Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль гена Leg-arista-wing complex в процессе базовой и специфической транскрипции и формировании гонад у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль гена Leg-arista-wing complex в процессе базовой и специфической транскрипции и формировании гонад у Drosophila melanogaster"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА

На правах рукописи УДК 577.218 : 595.773.4 ВОРОНЦОВА ЮЛИЯ ЕВГЕНЬЕВНА

РОЛЬ ГЕНА LEG-ARISTA-WING COMPLEX В ПРОЦЕССЕ БАЗОВОЙ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И ФОРМИРОВАНИИ ГОНАД У DROSOPHILA MELANOGASTER

Специальность: 03.00.26 - молекулярная генетика 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□ ОЗ 177331

Москва, 2007

003177331

Работа выполнена в лаборатории нейрогенетики и генетики развития Института биологии гена РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

О.Б. Симонова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Б. А. Кузин

кандидат биологических наук

А.К. Головнин

Ведущая организация:

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится «19» декабря 2007 года в « » часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан «19» ноября 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат фарм. наук

Г'рабовская

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Проблема получения и исследования мутаций генов, кодирующих зволюционно консервативные факторы транскрипции, не теряет своей актуальности Особенно ценны гипоморфные мутации, позволяющие исследовать функции гена in vivo В генах, кодирующих ключевые процессы, обеспечивающие жизнедеятельность организма, такие мутации получить не просто Например, не хватает мутаций многих генов, кодирующих факторы транскрипции, что заставляет молекулярных генетиков прибегать к методам исследования при помощи РНК-интерференции Однако это не всегда удобно, например, при поиске генов, участвующих в одних и тех же процессах

Жизнеспособные мутации транс-регуляторного гена lawc дрозофилы нарушают правильную экспрессию многих локусов (Симонова О Б и др, 1992) Анализ компьютерной базы данных, содержащей сиквенс генома дрозофилы, показал, что часть последовательности гена lawc лежит на расстоянии примерно 15 т п н от открытой рамки считывания гена ТВР related factor 2 (t>f2), который участвует в процессах базовой транскрипции и принадлежит эволюционно консервативному семейству генов ТВР До последнего времени границы локализации гена trfl у дрозофилы не были до конца установлены В первую очередь эти трудности были обусловлены отсутствием достаточного набора удобных мутаций в области гена trfi Открытие видимой инсерционной мутации lawc1'1 сыграло важную роль в установлении границ этого гена, в частности, района начала его транскрипции (Копытова Д В и др , 2005)

Район локализации гена lawc (7Е район цитологической карты Х-хромосомы дрозофилы) содержит блок нескольких летальных мутаций Поэтому стало актуально исследовать влияние этих мутаций на экспрессию гена ttJ2

Некоторые мутации гена leg-aiista-wing complex {lawc) вызывают стерильность самок, другие аллели приводят к раннему старению организма В настоящее время старение

предположительно связывают с нарушением самовоспроизведения стволовых клеток в репродуктивной системе Поэтому изучение генетической регуляции этих процессов предполагает исследование стерильных и слабофертильных мутантов на хорошо изученных модельных организмах

Цель и задачи исследования

Основная цель работы состояла в изучение роли гена leg-arista-wmg complex в процессе базовой и специфической транскрипции и формировании гонад у дрозофилы

В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи

1) проведение серии генетических экспериментов по исследованию влияния трансгенных конструкций, экспрессирующих различные белковые домены гена trf2, на фенотип летальных мутаций, локализованных в районе lawc-trf2,

2) определение молекулярной природы летальной мутации l(l)EF520,

3) установление экзон-интронной структуры части гена lawc путем совмещения геномной последовательности с последовательностью клона кДНК, полученного ранее в лаборатории,

4) цитологический анализ ядра ооцита поздних и ранних стадий развития в поисках причин нерасхождения хромосом в мейозе у мутантов по гену lawc,

5) анализ распределения ооцитспецифичного белка и белков цитоскелетного мат-рикса с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания репродуктивной системы стерильных самок lawc,

6) исследование материнского эффекта летальных аллелей гена lawc с помощью клонального анализа и флуоресцентного окрашивания

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые было показано, что мутации гена lawe нарушают экспрессию гена Irfl Обнаружено, что причиной нерасхождения в мейозе у мутантов по гену lawe явилось нарушение структуры хромоцентра и спаривания гомологичных хромосом ооцита ранних стадий развития Выявлена и молекулярно исследована единственная мутация, затрагивающая нуклеотидную последовательность, кодирующую белковый продукт гена trf2 Впервые показано, что 5 -регуляторная область гена trf2 перекрывается с транскриптом lawe, имеющим противоположное направление транскрипции Не исключено, что перекрывающиеся 5 -регуляторными районами разнонаправленные транскрипты отражают новый способ регуляции экспрессии этих генов, что требует дальнейшего анализа Впервые показано, что ген lawe участвует в формировании клеточного цитоскелета и связанного с ним транспорта ооцитспсцифичного белка Orb Установлено, что стерильность мутантов по гену lawe вызвана нарушением механизма дифференцировки терминальных и соматических фолликулярных клеток Обнаружено, что у мутантов с сокращенной продолжительностью жизни отсутствует самовоспроизведение терминальных стволовых клеток

Полученные данные являются основой для дальнейшего изучения функции гена lawe, а также помогут решить ряд спорных вопросов, касающихся взаимосвязей сигнальных путей в оогенезе у дрозофилы Учитывая наличие гомологичных генов у позвоночных, включая млекопитающих и человека, можно предположить, что соответствующие данные будут иметь универсальное значение

Апробация работы

Результаты работы докладывались на XIV школе биологии развития (Звенигород, 2005), VI международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2005), международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва,

2006), международном семинаре «Генетика репродукции насекомых и ее практическое применение» (Москва, 2006), на всероссийской медико-биологической научной конференции молодых ученых «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007), международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007) и на 46-й и 47-й Ежегодных исследовательских конференциях по дрозофиле (Сан-Диего, 2005, Хьюстон, 2006)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ (2 статьи и 7 тезисов) Структура диссертации

Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, заключения и списка цитируемой литературы ( ^О источников) Содержит рисунков и /^таблиц

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Восстановление жизнеспособности легальных мутаций в гене /икс (гезсие-анали з)

Открытие видимой инсерционной мутации ¡стс1'', расположенной вблизи открытой рамки считывания гена сыграло важную роль в установлении границ этого гена, в частности, района начала его транскрипции (5'область). Однако вопрос, нарушают ли мутации гена /с/и'с экспрессию гена !г{2, оставался открытым. Чтобы ответить на этот вопрос, мы поставили серию генетических экспериментов по исследованию влияния трансгенных конструкций, экспрессирующих различные белковые домены гена гг/2, на фенотип летальных мутаций, локализованных в районе \awc-trfi.. Предварительно в лаборатории С.Г. Георгиевой (ИБГ РАН) были созданы три генетические конструкции, кодирующие фрагменты аминокислотной последовательности гена и~]2, и получены трансгенные по этим конструкциям линии дрозофил. Для изучения были взяты 12 новых музейных линий (коллекционный центр линий дрозофилы, Блумингтон, США), содержащих летальные мутации предположительно в районе \awc-lrf2, и 31 линия, полученная в лаборатории нейроге-нетики и генетики развития ИБГ РАМ.

Для того чтобы подтвердить принадлежность музейных леталей гену 1а\ус, проводили тест на аллелизм. В таблице 1 представлены результаты теста на аллелизм. Мы показали, что 11 музейных летальных мутаций частично комплементируют с аллелем /сж-с , проявляя слабый /яи'С-фенотип - характерные вырезки крыловой пластинки (рис. 1).

Рисунок 1. Крыловая пластинка мух дикого типа и гетерозиготных самок 1(1)/!ат(/яи'с).

Таблица 1 Результаты теста на аллелизм и rescue-анализа с учетом частоты нерасхождения по Х-хромосоме

Леталь (№ пиши) Тест на аллелизм lawc, %* Rescue-анализ Q, %***

TRF2-I, %** lawcl, %** lawc2, %**

l(l)G0425 (12254) 49,2 84 4 0 66,7 2,7

l(I)G0039 (11546) 15,8 102,8 0 113,5 15,7

l(l)G0356 (11982) 32,0 72,9 0 136 0 18,2

l(l)G0332 (11927) 42,5 100,0 0 44,2 16,6

1(1)G0166( 11945) 60 0 140,0 0 15,2 30,7

l(l)G0372 (12295) 58,3 31,3 0 13,3 1,1

I(I)G0I78 ( \ 1868) 6,5 13,6 0 13,2 8,5

KDG0203 (11866) 74,2 84,0 0 15,2 0,4

l(I)GOI52 ( 11940) 61,7 26,9 0 21,4 8,8

l(I)G0376 (12250) 68,9 52,2 0 40,9 4,2

l(l)G007I (1 1739) 20,8 32,1 50 100,0 3,6

1(1)G0424 (12020) 5,4 0 0 0 8,8

* Частота проявления фенотипа «1апс» рассчитывалась как отношение «1ашс» самок к общему числу анализируемых ¡(¡)/1ансР' самок

** Частота выживаемости летальных самцов рассчитывалась как отношение количества выживших самцов с летальной хромосомой 1(1)/У, [конструкт]/+ к количеству самцов альтернативного класса с балансерной хромосомой balancer/Y, [конструкт]/+ *** Частота нерасхождения Х-хромосомы рассчитывалась по формуле

Q = 100% 2(XO+XXY)/(XX+2XY+2XO+2XXY), где Х0 и XXY - количество особей аномальных классов, XX и XY - количество особей нормальных классов В таблице приведено среднее значение Q по результатам скрещиваний с тремя конструкциями

Убедившись в принадлежности музейных летальных мутаций к гену lawc, мы проанализировали восстановление выживаемости летальных самцов (rescue-анализ) при введении в их геном конструкций, конститутивно экспрессирующих разные домены гена trf2 Конструкт [TRF2-I] содержит область, гомологичную ДНК-связывающему домену гена ТВР, конструкт [lawcl] кодирует уникальную область, прилежащую к гену trfl со стороны 5 района, конструкт [lawc2] кодирует область, принадлежащую обоим конструктам [TRF2-1] и [lawcl] (рис 2)

Из таблицы 1 видно, что конструкт [TRF2-1] восстанавливает выживаемость самцов почти всех линий, за исключением № 12020 В отличие от него конструкт [lawcl] восстанавливает выживаемость летальных самцов всего одной линии (№> 11739), а конструкт [lawc2] так же, как и [TRF2-1], восстанавливает выживаемость самцов почти всех линий, за исключением №12020 Так как оба конструкта [TRF2-1] и [lawc2] имели область, коли-

рующую домен, гомологичный ДНК-связывающему домену гена ТВР, то можно предположить, что дополнительная экспрессия именно этого района и обеспечивает восстановление выживаемости.

Та деталь (№12020), которая «не спасается» введением конструктов, очевидно, нарушает функции гена, отличные от тех, за которые отвечают последовательности, входящие в конструкты, либо экспрессии данных конструктов не достаточно для восстановления её жизнеспособности. Мы не можем отвергнуть возможность и того, что летальность в линии 12020 вызвана суперэкспрессией белка ТКР2, поэтому мы всё-таки решили использовать эту линию в дальнейших экспериментах.

11940,12250

11546, 11982. 12254

Л

2 т.п.н.

[1ауге1]__ [таГ2-1]_

Рисунок 2. Молекулярно-структурная организация района 1акс-и[2 и карта локализации летальных мутаций гена 1аюс. Кодирующая область гена ¡г[2 выделена черными прямоугольниками, некодирующая область - белыми. Треугольниками показаны инсерции Р-элемента. Двойные стрелки - инсерция двойной копии Р-элемента у мутантов .

[1а\¥с1], [1алус2], [ТКР2-1] - области, кодируемые соответствующими конструкциями. Цифры возле различных перестроек соответствуют номерам мутантных линий.

Жизнеспособность гемизиготных самцов линии №11739 восстанавливалась независимо от типа конструкта Очевидно, летальность в этой линии не связана с X-хромосомой, что было подтверждено контрольным скрещиванием

Таким образом, мы показали, что подавляющее большинство летальных мутаций гена lawe восстанавливают жизнеспособность на фоне конститутивной экспрессии конструктов, содержащих область, гомологичную ДНК-связывающему домену ТВР

В ходе генетических экспериментов нами были замечены особи аномальных классов, вызванных неправильным расхождением половых хромосом родительских самок Это самки XX/Y и самцы Х/О Мы рассчитали частоту нерасхождения Q для каждой линии (таблица 1) Так как в исследуемых линиях летальная хромосома поддерживается на хромосоме-балансере (FM), мы поставили контрольный эксперимент, чтобы выявить влияние хромосомы-балансера (FM) на частоту нерасхождения Х-хромосомы и сравнить ее с частотой нерасхождения Q, рассчитанной для наших линий Было проанализировано почти 2500 особей Частота нерасхождения Х-хромосомы в контрольном эксперименте составляла примерно 1,4 % В музейных линиях частота нерасхождения достигала 30,7%, те примерно в 20 раз превышала контрольную.

Ранее в лаборатории нейрогенетики и генетики развития (ИБГ РАН) были получены летальные мутации в районе гена lawe и установлена их принадлежность к исследуемому гену (Модестова Е А , 2005) Мы проанализировали у 31 такой линии восстановление выживаемости летальных самцов тем же методом, что и при исследовании музейных деталей Наибольшее число линий (6 деталей) восстанавливают жизнеспособность на фоне экспрессии конструкта [lawc2] Кроме того, в потомстве от самок лабораторных линий также наблюдалось возникновение особей аномальных классов Частота нерасхождения Х-хромосомы у самок достигала 13,4%

Цитологический анализ ядра оодита поздних и ранних стадий развития.

В поисках причин нерасхождения хромосом мы провели цитологический анализ ядра ооцита поздних и ранних стадий развития. Для этого были приготовлены давленые препараты яичников самок дикого типа и мутантных особей линии ок-

рашенные реактивом Шиффа по методу Пуро и Ноккала.

На поздних стадиях развития (ранняя анафаза I) в норме хромосомы ооцита собраны в кариосому с компактной структурой, а четвертые хромосомы ориентированы к разным полюсам деления (рис. 3 А).

Рисунок 3. Хромосомы ооцита на поздних и ранних стадиях развития. А хромосомы самки дикого типа на стадии ранней анафазы I мейоза; стрелками обозначены четвертые хромосомы. Б, В - нарушения расхождения хромосом в анафазе I мейоза у мутантов 1ст>ср'/1(1)ЕЕ520. Стрелкой показан хроматиновый мост между ядрами; цифрами обозначены гомологичные хромосомы. Г - хромосомы самки дикого типа на стадии профазы I мейоза, Д - хромосомы ооцита на стадии профазы I мейоза у мутантов 1акср1/1(1)ЕЕ520. Стрелками (-►) показан хромоцентр, дугой обозначено нарушение компактизации хромосом. Масштаб 10 мкм.

У мутантов по гену 1смс наблюдалось возникновение хроматинового моста при расхождении хромосом в анафазе I (рис. 3 В), возникшего, возможно, в результате аномального кроссинговера, и расщепление кариосомы (рис. 3 Б).

Расщепление кариосомы предполагает нарушение компактизации хроматина в

прицентромерных районах. Поэтому мы рассмотрели структуру хромосом ооцита на ран- 11 -

них стадиях развития (профаза I мейоза), когда можно проанализировать строение хромо-центра. На этой стадии все хромосомы связаны между собой прицентромерными районами, формирующими хромоцентр, который обеспечивает правильное спаривание гомологичных хромосом (Чубыкин В.Л, 2002). В норме хромоцентр плотный, а хромосомы конденсированные (рис. 3 Г). А у мутантов 1сгл>с?'/1(1)ЕР520 происходит расщепление хромо-центра, нарушается компактизация и спаривание гомологов (рис. 3 Д).

Очевидно, причиной наблюдаемого нами в генетических экспериментах нерасхождения хромосом явилось нарушение конденсации и компактизации хромоцентра.

Все музейные аллели слабо проявляли мутантный фенотип в гетерозиготе с исход-

рующие экзоны). Единственный аллель, который ярко проявлял себя на фоне мутации lawcf', был l(l)EF520. У гетерозиготных особей !awcp'/l(l)EF520 наблюдается почти 100% проявление /awc-фенотипа, включая гомеозисную трансформацию аристы в тарзус. В поисках структурных нарушений района lawc-trf2 у мутантов l(l)EF520 мы провели Сау-зерн-блот анализ их ДНК с тремя зондами (Est, lawc6, TRF2) из разных районов этой области. Однако нарушений в исследуемых областях выявлено не было (рис. 4, 5). Данная линия была получена при помощи этилметансульфоната, что позволяет предположить точечную природу этой мутации.

Молекулярное картирование мутации l(l)EF520

ной мутацией lawcf'. Они нарушали регуляторные районы lawc-trf2 (интроны и некоди-

т.п.н.

т.п.н.

Рисунок 4. Саузерн-блот анализ ДНК особей дикого типа и мутантов 1(1)ЕР520/РМ4

5.5—

2 *~фШ

А) зонд lawe6, рестрикция эндонук-леазами HindiII и ВатНI; Б) зонд TRF2, рестрикция эндонуклеазами Hindlll и BamHl; В) зонд Est, рестрикция Sail

>0 ф —3.0

А

Б

В

Поэтому мы решили провести поиск точечных мутаций у данных особей с помощью секвенирования амплифицированных ПЦР-фрагментов, соответствующих геномным последовательностям, кодирующих ген Для этого были использованы 12 пар 5'- и 3'-праймеров, охватывающих область около 6 т.п.н. (рис. 5).

2 т.п.н.

Рисунок 5. Район локализации делении l(l)EF520 на карте локуса trf 2. Сверху представлена структура гена и используемые зонды (Est, lawcö, TRF2), снизу указаны начало и конец нуклеотидной последовательности кодирующей области, входящей в состав экзона 9, рамкой ограничены делетированные нуклеотиды мутанта. Пунктирной линией с двойной стрелкой обозначена область, проанализированная с помощью ПЦР. S - Sali, Н - Hwdlil, В - ВатШ.

В результате было установлено, что эмбриональная мутация l(l)EF520 вызвана де-лецией девяти нуклеотидов девятого экзона, соответствующих аминокислотам треонину, аргинину и аспарагину в позициях 580 - 582 и 1662 - 1664 а.к. у двух изоформ белка, укороченной - GenBank #NM078529 и полноразмерной - GenBank #DQ162845, соответственно. Таким образом, впервые была идентифицирована мутация, нарушающая кодирующий район гена trf2.

Анализ 5'-области lawc-tr/2

После установления реальных границ гена trf2 (Kopytova et. al., 2006) оказалось,

что исходный аллель lawcf' и большинство летальных мутаций локализованы в 5'-

нетранслируемом районе этого гена, который, перекрывается с мРНК гена CG32711,

имеющего противоположное направление транскрипции. Ранее в нашей лаборатории был

клонирован фрагмент геномной ДНК из области локализации мутации lawc?1, затем в результате скрининга библиотеки кДНК был получен клон кДНК, размером 2723 н п (GenBank # DQ296481) Мы сравнили последовательности этого клона с геномной последовательностью и установили экзон-интронную структуру части гена Оказалось, что к ДНК lawc совпадает с транскриптом CG32711, но длиннее его на 1638 н п (рис 6) Полноразмерный клон кДНК lawc пока не изолирован

poly-Л*

У

3'

500 п.н.

----3'

5' lawc

poly-A+

Рисунок 6. Карта перекрывающихся областей локусов /г/2, lawc и CG32711 Кодирующая область выделена черным прямоугольником, некодирующая область - белыми Треугольником показана инсерция двойной копии Р-элемента мутации lawcf' Пунктиром выделена зона перекрывания транскриптов lawc и trf2. EI, Ell - 1 и 2-й экзоны trfl соответственно

Транскрипты С032711 и lawc содержат общую ОРС размером 219 нуклеотидов, кодирующую предполагаемый полипептид, не имеющий существенной гомологии к известным мотивам и белкам Поэтому функциональность этого пептида остается под вопросом Наличие зоны перекрытия у разнонаправленных транскриптов Гг/2 и 1см>с размером 408 нуклеотидов позволяет предположить существование способа регуляции уровня экспрессии гена 1г/2 транскриптом 1ст>с Этим можно было бы объяснить факт восстановления жизнеспособности /аи>с-мутантов на фоне дополнительной экспрессии доменов

торг

Нарушения в репродуктивной системе самок Лшс-мутантов

Анализ полустерильных и стерильных аллелей

Самки линии ¡аыс"3 проявляют полную стерильность Быстрое прекращение яйцекладки и резкое снижение фертильности самок уже в возрасте 1-2 недель, а также быстрое старение наблюдалось у самок, гомозиготных по аллелю 1мсрМ Самки линии также имели пониженную фертильность Мы провели морфологический анализ репродуктивной системы мутантных самок 1спл>си3,1сгм?м и 1<шср!/1(1)ЕЕ520

Яичники дрозофилы состоят из 16-20 овариол, каждая из которых содержит цепь созревающих яйцевых камер (рис 7 А) Новые фолликулы образуются в передней части овариол, гермарии В передней части гермария находятся терминальные стволовые клетки (ГСК), которые асимметрично делятся с образованием цистобласта и новой ГСК Цистоб-ласт подвергается 4 митотическим делениям с неполным цитокинезом, формируя 16-клеточную цисту, которая обрастает фолликулярными клетками, происходящими от соматических стволовых клеток (ССК) Из 16 клеток цисты только одна становится ооцитом, а другие дифференцируются в трофоциты (клетки, питающие ооциг) (рис 7 В, Г)

Анализ репродуктивной системы стерильных 5-дневных мутантных самок 1сгн>си3 показал, что их яичники заполнены разросшимися гермариями с недифференцированными клетками, возможно, цистобластами (рис 7 Б)

Анализ репродуктивной системы 10-дневных самок другого мутанта, ¡ат^, показал, что 90% гермариев содержат малое количество терминальных стволовых клеток Известно, что дифференцировка и способность стволовых клеток к самовоспроизведению зависит от их микроокружения («клеточной ниши») При делении стволовой клетки одна из дочерних клеток покидает нишу и дает начало цистобласту Вторая дочерняя клетка сохраняет признаки стволовой и остается в нише У самок 1стс/^е1 практически в 100% случаев «ниши» были пустые (рис 7 Д)

Рисунок 7. Морфология яичников мутантов 1акси1 и ¡акс1"1'1. А — овариола самки дикого типа; Б - яичник 5-дневной самки 1стс"3; В — схема строения гермария, Г - гермарий 10-дневной самки дикого типа; Д - гермарий 10-дневной самки lawc!",',. Тройное окрашивание антителами против белка Шв (желтый - после совмещения с маркером актинового цитоскелета фаллоидином - красный) и ДНК (синий). ВВК - внутренние выстилающие клетки, ВК - верхушечные клетки, ГСК - терминальная стволовая клетка, ССК - соматические стволовые клетки, ТФ - терминальный филамент, ФК - фолликулярные клетки, ЦБ - цистобласт, Як — яйцевая камера. Передняя область объектов слева. Масштаб 20 мкм.

В настоящее время предполагают, что нарушение клетками «ниши» самовоспроизведения и поддержания стволовых клеток приводит к быстрому старению организма. Процесс самовоспроизведения и дифференцировки терминальной стволовой клетки у самок дрозофилы контролируется сигнальным путём Dpp (Decapentaplegic), который является гомологом трансформирующего фактора роста позвоночных BMP 2/4 (Bone Morpho-genetic Protein 2/4). Компоненты сигнального Dpp-пути экспрессируются в соматических клетках «ниши», и их мутации сокращают жизнь терминальных стволовых клеток и скорость их деления. Суперэкспрессия dpp, наоборот, приводит к нарушению дифференцировки терминальных стволовых клеток и опухолевидному разрастанию гермариев.

Очевидно, быстрое старение самок lawcFM и стерильность lawc"3 вызвано нарушением процессов самовоспроизведения и дифференцировки стволовых клеток соответственно.

Далее мы проанализировали репродуктивную систему самок lawcf'/l(l)EF520, которые были полустерильны и откладывали в 3-5 раз меньше яиц по сравнению с диким типом. Рост и созревание ооцита в первую очередь связаны с транспортом ооцитспеци-фичных РНК и белков (Orb, BicD и др.). Окрашивание антителами против белка Orb,

ооцитспецифичного белка, выявило отсутствие его специфической локализации (рис. 8 Б, Г). За ооцитспецифичиый транспорт отвечают компоненты цитоскелетного матрикса -кольцевые каналы и фьюсома, соединяющая клетки цисты. Вдоль фьюсомы формируется сеть микротрубочек.

wt ооцит

Orb \

Л

tawc

Ii t \

Orb ДНК

>• I 1г

Актин

\vt фыоп>»а- _л

/ *;ч.

cncKipocoMiN Д -

htwc ином н»«и i «nvpoci) ¡^¿а

и фмосома

С-

v- ** v ^

_ E ___ _

Рисунок 8. Ооцитспецифичная локализация белка Orb и компоненты цитоскелетного матрикса у самок lawcp,/l(l)EF520. А, Б - распределение ооцит-специфичного белка Orb в норме (А) и у мутанта (Б); В, Г - двойное окрашивание гермария дикого типа (В) и мутантов (Г) антителами против белка Orb (синий) и ДНК (зеленый). Д, Е - гермарий дикого типа (Д) и мутанта (Е); на вставках показаны нормально развитые кольцевые каналы (Д) и зауженные кольцевые каналы у мутантов (Е). Двойное окрашивание антителами против белка Hts (желтый - после совмещения с маркером актинового цитоскелета фал-лоидином - красный). Масштаб 20 мкм.

Окрашивание фаллоидином и Hts (выявляет кольцевые каналы) показало, что у мутантов недоразвита фьюсома, а кольцевые каналы аномально узкие (рис. 8 Е). Очевидно, причиной отсутствия ооцитспецифичного транспорта у самок lawcf'/l(l)EF520 является нарушение формирования компонентов цитоскелета.

Яйцевые камеры связаны между собой клетками перемычки (рис. 9 Б). У самок lawcpI/l(l)EF520 перемычки между яйцевыми камерами иногда (14,9 %) отсутствовали (рис. 9Г). Формирование перемычек связано с дифференцировкой фолликулярных клеток и контролируется последовательно двумя сигнальными путями Notch/Delta и Upd/JAK/STAT. В результате клетки перемычки накапливают DE-кадгерин, чтобы «прилипнуть» к ооциту предшествующей яйцевой камеры, который тоже имеет повышенный уровень DE-кадгерина, вследствие чего ооцит выталкивается назад, при этом циста приобретает форму сферы (зона 3 гермария, рис. 7 В). Анализ мутантных яйцевых камер показал, что у мутантов lawcpl/l(l)EF520 цисты остаются дисковидными (рис 9 В), очевидно, из-за нарушения, по крайней мере, одного из этих сигнальных путей. Заметим, что фенотип жизнеспособных мутантов по гену lawc, как было показано ранее, опосредован сигнальным путём Notch, а погибшие эмбрионы летальных аллелей демонстрировали нейро-генный фенотип, характерный Notch-мутантам (Бурдина Н.В., неопубл.)

А -it- Л < * - -S. + J V' о — _ Б

в * ^ V' / ♦ 'ч. г

Рисунок 9. Нарушения дифференци-ровки фолликулярных клеток у самок 1акср1/1(1)ЕР52(). А, Б - дикий тип, В -овариола мутанта по гену 1смс; стрелками обозначены аномальные яйцевые камеры; Г - отсутствие перемычки между яйцевыми камерами у мутантной самки. Тройное окрашивание кольцевых каналов антителами против белка ГОэ (желтый -после совмещения с маркером актинового цитоскелета фаллоидином (красный)) и ДНК (синий). Масштаб 40 мкм.

Наличие стерильности и нарушений в репродуктивной системе у различных /тус-мутантов говорит о том, что ген 1а-л/с функционирует в оогенезе самки и имеет материнский эффект. Однако эти мутации не являются сильными, т.к. проявляют жизнеспособность. Поэтому мы получили и исследовали гомозиготные по летальным аллелям гена /аи>с клоны терминальных клеток, и провели морфологический анализ яичников мозаичных самок.

Анализ материнского эффекта гена /дуус Клоны получали с помощью системы митотической рекомбинации РЛТ/РЬР. РЬР-рекомбиназа находится под контролем промотора гена теплового шока и позволяет индуцировать митотические обмены между гомологичными РЯТ-сайтами с высокой частотой.

Мы внедрили РЯТ-сайты в геном исследуемых линий и совместили их с РЬР. Индукцию рекомбинации проводили у потомства на 2 и 3 личиночной стадии в течение 1 часа при температуре 37,5°С. Для того чтобы распознать гомозиготные по аллелям гена 1сюс клоны, мы использовали линии, экспрессирующие вРР, при этом гомозиготные по аллелям гена 1стс клоны были маркированы отсутствием ядерного йРР (рис. 10 Г). Мы исследовали 6 музейных и 4 лабораторных линии.

Наряду с мутантными фенотипами, характерными для вышеописанных стерильных мутантов, был выявлен ряд новых нарушений. С частотой 25 % встречались клоны яйцевых камер с малым количеством ядер (рис. 10 В, Г), с частотой 10,3 % формировались многоядерные фолликулы (рис. 10 Д), с частотой 4,4 % в яйцевой камере находилось больше одного ооцитподобной клетки (рис. 10 Б). Общее количество просмотренных гомозиготных клонов - 30-50 в зависимости от линии.

Рисунок 10. Морфологии яйцевых камер при клональном анализе.

А - яйцевая камера дикого типа, Б - Е яйцевые камеры мутантов по гену 1ст>с, Б - в одной яйцевой камере три ооцита. В - яйцевая камера содержит одно ядро. Г - отсутствие ядерного ОРР в гомозиготном терминальном клоне (стрелка). Д -многоядерная яйцевая камера. Е -ооцит имеет 5 кольцевых каналов. Звездочкой показан ооцит Красный - актин; синий - ДНК; зеленый — ядерный вРР; желтый -Шз и актин. Масштаб 40 мкм.

л Б **

в V

Из литературных источников известно, что формирование малоядерных фолликулов происходит у мутантов по генам, контролирующим спектрин и аддуцин-подобный белок Hull tai shao (Hts) Эти мутации нарушают формирование органеллы цитоскелетного матрик-са - фьюсомы Фьюсома происходит из сферической структуры, названной спектросома, которая характерна терминальным стволовым клеткам и цистобластам На всех этапах деления цистобласта фьюсома контролирует митоз, ориентируя веретено деления и участвует в образовании цитоплазматических мостиков («кольцевых каналов») между клетками цисты (Lin Н et al, 1994) В наших экспериментах недоразвитая фьюсома встречалась у полустерильных самок lawc?'Л(1)EF520 (см выше, рис 8 Е) Возможно, более сильные аллели могут приводить к полной (или почти полной) деградации фьюсомы, что вызывает нарушение митоза и дезорганизацию клеток цисты

Фенотипы «многоядерные яйцевые камеры» и «формирование 2-3 клеток, имеющих ооцитподобные ядра с низкой плоидностью и конденсированным хроматином» характерны мутантам, нарушающим регуляцию клеточного цикла (циклина Е, string/cdc25, транскрипционный фактор stonewall (stwl')) Ооцит многоядерной яйцевой камеры lawc-мутанта имеет не 4, а 5 кольцевых каналов (рис 10 Е) Это говорит о том, что во время деления цистобластов мутантные цисты претерпевали не 4, а 5 раундов митозов, в результате чего формировались не 16-ти, а 32-клеточные цисты

В результате проделанной работы, мы показали, что все мутации гена lawc нарушают правильную экспрессию гена trf2 , а наличие зоны перекрытия у разнонаправленных транскриптов trf2 и lawc позволяет предположить существование способа регуляции уровня экспрессии гена trf2 транскриптом lawc, что требует дальнейшего исследования Перекрывание двух однонаправленных транскриптов недавно было описано у дрозофилы для генов charlatan и behnda (Escudero L М et al, 2005)

Впервые была получена и молекулярно изучена мутация, затрагивающая нуклео-тидную последовательность, кодирующую белковый продукт гена !г]2 Эта мутация ярко проявляет себя на фоне мутации /аи^' У гетерозиготных особей 1а\ы?!/1(1)ЕР520 наблюдается почти 100% проявление /ашс-фенотипа, включая гомеозисную трансформацию аристы в тарзус

Также, было показано, что /оиг участвует в процессе формирования репродуктивной системы у самок дрозофилы, возможно, участвуя в контроле циклического деления стволовых терминальных и соматических клеток, формирующих репродуктивную систему дрозофилы

Выводы

1 Показано восстановление жизнеспособности у ряда летальных мутаций lawc на фоне экспрессии конструкций, кодирующих домен, гомологичный ДНК-связывающему домену ТВР гена trf2

2 Выявлена и молекулярно исследована единственная мутация, затрагивающая нук-леотидную последовательность, кодирующую белковый продукт гена trf2

3 Установлено, что неполноразмерная кДНК lawc совпадает с транскриптом CG32711 но длиннее его на 1638 н п

4 Показано, что разнонаправленные транскрипты гена trf2 и гена lawc перекрываются 5 -регуляторными районами на протяжении 408 нуклеотидов

5 Обнаружено, что причиной нерасхождения хромосом в мейозе у /awe-мутантов является нарушение структуры хромоцентра и спаривания гомологичных хромосом ооцита ранних стадий развития

6 Показано, что стерильность lawc-мутантов вызвана нарушением либо дифференцировки, либо самовоспроизведения стволовых терминальных клеток Слабофертильные аллели гена lawc нарушают формирование цитоскелета, обеспечивающего транспорт ооцит-специфичного белка Orb, и дифференцировку соматических фолликулярных клеток, а более сильные мутации гена приводят к полной дезорганизации клеток терминальной цисты

Автор выражает благодарность [Л И КорочкинМ и Г В Павловой за предоставленную возможность выполнить данную работу в своей лаборатории, за проявленный интерес к работе и поддержку, а также П Г Георгиеву за консультации и обсуждение полученных результатов

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Е А Модестова, Ю.Е. Воронцова, Л И Корочкин, О Б Симонова Получение летальных мутаций гена leg-ai ista-wing complex у D melanogaster // ДАН, 2005 T 403 №4, С 564-565

2 Ю Е Воронцова, Модестова Е А , Бурдина Н В , О Б Симонова Восстановление жизнеспособности летальных мутантов гена leg-artsta-wing complex на фоне конструкций, экспрессирующих домены гена trf2, у Drosophila melanogaster // ДАН, 2007, Т 417 №1

Тезисы конференции-

1 Ю Е Воронцова, Модестова Е А , Л И Корочкин, О Б Симонова Использование мо-лекулярно-генетических конструкций для восстановления жизнеспособности летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у дрозофилы // Онтогенез, 2005 , Т 36 , №5 С 372-373

2 Simonova О , Modestova Е , Vorontsova J , Korochkin L leg-ansta-wing complex mutations cause not only morphological abnormalities, but also chromosome non-disjunction // 46th Annual Drosophila Research Conference San Diego USA 2005 , p 144,170В

3 Ю.Е. Воронцова, E А Модестова, Л И Корочкин, О Б Симонова Использование молекулярно-генетических конструкций для восстановления жизнеспособности летальных мутаций гена leg-ai ista-wing complex у D melanogaster 11 VI Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток», г Звенигород, декабрь 2005,с 54

4 Simonova О , Modestova Е , Kopantseva М , Vorontsova J , Burdina N , Korochkin L Lethal and sterile mutations in leg-arista-wing complex zygotic and maternal effects // 47lh Annual Drosophila Research Conference Houston USA 2006 481 С

5 Ю Е Воронцова, Е А, Модестова, JI И Корочкин, О Б Симонова Роль гена leg-arista-wing complex в правильном расхождении хромосом и формировании гонад у Drosophila melanogaster // Материалы Международной Конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им Н И Вавилова РАН Москва 2006 С 38

6 Ю Е Воронцова, Модестова Е А Гомолог транскрипционного фактора млекопитающих TRF2 участвует в формировании гонад у дрозофилы // Всероссийская медико-биологическая научная конференция молодых ученых «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (X Всероссийская конференция «Человек и его здоровье»)

С -Петербург 2007, с 82-83

7 Ю Е Воронцова, Модестова Е А , О Б Симонова Ген leg-ansla-wing complex участвует в правильном расхождении хромосом в мейозе и в дифференцировке соматических и терминальных клеток в оогенезе у Drosophila melanogastei // Международная молодежная научно-методическая конференция «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» Томск 2007

Заказ № 96/11/07 Подписано в печать 14.10.2007 Тираж 70 экз. Усл. п.л. 1,5

. ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20

www.cfr.ru ; е-таП:info@cfr.ru

'■'уУ/