Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и молекулярно-генетическое исследование летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение и молекулярно-генетическое исследование летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 577.21:595.773.4

Модестова Елена Андреевна

ПОЛУЧЕНИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕТАЛЬНЫХ МУТАЦИЙ ГЕНА ЬЕО-ЛЯ15ТЛ-Я'тОСОМРЬЕХ У ВЯОБОРШЫ MELЛNOGЛSTER

03.00.26 - молекулярная генетика

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2005

Работа выполнена в лаборатории нейрогенетики и генетики развития Института биологии гена РАН

Научные руководители:

член-корреспондент РАН, доктор медицинских

наук, профессор Л. И. Корочкин

кандидат биологических наук О. Б. Симонова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Б. А. Кузин кандидат биологических наук Н. М. Груздева

Ведущая организация:

Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Защита диссертации состоится 27 мая 2005 г. в 12.00 на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан 27 апреля 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного соцрга канд.

ертационного соарта г> фарм. наук СОВ^^^бе^

Гвабовская Л.С.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Проблема получения достаточного количества мутаций при изучении функционирования генома дрозофилы много лет не теряет своей актуальности. Активное секвенирование генома дрозофилы и компьютерный анализ показывают наличие множества открытых рамок считывания, выявляют гомологии последовательностей. Но эти методы в настоящий момент позволяют лишь строить предположения, какие процессы затрагиваются ими in vivo. Мутагенез с одной стороны и молекулярные данные о структуре ДНК, синтезе белков и регуляции экспрессии позволяют соединить молекулярный и организменный уровни изучения работы генов.

Ранее был открыт новый транс-регуляторный ген дрозофилы - leg-arista-wing complex (lawc), мутации которого нарушают правильную экспрессию многих локусов, в частности, пронейральных achaete и scute генов и гомеобокссодержащего локуса cut. Ряд фактов указывает на непосредственную роль нового локуса как в органогенезе, так и в раннем эмбриогенезе дрозофилы: одним из многочисленных фенотипических признаков его мутаций явилась гомеозисная трансформация аристы в элементы тарзуса; небольшая делеция в области экзона вызывает нарушение финальных этапов пролиферации клеток крылового имагинального диска, приводя к сильным аномалиям развития торакса дрозофилы.

Район локализации гена lawc (7E район цитологической карты X-хромосомы дрозофилы) содержит блок нескольких леталей, порядок и функциональная значимость которых до сих пор не установлена. Все они являются точечными, что сильно осложняет клонирование соответствующих генов. Поэтому открытие видимых, инсерционных мутаций в "летальных зонах" генома дает возможность молекулярно и генетически исследовать структуры и функции подобных областей.

По предварительным молекулярным данным, основной транскрипт гена lawc имеет большие размеры (более 9 т.н.). В настоящий момент у дрозофилы известно мало локусов, имеющих транскрипты подобного размера, и все они имеют очень сложную структуру. Поэтому новый локус

является уникальной моделью для изучения функциональных особенностей сложно организованных локусов.

Цель работы.

Целью настоящей работы являлось:

• Создание генетической системы скрещиваний, позволяющей эффективно получать мутации в различных районах Х-хромосомы.

• Получение коллекции мутантов в исследуемом районе и её молекулярно-генетический скрининг.

• Выявление генетических взаимодействий lawc с другими генами и районами генома дрозофилы.

• Подавление экспрессии lawc при помощи химерного белка Р-Рп.

• Детализация фенотипического проявления /awe-мутаций.

Научная новизна и практическая ценность.

В данной работе помимо сугубо прикладной задачи - создания коллекции мутаций, была решена более глобальная проблема - увеличение эффективности мутагенеза у дрозофилы. Разработанная генетическая система позволяет с высокой частотой проводить мутагенез у Drosophila melanogaster в Х-хромосоме. Она была с успехом опробована для получения мутаций в гене leg-arista-wing complex, в то время как стандартными методами добиться успеха не удавалось. С помощью Саузерн-блот анализа мы установили молекулярную природу полученных мутаций. Впервые выявлены межгенные взаимодействия lawc с рядом генов и делециями, для чего применялась коллекция линий Deficiency Kit. Также с успехом применена пионерская методика инактивации генов при помощи химерного белка Р-Ph, разработанная в лаборатории П.Г. Георгиева (ИБГ РАН), и проведено снижение транскрипции в исследуемом нами районе, подтверждающее эффективность метода.

Апробация работы.

Результаты работы докладывались на 40-й, 41-й, 42-й, 44-й, 46-й Ежегодных исследовательских конференциях по дрозофиле (Сиэтл, 1999 г.,

Питтсбург, 2000 г., Вашингтон, 2001, Чикаго, 2003 г., Сан-Диего, 2005 г.), на I и II Международных симпозиумах (Новосибирск, 1999, 2000 гг.), на 16№ Европейской исследовательской конференции по дрозофиле (Цюрих, 1999 г.), VI и VII Всероссийских школах молодых учёных «Актуальные проблемы нейробиологии» (Казань, 1999, 2000 гг.), Международном симпозиуме памяти академика Павлова «Механизмы адаптивного поведения» (Санкт-Петербург, 1999г), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология», (Москва-Минск, 2001) и международной конференции «Молекулярная генетика эукариот» (Москва, 2003).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ (3 статьи и 13 тезисов).

Структура диссертации.

Диссертация содержит 123 страницы машинописного текста и состоит из «Введения», «Обзора литературы», «Материалов и методов», «Результатов и обсуждения», «Выводов», «Заключения» и «Списка цитируемой литературы» (69 ссылок). Диссертация содержит 25 рисунков, 6 таблиц и 1 приложение.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Ранее подробно описанные фенотипические изменения у \awc-мутантов основывались на множестве гетерогенных аллелей, полученных в системе нестабильности. Мы не могли с точностью быть уверены в том, что изучаемые мутации не сопровождаются изменениями в других локусах, и что эти мутации не влияют на фенотип особей.

Так, наиболее сильная трансформация аристы наблюдалась при работе с эмбриональной леталью 1(1)ЕР520 (синоним /аитс^520) у гетерозиготных полулетальных самок В гетерозиготе

аллели !аша не комплементируют, сочетание слабой жизнеспособной и

з

сильной летальной мутаций приводит к сильным морфологическим изменениям (включая гомеозисную трансформацию аристы) и снижению жизнеспособности. Имевшаяся в мировой коллекции EMS-индуцированная мутация l(1)EF520 ранее считалась единичной. Тем не менее, когда мы вплотную занялись изучением линии, несущей l(1)EF520, оказалось, что в ней присутствует не одна, а целый комплекс мутаций, локализованных в X-хромосоме. Используя для дупликационного картирования, мы

обнаружили, что наличие в аутосоме дупликации по исследуемому району не обеспечивает выживания особей l(1)EF520/Y; Dp(1;2)sn*72d/+. Далее, получая кроссоверных особей с целью ввести в хромосому с более

удобные маркеры, мы часто получали Х-хромосомы с леталями, комплементирующими с аллелями lawc, и эти мутации опять же выходили за пределы дупликации. На основе генетических данных нами было сделано предположение, что в исходной линии существует как минимум 3 летальные мутации, в том числе и в исследуемом локусе. Так как EMS чаще всего индуцирует точечные мутации, их картирование затруднено, и постановка корректных экспериментов с линией l(1)EF520/FM7c была признана нами невозможной. Отсутствиелетальных мутаций затрудняло дальнейшую работу.

С целью изучения получения единичных летальных мутаций в исследуемом локусе, мы:

1) провели работу по получению летальных мутаций;

2) изучили модельную систему со снижением транскрипционной активности в линии со слабой мутацией (так называемая репрессия при помощи химерного белка Р-РН, данная система функционально заменяет мутагенез).

Получение летальных мутаций.

Мутагенез проводили в условиях Р-М-гибридного дисгенеза при помощи разработанной в лаборатории методики, предотвращающей репарацию разрывов по механизмам гомологичной рекомбинации или конверсии после вырезания копии Р-элемента (рис. 1).

анализ полученных в F3 линий

Рисунок 1. Схема скрещиваний при проведении мутагенеза, iawcf1 -

исходный слабый аллель, стрелками обозначена инсерция Р-элементов, й2-3 - не способный перемещаться Р-элемент, кодирующий трнаспозазу, Sb -маркерная мутация Stubble, TM3, FM4 - балансерные хромосомы, утолщенная линия обозначает материал Y-хромосомы, вопросом обозначена хромосома, в которой могли возникнуть мутации.

Рисунок 2. Генотип самок F3 (детализировано): YS - короткое плечо У-хромосомы, YL - длинное плечо У-хромосомы, у*, у, В , f — маркеры транслокации, cf — маркерХ-хромосомы с Р-элементом, Д2-3 - не способный перемещаться Р-элемент, кодирующий трнаспозазу, Sb - маркерная мутация Stubble, треугольником со стрелками обозначено место инсерции Р-элемента, кружками обозначены центромеры.

Идея эксперимента заключалась в дестабилизации Р-элемента у особей, гомологичные Х-хромосомы которых несли: одна - встройку Р-элемента в интересующем районе, а другая - разрыв в той же самой, или близлежащей области (рис 2). У мутанта /э^с"' единственная потенциально активная копия Р-элемента изначально находилась в районе гена lawа [7Е5-11], а оппозитная хромосома несла разрыв в прилежащем районе [7Е2-3] и транслокацию по месту разрыва плеч У-хромосомы Т( 1;У)Ш31. Результаты мутагенеза представлены в таблице 1. Хотя мы ожидали большой стабильности от всех полученных линий, тем не менее, часть линий, в которых были обнаружены летальные мутации, в дальнейшем мутировала с восстановлением жизнеспособности. Мы не акцентировали внимание на этих процессах, так как нашей задачей было получение именно стабильных мутаций, позволяющих проводить длительные эксперименты. Фенотипически самцы с прошедшей через систему дисгенеза Х-хромосомой представляли весь спектр /аиа-мутантного фенотипа - от полной летальности до реверсии к дикому типу.

Таблица 1. Результаты мутагенеза.

Общее количество индивидуальных линий, полученых от самок F3 1147

Число полученных летальных мутаций 93 (8% от общего количества)

Число распавшихся линий 11

Число проанализированных леталей (дупликационное картирование) 82

Число леталей, выживающих при введении в геном дупликации Ор(1;2)8П*™ 33 (40% от тестированных линий)

В целом примененная нами схема скрещиваний подходит для получения мутаций в большинстве локусов Х-хромосомы йговорЬИа те1аподаэ1ег. Транслокации плеч У-хромосомы по месту разрывов в X-хромосоме отнюдь не единичны, их насчитывается более 300. Можно

рекомендовать примененную нами схему скрещиваний для эффективного локусспецифичного мутагенеза без применения ионизирующего излучения.

Для отнесения полученных летальных мутаций к определенному цитологическому району мы использовали дупликационное картирование. Как правило, наличие в геноме дупликации по району рецессивной летальной мутации восстанавливает жизнеспособность исследуемого класса. Таким образом, при совмещении в одном геноме летальной хромосомы и хромосомы с дупликацией должны были выживать самцы с летальной хромосомой, если леталь совпадала с районом дупликации.

Используемая нами дупликация при совмещении с сильными мутациями восстанавливает нормальный фенотип. Единственная ранее доступная летальная мутация !(1)ЕР520, являющаяся аллельным вариантом ¡аша, не выживала в присутствии дупликации, и для линии из мировой коллекции была показана множественность мутаций.

Значительная часть протестированных нами линий (40%) характеризовалась летальными мутациями, не выходящими за пределы дупликации.

Молекулярная природа полученных мутаций

Исходная мутация 1аи/с?1 представляет собой инсерцию 2 тандемно расположенных копий неполноразмерного Р-элемента/ Мы ожидали обнаружить полную эксцизию Р-элементов, изменение их копийности, а также возникновение делеций, возникающих за счет расширения бреши при эксцизии. Все мутации исследовались в гетерозиготе с хромосомой-балансером, содержащей интактный аллель, поэтому мы легко могли идентифицировать появление отличных от дикого типа полос, но в случае делеций, полностью затрагивающих область зонда, изменения будут не видны. В таких случаях эти аллели дополнительно тестировались в гетерогзиготе с аллелем у которого анализируемый район отличался

по размеру от дикого типа благодаря инсерции двойной копии Р-элемента.

Были проанализированы районы гена, лежащие в непосредственной близости к месту инсерции Р-элемента, а также прозондирована область, расположенная примерно в 10 т.п.н. от исходной вставки и кодирующая ОРС гена ГЯР2 (рис. 3).

Рисунок 3. Рестриктная карта района /awc. Треугольниками показаны инсерции Р-элемента, вертикальной волнистой чертой - разрыв карты длиной 7 т.п.н., Est, p1.1, Iawc6 и TRF2 - использованные зонды, серой стрелкой обозначен район ближайшей предполагаемой рамки считывания (ген TRF2), черным прямоугольником и штриховкой - делеции, двойной линией и пунктиром — инверсии, цифры справа от различных типов перестроек соответствуют номерам мутантных линий.

Рестрикция Sal I и гибридизация с зондом Est дает полосы ~2,3 и -3,0 т.п.н. в контроле, и на уровне ~3,0 и ~4,0 т.п.н. - у исходной мутации lawC1. Появление на фильтре дополнительных полос размером ~8.0 т.п.н. после гибридизации с зондом Est при обработке ДНК рестриктазой Sal I позволяло предположить пространственное разнесение последовательностей зонда, т.е. перестройку района по типу инверсий. На основании результатов гибридизации часть линий была отобрана для дальнейших генетических экспериментов. Для линий с аллелями I(1)lawc181(1)lawc21 и I(1)lawc54 была проведена дестабилизация имеющихся в линии Р-элементов с целью получить реинверсии и восстановить жизнеспособность особей (см. ниже).

Гибридизация фильтров с рестрицированной при помощи EcoR I ДНК с зондом р1.1 также оказалась очень информативной, так как именно область этого зонда совпадала с локализацией исходной вставки Р-элементов. В норме гибридизуется фрагмент ~1.0 т.п.н., у дестабилизируемой мутации

Таблица 2. Возникшие в линиях перестройки (обобщенный анализ результатов гибридизации по Саузерну).

Инверсии Делеции Изменение размера исходной вставки Изменения не обнаружены

I(1)lawc18 I(1)lawc21 I(1)lawc32 I(1)lawc33 I(1)lawc54 I(1)lawc43 I(1)lawc76 law<?1«2 I(1)lawc64 I(1)lawc68 I(1)lawc1 I(1)lawc2 I(1)lawc12 I(1)lawc26 l(1)lawc50 I(1)lawc57 l(1)lawc60 I(1)lawc67 l(1)lawc70 I(1)lawc76 I(1)lawc82 I(1)lawc4 I(1)lawc16 I(1)lawc19 I(1)lawc53 I(1)lawc66 I(1)lawc69 I(1)lawc72 I(1)lawc73 I(1)lawc75l( 1)lawc90

он утяжелен за счет наличия Р-элементов до ~3.6 т.п.н. Промежуточный вариант ~2.3 т.п.н. свидетельствовует о вырезании одной копии Р-элемента. Вырезание сайта рестрикции EcoR I у I(1)lawc43 I(1)lawc64 I(1)lawc68 приводит к объединению соседних рестриктных фрагментов в один и появлению тяжелых полос (5-6 т.п.н.), в этих случаях мы предположили наличие небольших делеций. Аллельные варианты, не дающие отличных от дикого типа полос, были дополнительно тестированы в гетерогзиготе с lawcf1, и для линии I(1)lawc76 было доказано наличие делеций, размером ~950 п.н. или больше.

Гибридизация с удаленными зондами Iawc6 и TRF2 (рестрикция по сайтам Hind 111 + BamH I, а также по EcoR I) не показала наличия видимых делеций или инсерций в рестриктных фрагментах.

Таким образом, разработанная система мутагенеза позволила получить коллекцию аллельных вариантов, имеющих структурные изменения в исследуемом районе, в том числе инверсии, делеций и инсерций. Рамка считывания ближайшего гена TRF2 при этом не затрагивалась. Однако дальнейшие генетические resgue-эксперименты с трансгенными конструктами, кодирующими домены гена TRF2, показали, что в ряде полученных нами линий (I(1)lawc19, I(1)lawc33, I(1)lawc43, I(1)lawc57, l(1)lawc60, I(1)lawc69, I(1)lawc73) восстанавливается выживаемость летального класса. Саузерн-блот гибридизация ДНК с меченым зондом района Р-элемента не выявила его копий в геноме трёх из этих аллелей

I(1)lawc19,1(1)lawc69,1(1)lawc73. Каких-либо перестроек в этих линиях также не было обнаружено. Возможно, данные мутации вызваны перестройками, выходящими за пределы использованных зондов, либо нарушения столь малы, что их невозможно определить методом блот-гибридизации по Саузерну.

Получение и анализ реинверсий и спонтанных мутаций

Инверсии, получившиеся в результате активизации мобильного генетического элемента, часто оказываются заключены между двумя его копиями. В таких случаях инверсии являются нестабильными и могут ревертировать к исходному состоянию.

Для того, чтобы доказать факт наличия инверсий в полученных нами линиях, мы провели повторную дестабилизацию линий I( 1)lawc18, I( 1)lawc21, I(1)lawc54. В результате для каждой инверсии было независимо получено по нескольку реинверсий, восстанавливающих жизнеспособность особей. Все они фенотипически были сходны с cflawcP1, за исключением lawc'8""' (производная I( 1)lawc18), где самцы часто имеют более сильно обрезанные и расставленные крылья, а также нарушения формирования аристы.

Помимо целенаправленного получения этих аллельных вариантов, мы не пренебрегли спонтанно возникшими в линии I(1)lawc2 жизнеспособным вариантом lawc2re", и в линии l(1)lawc60 - lawc60re". В настоящее время последний является наиболее сильной мутацией, сохраняющей жизнеспособность.

Репрессия экспрессии гена-мишени при помощи химерного белка P-Ph

Чтобы доказать главную роль Р-элемента в сложном плейотропном фенотипическом проявлении гена lawc, мы использовали репрессию транскрипции нашего гена in vivo при помощи системы химерного белка P-Ph. Этот белок, вырабатываемый мутантным аллелем гена polyhomeotic (рл), имеет домен, обладающий транспозазной активностью, что позволяет ему связываться с последовательностями Р-элементов (Р), и домен белка Polyhomeotic (Ph), который взаимодействует с белками группы Polycomb. Белки этой группы вызывают локальную конденсацию участков хроматина, делая его недоступным для других регуляторных факторов. В результате

эксперимента мы получили и исследовали экстремальные фенотипические проявления мутации гена \аша, а также продемонстрировали уменьшение уровня транскрипции этого локуса, опосредованное влиянием химерного белка P-Ph

Оказалось, что самцы характеризуются низкой

жизнеспособностью, усилением всех фенотипических проявлений мутации \аша, а гомозиготные самки ещё и стерильны Фенотипические изменения, вызывающиеся слабой мутацией \а^ат в присутствии химерного белка P-Ph, наглядно иллюстрирует рисунок 4

Рисунок. 4. Фенотипические изменения у компаундов р/^'/ажс?1, а -

торакальная часть кутикулы особей (отсутствие задних

дорзоцентральных щетинок показано стрелками), б - фай крыла (дикий тип), в - крыло особи с^/аи^сР*, г - антенна, стрелкой указана ариста (дикий тип), д - торакальная часть кутикулы особей ас^рИР^^сР'1 (нет редукции макрохет, дополнительные щетинки указаны стрелками), е - край крыла особей р№1 сР^сР!, ж - крыло о (р/7А?с/п&и,сй|*1 з -антенна особи (трансформированная членистая ариста указана стрелкой)

У мутантных мух наблюдалось усиление крыловых дефектов: расставленные крылья ( 0/сЛае?е-подобный фенотип), вырезки на крыле углубились и почти слились, приближая крылья отдельных особей к форме треугольника, аномалии распространились на наружный край крыла, выражаясь в наличии мелких вырезок, нарушении регулярного расположения щетинок (отсутствие микрохет, размывание паттерна, возникновение эктопических макрохет).

Усилилась степень трансформации аристы. У исходной линии аномалии на протяжении множества поколений сгладились, и в настоящее время едва заметны, в основном выражаются в слабом искривлении аристы. В присутствии химерного белка наблюдались аристы с заметным утолщением, возникновением членистых структур, завершающиеся характерным для лапки коготком.

Результаты генетических экспериментов были подтверждены при помощи Нозерн-блот анализа в лаборатории Ю.В. Ильина. Сравнивали уровень транскрипции гена lawc у дрозофил дикого типа, мутантов 1аи/сР1 и рЬРЬау/сР1. Тотальную РНК выделяли из самцов и гибридизовали с радиоактивным фрагментом (730 пн), соответствующим району гена lawc, куда встроилась копия Р-элемента. Было показано, что уровень транскрипции гена lawc в линии с инсерционной /awe-мутацией и продуцирующей химерный белок P-Ph ниже, чем просто в линии с инсерционной /awc-мутацией. Снижение транскрипции, очевидно, и привело к возникновению экстремальных фенотипических проявлений у инсерционных /^в-мутантов.

Нарушения в репродуктивной системе

Гомозиготные самки рИР^сР^сР^ оказались стерильны. Исследование яичников обнаружило наличие яиц у 3-5-дневных самок. Морфологический анализ репродуктивной системы самок показал аномальное развитие гонад - многоцистовость (когда в одной яйцевой камере развивается более одного овоцита). У самок 7-10-дневного возраста в яичниках наблюдается отсутствие ранних форм, т.е. созревание ограниченного числа овоцитов без их воспроизводства. Мы предполагаем, что мутация гена lawc приводит к нарушению дифференцировки стволовых

герминативных клеток, в силу чего у мутантных самок может развиваться только ограниченное количество яиц. Многоцистовость скорее всего вызвана неправильным развитием соматических фолликулярных клеток.

Следует отметить, что у мутантных самцов этой же линии (генотип ptfUawcP'/Y) наблюдается задержка в прохождении I мейотического деления, в семенниках накапливаются сперматоциты первого порядка, в семяприемниках обнаруживается небольшое количество спермы, и потомство эти особи оставляют, даже несмотря на сокращенную продолжительность жизни.

Стерильность самцов наблюдалась в экспериментах по поиску межгенных взаимодействий у компаундов law<f1e(y)1/Y. Она была вызвана нарушением дифференцировки герминативных клеток (сперматоцитов первого порядка) на стадии I мейотического деления. Сперматоциты II порядка у таких особей практически отсутствуют.

Поиск межгенных взаимодействий

Для изучения взаимодействия гена lawc с другими транс-регуляторными генами - факторами транскрипции группы enhancer of yellow -Taf40 (синоним е(у)1), е(у)2, е(у)3 при помощи кроссинговера были созданы генетические компаунды, содержащие комбинации жизнеспособных мутаций этих генов с мутацией по гену lawc. Оказалось, что совмещение мутаций по этим генам приводит либо к гибели или резкому снижению жизнеспособности (е(у)2, е(у)З), либо к нарушению фертильности полученных компаундов в сочетании со взаимоусилением мутантных признаков Taf40/e(y)1.

Чтобы обнаружить локусы, имеющие с геном lawc общую функциональную нагрузку, были проведены крупномасштабные генетические эксперименты по скринированию генома дрозофилы. Для этого мы использовали набор музейных линий (Deficiency Kit - более 400 линий), с делециями, в сумме перекрывающими значительную часть генома. Анализировались самцы ctPlawcPl/Y\ Df/+, несущие в гетерозиготе делеции

Таблица 3. Классификация описанных в «летальных» зонах генов, которые могут взаимодействовать с \awа.

Эндопептидазы убиквитарно-протеиноазного комплекса Факторы комплекса РНК-полимеразы II Гипотетические факторы комплекса РНК-полимеразы II Специфические факторы транскрипции и факторы, участвующие в компактизации хроматина Гены митоза

Pros3T MAT (TFIIH) net kis (kismet) - хеликаза Тор2 (Topoisomerase 2)

Dox-A2 (DiphenoloxidaseA2) Ss/7 (TFIIH) bsh (brain-specific homeobox) Top3a/pha (Topoisomerase 3a/pha) Vis (valois)

Pros5 Tfb4(TFIIH) E2f2( E2Ftranscription factor2) spir (spire) / организация и биогенез актиновых компонентов цитоскелета barr/конденсация хромосом

Pros20S-3t (Proteasome 20S3t subunit) Tfb2 (TFIIH) Mio (Mix interactor/ dia( diaphanous) /организация актиновых компонентов цитоскелета CG2508/анафаза митоза

subunitPros25 (Proteasome 25kD) Hay(TFIIH) crc (cryptocepha/), Df31( Decondensa tion factor 31)/ ремоделирование хроматина спп/сборка веретенаделения

Pros28.1 A/Pros! Taf60( TBP-associa ted factor 60kD)- TFIID Mistr(Mist1 -related) tsh (teashirt)-специфический фактор транскрипции (комплекс РНК-пол имеразы II) Sse (Separase)/ протеиназа, основнойбелок, контролирующий расхождение хромосом

Pros28.2 (Proteasome 28kD subunit 2) Taf150 (TBP-associated factor 150kD)-TFIID Bin (bin iou) lolal (lola like -) специфический фактор транскрипции (комплекс РНК-полимеразы II) С017498/чек-пойнт митотического веретенаделения

Rpn11 Taf11O(TBP-associated factor11OkD)-TFIID Jra (Jun-related antigen) MTF-1 - специфический фактор транскрипции (комплекс РНК-полимеразы II) Bj1 /конденсация митотических хромосом

Uch-L3/\(3)j2B8 (Ubiquitin C-terminal hydrolase) Taf30a (TBP-associa ted factor30kD)-TFIID vis( vismay) eIF-4E

Ubc47D (Ubiquitin- conjugating-enzyme- 47D) e(y) 1/Та f40 (TBP-associated factor40kD) -TFIID achi(achintya) Gap1

GammaTry (gammaTrypsin) Taf12L/Taf30-2(TBP-associated factor30kD subunit-2) )-TFIID bic( bicaudal)

Mdr49( Multidn/g resistance 49) -суперсемейство ААА-АТФаз Taf18(TBP-associated factor 18kD)-TFIID

или мутации в отдельных генах (опыт). Альтернативный класс самцов (контроль) был представлен особями, не несущими делеций или мутаций. Он идентифицировался по стандартным маркерным мутациям, характерным для аутосомных хромосом-балансеров. В результате были выявлены 15 «летальных» цитологических зон, содержащих локусы, возможно, участвующих с геном lawc в одних и тех же процессах: [21В6; 21В8], [25А2-3; 25А5], [37В; 37С1], [39E7-F1; 40А4], [46Е1-2; 46E1-F11], [47D1-2; 47D3], [49А1; 49А13], [49F15; 50С1], [55С1; 55D2-4], [64Е1-13; 65С], [66D10-11; 66Е], [67В1; 67D13], [75В8; 75F1], [86F1; 87В1-3], [92ВЗ; 92D3-6]. Среди известных генов, локализованных в этих районах много факторов как базовой, так и специфической транскрипции, а также генов, участвующих в протеолизе, в компактизации хроматина и правильном расхождении хромосом при митозе и мейозе (табл. 3).

Сами по себе делеций в гетерозиготе не вызывают гибели особей или сильных фенотипических нарушений. Таким образом, отклонения в скрещиваниях от стандартного расщепления или морфологические аномалии указывают на некие межгенные взаимодействия. Следует отметить, что мы не претендуем на обнаружение всех генов, задействованных в биохимически связанных процессах - это невозможно в силу ограниченности метода. Многие взаимодействия в принципе невозможно проследить, наблюдая мутации в гетерозиготном состоянии (применительно к нашим экспериментам, это означает, что отсутствие выявленных взаимодействий не означает их отсутствия вообще). Карта делеций, составляющих Deficiency Kit, перекрывает отнюдь не все цитологические районы. И, тем не менее, полученные данные важны для определения направления дальнейших исследований.

Так как среди генов, локализованных в «летальных» зонах было много транскрипционных факторов, мы провели подобный эксперимент с рядом мутаций в генах, кодирующих основные компоненты (транскрипционные факторы, TF), участвующие в базовой транскрипции с ТАТА-промоторов (TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIH, TATA-box binding protein (ТВР), и с мутациями группы генов taf(TBP associated factor) - taf30, taf60, tafWO, taf250 и т.д. Обнаружены следующие взаимодействия: Ssl1(H)

[79F5-6] - аномалия тергитов, микрохет и дорзоцентральных макрохет, Tfb4(H) [21E3-4] - слегка грубоватые глаза, слабое усиление трансформации аристы, hay [67E3-4] - сильная трансформация аристы с высокой пенетрантностью.

Было обнаружено, что в одних случаях происходит сильное взаимоусиление фенотипических признаков, даже приводящее к летальности компаундов (компоненты комплекса TFIIH и ряд генов семейства taf (taf30ct, taf40, taf60, taf11O, taf15O), в случае ТВР (ТАТА-binding protein) [57B7-10] происходит супрессия мутантного фенотипического проявления - аномалии формирования крыла,

расставленные крылья, а в остальных случаях никаких взаимодействий не наблюдалось (TFIIA, TFIIB, TFIIE, и ряд taf(taf30p, taf250 и др.). Данные суммированы в сводной таблице 4.

Таблица 4. Взаимодействие lawcP1 с мутациями и/или делециями ряда основных транскрипционных факторов РНК-полимеразы II.

Подчёркнуты локусы, мутации в которых приводят к летальному исходу на фоне lawcf1.

Сильные взаимодействия Нет взаимодействий

TFIIH (Ssl1, МАТ1 Tfb4, Tfb2, hay) е(у)2 e(v)3 TFIIE (TFIIEct, TFIIEP) TFIIB TFIID (TBP (TATA-binding protein))

Tafs (TBP-assosiated factors):

Taf60, Taf 150. Taf 110, Taf30a, e(v)1/Taf40 Taf250, Taf30p

Таким образом, взаимоусиление фенотипических мутантных признаков является надёжной гарантией того, что эти гены участвуют в одних и тех же процессах, в данном случае, продукт гена lawа участвует в процессе регуляции базовой транскрипции. Факт того, что взаимоусиление проявляется не со всеми компонентами, входящими в состав базовой

транскрипционной машины, говорит о том, что это участие, по-видимому, ограничивается определённым набором белок-белковых взаимодействий.

Считается, что основным и универсальным фактором базовой транскрипции является белок ТВР, связывающийся с ТАТА последовательностью, входящей в состав большинства промоторов. Совсем недавно у человека и дрозофилы обнаружены ещё 2 гена, продукты которых имеют структурное сходство ДНК-связывающего домена и, как полагают, выполняют схожую функцию, проявляя при этом некоторую тканевую специфичность. Это гены ТВР related factor 1 и 2 (Trf1 и Trf2). В настоящее время границы локализации гена Trf2 до конца не установлены. В частности, не известен район локализации начала его транскрипции (5' область). Анализ компьютерной базы данных, содержащей сиквенс генома дрозофилы показал, что часть последовательности гена lawc лежит на расстоянии примерно 10 т.п.н. от ОРС гена Trf2, в его 5' зоне. В предыдущих исследованиях мы выявили картину экспрессии гена lawc, которая выглядит довольно сложно, насчитывая до 13 вариантов транскриптов, три из которых лежат в области 12,5 тн, различаясь у самцов и самок. По данным Георгиевой С.Г. Нозерн-блот гибридизация этого же фильтра с зондами районов 77/2 и с зондом из «промежуточной» 10 т.п.н. области показал транскрипционный профиль, совпадающий с локализацией трёх крупных транскриптов гена lawc. Таким образом, было установлено, что ген lawc кодирует необыкновенно большой транскрипт, в состав которого, возможно, входит область гена 77/2, кодирующая ДНК-связывающий домен, гомологичный ТВР. Естественно, что такой ген может быть многофункционален. Одна из функций его продукта, возможно, - связывание с промоторами в процессе осуществления базовой транскрипции при участии РНК-полимеразы II, возможно, конкурируя с белком ТВР на ТАТА-промоторах.

выводы

1. Разработана генетическая система скрещиваний, позволяющая эффективно получать мутации в различных районах Х-хромосомы.

2. Получена коллекция летальных мутаций (33 линии) в районе гена leg-arista-wing complex, а также осуществлен молекулярно-генетический скрининг делеций и инверсий.

3. Выявлены 15 цитологических зон генома дрозофилы, содержащих локусы, взаимодействующие с геном lawc.

4. Обнаружены генетические взаимодействия lawc с базовыми и специфическими факторами транскрипции TFIIH {Ssl1, MAT1, Tfb4, Tfb2, hay), e(y)2, e(y)3, Taf60, Taf150, Taf110, Taf30a, e(y) 1/Taf40.

5. Проведено подавление экспрессии lawc при помощи химерного белка P-Ph.

6. Показано, что стерильность самок, мутантных по гену lawc, вызвана нарушением структуры яйцевых камер и созреванием ограниченного числа овоцитов без их воспроизводства.

7. Установлено, что стерильность самцов Iawc"'e(y)1/Y вызвана нарушением формирования сперматоцитов второго порядка.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. О. Simonova, T. Sukhoverkhova, E. Modestova, L. Korochkin. Olfactory and taste response of homeotic lawc mutants in D. melanogaster II 40th Annual Drosophila Research Conference. 1999. Sietle, USA. P. 589C.

2. O. Simonova, T. Sukhoverkhova, E. Modestova, L. Korochkin. Behavioral and molecular analysis ofhomeotic lawc mutants in D. melanogaster//International Simposium on X chromosom Inactivation in Mammals. Novosibirsk, Russia. 1999. P. 30-31.

3. О. Simonova, Т. Sukhoverkhova, E. Modestova, L. Korochkin. Olfactory and taste response of homeotic lawc mutants in D. melanogaster II 16th European Drosophila Research Conference. Zurich, Switzerland. 1999. P. 118.

4. Суховерхова Т.И., Симонова О.Б., Модестова ЕА, Корочкин Л.И. Исследование вкусовой и ольфакторной чувствительности у гомеозисных мутантов гена leg-arista-wing complex у D. melanogaster // Актуальные проблемы нейробиологии. VI Всероссийская школа молодых учёных. Казань, Россия. 1999. С. 111 - 112.

5. О. Simonova, Т. Sukhoverkhova, E. Modestova, L. Korochkin. Olfactory and taste response in homeotic lawc mutants in Drosophila melanogaster // International Symposium dedicated to Academician Ivan Pavlov's "Mechanisms ofAdaptive Behavior" St. Petersburg, Russia. 1999. P.70.

6. Simonova O., T. Sukhoverkhova, E. Modestova, L. Korochkin. Behavioral analyses ofhomeotic /awc-mutants in D. melanogaster //41st Annual Drosophila Research Conference. Pittsburgh, USA. 2000. P.a267.

7. Simonova O., T. Sukhoverkhova, E. Modestova, L. Korochkin. Behavioral analysis of homeotic lawc-mutants in D. melanogaster // Second International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. Novosibirsk, Russia.2000. P. 49.

8. Модестова Е.А., Суховерхова Т.И., Корочкин Л.И., Симонова О.Б. Анализ транскрипционной активности нового нейрогена дрозофилы leg-arista-wing complex и репрессия его транскрипции in vivo при помощи гибридного белка P-Ph // Актуальные проблемы нейробиологии. VII Всероссийская школа молодых учёных. Казань, Россия. 2000. С.71.

9. Павлова Г. В., Модестова Е. А., Венгрова С. П., Ефанов А. А., Рыбцова Н. Н., Корочкин Л. И. Экспрессия человеческого гена gdnf трансгенной линии Drosophila melanogaster//2001. ДАН, Т. 376, N 5. - С. 694-696.

10. Simonova O.B., Modestova EA, Sukhoverkhova T.I., Korochkin L.I. Analysis of the P-Ph protein-mediated repression of leg-arista-wing complex gene expression in Drosophila II 42nd Annual Drosophila Research Conference. Washington. USA.2001.P.al26.

11. E.A. Модестова, Л.И. Корочкин, О.Б. Симонова. Анализ экстремальных фенотипических проявлений гена leg-arista-wing complex после репрессии

его транскрипции in vivo у дрозофилы // Международный симпозиум «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология». Минск (Белорусия), Москва (Россия). 2001. С. 98.

12. Модестова Е.А., Копытова Д.В., Георгиева С.Г., Симонова О.Б. Использование генетической системы химерного белка P-Ph для репрессии транскрипции гена leg-arista-wing complex у дрозофилы. // Генетика. 2003. №5.С.713-716.

13. О. Simonova, E. Modestova. Identification of genes, involved in the same processes as leg-arista-wing complex. II 44th Annual Drosophila Research Conference. Chikago. USA. 2003. 33 ОС.

14. Modestova E., Mertsalov I., Kopytova D., Simonova O. LEG-ARISTA-WING COMPLEX: Destabilization of cytological region, analysis of mutant alleles, rescue experiments and screening od genes with related function // International conference "Molecular genetics ofeucariotes" Moscow. 2003. P. 13.

15. Simonova O., Modestova E., Vorontsova J., Korochkin L. leg-arista-wing complex mutations cause not only morphological abnormalities, but also chromosome non-disjunction. //46th Annual Drosophila Research Conference. San Diego. USA. 2005. 170B. P. 144.

16. Модестова Е.А., Ю.Е. Воронцова, Л.И.Корочкин, О. Б. Симонова. Получение летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у Drosophila melanogaster II ДАН, 2005, в печати.

Подписано в печать 28.04.2005 Объем 1.5 печ.л. Тираж 100 экз. Заказ № 77 ч

Отпечатано в ООО «Соцветие красок» '' Í ' 119992, г.Москва, Ленинские горы, д.I " "7 Главное здание МГУ, к. 102

'9 МЙЙ 2005

1018

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Модестова, Елена Андреевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Проблемы мутагенеза у дрозофилы.

1.1.1. Радиационный мутагенез.

1.1.2. Химический мутагенез.

1.1.3. УФ-индуцированный мутагенез.

1.1.4. Мобильные элементы как мутагенные факторы.

1.1.5. Р-М-гибридный дисгенез.

1.1.6. Система продленной нестабильности.

1.1.7. Супернестабильность.

1.1.8. «Горячие точки» при мутагенезе.

1.2. Использование генетической системы химерного белка P-Ph для репрессии транскрипции гена.

1.3. Характеристика гена leg-arista-wing complex.

1.3.1. Фенотип и картирование lawc-мутаций.

1.3.2. Исследование вкусовой и ольфакторной чувствительности у гомеозисных мутантов гена leg-aristae-wing complex у дрозофилы.

1.3.3. Взаимодействие leg-aristae-wing complex с различными генами.

1.4. Краткая характеристика различных аллелей гена lawc

1.5. Использование делеционного картирования для локализации мутаций и поиска межгенных взаимодействий.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Культивирование Drosophila melanogaster.

2.2. Генетические методы.

2.3. Биохимические методы.

2.4. Приготовление препаратов для микроскопии.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Поиск мутаций в мировой коллекции и их анализ.

3.2. Результаты мутагенеза.

3.3. Установление генотипа полученных леталей.

3.4. Дупликационное картирование.

3.5. Молекулярная природа полученных мутаций.

3.6. Получение и анализ реинверсий и спонтанных мутаций.

3.7. Репрессия экспрессии гена-мишени при помощи химерного белка P-Ph.

3.8. Нарушения в репродуктивной системе самок.

3.9. Нарушения в репродуктивной системе самцов.

3.10. Поиск межгенных взаимодействий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и молекулярно-генетическое исследование летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у Drosophila melanogaster"

Актуальность работы. Проблема получения достаточного количества мутаций при изучении функционирования генома дрозофилы много лет не теряет своей актуальности. Активное секвенирование генома дрозофилы и компьютерный анализ показывают наличие множества открытых рамок считывания, выявляют гомологии последовательностей. Но эти методы в настоящий момент позволяют лишь строить предположения, какие процессы затрагиваются ими in vivo. Мутагенез с одной стороны и молекулярные данные о структуре ДНК, синтезе белков и регуляции экспрессии позволяют соединить молекулярный и организменный уровни изучения работы генов.

Ранее был открыт новый гарсшс-регуляторный ген дрозофилы - leg-arista-wing complex (lawc), мутации которого нарушают правильную экспрессию многих локусов, в частности, пронейральных achaete и scute генов и гомеобокссодержащего локуса cut. Ряд фактов указывает на непосредственную роль нового локуса как в органогенезе, так и в раннем эмбриогенезе дрозофилы: одним из многочисленных фенотипических признаков его мутаций явилась гомеозисная трансформация аристы в элементы тарзуса; небольшая делеция в области экзона вызывает нарушение финальных этапов пролиферации клеток крылового имагинального диска, приводя к сильным аномалиям развития торакса дрозофилы.

Район локализации гена lawc (7Е район цитологической карты X-хромосомы дрозофилы) содержит блок нескольких леталей, порядок и функциональная значимость которых до сих пор не установлена. Все они являются точечными, что сильно осложняет клонирование соответствующих генов. Поэтому открытие видимых, инсерционных мутаций в "летальных зонах" генома дает возможность молекулярно и генетически исследовать структуры и функции подобных областей.

По предварительным молекулярным данным, основной транскрипт гена lawc имеет большие размеры (более 9 т.н.). В настоящий момент у дрозофилы известно мало локусов, имеющих транскрипты подобного размера, и все они имеют очень сложную структуру. Поэтому новый локус является уникальной моделью для изучения функциональных особенностей сложно организованных локусов.

Цель и задачи исследования. С учётом изложенного целью настоящей работы явилось получение и молекулярно-генетическое исследование летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у drosophila melanogaster.

Достижение указанной цели основывалось на решении следующих задач:

• Создание генетической системы скрещиваний, позволяющей эффективно получать мутации в различных районах Х-хромосомы.

• Получение коллекции мутантов в исследуемом районе и её молекулярно-генетический скрининг.

• Выявление генетических взаимодействий lawc с другими генами и районами генома дрозофилы.

• Подавление экспрессии lawc при помощи химерного белка P-Ph.

• Детализация фенотипического проявления /awe-мутаций.

Научная новизна и практическая ценность. В данной работе помимо сугубо прикладной задачи - создания коллекции мутаций, была решена более глобальная проблема - увеличение эффективности мутагенеза у дрозофилы. Разработанная генетическая система позволяет с высокой частотой проводить мутагенез у Drosophila melanogaster в X-хромосоме. Она была с успехом опробована для получения мутаций в гене leg-arista-wing complex, в то время как стандартными методами добиться успеха не удавалось. С помощью Саузерн-блот анализа мы установили молекулярную природу полученных мутаций. Впервые выявлены межгенные взаимодействия lawc с рядом генов и делециями, для чего применялась коллекция линий Deficiency Kit. Также с успехом применена пионерская методика инактивации генов при помощи химерного белка Р-Ph, разработанная в лаборатории П.Г. Георгиева (ИБГ РАН), и проведено снижение транскрипции в исследуемом нами районе, подтверждающее эффективность метода.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 40-й, 41-й, 42-й, 44-й, 46-й Ежегодных исследовательских конференциях по дрозофиле (Сиэтл, 1999 г., Питтсбург, 2000 г., Вашингтон, 2001, Чикаго, 2003 г., Сан-Диего, 2005 г.), на I и II Международных симпозиумах (Новосибирск, 1999, 2000 гг.), на 16th Европейской исследовательской конференции по дрозофиле (Цюрих, 1999 г.), VI и VII Всероссийских школах молодых учёных «Актуальные проблемы нейробиологии» (Казань, 1999, 2000 гг.), Международном симпозиуме памяти академика Павлова «Механизмы адаптивного поведения» (Санкт-Петербург, 1999г), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология», (Москва-Минск, 2001) и международной конференции «Молекулярная генетика эукариот» (Москва, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ (3 статьи и 13 тезисов).

Структура диссертации. Диссертация содержит 123 страницы машинописного текста и состоит из «Введения», «Обзора литературы», «Материалов и методов», «Результатов и обсуждения», «Выводов», «Заключения» и «Списка цитируемой литературы» (69 ссылок). Диссертация содержит 25 рисунков, 6 таблиц и 1 приложение.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Модестова, Елена Андреевна

ВЫВОДЫ

1. Разработана генетическая система скрещиваний, позволяющая эффективно получать мутации в различных районах Х-хромосомы.

2. Получена коллекция летальных мутаций (33 линии) в районе гена leg-arista-wing complex, а также осуществлен молекулярно-генетический скрининг делеций и инверсий.

3. Выявлены 15 цитологических зон генома дрозофилы, содержащих локусы, взаимодействующие с геном lawc.

4. Обнаружены генетические взаимодействия lawc с базовыми и специфическими факторами транскрипции TFIIH (Ssll, МАТ1, Tfb4, Tfb2, hay), e(y)2, e(y)3, Ta/60, Tafl50, Tafl 10, Tq/ЗОа, e(y)l/Taf40).

5. Проведено подавление экспрессии lawc при помощи химерного белка Р-Ph.

6. Показано, что стерильность самок, мутантных по гену lawc, вызвана нарушением структуры яйцевых камер и созреванием ограниченного числа овоцитов без их воспроизводства.

7. Установлено, что стерильность самцов law<f'e(y)l/Y вызвана нарушением формирования сперматоцитов второго порядка.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Припступая к циклу работ по организации и функционированию гена lawc, мы предполагали: изучить нарушения транскрипции в различных линиях со слабыми мутациями, в модельной системе на основе сайтспецифической рекомбинации дрожжей (система FLP-FRT) получить мозаичных особей, исследовать материнский эффект гена lawc и в заключение получить несколько сильных и летальных мутаций для дальнейших исследований.

Результаты первых экспериментов показали, что ранее полученные мутации фенотипически близки к дикому типу, и их проявление наблюдается лишь во взаимодействии с мутациями в других генах. Использованная при получении гомозиготных соматических клонов деталь l(l)EF520 оказалась комплексом никем не картированных мутаций, поэтому мы не могли объяснить наблюдавшиеся аномалии каким-либо одним фактором. Таким образом, проведение мутагенеза стало для нас жизненной необходимостью.

В основу работы легли рутинные и довольно объемные эксперименты по получению мутаций. Но совершенно неожиданно они выявили несколько новых и очень интересных направлений возможных исследований. Во-первых, примененная нами схема скрещиваний имеет самодостаточную ценность. Она оказалась настолько эффективной, что мы планируем опробовать её еще на нескольких генах, по которым в мировой коллекции нет удобных мутаций.

Во-вторых, в линиях с мутациями по гену lawc была крайне высока частота нерасхождения хромосом. С одной стороны, это создавало проблемы при синтезе линий, потому что, не имея маркеров в каждой хромосоме, мы не могли даже заменить одну балансерную хромосому другой, испытывали затруднения в корректном дупликационном картировании. С другой стороны, эти генетические данные служат прекрасным подтверждением наблюдавшихся на клеточном уровне аномалий: да, процесс деления нарушен, и нерасхождение хромосом типично для разных мутаций гена lawc. В «летальных» зонах генома дрозофилы, гетерозиготные делеции которых при совмещении со слабой /mvc-мутацией вызывают гибель особей, расположено много генов, контролирующих деление клеток. Получение из мировой коллекции мутантов по этим генам и детализация межгенных взаимодействий будет следующим этапом исследований в этом направлении.

В-третьих, летальные мутации из полученной коллекции мутантов исследуются фенотипически, для них установлены стадии летальности (как правило, эмбриональная), у погибших эмбрионов изучаются возникающие морфологические нарушения. Полученные данные позволяют нам предположить нарушение полярности эмбриона, недостаток белков, создающих передне-задний и дорзо-вентральный градиенты. Мы предполагаем продолжить исследования в этом направлении. На основе изучения фенотипов летальных эмбрионов уже написаны 1 курсовая и 2 дипломные работы.

В-четвертых, летальные мутации из полученной коллекции мутантов сейчас активно изучаются в rescue-тестах с применением трансгенных конструкций (совместная работа с группой С.Г. Георгиевой). Обнаружено несколько линий, в которых мутантные особи становятся жизнеспособными при введении трансгенных конструкций с последовательностью, кодирующей транскрипционный фактор TRF2. Но крайне низкая выживаемость особей во всех rescue-тестах, как с трансгенными конструктами, так и с протяженными дупликациями, указывают на выраженный материнский эффект. В пользу этого предположения свидетельствуют такие косвенные данные, как различия в транскрипции между самцами и самками, нарушения оогенеза у мутантов.

Мы планируем провести получение мозаиков в системе FLP-FRT по несколько видоизмененнной схеме с применением полученных летальных мутаций и трансгенных конструкций.

В целом настоящая диссертационная работа, решая ряд задач, ставит множество вопросов, одновременно давая средства к их разрешению и открывает широкие перспективы для дальнейших исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Модестова, Елена Андреевна, Москва

1. Ауэрбах, ILL, Проблемы мутагенеза, М., «Мир», 1978

2. Георгиев П.Г., Елагин В.А. Супернестабильные системы у Drosophila melanogaster. Анализ мутаций в локусе ocelliless. // Генетика. 1990. 26, №8, с.1416

3. Георгиев П.Г., Елагин В.А., Буфф Е.М., Колягин Н.П. Свойства супернестабильных мутаций в локусе yellow у Drosophila melanogaster.il Генетика. 1992. 28, №4, с.98

4. Георгиев П.Г., Симонова О.Б., Герасимова Т.И. Новый тип нестабильности генома у Drosophila melanogaster.ll Генетика, 26, №5, 1988, с. 867-876.

5. Головнин А.К., Георгиева С.Г., Георгиев П.Г. Механизм возникновения химерных мобильных элементов, вызывающих супернестабильные мутации у Drosophila melanogaster.И ДАН, 2000, 370, №3, с.420-424.

6. V 6. Дубинин Н.П., Пашин Ю.В. Мутагенез и окружающая среда, М., «Наука», 1978. 167 с.

7. Дубинин Н.П., Молекулярная генетика и действие излучений на наследственность. М., Госатомиздат, 1963. 231 с.

8. Елизаров Ю. А. Хеморецепция. В кн.: Руководство по физиологии органов чувств насекомых// М., Изд-во МГУ, 1977, С. 81-135.

9. Инге-Вечтомов С.Г., Введение в молекулярную генетику. М., Высшая школа, 1983, 343 с.

10. Ю.Ладвшценко А.Б., Могила В.А., Георгиев П.Г., и др. Супернестабильные системы у Drosophila melanogaster. Анализ мутаций в локусах singed и scute. // Генетика. 1990. 26, №7, с. 1133.

11. Лобашев М.Е., Генетика. Изд-во ДОЛГУ им. А.А. Жданова, 1967., 752с.

12. Медведев Н.Н. Практическая генетика. М., «Наука», 1966, 238с.

13. Окладнова О.В., Куфиттиг Ш., Новый тип локусспецифичной нестабильности у Drosophila melanogaster , не зависящий от Р-М гибридного дисгенеза.//Генетика, 1995, 31, №1, с. 54-59.

14. Петрук С.Ф., Джагаева И.В., Солдатов А.В., Симонова О.Б. Клонирование гена гена leg-arista-wing complex (lawc) и анализ его мутантных производных у дрозофилы. // Генетика, 1998, 34, №3, с. 446448.

15. Свидерский В. JL Основы нейрофизиологии насекомых // JI., Изд-во Наука, 1980.

16. Симонова О.Б., Петрук С.Ф., Джагаева И.В., Корочкин Л.И. Роль мутации lawc?1 в регуляции экспрессии локуса white у дрозофилы.// Генетика, 1998, т.34, №3, с. 349-354.

17. П.Симонова О.Б. Новый транс-регуляторный локус дрозофилы // Генетика. 2000. Т.36. N11. С. 1464- 1474.

18. Симонова О.Б., Кузин Б.А., Георгиев П.Г., Герасимова Т.И. Новая регуляторная мутация Drosophila melanodaster // Генетика. 1992. № 2. Т.28. С.164-167.

19. Симонова О.Б., Петрук С.Ф., Герасимова Т.И., Корочкин Л.И. Температурочувствительный период lawc?1-мутации у Drosophila melanodaster // Генетика. 1995. № 9. Т.31. С. 1243-1248.

20. Симонова О.Б., Суховерхова Т.И., Джансугурова Л.Б., Корочкин Л.И. Исследование вкусовой чувствительности у гомеозисных мутантов гена leg-aristae-wing complex у дрозофилы // Генетика. 2000. Т.36. N5. С.657 -665.

21. Ashburner М., Drosophila. A laboratory handbook. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 a. P. 1331.

22. Ashburner M., Drosophila. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 b., P. 434.

23. De Vries, H. The mutation theory/ Experiments and Observations on the Origin of Species in the Vegetable Kingdom // Open Court Publ. Co., Chicago, 1909, цит. по: Ауэрбах, 1978.

24. Demerec M. The behavior of mutable gene // Proc. V Intern. Congr. Genet. Berlin, 1927 P. 183, процитировано Окладновой и Куффитиг, 1995.

25. Engels W.R. The P family of transposable elements in Drosophila // Ann. Rev. Genet. 1983. V. 17. 315-344

26. Engels W.R., Benz W.K., Preston C.R., Graham P.L., Phillis R.W., Robertson H.M. Somatic effects of P element activity in Drosophila melanogaster: pupal lethality. //Genetics. 1987 Dec;l 17(4):745-57.

27. Evans D. R., Mellon D. Stimulation of primary tasreceptor by salt // J. gen. Physiol., 1962. V. 45. P. 651-661.

28. Engels W.R., Preston C.R. Formation of chromosome rearrangements by P factors in Drosophila. //Genetics. 1984 Aug;107(4):657-78.

29. Georgiev P.G., Kiselev S.L., Simonova O.B., Gerasimova T.I. A novel transposition system in Drosophila melanogaster depending on the Stalker mobile genetic element // EMBO J. 1990. V.9. N.7. P.2037-2034.

30. Golic K.G., Golic M M. Engineering the Drosophila genome: chromosome rearrangements by design. //Genetics. 1996 Dec; 144(4): 1693-711.

31. Hiraizumi Y. Spontaneous recombination in Drosophila melanogaster males.// Proc Natl Acad Sci USA. 1971 Feb;68(2):268-70.

32. Huynh J.-R., Johnston D.S. The origin of asymmetry: early polarisation of the Drosophila germline cyst and oocyte. // Curr. Biol. 2004, Vol. 14, pp. R438-R449.

33. Johnson and Judd. Analysis of the cut locus of Drosophila melanogaster II Genetics. 1979. V. 92. P. 485-502.

34. Jack J. W. Molecular organization of the cut locus of Drosophila melanogaster II Cell. 1985. V. 42. P. 869-876.

35. Karess R.E., Rubin G.M. Analysis of P transposable element functions in Drosophila.// Cell. 1984 Aug;38(l): 135-46.

36. Kidwell M.G. Reciprocal differences in female recombination associated with hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. //Genet Res. 1977 Aug;30(l):77-88.

37. Kidwell M.G. Transposable elements and the evolution of genome size in eukaryotes. //Genetica. 2002 May;115(l):49-63.

38. Lim J.K., Simmons M.J. Gross chromosome rearrangements mediated by transposable elements in Drosophila melanogaster.il BioEssays, 16, 4-April,1994, 269-275.

39. Lindsley, D.M., Grell, E.H. Genetic Variations of Drosophila melanogaster. Carnegie Institution of Washington Publication, Washington, 1972; P. 568.

40. Lindsley, D.M., Zimm, G., The genome of Drosophila melanogaster NY: Academic Press, Inc. 1992 P. 1134.

41. Morita H., Hidaka Т., Shiraihi A. Excitatory and inhibitory effects of salts on the sugar receptor of the flesnfly // Mem. Fac. Sci., Kyushu Univ. Series E (Biol.), 1966. V. 3. P. 81-87.

42. Neumann C. J. and Cohen S. M. A heirarchy of cross-regulation involving Notch, wingless, vestigial and cut organizes the dorsal/ventral axis of the Drosophila wing // Development. 1996. V. 122. P. 3477-3485.

43. Perrimon N, Engstrom L, Mahowald AP. Zygotic lethals with specific maternal effect phenotypes in Drosophila melanogaster. I. Loci on the X chromosome. //Genetics. 1989aFeb; 121(2):333-52.

44. Perrimon N, Smouse D, Miklos GL. Developmental genetics of loci at the base of the X chromosome of Drosophila melanogaster. И Genetics. 1989b Feb;121(2):313-31.

45. Pirrotta V. Polycomb silencing and the maintenance of stable chromatin states // Results Probl. Cell Differ. 1999. V.25. P.205-228.

46. Rasmusson K.E., Raymond J.D., Simmons M.J. Repression of hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster by individual naturally occurring P elements. // Genetics. 1993 Mar; 133(3):605-22.

47. Roiha H., Rubin G.M., O'Hare К. P element insertions and rearrangements at the singed locus of Drosophila melanogaster. // Genetics. 1988 May;l 19(1): 75-83.

48. Ronsseray S., Lehmann MAnxolabehere D. The maternally inherited regulation of P elements in Drosophila melanogaster can be elicited by two P copies at cytological site 1A on the X chromosome. // Genetics. 1991 0ct;129(2):501-12.

49. Rubin G.M., Kidwell M.G., Bingham P.M. The molecular basis of P-M hybrid dysgenesis: the nature of induced mutations. // Cell. 1982 Jul;29(3):987-94.

50. Ryder E., Russell S. Transposable elements as tools for genomics and genetics in Drosophila. // Briefing in Functional Genomic and Proteomic. 2003 Apr; 2(1):57-71.

51. Simonova О., T. Sukhoverkhova, E. Modestova, L. Korochkin. Behavioral and molecular analysis of homeotic lawc mutants in D. melanogaster // International Simposium on X chromosom Inactivation in Mammals. Novosibirsk, Russia. 1999a. P. 30-31.

52. Simonova О., T. Sukhoverkhova, E. Modestova, L. Korochkin. Olfactory and taste response of homeotic lawc mutants in D. melanogaster // 40th Annual Drosophila Research Conference. 1999b. Sietle, USA. P. 589C.

53. Simonova О., Т. Sukhoverkhova, Е. Modestova, L. Korochkin. Olfactory and taste response of homeotic lawc mutants in D. melanogaster // 16th European Drosophila Research Conference. Zurich, Switzerland. 1999c. P. 118.

54. Simonova O.B., Sukhoverkhova T.I., Jansugurova L.B., Korochkin L.I. Taste perception analysis in the leg-arista-wing complex homeotic mutants of Drosophila И Genetics (Russia). 2000a. V.36. N5 P.657 665.

55. Simonova О., T. Sukhoverkhova, E. Modestova, L. Korochkin. Behavioral analyses of homeotic /mvc-mutants in D. melanogaster // 41st Annual Drosophila Research Conference. Pittsburgh, USA. 2000b. P.a267.

56. Simonova О., T. Sukhoverkhova, E. Modestova, L. Korochkin. Behavioral analysis of homeotic /avfc-mutants in D. melanogaster // Second International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. Novosibirsk, Russia.2000c. P. 49.

57. Sukhoverkhova Т., О. Simonova, E. Modestova, L. Korochkin A study of olfactory and taste response of homeotic lawc mutants in D. melanogaster // Vl-th Russian School on Actual problems of neurobiology. Kazan. Russia. 1999. P. 111-112.

58. Spradling A.C., Rubin G.M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. //Science. 1982 Oct 22;218(4570): 341347.

59. Sved J.A., Blackman L.M., Gilchrist A.S., Engels W.R. High levels of recombination induced by homologous P elements in Drosophila melanogaster. //Mol. Gen. Genet. 1991 Mar; 225(3):443-7.

60. Vassin H., Vielmetter, Campos-Ortega J. A. Genetic interactions in early neurogenesis of Drosophila melanogaster // J. Neurogenet. 1985. V. 2. № 5. P. 291-308.

61. Voelker R.A. The genetics and cytology of a mutator factor in Drosophila melanogaster. // Mutation Res. 1974 Mar;22(3):265-76.

62. Wolbarsht M. L. Electrical activity in the chemoreceptors of the blowfly. II. Responses to electrical stimulation // J. gen. Physiol. 1958. V. 42: P. 413-4.104