Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование мутаций leg-arista-wing complex, нарушающих экспрессию фактора транскрипции TRF2 в эмбриогенезе Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Исследование мутаций leg-arista-wing complex, нарушающих экспрессию фактора транскрипции TRF2 в эмбриогенезе Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

604600127

БУРДИНА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАЦИЙ LEG-ARISTA-WING COMPLEX, НАРУШАЮЩИХ ЭКСПРЕССИЮ ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ TRF2 В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ Drosophila melanogaster

Специальность: 03.03.05 - биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 ДПР 2910

Москва 2010

004600127

Работа выполнена в лаборатории генетических основ морфогенеза Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук СИМОНОВА Ольга Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук ВАСЕЦКИЙ Сергей Григорьевич

кандидат биологических наук ТИЛЛИБ Сергей Владимирович

Ведущая организация: Институт общей генетики РАН.

Защита диссертации состоится « 28 » апреля 2010 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д.26.

Сайт: http://idbras.comcor.ru/; Е-гпаПл<1Ьга8@Ьк.ги.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан « 27 » марта 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эмбриогенез дрозофилы является удобной модельной системой для изучения морфогенеза. Морфогенетические события, охарактеризованные у дрозофилы, имеют много общего с механизмами, контролирующими морфогенез у позвоночных животных. Например, во время спинного закрытия морфогенез у эмбриона дрозофилы схож с процессами зпиболии и ранозаживления у позвоночных животных. Считается, что эти морфогенетические процессы происходят благодаря ведущим эктодермальным краевым клеткам, специфичность которых определяется экспрессией ряда определённых генов. Эмбриональное ранозаживление у позвоночных животных, в отличие от ранозаживления у взрослых особей, происходит без формирования рубца и является примером феномена, подобного спинному закрытию дрозофилы. В настоящее время ведётся активный поиск генов-участников этого процесса, а дрозофила может служить удобным модельным объектом.

Другим морфогенетическим событием в эмбриогенезе дрозофилы является инвагинация мезодермы в вентральной борозде. Во время гаструляции у части вентральных мезодермальных прекурсорных клеток происходит высоко скоординированное сокращение (сжимание) апикальной поверхности.,. Этот процесс способствует сначала инвагинации, а затем и формированию трубки, состоящей из клеток вентральной борозды. У эмбриона мыши смыкание нервной трубки является зеркальным отражением процесса формирования вентральной борозды дрозофилы. Эти факты позволяют предположить, что молекулярные программы, лежащие в основе таких процессов, как спинное закрытие и формирование вентральной борозды, эволюционно-консервативны.

Сейчас хорошо описаны отдельные изменения формы клеток, свойственные каждому морфогенетическому процессу, однако, недостаточно изучена роль конкретных факторов транскрипции, активирующих экспрессию регуляторов морфогенеза. Эти трудности часто связаны с отсутствием удобных для исследования мутаций генов, кодирующих подобные факторы.

Недавно было показано, что гомолог гена человека, кодирующего альтернативный фактор базовой транскрипции ТВР (TATA-box Binding Protein) Related Factor 2 (TRF2), у дрозофилы проявляет заметную специфичность и может контролировать экспрессию определённого набора генов, участвующих в развитии. Исследовать in vivo функции этого гена помогло открытие многочисленных видимых и летальных его мутаций, названных lawc (leg-arista-wing complex), локализованных на достаточном расстоянии от открытой рамки считывания этого гена, однако, основательно снижающих его экспрессию. Фенотипическое проявление этих мутаций достаточно чётко указывает на

участие комплекса Iawc/Trf2 в сигнальных путях, контролирующих морфогенез на всех этапах развития дрозофилы.

Как оказалось, кодирующий район мРНК Iciwc/Trf2 дрозофилы содержит дополнительный альтернативный сайт инициации трансляции, благодаря которому с одной мРНК синтезируются две изоформы белка (полноразмерная -GenBank#DQl 62845 и укороченная - GenBank#NM078529), отличающиеся N-концевыми последовательностями. Недавно изолированы летальные мутации, нарушающие либо экспрессию эволюционно-консервативной укороченной изоформы TRF2, либо экспрессию только полноразмерной изоформы TRF2, либо только её эволюционно-вариабельного N-концевого домена. Однако их влияние на развитие Drosophila не исследовалось.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в изучении у D. melanogaster особенностей эмбриогенеза мутантов leg-arista-wing complex, с нарушенной экспрессией фактора транскрипции TRF2.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) определить стадии летальности мутантов в линиях с различными tawc- аллелями;

2) провести морфологический анализ кутикулы погибших эмбрионов с нарушенной экспрессией:

а/ эволюционно-консервативной укороченной изоформы TRF2;

б/ полноразмерной изоформы TRF2;

в/ эволюционно-вариабельного N-концевого района полноразмерной изоформы TRF2;

3) исследовать материнский эффект гена Iawc/Trf2 на эмбриогенез;

4) определить особенности сегментации и формирования вентральной борозды и периферической нервной системы у мутантных эмбрионов с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания;

5) определить молекулярную природу мутации lawd'1, двух её летальных производных, и летальной мутации lawcLF520 методом полимеразной цепной реакции и секвенирования районов открытой рамки считывания, кодирующей белок TRF2.

Научная новизна и практическая ценность работы. Ген leg-aristae-wing complex/TBP related factor 2 (lawc/Tr/2), кодирующий у дрозофилы фактор базовой транскрипции, гомологичный фактору базовой транскрипции человека, продуцирует две изоформы белка - полноразмерную и укороченную. Впервые было показано, что эмбрионы с пониженной экспрессией каждого из его продуктов погибают из-за повреждений, вызванных аномалиями в морфогенетических событиях, схожих с процессами ранозаживления и

-4 -

формирования нервной трубки у позвоночных животных. Впервые было показано, что эволюционно вариабельный N-концевой домен полноразмерной изоформы TRF2 обладает самостоятельной функцией, заключающейся в контроле миграции и слияния трахейных ветвей, формирующих дыхательную систему зародыша. Впервые были идентифицированы и молекулярно исследованы четыре мутации, нарушающие кодирующий район гена lawc/Trfi. Были получены новые данные, указывающие на специфическое участие полноразмерной изоформы в формировании нервной системы эмбриона. Впервые исследован материнский эффект гена lawc/Trfi. Он выражается в нарушении синхронности первых делений-дроблений ядер эмбрионального синцития.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на ежегодных конференциях молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2006; 2007; 2008); на международном семинаре «Генетика репродукции насекомых и её практическое применение» (Москва, 2006); на всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007); на международной молодёжной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007) и на 47-й, 49-й и 50-й ежегодных исследовательских конференциях по дрозофиле (Хьюстон, 2006; Сан-Диего, 2008; Чикаго, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 2, тезисов докладов и материалов конференций - 10.

Структура н объем работы. Диссертационная работа изложена на 1 ¡ 2 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (114 источников) и приложения. Содержит 25 рисунков и 7 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнялись на плодовой мушке Drosophila melanogasler.

В работе использовалась 31 уникальная линия с летальными мутациями в районе lawdTrft, которые были получены в лаборатории генетических основ морфогенеза (ИБР РАН), и девять линий, полученных из коллекционного центра линий дрозофилы (Блумингтон, США). Линия lawd7' llawchh5:o использовалась для исследования материнского эффекта гена lawc/Trfi. Для определения стадии летальности использовалась трансгенная линия,

содержащая в балансерной хромосоме конструкт, экспресирующий зеленый флуоресцентный белок GFP.

При приготовлении препаратов кутикулы погибших эмбрионов хорион удаляли вручную, кутикулу просветляли в капле раствора Хойера с добавлением 30% молочной кислоты в течение часа при 60°С.

Восстановление жизнеспособности (rescue-TecT) проводили генетическими методами. В rescue-экспериментах использовали трансгенные линии, содержащие генетические конструкты, конститутивно экспрессирующие TRF2. Созданные конструкции были инъецированы в полярную плазму эмбриона дрозофилы на стадии прецеллюлярной бластодермы.

Для получения амплифицированных фрагментов ДНК мы использовали метод ПЦР на матрице геномной ДНК Drosophila melanogaster линий: lawcf1 ; la\vcl9/FM4; lawci9/FM4 и lawcEF>20/FM7c. Были использованы пятнадцать пар 5'- и З'-праймеров, охватывающих область около 6 т.п.н. (рис. 10) геномной последовательности, кодирующей ген Trf2. (Праймеры были синтезированы в компании ООО «Литех», Россия). Данные обрабатывали с помощь ю компьютерных программ DNASTAR и CHROMAS.

Для определения точных границ делеции, нарушающей как укороченную, так и полноразмерную изоформы TRF2, ПЦР-фрагмент, несущий делецию, был клонирован в плазмиду pGEM-T. Полученная конструкция pGEM-T TRFA520 была секвенирована в КЦП «Геном» (ИМБ РАН).

Исходная конструкция [TRF2-1] несла кДНК, кодирующую укороченную изоформу TRF2, и была ранее клонирована в вектор pl3FRT для трансформации дрозофил. Конструкция была создана в лаборатории П.Г. Георгиева (ИБГ РАН) и была нам любезно предоставлена (рис. 1Б).

Для наших целей кДНК короткой изоформы TRF2 из вектора p!3FRT была переклонирована в плазмиду pSK (pBluescript, Stratagene) по сайтам рестрикции Xhol и ВатШ. Далее в полученную конструкцию, названную pSK-TRF2, по сайтам рестрикции NheI и ЕсоШ был вставлен фрагмент, содержащий анализируемую делецию девяти нуклеотидов, который был предварительно вырезан по этим же сайтам рестрикции из конструкции pGEM-T TRFA520 (рис. 1 А). Таким образом, исходный фрагмент кДНК был заменен соответствующим фрагментом, содержащим делецию. Затем фрагмент мутантной кДНК из pSK-TRFA520 по сайтам рестрикции Xhol и ВатШ, был снова клонирован в вектор pl3FRT.

Созданная конструкция [TRFA520] (рис. 1В) была инъецирована в полярную плазму 350 эмбрионов дрозофилы линиии>/ш (белые глаза) на стадии прецеллюлярной бластодермы. Выживаемость после инъецирования составила 55%. Далее было поставлено более 200 аналитических скрещиваний с

дрозофилами линии w""1 (белые глаза). Было получено 11 независимых трансформантов (пигментированные глаза) с независимыми встраиваниями конструкции в разные хромосомы. Эффективность трансформации составила 6%. Эти экспериментальные линии получили рабочее название TRFA520.

Рисунок 1. Схема получения конструкции pSK-TRFA520 (А) и схемы векторов для

трансформации дрозофил pl3FRT конструкциями [TRF2-1| (Б) и |TRFA520| (В).

Обозначения: На А: стрелками обозначены клонированные

фрагменты TRF2, зигзагом плазмидные основы конструкций pSK, pGEM-T; пунктирными

линиями обозначена клонированная область с делецией (открытый треугольник), Xhol, Nhe I, /TcoRI, ВатШ - сайты рестрикции, используемые в клонировании. На Б и В: 5'Р и З'Р - 5'и 3' инвертированные концевые повторы Р-элемента; FRT- специфические дрожжевые сайты рестрикции FRT; mini-white - адаптированная копия селекторного гена while, необходимая для отбора успешно

трансформированных дрозофил по цвету глаз. Promoter Su(Hw) конститутивный промотор гена Suppressor of Hairy-wing., волнистые линии - pUC- плазмидная основа для наращивания в E.coli\

окрашивание проводили по модифицированной методике Ашбёрнера. Хорион удаляли, используя раствор гипохлорита натрия (30%). Фиксировали раствором п-гептан/формальдегид (3.7%) (1:1) и метанолом. Для визуализации периферической нервной системы в качестве первичных антител использовали моноклональные мышиные антитела анти-22с10 (Hybridoma Bank) в разведении 1:200, для исследования сегментации - анти-Engrailed (Hybridoma Bank) в разведении 1:100, FITC-конъюгированным а-тубулином (Abeam) в разведении 1:150 окрашивали структуры цитоскелета (клеточные стенки). В качестве ДНК-специфичного красителя использовали DAPI (1 мкг/мл, Sigma) и SytoxGreen (,Invitrogen) в разведении 1:500. В качестве вторичных использовали козьи антитела против мыши Су2 в разведении 1:100 (Jackson). Анализ полученных препаратов проводили с помощью конфокального микроскопа Leica DMIRE2, используя программное обеспечение Leica TCS SP2.

А

Xhol Miel ЕсоШ ВатШ -----|-н-V pSK-TRF2

делецня acgcaacag

pGEM-T TRFA520

♦

Xhol Miel EcoRl ВатШ --

делецня acgcaacag

pSK-TRFA520

Б л*

5'P _NW гаг __к rar 3,p

B jfi

polyA'ni_к гаг

A

jf.ifBsjRNS

Фиксирование и флуоресцентное

Препараты анализировались с использованием оборудования Центра коллективного пользования по биологии развития на основе оптических методов исследования ОБН РАН при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение стадии летальности мутантов в линиях, содержащих /ewc-аллели.

Анализировали две группы линий с летальными мутациями в гене Iawc/Trf2. Одна группа линий (9 линий) была получена из мировой музейной коллекции (Блумингтон, США). Ранее было показано, что летальность в музейных линиях вызвана пониженной экспрессией эволюционно консервативной укороченной изоформы белка TRF2 (Воронцова и др., 2007). Локализация мутаций в этих линиях представлена на рисунке 8. Линии другой группы (27 линий), три из которых (lawc19, lawc69, lawc33) содержали летальные /awe-мутации, вызванные пониженной экспрессией полноразмерной изоформы, и одна {lawc73), у которой гибель особей была вызвана пониженной экспрессией эволюционно вариабельного N-концевого участка полноразмерной изоформы TRF2, являлись производными исходной линии, содержащей видимую мутацию lawc?', и были получены ранее в нашей лаборатории (Модестова и др., 2005). Чтобы определить стадию летальности в исследуемых линиях мы заменили балансерную хромосому на хромосому-балансер, с конструкцией, экспрессирующей зелёный флуоресцентный белок (Green Fluorescence Protein - GFP). Таким образом, среди личинок 1 возраста мы могли отличать гетерозиготных самок lawc/FM-GFP и балансерных самцов FM-GFP/Y от гемизиготных самцов с летальной мутацией lawc/Y (рис.2).

/' \

Рисунок 2. Личинки первого возраста из линии lawc73/FM-GFP.

Большими стрелками указаны

яркосветящиеся личинки с генотипом lawc"/FM-GFP или FM-GFP/Y,

экспрессирующие GFP; маленькими стрелками - автофлуоресцирующие личинки с генотипом lawc1/У.

Мы определили, что нарушение экспрессии полноразмерной изоформы белка TRF2 вызывает гибель особей на эмбриональной стадии развития. Нарушение экспрессии лишь N-концевого участка полноразмерной изоформы позволяет переживать эмбриональную стадию развития - часть особей

доживает до стадии личинки I возраста. Снижение экспрессии укороченной

-8-

изоформы белка TRF2 вызывает гибель особей преимущественно на эмбриональной стадии развития с редким доживанием их до стадии личинки.

Анализ препаратов кутикулы погибших эмбрионов из линий с мутациями,

нарушающими экспрессию укороченной изоформы белка TRF2.

Анализ эмбрионов девяти линий с мутациями, нарушающими экспрессию укороченной изоформы TRF2, выявил у всех дефекты дорсо-вентральной полярности, то есть смещение в дорсальном направлении структур, свойственных вентральному отделу. Вентральную сторону эмбриона дрозофилы характеризуют восемь зубчатых полосок - производных вентрального эпителия, экспрессирующего дентин (рис. ЗА). При слабой вентрализации зубчатые полоски мутантов в большинстве случаев формировались латерально (рис. ЗБ-В). Такие эмбрионы имели «складчатую» структуру («folded»), говорившую о неправильной гаструляции, и «скрученную» форму, так называемый «twisted»-фенотип или фенотип «штопор» {tail-up) (рис. ЗБ-В). Дополнительно у них нарушалось развитие головного отдела: от слабой деградации головы (рис. ЗБ-В) до её полной атрофии.

Причиной «складчатости» может быть увеличения размеров тела в результате дупликации сегментов или их части, как в случае с сегментационными мутациями. Было проведено окрашивание эмбрионов антителами к белку Engrailed (En), часто используемому маркеру сегментации, т.к. рисунок его распределения представляет собой посегментно повторяющиеся полоски, определяющие заднюю часть каждого сегмента. Количество полос, экспрессирующих En, у мутанта и у дикого типа не меняется, однако у мутантов происходит их деформация, отражающая складчатый фенотип (рис. ЗД-Е). У дрозофилы известен ряд мутаций с похожим фенотипическим проявлением. Все они нарушают процесс инвагинации, связанный с апикальным сокращением клеток вентральной борозды (ВБ) (рис.ЗГ), замыкающейся в конечном итоге в трубку. Важным компонентом, контролирующим апикальное сокращение клеток ВБ, является киназа Abelson (Abi). Отсутствие Abi нарушает смыкание нервной трубки у мышиного эмбриона, процесса, схожего с формированием ВБ у дрозофилы. Ранее было показано, что у гемизиготных по жизнеспособному аллелю lawc-самцов происходит нарушение структуры конечностей на фоне гетерозиготной делеции гена АЫ, т.е. гаплокопия гена АЫ способна усиливать фенотип /awe-мутантов, что говорит о взаимодействие этих генов (Модестова, Симонова, не опубл.).

Рисунок 3. Нарушение дорсо-вентральной полярности у /яи>с-мутантов.

А - дикий тип: эмбрион в вителлиновой оболочке (вид с латеральной стороны) (1-8 -абдоминальные сегменты: зубчатые полоски отражают количество и размер сегментов, Ч -челюстной аппарат, Д - дыхальца).

Б, В - «латерализованный» мутантный эмбрион в вителлиновой оболочке (Б) и тот же самый эмбрион без неё (В), красными скобками указаны сильноскладчатые сегменты, которые распрямляются после удаления вителлиновой оболочки.

Г - схема апикального сжатия клеток вентральной борозды: 1) экспрессия транскрипционного фактора twist (twi*), определяющего мезодермальную судьбу вентральных клеток, активирует транскрипцию fog, что приводит к накоплению и секреции белка Fog на их апикальной поверхности (синие кружки); 2) связавшись на апикальной поверхности с белком Fog, неизвестный рецептор включает сигнальный путь, активирующий киназу Rhol (ROK) (красная звезда), которая в свою очередь активирует способность миозина взаимодействовать с актином и направленно сокращаться в сторону апикальной поверхности клетки (стрелки); 3) актин-миозиновый цитоскелет связан с клеточной | поверхностью через адгерентные связи (красные прямоугольники), сила, вызванная сокращением апикально расположенного актин-миозинового цитоскелета, распрямляет и уплощает куполовидную апикальную поверхность клеки и тянет вверх адгерентные связи (стрелки); 4) далее сокращение апикального актин-миозина направлено на адгерентные ! связи, сближая их, в результате чего происходит апикальное сокращение клеток. Д, Е - флуоресцентное окрашивание антителами к белку En: эмбрион дикого типа (Д) и мутантный эмбрион (Е), стрелками показано формирование складок у мутанта. Передний отдел эмбрионов расположен слева. Масштабная полоска - 100 мкм.

Мы предположили, что причиной нарушения формирования вентральной борозды у мутантных эмбрионов является отсутствие сжимания апикальной поверхности клеток. Окрашивание мутантных эмбрионов антителами к тубулину, конъюгированному с FITC, позволяющему выявлять форму клеток, I подтвердило нашу гипотезу: нарушение формования вентральной борозды у мутантов вызвано отсутствием сжимания апикальной поверхности клеток. Клетки остаются широкими и имеют округлую форму (рис. 4 А-Г).

L

А ' о Q Б \ \ в 1 1 1 1 1 1

411ft д щ Щ1ф

Рисунок 4. Нарушение апикального сжатия клеток вентральной борозды у lawc-мутантов.

А, Г - сагиттальный конфокальный срез мутантного эмбриона 5-й стадии развития, флуоресцентная окраска антителами к тубулину (клеточные стенки), стрелкой указан район нарушения смыкания клеток вентральной борозды (А), тот же срез эмбриона на просвет (Г) стрелкой и пунктиром указан район нарушения смыкания клеток вентральной борозды. Б, В - фрагменты, отмеченные на А: клетки вентральной борозды в норме узкие (Б) и при нарушении - широкие (В).

Д - «спасённый» эмбрион с эктопической экспрессией белка TRF2 из линии l(l)lawc; [TRF2-1]/[TRF2-1], Мутантный фенотип практически восстановлен до дикого типа. Передний отдел эмбрионов расположен слева. Масштабная полоска - 100 мкм.

В целях проверки специфичности подобных нарушений мы синтезировали линию, в которой генетическими методами были совмещены эмбриональная летальная мутация и трансгенная конструкция, экспрессирующая обе изоформы белка TRF2. Жизнеспособность таких особей восстанавливалась, и примерно половина из них доживала до стадии имаго. Так как жизнеспособность восстанавливалась не полностью, мы проанализировали фенотип кутикулы погибших эмбрионов в этой линии. Морфологических нарушений, характерных для мутантов с пониженной эспрессией TRF2, выявлено не было: восстанавливались даже головные структуры и структуры, характерные для вентральной области (зубчатые полоски) (рис. 4 Д).

Складчатым фенотипом, сопровождаемым деградацией головного и грудного отделов, характеризовались погибшие эмбрионы четырёх линий. Эмбрионы других пяти линий имели дополнительные дефекты. Кроме складчатости и деградации переднего отдела у погибших эмбрионов этих линий появлялись U-подобные эмбрионы, возникшие из-за дефекта сокращения зародышевой полоски, который часто сопровождался неполным спинным закрытием (фенотип «открытая спина» - «dorsal-open») (рис. 5А-Е).

- И -

Показано что, амниосероза, клетки которой сжимаются во время спинного закрытия, и зародышевая полоска движутся синхронно, а мигрирующие клетки формируют ламедлоподии, которые взаимодействует с внеклеточным матриксом (Schock, 2003). Эти исследования базировались на изучении мутантов, имеющих дефекты сокращения зародышевой полоски, фенотип «открытая спина» и связанное с этим изменение формы тела эмбриона («twistecb-фенотип). Оказалось, что эти мутации затрагивали гены, продукты которых контролируют межклеточную адгезию у дрозофилы (трансмембраные белки фермитины (Fit 1, Fit2), лиганд талин и др.) и взаимодействие белков цитоскелета (актин, миозин и др.) с белками внеклеточного матрикса (ламинин, фибронектин) (Perrimon, 1996; Nazario-Yepiz, 2005). Свидетельством взаимодействия Iawc/Trf2 с генами, кодирующими компоненты цитоскелета, могут служить и наши генетические данные: жизнеспособные /avvc-аллели гибнут на фоне гетерозиготных делеций генов lamininA, laminin у, Paramyosin, ответственного за формирование миофибрилл, и rhea, кодирующего талин -компонент цитоскелета, необходимый для прикрепления актина к плазматической мембране и связывания интегринов. Иными словами, эти гены становятся гапло-недостаточными на фоне слабой мутации lawtf1 (Модестова, Симонова, не опубл.). Ранее было показано, что в яичнике самок, мутантных по гипоморфной комбинации аллелей lawc/Trß, действительно нарушаются цитоскелетные структуры (Воронцова, не опубл). Кроме того, мутанты одного из жизнеспособных /awc-аллелей - lawc" - имеют фенотип «пузырчатые крылья», схожий с фенотипом мутантов по гену, кодирующему ламинин а 1,2 -wing blister, у дрозофилы. Нехватки компонента внеклеточного матрикса нарушает у этих мутантов адгезию между верхним и нижним эпителиальными слоями, формирующими крыловую пластинку.

Одним из сигнальных путей, контролирующих спинное закрытие, является сигнальный каскад JNK, активирующийся в ответ на стресс. Ранее было показано, что один из компонентов сигнального пути JNK, ген, кодирующий фактор транскрипции D-Jun, становится гапло-недостаточным на фоне мутации lawc?', поскольку жизнеспособные мутанты lawc гибнут на фоне гетерозиготной делеции этого гена (Модестова, Симонова, не опубл.). Кроме того, исследования на культуре клеток человека показали, что TRF2 репрессирует транскрипцию гена с-fos (у дрозофилы d-fos/kayak), продукт которого Fos образует гетеродимер с Jun.

Анализ препаратов кутикулы погибших эмбрионов из линий с мутациями, нарушающими экспрессию полноразмерной изоформы белка ТКР2.

Был проведен анализ фенотипа кутикулы погибших эмбрионов трёх линий с летальными мутациями, выживаемость самцов которых восстанавливалась только на фоне экспрессии конструкции, кодирующей полноразмерную изоформу Т1?Р2 (линии 1стс19,1ам'с3, 1ау>>с'').

Рисунок 5. Морфогенетические нарушения, характерные для погибших /яи'с-мутантов.

А - В - стадии эмбриогенеза: удлинение (А) и сокращение (Б) зародышевой полоски и спинное закрытие (В). Г - Е - мутантные эмбрионы линий с нарушенной экспрессией укороченной изоформы Т11Р2: с дефектом сокращения зародышевой полоски (Г, Д, стрелки обозначают положение заднего сегмента на спинной стороне, тогда как в норме он должен находиться постериально) и с дефектом спинного закрытия (Е: фенотип «открытая спина» (стрелка)). Ж - И - мутантные эмбрионы линий с нарушенной экспрессией полноразмерной изоформы ТШ^: с нейрогенным фенотипом (Ж, отсутствие брюшного и головного отделов, фрагмент кутикулы остался только на дорсальной стороне), с нарушением сокращения зародышевой полоски (3) и спинного закрытия (И). К-Л - флуоресцентное окрашивание антителами к белку 22С10 эмбрионов стадии 14 дикого типа (К) и мутанта (Л, гипертрофия нервной системы). М - нарушение слияния ствола трахеи у эмбрионов 1стс73 (стрелки указывают на разрывы трахеи).

Погибшие эмбрионы линий этой серии тоже проявляли складчатый фенотип и различной степени дефекты развития головного отдела, а также нарушение сокращения зародышевой полоски и спинного закрытия (рис. 53-И).

Однако в отличие от мутации, нарушающей экспрессию укороченной изоформы, в этой серии среди погибших эмбрионов встречались зародыши с отсутствием кутикулы брюшного и головного отделов (рис. 5Ж). Такие нарушения характерны для нейрогенных зиготических летальных мутантов по гену Notch. У эмбрионов Notch/Y большая, чем в норме фракция клеток нейрогенной эктодермы вступает на нейральный путь развития, поэтому у них остаётся только часть дорсальных эпидермальных клеток, формирующих кутикулу во время финальной дифференцировки в спинном отделе. Очевидно, что у мутантов, с нарушенной экспрессией полноразмерной изоформы TRF2, происходят подобные дефекты. Чтобы подтвердить наше предположение, мы провели иммунофлуоресцентное окрашивание эмбрионов линии lawc'9 антителами к белку 22С10, который является маркером периферической нервной системы (рис. 5К). В результате у мутантов были обнаружены сильная дезорганизация и гипертрофия всей периферической нервной системы (рис. 5Л).

Таким образом, нарушение экспрессии полноразмерной изоформы TRF2 критично не только для процессов гаструляции, но и для формирования нервной системы.

Интересно, что сигнальный путь Notch наряду с JNK сигнальным каскадам тоже регулирует спинное закрытие. Оказалось, что /Vote/г-мутанты могут частично восстанавливать фенотип, вызванный нарушением JNK-пути. Заметим, что аллели, нарушающие экспрессию полноразмерного TRF2 и проявляющие нейрогенный фенотип, действительно слабее нарушали спинное закрытие (сравните рис. 5Е и рис. 5И). Аллель lawc33, в отличие от других аллелей этой группы, вообще не нарушал спинное закрытие, очевидно, благодаря механизму репрессии, индуцированному нарушением Notch-пути (рис. 53). Полученные данные подтверждаются генетическими экспериментами, полученными ранее в нашей лаборатории. Было показано, что крыловой фенотип жизнеспособных мутантов lawtf' восстанавливается на фоне мутации гена Hairless, который является антагонистом Notch. Кроме того, жизнеспособные /awe-мутанты часто гибнут на фоне гетерозиготных делеций ряда генов-мишеней Notch-пути и генов-регуляторов этого каскада.

Анализ препаратов кутикулы погибших эмбрионов линий с мутациями, нарушающими экспрессию N-концевого домена белка TRF2.

Как было показано выше, нарушение экспрессии лишь N-концевого участка полноразмерной изоформы позволяет переживать эмбриональную стадию развития - часть (17,7%) особей линии lawc73 доживает до стадии

личинки I возраста. Фенотип кутикулы погибших эмбрионов этой линии был нами проанализирован. Мы не нашли сильных признаков нарушения гаструляции, хотя головной отдел и челюстной аппарат этих эмбрионов иногда был недоразвит. Однако слабые морфологические нарушения эмбрионов позволили нам выявить другой специфический их дефект: недоразвитие трахейной системы (рис. 5М). Мы заметили, что у погибших эмбрионов были нарушены финальные этапы формирования трахейной системы, приводящие к нарушению целостности дыхательных органов. Основной ствол трахеи у них оставался фрагментированным и к тому же часто не сливался с задними дыхальцами (рис. 5М).

Развитие трахеи у дрозофилы требует удлинения клеточных ветвей, которые связываются и сливаются в сложную сеть (Hartenstein, 1993). Эти процессы иерархически контролируются регуляторами транскрипции, факторами роста и их рецепторами (Nelson, 2003). Предварительные генетические данные, полученные в нашей лаборатории, показали, что жизнеспособные /mvc-мутанты погибают на фоне гетерозиготной делеции гена Branchless, кодирующего гомолог фактора роста фибробластов. Этот ген, играет основную роль на многих этапах развития трахейной системы. Подобные гапло-взаимодействия с lawc/Trfl были обнаружены и для других генов-участников процесса миграции и слияния трахейных ветвей (Lamin, whacked, fear-of-intimacy). Таким образом, мы подтвердили генетические данные, указывающие на участие гена Iawc/Trj2 в регуляции процессов миграции и слияния трахейных ветвей у дрозофилы, и особую роль в этом процессе, возможно, играет N-концевой домен его полноразмерного продукта.

Исследование материнского эффекта lawclTrß.

Обычно вентрализация возникает в результате нарушения дорсо-вентральной полярности, которая устанавливается ещё во время развития яйца в организме матери, а затем поддерживается работой генов зародыша, которые начинают активироваться во время поздней бластулы. Мы исследовали зиготических мутантов, поэтому характерный «скрученный» фенотип - это результат нарушения экспрессии генома зародышей /mvc-мутантов.

Чтобы исследовать материнский эффект гена lawc/Trfl на развитие эмбриона, мы использовали линию lawcP '/lawcEF52° с пониженной экспрессией этого гена у родительских самок. Экстремальным проявлением, характерным для погибших эмбрионов этой линии, было формирование клеточной массы со слаборазвитыми кутикулярными структурами (рис. 6Ж). У таких эмбрионов отсутствовали основные структуры тела, головной скелет, задние дыхальца, зубчатые полоски (рис.7А). Оставались лишь небольшие фрагменты

эмбриональной кутикулы, что говорит о нарушении раннего эмбриогенеза. Исследование стадий деления-дробления в доклеточной бластодерме синцития мутантов показало, что у них нарушена синхронность первых ядерных делений (рис. 6В, Е).

Потомки самок со сжскгнной жшжгнсй TRF-

Рисунок 6. Нарушение материнской функции lawclTrf2 приводит к асинхронному дроблению ядер эмбрионального синцития. А - Е - эмбрион на стадии многоядерного синцития (доклеточная бластодерма): А - Б седьмое деление дробления (дикий тип): метафаза (А) и анафаза (Б), В - асинхронное деления мутанта; Г, Д, Е - увеличенные фрагменты А, Б, В, соответственно (разной формы стрелки на Е показывают хромосомы разных стадий деления). Ж - эмбрион линии law<f'/lawcEF52"c дезинтегрированной, слаборазвитой кутикулой, wt - дикий тип, lawc - мутант law(f 7 lawcEF52°. Эмбрионы на А-Е окрашены DAPI- специфический флуоресцентный краситель ДНК.

В целях проверки специфичности подобных нарушений мы синтезировали линию /avv</V/awc£Fi2°;[TRF2]/[TRF2] с эктопической экспрессией белка TRF2.

Рисунок 7. Восстановленне морфологических структур головного отдела эмбрионов линии 1а}\>ср1/1ам>сЕ1'5~(1 на фоне эктопической экспрессии белка 1КГ2.

А. Погибшие эмбрионы линии ¡ан'С?1/1а\УСЕ1Г5~0 с нарушениями головного отдела (указаны красными стрелками).

Б. Погибшие эмбрионы линии /аи'Ср'//аи'С£Н'г0;[ТЯР2]/[ТКР2] с полным восстановлением головного отдела.

В. На диаграмме отражено значительное снижение нарушений головного отдела у погибших эмбрионов линии с дополнительной экспрессией ТИ-!.

Анализ потомства этой линии показал, что у большинства погибших эмбрионов отмечается восстановление морфологических структур головного отдела (рис. 7Б, В) при введении в геном мутантных самок конструкции экспрессирующей белок ТЯР2.

Исследование молекулярной природы аллелей гена 1ан>с/Тг/2.

Все музейные летальные мутации локализованы в 5'-зоне 1<тс/Тг^2 и не затрагивают открытой рамки считывания (ОРС) этого гена (рис. 8). В гетерозиготном состоянии с исходной мутацией /аи,ср' они проявляют слабый мутантный фенотип (вырезки на крыльях). Единственный аллель, который ярко проявляет себя в сочетании с мутацией /туср' - 1а\\'С'Г52П.

1 т.п.н.

-шиишь

■»«.ни» Рисунок 8. Структурная

ц»ч/_ организация и карта

локализации летальных мутаций гена 1аксУТг/7.

Кодирующая область гена выделена черными

прямоугольниками, некодирующая область белыми. Треугольниками показаны инсерции Р-элемента. Двойные стрелки -инсерция двойной копии Р-элемента у мутантов 1<тср'. Цифры возле треугольников соответствуют номерам

мутантных линий.

У гетерозиготных особей 1ам'сг'/1а\гсИ152" наблюдается почти 100% проявление /аи'с-фенотипа, включая гомеозисную трасформацию аристы в тарзус.

Известно, что аллель 1ам>сЕР52° был получен с помощью этилметансульфоната, который вызывает точечные мутации. Ранее эта и две другие лабораторные мутации - производные аллеля 1а\\'с"', нарушающие экспрессию полноразмерной изоформы ТЯР2 (1<тс19 и 1ан'с69), - исследовались методом Саузерн-блот анализа для выявления структурных перестроек района гена (Модестова и др. 2005). Однако нарушений в исследуемых областях выявлено не было. Мы провели поиск точечных мутаций в районе ОРС аллеля

¡стс?1, двух его летальных производных 1смс19 и 1а\\>с'' и летального аллеля с помощью секвенирования амплифицированных ПЦР-фрагментов, соответствующих кодирующей последовательности ТЯР2. Летальные аллели поддерживались в гетерозиготном состоянии с помощью балансерных хромосом, не содержащих мутаций в исследуемых районах. Поэтому, если тестируемый район содержал нарушение, то при его секвенировании с использованием прямых и обратных праймеров можно было фиксировать «сбой» хорошо читаемой нуклеотидной последовательности, начинающийся в районе, затронутом нарушением (рис. 9).

Рисунок 9, Секвенированный с использованием прямого (520-12 dir) и обратного (52012 rev) праймеров фрагмент ДНК линии laweEF5U из района 520-12. Стрелкой указан участок начала «сбоя» нуклеотидной последовательности.

Было установлено, что в линии с мутацией lawcEF520 имеется две небольшие делеции. Одна делеция локализована в девятом экзоне. Она удаляет девять н.п., соответствующих аминокислотам аргинину, аспарагину и серину у двух изоформ белка, укороченной и полноразмерной. Другая делеция удаляет 18 п.н., соответствующих цепочке шести аминокислот Глн-Гли-Глн-Глн-Глу-Лиз и локализована в седьмом экзоне полноразмерной изоформы.

Мы обнаружили, что аллель lawcEFS20 несёт небольшие делетированные участки в районах, кодирующих полноразмерную и укороченную изоформы белка TRF2 (рис. 10).

Рисунок 10. Локализации делсшюнмых мутаций на карте 1акс1Тг/2. Обозначения как на рис. 5; открытые треугольники -делеционпые мутации, двойным рядом стрелок обозначена область, проанализированная с помощью ПЦР.

Мутация lawc?1 и две её производные - lawc19 и lawc69 - имели каждая по одной делеции, локализованых нами в седьмом экзоне. Делеции произошли в области, кодирующие только полноразмерную изоформу TRF2 и не сбивали открытую рамку считывания белка, удаляя 18 аминокислот полноразмерной изоформы в линии lawc?' и шесть аминокислот в линиях lawc19 и lawc'9. Таким образом, впервые были идентифицированы мутации, нарушающие кодирующий район гена lawc/Trfi.

Чтобы проверить, влияет ли делеция девяти нуклеотидов девятого экзона линии 1awcEFS20 на выживаемость, мы ввели ПЦР-фрагмент с этой делецией в трансгенную конструкцию, которая использовалась ранее в экспериментах по спасению выживаемости мутантных самцов lawc, и проверили выживаемость самцов на фоне экспрессии конструкции с внесёнными изменениями (см. «Материалы и методы»).

Далее были поставлены генетические эксперименты по «спасению» выживаемости легальных самцов двух линий (№11982 и №12295) с летальными мутациями lawc на фоне экспрессии конструкции с внесёнными изменениями. В контрольных скрещиваниях использовалась трансгенная линия с исходной конструкцией [TRF2-1]. Оказалось, что обе конструкции (контрольная и с внесённой делецией), одинаково хорошо восстанавливают выживаемость при внедрении их в геном мутантных дрозофил. Таким образом, мы установили, что исследуемая делеция трёх аминокислот (аргинин, аспарагин и серии) линии lawcEI'320, общая для полноразмерной и укороченной изоформ, не меняет функциональных свойств белка TRF2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе впервые были охарактеризованы летальные мутации гена lawc/Trfi у D.melanogaster. Мы показали, что гибель особей наступает преимущественно на эмбриональной стадии развития. У дрозофилы в отличие от позвоночных животных и человека белок TRF2 представлен двумя изоформами. Более того, нокаут гена Trf2 у мыши не приводит к гибели особей и ограничивается лишь стерильностью самцов. Однако у позвоночных животных недавно обнаружен ген Тф, который, как оказалось, экспрессируется узкоспецифично: в ооцитах и на ранней эмбриональной стадии развития (Gazdag et al., 2007). У дрозофилы известны мутации гена lawc/Trfl, снижающие фертильность самок, связанную с нарушением созревания ооцита (Копытова и др, 2005). Таким образом, можно предположить, что по влиянию на развитие белок TRF2 дрозофилы ближе к TRF3 позвоночных.

Исследуя фенотип погибших эмбрионов, и анализируя полученные ранее генетические данные, можно заключить, что небольшое нарушение концентрации любой из изоформ TRF2 приводит к неправильному формированию вентральной борозды. Этот процесс, очевидно, наиболее чувствителен к колебаниям уровня экспрессии гена Iawc/Trf2. Более сильные аллели приводят к нарушениям сокращения зародышевой полоски и спинного закрытия, возможно, контролируя сигнальный путь .INK. Экспрессия полноразмерной изоформы специфически контролирует нейрогенез, возможно, через активацию сигнального пути Notch. Особой функцией в эмбриогенезе обладает и N-концевой отдел полноразмерной изоформы TRF2, которая очевидно, необходима для миграции и слияния трахейных ветвей при формировании дыхательной системы зародыша. Материнский эффект этого гена приводит к асинхронным делениям ядер эмбрионального синцития. Таким образом, несмотря на то, что продуктом la\vclTrf2 является один из трёх известных на данный момент у дрозофилы факторов базовой транскрипции, нарушение его экспрессии вызывает хотя и сильные, но весьма специфические дефекты. В основном все они связаны с миграцией и движением эпителиальных клеток, в основе которых лежит скоординированное изменение их формы и размера. Хотя отдельные изменения формы клеток, свойственные каждому процессу, хорошо описаны, однако, как это происходит механистически, мало понятно. Изменение формы клеток зависит от актина и миозина, а то, какую форму примет клетка, зависит от регуляторных белков цитоскелета. Выяснение того, как взаимодействуют морфогенетические регуляторы, и, в частности, эволюционно консервативные факторы транскрипции, к каким относится TRF2, поможет понять процесс формообразования органов и тканей.

Выводы

1. В линиях со сниженной экспрессией любой из двух изоформ TRF2 возникает гибель особей на эмбриональной стадии развития. Нарушение экспрессии лишь эволюционно-вариабельного N-концевого участка полноразмерной изоформы TRF2 сдвигает время гибели особей на более поздние стадии развития.

2. Снижение уровня экспрессии любой из изоформ TRF2 нарушает дорсо-вентральную полярность эмбрионов. Нарушение замыкания вентральной борозды в трубку у мутантов вызвано отсутствием сжимания апикальной поверхности ее клеток.

3. Снижение уровня экспрессии полноразмерной изоформы вызывает гипертрофию периферической нервной системы эмбриона.

4. Эволюционно-вариабельный домен TRF2 необходим на финальных этапах формирования дыхательной системы эмбриона во время слияния трахейных ветвей.

5. Снижение уровня экспрессии TRF2 в оогенезе родительских самок вызывает материнский эффект, приводящий к нарушению синхронности первых делений ядер эмбрионального синцития у их потомков.

6. Молекулярное исследование четырех мутантных линий выявило делеции внутри кодирующей белок последовательности гена lawdTrfl.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Воронцова Ю.Е., Модестова Е.А., Бурдина Н.В., Симонова О.Б.. Восстановление жизнеспособности летальных мутантов гена leg-arisla-wing complex на фоне конструкций, экспрессирующих домены гена /7/2, у Drosophila melanogaster // ДАН. 2007. Т. 417. №1. С. 429-31.

2. Симонова О.Б., Бурдина Н.В. Морфогенетическое движение клеток в эмбриогенезе Drosophila". механизмы и генетический контроль // Онтогенез. 2009. Т. 40. №5. С. 355-372.

Тезисы конференций:

1. Simonova О., Modestova Е., Kopanlseva M.R., Vorontsova J., Burdina N.V., Korochkin L. Lethal and sterile mutations in leg-arisla-wing complex: zygotic and maternai effects // 47th Annual Drosophila Research Conférence. Houston. USA. 2006. P.481C.

2. Бурдина H.B.. Морфологический анализ летальных эмбрионов, мутантных по гену leg-arista-wing complex у Drosophila melanogaster // Тезисы Конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез. 2007. Т. 38. №4. С. 314315.

3. Бурдина Н.В.. Исследование функции нейрогена leg-arista-wing complex в эмбриогенезе у Drosophila melanogaster Н Всероссийская медико-биологическая научная конференция молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (X Всероссийская конференция «Человек и его здоровье»), Спб. 2007. С. 60-61.

4. Бурдина Н.В., Мерцалов И.Б., Куликова Д.А., О.Б. Симонова. Исследование молекулярной структуры двух аллельных вариантов гена lawc/tr/2, нарушающих развитие Drosophila melanogaster // «Проблемы молекулярной и клеточной биологии». Сборник Международной молодёжной научно-методической конференции Томск. 2007. С. 35-36.

5. Симонова О.Б., Модестова Е.А., Бурдина Н.В., Мерцалов И.Б., Куликова Д.А., Кузин Б.А. Гипоморфные мутации /и/эднс-регуляторных генов как фактор фенотипического разнообразия органов и тканей у высших многоклеточных организмов. Получение и молекулярно-генетический анализ транс-регуляторных мутаций гена дрозофилы leg-arista-wing complex - гомолога фактору базовой транскрипции человека ТВР related factor 2 II Программа фундаментальных исследований РАН №11 «Биоразнообразие и динамика генофондов», подпрограмма II «Динамика генофондов». Материалы отчётной конференции, посвященной памяти академика Ю.П. Алтухова. Москва. 2007. С. 125-126.

6. Simonova О., Burdina N., Vorontsova J., Cherezov R„ Modestova E., Mertsalov I., Kulikova D. Two leg-arista-wing complex mutations disrupt different coding regions of TBP related factor 2 in Drosophila melanogaster!! 49th Annual Drosophila Research Conference. San Diego. USA. 2008. P.186, 290B.

7. Симонова О.Б., Бурдина Н.В., Воронцова Ю.Е., Черезов P.O., Кузин Б.А. Гипоморфные мутации транс-регуляторных генов как фактор фенотипического разнообразия органов и тканей у высших многоклеточных организмов. Продукты гена lawc/trß синхронизируют деления и координируют клеточную миграцию во время развития у Drosophila melanogaster II Сборник статей подпрограммы II «Динамика генофондов» Программы фундаментальных исследований РАН №11 «Биоразнообразие и динамика генофондов». 2008. Т.З. С.129-131.

8. Бурдина Н.В., Мерцалов И.Б., Куликова Д.А., Симонова О.Б. Выявление и анализ фенотипического проявления двух мутаций, нарушающих структуру разных доменов гена lawc/trß у Drosophila melanogaster II Тезисы Конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез. 2008. Т.39. №4. С.311.

9. Simonova О., Burdina N.. Vorontsova J., Cherezov R. Isolation and investigation of hypomorphic lethal mutations that specifically disturb the expression of each two

protein izoforms of TBP related factor 2 in Drosophila // 50th Annual Drosophila Research Conference. Chicago. USA. 2009. 91 ЗА. P.44.

10. Бурдина H.B. Особенности эмбриогенеза мутантов leg-arista-wing complex с нарушенной экспрессией фактора транскрипции TRF2 у Drosophila melanogaster // Тезисы Конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез. 2009. Т.40. №.4. С.308-309.

Заказ№ 110-а/03/10 Подписано в печать 24.03.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

t

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бурдина, Наталья Владимировна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Эмбриональное развитие дрозофилы.

1.2. Генетический контроль эмбрионального развития дрозофилы.

1.2.1. Формирование вентральной борозды.

1.2.2. Удлинение и сокращение зародышевой полоски.

1.2.3. Спинное закрытие.

1.2.4. Развитие трахеи.

1.3. Роль поляризации эпителиальных клеток в морфогенетическом движении.

1.3.1. Гены, определяющие план строения организма вдоль переднезадний оси, контролируют поляризованное поведение клетки.

1.4. Характеристика гена leg-arista-wing complex.

1.5. Фактор базовой транскрипции TRF2.

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Методы содержания дрозофилы и манипулирования с ней.

2.2. Генетические методы.

2.3. Флуоресцентная микроскопия и фотографирование.

2.4. Молекулярные методы.

2.5. Получение трансгенных конструкций.

2.6. Получение трансгенных линий D. melanogaster.

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Определение стадии летальности мутантов в линиях, содержащих lawc-ашели.

3.2. Анализ препаратов кутикулы погибших эмбрионов из линий с мутациями, нарушающими экспрессию укороченной изоформы белка TRF2.

3.3. Анализ препаратов кутикулы погибших эмбрионов из линий с мутациями, нарушающими экспрессию полноразмерной изоформы белка TRF2.

3.4. Анализ препаратов кутикулы погибших эмбрионов линий с мутациями, нарушающими экспрессию N-концевого домена белка TRF2.

3.5. Исследование материнского эффекта lawdTrfl.

3.6. Исследование молекулярной природы аллелей гена Iawc/Trf2.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование мутаций leg-arista-wing complex, нарушающих экспрессию фактора транскрипции TRF2 в эмбриогенезе Drosophila melanogaster"

Другим морфогенетическим событием эмбриогенеза дрозофилы является инвагинация мезодермы в вентральной борозде (Pilot, Lecuit, 2005). Во время гаструляции у части вентральных мезодермальных прекурсорных клеток происходит высоко скоординированное сокращение (сжимание) апикальной поверхности. Это событие способствует сначала инвагинации, а затем и формированию трубки, состоящей из клеток вентральной борозды. У эмбриона мыши смыкание нервной трубки зеркально отражает формирование вентральной борозды дрозофилы. Эти факты позволяют предположить, что молекулярные программы, лежащие в основе таких событий, как спинное закрытие и формирование вентральной борозды, консервативны и повторно использовались в эволюции.

Сейчас хорошо описаны отдельные изменения формы клеток, свойственные каждому морфогенетическому процессу, однако, недостаточно изучена роль конкретных факторов транскрипции, активирующих экспрессию регуляторов морфогенеза. Эти трудности часто связаны с отсутствием удобных для исследования мутаций этих генов.

Недавно было показано, что гомолог гена человека, кодирующего альтернативный фактор базовой транскрипции ТВР (TATA-box Binding Protein) Related Factor 2 (TRF2), у дрозофилы проявляет заметную специфичность и может контролировать определённый набор генов, участвующих в развитии. Исследовать in vivo функции этого гена помогло предварительное открытие многочисленных видимых и летальных мутаций дрозофилы, названных law с (leg-arista-wing complex), локализованных на достаточном расстоянии от его открытой рамки считывания, однако, основательно снижающих его экспрессию. Фенотипическое проявление этих мутаций достаточно чётко указывает на участие комплекса Iawc/Trf2 в сигнальных путях, контролирующих морфогенез на всех этапах развития дрозофилы.

Последние исследования показали, что кодирующий район мРНК Iawc/Trf2 дрозофилы содержит дополнительный альтернативный сайт инициации трансляции, благодаря которому с одной мРНК синтезируются две изоформы белка (полноразмерная и укороченная), отличающиеся N-концевыми последовательностями. Было показано, что 11 летальных мутаций, локализованных в 5'-нетранслируемом районе lawc/Trfl, нарушают экспрессию эволюционно-консервативной укороченной изоформы TRF2. Кроме того, в нашей лаборатории были изолированы летальные мутации lawc, нарушающие экспрессию только полноразмерной изоформы TRF2, либо только её эволюционно-вариабельного N-концевого домена. Однако их влияние на развитие Drosophila не исследовалось.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в изучении у D. melanogaster особенностей эмбриогенеза мутантов leg-arista-wing complex, с нарушенной экспрессией фактора транскрипции TRF2.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) определить стадии летальности мутантов в линиях с различными lawc- аллелями;

2) провести морфологический анализ кутикулы погибших эмбрионов с нарушенной экспрессией: а/ эволюционно-консервативной укороченной изоформы TRF2; б/ полноразмерной изоформы TRF2; в/ эволюционно-вариабельного N-концевого района полноразмерной изоформы TRF2;

3) исследовать материнский эффект гена Iawc/Trf2 на эмбриогенез;

4) определить особенности сегментации и формирования вентральной борозды и периферической нервной системы у мутантных эмбрионов с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания;

5) определить молекулярную природу мутации lawcf', двух её т EF520 летальных производных, и летальной мутации lawc методом полимеразной цепной реакции и секвенирования районов открытой рамки считывания, кодирующей белок TRF2.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Ген leg-aristae-wing complex/TBP related factor 2 (lawc/Tr/2), кодирующий фактор базовой транскрипции дрозофилы, гомологичный фактору базовой транскрипции человека, продуцирует две изоформы белка -полноразмерную и укороченную. Впервые было показано, что эмбрионы с пониженной экспрессией каждого из его продуктов погибают из-за повреждений, вызванных аномалиями в морфогенетических событиях, схожих с процессами ранозаживления и формирования нервной трубки у позвоночных животных. Впервые было показано, что эволюционно вариабельный N-концевой домен полноразмерной изоформы TRF2 обладает самостоятельной функцией в эмбриогенезе, контролирующей миграцию и слияние трахейных ветвей при формировании дыхательной системы зародыша. Впервые были идентифицированы и молекулярно исследованы четыре мутации, нарушающие кодирующий район гена Iawc/Trf2. Были получены новые данные, указывающие на специфическое участие полноразмерной изоформы в формировании нервной системы эмбриона. Исследование материнского эффекта гена Iawc/Trf2 показало нарушение синхронности первых делений-дроблений в эмбриогенезе дрозофилы. Таким образом, несмотря на то, что продуктом lawdTrfl является один из трёх известных на данный момент у дрозофилы факторов базовой транскрипции, нарушение его экспрессии вызывает хотя и сильные, но весьма специфические дефекты. В основном все они связаны с миграцией и движением эпителиальных клеток, в основе которых лежит скоординированное изменение их формы и размера. Выяснение того, как взаимодействуют морфогенетические регуляторы, и в частности эволюционно консервативные факторы транскрипции, к которым относится и TRF2, поможет понять процесс формообразования органов и тканей. Материалы работы используются как демонстрационный материал при чтении лекций для студентов кафедры эмбриологии биологического факультета МГУ им. Ломоносова.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на ежегодных конференциях молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2006; 2007; 2008), на международном семинаре «Генетика репродукции насекомых и её практическое применение» (Москва, 2006), на всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007), на международной молодёжной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007) и на 47-й, 49-й и 50-й ежегодных исследовательских конференциях по дрозофиле (Хьюстон, 2006; Сан-Диего, 2008; Чикаго, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК — 2, тезисов докладов и материалов конференций — 10.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 112 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (114 источников) и приложения. Содержит 25 рисунков и 7 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Бурдина, Наталья Владимировна

Выводы

1. В линиях со сниженной экспрессией любой из двух изоформ TRF2 возникает гибель особей на эмбриональной стадии развития. Нарушение экспрессии лишь эволюционно-вариабельного N-концевого участка полноразмерной изоформы TRF2 сдвигает время гибели особей на более поздние стадии развития.

2. Снижение уровня экспрессии любой из изоформ TRF2 нарушает дорсо-вентральную полярность эмбрионов. Нарушение замыкания вентральной борозды в трубку у мутантов вызвано отсутствием сжимания апикальной поверхности ее клеток.

3. Снижение уровня экспрессии полноразмерной изоформы вызывает гипертрофию периферической нервной системы эмбриона.

4. Эволюционно-вариабельный домен TRF2 необходим на финальных этапах формирования дыхательной системы эмбриона во время слияния трахейных ветвей.

5. Снижение уровня экспрессии TRF2 в оогенезе родительских самок вызывает материнский эффект, приводящий к нарушению синхронности первых делений ядер эмбрионального синцития у их потомков.

6. Молекулярное исследование четырех мутантных линий выявило делеции внутри кодирующей белок последовательности гена lawdTrfl.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе впервые были охарактеризованы летальные мутации гена Iawc/Trf2 у D.melanogaster. Мы показали, что гибель особей наступает преимущественно на эмбриональной стадии развития. У дрозофилы в отличие от позвоночных животных и человека белок TRF2 представлен двумя изоформами. Более того, нокаут гена Trf2 у мыши не приводит к гибели особей и ограничивается лишь стерильностью самцов. Однако у позвоночных животных недавно обнаружен ген Тг/З, который, как оказалось, экспрессируется узкоспецифично: в ооцитах и на ранней эмбриональной стадии развития (Gazdag et al., 2007). У дрозофилы известны мутации гена Iawc/Trf2, снижающие фертильность самок, связанную с нарушением созревания ооцита (Копытова и др, 2005). Таким образом, можно предположить, что по влиянию на развитие белок TRF2 дрозофилы ближе к TRF3 позвоночных.

Исследуя фенотип погибших эмбрионов, и анализируя полученные ранее генетические данные, можно заключить, что небольшое нарушение концентрации любой из изоформ TRF2 приводит к неправильному формированию вентральной борозды. Этот процесс, очевидно, наиболее чувствителен к колебаниям уровня экспрессии гена lawc/Trfl. Более сильные аллели приводят к нарушениям сокращения зародышевой полоски и спинного закрытия, возможно, контролируя сигнальный путь JNK. Экспрессия полноразмерной изоформы специфически контролирует нейрогенез, возможно, через активацию сигнального пути Notch. Особой функцией в эмбриогенезе обладает и N-концевой отдел полноразмерной изоформы TRF2, которая очевидно, необходима для миграции и слияния трахейных ветвей при формировании дыхательной системы зародыша. Материнский эффект этого гена приводит к асинхронным делениям ядер эмбрионального синцития. Таким образом, несмотря на то, что продуктом lawc!Trf2 является один из трёх известных на данный момент у дрозофилы факторов базовой транскрипции, нарушение его экспрессии вызывает хотя и сильные, но весьма специфические дефекты. В основном все они связаны с миграцией и движением эпителиальных клеток, в основе которых лежит скоординированное изменение их формы и размера. Хотя отдельные изменения формы клеток, свойственные каждому процессу, хорошо описаны, однако, как это происходит механистически, мало понятно. Изменение формы клеток зависит от актина и миозина, а то, какую форму примет клетка зависит от регуляторных белков цитоскелета. Выяснение того, как взаимодействуют морфогенетические регуляторы, и в частности эволюционно консервативные факторы транскрипции, к каким относится TRF2, поможет понять процесс формообразования органов и тканей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бурдина, Наталья Владимировна, Москва

1. Жимулев И.Ф. Общая и молекурная генетика // Издательство Новосибирского Университета. Сибирское Университетское Издательство. Новосибирск 2002.

2. Иванова-Казас О.М., Кричинская Е.Б. Курс сравнительной эмбриологии беспозвоночных животных // Издательство Ленинградского университета. Ленинград. 1988. С.352.

3. Корочкин Л.И. Биология индивидуального развития // Издательство Московского университета. Москва. 1999.

4. Копытова Д.В., Краснов А.Н., Симонова О.Б. и др. Изучение гена lawc-trf2 Drosophila melanogaster и его белкового продукта // ДАН. 2005. Т.405. №1. С.125-127.

5. Модестова Е.А., Воронцова Ю.Е.,. Корочкин Л.И. и др. Получение летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у D. melanogaster II ДАН. 2005. Т. 403, №4. С. 564-565.

6. Петрук С.Ф., Джагаева И.В., Солдатов А.В. и др. Клонирование гена гена leg-arista-wing complex (lawc) и анализ его мутантных производных у дрозофилы. // Генетика. 1998, 34, №3, С. 446-448.

7. Полуэктова Е.В., Митрофанов В.Г., Бурыченко Г.М. и др. Дрозофила-Drosophila II Объекты биологии развития // Изд-во «Наука». Москва. 1975.

8. Симонова О.Б., Кузин Б.А., Георгиев П.Г. и др. Новая регуляторная мутация Drosophila melanogaster II Генетика. 1992. № 2. Т.28. С. 164-167.

9. Симонова О.Б. Новый транс-регуляторный локус дрозофилы // Генетика. 2000. Т.36. N11. С. 1464 1474.

10. Слезингер М.С., Кузин Б.А. NO-синтаза участвует в регуляции поляризации клеток и их движения в морфогенезе Drosophila // Онтогенез. 2009. Т.40. №1. С.40-47.

11. Adler P.N. Planar signaling and morphogenesis in Drosophila // Devel.Cell. 2002. V.2. P.525-535.

12. Ashburner M, Drosophila. A laboratory handbook. // Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 a.

13. Ashburner M., Drosophila. A laboratory manual. // Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 b.

14. Axelrod J.D. Unipolar membrane association of Dishevelled mediates Frizzled planar cell polarity signaling// Genes Dev.2001.V.15. P.l 182-1187.

15. Baum B. and Perrimon N. Spatial control of the actin cytoskeleton in Drosophila epithelial cells //Nat. Cell Biol. 2001. V.3. P.883 -890.

16. BastockR., Strutt H.and Strutt D. Strabismus is asymmetrically localised and binds to Prickle and Dishevelled during Drosophila planar polarity patterning //Development. 2003. V.130. P.3007-3014.

17. Blankenship J.Т., Backovic S., Sanny J.S.P., et al. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis // Dev. Cell. 2006. V.ll.P.459-470.

18. Brouns M. R., Matheson S. F., Ни К. О., et al. The adhesion signaling molecule pi90 RhoGAP is required for morphogenetic processes in neural development//Development. 2000. V.127. P.4891-4903.

19. Campos-Ortega J.A. and Hartenstein V. In: The embryonic development of Drosophila melanogaster IУ Springer-Verlag. Berlin. 1985.

20. Ciruna В., Jenny A., Lee D. et al. Planar cell polarity signaling couples cell division and morphogenesis neurulation // Nature. 2006. V. 439. P. 220-224.

21. Colas J.F., Launay J.M., Kellermann O., et al. Drosophila 5-HT2 serotonin receptor: coexpression with fushi-tarazu during segmentation // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. V.92. P. 5441-5445.

22. Colas J.F., Launay J-M, Maroteaux L. Maternal and zygotic control of serotonin biosynthesis are both necessary for Drosophila germband extension // Mech. Dev. 1999a. V.87. P.67-76.

23. Colas J.F, Launay J-M, Vonesch J-L, et al. Serotonin synchronises convergent extension of ectoderm with morphogenetic gastrulation movements in Drosophila // Mech Dev 1999b. V. 87. P.77-91.

24. Costa M, Wilson E. Т. and Wieschaus E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation // Cell. 1994. V. 76. P. 1075-1089.

25. Dantonel J.C., Quintin S., Lakatos L., et al .TBP-like factor is required fpr embryonic RNA polymerase II transcription in C. elegans // Mol. Cell. 2000. V. 6. P. 715-722.

26. Das G., Jenny A., Klein T.J., et al. Diego interacts with Prickle and Strabismus/Van Gogh to localize planar cell polarity complexes I I Development. 2004. V.131. P.4467-4476.

27. Dawes-Hoang R.E., Parmor K.M., Christiansen A.E. et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization // Development 2005. V.132. P. 4165-4178.

28. Fehon R.G., Dawson I.A. and Artavanis-Tsakonas S. A. Drosophila homologue of membrane-skeleton protein 4.1 is associated with septate junctions and is encoded by the coracle gene // Development 1994. V.120. P.545-557.

29. Fischer E., Legue E., Doyen A. et al. Defective planar cell polarity in polycystic kidney disease //Nat. Genet. 2006. V.38. P. 21-23.

30. Fox D.T. and Peifer M. Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila // Development 2007. V.134. P.567-578.

31. Foe V.E., Alberts B.M. Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis //J. Cell Sci. 1983. V.61. P.31-70.

32. Gertler F. В., Comer A. R., Juang J. L., et al. enabled, a dosage-sensitive suppressor of mutations in the Drosophila Abl tyrosine kinase, encodes an

33. Abl substrate with SH3 domain-binding properties I I Genes Dev. 1995. V.9. P.521-533.

34. Ghabrial A.S., Krasnow M.A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis //Nature. 2006. V.441. P.746-749.

35. Glise В., Bourbon H. and Noselli S. hemipterous encodes a novel Drosophila MAP kinase kinase, required for epithelial cell sheet movement // Cell. 1995. V.83.P.451-461.

36. Glise В., Nosell S. Coupling of Jun amino-terminal kinase and Decapentaplegic signaling pathways in Drosophila morphogenesis // Genes Dev. 1997. V.l 1. P.1738-1747.

37. Goldstein E.S., Treadway S.L., Stephenson A.E., et al. A genetic analysis of the cytological region 46C-F containing the Drosophila melanogaster homolog of the jun proto-oncogene // Molec. Genet. Genomics. 2001. V.266. P.695-700.

38. Grevengoed E.E., Loureiro J.J., Jesse T.L. et al. Abelson kinase regulates epithelial morphogenesis in Drosophila // J. Cell Biol. 2001.V.l55. P. 11851198.

39. Gubb D., Garcia-Bellido A. A genetic analysis of the determination of cuticular polarity during development in Drosophila melanogaster //J. Embryol. Exp. Morphol. 1982. V.62. P. 37-57.

40. Hacker U. and Perrimon N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila// Genes Dev. 1998. V.12. P.274-284.

41. Hartenstein V. Atlas of Drosophila development // Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1993.

42. Hochheimer A., Zhou S., Zheng S., Holmes MC, Tjian R. TRF2 associares with DREF and directs promoter-selective gene expression in Drosophila I I Nature. 2002. V.420. P.439-445.

43. Hochheimer A. and Tijan R. Diversified transcription initiation complexes expand promoter selectivity and tissuespecific gene expression // Genes & Dev. 2003. V. 17. P.1309-1320.

44. Hyodo-Miura, Yamamoto T.S., Hyodo A.C., et al. XGAP, an ArfGAP, is required for polarized localization of PAR proteins and cell polarity in Xenopus gastrulation// Dev. Cell. 2006. V.l 1. P.69-79.

45. Irvine K., Wieschaus E. Cell intercalation during Drosophila germband extension and its regulation by pair-rule segmentation genes // Development. 1994. V.120. P. 827-841.

46. Jiang L., Crews S. T. Transcriptional Specificity of Drosophila Dysfusion and the Control of Tracheal Fusion Cell Gene Expression // J. Biol. Chem. 2007. V.282. P.28659-28668.

47. Jones C., Chen P. Planar cell polarity signaling in vertebrates // BioEssays. 2007. V.29. P.120-132.

48. Jiirgens G, Wieschaus E, Niisslein-Volhard C. et al. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster: II. Zygotic loci on the third chromosome // Roux's Arch Dev Biol. 1984. V.193. P.283-295.

49. Kaltschmidt J.A., Lawrence N., Morel V., et al. Planar polarity and actin dynamics in the epidermis of Drosophila II Nature Cell Biology. 2002. V.4.P. 937-944.

50. Keller R., Davidson L., Edlund A., et al. Mechanisms of convergence and extension by cell intercalation // Philos. Trans. R. Soc. Lond. В Biol. Sci. 2002. V. 355. P.897-922.

51. Knust E. Drosophila morphogenesis: Follow-my-leader in epithelia // Curr Biol. 1996. V.6. P.379-381.

52. Kohn W.D., Kay C.M., Hodges R.S. Salt effects on protein stability: two-stranded alpha-helical coiled-coils containing inter- or intrahelical ion pairs I I J Mol Biol. 1997. V. 267 № 4 P: 1039-1052.

53. Koleske A. J., Gifford A.M., Scott M.L., et al. Essential roles for the Abl and Arg tyrosine kinases in neurulation //Neuron. 1998. V.21. P.1259-1272.

54. Kuzin В., Roberts /., Peunova N. et al. Nitric oxide regulates cell proliferation during Drosophila development//Cell. 1996. V.87. P.639-649.

55. Kuzin В., Regulski M., Stasiv Y. Nitric oxide interacts with retinoblastoma pathway to control eye development in Drosophila // Curr. Biol. 2000. V.10. P.459-462.

56. Lanier L.M. and Gertler F.B. From Abl to actin: Abl tyrosine kinase and associated proteins in growth cone motility // Curr. Opin. Neurobiol. 2000. V.10.P.80-87.

57. Lawrence P.A., Casal J., Struhl G. Towards a model of the organisation of planar polarity and pattern in the Drosophila abdomen // Development 2002. V.129. P.2749—2760.

58. Lawrence P.A., Sanson B. and Vincent P. Compartments, wingless and engrailed: patterning the ventral epidermis of Drosophila embryos // Development 1996. V.122 (12). P.4095-4103.

59. Lewis E. B. Homeosis: the first 100 years Trends in Genetics // Nature. 1994. V.10. P.P.341-343.

60. Lindsley, D.M., Zimm, G., The genome of Drosophila melanogaster II NY: Academic Press, Inc. 1992.

61. Logan C.Y., Nusse R. The Wnt signaling pathway in development and disease II Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2004. V.20. P.781-810.

62. Luschnig S., Moussian В., Krauss J., et al. An Fi genetic screen for maternal-effect mutations affecting embryonic pattern formation in Drosophila melanogaster // Genetics. 2004. V.167. P.325-342.

63. MacKrell A.J., Blumberg В., Haynes S.R., et al. The lethal myospheroid gene of Drosophila encodes a membrane protein homologous to vertebrate integrin p subunits // Proc Natl Acad Sci USA. 1988. V.85. P.2633-2637.

64. Marshall C.J. MAP kinase kinase kinase, MAP kinase kinase and MAP kinase // Curr Opin Genet Dev. 1994. V.4. P.82-89.

65. Martin D., Zusman S., and Li X., et al. Wing blister, a new Drosophila laminin alpha chain required for cell adhesion and migration during embryonic and imaginal development // J. Cell Biol. 1999. V.145. P.191-201.

66. Martin P. and Nobes C.D. An early molecular component of the wound healing process in rat embryos: induction of c-fos protein in cells at the epidermal wound margin // Mech Dev. 1992. V.38. P.209-215.

67. Martin P., Dickson M.C., Milan F.A. et al. Rapid induction and clearance of TGFP-l is an early response to wounding in the mouse embryo // Dev Genet. 1993. V. 14. P.225—238.

68. Martin P. Wound healing aiming for perfect skin regeneration // Science.1997. У.216. P.75-81.

69. Miller J.R., Rowning B.A., Larabell C.A., et al. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation // J. Cell Biol. 1999. V.146. P. 427-437.

70. Mlodzik M. Planar cell polarization: do the same mechanisms regulate Drosophila tissue polarity and vertebrate gastrulation? // Trends Genet. 2002. V.18. P.564-571.

71. Morize P., Christiansen A.E., Costa M., et al. Hyperactivation of the folded gastrulation pathway induces specific cell shape changes // Development1998. V.125.P.589 -597.

72. Nazario-Yepiz N., Riecqo-Escovar Juan R. Characterization of a new dorsal closure gene piragua (pra) in Drosophila melanogaster // 46th Annual Drosophila Research Conference. San Diego (USA). 2005. P. 173.

73. Nelson W.J. Tube morphogenesis: closure, but many openings remain // Trends Cell Biol. 2003. V.13. P.615-621.

74. Nikolaidou К. К. and Barrett К. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation // Curr. Biol. 2004. V.14. P. 1822-1826.

75. Ninomiya H., Elinson R.P., Winklbauer R. Antero-posterior tissue polarity links mesoderm convergent extension to axial patterning // Nature. 2004. V.430. P.364-367.

76. Nobes C.D. and Hall A. Rho GTPases Control Polarity, Protrusion, and Adhesion during Cell Movement I IJ Cell Biol. 1999. V.144. P. 1235-1244.

77. Nusslein-Volhard C., Wieschaus E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila// Nature. 1980. V.287(5785). P. 795-801.

78. Oda H., Tsukita S., Takeichi M. Dynamic behavior of the cadherin-based cell-cell adhesion system during Drosophila gastrulation // Dev Biol. 1998. V.203. P.435-450.

79. Parks S. and Wieschaus E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein // Cell 1991. V. 64. P.447 -458.

80. Pastor-Pareja J.C., Grawe F., Martin-Blanco E., et al. Invasive cell behavior during Drosophila imaginal disc eversion is mediated by the JNK signaling cascade // Dev. Cell. 2004. V.7. P.387-399.

81. Perrimon N., Mahowald A. Multiple functions of segment polarity genes in Drosophila II Dev. Biol. 1987. V.l 19. P.587-600.

82. Perkins K.K, Admon A., Patel N. et al. The Drosophila fos-related AP-1 protein is a developmentally regulated transcription factor // Genes Dev. 1990. V.4. P. 822-834.

83. PeunovaN., Sheinker V., Ravi K., Enikolopov G. Nitric oxide coordinates cell proliferation and cell movements during early development of Xenopus И Cell Cycle. 2007. V.6. P. 3132-3144.

84. Pilot F. andLecuit T. Compartmentalized morphogenesis in epithelia: from cell to tissue shape // Dev. Dyn. 2005. V. 232. P.685 -694.

85. Rabenstein M. D, Zhou S, Lis J. Т., Tjian R. TATA box-binding protein (TBP)-related factor 2 (TRF2), a third member of the TBP family. // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. V. 96 № 9. P. 4791-4796.

86. Riesgo-Escovar J.R. and Hafen E. Drosophila Jun kinase regulates expression of decapentaplegic via the ETS-domain protein Aop and the AP-1 transcription factor, DJun, during dorsal closure // Genes Dev. 1997. V.ll. P. 1717—1727.

87. Ring J.M. and Martinez-Arias A. puckered a gene involved in position-specific cell differentiation in the dorsal epidermis of the Drosophila larva // Development 1993. V.l 19. P.251-259.

88. Rogers S.L., Wiedemann U., Hacker U., et al. Drosophila RhoGEF2 associates with microtubule plus ends in an ЕВ 1-dependent manner // Curr. Biol. 2004. V.14. P.1827 -1833.

89. Sanchez L., Thieffy D. Segmenting the fly embrio: logical analysis of pair-rule cross-regulatory module // J Theor Biol. 2003. V.224 №4. PP.517-537.

90. Sauer F. and Tjian R. Mechanisms of transcriptional activation: differences and similarities between yeast, Drosophila, and man // Current Opinion in Genetics & Development. 1997. V.7. PP. 176-181.

91. SchockF., Perrimon N. Cellular processes associated with germ band retraction in Drosophila//Dev. Biol. 2002. V.248. P.29-39.

92. SchockF., Perrimon N. Retraction of the Drosophila germ band requires cell-matrix interaction // Genes & Development. 2003. V.l7. P.597-602.

93. Schoenwolf G.C., Alvarez I.S. Roles of neuroepithelial cell rearrangement and division in shaping of the avian neural plate // Development. 1989. V.l06. P. 427-439.

94. Scuderi A.B., LetsouA. Amnioserosal function in dorsal closure I 146th Annual Drosophila Research Conference. San Diego (USA).2005

95. Shimada M., Nakadai Т., Tamura T.A. TATA-binding protein-like protein (TLP/TRF2/TLF) negatively regulates cell cycle progression and is required for the stress-mediated G(2) checkpoint // Mo 1 Cell Biol. 2003. V. 23 P. 4106-4120.

96. Shimada Y., Yonemura S., Ohkura H., et al. Polarized transport of Frizzled along the planar microtubule arrays in Drosophila wing epithelium // Dev. Cell. 2006. V.10. P. 209-222.

97. Sonnenblick B. P. The early embryology of Drosophila melanogaster .In: Biology of Drosophila // N. Y. John Wiley and Sons. 1950. P.535-590.

98. Stasiv Y, Regulski M., Kuzin B. et al. The Drosophila nitricoxide synthasa gene (dNOS) encodes a family of proteins that can modulate NOS activity by acting as dominant negative regulators // J. Biol. Chem. 2001. V.276. P. 42241-42251.

99. Stasiv Y, Kuzin В., Regulski M. et al. Regulation of maltimers via truncated isoforms: a novel mechanism to control nitricoxide signaling // Genes Devel. 2004. V.l8. P.1812-1823.

100. Strutt D.I. The asymmetric subcellular localisation of components of the planar polarity pathway // Semin. Cell Dev. Biol. 2002. V.13. P.225-231.

101. Suzuki A., Ohno S. The PAR-aPKC system: lessons in polarity // J. Cell Sci. 2006. V.l 19. P.979-987.

102. Teichmann M., Wang Z, Martinez E. et al. Human TATA-binding protein-related factor-2 (hTRF2) stably associates with hTFIIA in HeLa cells // Proc Natl Acad Sci USA. 1999 V. 96. P. 13720-5.

103. Tree D.R., Shulman J.M., Rousset R., et al. Prickle mediates feedback amplification to generate asymmetric planar cell polarity signaling // Cell. 2002. V.109.P. 371-381.

104. Turner F.R., Mahowald A.P. Scanning electron microscopy of Drosophila melanogaster embryogenesis. II. Gastrulation and segmentation I I Dev Biol. 1977. V.57. P.403-416.

105. Usui Т., Shima Y., Shimada Y., et al. Flamingo, a seven-pass transmembrane cadherin, regulates planar cell polarity under the control of Frizzled // Cell. 1988. V.98. P.585-595.

106. Wong L.L., Adler P.N. Tissue polarity genes of Drosophila regulate the subcellular location for prehair initiation in pupal wing cells //J. Cell Biol. 1993. V. 123. P. 209-221.

107. Young P.E., Richman A.M., Ketchum A.S., et al. Morphogenesis in Drosophila requires nonmuscle myosin heavy chain function // Genes Dev. 1993. V.7. P. 29-41.

108. Zallen J.A, Wieschaus E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila //Dev Cell. 2004. V. 6. P.343-355.