Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение транскрипционного фактора TRF2 у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение транскрипционного фактора TRF2 у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 575.164:595.773.4

Копытова Дарья Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА TRF2 У DROSOPHILA

MELANOGASTER 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов Института биологии гена РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Георгиева С.Г.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Чуриков H.A.

кандидат биологических наук Мельникова Л.С.

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится 2005 года, в 11 часов на заседании

диссертационного совета Д 002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан: года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических наук Л С.

1767?

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Инициация транскрипции является ключевым шагом в контроле экспрессии генов Промоторы многих генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II, содержат 'ГАТА бокс, коровый элемент, необходимый для связывания преинициаторного комплекса (ПК). ПК состоит из ряда мультибелковых комплексов, так называемых общих факторов транскрипции. Ключевую роль в инициации транскрипции РНК-полимеразой II играет ГАТА-binding protein (ТВР). Этот белок входит в состав общего фактора транскрипции TFIID и отвечает за распознавание и связывание комплекса TFIID с ТАТА боксом. Связывание TFIID с промотором инициирует формирование преинициаторного комплекса.

Многочисленные исследования показали, что у многоклеточных организмов существуют специализированные промоторные последовательности и белковые комплексы, которые осуществляют координированную активацию функционально сходных генов Недавно у многоклеточных был обнаружен ген, кодирующий белок, содержащий домен с высокой гомологией к коровому домену ТВР. Этот белок был назван различными авторами TBP-related factor (TRF2), TBP-like factor (TLF) или TBP-like protein (TLP) (Dantonel, 1999; Rabenstein, 1999; Veenstra, 2000; Maldonado, 1999; Kaltenbach, 2000; Moore, 1999). Как и ТВР, большинство членов семейства TRF2 имеют высоко консервативный С-концевой коровый домен, содержащий два симметричных повтора, и вариабельный N-концевой домен. Как было показано, TRF2 активирует транскрипцию РНК-полимеразой 11 и взаимодействует с общими гранскрипционными факторами TFIIA и TFIIB Однако, несмотря на структурное сходство с ТВР, TRF2 не связывает классический ТАТА бокс и, возможно, контролирует транскрипцию определенного набора генов, отличного от такового у ТВР. Показано, что у С. elegans и Xenopus TRF2 необходим для эмбриогенеза, в то время, как у мыши TRF2 не нужен для раннего развития, но необходим для сперматогенеза (Dantonel, 2000; Martianov, 2001). У D .melanogaster была изолирована кДНК trfl гена, содержащая открытую рамку считывания (ОРС) для белка длиной 632 ак (Rabenstein, 1999). Однако структура гена trfl и функция TRF2 у D melanogaster осталась не исследованной.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

иг/ f

Цель и задачи исследования.

Ранее у D melanogaster была получена мутация lawc (leg-arista-wing complex), имеющая плейотропный эффект на фенотип мухи (Петрук, 1998) Полученная мутация оказалась слабой, поэтому в этой же лаборатории она была скомбинирована с plf' аллелем, который, как было показано, усиливает проявление мутации (Модестова, 2003). Мутация lawc была вызвана инсерцией Р-элемента в некодирующую область в районе 7Е6-8 X хромосомы. Недавно другими авторами было показано, что в этом районе локализован ген trß (Rabenstein, 1999), что позволило нам предположить, что мутация lawc влияет на экспрессию гена trß. Подтверждение данного предположения позволило бы исследовать функцию белка TRF2 у D. melanogaster.

Настоящая работа посвящена исследованию структуры гена trß Drosophila melanogaster и функции кодируемого им белка. В ходе исследования предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

- определить, является ли lawc мутацией гена trß\

- изучить структуру гена trß\

- изучить белок, кодируемый геном trß и исследовать его функции;

- найти гомологов белка TRF2 у различных видов Drosophila.

Научная новизна и практическая ценность работы.

К настоящему моменту исследовано большое количество разнообразных факторов, формирующих аппарат транскрипции. Однако имеющаяся схематичная картина работы факторов в ядре постоянно детализируется и корректируется благодаря большому объему вновь появляющихся исследований, посвященных факторам транскрипции и другим белкам ядра. Данная работа вносит вклад в понимание функции и значения белка TRF2 у D. melanogaster и, следовательно, в общую картину организации и работы факторов транскрипции

В работе проведено клонирование и изучение структуры гена trß. Показано, что ген trß кодирует белок с молекулярной массой 175 кДа. Найдены гомолога TRF2 у различных видов Drosophila Показано, что подобно TLF млекопитающих, TRF2 необходим для дифференцировки половых клеток самцов, обнаруживая тем самым, что функция TRF2 в сперматогенезе является эволюционно консервативной Впервые

была показана важная роль TRF2 для оогснсза. Наши данные также подтверждают участие TRF2 в организации хроматина Апробация работы.

Результаты работы были представлены на XIV Зимней Международной молодежной Научной Школе «Перспекчивные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), на III Международном Съезде Биохимического общества (С.-Петербург, 2002), на Международной конференции молодых ученых по Молекулярной Биологии и Генетике (Киев, 2003) и на Международной Конференции " Molecular genetics of eukaryotes " (Москва, 2003). Публикации.

По теме работы опубликовано 6 печатных работ. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 105 страницах и состоит из разделов Введение, Обзор литературы, Объект и задачи исследования, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение результатов, Выводы и Список литературы, содержит 12 рисунков. Библиография включает 202 источника.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Молекулярный анализ мутации lawc.

На первом этапе было определено, влияет ли мутация lawc на транскрипцию гена tr/2 Для этого было клонировано, секвенировано и точно локализовано место встраивания Р-элемента в аллель lawc. Оказалось, что место инсерции находится на расстоянии 15 т.п.н. выше локализации гена trf2. Нозерн блот гибридизация с зондами из района инсерции Р-элемента и из района ОРС TRF2 (рис. 1А), показала, чш оба зонда гибридизуюгея с общими транскриптами, длиной 7.2, 7 8, 11.2 i п.н. (рис. 1Б). Т.о. место инсерции Р-элемента находится в транскрибируемой зоне гена trfi.

Для проверки, влияет ли вызванная Р-элементом мутация на уровень транскрипции trf2, был проведен Нозерн блот анализ мРНК, выделенной из линий law/1, law/'prí'1 и линии дикого типа. Было выявлено, чю встраивание Р-элемента изменяет длину некоторых транскриптов (эти транскрипты гибридизуются с Р-элементом) и снижает уровень экспрессии гена trft (рис.2А). Изменение уровня экспрессии также подтверждают результаты RT-PCR (рис 2Б). Наконец,

изолированная нами ОРС /г/2 (см ниже) была клонирована в вектор рСаЯрей 3 и использована для спасения фенотипа линий 1т/сР1 и 1ан>сР1рк!'1. Было выявлено полное спасение мутантного фенотипа. Таким образом, 1смс является мутацией гена Гг/2 Это первая изолированная мутация данного гена у £> melanogaster.

Структура гена /г/2.

Изолированный ранее кДНК клон не содержал 5'-концевых

последовательностей гена (ЯаЬет^ет, 1999) Поэтому была поставлена задача получения полноразмерной кДНК Гг/2 Для получения кДНК были сконструированы праймеры, основанные на последовательностях, полученных в результате 3'- и V-ЯАСЕ. Был получен кДНК клон, длиной 7.2 т.п.н (рис. 1А). Сравнение нуклеотидной последовательности изолированного кДНК клона и геномной копии показало, что ген имеет одинадцагь экзонов, кодирующих ОРС белка длиной 1715 ак (рис 1А) Первые три экзона гена находятся в 5'ТЛИ и инсерция Р-элемента произошла во второй экзон Два больших интрона 7.6 т.п.н. и 4.7 т.п.н. находятся в 5' области гена (рис 1А). л

-юид 1

Р-элемент зонд 2

^^_^_гт^^^ижю-

Б

самцы <>амки

12 12

Рис. 1. Молекулярная структура гена trfl и его транскриптов.

А - экзон-интронная структура гена. Кодирующая область выделена черным цветом. Обозначены зонды, использованные для Нозерн блот анализа на участки lawc (зонд 1) и кодирующего часть гена trfl (зонд 2) и место инсерции Р-элемента в мутантной линии lawc '.Б - общие транскрипты lawc-trfl (7.8, 9.5, 11.2 т.п.н.) и один (7.2т.п н.), не содержащий области lawc. Нозерн блот гибридизация polyA+ РНК, выделенной из взрослых мух с зондами 1 и 2.

А

тубупин

Рис.2. Снижение уровня экспрессии гена trf2 при мутации.

А - Нтерн блот гибридизация ро1уЛ+РНК, выделенной из линий Oregon R, lawcpilawcPIphPI с зондом 2 (из кодирующей части гена tr/2) и Р-элементом. В качестве контроля использовался зонд на РНК гена тубупин.

Б - RT-PCR на polyA+PHK, выделенной из линий Oregon R, lawcPl, lawcp'phpl с праймеров из кодирующей области гена tr/2 В качестве контроля использовался фрагмент, полученный с праймеров к кодирующей области гена тубулина

Изучение белков, кодируемых геном trf2.

Для обнаружения соответствующего белка, кодируемого найденной нами ОРС, были получены поликлональные антитела к N-концевому и С-концевому пептидам TRF2 (рис. ЗА). Аффинно-очищенные антитела к С-концевому пептиду (Атб), полученные в двух кроликах, распознавали основной белок с молекулярным весом около 75 кДа (р75) в ядерном экстракте из эмбрионов D. melanogaster, этот белок соответствовал описанному ранее (Rabenstein, 1999) (рис. ЗБ). Однако Атб также более слабо узнавали белок с примерным молекулярным весом 175 кДа (р175). Этот же белок детектировался N-концевыми (Ат1) антителами: и иммунной антисывороткой и аффинно-очтценными антителами, полученными в двух кроликах (рис ЗБ). Кроме того, р175 исчезал на Вестерн блоте, при предварительной инкубации иммунной антисыворотки с пептидом, использованным для иммунизации (рис. ЗБ). Для проверки существования белка р175 была сконструирована плазмида для экспрессии, несущая кодирующую рамку считывания белка, на N-конец которой было присоединено три FLAG эпитопа; полученная конструкция, использовалась для трансформации в клеточной культуре D. melanogaster Ат1 узнавали эндогенный р175 и белок более низкого молекулярного веса, который узнавался также anti-FLAG антителами (рис. ЗВ). Таким образом, в дополнение к белку, описанному ранее, trf2

кодирует белок р175, который присутствует в ядерном экстракте из эмбрионов и в кулыуре клеток D melanogaster. Было проанализировано присутствие р175 и р75 в различных фракциях ядерного экстракта из эмбрионов D melanogaster Вестерн блот анализом. Фракционирование ядерного экстракта на гель-фильтрационной колонке Superóse 6 показало, что р175 входит в состав комплекса массой около 900 кДа Этот комплекс сходит во фракциях 21-23, в го время как пик элюции р75 соответствует фракциям с молекулярным весом 500 кДа. (рис.4А). Кроме того, небольшое количество р75 детектировалось также во фракциях, содержащих р175 (рис 4А).

ТВР гомология

coiled-coil

NLS coiled-coil NLS NLS NLS

Arl

Щ—кжЦ-

Атб

-gg|-1—

pl75

p75

Атб

В

1 2 3 4 5 6 7 8

pl75-p75-

12 3 4

pl75 h FLAG_Apl75

Рис.3. Структура и Вестерн блот анализ двух изоформ белка TRF2.

А - Структура белков р175 и р75. Обозначены: домен гомологи с ТВР, два мотива coiled-coil, сигналы ядерной локализации белка (NLS) и районы, использованные для получения антител Б - Вестерн блот анализ белкового экстракта из эмбрионов D melanogaster. Эмбриональный экстракт D melanogaster был нанесен в широкую ячейку и после переноса белков мембрана была разрезана на несколько полосок. Каждая полоска была окрашена с использованием различных первичных антител 1-2 - аффинно-очищенные антитела к С-концевому пептиду (Атб), полученные в двух различных животных; 3-4 - аффинно-очищенные ан1итела к N-концевому пептиду (Ат1), полученные в двух различных животных; 5 -антисыворотка к N-концевому пептиду; 6 - та же антисыворотка, предварительно истощенная пептидом, использованным для иммунизации; 7-8 нреиммунные сыворотки В - Вестерн блот анализ белкового экстракта из культуры клеток D melanogaster Для иммунного окрашивания были использованы Ат1 (1, 2) и антитела к FLAG эпитопу (3,4). 1-3 - клетки, трансформированные FLAG Apl75; 2-4 -контрольные нетрансформированные клетки.

Для дальнейшей характеристики комплексов, содержащих р175 и р75, эмбриональный экстракт D melanogaster был фракционирован на гепариновой колонке Ultrogel. Оба белка связывали гепарин при 0.1 М KCl, однако наибольшее количество р75 злюировалось 0.24 М KCl, в то время как р175 детектировался только в 0.6 М KCl фракции (рис.4Б).

Таким образом, наибольшее количество р75 и р175 присутствует в комплексах различного молекулярного веса и биохимических свойств.

670 цДа 440 кДа

A I I

15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 Ат1 мм.. — Р175

Атб — р175 Атб -----------— р75

т. элюция

3 0.24 М 0.6 М s 1 2 3 4 5 All — «-Р— - р175

Атб — р175

Атб»» — — — — р75

Рис.4. Хроматографическое разделение комплексов, содержащих р175 и р75. Для анализа фракций на Вестерн блоте использовали Ат1 и Атб антитела.

А - Вестерн блот анализ фракций ядерного экстракт, элюированных с гель-фильтрационной колонки Superóse 6. Колонка была калибрована стандартами тиреоглобулином (670 кДа) и феррнтином (440 кДа). Указаны номера фракций и масса элюируемых комплексов (сверху). Б - Вестерн блот анализ фракций ядерно1 о экс факта, элюированных с гепариновой колонки Ultrogel input - эмбриональный ядерный экстракт; 1-5 - элюция 0,24 М и 0,6 М KCl

Анализ гомологов TRF2 у различных видов дрозофилы.

Был произведен компьютерный анализ гомоло! ов изучаемого белка у D erecta,

D. yakuba, D ananassae, D. mojavensis, D. pseudoobscura, D. virilis. У всех рассмотренных видов обнаружены гомологи TRF2. Все TRF2 белки содержат С-концевой коровый домен, общий для всех ТВР подобных белков, отвечающий за связывание с общими факторами транскрипции TFIIA и TFIIB (рис. 5). У ближайших видов: D erecta, D yakuba, D. ananassae обнаружены белки длиной 1423 ак, 1739 ак и 1715 ак соответственно, эти белки кроме общего С-концевого домена имеют высокую гомологию в N-концевой части белка (рис. 5). TRF2 этих видов имеет один общий и

дополнительные домены coiled-coil, которые могут отвечать как за димеризацию белка, так и за белок-белковые взаимодействия Однако D mojavensis, D pseudoobscura. D virihs не содержат N-концевую последова1ельнос1ь и гомология между этими видами значительно выше, чем с D melanogaster, D erecta, D yakuba, D ananassae Кроме того, было найдено по два гомолога TRF2 у D mojavensis и D virilis (рис. 5)

D melanngawr 1715 нк

D erecta [423 ак

D yakuba 1739 ак

ü ananassae 1727 a«

D pseudoobscura 482 ак

D virilis I 387 ак

D vtrih\ 2 697 ак

D mojavenm I 656 ак

D mujmemis 2 442 ак

Рис 5 Схема строения белков TRF2 белков различных видов дрозофилы. D melanogaster - Drosophlla melanngaster; D ananas чае - Drosophila ananassae (contig_1812); D erecta - Drotophila erecta (contig_3332); D mojavensis I - Drosophlla mojavensis (contig_3652); D mojavensis 2 - Drosophila mojavensis (contig_3518); D pseudoohscura - Drosophila pseudoobscura (GA 1476), D virilis I - Drosophila virihs (contig_964); D virilis 2 - Drosophila virilis (contig_782); D yakuba - Drosophila yakuba (contig_34.36) 1емно-синим цветом обозначены домены гомологии ТВР, голубым -coiled-coil, ярко голубым Zn finger домены, красным - трансмембранный домен Указана длина белков

Анализ экспрессии гена trf2.

Mei одом Нозерн блот гибридизации было показано, что ген trj2 экспрессируется на разных стадиях развития D melanogaster, наибольший уровень транскрипции данного гена наблюдается у ранних куколок, самцов и самок (рис. 6А) Анализ РНК различных тканей взрослых мух показал, что основное количество мРПК гена trf2 содержится в яичниках и семенниках (рис 6Б) В гонадах были также найдены белки р!75 и р75 (рис.бВ)

9.5 7 8

Б sf В

s и _

■ я " 2

sï s я а I g

ы j; I a <u s

? S э- S S 2 ё

(S ce S ев ев V с

О О « О О О С

95 -в*»"* ••"-»11 2

7 ^ Щт "^-+7.2 ¡га

тубулин

Рис.6. Анализ экспрессии гена trf2 и белков р175 и р75.

А - Нозерн блот гибридизация polyA+PHK различных стадий развития D melanogaster. Для гибридизации использовали зонд 2.

Ь - Нозерн блот гибридизация ро!уА+РНК из различных тканей азрослых мух. Для гибридизации использовали зонд 2

В - Вестерн блот анализ тотального белка из различных тканей взрослых мух. Для анализа использовали Ат1 и Атб антитела.

Далее был исследован паттерн экспрессии TRF2 в яичниках и семенниках мух.

Анализ экспрессии TRF2 в яичниках D. melanogaster.

Как показано на рис. 7А TRF2 демонстрирует ядерную локализацию в яичниках самок. Белок обнаруживается в половых клетках самок, но не в соматических клетках (рис. 7А). Экспрессия TRF2, детектируется в стволовых половых клетках, и на всех дальнейших стадиях дифференцировки половых клеток (рис. 7А). Интересно, что высокий уровень TRF2 обнаруживается как в ядрах трофоцитов (питающих клеток), в которых идет очень активная транскрипция, так и в ядре ооцита (наиболее высокий уровень TRF2), который считается транскрипционно неактивным.

Хроматин в ядре ооцита находится в конденсированном состоянии,

(кариосома) Исследование на конфокальном микроскопе показало что в то время как некоюрая часть 1КЬ2 равномерно распределена по ядру, значительное количество белка колокализуется с кариосомой (рис 7А,В) Эти данные показывают, что ТКГ2 также связан с конденсированным транскрипционно неактивным хроматином

Отсутствие транскрипционно активного хроматина подтверждается нешачительным присутствием в ядре оопиы основного транскрипционно!о фактора ТПР (рис 7Д) Следовые количества ТВР, обнаруженные в ядре присутствуют в двух ючках (рис 7Ь) вероятно являющихся спекгросомами ТВР был обнаружен в ядрах трофоциток и, в противоположность ТЯБ2 в ядрах соматических клеток яичников

Мутация 1ам>с1'1рИ''1, приводящая к полной стерильности самок, вызывает значительное уменьшение экспрессии ТКР2 в яичниках (рис 7Б). Содержание Т№2 в ооци!е также сильно уменьшается В ооците мугантных мух кариосома часю выглядит более диффузной, чем в ооците мух дикого типа на той же стадии; Это указывает, что хроматин в мутантных мухах конденсирован не полностью (рис 7Б,Г) Конденсация хроматина наиболее сильно нарушается в цистах с наименьшим количеством ТЯР2 (рис 7Г) Т.о. наблюдается обратная корреляция между уровнем конденсации хроматина и содержанием ТЛР2 в ядре.

ДНК наложение ТЯР2 ДНК наложение

■н

ТВР ДНК наложение ТВР ДНК наложение

Рис 7 Экспрессия ТЯР2 и ТВР в яичниках самок дикого типа и мутантных самок.

Л-Б - конфокальное изображение гермариума (Ос) и развивающихся цист из овариолей самок дикого типа (А) и линии ¡(шс^'р^1 (Б) окрашенных про! ив ТЯР2 (зеленый) и ДНК (красный). Обозначены: ядра различных соматических клеток (концевые филамепты ^Гс), клетки верхушки (сс), внутренние клетки оболочки (^с), фолликулярные клетки (Л;)) и клеток зародышевой линии (стволовые клетки ^эс), трофоциты (пс) и митшически делящиеся цистоциты (суя)) В - колокализация ТКР2 с ДНК (увеличенное изображение (А), показывающее ядро ооцита). Д - конфокальное изображение цисты 5 стадии, окрашенной против ТВР (зеленый) и ДНК (красный). Е - колокализация ТВР с ДНК (увеличенное избражение (Д), показывающее ядро ооцита). Г - конфокальное изображение цисты 5 стадии самок линии 1стс1''рИ окрашенной ТЯБ2 (зеленый) и ДНК (красный). На всех препаратах ДНК окрашена пропидиумом йодидом, для детекции тар2 были использованы Ат1 и поликлональные антитела были использованы для детекции ТВР.

Анализ экспрессии ТЯР2 в семенниках И. те1апод(Шег.

Иммуноокрашивание семенников личинок и взрослых мух не выявило ТКР2 в стволовых клетках и в половых клетках на стадии митотического деления Экспрессия ТЯБ2 появляется в ядрах первичных сперматоцитов, после перехода от митотических делений к 02 фазе мейоза (рис 8А, Б, В). Пик экспрессии наблюдается в зрелых первичных сперматоцитах (рис.8А, Б, В). ТИР2 исчезает из ядер после делений мейоза (рис.8 Б, В) Высокий уровень экспрессии ТШ^ в первичных сперматоцитов показывает его существенную роль в регуляции генной экспрессии на этой стадии.

Паттерн экспрессии TRF2 в семенниках взрослых самцов был сравнен с паттерном ТВР. В отличие от TRF2, высокий уровень экспрессии ТВР был найден в митотически делящихся половых клетках (рис. 8Г). Количество ТВР быстро уменьшается в первичных сперматоцитах, исчезая в зрелых первичных сперматоцитах и на всех последующих стадиях. ТВР присутствует в ядрах соматических клеток (рис 8Г). Таким образом, паттерны экспрессии ТВР и TRF2 в сперматогенезе являются комплементарными друг другу (рис. 8Б, В). Гибридизация РНК in situ с пробами trfi и tbp на семенниках взрослых мух подтвердила данные, полученные методом иммуноокрагаивания. Наибольший уровень транскрипции trfi наблюдался на стадии первичных сперматоцитов В то время как транскрипция tbp выявлялась преимущественно в апикальной части семенников на стадии митотически делящихся половых клеток (рис. 8Д).

На стадии ранних первичных сперматоцитов TRF2 распределен в ядре достаточно равномерно, его паттерн лишь частично перекрывается с ДНК (рис. 8Е). Однако в конце этой стадии, ког да хромосомы конденсируются перед первым делением мейоза, весь TRF2 связывается с хроматином (рис. 8Ж), что указывает на возможную функцию TRF2 в конденсации хроматина.

Самцы lawcp'php> обладают пониженной фертильностью. Всстерн блог анализ показал, что количество р175 и р75 значительно уменьшается в семенниках самцов lawcPlphP1 по сравнению с самцами дикого типа. Иммуноокрашивание семенников самцов lawcH' php> выявило значительное количество дефектов в первичных сперматоцитах на поздних стадиях дифференцировки. Наблюдаемый фенотип показал, что TRF2 необходим в первичных сперматоцитах для входа в деления мейоза, в частности, TRF2 важен для конденсации хроматина и правильной сборки хромосом.

) рашпм перехода от ШПШЫЧССьИЛ лсчсилй МсГк1 Г»'

ИНЫМ ПС|>ЙИ'|НЫХ

спе| члпциш» (рост I ^сп|>есси11 1енов)

)р<?тые первичные слсрматониты

кисти меГюги'кскн яеллшихся сперма ищи топ

гг/2-<шьелч; сЬр-шкепье

I

ТКГ2 ДНК наложение

гг/2-5<шс (Ьр-ялш;

Рис.8. Экспрессия ТЯ1-2 и ТВР в семенниках самцов дикого типа.

А - диаграмма семенников взрослых мух, показывающая главные стадии дифференцировки Б - иммуноокрашивание семенников взрослых мух антителами к ТКР2. Маленькие стрелки показывают цисты зрелых первичных сперматоцитов, стрелки указывают на цисгы, претерпевающие мейозические деления В -иммуноокрашивание семенников личинки третьего возраста против ТКР2 и ДНК Г -иммуноокрашивание семенников взрослых мух антителами к ТВР. Сильный сигнал ТВР, соогвегствующий соматическим клеткам, показан стрелками. Размерные стрелки на А-Г показывают область перехода от митотической (спсрматогонии) к мейошческой (первичные спермагоциты) программе дифференцировки Д -гибридизация т чИи семенников взрослых мух Сверху показаны результаты гибридизации РНК с зондами 1г/2 и гЬр Снизу приведены результаты 1ибридизации с вепве-зондом (отрицательный контроль). Е - первичные сперматоциты и клетки цист, окрашенные ТЯГ2 и ДНК. ТИР2 отсутствует в ядре клеток соматических цист (обозначены звездочками) Ж - ядра поздней профазы мейоза, окрашенные ТШ-^ и ДНК. На всех препаратах ДНК была окрашена или ОАР1 (голубой) или пропидиумом йодидом (красный), для детекции ТПР2 использовались Ат1, для детекции ТВР -поликлональные антитела.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

В данной работе был изучен ген 1г/2 В те1апо%а$1ег и кодируемый им транскрипционный фактор ТНР2. ТМ-! имеет домен, гомологичный ДНК

связывающему домену основного транскрипционного фактора ТВР, однако не связывается с ТАТА-промотором Логично было бы предположить, что TRF2 активирует экспрессию определенной группы промоюров. Однако до сих пор не было показано, что TRF2 способен связываться с какой-либо специфичной последовательностью ДНК. Таким образом, молекулярный механизм действия TRF2 и его функция у высших эукариот представляют большой интерес и во многом остаются неясными.

Для изучения структуры гена trfi нами был изолирован кДНК клон, длиной 7.2 т п.н , который имеет одинадцать экзонов (три экзона находятся в 5' нетранслируемой области) Нозерн блот гибридизация выявляет несколько транскриптов, соответствующих trfi, длиной 11.2 т.п.н., 9.5 т.п.н., 7.8 т.п.н., 7.2 т.и.н.. Таким образом, изолированный клон оказывается короче большинства обнаруженных мРНК Мы не проводили клонирования и точного определения последовательности каждого из этих транскриптов Однако наши данные указывают, что они отличаются нстранслируемыми 5' и 3'- концевыми областями.

Ранее был показан ткане-специфичный паттерн экспрессии гомологов trfi у человека и мыши. В данной работе показано, что ген D melanogaster также обладает ткане-специфичной экспрессией: транскрипт длиной 112 т п н. экспрессируется в голове мух и транскрипты длиной 7 8 т.п н. и 9.5 т.п.н. - в гонадах Транскрипт, длиной 7.2 т.п.н., выявляемый зондом к открытой рамке считывания TRF2, также являекя специфичным для гонад. Этот транскрипт не содержит области инсерции Р-элемента, и мутация не изменяет его длину. В то же время уровень экспрессии этого фанскриша у мучантных мух уменьшается. Скорее всего, существует сложная многоуровневая регуляция экспрессии гена trfi, который, по нашим предварительным данным, имеет два промотора, и содержит несколько сигналов терминации транскрипции в 3' области.

Изолированный кДНК клон содержит открытую рамку считывания для белка, длиной 1715 ак, что позволило предположить, что наряду с TRF2, описанным ранее, существует более длинная форма этого белка. В данной работе действительно было выявлено два белка TRF2: белок с молекулярной массой 75 кДа, который, как мы показали, соответствует описанному (Rabenstein, 1999), и новый белок с молекулярной массой 175 кДа. По сравнении с р75, р175 имеет дополнительную

длинную N-концевую последовательность Наиболее вероятно, что существование двух белков является результатом альтернативного сплайсинга мРНК trf2 Однако полученные данные не позволяют исключить и того, что р75 является результатом протеолизар175.

Наши эксперименты не выявили разницы в локализации двух форм белка на политснных хромосомах, что указывает на сходство их функций Однако р175 и р75 присутствуют в белковых комплексах с разной молекулярной массой с различными биохимическими свойствами. Вероятно, это объясняется тем, что coiled-coil мотивы, найденные в N-концевой части р175 взаимодействуют с другими белками Ранее было показано, что мотив coiled-coil, найденный в большом количестве транскрипционных факторов, участвует как в димеризации белка, так и в белок-белковых взаимодействиях.

В работе были найдены гомологи TRF2 у отдельных видов Drosophila: D erecta, D yakuba, D ananassae, D. mojavensis, D. pseudoobscura, D. virilis. Все белки имеют высококонсервативные С-концевые домены гомологичные ТВР (84% гомологии). Виды близкородственные D melanogaster (D erecta, D yakuba, D ananassae), имеют высокую гомологию в N-концевой части белка и имеют домены coiled-coil Однако у более эволюционно отдаленных видов Drosophila: D mojavensis, D pseudoobscura, D virilis N-концевой домен отсутствует. У видов D mojavensis и D virilis появилось по два юмолога TRF2 Эти белки попарно сходны между собой' 387 ак D virilis и 442 ак D mojavensis; 697 ак D virilis и 656 ак D mojavensis. Белки D virilis 1 и D mojavensis 2 имеют на С-конце Zn-finger ДНК-связывающий домен. Возможно, отсутствие N-концевого участка в этих белках компенсируется данным доменом или же эти белки приобретают дополнительные свойства. Белки D. virilis 2 и D mojavensis 1 также очень схожи между собой, но TRF2 D virilis 2 имеет трансмембранный домен, которого не было найдено в D mojavensis 1 (рис 5)

В данной работе был проведен молекулярный анализ мутации lawc Было показано, что инсерция Р-элемента, вызвавшая мутацию, произошла в транскрибируемую некодирующую область гена trf2 Было выявлено, что встраивание Р-элемента значительно понижает уровень транскрипции гена trf2. Таким образом, было показано, что мутация lawc является первой изолированной

мутацией гена trf2. Изолированная мутация дала возможность исследовать значение белка TRF2 для развития D. melanogaster.

Ранее было показано, что TLF необходим для сперматогенеза у мыши (Martianov, 2001, 2002). В нашей работе было показано, что TRF2 необходим для развития половых клеток у самок и самцов D melanogaster. Методом иммуноокрашиваиия было выявлено присутствие TRF2 в половых клетках, но не в соматических клетках гонад. Интересно, что высокий уровень ТВР был обнаружен в ядрах соматических клеток.

Накопление TRF2 в ядрах половых клеток самцов совпадает с началом G2 фазы мейоза, его количество увеличивается при росте первичных спермагоцитов. В отличие от TRF2, ТВР не детектируется в первичных сперматоцитах. Полученные данные показывают, что TRF2 может служить главным фактором инициации транскрипции на данной стадии дифференцировки половых клеток самцов Множество генов, необходимых для дальнейших делений мейоза и последующей дифференцировки сперматид, экспрессируюгся в первичных сперматоцитах (Fuller, 1998) Можно предположить, что TRF2 вовлечен в поддержание этой клеточно-специфичной транскрипционной программы.

Таким образом, также как TLF млекопитающих, TRF2 необходим для дифференцировки половых клеток самцов, обнаруживая 1ем самым, что функция TRF2 в сперматогенезе является эволюционно консервативной.

В нашей работе впервые была показана важная роль TRF2 для оогенеза D. melanogaster Экспрессия TRF2 была найдена в половых клетках самок на всех стадиях дифференцировки. TRF2 был обнаружен в трофоцитах, в которых идет интенсивная транскрипция. В этих клетках синтезируется множество белков, необходимых для последующих делений мейоза и последующего развития ооцита и эмбриона Высокий уровень TRF2, найденный в половых клетках у обоих полов на стадии G2 мейоза предполагает участие TRF2 в контроле экспрессии генов, вовлеченных в регуляцию мейоза. Множественные аномалии, выявленные в дифференцировке половых клеток мугантной линии lawcPlphFI на стадии делений мейоза, подтверждают это предположение.

Несмотря на то, что TRF2 был обнаружен в клетках, имеющих статус активной транскрипции, таких как трофоциты и первичные сперматоциты, паттерн его

экспрессии не всегда совпадает с активной транскрипцией. Высокое содержание TRF2 было найдено также в ядре ооцита, в котором хроматин высоко конденсирован (Spradling, 1993). Большое количество TRF2 присутствовало в ядре первичных сперматоцитов, когда хроматин начинает быстро конденсироваться при подготовке к мсйозу Таким образом, и в самцах и в самках TRF2 присутствует в транскрипционно неактивных половых клетках, характеризующихся конденсированным хроматином Полученные данные дают основание предположить, что TRF2 может принимать участие в организации хроматина

Изучение нарушений, вызванных мутацией гена trfl, подтверждают это предположение И в ooiwiax, и в первичных сперматоцитах мутация trfl вызывает дефекты в конденсации хромосом в мейозе. Возможно, TRF2 контролирует экспрессию соответствующих генов. Однако, высокий уровень TRF2 на стадии, предшествующей делениям мейоза, и связывание TRF2 с конденсированным хроматином указывает, что, скорее всего, он может напрямую принимать участие в эгом процессе. Примечательно, что TLF мыши, как было показано, принимает участие в организации хромоцентра (Martianov, 2002).

Ранее был изолирован комплекс, содержащий короткий белок TRF2 (р75) (Hochheimer, 2002). Данный комплекс также содержит компоненты хроматин-ремоделирующего комплекса NURF, в частности ISWI АТФазу, которая, как было показано, вовлечена в образование и поддержание структуры хроматина высшего порядка (Corona, 2004). Возможно, обе формы TRF2 участвуют в организации хроматина, рекрутируя ISWI и другие хроматин-ремоделирующие факторы. Дальнейшие эксперименты должны прояснить эту гипотезу.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что мутация lawe D. melanogaster, является мутацией гена, кодирующего транскрипционный фактор TRF2.

2 Охарактеризована экзон-интронная структура гена trfl Показано, что ген trfl кодирует белок длиной 1715 ак

3. Выявлено, что ген trfl транскрибируется на всех стадиях развития и в различных тканях имаго.

4 Обнаружен новый белок TRF2 (р175), который, в отличие ш описанного ранее TRF2 (р75), содержит N-концевую последовательность длиной 1083 ак. Показано, что р175 и р75 входят в состав различных белковых комплексов.

5. Найдены гомологи TRF2 у различных видов Drosophila Показано единство структуры гомологов TRF2 у видов, близкородственных D melanogaster.

6. TRF2 присутствует как в клетках с активной транскрипцией, так и транскрипционно неактивных клетках В транскрипционно неактивных клетках белок связан с конденсированным хроматином, и понижение уровня белка в мутантных мухах нарушает конденсацию хроматина.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ. Статьи:

1. Модестова Е.А., Копытова Д.В., Георгиева С.Г., Симонова О.Б. «Использование генетической системы химерного белка P-Ph для репрессии транскрипции гена leg-arista-wing complex у Дрозофилы». Генетика, 2003, том 39, №5, сгр.713-716.

2. Копытова Д.В., Краснов А.Н., Симонова О.Б., Модестова Б.А., Корочкин Л.И., Гсоршева С.Г. «Изучение гена lawc-trfi drosophila melanogaster и его белкового продукта». ДАН, 2005, том 405, №1, стр. 1-3.

Тезисы конференций:

1. Лебедева Л.А., Шидловский Ю.В., Модестова Е.А., Копытова Д.В. "Исследование enhancer of yellow 3 и TRF2 - новых транскрипционных факторов РНК полимеразы II." Тезисы «III съезд биохимического общества» 26.06.2002-01.07.2002, Санкт-Петербург, стр.406

2. D.Kopitova, L.Lebedeva, O.Simonova, A.Krasnov "Studing the expression of Trf2 gene." Тезисы «Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics" September 25-27, 2003, Kyiv, Ukraine, p.83.

3. D.Kopitova, AKrasnov "Studing the expression of Trf2 gene." Тезисы международной конференции "Molecular genetics of eucaryotes", Moscow, 2003, p.17.

4 EModestova, I.Mertsalov, D.Kopytova, O.Simonova "LEG-ARISTA-WING COMPLEX: Destabilization of cytological region, analysis of mutant alleles, rescue

20

experiments and screening of genes with related function." Тезисы международной конференции "Molecular genetics of eucaryotes", Moscow, 2003, p. 13

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел: 939-33-38 Тираж 70 экз. Подписано в печать 19. 09. 2005 г.

»17 07!

РНБ Русский фонд

2006-4 11614

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Копытова, Дарья Владимировна

Список сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы.

PIC (Preinitiatory complex).

РНК-полимераза П.

РНК полимераза И и его CTD.

Холофермент РНК-полимеразы II.

Свойства коровых промоторных элементов РНК полимеразы II.

TATA бокс.

ТАТА-связывающие факторы.

Инициаторный элемент (Inr).

DPE (Downstream promoter element).

TFIIB распознающий элемент.

Проксимальный элемент (proximal sequence element - PSE).

Другие коровые промоторные элементы.

CpG островки (islands).

GTFs.

TFIIB.

TFIIF.

TFIIE.

TFIIH.

TFIIA.

TFIED.

Корегуляторы.

TAFs.

Медиаторный комплекс.

Семейство TRF (ТВР-подобных факторов).

TRF1.

TRF2/TLF/TLP.

TRF2 необходим для эмбрионального развития и дифференцировки.

TRF2 мыши необходим для сперматогенеза.

TRF2 управляемая промотор-селективная генная экспрессия у дрозофилы.

TRF3.

Регуляторный ген Drosophila leg-arista-wing complex (lawc).

Объект и задачи исследования.

3. Материалы и методы.

1. Реактивы.

2. Программное обеспечение Базы данных.

3. Работа с ДНК.

Приготовление компетентных клеток и трансформация. Выделение плазмидной

ДНК. Рестрикция, лигирование, переосаждение ДНК, гель-электрофорез.

Введение радиоактивной метки в ДНК-зонд.

5. Работа с РНК.

Выделение тотальной РНК.

Очистка polyA+ РНК.

Получение кДНК, ОТ-ПЦР, 5'-, З'-RACE.

Нозерн анализ.

6. Генетические скрещивания, фенотипический анализ trf2 мутантов.

7. Работа с белками.

Экспрессия и очистка рекомбинантных белков.

Получение антител и их очистка.

Белковый гель-электрофорез.

Иммуноблоттинг.

Dot-blot.

Выделение эмбрионального ядерного экстракта.

Хроматография.

Получение белковых экстрактов из эмбрионов.

8. Гибридизация in situ.

Гибридизация семенников in situ.

9. Иммуноокрашивание.

Иммуноокрашивание политенных хромосом.

Иммуноокрашивание эмбрионов.

Иммуноокрашивание яичников и семенников.

10. Работа с эмбриональными клетками D.melanogaster.

4.Результат ы.

1. Изучение структуры гена trf2.

Картирование мутации lawc.

Исследование влияния мутации lawc на уровень экспрессии гена trf2.

Клонирование кДНК trf2.

2.Изучение белков, кодируемых геном trf2.

3. Иммуноокрашивание хромосом и хроматография.

Локализация на политенных хромосомах слюнных желез Drosophila melanogaster.66 Хроматографическое исследование.

3. Анализ гомологов TRF2 у различных видов Drosophila.

4. Анализ экспрессии гена trf2.

Нозерн развития.

Нозерн тканей.

Вестерн блот гибридизация тканей.

Иммуноокрашивание яичников.

Иммуноокрашивание семенников антителами к TRF2 и ТВР.

Гибридизация семенников in situ.

Вестерн блот анализ семенников мутантных мух.

5. Обсуждение результатов.

6. Выводы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение транскрипционного фактора TRF2 у Drosophila melanogaster"

Инициация транскрипции у эукариот нуждается в наборе определенных общих факторов транскрипции. Ключевую роль в инициации транскрипции всех классов РНК-полимераз играет TATA-binding protein (ТВР) [18, 22, 24, 57]. Этот белок входит в состав мультибелкового комплекса TFIID и отвечает за распознавание и связывание комплекса TFIID с TATA боксом, коровым элементом, общим для многих промоторов. Связывание TFIID с промотором инициирует формирование преинициаторного комплекса. Кроме ТВР в этот комплекс входят дополнительные ТВР ассоциированные факторы (TAFs). С-концевой домен ТВР высоко консервативен среди эукариот и содержит два симметричных повтора, которые складываются в «седловидную» структуру, необходимую для взаимодействия с последовательностью промотора [80, 83].

Второй ген, кодирующий белок с высокой гомологией к коровому домену ТВР, TBP-related factor (TRF2), также называемый TBP-like factor (TLF) или TBP-like protein (TLP), был обнаружен во всех многоклеточных [31, 77, 102, 111, 122, 123,136, 178]. Как и ТВР, большинство членов TRF2 семейства имеют высоко консервативный С-концевой коровый домен, содержащий два симметричных повтора, и вариабельный N-концевой домен. Как было показано, TRF2 активирует транскрипцию РНК-полимеразой II и взаимодействует с TFIIA и TFIEB, компонентами преинициаторного комплекса РНК-полимеразы П. Однако несмотря на структурное сходство с ТВР, TRF2 не связывает классический TATA бокс и, возможно, контролирует транскрипцию определенного набора генов, отличного от такового у ТВР [31,111, 124, 136,173].

Показано, что у С. elegans и Xenopus TRF2 необходим для эмбриогенеза, в то время как у мыши TRF2 не нужен для раннего развития, но необходим для сперматогенеза [30, 107]. У D. melanogaster была изолирована кДНК trf2, содержащая открытую рамку считывания (ОРС) для белка длиной 632 ак [136]. Данный белок был охарактеризован на молекулярном уровне. Однако структура гена trf2 и функция TRF2 у D. melanogaster осталась не исследованной.

Целью данной работы было изучение функции TRF2 в развитии Drosophila melanogaster.

Использовались разнообразные физико-химические методы работы с ДНК, РНК, белками, методы биоинформатики. Исследована экспрессия гена, показано, что в дополнение к TRF2 полипептиду, описанному ранее, trf2 ген кодирует более длинный полипептид, размером 175 кДа. Продемонстрировано, что TRF2 является ткане-специфичным фактором и необходим на разных стадиях развития Drosophila melanogaster.

2. Обзор литературы

Регуляция транскрипции является ключевым шагом в контроле экспрессии генов. В данном процессе происходит комбинаторное взаимодействие c/s-регуляторных элементов ДНК и многих транскрипционных факторов. Недавние исследования показали, что многоклеточные организмы обладпют специализированными комплексами инициации транскрипции и промоторными последовательностями, которые координирование управляют регуляцией генов.

Регуляция транскрипции намного более сложна у эукариот, нежели у микроорганизмов. У микроорганизмов регулируются 800-6000 генов, их промоторы находятся в пределах 100-200 п.н. в области начала транскрипции, каждый промотор контролируется только 1-4 сиквенс-специфическими ДНК-связывающими белками. В то же время, животные имеют 14000-80000 генов, множество промоторов, распространяющихся на десятки тысяч нуклеотидов, которые могут регулироваться 40 или более сиквенс-специфическими ДНК-связывающими белками. Кроме того, животные имеют 80-250 типов клеток. Однако этим сложность регуляции транскрипции эукариотических организмов не исчерпывается. Изучение экспрессии выбранных случайным образом генов в эмбрионах дрозофилы показало, что даже среди клеток одного клеточного типа, большинство мРНК экспрессируются на различном уровне [87, 94]. Так, в сущности, каждая клетка у животных может иметь уникальный уровень транскрипции генов. В дополнение к этому, происходят постоянные изменения в транскрипции в течение развития организма и в ответ на перемены в окружающем пространстве.

Drosophila melanogaster, в настоящее время является наиболее удобной моделью для изучения. Трансгенный анализ в этих организмах быстр и дешев [5, 163]. Для биохимических исследований, имеют значение белковые экстракты, которые можно получить из мух и эмбрионов в большом количестве, что позволяет осуществить очистку регуляторов и общих транскрипционных факторов [162]. Несмотря на высокую сложность, модель Drosophila проще, чем Vertebrata. Результатом этого является глубокое изучение механизмов транскрипции эукариот на примере Drosophila melanogaster.

PIC (Preinitiatory complex)

Для инициации транскрипции белок-кодирующих генов необходимо образование преинициаторного комплекса (PIC), состоящего из матрицы ДНК, РНК-полимеразы II и 5 общих транскрипционных факторов. Образование PIC происходит посредством связывания ТВР, субъединицы TFIID, с TATA боксом, последующего согласованного привлечения TFIIB, комплекса нефосфорилированной РНК-полимеразы П с TFIIF, TFIIE и TFIIH. После изменения промотора и инициации транскрипции, CTD домен большой субъединицы РНК-полимеразы II фосфорилируется. Это событие приводит к началу элонгации транскрипции. Последующая терминация (фосфатазное возвращение РНК-полимеразы II в ее нефосфорилированную форму) позволяет GTFs и РНК-полимеразе II инициировать следующий раунд транскрипции.

РНК-полимераза II

РНК-полимераза П является ферментом, ответственным за транскрипцию белок-кодирующих генов у эукариот. РНК-полимераза П катализирует ДНК-зависимый синтез мРНК, но не способна инициировать промотор-зависимую транскрипцию или отреагировать на действие регуляторных белков транскрипции в отсутствие других факторов. Современное представление о механизме инициации транскрипции изменилось после открытия возможности транскрипции в бесклеточных системах. Оказалось, что очищенная РНК-полимераза II млекопитающих может избирательно инициировать транскрипцию с матрицы ДНК при добавлении ее в клеточный экстракт грубой очистки. Этот факт позволил в дальнейшем идентифицировать GTFs, факторы, необходимые для аккуратной инициации транскрипции РНК-полимеразой II in vitro.

Хотя присутствия GTFs достаточно для осуществления базальной транскрипции РНК-полимеразой П, активация транскрипции в ответ на связывание промотор-специфических активаторов нуждается в дополнительных факторах, называемых транскрипционными коактиваторами. Большинство этих «необщих» факторов необходимы для экспрессии всех генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II [192].

РНК-полимераза П была локализована только в пределах кодирующих областей экспрессируемых генов. РНК-полимераза П (Mw 500-600 кДа) имеет консервативную мультисубъединичную структуру. Показано, что 40-50% аминокислотной последовательности этого белка идентичны в различных эукариотических организмах [149].

Особенно хорошо исследована РНК-полимераза П дрожжей, которая состоит из 12 субъединиц, кодируемых генами от RPB1 до RPB12 соответственно [191]. Интересно, что шесть субъединиц РНК-полимеразы II человека могут функционально заменять их гомологи в дрожжах [108]. Две самые большие субъединицы РНК-полимеразы II, Rbpl (~200 кДа) и Rbp2 (-150 кДа), являются наиболее консервативными субъединицами. Кроме того, Rpbl и Rpb2 являются гомологами р' и р субъединиц соответственно, бактериальной РНК-полимеразы. Белок Rpb3 родственен а субъединице бактериальной РНК-полимеразы [191]. Ни одна из субъединиц РНК-полимеразы II не является родственной бактеральной а-субъединичной семье, хотя найдено структурное и функциональное сходство между а и определенными GTFs. Rpbl, Rpb2, Rpb3 и Rpbll субъединицы РНК-полимеразы II гомологичны субъединицам РНК-полимераз I и III. Кроме того, пять субъединиц: Rpb5, Rpb6, Rpb8, RpblO и Rpbl2 являются общими для всех трех РНК-полимераз. Только Rpb4, Rpb7 и Rpb9 уникальны для РНК-полимеразы II. Десять генов дрожжей, кодирующих субъединицы РНК-полимеразы II являются необходимыми для жизнеспособности клеток [51].

РНК полимераза II и ее CTD

Все известные клеточные РНК-полимеразы, включая эукариотические РНК-полимеразы I, II и III и прокариотические РНК-полимеразы, удивительно схожи между собой по составу, аминокислотной последовательности и функции. Большая субъединица РНК-полимеразы П имеет С-концевой домен (CTD), содержащий гептадный повтор с консенсусной последовательностью Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. CTD специфичен для РНК-полимеразы П, высоко консервативен среди эукариотических организмов, и играет ключевую роль в регуляции инициации транскрипции и координации котранскрипционных событий процессинга [192]. Длина этого повтора варьирует. Например, Rpbl дрожжей включает 26 или 27 повторов, у C.elegans - 34, у Drosophila — 43, и CTD человека содержит 52 повтора. Существует предположение, что длина повтора увеличивается с увеличением сложности генома. Извесны две формы РНК-полимеразы И: IIO, в которой CTD домен фосфорилирован и ПА, в которой он не фосфорилирован. Чаще всего IIA форма входит в PIC, в то время как ПО форма обнаруживается в комплексах элонгации. События процессинга РНК, вызываемые фосфорилированием CTD, включают кэпирование 5' конца, сплайсинг и присоединение 3-ро1у(А) [192].

Холофермент РНК-полимеразы II

До сих пор остается открытым вопрос о том, может ли холофермент РНК-полимеразы II сам индуцировать транскрипцию in vitro или требует присутствия белков из клеточного экстракта, т.к. бывает довольно трудно решить, можно ли считать тот или иной полипептид, участвующий на определенных стадиях транскрипции, составной частью РНК-полимеразы или же дополнительным компонентом. Из ядерного экстракта печени млекопитающих с помощью моноклональных антител к киназе M015/CDK7 С-РНК-полимеразы П был выделен комплекс, содержащий все компоненты, требующиеся для эффективной промотор-специфической инициации транскрипции на линейной и кольцевой ДНК [128]. Холофермент состоял из 12 субъединиц и, в отличие от дрожжевых компонентов, полученных ранее в других опытах, не требовал добавления факторов ТВР и TFIIE для успешной транскрипции, т.к. уже содержал эти компоненты. Предположили, что фракция РНК-полимеразы II содержит большой комплекс, который назвали "РНК-полимераза II холофермент". Этот большой белковый конгломерат содержит кор РНК-полимеразы II (мультибелковый фермент, который традиционно обозначают как РНК-полимераза II), субпопуляцию общих транскрипционных факторов (таких как TFIIB, TFIIE, TFIIF и/или TFIIH), 9 SRB белков (супрессоров РНК-полимеразы В) и другие известные (такие как GAL11, SIN4, RGR1 и ROX3) и неизвестные белки [74].

Свойства коровых промоторных элементов РНК полимеразы II

Транскрипция белок-кодирующих генов эукариот включает в себя ряд событий, таких как, деконденсацию локуса, ремоделинг нуклеосом, модификации гистонов, связывание транскрипционных активаторов и коактиваторов с энхансерами и промоторами и взаимодействие основного молекулярного аппарата транскрипции с коровым промотором. Внутренний промотор содержит: коровый регион, проксимальный промотор и дистальную энхансерную область. Коровый промотор - это последовательность ДНК, которая располагается на расстоянии -35 п.н. upstream и/или downstream от сайта инициации транскрипции. В основной молекулярный аппарат транскрипции входят: РНК-полимераза П и факторы, которые минимально необходимы для транскрипции in vitro с изолированного корового промотора (основные/общие факторы транскрипции). TATA бокс является основным, наиболее изученным коровым промоторным элементом. Стабильный комплекс преинициации транскрипции на ТАТА-зависимых коровых промоторах формируется ассоциацией основных факторов транскрипции в следующем порядке: TFIID/TFIIA, TFIIB, РНК-полимераза II/TFIIF, TFIIE, TFIIH. Свойства основных факторов транскрипции и механизм, по которому они действуют достаточно хорошо изучены.

Хотя ранее считалось, что коровые промоторы РНК-полимеразы II неизменны, было обнаружено, что они имеют значительные структурные и функциональные различия. Оказалось, что различные коровые промоторы вносят важный вклад в комбинаторную регуляцию генной экспрессии.

ТА ТА бокс

TATA бокс является первым коровым промоторным элементом, обнаруженным в белок-кодирующих генах. Фактически во всех генах, транскрибируемых РНК-полимеразой II, последовательность ТАТААА присутствует на расстоянии 25-30 п.н. upstream от сайта старта транскрипции. Было показано, что мутации в TATA последовательности обычно уменьшают активность клеточных и вирусных промоторов или делают их неактивными [14, 68]. Если инициация транскрипции с мутантного промотора остается заметной, то смещается старт инициации транскрипции. В Saccharomyces cerevisiae, TATA бокс также необходим для инициации транскрипции, но в этом организме данный элемент располагается на расстоянии 40-120 п.н. upstream от сайта старта [165].

Компьютерный анализ базы данных генов Drosophila melanogaster показал, что ТАТААА последовательность или последовательность с одной нуклеотидной заменой в ней представлена в 43% из 205 коровых промоторов или, по другим исследованиям, в 33% из 1941 потенциальных промоторов [89,126].

Было показано, что последовательность 5'-TATATAAG-3' является оптимальной для распознавания основным фактором транскрипции ТВР (TATA binding protein) [190]. Однако в других экспериментах было выявлено, что широкое число А/Т-богатых последовательностей могут функционировать как TATA боксы, и взаимодействовать с ТВР. Результаты структурного анализа и статистические данные показали, что для активности TATA бокса три нуклеотида (в позициях 2, 4 и 5) должны оставаться неизменными [161].

Хотя большинство исследований TATA бокса было проведено на дрожжах, дрозофиле и человеке, аналогичные элементы были найдены и в более древних эукариотах, например у архея.

TATA боксы или АТ-богатые последовательности на фиксированном расстоянии upstream от старта начала транскрипции, были найдены практически во всех животных, растениях и грибах, которые были исследованы. Кроме того, ТАТА-подобные последовательности обнаружены у простейших [135]. Однако, несмотря на существование TATA боксов и ТВР у архея, ТАТА-подобные последовательности не выявлены в таких эукариотах, как большинство древнейших паразитов простейших [98].

Механизм, который определяет расстояние от TATA бокса до сайта старта транскрипции, является объектом большого числа исследований [39]. Было найдено, что на изменение расстояния влияют TFIIB и РНК-полимераза П [93]. Механизм, по которому TFIIB и РНК-полимераза II определяют расстояние, неизвестен. Однако было показано, что мутации TFIIB, вызывающие изменение старта транскрипции, меняют также конформацию TFIIB [39]. Возможно, что конформационные изменения сдвигают локализацию каталитического центра РНК-полимеразы II на промоторе. Или, по другой гипотезе - мутации TFIIB вызывают конформационные изменения РНК-полимеразы И, которые мешают правильному позиционированию РНК-полимеразы П на промоторе [199].

ТА ТА-связывающие факторы

Хотя ТВР, по-видимому, является главным ТАТА-связывающим фактором, многоклеточные животные от нематод до человека экспрессируют дополнительные ТАТА-подобные факторы -TRF1 (TBP-related factor 1) и TRF2 (TATA-related factor 2) или TLF (TATA-like factor) [31]. Первый TRF - TRF1, был обнаружен у дрозофилы и является ткане-специфичным регуляторным белком [28]. Этот белок способен связывать консенсус TATA бокса, взаимодействует с TFILA и TFIIB (два основных фактора транскрипции, взаимодействующие с ТВР). У дрозофилы TRF1 является также основным компонентом транскрипционного комплекса РНК-полимеразы III, TFIIIB, в то время как ТВР является компонентом этого комплекса в других эукариотах [52, 170]. TRF1 образует мультибелковый комплекс с факторами, не входящими в TFIID комплекс [52]. Эти исследования показали, что TRF1 может быть функционально сходен с ТВР, и вызывает активацию определенного набора белок-кодирующих генов.

Хотя TRF1 был найден только у дрозофилы, второй TRF, TRF2 (также известный как TLF, TLP и TRP) был идентифицирован у нескольких многоклеточных организмов, но не у растений и грибов [31]. TRF2 более сильно отличается от ТВР, чем TRF1, но, вероятно, укладывается в сходную «седловидную» структуру. Взаимодействие с TFIIA и TFIIB сохраняется, но фенилаланины, которые (в ТВР) отвечают за расплетание и выпетливание нити ДНК, в составе TRF2 не обнаружены [31]. В связи с отличием в ДНК-связывающей поверхности, TRF2 не способен связывать TATA боксы [31,77].

Инициаторный элемент (Inr)

Инициаторный элемент является дискретным коровым промоторным элементом, который функционально схож с TATA и может функционировать независимо от TATA бокса [159, 160]. Транскрипция с этого промотора инициирует единственный сайт старта транскрипции. Было показано, что последовательность между -3 и -5 необходима и достаточна для аккуратной транскрипции и in vitro и in vivo [73,159].

Был выявлен консенсус Inr: Ру Ру А (+1) N Т/А Ру Ру [73, 99]. Для активности Inr оказалось достаточно набора пиримидинов в позициях -2, +4 и +5, но активность этого промотора повышается с увеличением числа пиримидинов [73, 99]. Функциональный консенсус сходен, но не идентичен у млекопитающих и у дрозофилы (у млекопитающих: Ру С А(+1) N Т Ру Ру; у дрозофилы: Т С A(+l) G/T Т Ру) [161]. Компьютерный анализ последовательности (идентичной Inr или содержащей одну нуклеотидную замену) у дрозофилы показал, что Inr представлен у 69% из 205 промоторов или, по другим исследованиям, у 69% из 1941 коровых промоторов [89, 126].

Было найдено, что TFIID (коактиваторный комплекс) специфично взаимодействует с Inr [161]. Анализ связывания TFIID с коровым промотором, содержащим и Inr и DPE элемент, показал, что Inr важен для стабильного связывания TFIID. Хотя стабильное связывание TFIID комплекса с изолированным Inr, в отсутствие TATA или DPE, не показано, Verrijzer и коллеги определили стабильное связывание Inr с комплексом, состоящим из двух TAFs: TAFul и TAFn2 [180]. Также было показано, что TFIIA необходим для связывания TFIID с Inr элементом [37]. Возможно TFILA может вызывать конформационные изменения TFIID комплекса [21, 66, 67].

Кроме TFIID, три других белка распознают Inr элементы: РНК-полимераза II, TFII I, YY-1. РНК-полимерза II неэффективно инициирует транскрипцию с Inr элементов в отсутствие других транскрипционных факторов [161].

DPE (Downstream promoter element)

DPE был идентифицирован как downstream коровый промоторный мотив, который необходим для связывания TFIID с ДНК определенных генов [75]. DPE является консервативным элементом и работает вместе с Inr. Последовательность DPE локализована точно от +28 до +32 относительно A+i нуклеотида Inr мотива [89]. Типичный DPE-зависимый промотор содержит Inr и DPE. Мутация и DPE и Inr приводит к потере связывания TFIID и базальной активности транскрипции [17]. В базе данных с 205 коровыми промоторами, было найдено около 29% промоторов, содержащих TATA, но не DPE, 26% обладают DPE, но не TATA, 14 % содержат и TATA и DPE, 31% не содержат ни того ни другого [89]. Компьютерный анализ консенсуса DPE человека показывает, что он сходен, но не идентичен DPE дрозофилы [16]. Существует активность, которая стимулирует DPE-зависимую транскрипцию и репрессирует ТАТА-зависимую транскрипцию. Эта активность опосредуется белком NC2/Drl-Drapl, который был найден как репрессор ТАТА-зависимой транскрипции. Исследования показывают, что NC2/Drl-Drapl активирует DPE-зависимую транскрипцию, и, что его функции различны в DPE- и ТАТА-зависимых промоторах [161].

TFIIB распознающий элемент

TFIIB распознающий элемент (BRE) является единственным хорошо охарактеризованным элементом в коровых промоторах белок-кодирующих генов, который распознается фактором другим, чем TFIID (или TRF1 или TRF2). Этот элемент находится сразу upstream от TATA бокса, что впервые было выявлено у архея [129, 140]. X-ray кристаллическая структура TBP-TFIIB-TATA комплекса показывает, что TFIIB взаимодействует с главным желобком ДНК сразу upstream от TATA бокса и с малым желобком ДНК downstream от TATA бокса [120]. Была найдена консенсусная последовательность BRE человека: G/C G/C G/A С G С С [90]. BRE распознается НТН мотивом на С-конце TFIIB [90, 120, 177]. Этот мотив отсутствует у дрожжей и растений. Существует предположение, что BRE не участвует в регуляции транскрипции у этих организмов.

Проксимальный элемент (proximal sequence element —PSE)

Это высоко консервативный элемент корового промотора генов мяРНК. PSE элемент локализован между -45 и -60 относительно старта транскрипции генов мяРНК. Этот элемент необходим для базальной транскрипции и определяет локализацию сайта старта транскрипции [29, 56, 58, 100, 151, 157]. Консенсусная последовательность PSE была найдена у различных организмов [29, 100]. У человека: TCACCNTNA C/G Т N A A A A G T/G [100]. PSE распознается уникальным мультибелковым комплексом, назваемым SNAPc, РВР или PTR [56, 58, 115, 145, 151, 182]. У человека SNAPc комплекс необходим для активности промоторов генов мяРНК, транскрибируемых и РНК-полимеразой II, и РНК-полимеразой III [56]. SNAPc-направленная транскрипция также нуждается в ТВР, который связывает ДНК промоторов генов мяРНК, которые кроме PSE содержат TATA бокс [56, 58,151].

Другие коровые промоторные элементы

Первый, downstream core element — DCE был идентифицирован в промоторе глобинового гена человека [92]. DCE расположен между +10 и +45. Этот элемент способен вызывать активацию транскрипции и связывать TFIID. Второй, найденный в гене глиального фибриллярного белка (gfa), downstream promoter element (от +11 до +50) также необходим для связывания TFIID и активации транскрипции [118]. Третий, multiple start site downstream element (MED-1) был найден в ТАТА-не содержащих промоторах, которые имеют некластеризированные множественные сайты старта [69]. Было показано, что MED-1 элемент способствует транскрипционной активации с двух из трех исследованных промоторов.

CpG островки (islands)

Несмотря на широкое распространение промоторов, ассоциированных с CpG, элементы, ответственные за их функцию корового промотора остаются не исследованными. CpG-ассоциированные промоторы обычно не содержат консенсус TATA бокса, DPE элемент или Inr элементы [10, 158]. Одна общая черта CpG-промоторов — присутствие множественных сайтов связывания для транскрипционного фактора Spl [10, 13, 101]. Сайты старта транскрипции локализованы на расстоянии 40-80 п.н. downstream от Spl сайтов. Скорее всего Spl может управлять базальной транскрипцией через формирование преинициаторного комплекса внутри определенного свободного «окна». [10, 158]. Есть также возможность, что субъединицы TFIID, которые способны распознавать промотор, затем взаимодействуют с последовательностью внутри этого «окна». Согласно этой гипотезе, распознавание корового промотора внутри CpG зависит от тех же факторов и элементов, описанных выше. Ключевым отличием является то, что связывание основных факторов транскрипции более строго зависит от активаторных белков, связанных с дистальными промоторными элементами [161].

GTFs

После изменения промотора и инициации транскрипции, CTD домен большой субъединицы РНК-полимеразы II фосфорилируется, это событие способствует началу элонгации транскрипции. Последующие терминация и фосфатазное возвращение РНК-полимеразы П в ее нефосфорилированную форму позволяют GTFs и РНК-полимеразе II инициировать следующий раунд транскрипции.

ТВР

Первоначально, TATA-binding protein (ТВР) был найден в Saccharomyces cerevisiae, где белок был выделен как одиночный полипептид. Белковая последовательность, найденная у дрожжей, привела к изоляции кДНК клонов ТВР у нескольких видов эукариот. Рекомбинантный ТВР может связывать и общие, и регуляторные факторы, а также управлять сборкой PIC in vitro и базальной транскрипцией. В отсутствие ДНК, консервативный кор ТВР кристаллизован как димер так, что закрывает ДНК-связывающую поверхность. Мутация вдоль выпуклой ДНК-связывающей и димеризационной поверхности в различной степени ингибирует самоассоциацию ТВР, в то время как способность ТВР связывать TATA бокс одинаково уменьшается [192].

Гомологи дрожжевого ТВР, у дрозофилы и человека, как было показано, являются ТАТА-связывающими субъединицами мультисубъединичного TFIID комплекса. ТВР также является компонентом других мультисубъединичных комплексов, которые способствуют инициации транскрипции РНК-полимеразами I и III.

Анализ ТВР-ТАТА кристаллов показал новый механизм связывания ДНК. ДНК-связывающий регион ТВР складывается в структуру, похожую на «седло». Это молекулярное «седло» состоит из двух квази-симметричных доменов, каждый из которых содержит 89-90 аминокислот. N-концевой домен белка взаимодействует с З'-половиной

TATA последовательности, в то время как С-концевой домен взаимодействует с 5'-половиной. Каждая половина большой вогнутой поверхности «седла» состоит из 5 складок антипараллельных Р-слоев. Восемь из десяти Р-слоев взаимодействуют с малым желобком двойной спирали ДНК. Связывание ТВР с малым желобком предполагает обширные гидрофобные взаимодействия. ТВР также вызывает выпетливание ДНК и на 5'-и на 3'- концах TATA бокса и частично разматывает дуплекс, благодаря инсерции фенилаланиновых остатков. Связывание ДНК осуществляется изогнутыми антипараллельными р-слоями, которые подготавливают большую вогнутую поверхность малого желобка и обратной стороной контактируют с 8 п.н. TATA элемента. 5'-конец стандартной В-формы ДНК входит в нижнюю часть молекулярного «седла», в то время как ТВР вызывает частичное раскручивание правозакрученной двойной спирали, вызванное инсерцией двух фенилаланиновых остатков в первые Т:А основания. После этого, расширенная поверхность малого желобка, раскрученной, ровно изогнутой ДНК приближается к нижней части молекулярного «седла», вызывая направленные взаимодействия между цепями белковой стороны и концами малого желобка центральных 6 п.н. Вторая большая петля образуется благодаря инсерции двух фенилаланиновых остатков между последними двумя парами оснований TATA элемента, что приводит к возврату к В-форме ДНК [119].

Несмотря на это большое изменение, уотсон-криковское образование пар сохраняется во всех отношениях, так как частичное разматывание компенсируется правым суперскручиванием двойной спирали.

Искаженная структура ДНК делится на область, которая напрямую взаимодействует с ТВР и фланкирующую ДНК, большей частью неизмененную. Связанная ДНК защищена вогнутой стороной «седла», в то время как выпуклая (или «место «седла»») располагается на поверхности, и связывает различные компоненты молекулярного аппарата транскрипции.

Была определена структура взаимодействия ТВР с различными TATA элементами растений, дрожжей и человека. Эти три кокристаллические структуры очень похожи и демонстрируют общий индуцибельный механизм распознавания белком ДНК [119].

Долгое время ТВР рассматривался как универсальный фактор, необходимый для инициации транскрипции РНК-полимеразами I, И, III. Это мнение изменилось после открытия у многоклеточных TLF/TRF2 семейства, представители которого связывают последовательность ДНК отличную от классического TATA бокса.

Альтернативные ТВР-содержащие комплексы также играют важную роль в инициации транскрипции РНК-полимеразой II.

Другая форма ТВР-содержащего комплекса, B-TFIID человека (или TBP/Motl комплекс у дрожжей), не содержит классические TAFs, но вместо них имеет единственную SnO/Snf-родственную АТФазу, BTAFI (ранее TAF170) человека (или Motl у дрожжей) [133, 175]. Motl является необходимым регулятором РНК-полимераза II-зависимой транскрипции in vivo [32] и диссоциирует ТВР-ДНК комплекс in vitro [1]. In vitro, B-TFIID человека опосредует базальную транскрипцию РНК-полимеразой II, но не помогает в стимуляции транскрипции факторами, содержащими кислые или глутамин-богатые мотивы активации [176].

Другим примером может служить NC2 содержащий комплекс. NC2 является гетеродимером двух, субъединиц (Вигб/DRAPl и NC2alfa/DRl), каждая из которых содержит две гистоновые складки. NC2 связывает и стабилизирует ТВР/ТАТА комплексы, ингибируя связывание TFIIA и TFIEB. NC2 занимает область сразу под ТВР/ТАТА поверхностью, содержащей ДНК с двух сторон от ТВР. Домен NC2 подтягивается и контактирует аминокислотными основаниями вдоль выпуклой поверхности ТВР, что вызывает стерическую преграду для связывания TFIIB. Мутация ТВР в дрожжах вдоль этой поверхности нарушает TBP/NC2 взаимодействия in vitro и вызывает повышенную экспрессию определенного набора генов, не имеющих энхансера in vivo. Также NC2 играет и позитивную роль в транскрипции (природа этого явления не выяснена) [27]. Т.е. NC2/TBP комплекс является бифункциональным основным транскрипционным фактором, который, сходным с Motl/TBP комплексом образом, дифференцированно регулирует инициацию транскрипции РНК-полимеразой И.

Недавно, в эмбриональных клетках карциномы был описан другой ТВР-содержащий комплекс, ТАС (TBP-TFILA-содержащий комплекс) [110]. ТАС содержит TFIIAy субъединицу и непроцессируемую форму TFIIAap, и опосредует инициацию транскрипции РНК-полимеразой II в отсутствие TAFs.

TFIIB

TFIIB входит в PIC после формирования ТВР-ДНК комплекса и является необходимым условием для связывания РНК-полимеразы П. TFIIB является единственным полипептидом, который включает: N-концевой Zn-связывающий домен (nTFIIIB); коровый домен, в который входит С-концевые две трети молекулы (cTFIIB); и филогенетически консервативную последовательность, которая соединяет эти два домена. cTFIIB человека включает helix-tum-helix (НТН) мотив, который связывает BRE -последовательность, присутствующую в некоторых промоторах сразу upstream от TATA бокса [90]. BRE может репрессировать базальную транскрипцию с активатор-опосредованным разрушением взаимодействия TFIIB-BRE [38].

X-ray структуры для cTFIIB в ДНК-TBP-TFIIB тройных комплексах определили специфичные контакты TBP-TFIIB и TFIIB с ДНК промотора [9, 177]. cTFIIB связывает промотор через специфичные контакты между основаниями в большом желобке upstream (BRE) и в малом желобке downstream TATA бокса. Это асимметричное связывание TFIIB, вероятно, служит для однонаправленной сборки PIC и направления транскрипции. Показано что TFIIB, входя в PIC, претерпевает конформационные изменения [54]. Структура N-концевого Zn-связывающего домена TFIIB архея оказалась сходной со структурой, найденной у фактора элонгации TFIIS [200].

Мутации гена TFIIB дрожжей смещают сайт старта; сходные дефекты у TFIIB человека также смещали старт инициации [53]. Критичный для сборки PIC, TFIIB также играет большую роль в дальнейшей транскрипции [23, 139].

Электронная кристаллография TFIIB-PHK-полимераза II комплекса, и структура ДНК-TBP-TFIIB тройного комплекса показывают механизм выбора сайта старта: TFIIB является мостом для взаимодействия между ТВР и РНК-полимеразой И, и матрице ДНК нужно только проследовать от TATA бокса к позиции сайта старта в активном центре РНК-полимеразы II [91]. В рамках данной модели можно посчитать консервативное расстояние между TATA и стартом сайта у многих промоторов. Однако из нее неясно, как мутации и в TFIIB, и в РНК-полимеразе II влияют на выбор сайта старта или как РНК-полимераза II дрожжей способна инициировать транскрипцию с множественных стартов специфичных промоторов. Несмотря на критическую важность соединения TFIIB-PHK-полимераза П, ни домены, ни специфичные основания, которые определяют это взаимодействие, не были найдены [192].

TFIIF

TFIIF фактор был выделен на основании его физического связывания с РНК-полимеразой П. Связывание РНК-полимеразы II с TFIIF стабилизирует ДНК-TBP-TFIIB тройной комплекс и является предпосылкой для входа в PIC основных факторов транскрипции TFIIE и TFIIH . TFIIF является гетеродимером, состоящим из двух больших (TFIIFa/RAP74) и двух малых (TFIIFp/RAP30) субъединиц. Обе субъединицы являются многодоменными полипептидами, которые играют различные роли в инициации, элонгации и регуляции CTD фосфатазной активности.

Эксперименты по определению сайт-специфических белок-ДНК взаимодействий выявили точки контакта TFIIF с матрицей ДНК. RAP30 взаимодействует с матрицей ДНК с каждой стороны от TATA бокса, в то время как RAP74 взаимодействует только downstream от TATA [82]. Результаты нескольких независимых исследований говорят о сходных контактах, исключая исследование, где RAP74 также связывал промотор ДНК upstream от TATA [42]. Электронные микрофотографии TBP-TFIIB-TFIIF-RNAPII-матрица комплекса подтверждают обе версии связывания, и показывают, что промоторная ДНК заворачивается вокруг РНК-полимеразы II в PIC. Сомнительный upstream контакт RAP74 интегрируется в модель о возможной TFIIF-опосредованной изомеризации PIC [141]. Микрофотографии высокого разрешения TBP-TFIIB-TFIIF-RNAPII-матрица комплекса, описывающие топологию TFIIF, недоступны.

X-ray кристаллическая структура гетеродимера, состоящего из N-концевых фрагментов TFIIF определена как новый димеризационный фолд «тройной бочонок» [45]. Сруктуры С-концевых доменов RAP30 и RAP74 соответственно, оказались схожи в третичной структуре, несмотря на ограниченное сходство между двумя субъединицами [49, 78]. Эти структуры формируют разветвленные петли, сходные с таковыми у гистона Н5. И линкерный гистон, и RAP30 связывают ДНК без специфичной последовательности, но с предпочтением к нелинейным конформациям ДНК. Это может объяснить зависимость ТВР от связывания RAP30 с промоторной ДНК. Следовательно, две разветвленные петли RAP30 внутри TFIEF гетеротетрамера могут считаться паттерном RAP30 с каждой стороны от TATA бокса. По существу, RAP30 является «фактором конденсации» [49], который может объяснить компактизацию промоторной ДНК вокруг РНК-полимеразы П, исследованную на электронных микрографиях PIC [42, 82]. Электростатические свойства расплетенной петли RAP74 отличаются от таковой у RAP30. Предположительно, RAP74 взаимодействует с Fcpl CTD фосфатазой [78].

TFIIE

Первоначально TFIIE фактор был выделен из ядерного клеточного экстракта клеток HeLa. Биохимический анализ показал, что TFIIE человека состоит из 56 кДа (TFIIE-a) и 34 кДа (TF1IE-P) субъединиц, которые формируют аг Рг гетеротетрамер. Таким образом, подобно TFIIF, TFIIE является гетеродимером, содержащим две большие

TFIIEa) и две малые (TFIIEp) субъединицы. Однако двумерная кристаллография комплекса TFIIE-PHK-полимеразы II показала, что дрожжевой TFIIE существует как ар димер [91]. Гены человека, кодирующие обе субъединицы, были клонированы [125, 131, 166]. Обе субъединицы высоко заряжены, со значениями рН 4,5 и 9,5 для TFIIE-a и TFIIE-Р соответственно. Не найдены близкородственные белки, хотя обе субъединицы включают определенные структурные мотивы, такие как zink-ribbon motif (С-Х2-С-Х2-С-Х2-С), протеинкиназная последовательность в TFIIE-a и консенсус нуклеотид-связывающего сайта в TFIIE-p. Обе субъединицы обнаруживают определенное сходство с о фактором бактерий. Дрожжевой фактор также необходим для аккуратной транскрипции in vitro [150]. Анализ очищенного с фактора определил, что в его состав входят две субъединицы 66 кДа и 43 кДа. Этот фактор, возможно, является дрожжевым аналогом и TFIIE и TFIIF [150]. Связь этого фактора с GTFs многоклеточных стала ясной после клонирования генов дрожжей, кодирующих эти две субъединицы.

TFIIE вызывает поздние события в сборке PIC, включая вовлечение TFIIH и последующую регуляцию TFIIH активности. TFIIE направленно взаимодействует с нефосфорилированной формой РНК-полимеразы II, а также обеими субъединицами TFIIF и TFIIH. TFIIE и TFIIH необходимы для формирования АТФ-зависимого открытого промоторного комплекса перед образованием первой фосфатной связи. TFIIE, TFIIF и TFIIH также кооперируются для перехода РНК-полимеразы II к продуктивной элонгации. Кроме того, TFIIE вовлечен во взаимодействие некоторых генно-специфических активаторов [51].

Коровый домен TFIIEp человека формирует мотив расплетенной петли, третий пример расплетенной петли в молекулярном аппарате транскрипции РНК-полимеразы II [127]. В отличие от расплетенной петли RAP74, расплетенные петли TFIIEp и RAP30, как предполагается, принимают участие в неспецифическом связывании ДНК. TFIIE формирует промоторные контакты downstream от транскрипционной «пузырьковой» области, не видоизменяясь под действием белок-ДНК взаимодействий, РНК-полимеразы II или других GTFs [81]. Эти контакты TFIIE-промотор подтверждаются снимками электронной кристаллографии TFIIE с РНК-полимеразой II, где TFIIE находится около активного центра фермента [91].

TF1IH

GTFs TFIIB, TFiro, TFIIE и TFIIF с TFIIA достаточно для аккуратной инициации транскрипции РНК-полимеразой П in vitro.

TFIIH наибольший и наиболее сложный комплекс GTFs, состоящий из девяти субъединиц, по молекулярному весу сравнимый с РНК-полимеразой II. TFIIH является GTF с определенными энзиматическими свойствами и включает: ДНК-зависимую АТФазу, две АТФ-зависимые хеликазы противоположной полярности (ХРВ и XPD) и циклин-зависимую протеинкиназу (cdk7-cyclinH). TFIIH может быть разделен на два субкомплекса: коровый-TFIIH и циклин-киназный комплексы. Коровый-TFIIH является не только компонентом основного молекулярного аппарата транскрипции, но также входит в состав NER (nucleotide excision repair). Этот дуализм показывает молекулярную связь между транскрипцией и репарацией, которая только подозревалась до идентификации TFIIH. Холо-TFIIH вызывает изменения до, в течение, и сразу после инициации транскрипции [192].

Недавние исследования выдвинули две различные модели того, как ХРВ катализирует изменение промотора. По первой модели, ХРВ взаимодействует с ДНК и upstream и downstream от сайта старта, приводя к заворачиванию матрицы вокруг PIC. Гидролиз АТФ затем вызывает конформационные изменения ХРВ, которые физически разделяют две цепи ДНК для формирования открытого промоторного комплекса [34]. Во второй модели, ХРВ делает более ограниченные контакты с ДНК, только downstream от сайта старта. Эти данные приводят к предположению, что ХРВ катализирует АТФ-зависимую ротацию ДНК downstream около неподвижного upstream сайта, и функционирует как молекулярный «раскручиватель» ДНК на сайте старта [81]. Несмотря на фундаментальные различия этих двух моделей ХРВ-опосредованного открытия промотора, никто не предполагает, что ХРВ функционирует как классическая хеликаза.

Была расшифрована трехмерная структура TFIIH частиц человека и дрожжей. TFIIH человека при разрешении 38 А оказалась кольцеподобной структурой с центральным отверстием, чьи размеры достаточны для размещения двуцепочечной молекулы ДНК [152]. В дрожжах закрытое «кольцо» исчезает. Четвертичная структура TFIIH сходна с другими колецеподобными связывающими нуклеиновые кислоты комплексами [192].

TFIIA

TFILA был открыт как GTF, поскольку необходим для специфичной транскрипции in vitro. Однако недавние исследования установили, что TFELA необязателен для ТВР-управляемой инициации, но стимулирует транскрипцию в TFIID-управляемой системе. TFIIA ассоциирует с PIC, взаимодействуя с ТВР, и стабилизирует связывание ТВР с TATA боксом. TFIIA также взаимодействует со специфичными активаторами, TAF4, и с коактиваторами РС4 и HMG2. Кроме того, TFIIA необходим для шага, определяющего скорость формирования открытого промоторного комплекса. Так, TFIIA не существенен для аккуратной инициации, но играет важную роль в активации транскрипции, функционируя и как антирепрессор и как коактиватор.

Гомолог TFIIA дрожжей у многоклеточных был идентифицирован в транскрипционной системе млекопитающих in vitro. Активностью TFIIA дрожжей обладают два полипептида с примерной молекулярным весом 32 и 13,5 кДа. Гены, кодирующие обе субъединицы, были клонированы и обозначены ТОА1 и ТОА2. И ТОА1, и ТОА2 необходимы для жизни клеток, что подчеркивает функциональную важность TFIIA. Структурный анализ Toal и Тоа2 определил домены обеих субъединиц, которые необходимы для их ассоциации, ТВР-ДНК взаимодействий и транскрипционной активности.

Сходно с TAF субъединицами TFIID, TFIIA не является необходимым для активации транскрипции in vitro фактором. Однако, мутанты ТВР, не способные связываться с TFIIA, дефектны в активации in vivo. Это очевидное несоответствие может быть объяснено тем, что взаимодействие TBP-TFIIA блокирует эффекты общих транскрипционных репрессоров, отсутствующих в системах in vitro, которые или вызывают TBP-TFIIA диссоциацию или ослабляют TBP-TFIIA ассоциацию.

TFIIA человека и TFIIA дрозофилы состоят из трех субъединиц с примерным молекулярным весом 35/30, 19/20 и 12/13 кДа. В обоих организмах две наибольшие субъединицы кодируются одним и тем же геном и, возможно, являются посттрансляционно модифицированными формами белка предшественника. N-концевые 54 аминокислоты и С-концевые 76 аминокислот белка предшественника обнаруживают структурное сходство с ТОА1-кодируемой субъединицей TFIIA дрожжей. Следовательно, неконсервативный центральный регион Toal несущественен для функции. Наименьшая субъединица TFIIA является гомологом ТОА2-кодирующей субъединицы TFIIA дрожжей. Так, три субъединицы TFIIA многоклеточных кодируются двумя генами, которые гомологичны ТОА1 и ТОА2 дрожжей.

Была получена кристаллическая структура двух форм дрожжевых TFIIA-TBP-ДНК трехкомпонентных комплексов. В обоих случаях, структуры были определены с наименьшей формой TFIIA, которая поддерживает биологическую функцию. Согласно этим исследованиям, наибольшая из субъединиц TFIIA несущественна, центральный регион полипептида делетируется. Были идентифицированы два главных структурных элемента: шестинитевой р-сэндвич и четырехпетлевой узел. С-конец обеих субъединиц вносит вклад в виде трех нитей в р-сандвич и N-конец каждой субъединицы вносит вклад в виде двух петель в каждый петлевой узел. TFIIA ассоциирует со стороной ТВР-ДНК, обратной TFIIB. В отличие от TFIIB, который связывается и upstream и downsream от TATA бокса, TFILA локализуется исключительно upstream от TATA бокса и, вероятно, контактирует с другими общими факторами, которые связываются downstream от TATA [51].

TFIID

В большинстве случаев, синтез мРНК начинается с распознавания и плотного связывания с TATA элементом TFIID комплекса. Роль TFIID комплекса оказалась в фокусе значительных биохимических и генетических исследований с момента его открытия в клетках человека в 1980 году. TFIID состоит из более чем десяти различных полипептидов, масса которых варьирует от 15 до 250 кДа. Большинство этих субъединиц TFIID очень консервативны между различивши видами такими как: дрожжи, дрозофила и человек. Эксперименты по нокауту генов 4 TFIID субъединиц дрожжей, показали, что они необходимы для жизнеспособности клеток. TFIID является фактором, специфичным для РНК-полимерзаы II и включает: ТВР и от 8 до 11 других полипептидов.

Связывание TFIID человека с ДНК сначала было продемонстрировано на примере аденовирусного промотора (AdMLP). Другие исследования AdMLP с использованием ДНКазы I и промоторов генов человека показали сиквенс-специфическое взаимодействие между TFIID человека и TATA элементом, которое было обусловлено ТВР субъединицей TFIID комплекса. Примечательно, что связывание TATA бокса и TFIID и ТВР нарушает укладку корового промотора с нелинкерными гистоновыми белками (Н2А, Н2В, НЗ и Н4). Наоборот, укладка корового промотора с гистоновым октамером в нуклеосомы предотвращает связывание TFIID и ТВР с TATA элементом, эффективно репрессируя транскрипцию. In vivo, хроматин-опосредованная репрессия транскрипции преодолевается различными АТФ-зависимыми макромолекулярными аппаратами, которые ремоделируют хроматин в районе корового промотора.

Разнообразный спектр ТВР- и TAF- факторов позволяет эукариотическим клеткам формировать множество комплексов, распознающих промотор, различающихся по составу и функции. В самом деле, большое количество исследований in vitro сообщает о том, что одиночная клетка человека содержит TFIID комплексы с или без TAF10, которые обладают функционально различными свойствами [15, 71]. Также были найдены TFIID комплексы, включающие в себя коровые TAFs и клеточные ткане-специфичные TAFs. Например, было показано, что TAF4b обогащены дифференцирующиеся В лимфоциты человека, и из этих клеток был изолирован уникальный ТАР4Ь-содержащий TFIID [33]. Позднейшие исследования показали, что TAF4b имеет избыточные функции в В клетках по сравнению с другими родственными факторами, и что TAF4b опосредует транскрипцию определенного набора генов, необходимых для правильного образования фолликул в яичниках [43]. Кроме того, были найдены, участвующие в процессе сперматогенеза ТАР7Ь-содержащие TFIID комплексы [132]. Другой пример недавних исследований: апоптотический стимул может приводить к альтернативному сплайсингу TAF6, превращающегося в TAF65, который является частью TFIID-подобного комплекса без TAF9 [8]. Эти исследования говорят в пользу того, что различные TFIID комплексы играют специфическую роль в: (1) распознавании различных промоторов, (2) взаимодействии с различным набором общих транскрипционных факторов и (3) опосредовании различных ответов от транскрипционных активаторов к PIC. Существование разных TFIID комплексов также согласуется с открытием, что различные TAFs регулируют только определенный набор специфичных генов.

Корегуляторы

Инициация транскрипции у эукариот нуждается во многих белках, включая генно-специфические транскрипционные факторы, белковые кофакторы и общие факторы транскрипции. Генно-специфические транскрипционные факторы (или активаторы) необходимы для включения специфичной экспрессии генов путем привлечения общих факторов транскрипции, таких как, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH и РНК-полимеразы II, а также хроматиновых кофакторов, таких как АТР-зависимые хроматин ремоделирующие комплексы и гистон ацетилтрансферазы. Эта связь между активаторами и общими факторами транскрипции также нуждается по крайней мере в одном из трех общих кофакторов: Медиаторе, TATA-binding protein (TBP)-associated factors (TAFs) в TFIID или в upsteam stimulatory activity (иЗА)-вторичных белковых компонентах, таких как положительный кофактор 4 (РС4).

TAFs

ТВР является транскрипционным фактором, необходимым для всех трех полимераз. В каждом случае ТВР ассоциирован с различным набором факторов. Несколько различных комплексов ТВР были описаны в системах многоклеточных. TFIDD является комплексом, специфичным для РНК-полимеразы II и включает ТВР и от 8 до 11 других полипептидов. SL1 комплекс (человек) является специфичным для РНК-полимеразы I и состоит из ТВР и трех TAFs. TFIIIB комплекс является специфичным для РНК-полимеразы III и состоит из ТВР и по крайней мере двух дополнительных полипептидов. SNAPc, другой РНК-полимераза Ш ТВР комплекс, необходим для транскрипции генов малых ядерных РНК (snRNA) [51].

Хотя фактора ТВР достаточно для распознавания промотора и последующей сборки других факторов в функциональный PIC, активация транскрипции в системах многоклеточных исследовалась только когда PIC собирался на мультисубъединичном комплексе TFIID. Эти исследования привели к открытию TAFs и гипотезе, что TAFs являются необходимыми медиаторами активации транскрипции [134]. В соответствии с этой гипотезой, одни TAFs напрямую контактируют с активаторными белками, в то время как другие напрямую связываются или с GTFs или с промоторной ДНК. Таким образом, TAFs передают информацию от активатора к основному молекулярному аппарату транскрипции [51].

Биохимические свойства TAFs включают распознавание корового промотора, ацитилтрансферазную активность, которая использует гистоны и другие белки как субстраты, киназную активность, убиквитиновую активацию, а также коактиваторную функцию, обусловленную белок-белковыми взаимодействиями с гено-специфичными транскрипционными факторами.

Эксперименты in vitro показали, что TAFs необходимы для активации транскрипции некоторыми классами активаторов, но не для базальной транскрипции. TAFs в TFIID действуют коллективно как транскрипционный коактиватор для увеличения активатор-зависимой транскрипции с хроматина [117, 195], для контакта активаторного домена или ДНК-связывающего домена активатора, для привлечения инициированной формы РНК-полимеразы II к промоторной области [193], или чтобы вызвать закручивание ДНК в TFIID-связывающем промоторном регионе [121]. TAFs также увеличивают вероятность распознавания промотора путем множественных белок-ДНК взаимодействий с Inr и DPE [16, 181]. Однако TAFs не являются необходимыми ни для активаторной функции, ни для транскрипционной репрессии некоторыми генно-специфическими транскрипционными репрессорами [156].

Хотя сейчас достаточно доказательств для того, чтобы отнести TAFs к посредникам активатор-зависимой транскрипции, некоторые исследования приписывают TAFs другие функции. Например, было найдено, что TAFs стабилизируют связывание TFIID с промотором, посредством специфических контактов с ДНК Inr и DPE, которые присутствуют рядом с сайтом старта транскрипции у определенного числа промоторов. Эти TAF-ДНК взаимодействия могут иметь место у большинства промоторов, но особенно важны у промоторов, не содержащих каноническую TATA последовательность. Недавние исследования показали, что TAFs могут также способствовать активации транскрипции по-другому. Например, наибольшая субъединица TFIID, TAF1 обладает различными ферментативными активностями, включая протеинкиназную и гистон ацетилазную. Было также показано, что TAF1 имеет убиквитин-активирующую и сопряженную активности, которые необходимы для функционирования некоторых активаторов транскрипции в эмбрионах дрозофилы. TAF1 также содержит два бромодомена, структурные модули, найденные во многих коактиваторах и факторах, которые вовлечены в ремоделинг хроматина [192].

Было показано, что TAF дрожжей необходимы для клеточного роста, в то время как некоторые TAF оказались не обязательными для активации транскрипции in vivo. Кроме того, TAF являются ткане-специфичными коактиваторами, участвующими в привлечении и стабилизации TFIID на коровом промоторе генно-специфическими активаторами.

Первичная структура нескольких TAF имеет определенное сходство с гистонами. Такая гомология последовательностей определяет и сходство структурное: кристаллическая структура TAF9 и TAF6 дрозофилы обладает сходством с гистоновым тетрамером НЗ-Н4. Хотя гомолога гистона Н2А не было найдено, Н2В-подобный TAF человека был обнаружен. Это позволяет предположить, что TFIID формирует гистон-подобный октамерный комплекс. TAF7, TAF9 и TAF6 дрожжей демонстрируют структурное сходство с гистонами Н2В, НЗ и Н4 соответственно. Несколько других дрожжевых TAF также содержат мотив гистоновой складки. Кроме того, воссозданный экспериментально TAF октамер, состоящий из центрального TAF9-TAF6 тетрамера, фланкированного с каждой стороны TAF7-TAF4 димерами, схож с гистоновым октамером. До сих пор остается неясным существует ли TAF октамер в нативном TFIID, а также связывает ли ДНК, формируя структуру сходную с гистоновым октамером в нуклеосоме [192].

TAFs присутствуют в мулътибелковых комплексах, не содержащих ТВР

Только общее представление получено о гистоно-подобных TAF. Эти TAF не специфичны для TFIID, но являются компонентами SAGA гистон ацетилтрансферзного комплекса. SAGA включает: TAF9, 6 и 7, но не двойника Н2А, TAF4. В SAGA комплексе, возможно, также имеется двойник TAF4, Adal; поскольку этот белок содержит мотив гистоновой складки и формирует гетеродимер с TAF7, формируя SAGA-специфичную гистоно-подобную структуру. У высших организмов также были найдены TAF-содержащие комплексы, отличные от TFIID, такие как TFTC, STAGA, PCAF. Гистоно-подобным TAF приписывают роль коровых компонентов множества комплексов [192].

Несколько TAF-содержащих мультибелковых комплексов, не содержащих ТВР, были выделены из дрожжей, дрозофилы и клеток человека [114]. ТВР-не содержащий TAF-coдержащий комплекс (TFTC), как было показано, перемещает TFIID или ТВР на ТАТА-содержащие и ТАТА-не содержащие промоторы in vitro [12, 188].

Ткане-специфичные TAFs и функционально специализированные TFIID комплексы

Полный геномный анализ дрозофилы, человека, C.elegans и дрожжей привел к идентификации многих ортологов и паралогов TAF. Некоторые из них показывают специфичные для клеточного типа паттерны экспрессии в различных тканях [4, 179]. Эти результаты показывают, что TAFs могут способствовать ткане-специфичной генной регуляции в организмах многоклеточных. Вопреки большому и еще растущему количеству сообщений о TAFs с различными паттернами экспрессии, только несколько вариантов TAFs изучены в деталях.

Ткане-специфичные свойства TAF4b Млекопитающих

Первая, специфичная для клеточного типа субъединица TFIID, hsTAF4b была открыта в высокодифференцированной человеческой линии В клеток [33]. Анализ первичной аминокислотной последовательности показал, что hsTAF4b близко родственен более широко представленному в организме человека hsTAF4 [172] и его гомологу у дрозофилы dmTAF4 [64]. Экспрессионный анализ выявил, что гомолог этого белка у мыши также экспрессируется ткане-специфичио с наивысшим уровнем экспрессии в семенниках и яичниках [43]. Важно, что мышиный TAF4b, является внутренней субъединицей большого комплекса, содержащего и mTAFl и шТВР, обнаруженного в белковом экстракте из яичников. Этот эксперимент подтверждает, что TAF4b действительно является субъединицей специфичного для яичников TFIID [43]. Анализ нокаутных по TAF4b мышей показал, что самки, не имеющие TAF4b жизнеспособны, но стерильны, из-за дефекта фолликулогенеза яичников [43]. Таким образом, TAF4b является специфичным для определенного клеточного типа компонентом транскрипционной машины млекопитающих, которая опосредует экспрессию набора генов, необходимых для корректного фолликулогенеза. Хотя нокаутные по TAF4b мыши не показали дефектов в развитии или функции В-клеток, В-клетки селезенки действительно экспрессируют повышенный уровень TAF4b [33]. Возможно TAF4b функционирует в В клетках таким же образом, как и в гонадах. Кроме того, было показано, что TAF4b взаимодействует с регуляторами В-клеточной транскрипции, такими как: члены NFicB/Rel семейства транскрипционных факторов и ОСА-В, В-клеточного специфического коактиватора [189, 196, 197]. Данные результаты показывают, что функционально специализированный TAF4b-coдержащий TFIID комплекс может взаимодействовать со специфичными коровыми промоторными элементами.

Cannonball необходим для сперматогенеза дрозофилы

Хотя TAF4b был первым обнаруженным ткане-специфичным TAF, который был найден, сейчас кажется очевидным, что существует большое количество специализированных TAFs. Систематические генетические исследования у дрозофилы идентифицировали по крайней мере четыре специфичных для семенников изоформ TAF. No hitter (nht) родственен TAF4, cannonball [сап) родственен dmTAF5, ryan express (rye) -dmTAF12, meiosis I arrest (mia) - dmTAF6. Экспрессия cannonball является стадия- и ткане-специфичной и ограничивается первичными сперматоцитами, в то время как его прототип dmTAF5 экспрессируется повсеместно [60]. Cannonball необходим для экспрессии некоторых генов дифференцировки сперматид [187] и для развития зародышевых клеток у самцов мух [60]. В нуль мутантах cannonball, транскрипция специфичных генов мишеней значительно снижается и, следовательно, прогрессия мейотического клеточного цикла блокируется, что приводит в результате к прекращению дифференцировки сперматид [60]. Эти исследования показывают, что cannonball необходим для транскрипции стадия- и ткане-специфичных генов-мишеней, необходимых для нормального гаметогенеза самцов мух in vivo.

Пока неясно, взаимодействуют ли cannonball и другие специфичные для семенников TAF изоформы с прототипом TAFs для формирования функционально специализированного TFIID комплекса, который инициирует транскрипцию на выбранном наборе промоторов гаметогенеза. Замечательно, однако, что дрозофила имеет, по крайней мере, четыре специфичных для семенников изоформы dTAFs. Возможно, что дрозофила не только обладает ткане-специфичными TAFs, но, и имеет полностью новый функционально специализированный TBP/TAF изокомплекс, который мог бы быть составлен, большей частью, из специфичных для семенников компонентов.

TAF1 и TAF 10 млекопитающих необходимы для прогрессии клеточного цикла

Биохимическое фракционирование клеточных экстрактов млекопитающих показало различные популяции TFIID, которые отличаются по составу TAF [9]. Интересно, что hsTAFlO, присутствует только в 50% всех TFIID комплексов [71]. Последовательные эксперименты в клетках карциномы мышей показали, что клетки, не имеющие мышиного TAF10, блокируются в Gi/Go фазе клеточного цикла и подвергаются апаптозу [109]. Эти исследования показывают, что TAF10 необходим для экспрессии набора генов, важных для прогрессии клеточного цикла и жизнеспособности в эмбриональных клетках карциномы мышей; однако, специфичные гены-мишени TAF10 остаются неуловимыми и не ясно, служит ли TAF10 действительно как ткане-специфичная или специфичная для клеточного типа субъединица TFIID.

Температура-чувствительная мутация TAF1 также приводит к остановке клеточного цикла и апаптозу [153, 171]. Экспрессия генов, регулирующих клеточный цикл, таких как циклины A, Dl, D3 и cdc2 снижена, когда tsl3 клетки, несущие мутантный TAF1 растут при ограниченной температуре [168, 183, 184]. Интересно, что ацетилтрансферазная активность TAF1 также ослабляется при ограниченной температуре, и эта каталитическая активность TAF1, возможно, необходима для нормальной экспрессии генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла и апаптоз [35].

Другим примером многообразия TAF являются альтернативно сплайсированные транскрипты, кодирующие три изоформы hsTAF6 и обозначаемые TAF6a,b,c [185]. TAF6 человека и дрозофилы прямо взаимодействует с TFIID субъединицами [185]. Bell и коллеги [8] выделил другую сплайсоизоформу hsTAF6 (hsTAF6d), которая протеолитически распадается под апоптотическим стимулом. Интересно, что сверхэкспрессия hsTAF6d в HeLa клетках, также как hsTAF6a, вызывает клеточную гибель и, по-видимому, hsTAF6d является частью TFIID-подобного комплекса, не имеющего TAF6 и TAF9 [8]. Это подтверждается экспериментами, показывающими что снижение экспрессии TAF9 в DT40 клетках курицы вызывает апаптоз [20]. Эти исследования показали, что специфические изоформы TAF возможно образуются в результате альтернативного сплайсинга и пост-трансляционных модификаций в ответ на внеклеточные события, которые могут изменить состав и, предположительно, активность TFIID.

USA

К USA относятся: негативный кофактор NC2 и положительные кофакторы, такие как PCI, РС2, РСЗ и РС4, модулирующие уровень транскрипции [76]. РС4, необычный одноцепочечный и двуцепочечный ДНК-связывающий белок с небольшим молекулярным весом около 15 кДа, может действовать как посредник в активатор-зависимой транскрипции [46, 88, 194]. Интересно, что РС4 также действует как репрессор для базальной транскрипции в отсутствие активатора [104, 186, 194]. Репрессия базальной транскрипции РС4 осуществляется путем формирования полного преинициаторного комплекса и может быть облегчена повышением количества TFIID, TFIIH и холоферментом РНК-полимеразы II [79, 104]. Эта двойная активность РС4 является доза-зависимой и может работать синергетически с другими USA-производными кофакторами, такими как РС2 и РСЗ [103].

Медиаторный комплекс

Наибольшим из универсальных кофакторов, которые служат для трансдукции регуляторной информации между ген-специфическими транскрипционными факторами и коровой машиной РНК-полимеразы II, является модульный комплекс, известный как Медиатор. Этот комплекс включает до 25 различных полипептидных компонентов, которые взаимодействуют с активаторами и репрессорами и трансдуцируют как позитивную, так и негативную информацию к общим факторам транскрипции. Медиатор может быть выделен в комплексе с РНК-полимеразой П, кроме того, специфичные субъединицы Медиатора взаимодействуют напрямую с различными транскрипционными белками [192].

Первоначально медиаторный комплекс был идентифицирован в дрожжах двумя различными методами. В первом использовали генетический скрининг для супрессоров CTD большой субъединицы дрожжевой РНК-полимеразы П. Эти исследования выявили SRB (suppressors of RNA polymerase В) компоненты, которые постоянно находились в 1-2 МДа комплексе, содержащем субстихиометрические количества РНК-полимеразы II [55, 86, 95, 174]. Во втором случае медиатор изолировали биохимически на основании его способности стимулировать активатор-зависимую транскрипцию in vitro на голых матрицах ДНК и идентифицировали различные белки, такие как Gall, Srb белки, Med белки и Rox3 [84, 116]. Другие эксперименты показали, что медиатор может коиммунопреципитироваться с различными активаторами, а также с CTD РНК-полимеразы II [55, 109].

Были идентифицированы два медиаторных комплекса человека: большой 2 МДа комплекс, обозначаемый как TRAP, DRIP, ARC, SMCC и NAT [11, 40, 41, 70, 117, 137, 138, 167] и малый 500-700 кДа, названный PC2/CRSP [105, 144]. Оба комплекса, как было показано, опосредуют активатор-зависимую транскрипцию in vitro. Кроме того, NAT и SMCC комплексы репрессируют активатор-зависимую транскрипцию, также как и базальную транскрипцию [2, 50, 167]. Tjian и соавторы показывают, что большой комплекс является транскрипционно инертным, а малый CRSP комплекс является активным на промоторе [169], но эти выводы базируются на экспериментах in vitro и могут не отражать механизмов взаимодействия медиатор-промотор in vivo.

Информация о взаимодействии РНК-полимеразы II с Медиатором была получена из структуры дрожжевого РНК-полимераза П-Медиатор комплекса, в котором Медиатор свернут вокруг задней части РНК-полимерзы II и покрывает небольшую поверхность фермента, которая центрирована на субъединицах Rpb3 и Rpbll [6]. Согласно с этими исследованиями, мутация в Rpb3 затрагивает активатор-зависимую, но не базальную, транскрипцию; кроме того, а-а' гетеродимер, который является бактериальным гомологом эукариотического Rpb3-Rpbll гетеродимера, вовлечен во взаимодействие с белками, которые способствуют бактериальной регуляции.

Результирующая модель минимального PIC, показывает, что upsteam промоторная ДИК, TFIIB и ТВР (и возможно другие компоненты ПО комплекса) должны быть локализованы между РНК-полимеразой П и Медиатором, и формируют часть поверхности между этими двумя. Таким образом, РНК-полимераза II и Медиатор не могут достигать промотора как предсформированный комплекс, но должны рекрутироваться независимо [б].

Семейство TRF (ТВР-подобных факторов)

Ранее считалось, что ТВР является универсальным и единственным транскрипционным фактором, необходимым всем трем РНК-полимеразам для распознавания промоторов и инициации транскрипции в эукариотических организмах [18, 62, 72], К процессам с участием ТВР относятся: транскрипция белок-кодирующих генов РНК-полимеразой II, а также рибосомальных РНК и малых ядерных РНК, транскрибируемых РНК-полимеразой I и РНК-полимеразой III соответственно. Кроме того, как было показано, у всех эукариот ТВР является компонентом трех различных мультисубъединичных комплексов инициации транскрипции: SL1, TFIID и TFIIIB, вовлеченных в направленную транскрипцию РНК-полимеразами 1,11, III [18, 24, 36, 62, 154]. В каждом классе инициаторных комплексов, ТВР специфически взаимодействует с ассоциированными белками и/или промоторной ДНК для образования ядра инициаторного комплекса РНК-полимеразы. В случае РНК-полимеразы II, ТВР наряду с TAFs входят в состав TFIID, который может связываться со специфичными коровыми промоторными элементами, такими как TATA бокс, Inr и DPE для формирования активного PIC, содержащего РНК-полимеразу II и общие транскрипционные факторы TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH и TFILA [19]. Сейчас точно определено , что взаимодействия между инициаторными факторами и различными коровыми элементами определяют сайт старта транскрипции и могут также модулировать силу промотора [161]. Когда PIC был идентифицирован, казалось, что нет необходимости искать дополнительные генно-специфичные или специфичные для клеточного типа субъединицы основного молекулярного аппарата транскрипции. Однако у дрозофилы был найден новый ген, кодирующий белок, близко родственный, но отличающийся от ТВР, впоследствии он был назван TBP-related factor 1, TRF1 [28].

TRF1

Как оказалось, TRF1 может играть роль ТВР у определенного набора генов, не регулируемых ТВР. Окрашивание эмбрионов дрозофилы in situ выявило, что TRF1 наиболее сильно экспрессируется в клетках нервной системы и гонадах [28, 52]. Биохимические исследования показали, что TRF1, как и ТВР, может специфично взаимодействовать с TFIIA и TFIIB, связываться с TATA боксом ДНК и направлять РНК-полимераза П-специфичную транскрипцию in vitro [52]. Как и ТВР, TRF1 является частью большого мультисубъединичного комплекса. Окрашивание политенных хромосом выявило, что в отличие от ТВР, TRF1 ассоциирован с локусами политенных хромосом, которые включают много генов, мутации в которых приводят к стерильности самцов и нарушении в функционировании нервной системы. Однако многие сайты также содержали гены тРНК и 5S РНК. [52]. Эти данные, а также ткане-специфичное распределение TRF1 показали, что TRF1 может быть функциональным гомологом корового транскрипционного фактора ТВР. И, возможно, необходим для управления ткане-специфичной или генно-специфичной транскрипцией у дрозофилы. В других экспериментах было выявлено, что скорее TRF1, чем ТВР ответственен за транскрипцию РНК-полимеразой Ш у дрозофилы. Эксперименты по иммунопреципитации хроматина (ChIP) идентифицировали несколько генов дрозофилы, содержащих промоторы, с которыми связывается TRF1 [65]. Биохимические исследования показали, что TRF1 предпочтительно связывается и направляет транскрипцию с одного или двух тандемных промоторов гена tudor, который вовлечен в регуляцию фертильности самцов дрозофилы. TRF1-связывающий регион был определен при помощи футпринтинга и оказался ТС-богатой областью (ТС box) [65]. Это исследование также показало, что ген tudor имеет второй TBP/TFIID-зависимый промотор, с которым TRF1 не связывается. Такая структура тандемных промоторов является интересным механизмом, по которому альтернативный коровый промотор, такой как ТС box может управлять экспрессией определенного набора

Г РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА I генов. Эндогенный TRF1 был изолирован в комплексе с другими белками (предполагаемые TRFl-ассоциированные факторы). Эти эксперименты показали, что способность TRF1 распознавать специфичные коровые промоторные последовательности происходит не только за счет Д1 IK-распознающих свойств TRF1. Вполне возможно, что промоторная специфичность TRF1 значительно зависит от ассоциированных с ним субъединиц. Поскольку TRF1 локализован на политенных хромосомах также в локусах тРНК и 5S РНК генов, возможно, что TRF1, как и ТВР, участвует в регуляции транскрипции и РНК-полимеразой П, и РНК-полимеразой III у дрозофилы. Чтобы подтвердить эту гипотезу, была использована транскрипционная система in vitro РНК-полимеразы Ш дрозофилы. Было показано, что TRF1, скорее всего, играет главную роль в транскрипции РНК-полимеразой Ш [170]. Это было неожиданным открытием, поскольку у человека, дрожжей и у большинства других эукариот, которые были изучены, ТВР и BRF (TFIIB-related factor) являются необходимыми компонентами для инициации транскрипции РНК-полимеразой П1 [47]. Последующие эксперименты показали, что BRF является TRF1-ассоциированным фактором, который управляет транскрипцией РНК-полимеразой Ш в клетках дрозофилы. Транскрипция in vitro показала, что комплекс TRF1:BRF участвует в регуляции транскрипции генов тРНК, 5S и U6 РНК. In vivo, TRF1 в большинстве случаев связан с BRF и эти два белка колокализуются на многих сайтах политенных хромосом, содержащих гены, транскрибируемые РНК-полимеразой III [170]. Однако, количество TRF1, связанного с BRF, отличается в развивающихся эмбрионах дрозофилы и в SL2 клетках дрозофилы. Скорее всего, TRF1 также может работать как промотор-селективный регулятор транскрипции РНК-полимеразой П [65]. Двойная функция TRF1, вероятно, зависит от его ассоциации с различными субъединицами, влияющими на свойства этого корового транскрипционного фактора. Таким образом, многоклеточные организмы, такие как дрозофила могут использовать гомолог основного транскрипционного фактора, такой как TRF1 для ткане-специфичной и/или генно-специфичной транскрипции.

TRF2/TLF/TLP

Анализ ESTs привел к открытию еще одного члена семейства TRF - TRF2 (ТВР-related factor 2). Этот фактор был найден в человеке, мыши, дрозофиле, С. elegans, крысе, Xenopus и у нематоды Brugia malayi [31, 136]. Однако TRF2 не был обнаружен ни в дрожжах ни у архея. Поскольку TLF/TRF2 был выделен из различных организмов, этот фактор имеет несколько названий: TBP-related factor 2 (TRF 2; [102]), TBP-like factor (TLF; [31, 77, 178]), TBP-like protein (TLP; [122, 123]). Первичная структура этого белка варьирует у различных видов, но все они содержат консервативный коровый домен, состоящий из двух повторов, общий у всего семейства ТВР подобных факторов. У TRF2 дрозофилы этот домен идентичен коровому домену ТВР на 39 %. Однако, несмотря на то, что ДНК-связывающий домен у всего семейства ТВР высоко консервативен (около 50% идентичности), детальное сравнение последовательностей ТВР и TRF2 показало, что ключевые аминокислоты, необходимые для взаимодействия ТВР с малым желобком ДНК TATA бокса, в TRF2 отличаются [30]. Эти данные подтверждаются тем, что рекомбинантный TRF2 не связывает канонический TATA бокс [111, 136, 173]. Хотя у TRF2 дрозофилы коровый домен гомологии с ТВР только на 39% идентичен, основания, ответственные за связывание с TFIIA и TFIIB факторами гомологичны на 60% и на 75%. Таким образом, TRF2, скорее всего, может взаимодействовать с этими компонентами PIC [136,173] и принимать участие в инициации транскрипции РНК-полимеразой II.

Интересно, что когда было создано единое древо ТВР-подобных факторов, все TLF в результате сгруппировались в одну семью, отличную от ТВР. Некоторые виды имеют более одного гена, кодирующего ТВР. Например, архей имеет три гена, и многие, если не все растения имеют два гена tbp. Однако оказалось, что многоклеточные экспрессируют также по крайней мере три различных ТВР-подобных фактора. Дрозофила является единственным известным организмом, имеющим ТВР, TRF1 и TRF2. Геном C.elegans содержит только два ТВР-подобных фактора (сеТВР и ceTLF), что говорит о том, что TLF появился раньше в эволюции, нежли TRF1 или, что у C.elegans произошла потеря TRF1 [31].

Сравнение трех членов ТВР семейства (ТВР, TRF1, TRF2) показало, что ТВР и TRF1 более схожи между собой, чем TRF2, и TRF2 имеет большую гомологию с ТВР , чем с TRF1. Исходя из этих данных можно предположить, что TRF2 дивергировал от ТВР раньше, чем TRF1, и TRF1 эволюционировал позже также от ТВР. Эта гипотеза подтверждается тем, что в дрожжах обнаружен только ТВР, в то время как C.elegans содержит ТВР и TRF2, а у дрозофилы есть ТВР, TRF1 и TRF2.

Хотя TRF2 человека и дрозофилы оба содержат консервативный коровый повтор, они имеют различные размеры и доменную структуру. TRF2 человека включает только коровый домен, в то время как TRF2 дрозофилы имеет также N- и С-концевые домены. Коровый повтор у TRF2 человека и TRF2 дрозофилы имеет 55% идентичности. Несколько аминокислотных оснований, консервативных у всех TRF2 белков отличаются от консенсусной последовательности ТВР. Наиболее значимы последовательности DIXIXNWC и TGSXTVT, располагающиеся около N- и С- концов, соответственно, корового повтора. Эти области участвуют в активации транскрипции в дрожжах.

TRF2 необходим для эмбрионального развития и дифференцировки

Изучение TRF2 у С. elegans и Xenopus привело к разгадке его биологической функции [30, 77, 178]. Нокаут TRF2 в червях и лягушках приводил к гибели организма на ранней стадии эмбрионального развития. Анализ паттерна генной экспрессии показал, что эти эмбрионы не способны экспрессировать обычные маркеры развития, и общий уровень транскрипции РНК-полимеразой П у них снижается. Интересно, что нарушение регуляции генов развития на ранних стадиях эмбриогенеза также приводит к уменьшению экспрессии TRF2 [30]. Дополнительные исследования у Xenopus и zebrafish выявили также, что ТВР и TRF2 необходимы для экспрессии различного набора генов. Эти данные подтверждают, что ТВР и TRF2 могут функционировать дифференцированно для контроля транскрипции специфичного набора генов в клетках животных [113,178].

TRF2 мыши необходим для сперматогенеза

Нозерн блот анализ показал, что TRF2 человека экспрессируется ткане-специфично и наивысший уровень экспрессии гена наблюдается в семенниках [136]. Чтобы объяснить его потенциальную биологическую функцию был получен TRP2/* нокаут мыши [107, 198]. TRF2"'" мыши были жизнеспособны; однако мутантные самцы оказались стерильны из-за позднего ареста в сперматогенезе. Эти данные показывают, что мышиный TRF2, в отличие от TRF2 лягушки или рыбы, возможно, не необходим для эмбрионального развития, но нужен для сперматогенеза. Нозерн блот и ОТ-ПЦР анализ подтвердили, что TRF2"/~ мыши показывают измененный паттерн экспрессии генов, участвующих в сперматогенезе. Таким образом, TRF2, возможно, специфично участвует в транскрипционной регуляции сперматозоидов [107, 198].

Функция мышиного TRF2 не совпадает с сильным ранним эмбриональным фенотипом, видимым у C.elegans, Xenopus и zebrafish. Хотя члены TRF2 семейства похожи и имеют общий высоко консервативный ДНК-связывающий домен, они значительно варьируют в размерах и доменной архитектуре [31, 136]. Например, человеческий TRF2 сравнительно небольшой и состоит, в основном, из двойного корового повтора, в то время как TRF2 С. elegans и дрозофилы имеют уникальные протяженные Си N-концевые домены [31, 136]. Эта вариабельность, вероятно, необходима для осуществления специфичных биологических функций у различных видов организмов. Несмотря на все эти исследования in vivo, механизм, по которому TRF2 контролируют транскрипцию, остается не выясненным, и гены-мишени TRF2 пока не идентифицированы.

TRF2 управляемая промотор-селективная генная экспрессия у дрозофилы

TRF2 дрозофилы, как и ТВР, и TRF1, взаимодействует с общими транскрипционными факторами TFIIA и TFIIB, однако dTRF2 взаимодействует с ДНК, содержащей канонический TATA бокс. Хроматографические исследования показали, что TRF2 является частью макромолекулярного комплекса. TRF2 может быть ассоциирован с новым набором белков, который отличается от ТВР- и TRFl-ассоциированных факторов [48, 52, 170]. Были идентифицированы ТКР2-содержащие комплексы дрозофилы, в которые входят: компоненты NURF хроматин ремодулирующего комплекса, DREF (DNA replication-related element (DRE)-binding factor), и другие белки, которые могут взаимодействовать с хроматином [63]. Биохимический анализ ТКР2-содержащего комплекса выявил ТКР2-специфичные промоторы. Фактор DREF, связывающий промоторный проксимальный элемент ДНК — DRE и вовлеченный в регуляцию клеточного цикла и клеточную пролиферацию генов, оказался связанным с TRF2. [62].

Исследования in vitro показали, что DREF-содержащий TRF2 комплекс участвует в распознавании корового промотора гена PCNA (proliferating cell nuclear antigen) [63]. По механизму, напоминающему связывание TRF1 с тандемными промоторами, PCNA ген также использует два тандемных коровых промотора, которые разделены 63 п.н. DREF/TRF2 комплекс селективно инициирует транскрипцию с промотора 2, который содержит DREF-связывающий сайт (DRE), в то время как промотор 1 стимулируется комплексом TBP/TFIID [63]. Генный анализ экспрессии идентифицировал несколько дополнительных генов-мишеней TRF2, вовлеченных в репликацию ДНК и клеточную пролиферацию, которые содержат промотор проксимальный элемент DRE [63]. Таким образом, промотор 2 PCNA гена может представлять класс промоторов, которые содрежат DRE элемент [63]. Компьютерный анализ коровых промоторных элементов в геноме дрозофилы определил DRE как один из консервативных потенциальных коровых промоторных элементов [126]. Более того, по имеющимся данным DRE вовлечен в контроль развития глаз, в частности, в переход от клеточной пролиферации к конечной дифференцировке [72]. Эти данные показывают, что TRF2 может функционировать как коровый промотор-селективный фактор, отвечающий за согласованно регулируемую транскрипцию определенного набора генов у дрозофилы.

Был исследован уровень экспрессии TRF2 человека (hTRF2) в различных тканях. Нозерн блот анализ показал наибольший уровень экспрессии гена в тканях семенников. Кроме того, среди остальных тканей большой уровень транскрипции был показан для мозга.

TRF2 ассоциирован на хромосомах дрозофилы с локусами, отличными от мест связывания ТВР и TRF1. Иммуноокрашивание политенных хромосом слюнных желез личинки дрозофилы показало, что TRF2 окрашивает следующие сайты: 74EF, 75В, 45F-46А, 55Е, 7IDE, 72D, 78D, 85EF, 88D, 93D. Также, более 40 других сайтов показали окрашивание, отличное от фона [136].

Хотя функция TRF2 не ясна, показано, что TRF2 необходим для эмбриогенеза и сперматогенеза. Также была исследована клеточная функция TRF2 на нокаутных клетках цыпленка DT40. TRF2 оказался негативным регулятором клеточного роста. Кроме того, было найдено, что TRF2 присутствует главным образом в цитоплазме и транслоцируется в ядро в G2 фазе. Также, TRF2 рассматривается как фактор, участвующий в регуляции клеточного цикла и при ответе на стресс [155]. TRF3

TRF3 фактически идентичен С-концевому коровому домену ТВР, включая все основания, участвующие в связывании ДНК, и отвечающие за взаимодействие с другими общими факторами транскрипции. Как и у других членов ТВР семейства, N-концевая область TRF3 дивергировала. Ген trf3 присутствует и экспрессируется в Vertebrata от рыб до человека, но отсутствует в геноме Urochordata Ciona intestinalis и у низших эукариот, таких как дрозофила и С. elegans. TRF3 является ядерным белком, который экспрессируется во всех тканях человека и мыши. Несмотря на высокую гомологию с С-концевым коровым доменом ТВР, гель фильтрационный анализ показал, что нативный молекулярный вес комплекса TRF3 меньше, чем TFIID. Таким образом, TRF3 является высоко консервативным специфичным для позвоночных TRF, чей высоко консервативный паттерн экспрессии и другие свойства отличаются от таковых у ТВР и всех других TRF [130].

Регуляторный ген Drosophila leg-arista-wing complex (Iaw с)

Ген lawc имеет сложную молекулярно-генетическую структуру и плейотропный фенотипический эффект. Его слабые мутации нарушают топологию механосенсорных органов (макрохет) у дрозофилы. Редкие более сильные проявления вызывают гомеозисные трансформации и другие дефекты различных органов. Взаимодействие гена lawc с основными пронейральными генами achaete и scute, а также с гомеобокс-содержащим локусом cut, позволяет считать его одним из важных регуляторов эмбриогенеза дрозофилы [203].

Район локализации /awe-мутаций (7Е) несет инсерцию двух тандемно расположенных копий мобильного Р-элемента [202]. Полученная мутация оказалась слабой и не влияла на жизнеспособность мух, поэтому в этой же лаборатории была скомбинирована с phPI аллелью [7], которая, как было показано, увеличивает проявление мутации. Обе мутации были совмещены с помощью метода генетической рекомбинации. Фенотипический анализ lawcp'phpl -компаундов показал, что все они имели очень сильное мутантное проявление гена lawc. У них были сильнотрансформированные аристы, искривленные ноги и слабая жизнеспособность. Слабая lawcР1 мутация не приводит к гибели мух на ранних стадиях и таким образом позволяет исследовать вовлечение lawc в различные процессы развития дрозофилы. У гомозиготных мух выявляются гомеотические трансформации сегментов дистальной антенны в соответствующие элементы тарсуса, развитие эктопических щетинок на голове, торакс и скутеллиум, грубые глаза, вырезки крыла на внутреннем крае, и различные дефекты в сегментации ног (соединение сегментов или отсутствие). Мутация не влияет на жизнеспособность мух, однако наблюдается 0.1% пенетрантность для полной трансформации аристы в тарсус и полная пенетрантность для частичных трансформаций, которые проявляются в искривленной и утолщенной аристе. Гомозиготные phF'lawc^1 показывали строгое увеличение мутантного фенотипа: частота трансформаций экстремальной аристы была около 30%, жизнеспособность уменьшалась до 10%, наблюдалась полная стерильность гомозиготных самок и уменьшение фертильности гемизиготных самцов [201].

Объект и задачи исследования

В предыдущих работах у D. melanogaster была получена мутация lawc, вызванная инсерцией Р-элемента и обладающая плейотропным эффектом на фенотип мухи [201, 203]. Было показано, что инсерция Р-элемента произошла в район, расположенный на расстоянии 15 т.п.н. выше места локализации гена trjl, что позволило предположить, что мутация lawc, влияет на экспрессию гена trf2 и, возможно, инсерция произошла в транскрибируемую часть гена trf2. Подтверждение данного предположения позволило бы исследовать функцию белка TRF2 у D. melanogaster.

Ген trf2, как было показано ранее, кодирует транскрипционный фактор TRF2 (ТВР related factor 2), имеющий домен гомологичный ДНК-связывающему домену общего фактора транскрипции ТВР (TATA box binding protein). TRF2 имеет гомологов у многих видов эукариот [31, 136]. Локализация TRF2 на политенных хромосомах отличается от сайтов связывания ТВР. Кроме того, TRF2 и ТВР входят в состав комплексов, отличающихся друг от друга по своему белковому составу [136]. Таким образом, можно предположить, что TRF2 и ТВР обладают разными функциями в регуляции транскрипции.

Показано, что у С. elegans и Xenopus TRF2 необходим для эмбриогенеза, в то время как у мыши TRF2 не нужен для раннего развития, но необходим для сперматогенеза (Dantonel, 2000; Martianov, 2001). У D .melanogaster была изолирована кДНК trf2, содержащая открытую рамку считывания (ОРС) для белка длиной 632 ак [136]. Данный белок был охарактеризован на молекулярном уровне. Однако структура гена trf2 и функция TRF2 у D. melanogaster осталась не исследованной.

Настоящая работа посвящена исследованию структуры гена trf2 Drosophila melanogaster и функции кодируемого им белка. В ходе исследования предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

- определить, является ли lawc мутацией гена trf2;

- изучить структуру гена trf2\

- изучить белок, кодируемый геном trf2 и исследовать его функции;

- найти гомологов белка TRF2 у различных видов Drosophila.

3. Материалы и методы

1. Реактивы

Были использованы реактивы фирм Amersham, Serva, Sigma, Fluka, Gibco BRL, Bio-Rad, Fermentas, Invitrogen, Pharmacia, Qiagen, Stratagene.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Копытова, Дарья Владимировна

6. Выводы

1. Показано, что мутация lawc D. melanogaster, является мутацией гена, кодирующего транскрипционный фактор TRF2.

2. Охарактеризована экзон-интронная структура гена trf2. Показано, что ген trf2 кодирует белок длиной 1715 ак.

3. Выявлено, что ген trf2 транскрибируется на всех стадиях развития и в различных тканях имаго.

4. Обнаружен новый белок TRF2 (р175), который, в отличие от описанного ранее TRF2 (р75), содержит N-концевую последовательность длиной 1083 ак. Показано, что р175 и р75 входят в состав различных белковых комплексов.

5. Найдены гомологи TRF2 у различных видов Drosophila. Показано единство структуры гомологов TRF2 у видов, близкородственных D. melanogaster.

6. TRF2 присутствует как в клетках с активной транскрипцией, так и транскрипционно неактивных клетках. В транскрипционно неактивных клетках белок связан с конденсированным хроматином, и понижение уровня белка в мутантных мухах нарушает конденсацию хроматина.

Благодарности

Автор выражает сердечную благодарность коллегами, без помощи которых данная работа не смогла бы появиться на свет. Среди них особо хочется отметить, Краснова Алексея, Копанцеву Марину, Набирочкину Елену, Лебедеву Любовь, Куршакову Марию за плодотворную совместную работу, а также Николенко Юлию, Laszlo Тога, Воробьеву Надежду за помощь в работе, ценные советы и обсуждение результатов. Невозможна данная работа была бы и без чуткого мудрого руководства Софии Георгиевой. Искреннюю благодарность автор выражает оппонентам и рецензентам данной работы. А также всем, поддержавших автора словом и делом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Копытова, Дарья Владимировна, Москва

1. Adamkewicz, J Л.; Mueller, C.G.; Hansen, K.E.; Prud'homme, W.A.and Thorner,

2. J.(2000) Purification and enzymic properties of Motl ATPase, a regulator of basal transcription in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 275, 21158— 21168( Abstract)

3. Akoulitchev, S.; S. Chuikovand and D. Reinberg(2000) TFIIH is negatively regulated bycdk8-containing mediator complexes. Nature 407,102-106(Abstract)

4. Alsina, В., Corominas, M., Berry, M.J., Baguna, J., Serras, F. (1999) Disruption ofselenoprotein biosynthesis affects cell proliferation in the imaginal discs and brain of Drosophila melanogaster. JCellSci 112 ( Pt 17), 2875-84

5. Aoyagi, N., Wassarman, D.A. (2000) Genes encoding Drosophila melanogaster RNApolymerase II general transcription factors: diversity in TFILA and TFIID components contributes to gene-specific transcriptional regulation. J Cell Biol 150, F45-50

6. Ashburner M. (1989) Drosophila. A laboratory manual. CSH laboratory press,1. Cambridge

7. Asturias, F.J. (2004) RNA polymerase II structure, and organization of the preinitiationcomplex. Curr Opin Struct Biol 14, 121-9

8. Bell, В.; Scheer, E.and and Tora, L.(2001) Identification of hTAFII80 links apoptoticsignaling pathways to transcription factor TFIID function. Mol. Cell 8, 591-600(Abstract)

9. Bell, В., Tora, L. (1999) Regulation of gene expression by multiple forms of TFIID andother novel TAFII-containing complexes. Exp Cell Res 246,11-9

10. Blake, M.C.; Jambou, R.C.; Swick, A.G.; Kahn, J.W.and Azizkhan, J.C.(1990)

11. Transcriptional initiation is controlled by upstream GC-box interactions in a TATAA-less promoter. Mol. Cell. Biol. 10 , 6632-41 (Abstract)

12. Boyer, T.G.; M. E. D. Martin; E. Lees; R. P. Ricciardiand and A. J. Berk(1999)

13. Mammalian Srb/Mediator complex is targeted by adenovirus El A protein. Nature 399,276-279(Abstract)

14. Brand, M.; Leurent, C.; Mallouh, V.; Tora, L.and and Schultz, P.(1999) Threedimensional structures of the TAFII-containing complexes TFIID and TFTC. Science 286,2151-2153(Abstract)

15. Brandeis, M.; Frank, D.; Keshet, I.; Siegfried, Z.; Mendelsohn M.and et al.(1994) Spl14.