Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика регуляторной зоны перекрывающихся генов lawc и Trf2 у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика регуляторной зоны перекрывающихся генов lawc и Trf2 у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

ЧЕРЕЗОВ Роман Олегович

ХАРАКТЕРИСТИКА РЕГУЛЯТОРНОЙ ЗОНЫ ПЕРЕКРЫВАЮЩИХСЯ ГЕНОВ /ан>с и Тг/2 у ОгоБорИНа текшо^Ыег

03.02.07 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

21 НОЯ 2013

Москва 2013

005538615

005538615

Работа выполнена в лаборатории генетических основ морфогенеза ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук»

кандидат биологических наук СИМОНОВА Ольга Борисовна

доктор биологических наук ЕВГЕНЬЕВ Михаил Борисович ФГБУН «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук» заведующий лабораторией

кандидат биологических наук КЛЁНОВ Михаил Сергеевич ФГБУН «Институт молекулярной генетики Российской академии наук» старший научный сотрудник

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет

Защита диссертации состоится «18» декабря 2013 года в «15—» часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, г. Москва ул. Вавилова, Д.26.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН: http://idbras.ru/.

Автореферат разослан «"7 » ноября 2013 года.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

О.В. Бойко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение регуляции экспрессии генов является одной из актуальных проблем современной генетики. Важную роль в регуляции экспрессии генов играют их регуляторные зоны, которые наряду с наличием в них сайтов связывания регуляторных белков могут являться источником разных типов регуляторных РНК. В настоящее время показано, что значительная часть генома эукариотических организмов способна транскрибироваться в двух направлениях (смысловом и антисмысловом), то есть многие гены эукариот перекрываются. Так, у Drosophila melanogaster перекрывается 26.2 % кодирующих белки генов. Такое строение генома приводит к появлению общих для разных генов регуляторных зон и возникновению перекрывающихся РНК, как кодирующих, так и не кодирующих белки. В свою очередь, перекрывающиеся регуляторные элементы, и, главным образом, перекрывающиеся транскрипты, представляют собой дополнительный способ регуляции экспрессии генов. Эволюционная и биологическая значимость этого явления не совсем ясна. Большинство найденных перекрытий возникает между генами, транскрибируемыми с противоположных цепей одного и того же локуса. Часто в перекрытие вовлекается не кодирующий белок транскрипт. Накапливаются данные, что антисмысловые транскрипты участвуют во множестве клеточных процессов, таких как геномный импринтинг, инактивация Х-хромосомы, альтернативный сплайсинг, сайленсинг генов и метилирование, трансляция. Наличие перекрывающихся транскриптов и их регуляторная роль показаны для ряда генов у разных организмов, среди которых гены, вовлечённые в онкогенез и развитие других патологий. Существуют разные модели механизмов регуляции смысловой мРНК антисмысловым транскриптом. Одной из них является модель транскрипционной интерференции (ТИ) (или транскрипционного столкновения). Согласно этой модели, процесс транскрипции одного гена подавляет транскрипцию перекрывающегося с ним другого гена. Большинство исследований перекрывающихся генов и антисмысловой транскрипции проводится in vitro или in silico и остро нуждаются в подтверждении результатов in vivo.

Ранее в нашей лаборатории была открыта мутация D. melanogaster, нарушающая правильную экспрессию многих нейрогенов и транскрипционных факторов, контролирующих развитие организма. По данным GenBank район локализации мутации содержал два гена leg-arista-wing complex и TBP-related factor 2 (lawc/Tr/2), предположительно имеющих общую 5'-регуляторную зону. Транскрипты, синтезирующиеся с данного локуса, представляли собой набор разнонаправленных мРНК, количество и структура которых неизвестны. По нашим предварительным данным по крайне мере один из транскриптов гена lawc должен перекрываться с транскриптами гена Тг/2. Мы предположили, что гены lawc и Тг/2 взаимодействуют, а зона перекрытия и разнонаправленные транскрипты могут участвовать в координировании экспрессии обоих генов.

Исследование 5'-регуляторной области генов law с и Trß важно не только для понимания механизмов контроля экспрессии данного локуса, но и для получения знаний о способах и механизмах регуляции экспрессии перекрывающихся генов у эукариот. Описание 5'-регуляторной зоны lawdTrß позволит в дальнейшем использовать данный локус в качестве модели для исследования взаимодействия перекрывающихся генов in vivo. Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в исследовании регуляторной 5'-зоны перекрывающихся генов leg-arista-wing complex и ТВР-relatedfactor 2 у Drosophila melanogaster.

В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1) установить экзон-интронную структуру гена lawc\

2) исследовать экспрессию мРНК перекрывающихся генов lawc и Trf2 на разных стадиях развития D. melanogaster и в культуре клеток Schneider 2;

3) провести сравнительный анализ экспрессии перекрывающихся генов lawc и Trf2 у мутантов с различными нарушениями регуляторных областей;

4) исследовать эффект подавления экспрессии lawc-транскриптов на уровень экспрессии перекрывающихся с ними противоположно направленных транскриптов Trß in vitro в культуре клеток Schneider 2 и in vivo;

5) исследовать паттерн экспрессии перекрывающихся генов lawc и Тг/2 у разных видов дрозофил.

Научная новизна и практическая значимость работы. Обнаружено, что часть регуляторной области локуса lawdTrß входит в состав нескольких разнонаправленных транскриптов и является общей для двух генов. Открыт новый экзон и установлены реальные точки старта транскрипции известных ранее сплайс-вариантов мРНК гена lawc. Изолировано шесть новых сплайс-вариантов мРНК гена lawc\ нуклеотидная последовательность одного из них внесена в базу данных Genbank под номером JX546150. Впервые показано наличие у гена Trß не описанных ранее коротких транскриптов длиной 1,1 т.н. и 3,1 т.н., формирующихся в 5'-регуляторной зоне. Впервые выявлены новые полоспецифические (специфичные только для самок или самцов) транскрипты обоих генов. Выявлены возможные регуляторные зоны, ответственные за тканеспецифическую регуляцию экспрессии генного комплекса в репродуктивной системе самок. Показано, что экспрессия прямых и обратных перекрывающихся транскриптов lawdTrß в раннем эмбриогенезе пространственно не совпадает, что предполагает регуляцию экспрессии этих генов по механизму транскрипционной интерференции на данном этапе развития. Впервые охарактеризована природа мутантных аллелей исследуемого района. В экспериментах in vivo и in vitro по избирательному посттранскрипционному подавлению экспрессии гена lawc показана зависимость уровня экспрессии гена Trß от транскрипционной активности гена lawc. Обнаружен активирующий эффект РНК-интерференции на экспрессию одного из двух перекрывающихся генов (увеличение экспрессии вместо подавления), что очень важно учитывать на практике, поскольку в литературе всё больше уделяется внимание проблеме лечения ряда генетических

заболеваний (включая рак) с помощью генотерапии на основе РНК-интерференционного подавления экспрессии «испорченного» гена. Показана эволюционная консервативность района перекрытия генов lawc и Trf2 для близкородственных видов дрозофил подгруппы melanogaster. Степень достоверности и апробация результатов. Результаты проведенных исследований являются достоверными, что подтверждено публикациями в рецензируемых журналах, воспроизводимостью результатов в различных условиях и на различных моделях. Исследования проводились на сертифицированных и откалиброванных приборах, для анализа полученных данных были использованы современные методы обработки данных, применяемые для исследования биологических процессов. Результаты работы докладывались на ежегодных конференциях молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2008; 2009; 2010; 2011); на X Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007), на Международной молодёжная научно-методическая конференция «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007), на X Всероссийская конференция «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2009), на Международной конференции «Современное состояние генетики в Казахстане (Алмата, 2010), на Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра (Санкт-Петербург, 2010), а также на международных конференциях по дрозофиле (ADRC) в США (San Diego, 2008; Chicago, 2009; Washington, 2010; Washington, 2013) и в Испании (Barcelona, 2013).

Личное участие автора. Представленная работа полностью выполнена автором, включая разработку экспериментальных моделей и планирование экспериментов, получение исходных экспериментальных данных и непосредственное участие в научных экспериментах, статистическую обработку и интерпретацию полученных результатов, подготовку основных публикаций по проделанной работе и представление результатов исследований на конференциях соответствующей тематики.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 16 рисунков, 3 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 223 цитируемых источника и одного приложения.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 4 в журналах, соответствующих Перечню ВАК, одна электронная публикация и 14 тезисов докладов и материалов конференций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнялись на плодовой мушке Drosophila melanogaster и культуре клеток дрозофилы Schneider 2 (S2). Использовались линии мух самостоятельно полученные в данной работе, а также линии из мировых коллекционных центров.

РНК выделяли с помощью Tri Reagent (Sigma, США) в соответствии с рекомендациями производителя.

Полноразмерную кДНК транскриптов гена lawc получали методом быстрой амплификации 5'и 3'-концевых фрагментов кДНК (5', З'-RACE) с помощью наборов реагентов Step-Out RACE (Evrogen, Россия) и FirstChoice RLM kit (Ambion, США) в соответствии с рекомендациями производителей.

Сравнительный анализ количества и размера прямых и обратных транскриптов проводили методом нозерн-блот анализа по методике Sambrook J. and Rüssel D.W. (Molecular cloning, 2001) с изменениями. Для нозерн-блот гибридизации в качестве зондов использовали меченые 32Р ДНК-пробы, а также одноцепочечные 32Р меченые рибопробы из района перекрывания транскриптов. В качестве референсного гена использовали зонды к гену альфа-тубулина.

Сравнительный анализ экспрессии генов lawc и Trfl проводили методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием зондов, меченных флуоресцентными красителями (зонды TaqMan®). Праймеры подбирались из транслируемых областей обоих исследуемых генов. В качестве эндогенного контроля использовался ген рибосомального белка Rpl32.

Гибридизацию in situ на целых эмбрионах проводили, используя дигоксигенин-меченые рибопробы из района перекрытия генов lawc/Trß.

РНК-интерференцию в культуре клеток дрозофилы проводили по методике Ausubel F.M. (Ausubel et al., 2003). Фрагмент кДНК гена lawc, содержащий транслируемую последовательность, апмплифицировали с помощью ПЦР (рис. 1). Каждый праймер содержал кроме последовательности гена сайт связывания Т7 полимеразы на 5'-конце. Полученные продукты амплификации использовали в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной РНК (дцРНК) in vitro, которую трансфецировали в клетки согласно методике Ausubel F.M. (Ausubel et al., 2003). В качестве неспецифического контроля использовали дцРНК, содержащую последовательность гена GFP или стерильную воду в объеме, равном объему вносимой дцРНК. Эффект РНК-интерференции оценивали по уровню мРНК целевых генов с использованием ПЦР-РВ.

Трансгенные инактивирующие конструкции, экспрессирующие РНК-шпильку, направленную на пост-транскрипционное подавление мРНК гена lawc по пути РНК-интерференции, были созданы на основе вектора pUAST (Brand, Perimon, 1993). Каждая конструкция содержала два фрагмента транскрибируемой области гена lawc, клонированные в направлении «хвост-к-хвосту» по отношению друг к другу. Фрагменты были комплементарны транслируемым или нетранслируемым участкам в зависимости от дизайна конструкции (рис. 1). ДНК созданных конструкций была инъецирована в полярную плазму эмбрионов дрозофилы на стадии прецеллюлярной бластодермы. Полученные линии трансгенных дрозофил использовались в генетических экспериментах с применением дрожжевой двухкомпонентной

системы иА8/САЬ4. Для этого мухи, экспрессирующие дрожжевой белок-активатор Оа14 под контролем убиквитарного промотора гена тубулина 1иЬ-(За14/ТМЗ, ТЬ, были скрещены с трансгеннными мухами иАБ-Ш/иА5-Ш, несущими инактивирующую конструкцию, контролируемую дрожжевым промоторным элементом иА8.

(I)

«ОС

m

dsLawc

ш-

lawc

dl)

frntt гev^Khol FmRI rev^xhol

ХЬв1_Л__Xh ol Xbai_j!L__Xhol

5xUAS EcoRI f Xhol Xbal

1

rfsRNA - lawc | Dicer2

1

Деградация мРНК целевого гена lawc

Рисунок 1. Схема создания инактивирующих конструкций (Ri и Riß для подавления lawc (I) - геномная организация перекрывающихся генов lawc и Trf2. Серым цветом окрашена область перекрывающихся экзонов, черным - обозначены районы, кодирующие белок, неокрашены - некодирующие экзоны. (II) - фрагменты инактивирующей конструкции UAS-Ri (слева) и UAS-Rif (справа). Внизу представлена схема формирования РНК-шпильки при активации конструкций в системе UAS/GAL4. (III) - карта плазмид pUAST-lawcRNAi (RURif), miri\-white - маркерный ген; З'Р, 5'Р - концевые повторы Р-элемента, 5xUAS - 5 копий дрожжевого промотерного элемента UAS (Upstream activating sequence), SV40 polyA -фрагмент, содержащий сигнал полиаденилирования мРНК вируса SV40.

В результате нарабатывался белок Gal4, который связывался с сайтами UAS и повсеместно вызывал экспрессию РНК-интерференционной шпильки в организме мухи tub-Gal4/UAS-Ri.

Восстановление жизнеспособности (rescue—тест) проводили генетическими методами. В rescue-экспериментах использовали три трансгенные линии, содержащие генетические конструкты, конститутивно экспрессирующие различные домены TRF2. При приготовлении препаратов кутикулы погибших эмбрионов хорион удаляли вручную, кутикулу просветляли в капле раствора Хойера с добавлением 30% молочной кислоты в течение часа при 60°С.

Препараты анализировали с использованием оборудования Центра коллективного пользования «Биология развития на основе использования клеточных технологий и оптических методов исследований» при Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Экспрессия прямых и обратных транскриптов комплекса 1ан>с/Тг/2 Паттерн экспрессии разнонаправленных транскриптов исследовали с помощью Нозерн-блот анализа поли(А)4РНК (рис. 2). Для Т'г/2 было выявлено пять новых полос гибридизации. Среди них три лёгких (менее 1,5 т.н.), две из которых полоспецифические, характеризующие, возможно, некодирующие, транскрипты Тг/2 (рис. 2Б). Для 1стс было выявлено 6 полос гибридизации, 3 из которых полоспецифические - характерные самкам - соответствующие транскриптам длиной -3.7 т.н., ~0.8 т.н. и -0.6 т.н. (рис. 2Б). Таким образом, впервые были обнаружены новые транскрипты изучаемых генов, не описанные ранее в литературе, и, вероятно, имеющие регуляторное значение. В связи с этим возникла необходимость клонирования и изучения структуры новых транскриптов гена 1ам>с.

ШР'

2 т.п.н.

чь

-споснз-

■

Зонд 1аисЗ'

Зонд рЗ.З

Б ДНК-зонд Тл. '

9.о-6.0-

е

з.о-

РНК-зонд

г г *

в г

$ 9

О

1гж/Ттй ангм-ГгГЗ |>33 [>33

анти-Ьпс аити-.Панс рЗЗ 1аигсЗ'

ДНК-зонд РНК-зонд

|©

Тл. 9.06.05.04.03.0" 252,01.51.00.5-

<? 5

1тс/Ш

рЗЗ

3 9

аити-ЗТат-1аисЗ'

Дикий ТИП 1а\л/^1

Тл. 9.06.04.03.02.01.51.0-

<5 ¥ в 9

+Р

+р

-+Р

¿1.

ДНК-)она |)3 3

+Р ¡: ?

1.8-

а-ЫЬиНп

Рисунок 2. Анализ экспрессии прямых и обратных транскриптов комплекса 1аюс/Тг[2 у мух дикого типа и у гипоморфных мутантов ¡ап'с1'1. А. Карта перекрывающихся транскриптов 1ач/с/Тг/2. Направление транскрипции указано стрелками, широкие прямоугольники - экзоны, закрашенные прямоугольники - кодирующие белок области экзонов. Зона перекрытия транскриптов заштрихована. Синим цветом указаны зонды.

Треугольником показано место инсерции Р-элемента у мутанта /а№ср'. Б. Нозерн-блот анализ поли(А)+РНК мух дикого типа. Гибридизацию проводили с зондом из зоны перекрытия: слева ДНК-зонд рЗ.З, далее - рибопробы, выявляющие прямые Тг/2-транскрипты и обратные 1см>с-транскрипты из района рЗ.З и З'-района. Красные стрелки -транскрипты Тг/2, зелёные - транскрипты 1аюс, голубые - совпадающие по размеру прямые и обратные транскрипты, обведены овалом полоспецифические /аи'с-транскрипты, обведены квадратом полоспецифические некодирующие 7>/2-транскрипты. Составные профили гибридизации (с зондом 1а\усЗ') скомбинированы из радиоавтографов, полученных с одного фильтра, но с разной экспозицией. Справа показана схема нозерн-блот гибридизации с разными зондами. Красным показаны транскрипты гена 1аюс, зеленым - Тг]2, синим -совпадающие по размеру прямые и обратные транскрипты. В. Нозерн-блот анализ поли(А)+РНК мух дикого типа и гипоморфного мутанта 1а№ср1. Обозначены 1а\чс- и Тг/2-транскрипты мутанта, имеющие в своём составе последовательность Р-элемента. Знак вопроса указывает на исчезающие у мутанта транскрипты. Внизу - нормализующая нозерн-блот гибридизация того же фильтра с зондом к альфа-тубулину.

Характеристика транскриптов гена lawc

Ранее в нашей лаборатории при скрининге библиотеки кДНК из эмбрионов дрозофилы был получен клон части кДНК гена lawc - isofom С (GenBank # DQ296481) (Simonova О.В. et al., 2005). Для изолирования полноразмерной кДНК гена lawc была проведена быстрая амплификация 5'-концевых фрагментов кДНК (5'-RACE). В результате был получен клон размером 3437 н., который был длиннее транскрипта lawc - isoform С на 714 н. (рис. 3).

I

lawc - isoform А lawc - isoform В

J- lawc

lawc - isoform С

Рисунок 3. Структурная организация и схема сплайсинга транскриптов гена 1ап>с.

Прямоугольниками обозначены экзоны, чёрным выделен район, кодирующий белок, зеленым выделена зона перекрытия транскриптов 1а\ис и 7У/2, синим обозначены новые транскрипты, обнаруженные у самок (Р1-4), оранжевым - у самцов (М1-2). Штриховкой обозначены установленные в данной работе границы 5'-районов соответствующих транскриптов и новый экзон гена 1смс.

Сравнение его нуклеотидной последовательности с последовательностью геномной ДНК показало, что ген 1а\\>с имеет протяженную 5'-нетранслируемую область и перекрывается со вторым экзоном 7>/2 на протяжении 408 п.н.

Для изучения структуры остальных /сги'с-транскриптов мы использовали метод 5'-КЬМ-КАСЕ и З'-КАСЕ. В результате из взрослых особей (самцов и самок) были получены и секвенированы кДНК-клоны новых сплайс-вариантов мРНК гена 1ам>с, не описанные ранее (Р1-4, М1-2 на рис. 2Б и рис. 3), а также получены полноразмерные кДНК известных ранее сплайс-вариантов ¡эоГогт А и ¡эой)гт В (рис. 3). Картирование кДНК сплайс-вариантов ¡зойэгт А и ¡бойгш В показало, что они перекрываются со вторым экзоном гена 7>;/2 на протяжении 149 п.н. При сравнении новых сплайс-вариантов с геномной ДНК и с последовательностями базы данных вепБапк оказалось, что транскрипты БЗ и Б4 содержат новый экзон. Кроме того эти и другие (К 1, Р2 и М1, М2) транскрипты имеют новые сайты старта транскрипции. Нуклеотидная последовательность транскрипта ¥4 внесена в базу данных ОепЬапк под номером 1X546150.

Таким образом, мы показали, что в районе перекрывающихся генов 1ам>с/Тг/2 транскрибируется множество разнонаправленных (в том числе полоспецифических) сплайс-вариантов мРНК, как кодирующих, так и не кодирующих белки.

Экспрессия генов /йи с и 7У/2 на разных стадиях развития />. melanogaster и

в культуре клеток 82

Анализ картины и уровня экспрессии генов 1а\\'с и 7>/2 в развитии пповодили с помощью нозерн-блот гибридизации и ПЦР в реальном времени.

Еш Л1 Л2 .13 К1 К2 КЗ

\3lawc □ Тг/2

<

шЙ 'I

ШтШт

а1рИа-ШЬи1ш

тй—

л

п

Эм Л1 Л2 ЛЗ

Рисунок 4. Анализ экспрессии 1акс и Тг/2 на разных стадиях развития О. те1апаца%1ег и в культуре клеток 82. (А) Нозерн-блот гибридизация мРНК с зондом рЗ.З из зоны перекрытия 1а\\/с/Тг/2 (см. рис. 2А). Для нормализации использовали ДНК-зонд к альфа-тубулину. (Б) ПЦР-РВ-анализ экспрессии транскриптов 1стс и Тг/2 на разных стадиях развития. Обозначения: Еш (Эм) - эбрионы, Л1-ЛЗ личинки 1-3-го возрастов, К1-КЗ - стадии куколки (ранняя, средняя, поздняя), - самцы, $ - самки, Б2 - культура клеток 52.

Оказалось, что экспрессия этих генов не является убиквитарной, т.е. количество транскриптов и их уровень экспрессии меняется в зависимости от стадии развития (рис. 4А). Наиболее сильная экспрессия генов совпадает по времени с основными событиями морфогенеза (эмбриогенез, метаморфоз) (рис. 4Б). Нозерн-блот анализ поли(А)+РНК из культуры клеток S2 показал одновременную экспрессию генов Iawc/Trf2. В связи с этим возник вопрос, совпадают ли пространственно паттерны экспрессии изучаемых генов в живом организме. Гибридизация in situ на целых эмбрионах показала, что гены Trf2 и lawc экспрессируются практически во всех тканях (рис. 5), но с разной интенсивностью. На поздних стадиях эмбрионального развития экспрессия обоих генов падает.

Гибридизация in situ на целых эмбрионах с РНК-зондами из района перекрытия генов

Полярные клетки

Т/12 lavjc

стадия

стадия 1

Рисунок 5. Гибридизация in situ на целых эмбрионах с РНК-зондами из района перекрытия генов. Стрелками показана экспрессия Тг/2 и lawc.

Наиболее информативной для анализа явилась стадия поздней бластодермы, так как она сравнительно просто устроена и представляет собой однослойный клеточный мешок. Оказалось, что транскрипты гена lawc экспрессируются преимущественно в полярных клетках на заднем полюсе эмбриона, а транскрипты Trf2, в отличие от lawc, выявлялись в центральной области эмбриона (рис. 5). Таким образом, экспрессия прямых и обратных перекрывающихся транскриптов Iawc/Trf2 в раннем эмбриогенезе пространственно не совпадает, что предполагает регуляцию экспрессии этих генов по механизму транскрипционной интерференции на данном этапе развития.

Экспрессии транскриптов lawc и Trf2 в мутантных линиях

Ранее в нашей лаборатории была получена гипоморфная мутация lawtf'. Было показано, что она вызвана инсерцией двойной копии мобильного Р-элемента (Модестова и др., 2003). Нозерн-блот гибридизация с зондом, содержащим последовательности зоны перекрытия генов, показала увеличение размера ряда транскриптов обоих генов на размер Р-элемента (+Р на рис. 2В).

Самки другой линии - 1стс" - стерильны из-за нарушения самовоспроизведения стволовых клеток яичников. Нозерн-блот гибридизация показала отсутствие у стерильных самок 1стс"3 полоспецифического транскрипта Тг/2 (рис. 6Б, зелёная стрелка) и перекрывающегося с ними обратного полоспецифического /яи'с-транскрипта (3,7 т.н.) (рис. 6В, синяя стрелка). Было обнаружено избирательное утяжеление общего для самок и самцов транскрипта ТУ/2 и общего для самок и самцов транскрипта 1ам>с (рис. 6Б, В, красные стрелки), возможно, вызванное инсерцией мобильного элемента в общий для этих транскриптов район.

lawc

OK lawc OR Imf-1

Т.Н. S ? 8 ? т.н.

4.0 - 4.0 - V

3.0 - ч * 3.0 -

2.0 - 2.0 _

1.5 -v 1.5 ч

1.0 MI ,.о-ч

0.5. 1 0,-

Зонд Iawc.V Зонд анти-/ан'С

■OK 1акс" .ОН 21аж"'

Рисунок 6. Анализ экспрессии транскриптов комплекса Iawc/Trf2 в линии lawc" . А.

Карта перекрывающихся транскриптов Icrwc/Trf2. Описание как на рис. 2. Синим цветом указаны РНК-зонды: зонд lawc3', зонд анти-/аи<с является рибопробой ДНК-зонда рЗ.З, специфичной к обратным lawc-транскриптам, lawcö - ДНК-зонд. Б. Нозерн-блот анализ поли(А)+РНК диких (OR) и мутантных lawc"3 самок и самцов с ДНК-зондом lawcö. Красной стрелкой указаны утяжеленные транскрипты Trf2 общие для самцов и самок. Зеленой -отсутствие полоспецифического транскрипта размером 9.5 т.н. у стерильных самок. В. Нозерн-блот анализ поли(А)+РНК диких (OR) и мутантных lawc"3 самок и самцов с использованием зондов, выявляющих lawc-транскрипты. Синие стрелки указывают lawc-транскрипты, отсутствующие у мутантов, красные стрелки указывают увеличенный в размере транскрипт (общий для самцов и самок), зелёные указывают на транскрипты, размер которых не изменился. Г. Уровень экспрессии мРНК lawc в мухах дикого типа (OR) и в мутантах (lawc"3).

Анализ уровня мРНК обоих генов с помощью ПЦР-РВ показал сильное снижение экспрессии гена 1ам;с в линии 1см>си3 (рис. 6Г).

Мы предполагаем, что стерильность самок 1ам>с"3 вызвана нарушением некой регуляторной зоны, специфически контролирующей экспрессию полоспецифических транскриптов 1см>с1Тг/2 в оогенезе. Возможно, эта зона находится в районе «промотор-первый интрон 7У/2» или в районе второго интрона Тг/2 (район зонда 1а,^;3' и рЗ.З (рис. 6А)), так как в этих районах нами обнаружены хромосомные перестройки, вызвавшие утяжеление 1ам/с-транскриптов самок (0.8 т.н.) и самцов (0.9 т.н.) до 2.9 т.н. и 3.0 т.н. соответственно (рис. 6В слева, красные стрелки). Отсутствие утяжелённой полосы при гибридизации с рибопробой анти-/ям>с (рис. 6В справа) вызвано высокоспецифичностью рибопроб, так как они не гибридизуются с частично комплементарными РНК.

Дополнительно мы проанализировали линию 1а-мс№520/РМ4. Гомозиготные самки 1ач/сЕГ52Г) и гемизиготные самцы 1а\чсЕ¥52п/У погибают на эмбриональной стадии развития (рис. 7Б).

А

ТП2 5' —о

Df 18

Df 9

рЗ.З

Df

Iawc6 trf2

2 т.п.н

ЗондрЗ.З Самки

тн 9.0 _ 6.0- 20.W Df 520/+ +

4.03.0- • «1

2.0;::: 8 II

рЗ.З

1.8- * m

a-tubulin

Зонд Iawc6

Самки

тн

9.0 -

+ 520/Df

Зонд №2

Самки

тн + 520/Df

9.0 -I

Рисунок 7. Анализ экспрессии 1аюс/Тг/2 в линии с эмбриональной летальной мутацией

1ап>сЕГ520. А. Карта перекрывающихся транскриптов 1стс/Тгр. Описание как на рис. 1. Внизу синим цветом указаны ДНК-зонды, ниже прерывистой линией обозначена деления в линии 1ам1срМ. ОЯ 8 и — небольшие делеции в линии с мутацией ¡амн?"20. Б. Фенотип кутикулы эмбрионов дикого типа (вверху) и погибших мутантных эмбрионов ¡амс^520 (внизу). Стрелками указана область головного отдела. В. Нозерн-блот анализ поли(А)+РНК гетерозиготных мутантных самок 1ам!сР'1е1/1сюсЕГ52'\Ы^1\^^), самок 1ам.'с!"ш (0{), самок 1аюсЕ1'520/РМ4 (520/+) и самок дикого типа (+). Транкированный транскрипт мутанта указан красной стрелкой. Для нормализации использовали ДНК-зонд к альфа-тубулину.

Ранее было показано, что у мух в линии с мутацией lawcEF52° есть небольшие делеции в транслируемой области гена 7>/2, однако роль этих делеций в проявлении мутантного фенотипа не исследовалась. С помощью нозерн-блот анализа мы выявили в мухах этой линии укороченные транскрипты гена Trf2, возможно, кодирующие транкированный белок (рис. 7В, зонд рЗ.З и зонд lawc6). Обнаружить и продемонстрировать укороченный транскрипт в

,, .. . EF520

мухах линии с летальной хромосомой lawc позволило использование комбинации аллелей lawcpdelllawcEF52°, где law(fdel несёт делению в районе

i i EF520

используемого зонда рЗ.З, позволяя выявлять транскрипты мутантов lawc (рис. 7А). Транскрипция укороченной мРНК пересекает район зонда lawc6, но не доходит до района зонда trf2, поскольку гибридизация с зондом trf2 выявляет только транскрипты lawcpdel в мухах law<fdelllawcEF^° (рис. 7В, зонд trf2). Отсутствие полноразмерных транскриптов 7У/2 у lawcEF52" говорит о том, что мутация lawcEF:>2" является ноль-мутацией по гену 7>/2.

Таким образом, анализ трех мутантных линий выявил нулевой аллель Trf2 в одной из них и показал, что фенотип мух двух остальных линий обусловлен нарушениями регуляторной зоны lawdTrf2. Более того, мы показали, что регуляторная зона Iawc/Trf2 содержит область, необходимую для активации экспрессии полоспецифических транскриптов lawdTrfl в репродуктивной системе самок.

Регуляторное влияния lawc на экспрессию Trf2

Мы исследовали влияние подавления экспрессии гена lawc на функционирование противоположно направленного гена Trf2 in vitro на культуре клеток S2 и in vivo в мухах, используя метод РНК-интерференции.

Рисунок 8. Подавление экспрессии 1акс в культуре клеток 82.

Желтым показан уровень экспрессии мРНК гена 1ст>с, зеленым - уровень экспрессии Тг/2.

(ЬЬА'М'С, сЫЗРР-

уровень мРНК при введении дцРНК,

гомологичной гену 1смс (опыт) или СРР (контроль), соответственно.

Для экспериментов in vitro была получена дцРНК, содержащая последовательность транслируемой области lawc (рис. 1). Введение в клетки дцРНК неожиданно привело к сильному повышению уровня мРНК гена lawc и

снижению экспрессии Trf2 (рис. 8). Таким образом, возможно, транскрипционная активность гена lawc в ядре или его мРНК в цитоплазме могут регулировать экспрессию Trf2.

Для экспериментов in vivo были созданы линии трансгенных дрозофил UAS-Ri, несущих конструкции, способные экспрессировать РНК-шпильку, направленную на пост-транскрипционное подавление мРНК гена lawc по пути РНК-интерференции (рис. 1). Активация конструкции с помощью убиквитарно экспрессирующегося драйвера Tub-Gal4 приводила к массовой (до 97% в зависимости от температуры развития, поскольку активность драйвера зависит от температуры) гибели потомства UAS-Ri/Tub-Gal4 на эмбриональной стадии развития (рис. 9).

Рисунок 9. Выживаемость дрозофил после активации конструкции Ri.

Синие столбики — выживаемость дрозофил после активации конструкции UAS-Ri белком Gal4, экспрессирующегося под контролем промотора гена тубулина (Tub-Gal4>UAS-Ri) при различной температуре развития, коричневый и желтый столбики - выживаемость (Rescue-test) на фоне эктопической экспрессии двух изоформ белка TRF2: укороченной и полноразмерной соответственно. По оси абсцисс — температура развития, °С. По оси ординат - частота выживаемости, %.

Исследование фенотипа погибших эмбрионов показало наличие у них ряда аномалий, характерных для эмбрионов со сниженной экспрессией TRF2 (рис. 10Б). Введение дополнительных конструкций, экспрессирующих TRF2, восстанавливало жизнеспособность мух, обосновывая факт того, что эмбриональная гибель в трансгенных линиях является результатом снижения уровня экспрессии Trf2 (рис. 9, коричневый и жёлтый столбики). Данные генетических экспериментов были подтверждены в сравнительном анализе экспрессии генов lawc и Trf2, выполненном при помощи метода ПЦР в реальном времени (рис. 10А). Оказалось, что у мух после активации конструкции UAS-Ri, уровень экспрессии Trf2 действительно резко падает, в то время как экспрессия lawc увеличивается более чем в два раза по сравнению с мухами, содержащими неактивную конструкцию UAS-Ri (рис. 10А).

Таким образом, эксперименты по подавлению экспрессии гена lawc in vivo и in vitro дали сходные результаты: попытка ингибировать экспрессию lawc по пути РНК-интерференции приводит к увеличению экспрессии гена lawc и снижению экспрессии Trf2.

□Tub-Gal4>UAS-Ri - QTub-Gal4>UAS-Ri+TRF2yK □ Tub-Gal4>UAS-Rn-TRF2

'J П F 1

23°С 25°С 2Г-С 25°С 25-С

Температура развития

Мы провели анализ фенотипа кутикулы эмбрионов, погибших в результате снижения экспрессии Тг/2 (рис. 10Б).

А Б

Г--

□ /аигс □ Тг/2

2,5

=

л

ь

£ 1.5

¡^ КОН'фОЛЬ

\: Й

__ЦАБ-т

в

ftY989652 ^^ DQ162Ö4S ■ — — ----------------—---—

а EU971464 DQ2964Ô1

1 2 ........ '

а. ?

I §

.5

ОС Caudal Hunchback

3 = | Se Я Dorsal Hunchback t...-....-•»................................ IIIIIIIII III II......Ii »II и Hill IIIIII II an. ..••■■in......MI H III II II II 1 III III II Ii 1 lllll Ii III III III 1 III II IUI 111 • II III НИ 1 Hill II II II II 1 III III II......IM 1M • II ............ .......

ев О Krüppel

Diehaete .................. «Ilm 1 III III ,1 , . H

Рисунок 10. Нарушение развития эмбрионов со сниженной экспрессией TRF2. (А)

Количественная характеристика уровня экспрессии генов 7V/2 и lawc у дрозофил в условиях РНК-интерференции lawc. Контроль - уровень экспрессии lawc и 7У/2 до активации конструкции UAS-RI; (Б) Фенотип эмбрионов, погибших после подавления экспрессии транскриптов lawc комплекса !awc/Trf2. (I) Эмбрион дикого типа. А1-А8 - абдоминальные сегменты. А, Р - передний и задний полюса эмбриона соответственно, (II) Фенотип "Doubleline", с нарушенной D/V полярностью (зубчатые полоски в спинном отделе показаны стрелками), 22%. (III) Фенотип "Ghost", нарушение А/Р и D/V полярностей, 11%. (IV) Нарушение слияния трахей, 67 %. (В) Карта района lawdTr/2 по данным UCSC Genome Browser: места локализации «открытого» хроматина в регуляторной зоне и предположительные районы связывания ключевых факторов раннего развития (ТФ).

У многих эмбрионов не происходило слияния фрагментов трахей в единую сеть на финальных этапах её формирования, что приводило к нарушению целостности дыхательной системы. У других нарушалась сегментация: фенотип «двойная линия» («double line»), либо отсутствовали кутикулярные структуры тела: фенотип «призрак» («ghost»). Фенотип

»..чд IWnkiim" МИИПМ1И«И

.fitarl

Tub-Gal4>UAS-Ri

«призрак» представляет собой дезинтегрированную клеточную массу, которая возникает в результате нарушения дорсо-ветральной (D/V) и антерио-постериорной (А/Р) полярностей эмбриона.

Известны ключевые гены, определяющие полярность эмбриона. Мы предположили, что регуляторная зона lawdTrfl должна содержать сайты связывания белков этих генов. Анализ с использованием базы данных UCSC Genome Browser (Fujita P.A. et al., 2010) подтвердил наши предположения (Рис. 10В). Были обнаружены сайты связывания для Dorsal (D/V полярность), Hanchback и Caudal (А/Р полярность). Дополнительно были выявлены сайты связывания для белков Krüppel и Dichaete, которые также контролируют ранний эмбриогенез. На возможность связывания этих транскрипционных факторов с конкретными участками регуляторной зоны указывает совпадение их локализации с районами «открытого» хроматина, доступного для связывания с регуляторными факторами (рис. 10В).

Экспрессия транскриптов lawc и Trf2 у разных видов дрозофил

В ряде работ показано, что перекрывающиеся гены обладают малой эволюционной консервативностью между разными видами и подвергаются отрицательному отбору. Сравнительный анализ базы данных показал, что не у всех видов Drosophila присутствуют транскрипты, экспрессирующие гомологи белков Lawc и Trf2. Тем не менее, мы решили проверить, сохраняются ли перекрытия между транскриптами генного комплекса lawdTrfl у близкородственных видов дрозофил подгруппы melanogaster и эволюционно отдалённых видов дрозофил группы virilis и дрозофил вида D. funebris (рис. ПА).

Нозерн-блот гибридизация поли(А)+РНК, выделенной из эволюционно отдалённых видов дрозофил группы virilis: D. virilis, D. ezoana, D. borealis, D. texana и вида D. funebris группы funebris, с зондом рЗ.З из района перекрытия lawc/Tr/2 у D. melanogaster показала наличие полос гибридизации, характерных для транскриптов Trf2 и отсутствие полос гибридизации, характерных для перекрывающихся с ними транскриптов lawc (рис. 11Б). Таким образом, у эволюционно отдалённых видов перекрывание транскриптов в исследуемой зоне отсутствует. Размер транкриптов Trf2 у дрозофил исследуемых видов группы virilis и funebris гораздо меньше по сравнению с 7>/2-транскриптами дрозофил из подгруппы melanogaster.

Другой результат показала нозерн-блот гибридизация поли(А)+РНК, выделенной из близкородственных видов дрозофил подгруппы melanogaster-, D. erecta, D. yakuba и D. simulans, с зондом рЗ.З. Мы увидели наличие полос гибридизации, характерных, как для Trf2, так и для lawc. Таким образом, у эволюционно близких к D. melanogaster видов дрозофил экспрессия перекрывающихся транскриптов lawc и Trf2 сохраняется, хотя размеры некоторых транскриптов и их количество слегка варьирует (рис. 11Б).

В целом, анализируя полученные результаты, можно сделать два вывода. Во-первых, эволюция гена Trf2 и lawc шла в направлении увеличения размеров

транскриптов этих генов. Во-вторых, перекрытие в исследуемой зоне между генами 1сшс и Тг/2 эволюционно возникло как минимум на этапе формирования подгруппы melanogaster и сохраняется среди близкородственных видов дрозофил этой подгруппы.

Soptiophoru [

подгруппа melanogaster

Род

Drosnphila

£

пойгрушш nilUHuUll I

группа virilis

DrosophUu

подгруппа virilis

<'[)ушш (imehri^

D. símil tuns

, D. melanogaster ■ D. yakuba D. erecta

• D. ezoanna . IX borealis

D. texana , D. virilis . I), funebris

D.mel D.sim P er D.yak D. vir D.bor D.tex D.ezo D.fun

л

S ?

$

т.н. т.н.

4 0- ш «и» ш* -9.0

6.0- —6.0

> .А.Ч

4.0- i w -4.0

2.0- Hp ' -2.0

1.0- mm -1.0

0.5- Ш -0.5

Подгруппа melanogaster

Группа virilis Группа funebris

Рисунок 11. Анализ экспрессии транскриптов Iawc/Trf2 у различных видов дрозофил группы melanogaster. А. Упрощённая схема эволюционного дерева рода Drosophila. Б. Нозерн-блот гибридизация поли(А)+РНК, выделенной из разных видов дрозофил, с зондом рЗ.З из района перекрытия генов lawc и Trf2 у D. melanogaster. Обозначения: D.mel - D. melanogaster, D.sim - D. simulans, D. er - D. erecta, D.yak - D. yakuba, D. vir - D. virilis, D.bor — D. borealis, D. tex - D. texana, D. ezo - D. ezoanna, D.fun - D. funebris

Таким образом, однажды возникнув в ходе эволюционного процесса, район перекрытия генов 1<шс и 7>/2 сохраняет консерватизм и не подвергается отрицательному отбору.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ранее для Trf2 были описаны только четыре транскрипта с большим молекулярным весом, для lawc - три. В настоящей работе мы показали, что, как для Trf2, так и для lawc характерны короткие сплайс-варианты транскриптов, активно экспрессирующиеся на эмбриональной и куколочной стадиях развития. Мы обнаружили новый экзон в составе гена lawc и показали, что некоторые транскрипты имеют альтернативные сайты старта транскрипции. Ряд транскриптов этих генов не кодируют белки и являются полоспецифическими. Анализ базы UCSC Genome Browser показал, что регуляторная область Iawc/Trf2 насыщена сайтами связывания важных белковых факторов, контролирующих эмбриогенез, поэтому одна из вероятных функций некодирующих РНК генов lawc и Trf2 - обеспечение доступности хроматина для этих регуляторных факторов, путём привлечения хроматин-ремоделирующих комплексов. Регуляция экспрессии смыслового гена антисмысловыми длинными некодирующими РНК на уровне хроматина описана для гена человека CDKN2B (Yu et al., 2008), генов крысы Nefl и Vim (Tomikawa et al., 2011) и генов Evxl и Hoxb5/6 мыши (Dinger et al., 2008).

Продукт гена Trf2 является базовым транскрипционным фактором. Несмотря на это мутации гена Trf2 проявляют специфичный эффект, выраженный в гомеозисной трансформации аристы в элементы тарзуса у одних мутантов и стерильности самок у других. Это указывает на существование тканеспецифических регуляторных элементов в структуре гена lawc/Tr/2. В результате наших экспериментов показано наличие регуляторного района специфически функционирующего у самок. В дальнейших экспериментах необходимо установить точные границы этого района.

Нами впервые показано наличие зоны перекрытия между разнонаправленными транскриптами lawc и Trf2. Наличие такой зоны позволяет предположить регуляцию экспрессии этих генов на уровне взаимодействия их РНК. Дуплекс между разнонаправленными транскриптами может являться субстратом, как для белков пути РНК-интерференции, так и для аденозиндеаминазы (ADAR), или влиять на сплайсинг пре-РНК обоих генов. Образование РНК-дуплекса возможно при коэспрессии перекрывающихся генов в одной клетке. Мы показали, что в культуре клеток перекрывающиеся транскрипты Iawc/Trf2 экспрессируются одновременно. Перекрывающийся паттерн экспрессии разнонаправленных транскриптов, полученный при гибридизации in situ на целых эмбрионах, также указывает на коэкспрессию этих генов. Однако в раннем эмбриогенезе, на стадии клеточной бластодермы, экспрессии этих генов не совпадают. Такой паттерн экспрессии характерен для регуляции транскрипции перекрывающихся генов по модели транскрипционной интерференции, или транскрипционного столкновения.

Большинство исследований по изучению регуляции перекрывающихся генов проводятся in silico с использованием анализа баз данных или ex vivo на культуре клеток. Наличие системы перекрывающихся транскриптов lawdTrfl позволило нам поставить эксперименты по влиянию подавления обратных

транскриптов на экспрессию прямых в условиях in vitro и in vivo. Результаты этих экспериментов показали увеличение экспрессии гена lawc в ответ на введение инактивирующих конструкций и дцРНК, содержащих последовательности транслируемой области гена. Таким образом, мы обнаружили, что подавление экспрессии в живом организме с использованием РНК-интерференции не всегда приводит к снижению уровня мРНК целевого гена, но может и вызвать его повышение. Результат нашего эксперимента противоречит общепринятым представлениям о РНК-интерференции, как о механизме, с помощью которого можно осуществлять избирательное подавление синтеза белков через деградацию информационной РНК.

Почему же попытка снизить экспрессию всех /awc-транскриптов привела к обратному результату? Возможно, что сначала индукция РНК-интерференции in vitro или in vivo вызывает снижение уровня белка Lawc. И это, вероятно, приводит к включению специфических компенсаторных механизмов, увеличивающих экспрессию мРНК гена lawc. Мы считаем, что такая суперактивация транскрипции lawc должна была бы помешать нормальной работе РНК-полимеразы, синтезирующей мРНК перекрывающегося с ним и идущего в обратном направлении гена Trf2, то есть привести к транскрипционной интерференции. Этот механизм, исходно открытый у дрожжей играет, как считается, немалую роль в регуляции экспрессии генов. В пользу подобного сценария при РНК-интерференции гена lawc говорит ещё один наш эксперимент, в котором мы снижали экспрессию только одного его транскрипта - /¿rwc-isoform С (рис. 1, конструкция UAS-Rif). В этом случае драматического результата с массовой гибелью дрозофил не наблюдалось, вероятно, оттого, что экспрессия оставшихся транскриптов обеспечивала необходимый уровень белка LAWC. В результате интенсивность транскрипции lawc повышалась незначительно, что не мешало работе гена Trf2. Наблюдаемое снижение экспрессии гена Trf2 в ответ на активацию транскрипции гена lawc позволяет предположить модулирующую роль lawc в регуляции транскрипции гена Trf2. Такое взаимодействие могло сложиться в ходе эволюционного процесса при формировании подгруппы melanogaster, поскольку у эволюционно более древних видов дрозофил (группа virilis, funebris) гены lawc и Trf2 не имеют перекрытия в изучаемом районе, хотя этот район и входит в состав 7У/2-транскриптов, что говорит о его функциональной значимости. Сохранение же района перекрытия в геноме исследуемых дрозофил близкородственных видов подгруппы melanogaster, очевидно говорит об эволюционной значимости данного района, возможно, приспособленного для тонкой регуляции транскрипционного процесса, и не подвергающегося отрицательному эволюционному отбору у этих видов.

выводы

1) мРНК гена lawc транскрибируется с восьми альтернативных промоторов и имеет девять сплайс-вариантов: 3 транскрипта кодируют белки, 6 транскриптов являются некодирующими.

2) В районе lawclTrß транскрибируется кластер разнонаправленных транскриптов, часть из которых перекрывается. Выявлены новые полоспецифические транскрипты генов lawc и Trf2.

3) В культуре клеток Schneider 2 и во время эмбриогенеза наблюдается коэкспрессия разнонаправленных перекрывающихся транскриптов lawc/Trß. В раннем эмбриогенезе экспрессия прямых и обратных перекрывающихся транскриптов lawc/Trß пространственно не совпадает.

4) Регуляторная зона lawc/Trß содержит участок, специфически контролирующий экспрессию Trß в оогенезе.

5) Попытка подавления белок-кодирующих транскриптов гена lawc по пути РНК-интерференции, как in vitro, так и in vivo, вызывает активацию экспрессии его мРНК.

6) Показано модулирующее влияние транскрипционной активности гена lawc на экспрессию Trß.

7) Зона перекрытия экзонов генов lawc и Trß обладает эволюционным консерватизмом, сохраняясь у видов дрозофил подгруппы melanogaster (D. melanogaster D. simulons, D. erecta, D. yakuba).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК

1. Воронцова Ю.Е., Черезов P.O., Зацепина О.Г., Слезингер М.С., Кузин Б.А., Симонова О. Б. Модуляция экспрессии генов - эволюционный резерв адаптационных изменений морфогенеза конечностей насекомых // Известия РАН. Сер. Биол. 2012. № 2. С. 228-236.

2. Симонова О.Б., Модестова Е.А., Воронцова Ю.Е., Черезов P.O. Выявление геномных районов, влияющих на экспрессию lawc/Trß в процессе развития D. melanogaster // Онтогенез. 2012. Т.43. № 5. С. 366-384.

3. Черезов P.O., Воронцова Ю.Е., Мерцалов И.Б, Куликова Д. А., Симонова О.Б. Влияние РНК-шпильки, специфичной к гену lawc, на экспрессию перекрывающихся генов комплекса lOawc/Trfl у D. melanogaster // Известия РАН. Сер. Биол. 2013. № 2. С. 133-137.

4. Воронцова Ю.Е., Черезов P.O., Симонова О.Б. Влияние мутаций гена Iawc/Trf2 на формирование хромоцентра и расхождение хромосом у Drosophila melanogaster //Генетика. 2013. Т. 49. № 5. С. 1-12.

Электронный ресурс

5. Tcherezov R.O., Simonova О.В. Drosophila melanogaster leg arista wing complex (,lawc) mRNA, 3'UTR// GenBank: JX546150. Submitted (28-AUG-2012). Режим доступа: http://wvvw.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JX546150.

Заказ № 19-Р/11/2013 Подписано в печать 11.11.13 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 VV 'jyy www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черезов, Роман Олегович, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ ИМ Н.К. КОЛЬЦОВА РАН

На правах рукописи

04201451636

Черезов Роман Олегович

ХАРАКТЕРИСТИКА РЕГУЛЯТОРНОЙ ЗОНЫ ПЕРЕКРЫВАЮЩИХСЯ ГЕНОВ 1ан>с И Тг/2 У Б г о^орИНа те1апо^ан1ег

03.02.07 - генетика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук О.Б. Симонова

Москва - 2013

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................11

1.1. Перекрывающиеся гены и антисмысловая транскрипция...........................11

1.1.1. История открытия регуляторных антисмысловых РНК..............................12

1.1.2. Типы перекрывания транскриптов.................................................................14

1.1.3. Реальны ли взаимодействия в САС-паре.......................................................16

1.1.4. Биологическая значимость перекрывающихся транскриптов....................17

1.1.5. Сложность строения организма и количество перекрывающихся транскриптов...............................................................................................................19

1.1.6. Предположения о возникновении и эволюции перекрывающихся генов и их транскриптов.........................................................................................................20

1.2. Модели и механизмы регуляции перекрывающихся генов и их транскриптов................................................................................................................21

1.2.1. Механизмы, связанные с процессом транскрипции..................................22

1.2.1.1. Транскрипционная интерференция.............................................................23

1.2.1.2. Внутригенные перестройки.........................................................................24

1.2.1.3. Конкуренция за взаимодействие с транскрипционными факторами......25

1.2.2. РНК-ДНК взаимодействия...........................................................................26

1.2.2.1. Изменения ДНК и хроматина......................................................................27

1.2.2.2. Изменения хроматина активных промоторов............................................28

1.2.2.3. Геномный импринтинг.................................................................................30

1.2.2.4. Инактивация Х-хромосомы.........................................................................30

1.2.3. РНК-РНК взаимодействия в ядре................................................................31

1.2.3.1. Альтернативынй сплайсинг и терминация.................................................31

1.2.3.2. Ядерно-цитоплазматический транспорт и удержание в ядре смысловой РНК..............................................................................................................................32

1.2.3.3. РНК-редактирование....................................................................................32

1.2.4. Формирование РНК-дуплекса в цитоплазме.................................................34

1.2.4.1. Влияние на стабильность мРНК и трансляцию.........................................34

1.2.4.2. Маскирование сайтов связывания микро-РНК..........................................35

1.2.4.3. Формирование эндогенных малых интерференционных РНК (siPHK).. 36

1.3. Характеристика гена leg-arista-wing complex....................................................38

1.4. Фактор базовой транскрипции TRF2.................................................................40

1.5. Проблемы, связанные с исследованием антисмысловой транскрипции........44

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................47

2.1. Культивирование клеток S2...............................................................................47

2.2. Генетические методы..........................................................................................47

2.2.1. Хромосомное картирование трансгенных конструкций..............................49

2.2.2. Выведение линий мух, гомозиготных по трансгенной конструкции.........51

2.2.3. Подавление экспрессии транскриптов гена lawc..........................................51

2.3.Микроскопия и фотографирование....................................................................53

2.3.1 Приготовление препаратов кутикулы летальных эмбрионов......................53

2.4. Биохимические методы.......................................................................................55

2.4.1.Выделение ДНК дрозофилы............................................................................55

2.4.2. Метод амплификации фрагментов ДНК с помощью...................................56

полимеразной цепной реакции (ПЦР).....................................................................56

2.4.3. Трансформация бактериальных штаммов плазмидной ДНК......................57

2.4.4. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса..........................57

2.4.5. Горизонтальный агарозный гель электорофорез..........................................59

2.4.6. Выделение фрагментов ДНК из геля..............................................................60

2.4.7. Определение концентрации ДНК...................................................................60

2.4.8. Лигирование фрагментов в плазмидную ДНК.............................................60

2.4.9. Рестрикция плазмидной ДНК.........................................................................61

2.4.10. Выделение РНК из дрозофил и клеток 82...................................................61

2.4.11. Выделение поли(А)+РНК..............................................................................62

2.4.12. Получение кДНК............................................................................................63

2.4.13. Метод ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ)................................................63

2.4.14. Быстрая амплификация 5' и 3' концевых фрагментов кДНК (5', З'-КАСЕ) ......................................................................................................................................64

2.4.15. Нозерн-блот анализ поли(А)+РНК...............................................................65

2.4.16. Синтез зондов меченых 32Р...........................................................................68

2.4.17. Олигонуклеотиды, использованные в данной работе................................68

2.4.18. Гибридизация in situ на целых эмбрионах..................................................69

2.4.19. Сбор и фиксация эмбрионов.........................................................................70

2.4.20. РНК-интерференция в культуре клеток S2.................................................70

2.4.21. Секвенирование..............................................................................................71

2.5. Получение трансгенных конструкций..............................................................71

2.5.1. Основные векторы, используемые в работе..................................................71

2.5.2. Создание конструкций.....................................................................................72

2.6. Приготовление плазмид для инъекции..........................................................73

2.6.1. Очистка плазмидной ДНК для инъекции....................................................73

2.6.2. Сбор и приготовление эмбрионов для инъекции.......................................74

2.6.3. Микроинъекция эмбрионов..........................................................................74

2.7. Получение трансгенных линий D. melanogaster...............................................75

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..........................................................76

3.1. Экспрессия прямых и обратных транскриптов комплекса Iawc/Trf2.............76

3.2. Характеристика транскриптов гена lawc..........................................................77

3.3. Экспрессия генов lawc и Trf2 на разных стадиях развития D. melanogaster и в культуре клеток S2..................................................................................................79

3.4. Анализ экспрессии транскриптов lawc и Trf2 в мутантных линиях..............81

3.5. Исследование регуляторного влияния lawc на экспрессию Trf2...................86

3.6. Анализ экспрессии транскриптов lawc и Trf2 у разных видов дрозофил.....90

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................................93

ВЫВОДЫ.....................................................................................................................96

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ............................................................. 97

Приложение 1............................................................................................................121

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изучение регуляции экспрессии генов является одной из актуальных проблем современной генетики. Важную роль в регуляции экспрессии генов играют их регуляторные зоны, которые наряду с наличием в них сайтов связывания регуляторных белков могут являться источником разных типов регуляторных РНК. В настоящее время показано, что значительная часть генома эукариотических организмов способна транскрибироваться в двух направлениях (смысловом и антисмысловом), то есть многие гены эукариот перекрываются. Так, у Drosoph.Ua melanogaster перекрывается 26.2 % кодирующих белки генов. Такое строение генома приводит к появлению общих для разных генов регуляторных зон и возникновению перекрывающихся РНК, как кодирующих, так и не кодирующих белки. В свою очередь, перекрывающиеся регуляторные элементы, и, главным образом, перекрывающиеся транскрипты, представляют собой дополнительный способ регуляции экспрессии генов. Эволюционная и биологическая значимость этого явления не совсем ясна. Большинство найденных перекрытий возникает между генами, транскрибируемыми с противоположных цепей одного и того же локуса. Часто в перекрытие вовлекается не кодирующий белок транскрипт. Накапливаются данные, что антисмысловые транскрипты участвуют во множестве клеточных процессов, таких как геномный импринтинг, инактивация Х-хромосомы, альтернативный сплайсинг, сайленсинг генов и метилирование, трансляция. Наличие перекрывающихся транскриптов и их регуляторная роль показаны для ряда генов у разных организмов, среди которых гены, вовлечённые в онкогенез и развитие других патологий. Существуют разные модели механизмов регуляции смысловой мРНК антисмысловым транскриптом. Одной из них является модель транскрипционной интерференции (ТИ) (или транскрипционного столкновения). Согласно этой модели, процесс транскрипции одного гена подавляет транскрипцию перекрывающегося с ним другого гена. Большинство исследований перекрывающихся генов и антисмысловой

транскрипции проводится in vitro или in silico и остро нуждаются в подтверждении результатов in vivo.

Ранее в нашей лаборатории была открыта мутация D. melanogaster, нарушающая правильную экспрессию многих нейрогенов и транскрипционных факторов, контролирующих развитие организма. По данным GenBank район локализации мутации содержал два гена leg-arista-wing complex и TBP-related factor 2 (lawc/Trß), предположительно имеющих общую 5'-регуляторную зону. Транскрипты, синтезирующиеся с данного локуса, представляли собой набор разнонаправленных мРНК, количество и структура которых неизвестны. По нашим предварительным данным по крайне мере один из транскриптов гена lawc должен перекрываться с транскриптами гена Trß. Мы предположили, что гены lawc и Trß взаимодействуют, а зона перекрытия и разнонаправленные транскрипты могут участвовать в координировании экспрессии обоих генов. Исследование 5'-регуляторной области генов lawc и Trf2 важно не только для понимания механизмов контроля экспрессии данного локуса, но и для получения знаний о способах и механизмах регуляции экспрессии перекрывающихся генов у эукариот. Описание 5'-регуляторной зоны lawc/Trß позволит в дальнейшем использовать данный локус в качестве модели для исследования взаимодействия перекрывающихся генов in vivo.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в исследовании регуляторной 5'-зоны перекрывающихся генов leg-arista-wing complex и TBP-related factor 2 у Drosophila melanogaster.

В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1) установить экзон-интронную структуру гена lawc;

2) исследовать экспрессию мРНК перекрывающихся генов lawc и Trß на разных стадиях развития D. melanogaster и в культуре клеток Schneider 2;

3) провести сравнительный анализ экспрессии перекрывающихся генов lawc и Trß у мутантов с различными нарушениями регуляторных областей;

4) исследовать эффект подавления экспрессии /а>уотранскриптов на уровень экспрессии перекрывающихся с ними противоположно направленных транскриптов Trf2 in vitro в культуре клеток Schneider 2 и in vivo;

5) исследовать паттерн экспрессии перекрывающихся генов lawc и Trf2 у разных видов дрозофил.

Научная новизна и практическая значимость работы. Обнаружено, что часть

регуляторной области локуса lawc/Trß входит в состав нескольких

разнонаправленных транскриптов и является общей для двух генов. Открыт

новый экзон и установлены реальные точки старта транскрипции известных ранее

сплайс-вариантов мРНК гена lawc. Изолировано шесть новых сплайс-вариантов

мРНК гена lawc; нуклеотидная последовательность одного из них внесена в базу

данных Genbank под номером JX546150. Впервые показано наличие у гена Тг/2 не

описанных ранее коротких транскриптов длиной 1,1 т.н. и 3,1 т.н.,

формирующихся в 5'-регуляторной зоне. Впервые выявлены новые

полоспецифические (специфичные только для самок или самцов) транскрипты

обоих генов. Выявлены возможные регуляторные зоны, ответственные за

тканеспецифическую регуляцию экспрессии генного комплекса в репродуктивной

системе самок. Показано, что экспрессия прямых и обратных перекрывающихся

транскриптов lawdTrfl в раннем эмбриогенезе пространственно не совпадает, что

предполагает регуляцию экспрессии этих генов по механизму транскрипционной

интерференции на данном этапе развития. Впервые охарактеризована природа

мутантных аллелей исследуемого района. В экспериментах in vivo и in vitro по

избирательному посттранскрипционному подавлению экспрессии гена lawc

показана зависимость уровня экспрессии гена Trf2 от транскрипционной

активности гена lawc. Обнаружен активирующий эффект РНК-интерференции на

экспрессию одного из двух перекрывающихся генов (увеличение экспрессии

вместо подавления), что очень важно учитывать на практике, поскольку в

литературе всё больше уделяется внимание проблеме лечения ряда генетических

заболеваний (включая рак) с помощью генотерапии на основе РНК-

интерференционного подавления экспрессии «испорченного» гена. Показана

9

эволюционная консервативность района перекрытия генов 1ам>с и Тг/2 для близкородственных видов дрозофил подгруппы melanogaster.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Перекрывающиеся гены и антисмысловая транскрипция

Широкомасштабное исследование геномов различных эукариотических организмов показало, что суммарное число генов, кодирующих белки, не объясняет сложность строения организмов на молекулярном и клеточном уровнях. Что же делает человека отличным от круглого червя C.elegans, у которого -19000 кодирующих белок генов, растения A. thaliana (-270000 кодирующих белок генов) и плодовой мушки D. melanogaster (-13500 кодирующих белок генов)? Можно, конечно, ответить, что у высших организмов более высокий уровнь альтернативного сплайсинга пре-мРНК и разнообразнее посттрансляционные модификации белков. Однако большинство ученых сейчас полагают, что ключевую роль здесь играют не только кодирующие белки гены и их мРНК-транскрипты, но и некодирующие РНК, которые составляют более 90% от всего транскриптома человека, управляемого сложной сетью функциональных, структурных и регуляторных элементов. Интересно, что значительная фракция транскриптома РНК содержит последовательности, комплементарные другим эндогенным РНК. Такие естественные антисмысловые транскрипты (EAT) могут кодировать белки, но чаще всего представляют собой некодирующие РНК. Число исследований, направленных на оценку количества и разнообразия EAT быстро возрастает, но, к сожалению, экспериментов, направленных на выяснение конкретной функции и физиологической значимости этих транскриптов пока недостаточно. Тем не менее, уже известно, что EAT влияют на регуляцию импринтинга, инактивации Х-хромосомы, процессинга РНК, экспорта РНК и транскрипции генов.

1.1.1. История открытия регуляторных антисмысловых РНК

В своей классической работе Жакоб и Моно (Jacob and Monod, 1961) предположили, что РНК, также как и белки, могут напрямую регулировать экспрессию отдельных генов. Эти и похожие предположения были подтверждены через несколько лет в 1981 году при открытии регуляции с участием эндогенной антисмысловой РНК (Spiegelman et al., 1972; Davidson et al., 1979). Отмечалось, что регуляторная РНК образует дуплекс с функциональным транскриптом гена, а не самим геном. Впервые естественные антисмысловые транскрипты были обнаружены при исследовании вирусов. В 1969 году К. Bovre с соавторами обнаружил, что центральный регион Ь2 в геноме фага лямбда может продуцировать две противоположно направленные перекрывающиеся мРНК, одна из которых траснкрибируется в прямом направлении (+ цепь), а другая в обратном (- цепь) (Bovre and Szybalski, 1969). В дальнейшем, похожие явления были описаны у прокариот (Wek and Hatfield, 1986) и эукариот (Wong et al., 1987). Первыми тщательно исследованными антисмысловыми РНК были те, которые регулировали репликацию бактериальных плазмид. Вскоре были идентифицированы другие антисмысловые РНК, контролирующие экспрессию бактериальных мРНК (Storz et al., 2005; Eguchi et al., 1991, Itoh et al., 1980; Lacatena and Cesareni, 1981; Wagner and Simons, 1994). Дальнейшие исследования были сосредоточены на поиске возможных антисмысловых РНК у различных эукариотических организмов. Впоследствии возникло детальное понимание механизма антисенс-опосредованной регуляции генов у бактерий (Storz et al., 2005; Wagner et al., 2002), но регуляторное действие эндогенных антисмысловых РНК у эукариот за некоторым исключением в целом оставалось неясным (Vanhee-Brossollet and Vaquero, 1998; Kumar and Carmichael, 1998; Lavorgna et al., 2004; Werner and Berdal, 2005; Munroe, 2004; Reis et al., 2005). Несмотря на широкое использование антисмысловых РНК (и ДНК) для подавления экспрессии определенных генов, молекулярные механизмы функционирования

антисенсмысловой РНК у эукариот до конца не изучены (Scherer and Rossi, 2003; Crooke, 2000).

Важным примером антисмысловой регуляции генов у эукариот являются микроРНК. В 1993 году в лаборатории В. Амброса и G. Ruvkun сообщили об открытии необычных малых РНК, ассоциированных с геном lin-4 у нематоды С. elegans. Продукт гена lin-4 имел в длину всего 21 нуклеотид. Было показано, что этот транскрипт подавляет трансляцию целевой мРНК, формируя дуплекс с комплементарной последовательностью в З'-нетранслир