одной экспериментальной точке было использовано количество экстракта, содержащееся в 2577489x5,34=13763791 клетках. Как было сказано выше, в оптимальных условиях до 95% меченых фрагментов SaulO участвуют в образовании ДНК-белковых комплексов, то есть на одну клетку взрослой особи дрозофилы приходится (3462298484*0,95)/13763791 239 молекул белка, специфично взаимодействующих с ДНК SaulO.

В геноме дрозофилы обнаружено по крайней мере 167 копий консенсусных последовательностей PRE/TRE, причем около 50% из них расположены в гомеотических генах [Tolhuis et al., 2006]. Не вполне ясно, какая, часть из этих последовательностей является функциональной в мухах. Одним из указаний на функциональность PRE/TRE последовательностей является обнаружение в непоследственной близости от них белков, относящихся к группам Polycomb и Trithorax [Tolhuis et al., 2006]. Согласно данным хроматиновой иммунопреципетации одного из недавних исследований, в районе 149 предполагаемых PRE, обнаруживаются, по крайней мере, 2 белка, входящих в состав PRC1 комплекса [Schwartz et al., 2006].

Используя программу protein blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) мы провели поиск консенсусных аминокислотных последовательностей гомеодомена в составе известных белков дрозофилы. Согласно полученным нами данным геном дрозофилы кодирует по-крайней мере 97 уникальных белков, содержащих гомеодомен.

Таким образом, при подтверждении предположения о возможности взаимодействия PcG и/или TrxG белков с фрагментом SaulO, можно сделать вывод о том, что число белковых молекул (комплексов), специфично взаимодействующих с PRE и/или TRE примерно соответствует числу генов, экспрессия которых регулируется белками групп Polycomb и Trithorax.

2. Энхансер элемента copia усиливает экспрессию репортерного гена

Ранее в составе et6 области локуса cut было обнаружено несколько ткань-специфических энхансеров [Jack et al., 1991]. Предполагая, что фрагмент SaulO, входящий в состав et6, также может содержать один или несклько энхансеров, мы использовали для проверки работоспособности предложенной нами репортерной конструкции, хорошо охарактеризованный энхансер мобильного элемента copia [Cavarec et al., 1994]. В геноме D. melanogaster содержится от 10 до 50 копий мобильного элемента copia, относящегося к семейсву вирусоподобных ретротранспозонов. Клеточные линии D. Melanogaster, такие как Schneider 2, не содержат сильного активатора энхансера данного мобильного элемента. То есть в клеточной линии Schneider 2, энахансер мобильного элемента copia способен увеличивать экспрессию репортерного гена только в несколько раз, а не в 100-700 раз как в клетках, экспрессирующих специфический активатор энхансера copia.

Для нашего исследования мы выбрали именно такой слабый энхансер, т.к. использование сильного энхансера могло бы существенно повлиять на физиологическое состояние клеток и усложнить интерпретацию получаемых данных. Об этом в частности свидетельствует тот факт, что клеточная линия DH 33, ведущая происхождение из клеток D.hydei экспрессирует гомеодоменный белок, являющийся сильным активатором энхансера мобильного элемента copia, но сам мобильный элемент copia в геноме этих клеток отсутствует.

16000001400000 -^ 1200000>, 1000000-

« 800000 -ч

enh(copia)-hsp

Рисунок 2 Приведены данные влияния епЬ(сор1а) на экспрессию гена люциферазы светлячка, находящегося под контролем не индуцированного теплом промотора 11зр70.

3. SaulO является эффективным сайленсером

На первом этапе функционального анализа, фрагмент SaulO был клонирован в базовый

вектор (рис 5а) перед промотором hsp70 на расстоянии 2215 bp от него, в той же

ориентации относительно промотора, что и в самом локусе cut (все генетические конструкции полученные в данной работе приведены на рис. 9. Полученную конструкцию использовали для экспериментов по трансфекции клеток Schneider 2 совместно с контрольной конструкцией, содержащей ген люциферазьг коралла, обрамленный теми же промотором и областью 3'act-5C (рис. 5, б) [Кретова и Чуриков, 2005]. Как было сказано выше, область et6 локуса cut содержит энхансеры [Jack et al., 1991]. Поэтому мы ожидали, что изучаемый фрагмент - SaulO - окажет примерно такое же влияние на экспрессию гена люциферезы светлячка, как и энхансер элемента copia -enh(copia). Как видно из данных, приведенных на рис. 8, эффект оказался обратным.

hsp Sau1G-hsp

Рисунок 7 Приведены данные влияния фрагмента SaulO на экспрессию гена люпиферазы светлячка, находящегося под контролем не индуцированного теплом промотора hsp70.

Если через 48 часов после трансфекции enh(copia) усиливает экспрессию репортерного гена примерно в 10 раз, то, неожиданно для нас, фрагмент SaulO вызывает ее подавление - в 4-5 раз. Известно, что эпигенетический сайленсинг в генах, содержащих гомеодомен, к которым относится и Cut, во многих случаях осуществляется белками группы Polycomb. При этом, белки из группы trithorax обычно оказывают противоположный эффект на те же самые гены, то есть являются активаторами транскрипции.

Хотя известно всего несколько консенсусных последовательностей (PRE/TRE) для связывания с указанными группами белков, мы сочли целесообразным провести поиск таких последовательностей в составе SaulO фрагмента.

h®p lue Fire fiy 3'act-5C

lue Fire fly 3"act-5C

h8P lue Rre fly S'act-SC

hsP lue Fire fly 3*act-5C

hsp lue Fire fly 3'act-5C

hsP lue Fire fiy 3 act-5C

h3P tue Fire f)y3'act-5C

J lî-e-g-h

hsP lue Rre fly3'aci-5C

Л JS-e-g-ï

Sau Sau enh

lue Fire fly 3^et-5C

hsp lue Renille 3'act-5C

p-enh-hsp-Renilla-3'act-5C

Рисунок 8 Генетические конструкции, использованные в экспериментах по ко-трансфекции. Схематически, не в масштабе, показаны вставки SaulO в двух орнентацмях, эихансера элемента copia (enh) и ннсулятора gypsy в прямой ориентации. Сокращенное название конструкций, приведенное справа, основано на последовательности элементов в ней. Обозначения: S, SaulO; е, enh(copia); g, инсулятор gypsy I h, промотор hsp70. Ориентация SaulO показана стрелкой. Правильность генетических конструкций, подтверждена секвенированнем.

4. Saul0 содержит консенсусные последовательности для связывания как активаторов, так и ингибиторов транскрипции

Поиск консенсусных последовательностей в составе Sau 10 проводился с использованием компьютерной программы Cister (http://zlab.bu.edu/mfrith/cister.shtml). Известно [Ringrose et al., 2003; Dejardin et al., 2004], что консенсусная последовательность для связывания белка РНО имеет вид CNGCCATNDNND (обозначения согласно UIPAC), Мы нашли такую последовательность во фрагменте Sau 10, которая, как ранее было показано, связывается с ядерными белками (рис 6).

agttaac.таглатт gypsy

7381 atcgättgtt tgcñ tagctaacaa h.cgt

iacgtt tttgtgagcg catttattga gtattttatt aatttcaact 3tgcaa aaacactcgc gtaaataact cataaaataa ttaaagttga

7441 GATCGATGAG cttgccgcct gttacaattg ccgctctttt tcctcgttta actgctggtc

ctagctactc gaacggcgga caatgttaac ggcgagaaaa äggagcaaat tgacgaccag

aaaaattaac gcactttagc cttatccccc agaactctca ccgcaaaaaa acttacttga

7561 TOHJ^TOg gtaatggacc ctttgcggcg tgctta{ääcää|ftcttgtaa agacaataag аатттаалцщ1 ^itfpu 1ч(7|яя " г| г|------acgaatttgt taagaacatt tctgttattc

7621 g^ntsbmb aaataactaa aaaagactgc tcgaactatg acagcgtctt aatatcggcc caaagttaat tttattgatt ttttctgacg agcttgatac tgtcgcagaa ttatagccgg

7 681 ttatctttaa atattcjägft] tt|gaga|tc aatagäaatt tataagctct aactctag

Рисунок 9 Мотивы, характерные для PRE/TRE, найденные во фрагменте SauJO. Представлена последовательность фрагмента (область 7441 - 7708 в последовательности AC U96440), а также выше расположенная область внедрения элемента gypsy в мутантах cut. Мотив РНО затенен. Последовательности CACA и ААСАА, характерные для TRE, взяты в рамки, а области олнго(Т) указаны черными линиями.

Интересно, что в SaulO имеются также три последовательности GAGA, с которыми потенциально может взаимодействовать GAGA-фактор, последовательность ААСАА, с которой могут связываться белки trx [Dejardin et al., 2004] и шесть поли(Т)-мотивов, также характерных для PRE/TRE [Ringrose et al., 2003]. Не исключено, что фрагмент SaulO является мишенью белков обеих групп - репрессоров и активаторов транскрипции в локусе. Экспрессия локуса cut необходима на ранних стадиях развития и позже - при развитии имаго. Поэтому наличие мотивов, характерных для репрессоров (PcG) и активаторов (txr), может быть связано с активацией транскрипции локуса на

определенных этапах раннего и позднего развития, а также его сайленсингом на ряде других стадий. В культуральных же клетках Schneider 2 данный фрагмент проявляет свойства сайленсера.

Полученные нами данные убедительно свидетельствуют о том, что фрагмент SaulO является эффективным сайленсером. Можно полагать, что этот элемент, может обеспечивать связывание белков PcG и вызывать дистантно сайленсинг локуса cut.

5. В сочетании с энхансером, SaulO является активатором транскрипции

Для анализа возможности взаимодействия обнаруженного сайленсера с другими регуляторными элементами, SaulO был клонирован во Fsel сайт, расположенный в 3.34 т.п.н. выше промотора в конструкцию, содержащую энхансер (S-e-h).

Рисунок 10 Приведены сравнительные данные, показывающие влияние на экспрессию геиа люциферазы светлячка одиночного энхансера (e-hsp), а также энхансера в сочетании с фрагментом SaulO (S-e-h) в двух орнентацнях (ориентация SaulO указана стрелкой).

Вопреки ожидаемым результатам, добавление сайленсера в обеих ориентациях привело не к подавлению активности гена, а к заметному ее усилению независимо от полярности сайленсера. Таким образом, обнаруженные нами в составе SaulO TRE последовательности, по всей вероятности, являются функционально активными. В

литературе, механизм взаимодействия белков группы trithorax с промоторами или энхансерами не описан, по этому для построения модели взаимодействия этих элементов между собой было принято решение ввести в конструкцию еще один регуляторный элемент, а именно инсулятор gypsy.

6. Введение инсулятора подавляет активность энхансера

Видно, что введение инсулятора gypsy между энхансером и промотором в несколько раз ослабляет влияние энхансера (см. конструкции e-h и e-g-h на рис.12).

Рисунок 11 Приведены сравнительные данные, показывающие влияние на экспрессию гена люцифераэы светлячка одиночного энхансера (e-hsp), а также энхансера в сочетании с ннсулятором gypsy.

7. SaulO-активатор обладает полярностью действия

Две последние конструкции, указанные на рис. 13, содержат фрагмент Sau 10, энхансер и инсулятор. Видно, что фрагмент SaulO усиливает экспрессию гена lue. Причем, Sau 10 в обратной ориентации оказывает более сильный эффект, восстанавливая уровень экспрессии репортерного гена до уровня, наблюдаемого в присутствии только одного энхансера (конструкция e-hsp). Таким образом, SaulO-активатор обладает полярностью действия. Инсулятор gypsy препятствует прохождению сигнала от ЗаиЮ-активатора и энхансера к промотору, когда SaulO находится в прямой ориентации. Когда же SaulO находится в обратной ориентации, тот же сигнал активации достигает промотора, не встречая инсулятора.

Рисунок 12 Сравнительные данные, показывающие влияние на экспрессию гена люциферазы светлячка одиночного энхансера (e-hsp), энхансера в сочетании с инсулятором gypsy (e-g-h), а также энхансера, инсулятора и фрагмента SaulO присутствующих в одной конструкции. Ориентация SaulO в указана стрелкой.

8. Кооперативный эффект SaulO

Интересно, что две копии SaulO, вставленные в прямой ориентации, значительно усиливают экспрессию репортерного гена по сравнению с одной копией (рис. !4). То есть при анализе активности SaulO в качетве активатора, обнаруживается кооперативный эффект действия, характерный для TRE и PRE. Этот факт еще раз подтверждает, что функциональная активность SaulO обусловлена присутствием в его составе именно этих последовательностей.

Полярность действия SaulO-активатора следует также из данных сравнения экспрессии двух последних конструкций на рис. 14: две копии SaulO в прямой ориентации в конструкции S-S-e-g-h обеспечивают примерно такой же уровень экспрессии, как и одна его копия в конструкции S-e-g-h, где SaulO присутствует в обратной ориентации.

Рисунок 13 Сравнительные данные, показывающие влияние на экспрессию гена люциферазы светлячка энхансера в присутствии инсулнтора (е-£-Ь), энхансера в присутствии инсулятора и ваиЮ (.Ч-е-й-И), а также энхансера, инсулятора и двух копий ЯаиЮ в прямой ориентации. Ориентации ваиЮ указаны стрелками.

U- 300000200000 -100000 -0-

Таким образом, результаты этих экспериментов позволяют сделать вывод о том, что один и тот же фрагмент SaulO, имеющий длину 268 bp, содержит последовательности,

способные в зависимости от окружающих их последовательностей, либо репрессировать, либо активировать транскрипцию рядом расположенных генов. Наличие активного энхансера функционально переключает данный фрагмент, и он из репрессора становится активатором. Полученные данные свидетельствуют о том, что инсулятор gypsy в изучаемых нами мини-хромосомах, которые образуются после доставки кольцевых генетических конструкций в клетки, способен ослабить эффекты как энхансера так и Saul О-активатора.

Раздел V Обсуждение результатов

1. Использование репортерных конструкций является новым удобным и подходом для исследования механизмов дистантной регуляции транскрипции

Разработанная нами модель для изучения РЯЕ/ТЯЕ последовательностей, инсуляторов, промоторов, энхансеров и других регуляторных элементов очень удобна и имеет преимущества по сравнению с обычно используемым подходом, связанным с получением трансгенных линий дрозофилы. Во-первых, трансгенный подход не может учесть влияние неизвестных инсуляторов, энхансеров, сайленсеров и других регуляторных элементов в сайтах интеграции конструкции, которые могут оказывать влияние на полученные результаты, но не могут быть приняты во внимание в расчетах и моделях. Описанная в данной работе система позволяет быстрее получать результаты, имеет большую чувствительность и позволяет количественно оценивать эффекты. Недостаток этой системы состоит в том, что она связана с культуральными клетками, в которых, возможно, не "работают" некоторые тканеспецифические элементы.

2. SaulO является молекулярным переключателем, сочитающим функции сайленсера и активатора транскрипции

Вопрос о согласованности механизмов действия белков групп поликомб и триторакс до настоящего времени остается открытым. Согласно имеющимся на сегодня данным, PcG и TrxG белки могут осуществлять координированную регуляцию активности хромосомных доменов, содержащих от 1 до 9 генов. Размер этих доменов, известных также как форум-домены или Рс-домены может варьировать от 50 до 150 т.п.н., при этом PRE и TRE последовательности в составе этих доменов могут быть удалены друг от друга на сотни и даже тысячи н.п.

В случае SaulO PRE и TRE элементы расположены в непосредственной близости друг от друга, при чем оба типа поледовательностей в составе SaulO, по всей видимости, являются функциональными. В частности об этом свидетельствуют полученные нами данные о том,

что фрагмент Saul 0 является эффективным сайленсером и активатором транскрипции, а также зависимость силы SaulO-активатора от числа его копий в в конструкции. Мы предлагаем называть такие короткие фрагменты, сочетающие в себе противоположные свойства активаторов и сайленсеров, "оксюморонами". В локусе cut оксюморон расположен на расстоянии около 96 и 73 kb от известных промоторов [Чуриков с соавт., 1998]. Можно полагать, что этот элемент может обеспечивать специфическое связывание комплексов белков PcG или trx и вызывать дистантно сайленсинг или активацию транскрипции в локусе cut. Дальнейшее изучение обнаруженного нами оксюморона и его взаимодействий с другими дистантно действующими регуляторными последовательностями - инсуляторами и энхансерами -позволит ответить более детально на ряд вопросов о его роли в регуляции локуса cut. В частности, интересно выяснить, какие эпигенетические механизмы вовлечены- в переключение активностей активатор-сайленсер в оксюмороне? Так же важно выяснить — какие другие регуляторные последовательности, расположенные на границах и внутри форум-доменов, обеспечивают правильную экспрессию транскрипционных территорий и, следовательно, дифференцировку и поддержание ее состояния, а также эктопическое спаривание хромосом и репликацию.

3. Поведение SaulO в присутствии инсулятора и энхансера указывает на наличие третичных петлевых структура

Образование фибриллами хроматина третичных структур является универсальной стратегией клетки для обеспечения механизмов дистантной регуляции экспрессии генов с помощью энхансеров, сайленсеров инсуляторов и др. [Gerasimova et al., 2000]. В нашем случае в составе исследуемого SaulO фрагмента нами были обнаружены функциональные PRE и TRE последовательности, что предполагает возможность взаимоедйствия: белков поликомб и триторакс. Ранее было показано, что протяженные ДНК взаимодействия не являются необходимыми для сайленсинга с участием PcG [Cleard et al., 2006]. Более того, ряд данных указывает на способность PcG белков взаимодейсвовать не только с PRE, но и с удаленным промотором [Comet et al., 2006; Kahn et al., 2006].

Взаиморасположение SaulO и энхансера в наших конструкциях скорее всего исключает транскрипционный механизм (или трекинг-модель) действия энхансера на SaulO. Действительно, транскрипционная модель предполагает продвижение комплекса

хеликазы, модифицирующего гистоны, или транскрипцию РНК полимеразой II от энхансера к промотору. В наших же конструкциях энхансер расположен между промотором и SaulO. Поэтому мы полагаем, что белковые комплексы, расположенные на энхансере, связываются с некоторыми белками, узнающими SaulO, образуя петлю в фибрилле хроматина и способствуя связыванию с ним других белковых комплексов -активаторов. Полученные нами данные свидетельствуют в пользу образования трех петель, образующихся при сближении областей энхансера, SaulO и промотора (рис, 15). Инсулятор в конструкции S-e-g-h блокирует передачу сигнала активации транскрипции от энхансера и SaulO-активатора через петлю, в которой находится инсулятор, но не препятствует прохождению этого сигнала в противоположном направлении,

Рисунок 14 Предлагаемая модель взаимодействия энхансера с оксюмороном и промотором в присутствии ннсулятора. а — расположение элементов в конструкции 5-е-§-11. б - образование петель фибриллами хроматина при сближении энхансера с оксюмороном и промотором. Показано, что сигнал активации от энхансера и оксиморона к промотору не проходит через петлю, содержащую инсулятор, но проходит в противоположном направлении.

Раздел VI Выводы

1. Создана эффективная система для функционального анализа элементов генома дрозофилы, участвующих в дистантной регуляции экспрессии генов. Данная система использует репортерный ген люциферазы светлячка и позволяет исследовать свойства как индивидуальных сайленсеров, энхенсеров и инсуляторов, так и их комбинации для изучения механизмов регуляции активности гена.

2. В локусе cut дрозофилы обнаружен новый регуляторный элемент длинной 268 н.п., сочетающий в себе функции сайленсера и активатора. Короткие последовательности ДНК (около 300 н.п.), сочетающие в себе указанные функции предложено называть оксюморонами. Мы полагаем, что способность оксюморона локуса cut к сайленсенгу и активации транскрипции связана с обнаруженными в его составе мотивами характерными для PRE и TRE.

3. Оксюморон локуса cut обладает свойством активатора в обеих ориентациях, причем, сила SaulO-активатора в обратной ориентации примерно в два раза больше чем в прямой.

4. Инсулятор gypsy ослабляет как действие энхансера, так и активаторную активность оксюморона локуса cut.

5. Эффективность работы оксюморона локуса cut в качестве активатора зависит от числа его копий. Две копии оксюморона в прямой ориентации увеличивают его активаторную активность примерно в два раза, по сравнению с конструкциями, содержащими его одну копию в прямой ориентации.

6. Предложена модель, описывающая поведение оксюморона из локуса cut дрозофилы в конструкциях, содержащих активный энхансер и инсулятор gypsy. Модель предполагает, что переключение сайленсер-активатор происходит при взаимодействии оксюморона с энхансером.

Раздел VII Список литературы

1. Akbari, О. S., Bousum, А., Bae, Е., and Drewell, R. А. (2006). Unraveling cisregulatory mechanisms at the abdominal-A and Abdominal-B genes in the Drosophila bithorax complex. Dev Biol 293, 294-304.

2. Barges, S., Mihaly, J., Galloni, M., Hagstrom, K., Muller, M., Shanower, G., Schedl, P., Gyurkovics, H., and Karch, F. (2000). The Fab-8 boundary defines the distal limit of the bithorax complex iab-7 domain and insulates iab- 7 from initiation elements and a PRE in the adjacent iab-8 domain. Development 127, 779-790.

3. Bantignies, F., Grimaud, C., Lavrov, S., Gabut, M., and Cavalli, G. (2003). Inheritance of Polycomb-dependent chromosomal interactions in Drosophila.Genes Dev 17(19), 2406-2420.

4. Blanton, J., Gaszner, M., and Schedl, P. (2001). Interaction between two boundary proteins, zeste-white 5 and BEAF. In Annu. Drosophila Res Conf 42nd, p. a20 Washington, DC

5. Blochlinger, K., Bodmer, R., Jack, J., Jan, L. Y., and Jan, Y. N. (1988). Primary structure of a product from cut, a locus involved in specifying sensory organ identity in Drosophila. Nature 333, 629-635

6. Blochlinger, K., Jan, L. Y., and Jan, Y. N. (1993) Postembryonic patterns of expression of cut, a locus regulating sensory organ identity in Drosophila. Development 117(2), 441-450.

7. Boivin, A., and Dura, J. M. (1998). In vivo chromatin accessibility correlates with gene silencing in Drosophila. Genetics 150,1539-1549.

8. Bondarenko, V. A., Jiang, Y. I., and Studitsky, V. M. (2003a). Rationally designed insulator-like elements can block enhancer action in vitro. EMBO J 22,4728-4737.

9. Bondarenko, V. A., Liu, Y. V., Jiang, Y. I., and Studitsky, V. M. (2003b). Communication over a large distance: enhancers and insulators. Biochem Cell Biol 81, 241—251.

10. Boyer, L. A., Plath, K., Zeitlinger, J., Brambrink, T., Medeiros, L. A., Lee, T. I., Levine, S. S., Wernig, M., Tajonar, A., Ray, M. K., Bell, G. W., Otte, A. P., Vidal, M., Gifford, D. K., Young, R. A., and Jaenisch, R. (2006). Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells. Nature 441, 349-353.

11. Bracken, A. P., Dietrich, N., Pasini, D., Hansen, K. H., and Helin, K. (2006). Genome-wide mapping of Polycomb target genes unravels their roles in cell fate transitions. Genes Dev. 20,1123-1136.

12. Breiling, A., Turner, B. M., Bianchi, M. E., and Orlando, V. (2001). General transcription factors bind promoters repressed by Polycomb group proteins. Nature 412, 651-655.

13. Brown, J. L., Fritsch, C., Mueller, J., and Kassis, J. A. (2003). The Drosophila pho-like gene encodes a YY1-related DNA binding protein that is redundant with pleiohomeotic in homeotic gene silencing. Development 130, 285-294.

14. Buchenau, P., Hodgson, J., Strutt, H. and Arndt-Jovin, D. J. (1998). The distribution of polycomb-group proteins during cell division and development in Drosophila embryos: impact on models for silencing. J Cell Biol 141, 469481.

15. Byrd, K. N., and Shearn, A. (2003). ASH1, a Drosophila trithorax group protein, is required for methylation of lysine 4 residues on histone H3. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11535-11540.

16. Cai, H., and Levine, M. (1995). Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo. Nature 376, 533- 536

17. Cai, H. N., and Shen, P. (2001). Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. Science 291,493-495.

18. Cao, R., Tsukada, Y. I., and Zhang, Y. (2005). Role of Bmi-1 and RinglA in H2A Ubiquitylation and Hox Gene Silencing. Mol Cell 20, 845-854.

19. Cao, R., and Zhang, Y. (2004). The functions of E(Z)/EZH2-mediated methylation of lysine 27 in histone H3. Curr Opin Genet Dev 14, 155-164.

20. Cavalli, G., and Paro, R. (1998). The Drosophila Fab-7 chromosomal element conveys epigenetic inheritance during mitosis and meiosis. Cell 93, 505-518.

21. Cavarec, L., Jensen, S., and Heidmann, T. (1994). Identification of a strong transcriptional activator for the copia retrotransposon responsible for its differential expression in Drosophila hydei and melanogaster cell lines. Biochem Biophys Res Commun 203, 392-399.

22. Celniker, S. E., and Drewell, R. A. (2007) Chromatin looping mediates boundary element promoter interactions. Bioessays 29(1), 7-10.

23. Chambeyron, S., and Bickmore, W. A. (2004). Does looping and clustering in the nucleus regulate gene expression? Curr Opin Cell Biol 16(3), 256-262.

24. Chen, S., and Corces, V. G. (2001). The gypsy insulator affects chromatin structure in a directional manner. Genetics 159(4), 1649-1658

25. Chung, J. H., Whiteley, M., and Felsenfeld, G. (1993). A 50 element of the chicken betaglobin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila. Cell 74, 505-514

26. Cleard, F., Moshkin, Y., Karch, F., and Maeda, R. K. (2006). Probing longdistance regulatory interactions in the Drosophila melanogaster bithorax complex using Dam identification. Nat Genet 38, 931-935.

27. Comet, I., Savitskaya, E., Schuettengruber, B., Nègre, N., Lavrov, S., Parshikov, A., Juge, F., Gracheva, E., Georgiev, P., and Cavalli, G. (2006). PRE-mediated bypass of two Su(Hw) insulators targets PcG proteins to a downstream promoter. Dev Cell 11, 117-124.

28. Cuvier, O., Hart, C. M., and Laemmli, U. K. (1998). Identification of a class of chromatin boundary elements. Mol Cell Biol 18, 7478-86.

29. Dean, A. (2004). Chromatin remodelling and the interaction between enhancers and promoters in the beta-globin locus. Brief Funct Genomic Proteomic 2, 344-354.

30. Dejardin, J., and Cavalli, G. (2004). Chromatin inheritance upon Zestemediated Brahma recruitment at a minimal cellular memory module. EMBO J 23, 857-868.

31. Dejardin, J., Rappailles, A., Cuvier, O., Grimaud, C., Decoville, M., Locker, D., and Cavalli, G. (2005). Recruitment of Drosophila Polycomb group proteins to chromatin by DSP 1. Nature 434, 533-538.

32. Dellino, G. I., Schwartz, Y. B., Farkas, G., McCabe, D., Elgin, S. C., and Pirrotta, V. (2004). Polycomb silencing blocks transcription initiation. Mol Cell 13, 887-893.

33. de Napoles, M., Mermoud, J.E., Wakao, R., Tang, Y.A., Endoh, M., Appanah, R., Nesterova, T.B., Silva, J., Otte, A.P., Vidal, M., Koseki, H., and Brockdorff, N. (2004). Polycomb group proteins RinglA/B link ubiquitylation of histone H2A to heritable gene silencing and X inactivation. Dev. Cell 7, 663-676.

34. Donze, D., and Kamakaka, R. T. (2001). RNA polymerase III and RNA polymerase II promoter complexes are heterochromatin barriers in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J 20, 520-531.

35. Dorn, R., Krauss, V., Reuter, G., and Saumweber, H. (1993). The enhancer of position-effect variegation of Drosophila, E(var)3-93D, codes for a chromatin protein containing a conserved domain common to several transcriptional regulators. Proc Natl Acad Sci USA 90, 11376-11380.

36. Dou, Y., Milne, T. A., Tackett, A. J., Smith, E. R., Fukuda, A., Wysocka, J., Allis, C. D., Chait, B. T., Hess, J. L., and Roeder, R.G. (2005). Physical association and coordinate function of the H3 K4 methyltransferase MLL1 and the H4 K16 acetyltransferase MOF. Cell 121, 873-885.

37. Engel, J. D. (1993). Developmental regulation of human beta-globin gene transcription: a switch of loyalties? Trends Genet 9:304-309.

38. Ficz, G., Heintzmann, R., and Arndt-Jovin, D. J. (2005). Polycomb group protein complexes exchange rapidly in living Drosophila. Development 132, 3963-3976.

39. Fitzgerald, D. P., and Bender, W. (2001). Polycomb group repression reduces DNA accessibility. Mol Cell Biol 21, 6585-6597.

40. Francis, N. J., Kingston, R. E., and Woodcock, C. L. (2004). Chromatin compaction by a Polycomb group protein complex. Science 306, 1574—1577.

41. Francis, N. J., Saurin, A. J., Shao, Z., and Kingston, R. E. (2001). Reconstitution of a functional core Polycomb repressive complex. Mol Cell 8, 545-556.

42. Furuyama, T., Banerjee, R., Breen, T. R., and Harte, P. J. (2004). SIR2 is required for polycomb silencing and is associated with an E(Z) histone methyltransferase complex. Curr.Biol 14,1812-1821.

43. Galloni, M., Gyurkovics, H., Schedl, P., and Karch, F. (1993). The bluetail transposon: evidence for independent cis-regulatory domains and domain boundaries in the bithorax complex. EMBO J 12, 1087-1097.

44. Gartenberg, M. R., Neumann, F. R., Laroche, T., Blaszczyk, M., and Gasser, S. M. (2004). Sir-mediated repression can occur independently of chromosomal and subnuclear contexts. Cell 119, 955-967.

45. Gaszner, M., Vazquez, J., and Schedl, P. (1999). The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction. Genes Dev 13,2098-2107.

46. Gdula, D. A., Gerasimova, T. I., and Corces, V. G. (1996). Genetic and molecular analysis of the gypsy chromatin insulator of Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA 93, 9378-9383.

47. Geyer, P. K., and Corces, V. G. (1992). DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev 6,1865-1873.

48. Gerasimova, T. I., Byrd, K., and Corces, V. G. (2000). A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA. Mol Cell 6, 1025-1035.

49. Gerasimova, T. I., and Corces, V. G. (1996). Boundary and insulator elements in chromosomes. Curr Opin Genet Dev 6(2), 185-192.

50. Gerasimova, T. I., Gdula, D. A., Gerasimov, D. V., Simonova, O., and Corces, V. G. (1995). A Drosophila protein that imparts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation. Cell 82, 587- 597

51. Ghosh, D., Gerasimova, T. I., and Corces, V. G. (2001). Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function. EMBO J 20,2518-2527

52. Grimaud, C., Bantignies, F., Pal-Bhadra, M., Ghana, P., Bhadra, U., and Cavalli, G. (2006). RNAi components are required for nuclear clustering of Polycomb group response elements. Cell 124(5), 957-971.

53. Hagstrom, K., Muller, M., and Schedl, P. (1996). Fab-7 functions as a chromatin domain boundary to ensure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex. Genes Dev 10, 3202-3215

54. Harrison, D. A., Gdula, D. A., Coyne, R. S., and Corces, V. G. (1993). A leucine zipper domain of the suppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on enhancer function. Genes Dev 7, 1966-1978

55. Hart, C. M., Cuvier, 0., and Laemmli, U. K. (1999). Evidence for an antagonistic relationship between the boundary element-associated factor BEAF and the transcription factor DREF. Chromosoma 108,375-383

56. Hart, C. M., Zhao, K., and Laemmli, U. K. (1997). The scs' boundary element: characterization of boundary element-associated factors. Mol Cell Biol 17, 999-1009

57. Hendrickson, J. E., and Sakonju, S. (1995). Cis and trans interactions between the iab regulatory regions and abdominal-A and abdominal-B in Drosophila melanogaster. Genetics 139, 835-848.

58. Hernandez-Munoz, I., Taghavi, P., Kuijl, C., Neefjes, J., and van Lohuizen, M. (2005). Association of BMI1 with polycomb bodies is dynamic and requires PRC2/EZH2 and the maintenance DNA methyltransferase DNMT1. Mol Cell Biol 25,11047-11058.

59. Holdridge, C., and Dorsett, D. (1991). Repression of hsp70 heat shock gene transcription by the suppressor of hairy-wing protein of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol 11, 1894-1900

60. Hopmann, R., Duncan, D., and Duncan, I. (1995). Transvection in the iab-5,6,7 region of the bithorax complex of Drosophila: Homology independent interactions in trans. Genetics 139, 815-833.

61. Hsieh, J. J., Cheng, E. H., and Korsmeyer, S. J. (2003). Taspasel: a threonine aspartase required for cleavage of MLL and proper HOX gene expression. Cell 115, 293-303.

62. Hughes, C. M., Rozenblatt-Rosen, O., Milne, T. A., Copeland, T. D., Levine, S. S., Lee, J. C., Hayes, D. N., Shanmugam, K. S., Bhattacharjee, A., Biondi, C. A., Kay, G. F., Hayward, N. K., Hess, J. L., and Meyerson, M. (2004). Menin associates with a trithorax family histone methyltransferase complex and with the hoxc8 locus. Mol. Cell 13, 587-597.

63. Jack, J., and DeLotto, Y. (1995). Structure and regulation of a complex locus: the cut gene of Drosophila. Genetics. 139(4), 1689-1700.

64. Jack, J., Dorsett, D., Delotto, Y., and Liu, S. (1991). Expression of the cut locus in the Drosophila wing margin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer. Development. 113(3), 735-747.

65. Johnson, T. K., and Judd, B. H. (1979). Analysis of the cut locus of Drosophila melanogaster. Genetics. 92,485-502

66. Kahn, T. G., Schwartz, Y. B., Dellino, G. I., and Pirrotta, V. (2006). Polycomb complexes and the propagation of the methylation mark at the Drosophila Ubx gene. J. Biol. Chem. 281,29064-29075.

67. Kellum, R., and Schedl, P. (1991). A position effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains. Cell 64, 941-950

68. Kellum, R., and Schedl, P. (1992). A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. Mol Cell Biol 12,2424-2431

69. Kim, D. H., Villeneuve, L. M., Morris, K. V., and Rossi, J. J. (2006). Argonaute-1 directs siRNA-mediated transcriptional gene silencing in human cells. Nat Struct Mol Biol 13(9), 793-797.

70. Kim, T. H., Barrera, L. O., Zheng, M., Qu, C., Singer, M. A., Richmond, T. A., Wu, Y., Green, R. D., and Ren, B. (2005). A high-resolution map of active promoters in the human genome. Nature 436, 876-880.

71. King, I. F., Francis, N. J. and Kingston, R. E. (2002). Native and recombinant Polycomb group complexes establish a selective block to template accessibility to repress transcription in vitro. Mol Cell Biol 22, 7919-7928

72. Klymenko, T., Papp, B., Fischle, W., Kocher, T., Schelder, M., Fritsch, C., Wild, B., Wilm, M., and Muller, J. (2006). A Polycomb group protein complex with sequence-specific DNA-binding and selective methyllysine-1 binding activities. Genes Dev 20, 1110-1122.

73. Knezetic, J. A., Jacob, G. A., and Luse, D. S. (1988) Assembly of RNA polymerase II preinitiation complexes before assembly of nucleosomes allows efficient initiation of transcription on nucleosomal templates. Mol Cell Biol 8, 3114—3121.

74. Kuzmichev, A., Jenuwein, T., Tempst, P., and Reinberg, D. (2004). Different EZH2-containing complexes target methylation of histone HI or nucleosomal histone H3. Mol. Cell 14, 183-193.

75. Laybourn, P. J., and Kadonaga, J. T. (1992). Threshold phenomena and longdistance activation of transcription by RNA polymerase II. Science 257, 1682— 1685.

76. Lee, T. I., Jenner, R. G., Boyer, L. A., Guenther, M. G., Levine, S. S., Kumar, R. M., Chevalier, B., Johnstone, S. E., Cole, M. F., Isono, K., Koseki, H., Fuchikami, T., Abe, K., Murray, H. L., Zucker, J. P., Yuan, B., Bell, G. W., Herbolsheimer, E., Hannett, N. M., Sun, K., Odom, D. T., Otte, A. P., Volkert,

T. L., Bartel, D. P., Melton, D. A., Gifford, D. K., Jaenisch, R, and Young, R. A. (2006). Control of developmental regulators by polycomb in human embryonic stem cells. Cell 125, 301—313.

77. Lehmann, M. (2004). Anything else but GAGA: a nonhistone protein complex reshapes chromatin structure. Trends Genet. 20, 15-22.

78. Levine, S. S., Weiss, A., Erdjument-Bromage, H., Shao, Z., Tempst, P., and Kingston, R. E. (2002). The core of the Polycomb repressive complex is compositionally and functionally conserved in flies and humans. Mol Cell Biol 22, 6070-6078.

79. Li, H., Ilin, S., Wang, W., Duncan, E. M., Wysocka, J., Allis, C. D., and Patel, D. J. (2006). Molecular basis for site-specific read-out of histone H3K4me3 by the BPTF PHD finger of NURF. Nature 442, 91-95.

80. Lim, J. K., Simmons, M. J., Raymond, J. D., Cox, N. M., Doll, R. F., and Culbert T. P. (1983). Homologue destabilization by a putative transposable element in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A 80(21), 66246627.

81. Lin, Q., Chen, Q., Lin, L., and Zhou, J. (2004). The Promoter Targeting Sequence mediates epigenetically heritable transcription memory Genes Dev 18(21), 2639-2651.

82. Liu, S., McLeod, E., and Jack, J. (1991). Four distinct regions of the cut locus and their effect on cell type specification in Drosophila. Genetics 127,151-159.

83. Lu, L., and Tower, J. (1997). A transcriptional insulator element, the su(Hw) binding site, protects a chromosomal DNA replication origin from position effects. Mol Cell Biol 17, 2202-2206.

84. Mallin, D. R., Myung, J. S., Patton, J. S. and Geyer, P. K. (1998). Polycomb group repression is blocked by the Drosophila suppressor of Hairy-wing [su(Hw)] insulator. Genetics 148, 331-339.

85. Martin, C., Cao, R., and Zhang, Y. (2006). Substrate preferences of the EZH2 histone methyltransferase complex. J Biol Chem 281, 8365- 8370.

86. McCall, K., and Bender, W. (1996). Probes of chromatin accessibility in the Drosophila bithorax complex respond differently to Polycomb-mediated repression. EMBO J 15, 569-580.

87. Meneghini, M. D., Wu, M., and Madhani, H. D. (2003). Conserved histone variant H2A.Z protects euchromatin from the ectopic spread of silent heterochromatin. Cell 112, 725-736.

88. Mihaly, J., Barges, S., Sipos, L., Maeda, R., Cleard, F., Hogga, I., Bender, W., Gyurkovics, H., and Karch, F. (2006). Dissecting the regulatory landscape of the Abd-B gene of the bithorax complex. Development 133, 2983-2993.

89. Mihaly, J., Hogga, I., Barges, S., Galloni, M., Mishra, R. K, Hagstrom, K., Muller, M., Schedl, P., Sipos, L., Gausz, J., Gyurkovics, H., and Karch, F. (1998). Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex. Cell Mol. Life Sci 54, 60-70.

90. Mishra, R., and Karch, F. (1999). Boundaries that demarcate structural and functional domains of chromatin. J Biosci 24, 377-389.

91. Milne, T. A., Martin, M. E., Brock, H. W., Slany, R. K„ and Hess, J. L. (2005). Leukemogenic MLL fusion proteins bind across a broad region of the Hox a9 locus, promoting transcription and multiple histone modifications. Cancer Res 65, 11367-11374.

92. Mohd-Sarip, A., Cleard, F., Mishra, R. K., Karch, F., and Verrijzer, C. P. (2005). Synergistic recognition of an epigenetic DNA element by Pleiohomeotic and a Polycomb core complex. Genes Dev 19, 1755-1760.

93. Mohd-Sarip, A., van der Knaap, J. A., Wyman, C., Kanaar, R., Schedl, P., and Verrijzer, C. P. (2006). Architecture of a Polycomb Nucleoprotein Complex. Mol Cell 24, 91—100.

94. Mohd-Sarip, A., Venturing F., Chalkley, G. E., and Verrijzer, C. P. (2002). Pleiohomeotic can link polycomb to DNA and mediate transcriptional repression. Mol Cell Biol 22, 7473-7483.

95. Morgan, H. D., Sutherland, H. G., Martin, D. I., and Whitelaw, E. (1999). Epigenetic inheritance at the agouti locus in the mouse. Nat Genet 23, 314— 318.

96. Moshkin, Y. M., Alekseyenko, A. A., Semeshin, V. F., Spierer, A., Spierer, P., Makarevich, G. F., Belyaeva, E. S., and Zhimulev, I. F. (2001). The bithorax complex of Drosophila melanogaster: Underreplication and morphology in polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci USA 98, 570-574

97. Muller, J., and Kassis, J.A. (2006). Polycomb response elements andtargeting of Polycomb group proteins in Drosophila. Curr Opin Genet Dev 16; 476-484.

98. Muravyova, E., Golovnin, A., Gracheva, E., Parshikov, A., Belenkaya, T., Pirrotta, V., and Georgiev, P. (2001). Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. Science 291,495-498

99. Nakayama, J., Klar, A.J., and Grewal, S.I. (2000). A chromodomain protein, Swi6, performs imprinting functions in fission yeast during mitosis and meiosis. Cell 101, 307-317.

100. Negre, N., Hennetin, J., Sun, L. V., Lavrov, S., Bellis, M., White, K. P., and Cavalli, G. (2006). Chromosomal Distribution of PcG Proteins during Drosophila Development. PLoS Biol 4, el70.

101. Nepveu, A. (2001) Role of the multifunctional CDP/Cut/Cux homeodomain transcription factor in regulating differentiation, cell growth and development. Gene 270(1-2), 1-15.

102. Ohtsuki, S., and Levine, M. (1998). GAGA mediates the enhancer blocking activity of the eve promoter in the Drosophila embryo. Genes Dev 12, 33253330

103. Papp, B., and Muller, J. (2006). Histone trimethylation and the maintenance of transcriptional ONand OFF states by trxG and PcG proteins. Genes Dev 20, 2041-2054.

104. Petruk, S., Sedkov, Y., Riley, K. M., Hodgson, J., Schweisguth, F., Hirose, S., Jaynes, J. B., Brock, H. W., and Mazo, A. (2006). Transcription of bxd Noncoding RNAs Promoted by Trithorax Represses Ubx in cis by Transcriptional Interference. Cell 127,1209-1221.

105. Polyakov, V. Y., Zatsepina, O. V., Kireev, I. I., Prusov, A. N., Fais, D. I., Sheval, E. V., Koblyakova, Y. V., Golyshev, S. A., and Chentsov, Y. S. (2006). Structural-functional model of the mitotic chromosome. Biochemistry (Mosc) 71(1), 1-9.

106. Rakyan, V., and Whitelaw, E. (2003). Transgenerational epigenetic inheritance. Curr Biol 13, R6.

107. Rakyan, V. K., Preis, J., Morgan, H. D., and Whitelaw, E. (2001). The marks, mechanisms and memory of epigenetic states in mammals. Biochem J 356, 110.

108. Reynolds, P. A., Sigaroudinia, M., Zardo, G., Wilson, M. B., Benton, G. M., Miller, C. J., Hong, C., Fridlyand, J., Costello, J. F., and Tlsty, T. D. (2006). Tumor suppressor P16INK4A regulates polycombmediated DNA hypermethylation in human mammary epithelial cells. J Biol Chem 281, 24790-24802.

109. Ringrose, L., Ehret, H., and Paro, R. (2004). Distinct contributions of histone H3 lysine 9 and 27 methylation to locus-specific stability of polycomb complexes. Mol Cell 16, 641-653.

110. Roseman, R. R., Pirrotta, V., and Geyer, P. K. (1993). The su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects. EMBO J 12,435—442

111. Rusche, L. N., Kirchmaier, A. L., and Rine, J. (2003). The establishment, inheritance, and function of silenced chromatin in Saccharomyces cerevisiae. Annu Rev Bio - chem 72,481-516.

112. Sanchez-Eisner, T., Gou, D., Kremmer, E., and Sauer, F. (2006). Noncoding RNAs of Trithorax Response Elements Recruit Drosophila Ashl to Ultrabithorax. Science 311, 1118-1123.

113. Saurin, A. J., Shao, Z., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., and Kingston, R. E. (2001). A Drosophila Polycomb group complex includes Zeste and dTAFII proteins. Nature 412, 655-660.

114. Schlesinger, Y., Straussman, R., Keshet, I., Farkash, S., Hecht, M., Zimmerman, J., Eden, E., Yakhini, Z., Ben-Shushan, E., Reubinoff, B. E., Bergman, Y., Simon, I., and Cedar, H. (2006). Polycomb-mediated methylation on Lys27 of histone H3 pre-marks genes for de novo methylation in cancer. Nat Genet 39, 232-236.

115. Schlossherr, J., Eggert, H., Paro, R., Cremer, S. and Jack, R. S. (1994). Gene inactivation in Drosophila mediated by the Polycomb gene product or by position-effect variegation does not involve major changes in the accessibility of the chromatin fibre. Mol Gen Genet 243, 453-462.

116. Schmitt, S., and Paro, R. (2006). RNA at the steering wheel. Genome Biol 7, 218.

117. Schwartz, Y. B., Kahn, T. G., Nix, D. A., Li, X. Y., Bourgon, R., Biggin, M., and Pirrotta, V. (2006). Genome-wide analysis of Polycomb targets inDrosophila melanogaster. Nat Genet 38, 700-705.

118. Schweinsberg, S. E., and Schedl, P. (2004). Developmental modulation of Fab-7 boundary function. Development 131, 4743-4749.

119. Scott, K. S., and Geyer, P. K. (1995). Effects of the su(Hw) insulator protein on the expression of the divergently transcribed Drosophila yolk protein genes. EMBO J 14, 6258- 6627.

120. Scott, K. C., Taubman, A. D., and Geyer, P. K. (1999). Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength. Genetics 153, 787-798.

121. Shao, Z., Raible, F., Mollaaghababa, R., Guyon, J. R., Wu, C. T., Bender, W., and Kingston, R. E. (1999). Stabilization of chromatin structure by PRC1, a Polycomb complex. Cell 98, 37-46.

122. Schubert, D., Primavesi, L., Bishopp, A., Roberts, G., Doonan, J., Jenuwein, T., and Goodrich, J. (2006). Silencing by plant Polycombgroup genes requires dispersed trimethylation of histone H3 at lysine 27. EMBO J 25,4638-4649.

123. Schuettengruber, B., Chourrout, D., Vervoort, M., Leblanc, B., and Cavalli, G. (2007) Genome regulation by polycomb and trithorax proteins. Cell 128(4), 735-745.

124. Seto, H., Hayashi, Y., Kwon, E., Taguchi, O., and Yamaguchi, M. (2006) Antagonistic regulation of the Drosophila PCNA gene promoter by DREF and Cut. Genes Cells 11(5), 499-512.

125. Sigrist, C. J. and Pirrotta, V. (1997). Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by the Drosophila Polycomb response element (PRE) but allow trans interactions between PREs on different chromosomes. Genetics 147,209-221.

126. Smith, S. T., Petruk, S., Sedkov, Y., Cho, E., Tillib, S., Canaani, E., and Mazo, A. (2004). Modulation of heat shock gene expression by the TAC1 chromatin-modifying complex. Nature Cell Biol 6,162-167.

127. Spana, C., and Corces, V. G. (1990). DNA bending is a determinant of binding specificity for a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev 4, 1505-1515.

128. Studitsky, V. M. (1991). Allosteric mechanism of enhancer action? FEBS Lett 280, 5-7.

129. Sun, Z. W., and Allis, C. D. (2002). Ubiquitination of histone H2B regulates H3 methylation and gene silencing in yeast. Nature 418, 104-108.

130. Sung, S., He, Y., Eshoo, T. W., Tamada, Y., Johnson, L., Nakahigashi, K., Goto, K., Jacobsen, S. E., and Amasino, R. M. (2006). Epigenetic maintenance of the vernalized state in Arabidopsis thaliana requires LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1. Nat Genet 38, 706-710.

131. Tchurikov, N. A., Gerasimova, T. I., Johnson, T. K., Barbakar, N. I., Kenzior, A. L., and Geogiev, G. P. (1989). Mobile elements and transposition events in the cut locus of Drosophila melanogaster. Mol Gen Genet 219,241-248.

132. Terranova, R., Agherbi, H., Boned, A., Meresse, S., and Djabali, M. (2006). Histone and DNA methylation defects at Hox genes in mice expressing a SET domain-truncated form of Mil. Proc. Natl Acad Sci USA 103, 6629-6634.

133. Tchurikov, N. A., Gerasimova, T. I., Johnson T. K., Barbakar, N. I., Kenzior, A. L., and Geogiev, G. P. (1989). Mobile elements and transposition events in the cut locus of Drosophila melanogaster.Mol Gen Genet 219,241-248.

134. Tillib, S., Petruk, S., Sedkov, Y., Kuzin, A., Fujioka, M., Goto, T., and Mazo,

A. (1999). Trithorax- and Polycomb-group response elements within an Ultrabithorax transcription maintenance unit consist of closely situated but separable sequences. Mol Cell Biol 19, 5189-5202.

135. Tolhuis, B., de Wit, E., Muijrers, I., Teunissen, H., Talhout, W., van Steensel,

B., and van Lohuizen, M. (2006). Genome-wide profiling of PRC 1 and PRC2 Polycomb chromatin binding in Drosophila. Nat Genet 38, 694-699.

136. Udvardy, A., Maine, E., and Schedl, P. (1985). The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains. J Mol Biol 185, 341-358.

137. van der Knaap, J. A., Kumar, B. R., Moshkin, Y. M., Langenberg, K., Krijgsveld, J., Heck, A. J., Karch, F., and Verrijzer, C. P. (2005). GMP synthetase stimulates histone H2B deubiquitylation by the epigenetic silencer USP7. Mol Cell 17, 695-707.

138. Vazquez, J.,and Schedl, P. (2000). Deletion of an insulator element by the mutation facet-strawberry in Drosophila melanogaster. Genetics. 155, 12971311.

139. Vazquez, J., and Schedl, P. (1994). Sequences required for enhancer blocking activity of scs are located within two nucleasehypersensitive regions. EMBO J 13,5984-5993.

140. Vire, E., Brenner, C., Deplus, R., Blanchon, L., Fraga, M., Didelot, C., Morey, L., Van Eynde, A., Bernard, D., Vanderwinden, J. M., Bollen, M., Esteller, M., Di Croce, L., de Launoit, Y., and Fuks, F. (2005). The Polycomb group protein EZH2 directly controls DNA methylation. Nature 439, 871-874.

141. Wang, H., Wang, L., Erdjument-Bromage, H., Vidal, M., Tempst, P., Jones, R. S., and Zhang, Y. (2004a). Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature 431, 873-878.

142. Wang, L., Brown, J. L., Cao, R, Zhang, Y., Kassis, J. A., and Jones, R. S. (2004b). Hierarchical recruitment of polycomb group silencing complexes. Mol Cell 14, 637-646.

143. Wysocka, J., Myers, M. P., Laherty, C. D., Eisenman, R. N., and Herr, W. (2003). Human Sin3 deacetylase and trithorax-related Setl/Ash2 histone H3-K4 methyltransferase are tethered together selectively by the cell-proliferation factor HCF-1. Genes Dev 17, 896-911.

144. Wysocka, J., Swigut, Т., Xiao, H., Milne, T. A., Kwon, S. Y., Landry, J., Kauer, M., Tackett, A. J., Chait, В. Т., Badenhorst, P., Wu, C., and Allis, C. D. (2006). A PHD finger of NURF couples histone H3 lysine 4 trimethylation with chromatin remodelling. Nature 442, 86-90.

145. Yusufzai, Т. M., Tagami, H., Nakatani, Y., and Felsenfeld, G. (2004). CTCF tethers an insulator to subnuclear sites, suggesting shared insulator mechanisms across species. Mol Cell 13, 291-298.

146. Zhao, K., Hart, С. M., and Laemmli, U. K. (1995). Visualization of chromosomal domains with boundary element-associated factor BEAF-32. Cell 81, 879-889.

147. Zhou, J., Barolo, S., Szymanski, P., and Levine, M. (1996). The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo. Genes Dev 10, 3195-3201.

148. Zhou, J., and Levine, M. (1999). A novel c/sregulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embryo. Cell 99, 567-575.

149. Zhimulev, I. F., Belyaeva, E. S„ Makunin, I. V., Pirrotta, V., Volkova, E. I., Alekseyenko, A. A., Andreyeva, E. N., Makarevich, G. F., Boldyreva, L. V., Nanayev, R. A., and Demakova, О. V. (2003). Influence of the SuUR gene on intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster polytene chromosomes. Chromosoma 111, 377-398.

150. Иванов, H. E. и Чуриков H. А. Локусконтролирующий район ( LCR) из локуса Cut дрозофилы активирует репортерный Lac-Z ген периодически. ДАН, 2001, том. 378 №3 С. 394-397.

151. Кретова О.В., Чуриков Н.А. О возможности происхождения короткого ретроэлемента дрозофилы - суффикса - от родственного длинного ретроэлемента - F-элемента. ДАН. 2005. том. 403 №6 С. 824-828.

152. Ратнер, В.А., Васильева, JI.A. Мобильные генетические элементы (МГЭ): «Эгоистическая ДНК» или функциональная часть генома? 11 Современные концепции эволюционной генетики // Ред. В.К.Шумный, А.Л. Маркель. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, С. 128-150. (2000)

153. Чуриков Н.А, Кензиор А.Л., Трубецкая Н,В и др. 1986. Молекулярное клонирование локуса cut Drosophila melanogaster. Докл. АН СССР Т. 286 №5 С.1257-1260

154. Чуриков Н.А, Павлова Г.В., Корочкин Л.И. и др. 1998. Обнаружение протяженного белок-связывающего домена в с1б-энхансерной области локуса cut дрозофилы Докл. АН Т. 363 №6 С.835-838.

Благодарности.

Автор работы выражает глубокую благодарность своему научному руководителю - Чурикову Николаю Андреевичу за всестороннюю поддержку и помощь, оказанные во время выполнения работы.

Выражаю искреннюю благодарность всему коллективу Лаборатории организации генома за помощь в проведении экспериментов и создание позитивной рабочей атмосферы.

Также выражаю особую признательность Якову Менделевичу Розовскому, предоставившему нашей лаборатории клеточную линию Schneider 2.

Информация о работе

Сосин, Дмитрий Витальевич
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Молекулярный анализ области LCR в локусе cut Drosophila melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Молекулярный анализ области LCR в локусе cut Drosophila melanogaster ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный анализ области LCR в локусе cut Drosophila melanogaster"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сосин, Дмитрий Витальевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярный анализ области LCR в локусе cut Drosophila melanogaster"

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Сосин, Дмитрий Витальевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярный анализ области LCR в локусе cut Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология