Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль гена leg-arista-wing complex в процессе базовой и специфической транскрипции и формировании гонад у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль гена leg-arista-wing complex в процессе базовой и специфической транскрипции и формировании гонад у Drosophila melanogaster"

003451Jüts

На правах рукописи УДК 575.1 : 595.773.4

Воронцова Юлия Евгеньевна

Роль гена leg-arista-wing complex в процессе базовой и специфической транскрипции и формировании гонад у Drosophila melanogaster

Специальность: 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з о

Москва 2008

003451388

Работа выполнена в лаборатории нейрогенетики и генетики развития Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Симонова Ольга Борисовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Евгеньев Михаил Борисович

доктор биологических наук Чубыкин Валерий Леонидович

Ведущая организация: кафедра генетики биологического факультета Московского государственного университета им. Н.В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится 19 ноября 2008 года в «_» часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.238.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, г. Москва ул. Вавилова, д.26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (119334, г. Москва ул. Вавилова, д.26).

Автореферат разослан 17 октября 2008 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Создание и совершенствование мощных технологий, позволяющих детализировать молекулярные процессы, регулирующие развитие, привело к тесному сплетению генетики, клеточной биологии и биологии развития, и многие гены, которые, считалось, выступают в роли регуляторов основных биологических функций клетки (гены домашнего хозяйства), оказалось, обладают специфическими регуляторными функциями в развитии. Поэтому изучение особенностей проявления генов, кодирующих эволюционно консервативные факторы транскрипции, является актуальной проблемой.

Инсерционная мутация leg-arista-wing complex (lawc) дрозофилы, нарушающая правильную экспрессию многих локусов, была обнаружена в 1992 году в лаборатории Т.Н. Герасимовой (ИОГен РАН). Район исследуемой инсер-ции был клонирован и картирован. Позднее в 1999 году в лаборатории Тидже-на (Tjan, США) у дрозофилы был открыт ген, гомологичный гену человека и кодирующий фактор базовой транскрипции ТВР related factor 2 (TRF2), который принадлежит к эволюционно консервативному семейству белков ТВР (TATA-box binding protein). Однако границы этого гена не были установлены. В первую очередь эти трудности обуславливались отсутствием мутаций, локализованных в этой области. И только к 2003 году, когда полностью расшифровали геном дрозофилы, стало ясно, что клонированная часть последовательности lawc лежит на расстоянии примерно 15 т.п.н. от открытой рамки считывания гена trf2. Открытие и клонирование инсерционной мутации lawcf'1 сыграло важную роль в установлении границ гена ¡г/2, в частности, района начала его транскрипции (совместная работа лабораторий П.Г. Георгиева, Ю.В. Ильина, Л.И. Корочкина, ИБГ РАН). В результате оказалось, что с одной мРНК trf2 могут синтезироваться две изоформы белка (полноразмерная и укороченная), отличающиеся N-концевыми последовательностями. Район локализации lawc (7Е район цитологической карты Х-хромосомы дрозофилы) содержит блок нескольких летальных мутаций разной природы. Поэтому стало актуально изолировать аллели, нарушающие экспрессию конкретных изоформ TRF2.

Некоторые /awe-мутации вызывают стерильность самок, другие аллели приводят к раннему старению организма. В настоящее время старение предположительно связывают с нарушением самовоспроизведения стволовых клеток в репродуктивной системе. Гаметогенез у дрозофилы исследован очень хорошо. Однако его генетический контроль изучен недостаточно. Например, неизвестно, каким образом происходит выбор ооцита среди шестнадцати клеток цисты, хотя уже ясно, что за его спецификацию отвечает недавно открытая цитоплаз-матическая структура, возникающая в стволовых клетках полового пути, названная фьюсомой. Поэтому изучение генетической регуляции процессов идентификации ооцита и поддержания его статуса, а также самовоспроизведения стволовых герминативных клеток и старения предполагает исследование стерильных и слабофертильных мутантов у хорошо изученных модельных организмов.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в идентификации мутаций leg-arista-wing complex, нарушающих экспрессию каждой из изоформ фактора транскрипции TRF2, и изучении их влияния на оогенез у Drosophila melanogaster.

В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1) провести серию генетических экспериментов по исследованию влияния трансгенных конструкций, экспрессирующих различные белковые изоформы гена trß, на фенотип летальных мутаций, локализованных в районе lawc-trß\

2) провести цитологический анализ ядра ооцита поздних и ранних стадий развития в поисках причин нерасхождения хромосом в мейозе у /awc-мутантов;

3) исследовать особенности распределения белка TRF2 на политенных хромосомах слюнных желёз личинок дрозофилы;

4) изучить функциональные особенности lawc/trß в репродуктивной системе самок дрозофилы с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания яичников стерильных и слабофертильных мутантов ооцитспецифичными и другими маркерами;

5) исследовать материнский эффект летальных аллелей lawc с помощью клонального анализа и флуоресцентного окрашивания.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые были изолированы летальные аллели lawc с нарушенной экспрессией полноразмерной и укороченной изоформ белка TRF2. Установлено, что эволюционно вариабельный N-концевой район полноразмерной изоформы TRF2 обладает самостоятельной функциональной нагрузкой. Обнаружено, что нерасхождение хромосом в мейозе у /awc-мутантов вызвано нарушением структуры хромоцен-тра и спаривания гомологичных хромосом ооцита ранних стадий развития. Впервые показано, что продукт ген lawc/trß участвует в формировании клеточного цитоскелета и связанного с ним транспорта ооцитспецифичного белка Orb. Обнаружено влияние уровня экспрессии lawc/trß на организацию актина в эпителиальных клетках яичника. Установлено, что стерильность /awc-мутантов вызвана нарушением механизма дифференцировки герминативных и соматических фолликулярных клеток. Обнаружено, что у мутантов с сокращенной продолжительностью жизни отсутствует самовоспроизведение герминативных стволовых клеток.

Полученные данные являются основой для дальнейшего изучения функции гена lawc/trß, а также помогут решить ряд спорных вопросов, касающихся взаимосвязей сигнальных путей в оогенезе у дрозофилы. Учитывая, что у позвоночных, в том числе у млекопитающих и человека, присутствуют гомологичные гены, то можно предположить, что полученные данные будут иметь универсальное значение.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на XIV школе по биологии развития (Звенигород, 2005), VI международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2005), международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006), международном семинаре «Генетика репродукции насекомых и её практическое примене-

ние» (Москва, 2006), на всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007), международной молодёжной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007), на конференции молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2007) и на 46-й, 47-й и 49-й Ежегодных исследовательских конференциях по дрозофиле (Сан-Диего, 2005; Хьюстон, 2006; Сан-Диего, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, их них 3 статьи в рецензируемых журналах и 9 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (91 источник). Содержит 21 рисунок и 10 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Восстановление жизнеспособности особей с летальными /ан»с-мутациямн (геясие-тест)

Открытие инсерционной мутации /ап'с/'1, расположенной вблизи открытой рамки считывания гена 1г/2, сыграло важную роль в установлении границ этого гена, в частности, района начала его транскрипции (5'-область). Однако вопрос, нарушают ли летальные /он'с-мутации экспрессию гена 1г/2, оставался открытым. Чтобы ответить на него, мы поставили серию генетических экспериментов по исследованию способности трансгенных конструкций, экспресси-рующих различные изоформы белка ТЯР2, восстанавливать жизнеспособность самцов летальных мутаций, локализованных в районе /ан'с-Гл/2. Для эксперимента были взяты 12 музейных линий (коллекционный центр линий дрозофилы, Блумингтон, США), содержащих летальные мутации в районе 1ач)с-1гр., и 31 линия, полученная ранее в лаборатории нейрогенетики и генетики развития ИБГ РАН.

Анализ музейных летальных \awc-мутаций Для того чтобы установить, являются ли музейные летальные мутации комплементарными аллелю Ьп'с1'', проводили тест на аллелизм. В таблице 1 представлены результаты теста. Мы показали, что 10 музейных летальных мутаций частично комплементарны аллелю 1ам>с', так как гетерозиготные самки 1(1)/1ап(?' проявляли слабый /шус-фенотип - характерные вырезки крыловой пластинки (рис. 1, табл. 1 - серый фон).

Рисунок 1. Крыловая пластинка мух дикого типа и гетерозиготных самок

1(1)/1ап'с'" (1апс).

Далее мы проанализировали восстановление выживаемости летальных самцов (гезсие-тест) при введении в их геном конструкций, конститутивно экс-прессирующих разные домены белка ТЯР2.

Конструкция [ТЯР2-1] экспрессирует укороченную изоформу белка ТЯР2 с доменом, гомологичным эволюционно консервативному ДНК-связывающему району гена (Ьр\ конструкция [1а\ус1] экспрессирует смежный с ним эволюционно вариабельный Ы-концевой домен полноразмерного белка ТЯР2; конструкция [1ашс2] кодирует область, принадлежащую обеим конструкциям [Т11Р2-1] и [1ау/с1] и экспрессирует полноразмерную изоформу белка ТЯР2 (рис. 2).

Таблица 1. Результаты теста на аллелизм и гехсие-теста с учетом частоты нерасхождения половых хромосом._

Леталь (№ линии) Тест на аллелизм «1(№С», %* /?ехсие-тест <2, %***

ТЬЮ" 2-1, %** %** 1а\ус2, %**

1(1)00425 (12254) 49,2 84,4 0 66,7 2,7

1(1)00039 {\\5Щ 15,8 102,8 0 113,5 15,7

1(1)00356 (\Ш2) 32,0 72,9 0 136,0 18,2

1(1)00332 (11927) 42,5 100,0 0 44,2 16,6

1(1)00166 (11945) 60,0 140,0 0 15,2 30,7

1(1)00372 (12295) 58,3 31,3 0 13,3 1,1

1(1)00178 (11868) 9,6 13,6 0 13,2 8,5

1(1)00203 (\\Ж) 74,2 84,0 0 15,2 0,4

1(1)00152 {11940) 61,7 26,9 0 21,4 8,8

1(1)00376 (12250) 68,9 52,2 0 40,9 4,2

1(1)00071 (11739) 4,2 32,1 50 100,0 3,6

1(1)00424 (12020) 5,4 0 0 0 8,8

* Частота проявления фенотипа «1аш» рассчитывалась через отношение количества самок «/пн'с» к общему числу анализируемых 1(1)/1<т^' самок.

** Частота выживаемости летальных самцов рассчитывалась через отношение количества выживших самцов с летальной хромосомой !('1)/Ч; [конструкция]/+ к количеству самцов альтернативного класса с балансерной хромосомой Ьа1апсег1\\ [конструкция]/+. *** Частота нерасхождения половых хромосом рассчитывалась по формуле: О = 100% • 2(ХО+ХХУ)/(ХХ+2ХУ+2ХО+2ХХУ), где Х0 и ХХУ - количество особей аномальных классов, XX и ХУ - количество особей нормальных классов. В таблице приведено среднее значение 0 по результатам скрещиваний с тремя конструкциями.

Из таблицы 1 видно, что конструкция [ТКБ2-1] восстанавливает выживаемость самцов почти всех линий, за исключением № 12020. В отличие от него конструкция [1ашс1] восстанавливает выживаемость летальных самцов всего одной линии (№ 11739), а конструкция [1ашс2] так же, как и [ЛЖМ], восстанавливает выживаемость самцов почти всех линий, за исключением №12020. Так как обе конструкции [ТКР2-1] и [1а\ус2] содержали общую область, кодирующую домен, гомологичный ДНК-связывающему району гена 1Ьр, то можно предположить, что дополнительная экспрессия именно этого района и обеспечивает восстановление выживаемости.

Летальная мутация (№ 12020), которая «не спасается» введением конструкций, очевидно, нарушает функции гена, отличные от тех, за которые отвечают последовательности, входящие в конструкции, либо экспрессии данных конструкций не достаточно для восстановления жизнеспособности летальных самцов этой линии. Мы не можем отвергнуть возможность и того, что летальность в линии №12020 вызвана суперэкспрессией белка TRF2, поэтому мы всё-таки решили использовать эту линию в дальнейших экспериментах.

ИМИ. 11250 11S6S, НЦ^У^

la Н'

115«. 1IM2 12254'

4-3

2 т.п.н.

HDEFS20

4ÏH

[lawcl] |TRF2-1J _|lawc2|

Рисунок 2. Молекулярно-структурная организация района 1ан>Ыг/2 и карта локализации исходной 1аксР' и летальных мутаций. Кодирующая область гена выделена черными прямоугольниками, некодирующая область - белыми. Двойными стрелками показана инсерция двойной копии Р-элемента у мутантов /аич/"7. Наклонная стрелка обозначает район локализации мутации 1(1)ЕР520. [1ашс1], [1ашс2], [ТЯР2-1] - области, кодируемые соответствующими конструкциями. Цифры возле различных перестроек соответствуют номерам мутантных линий.

Жизнеспособность гемизиготных самцов линии № 11739 восстанавливалась независимо от типа конструкций. Очевидно, летальность в этой линии не связана с Х-хромосомой, что было подтверждено контрольным скрещиванием.

В ходе генетических экспериментов нами были замечены особи аномальных классов, вызванных неправильным расхождением половых хромосом родительских самок. Это самки ХХ/У и самцы Х/О. Мы рассчитали частоту нерасхождения для каждой линии (таблица 1). Так как в исследуемых линиях летальная хромосома поддерживается на хромосоме-балансере (РМ), мы поставили контрольный эксперимент, чтобы выявить влияние хромосомы-балансера (РМ) на частоту нерасхождения половых хромосом и сравнить её с частотой нерасхождения С?, рассчитанной для наших линий. Было проанализировано почти 2500 особей. Частота нерасхождения Х-хромосомы в контрольном экспе-

рименте составляла примерно 1,4 %. В музейных линиях частота нерасхождения достигала 30,7%, т.е. примерно в 20 раз превышала контрольную.

Итак, в результате исследования 12 музейных линий мы изолировали 10 летальных мутаций, локализованных в 5'-нетранслируемом районе 1а\\<с/1г/2, нарушающих экспрессию укороченной изоформы ТНР2. Однако мутаций, нарушающих экспрессию только полноразмерной изоформы ТЯР2, обнаружено не было, поэтому стал актуален их поиск и исследование.

Анализ лабораторных летальных /дуус-мутаций

Ранее в лаборатории нейрогенетики и генетики развития (ИБГ РАН) после дестабилизации исходного аллеля \a\vd11 была получена коллекция летальных мутаций. Мы проанализировали восстановление выживаемости летальных самцов 31 подобной линии при введении в геном конструкций, экспрессирую-щих разные изоформы ТЯР2.

В результате мы изолировали три линии 1(1)1акс19, 1(1)1ам>сЗЗ, 1(1)1амс69, жизнеспособность самцов в которых восстанавливалась только на фоне экспрессии конструкции, кодирующей полноразмерный белок ТЯР2. Кроме того, была обнаружена линия 1(1)1ам/с73, выживаемость самцов которой восстанавливалась на фоне экспрессии как полноразмерный изоформы ТЯР2, так и его Ы-концевого домена, но не восстанавливалась на фоне экспрессии конструкции, кодирующей укороченную изоформу (табл. 2). Очевидно, в этой линии мутация нарушает экспрессию 1Ч-концевой области полноразмерной изоформы ТЯР2. Отметим, что данный район является эволюционно вариабельным, т.к. он не встречается у позвоночных животных и имеет низкую степень гомологии с подобными районами других видов дрозофилы. Наши данные говорят о том, что эволюционно вариабельный Ы-концевой район белка имеет самостоятельную функциональную активность.

Табл. 2. Яежсие-тест четырёх лабораторных 1аюс-мутаций с учетом частоты нерасхождения половых хромосом. __

Частота выживаемости, %* д**

Линия Т!^ 2-1 1аит1 1ашс2 %

1(1)1стс19 0 0 3,6 2,8

1(1)1стсЗЗ 0 0 23,0 0

1(1)1а\\'с69 0 0 5,1 2,4

1(1)1<тс73 0 4,7 17,6 5,5

* Частота выживаемости летальных самцов рассчитывалась как отношение количества выживших самцов с летальной хромосомой 1(1 )/У; [конструкция]/+ к количеству самцов альтернативного класса с балансерной хромосомой Ьа1апсегП\ [конструкция]/+. ** Частота нерасхождения половых хромосом (О) рассчитывалась по формуле, указанной в табл. 1.

Очевидно, остальные линии, летальность самцов в которых «не спасалась конструкциями», либо содержат дополнительные летальные области, отличные от зоны 1аюс-(г/2, либо экспрессии конструкций недостаточно для восстановле-

ния нарушений, поскольку по молекулярно-генетическим данным в этих линиях есть делеции, инверсии, инсерции Р-элемента, возможно, затрагивающие дополнительные районы.

В потомстве от самок двенадцати лабораторных линий также наблюдалось возникновение особей аномальных классов. Частота нерасхождения половых хромосом в этих линиях колебалась в пределах от 2,2 до 23,5%.

Таким образом, протестировав 43 линии в геясие-экспериментах, мы изолировали 10 мутаций, нарушающих экспрессию только укороченной изоформы ТКР2, три мутации, нарушающих экспрессию полноразмерной изоформы ТИР2 и одну мутацию, нарушающую экспрессию вариабельного Ы-концевого домена полноразмерной изоформы. Интересно, что музейные летальные мутации нарушали экспрессию лишь укороченной изоформы, а лабораторные - полноразмерной. Эти две группы линий отличаются по своей природе. Музейные линии являются инсерционными, поскольку летальность в них вызвана встраиванием транспозона р{1ас\¥} в регуляторную, некодирующую зону 1см>с-1г/2. Причины летальности в лабораторных линиях, нарушающих полноразмерную изоформу, до конца не исследованы. Известно только, что эти линии были получены после дестабилизации мобильного Р-элемента у исходного аллеля 1ап'ср1, и одна из них, 1(1)1см>сЗЗ, является инверсией.

Открытие у дрозофилы мутации 1стс в условиях отсутствия возможности исследовать белковый продукт привело к употреблению термина «ген /ст>с» в соответствии с определением гена, как единицы мутации. Впоследствии, когда полностью был расшифрован геном дрозофилы, стало ясно, что часть клонированной последовательности 1<тс лежит на расстоянии примерно 15 т.п.н. от открытой рамки считывания, кодирующей новый транскрипционный фактор, гомологичный фактору базовой транскрипции Т11Р2, обнаруженному у позвоночных животных. «Спасение» фенотипического проявления не всех, но подавляющего большинства /ам'с-мутаций на фоне дополнительной экспрессии Т11Р2 даёт основание считать эти аллели аллелями гена ¡г/2. На основании этого в дальнейшем мы будем называть ген 1а\\'с!1г]2.

Исследование причин нерасхождения хромосом у /ант-мутантов

В поисках причин нерасхождения хромосом, обнаруженных в геясие-экспериментах, мы провели цитологический анализ ядра ооцита поздних и ранних стадий развития. Для этого были приготовлены давленые препараты яичников самок дикого типа и мутантных особей 1амср1/1(1)ЕР52 О, проявляющих наиболее сильный мутантный /аи'с-феиотип, окрашенные реактивом Шиффа по методу Пуро и Ноккала.

На поздних стадиях развития (ранняя анафаза I) в норме хромосомы ооцита собраны в кариосому с компактной структурой, а четвертые хромосомы ориентированы к разным полюсам деления (рис. ЗА).

У мутантов наблюдалось возникновение хроматинового моста при расхождении хромосом в анафазе I (рис. ЗВ), возникшего, возможно, в результате аномального кроссинговера, и расщепление кариосомы (рис. ЗБ).

Расщепление кариосомы предполагает нарушение компактизации хроматина в прицентромерных районах. Поэтому мы рассмотрели структуру хромосом ооцита на ранних стадиях развития (профаза I мейоза), когда можно проанализировать строение хромоцентра.

Рисунок 3. Хромосомы ооцитов у мутантных самок 1стср1/1(1)ЕР520.

А - ранняя анафаза I в норме; стрелками обозначены четвертые хромосомы; Б, В - анафаза I у мутантов. Стрелкой показан хроматиновый мост между ядрами; цифрами обозначены гомологичные хромосомы; Г - нормальная профаза I; Д — профаза I у мутантов. Стрелками показан хромоцентр, дугой обозначено нарушение компактизации хромосом. Масштабная полоска 10 мкм.

На этой стадии все хромосомы связаны между собой прицентромерными районами, формирующими хромоцентр, который обеспечивает правильное спаривание гомологичных хромосом. В норме хромоцентр плотный, а хромосомы конденсированные (рис. ЗГ). У мутантов происходит расщепление хромоцентра, нарушается компактизация и спаривание гомологов (рис. ЗД).

^ ^ 1 Рисунок 4. Иммунофлуоресцент-

Хромоцентр 1 ное окрашивание антителами к

* 31. СРР политенных хромосом слюн-

21 ных желёз личинок дрозофилы,

экспрессирующих гибридный бе-

лок ТКР2-СРР.

Дополнительно мы проанализировали распределение белка ТИР2 на по-литенных хромосомах слюнных желез личинок третьего возраста с помощью метода иммунофлуоресцентного окрашивания. Оказалось, что белок локализуется преимущественно в области хромоцентра (рис. 4).

Очевидно, причиной наблюдаемого нами в генетических экспериментах нерасхождения хромосом явилось нарушение конденсации и компактизации хромоцентра, возможно, вызванное снижением уровня экспрессии TRF2.

Из литературных данных известно, что укороченная изоформа TRF2 входит в состав макромолекулярного хроматин-ремодулирующего комплекса NURF (nucleosome remodelling factor). Локализация белка TRF2 в хромоцентре и высокая частота нерасхождения хромосом, вызванная нарушением структуру хромоцентра у мутантов с пониженной экспрессии TRF2, подтверждают выдвинутую другими авторами гипотезу о том, что этот белок может не только участвовать в транскрипции, но и выполнять структурные функции в организации хроматина.

Нарушения в репродуктивной системе самок /awe-мутантов

Анализ слабофертильных и стерильных самок

Ранее полученные результаты Нозерн-гибридизации показали, что транскрипты гена lawc/trf2 различаются у самок и самцов. Имунноокрашивание яичников дикого типа обнаружило одинаковую локализацию двух изоформ, преимущественно в герминативных клетках. Тем не менее, мутантные самки lawcf' были фертильны и только в комбинации с мутацией гена polyhomeotic (plf') становились стерильными из-за нарушения дифференцировки герминативных клеток, но конкретные причины этих нарушений не исследовались, так же, как не исследовались стерильные мутанты этого гена.

Мы провели морфологический анализ репродуктивной системы слабофертильных (lawcf е и и стерильных самок (lawcи3). Дополнительно, у слабофертильных мутантов наблюдалось быстрое старение самок уже в возрасте 1-2 недель.

Яичники дрозофилы состоят из 16-20 овариол, каждая из которых содержит цепь созревающих яйцевых камер (рис. 5А). Новые фолликулы образуются в передней части овариолы, гермарии (рис. 6А). В передней части гермария находятся герминативные стволовые клетки (ГСК), которые асимметрично делятся с образованием цистобласта и новой ГСК. Цистобласт подвергается четырём митотическим делениям с неполным цитокинезом, формируя 16-клеточную цисту, которая обрастает фолликулярными клетками, происходящими от соматических стволовых клеток (ССК). Из 16 клеток цисты только одна становится ооцитом, а другие дифференцируются в трофоциты (крупноядерные клетки, питающие ооцит) (рис. 5А).

Анализ репродуктивной системы молодых стерильных самок lawc"3 показал, что в их яичниках формируются аномальные яйцевые камеры (примерно, 1 на овариолу), содержащие 1-3 трофоцита без ооцита, которые затем деградируют (рис. 5Б-В). Овариолы зрелых самок представляли собой разросшиеся гермарии (рис. 5Е). Хотя формирования яйцевых камер у них не происходило, тем не менее, некоторые овариолы были заполнены либо недифференцированными клетками, возможно, цистобластами, либо делящимися цистоцитами и зрелыми цистами без фолликулярного слоя (рис. 5Г, Е).

Рисунок 5. Морфология яичников мутантов 1ап>с"3. А - овариола самки дикого типа, фигурной скобкой обозначена область гермария, буквой «Т» - тро-фоциты, звездочкой - ооцит; Б - яичник 3-дневного мутанта; В - яйцевая камера мутанта содержит два трофоцита; Г - увеличенная область, отмеченная на Е, часть мутантной овариолы, заполненная многочисленными цистами без оболочек (пунктир), на врезке представлена схема 16-клеточной цисты с фью-сомой (стрелки); Д-3 - овариолы (Д-Е) и гермарий (Ж-3) самок дикого типа (Д, Ж), и 10-дневных мутантов (Е, 3) после окрашивания антителами к спектрину и актину (на Ж—3 представлены зоны гермария 1 и 2а). Актин - красный, спек-трин - зеленый (при совмещении с актином - желтый), ДНК - синий. Масштабная полоска 20 мкм (А -Б, Д-Е) и 10 мкм (В-Г, Ж-3).

Формирование малоядерных яйцевых камер предполагает нарушение ор-ганеллы цитоскелета фьюсомы, одной из функций которой является контролирование митоза герминативных клеток путём ориентации веретена деления. Мы посмотрели распределение спектрина и актина - структурных компонентов фьюсомы и её предшественника спектросомы - сферической органеллы, характерной стволовым герминативным клеткам (рис. 5Ж). Оказалось, что спектросомы (а значит и стволовые герминативные клетки) в мутантных гермариях отсутствуют, а фьюсомы полностью лишены актина (рис. 5Г, 3). Очевидно, отсутствие одного из её компонентов у /сп-ус"3 негативно влияет на процесс деления цистоцитов, что приводит к формированию малоядерных фолликулов. Отсутствие спектросом говорит об ограниченном самовоспроизведении стволовых герминативных клеток. Формирование одной яйцевой камеры на овариолу у молодых и отсутствие фолликулярного слоя у поздних цист зрелых самок этой линии говорит о нарушении самовоспроизведения стволовых соматических клеток, которые являются источником дифференцированных фолликулярных клеток, покрывающих цисту.

У слабофертильных мутантов 1сп\>с? е1 наблюдалось быстрое старение самок уже в возрасте 1-2 недель. Анализ репродуктивной системы молодых самок этого мутанта показал, что в их гермариях было мало ранних цист (сравните

12

рис. 6Б и В). В гермариях зрелых самок не было ни ранних цист, ни герминативных стволовых клеток (рис. 6Г). Известно, что дифференцировка и способность стволовых клеток к самовоспроизведению зависит от их микроокружения («клеточной ниши»). При делении стволовой клетки одна из дочерних клеток покидает нишу и дает начало цистобласту. Вторая дочерняя клетка сохраняет признаки стволовой и остается в нише. У самок 1амн?м ниши были пустые уже в 10-дневном возрасте, тогда как в норме это происходит у 40-50-дневных самок.

Тф ЦБ стада 1

А I * V V * з ^ Б 2я--- -

Г 2a v AjV^jf ■ J» »

Рисунок 6. Морфология яичников мутантов lawcpdd. А - схема строения гер-мария, Б - гермарий 10-дневной самки дикого типа; В - гермарий 3-дневной самки lawcpdel. Г - гермарии 10-дневной самки lawcpdel. Пунктиром обозначена первая 16-клеточная циста. Тройное окрашивание антителами к белку Hts (желтый - после совмещения с фаллоидином - красный) и ДНК (синий). Масштабная полоска 20 мкм. На схеме: ВВК - внутренние выстилающие клетки, ВК -верхушечные клетки, ГСК — герминативные стволовые клетки, ССК - соматические стволовые клетки, ТФ - терминальный филамент, ФК - фолликулярные клетки, ЦБ - цистобласт, Як - яйцевая камера.

В настоящее время предполагают, что нарушение клетками ниши самовоспроизведения и поддержания стволовых клеток приводит к быстрому старению организма. Очевидно, быстрое старение самок lawcfdel вызвано нарушением процессов самовоспроизведения герминативных стволовых клеток.

Далее мы проанализировали репродуктивную систему гетерозиготных самок которые были полустерильны и откладывали в 3-5 раз

меньше яиц по сравнению с диким типом. Рост и созревание ооцита в первую очередь связаны с транспортом ооцитспецифичных РНК и белков (Orb, BicD и др.). Окрашивание антителами против ооцитспецифичного белка Orb, выявило отсутствие его характерной локализации (рис. 7Б, Г).

За ооцитспецифичный транспорт отвечают компоненты цитоскелетного матрикса: кольцевые каналы и фьюсома, соединяющая клетки цисты. Вдоль фьюсомы формируется сеть микротрубочек. Окрашивание фаллоидином и Hts

(выявляет кольцевые каналы) показало, что у мутантов недоразвита фьюсома, а кольцевые каналы аномально узкие (рис. 7Е).

Wt фыосбма — Jawc ¡iimi^MairtTtcCTjm'twii*,^ it ф|.шС1>ч:1 «-'У''/

Актин. \ Д сп сбросом а Н.Г, а 4 т* ^Е V., \v . /

Рисунок 7. Ооцитспецифичная локализация белка Orb и компоненты ци-тоскелетного матрикса у самок lawd''Л(1)EF520. А, Б - распределение ооцит-специфичного белка Orb в норме (А) и у мутанта (Б); В, Г - двойное окрашивание гермария дикого типа (В) и мутантов (Г) антителами к белку Orb (синий) и ДНК (зеленый). Д, Е - гермарий дикого типа (Д) и мутанта (Е); на вставках показаны нормально развитые кольцевые каналы (Д) и зауженные кольцевые каналы у мутантов (Е). Двойное окрашивание антителами к белку Hts (желтый -после совмещения с маркером актинового цитоскелета фаллоидином - красный). Масштабная полоска 10 мкм.

Очевидно, причиной отсутствия ооцитспецифичного транспорта у самок lawcf '/1(1)EF520 является нарушение формирования компонентов цитоскелета.

Яйцевые камеры связаны между собой клетками перемычки (рис. 8Б). У самок lawcf1/l(l)EF520 перемычки между яйцевыми камерами иногда (14,9%) отсутствовали (рис. 8Г).

Формирование перемычек связано с дифференцировкой фолликулярных клеток и контролируется последовательно двумя сигнальными путями Notch/Delta и Upd/JAK/'STAT. В результате клетки перемычки накапливают DE-кадгерин, чтобы «прилипнуть» к ооциту предшествующей яйцевой камеры, который (в отличие от трофоцитов) тоже имеет повышенный уровень DE-кадгерина, вследствие чего ооцит выталкивается назад, при этом циста приобретает форму сферы (зона 3 гермария, рис. 6А).

Анализ мутантных яйцевых камер показал, что у мутантов lawcf /I (1JEF520 цисты остаются дисковидными (рис 8В), очевидно, из-за нарушения, по крайней мере, одного из этих сигнальных путей. Интересно, что ранее было показано, что крыловой фенотип мутантов lawcf1, опосредован сигнальным путём Notch, а погибшие эмбрионы l(l)EF520/Y демонстрировали нейрогенный фенотип, характерный Notch-мутантам.

Рисунок 8. Нарушения дифферен-цировки фолликулярных клеток у самок 1ап>ср1/1(1)ЕЕ520. А, Б - дикий тип, В - овариола мутанта; стрелками обозначены аномальные яйцевые камеры; Г - отсутствие перемычки между яйцевыми камерами у мутантной самки. Тройное окрашивание кольцевых каналов антителами к белку Шв (желтый - после совмещения с маркером актинового цитоскелета фаллои-дином (красный)) и ДНК (синий). Масштабная полоска 20 мкм.

Стерильность и нарушения в репродуктивной системе у /¿тс-мутантов говорят о том, что 1стс/&/2 функционирует в оогенезе самки и проявляет материнский эффект. Однако эти мутации не являются сильными, т.к. они не нарушают жизнеспособность. Поэтому мы получили гомозиготные по летальным !ст>с-аллелям клоны клеток, а также провели морфологический анализ яичников мозаичных самок.

Анализ материнского эффекта гена /а\усЛг/2

Клоны получали с помощью системы митотической рекомбинации П^Т/ЕЬР. РЬР-рекомбиназа находится под контролем промотора гена теплового шока и позволяет индуцировать митотические обмены между гомологичными РЯТ-сайтами с высокой частотой.

Мы внедрили БЯТ-сайты в геном исследуемых линий и совместили их с БЬР. Индукцию рекомбинации проводили у потомства на стадии личинки третьего возраста в течение 1 часа при температуре 37,5°С. Чтобы распознать гомозиготные по /¿ше-аллелям клоны, мы использовали линии, экспрессирую-щие вРР, при этом мутантные клоны были маркированы отсутствием ядерного ОБР. Мы использовали пять линий с летальными мутациями, вызванными нарушением экспрессии укороченной изоформы белка ТЯБ2 (№ 11982, 12254, 11945, 12295, 1(1)ЕЕ520), и две линии с мутациями, нарушающими экспрессию полноразмерной изоформы (1(1)1а\ус19, 1(1)1ам>с69). Общее количество просмотренных гомозиготных клонов - 100-150 по каждой линии.

Наиболее часто встречались нарушения, связанные с формированием и организацией эпителиального слоя фолликулярных клеток (ФК).

При сильных нарушениях яйцевые камеры покрывались ФК лишь частично, формируя бреши («лысые» цисты) (рис. 9А-В, Д). Такой дефект, очевидно, связан с нарушением деления мутантных ФК. Если же площадь мутантного клона была небольшой, то фолликулярный слой формировался, но форма клеток внутри него нарушалась, приобретая вид неправильных шестигранников варьирующих размеров (рис. 9Д, Ж, И).

ш

КЗ

Дополнительно мы отметили, что часть ядер ФК теряет свою апикальную локализацию (рис. 9 В-Г). Возможно, эти дефекты вызваны нарушением клеточной поляризации, которые требуют дополнительного исследования. Дефекты фолликулярного слоя были характерны для всех тестированных линий и наиболее часто проявлялись при повышенной температуре развития мозаиков.

Рисунок 9. Нарушения структуры эпителиального слоя фолликулярных клеток мутантных клонов. А-Г - продольный тангентальный (А-Б) и радиальный (В-Г) оптические срезы мозаичной яйцевой камеры, Г - область квадрата на В; стрелкой показано нарушение апикальной локализации ядер фолликулярных клеток; Д - мозаичные яйцевые камеры с разной площадью мутантных клонов, область верхнего квадрата представлена на Е, 3, а нижнего - на Ж, И; Е-И - структура клеточных стенок в клоне дикого типа (Е, 3) и мутант-ном (Ж, И). Актин - красный, ОБР - зеленый, ДНК - синий.

Нарушение формирования ФК уже встречалось при исследовании репродуктивной системы самок 1ст>с"3, когда овариолы представляли собой разросшиеся гермарии. Дополнительно у этих и других мутантов (1ам>ср<1е, нарушалась структура компонентов цитоскелета (спектросо-мы, фьюсомы, кольцевых каналов). Такие же дефекты встречались у мозаичных самок при клональном анализе. Например, у мозаиков ооцит при созревании часто не увеличивался в размерах (рис. 10В-Г). Кольцевые каналы таких фолликулов были заужены, и вокруг них формировался ненормальный слой акти-новых филаментов (рис. 10Е). Клеточные стенки трофоцитов и ооцита были дезорганизованы, а внутри клеток образовывались пучки актина.

щ

Другим признаком, характерным для жизнеспособных мутантов и мозаи-ков, было наличие лишь разветвлённых фьюсом (рис. 10И), характерных для поздних цист, и отсутствие спектросомсодержащих клеток (стволовых герминативных и цистобластов). Этот признак говорит о том, что мутантный герма-рий в зоне 1 - 2а не содержит ранних цист из-за ограниченного самовоспроизведения стволовых герминативных клеток.

Рисунок 10. Организация структурных компонентоЕ

цитоскелета в герминативные клетках мозаичных яичников.

А-Г - нормальная (А-Б) и мутантная (В-Г) яйцевая камера, звёздочкой показан ооцит; Д-Е - нормальноразвитый (Д) и аномальный (Е) кольцевой канал; Ж - общий вид мозаичных овариол; 3-И - структура цитоскелетных компонентов клеток гермария дикого типа (3) и мутантного клона (И), в мутантном гермарии нет спектросом, а на их месте находится уже разветвлённая фьюсома. И - область квадрата на Ж.

Актин - красный, СЕР - зеленый, ДНК - синий.

so Wt —■ -фьюсома-/'. í I $ спектросомо.» -

\ К11111 / «.IT « > гермарии _ jtr

1-

lawc, {' < ' " U i фьюсом^

У мозаиков с нарушенной экспрессией укороченной изоформы TRF2 встречались клоны яйцевых камер с малым количеством ядер (рис. 11 Д-Е, рис. 12). Такое нарушение было температурочувствительным и возникало при 18°С. У мозаиков с нарушенной экспрессией полноразмерной изоформы TRF2 этого дефекта не было.

Из литературных источников известно, что формирование малоядерных фолликулов происходит у мутантов по генам, контролирующим спектрин и ад-дуцин-подобный белок Hu-li tai shao (Hts). Эти мутации нарушают формирование фьюсомы. На всех этапах деления цистобласта фьюсома контролирует митоз, ориентируя веретено деления, и участвует в образовании цитоплазматиче-ских мостиков («кольцевых каналов») между клетками цисты. В наших экспериментах недоразвитая фьюсома встречалась у стерильных самок lawc"3 (рис. 53) и полустерильных самок lawcf''/l(l)EF520 (рис. 7Е). Таким образом, эти аллели могут вызывать недоразвитие фьюсомы, что приводит к нарушению митоза и дезорганизации клеток цисты.

Наряду с особенностями, характерными для вышеописанных стерильных мутантов, был выявлен ряд новых нарушений. Мы видели многоядерные яйцевые камеры (рис. 11Ж-3) и формирование 2-3 клеток, имеющих ооцитоподоб-ные ядра с низкой плоидностью и конденсированным хроматином (рис. 11 Б). Некоторые фолликулы содержали трофоциты с разноплоидными ядрами (рис. 11В-Г) или содержали несколько ядер в одной клетке, вероятно, из-за нарушения расхождения хромосом (рис. 11И-К).

Актин. wt Ш Актин- I, * '*

4«S J® GFP ■ С Е

1 м^'-т Ъ * * ./ L ••■'* '■*•• \ о !

Рисунок 11. Морфология яйцевых камер (клональный анализ). А - яйцевая камера дикого типа, Б-К - мозаичные яйцевые камеры (мутантный клон не содержит GFP): Б - в одной яйцевой камере три ооцитоподобные клетки, В-Г -увеличенное ядро трофоцита, Д-Е - яйцевая камера содержит один трофоцит, Ж - многоядерная яйцевая камера, 3 - ооцит имеет 5 кольцевых каналов (выделенная зона), И-К - трофоцит содержит несколько ядер. Звездочкой на А, Б и овальной линией на 3 показаны ооциты. Стрелками показаны мутантные герминативные клоны. Красный - актин; синий - ДНК; зеленый - GFP; желтый - Hts и актин. Масштабная полоска 40 мкм.

Фенотипы «многоядерные яйцевые камеры» и «формирование 2-3 клеток, имеющих ооцитоподобные ядра с низкой плоидностью и конденсированным хроматином» присущи мутантам, с нарушенной регуляцией клеточного цикла (циклин Е, string/cdc25, транскрипционный фактор stonewall (stwl')).

Ооцит многоядерной яйцевой камеры /awe-мутанта имеет не 4, а 5 кольцевых каналов (рис. 113). Это говорит о том, что во время деления цистобла-стов мутантные цисты претерпевали не 4, а 5 раундов митозов, в результате чего формировались не 16-ти, а 32-клеточные цисты. Разная плоидность ядер трофоцитов говорит о нарушении эндорепликации хромосом, а их нерасхождение, вероятно, вызвано дефектной компактизацией, выявленной нами в цитологических экспериментах.

Рисунок 12. Частота встречаемости и тип нарушений, индуцированных снижением экспрессии укороченной и полноразмерной изо-формы ТЯР2 в герминативных клетках яичников мозаичных самок.

Мы обнаружили, что большинство аномалий термочувствительны и некоторые из них характерны только для линий с нарушенной экспрессией укороченной изоформы (рис. 12 - формирование «малоядерных» фолликулов и «нескольких ооцитов» в одном фолликуле). Это говорит о том, что для контроля соответствующих процессов в герминативных клетках достаточно укороченной изоформы белка. Интересно, что к разноплоидности может приводить недостаток экспрессии обоих изоформ, но при разных условиях: полноразмерная больше влияет при 18°С, а укороченная - при 25°С. Это говорит о том, что в эндомитозе участвуют обе изоформы, но при нехватке одной из них другая может её компенсировать.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проделанной работы мы показали, что большинство мутаций 1ам/с являются аллелями ¡г/2, т.к. мутанты восстанавливают фенотип на фоне дополнительной экспрессии ТЯР2. Мы изолировали и исследовали летальные аллели 1стс!1г/2 с нарушенной экспрессией каждого из его продуктов. Впервые было обнаружено, что эволюционно вариабельный Ы-концевой район полноразмерной изоформы ТЯР2 обладает самостоятельной функциональной активностью. Природа этих мутаций в настоящее время исследуется.

При том, что плейотропный эффект /ам^с-мутаций уже хорошо описан, нам удалось обнаружить его новое проявление: нерасхождение хромосом, вызванное, очевидно, нарушением компактной структуры хромоцентра. Локализация белка ТЕ1Р2 в хромоцентре подтверждает выдвинутую другими авторами гипотезу о том, что этот белок может не только участвовать в транскрипции, но и выполнять структурные функции в организации хроматина.

Исследуя репродуктивную систему мозаичных самок, мы обнаружили, что снижение экспрессии каждой из двух изоформ 1ам>с/1г/2 в соматических фолликулярных клетках приводит к нарушению структурированности их эпителиального слоя, вызванному неправильной организацией актиновых микро-филаментов. Этот факт стал для нас неожиданным, т.к. ранее было показано, что этот белок локализуется преимущественно в ядрах герминативных, а не соматических фолликулярных клеток.

% 15

Частота и тип нарушений герминативных мутантных клонов

7.4 7,1

Укороченная изоформа ■ Полноразмерная изоформа

"О

V

•О*

Исследование мутантных клонов обнаружило участие короткой изофор-мы ТКБ2 в контроле циклического деления стволовых соматических клеток, дающих начало фолликулярному эпителию, так как снижение экспрессии этой изоформы приводило к полному отсутствию фолликулярного слоя и формированию «длинных» гермариев. Низкая экспрессия этой изоформы также вызывала нарушение самовоспроизведения стволовых герминативных клеток, о чём свидетельствуют «пустые» гермарии и отсутствие ранних цист. Анализируя яичники слабофертильных мутантов, мы впервые показали, что отсутствие дифференцировки ооцита сопровождается аномальной структурой кольцевых каналов и вызывается нарушением ооцитспецифичного транспорта, обеспечивающего ооциту его статус. Аномальные кольцевые каналы, нарушающие рост и созревание ооцита, были характерны и более зрелым мутантным яйцевым камерам, исследованным нами в ходе клонального анализа.

У мутантных клонов было выявлено много нарушений, связанных с регуляцией клеточного цикла. В основном они были в линиях с пониженной экспрессией укороченной изоформы ТИК. Однако лишний раунд деления и формирование 32-клеточных цист был характерен и для клонов линий с пониженной экспрессией полноразмерной изоформы.

Интересно проявил себя факт разноплоидности трофоцитов. Этот признак возникал при снижении экспрессии укороченной изоформы, но только при повышенной температуре развития мозаиков, и при снижении экспрессии полноразмерной изоформы, но в условиях пониженной температуры развития. Возможно, контролируя данный процесс, обе изоформы могут заменять друг друга.

Результаты данной работы лягут в основу для дальнейшего исследования функциональных особенностей сложно устроенного генного комплекса /аж> 1г/2, чтобы установить, какую группу генов в сложной иерархии процесса регуляции гаметогенеза дрозофилы он контролирует.

Выводы

1. Показано, что большинство летальных мутаций /¿nvc являются аллелями гена trß, кодирующего фактор базовой транскрипции. Идентифицированы 10 летальных мутаций lawc, которые вызваны снижением экспрессии укороченной изоформы TRF2, и три летальные мутации lawc, вызванные снижением экспрессии полноразмерной изоформы TRF2. Обнаружено, что эволюционно вариабельный N-концевой домен TRF2 D. melanogaster обладает самостоятельной функциональной активностью.

2. Впервые показано, что во время мейоза у самок /awe-мутантов происходит нерасхождение половых хромосом. Установлено, что причиной нерасхождения является нарушение структуры хромоцентра и спаривания гомологичных хромосом ооцита. Преимущественная локализация TRF2 в хромоцентре подтверждает его специфическую функцию в организации структуры хромоцентра.

3. Установлено, что продукт гена lawc/trf2 участвует в организации актиновых филаментов фолликулярного эпителиального слоя яичников и герминативных клеток цисты.

4. Показано, что нарушение дифференцировки ооцитов у слабофертильных самок /au'c-мутантов происходит из-за аномальных структур цитоскелета, обеспечивающих транспорт ооцитспецифичного белка Orb.

5. Было установлено, что большинство аномалий, выявленных в оогенезе при помощи клонального анализа, затрагивают регуляцию клеточного цикла и связаны с пониженной экспрессией укороченной изоформы TRF2, однако, в эндо-митозе трофоцитов могут участвовать обе изоформы, и при нехватке одной из них другая может её компенсировать.

6. Впервые обнаружено, что сильные мутации гена lawe/trß могут нарушать циклическое деление герминативных стволовых клеток и соматических фолликулярных стволовых клеток репродуктивной системы самок дрозофилы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Е.А. Модестова, Ю.Е. Воронцова, Л.И. Корочкин, О.Б. Симонова. Получение летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у D. melanogaster II ДАН, 2005. Т. 403, №4. С. 564-565.

2. Ю.Е. Воронцова, Модестова Е.А., Бурдина Н.В., Корочкин Л.И., О.Б. Симонова. Восстановление жизнеспособности летальных мутантов гена leg-arista-wing complex на фоне конструкций, экспрессирующих домены гена trß, у Drosophila melanogaster//ДАН, 2007. Т. 417, № 1. с. 133-135.

3. Симонова О.Б., Воронцова Ю.Е. Становление асимметрии в онтогенезе: ранняя поляризация герминативной цисты и ооцита у дрозофилы // Генетика, 2008. Т. 44, №9. С. 1157-1171.

Тезисы конференций:

4. Ю.Е. Воронцова, Модестова Е.А., Л.И.Корочкин, О.Б. Симонова. Использование молекулярно-генетических конструкций для восстановления жизнеспо-

собности летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у дрозофилы // Онтогенез, 2005. Т. 36, №5. С. 372-373.

5. Simonova О., Modestova Е., Vorontsova J., Korochkin L. leg-arista-wing complex mutations cause not only morphological abnormalities, but also chromosome non-disjunction. // 46th Annual Drosophila Research Conference. San Diego. USA, 2005. P. 144, 170B.

6. Ю.Е. Воронцова, E.A. Модестова, Л.И. Корочкин, О.Б. Симонова. Использование молекулярно-генетических конструкций для восстановления жизнеспособности летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у D. melanogaster. II VI Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток», г. Звенигород, декабрь 2005. С. 54.

7. Simonova О., Modestova Е., Kopantseva М., Vorontsova J., Burdina N., Korochkin L. Lethal and sterile mutations in leg-arista-wing complex: zygotic and maternal effects //47th Annual Drosophila Research Conference. Houston. USA, 2006. 481С.

8. Ю.Е. Воронцова, E.A, Модестова, Л.И.Корочкин, О.Б. Симонова. Роль гена leg-arista-wing complex в правильном расхождении хромосом и формировании гонад у Drosophila melanogaster // Материалы Международной Конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Москва, 2006. С. 38.

9. Ю.Е. Воронцова, Е.А. Модестова. Гомолог транскрипционного фактора млекопитающих TRF2 участвует в формировании гонад у дрозофилы // Всероссийская медико-биологическая научная конференция молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (X Всероссийская конференция «Человек и его здоровье»), С.-Петербург, 2007. С. 82-83.

10. Ю.Е. Воронцова, Е.А. Модестова, О.Б. Симонова. Роль гена leg-arista-wing complex в оогенезе у Drosophila melanogaster // Международная молодёжная научно-методическая конференция «Проблемы молекулярной и клеточной биологии». Томск, 2007. С. 51-52.

11. Ю.Е. Воронцова, О.Б. Симонова. Мутации гена lawc нарушают дифферен-цировку и деление стволовых герминативных и соматических фолликулярных клеток в репродуктивной системе самок дрозофилы // Конференция молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез, 2008. Т. 39. №4. С. 252.

12. О. Simonova, N. Burdina, J. Vorontsova, R. Cherezov, E. Modestova, I. Mertsa-lov, D. Kulikova. Two leg-arista-wing complex mutations disrupt different coding regions of TBP related factor 2 in Drosophila melanogaster II 49th Annual Drosophila Research Conference. San Diego. USA, 2008. P, 186,290B.

Заказ № 109/10/08 Подписано в печать 10.10.2008 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,25

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таП:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Воронцова, Юлия Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Генетический контроль ранней поляризации терминальной цисты и ооцита у дрозофилы.

1.1.1. Ранний оогенез у дрозофилы.

1.1.2. Формирование поляризованной цисты.

1.1.3. Следствие полярности фьюсомы: детерминация трофоцита против детерминации ооцита.

1.1.4. Ранняя поляризация ооцита.

1.1.5. Ориентация ооцита является связующим звеном между ранней и поздней поляризацией яйцевой камеры.

1.1.6. Сравнение ранних этапов оогенеза дрозофилы и ксенопуса.

1.2. Характеристика гена leg-arista-wing complex.

1.2.1. Взаимодействие leg-arista-wing complex с различными генами.

1.2.2. Характеристика различных аллелей гена lawc.

1.3. Фактор базовой транскрипции TRF2.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Культивирование Drosophila melanogaster.

2.2. Генетические методы.

2.3. Приготовление препаратов для микроскопии.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Восстановление жизнеспособности особей с летальными mvc-мутациями (rescue-тест).

3.1.1. Анализ музейных летальных /awe-мутаций.

3.1.2. Анализ лабораторных летальных /awe-мутаций.

3.1.3. Восстановление фенотипа у мутантных гетерозиготных самок lawc?1/1(l)EF520.

3.2. Исследование причин нерасхождения хромосом у 1а\\>с-мутантов

3.3. Нарушения в репродуктивной системе самок /аи>с-мутантов.

3.3.1. Анализ слабофертильных и стерильных самок.

3.3.2. Анализ материнского эффекта гена 1<теНгр.

3.4. Взаимодействие 1аюсЛг/2с генами митоза, мейоза и оогенеза.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль гена leg-arista-wing complex в процессе базовой и специфической транскрипции и формировании гонад у Drosophila melanogaster"

Актуальность проблемы. Создание и совершенствование мощных технологий, позволяющих детализировать молекулярные процессы, регулирующие развитие, привело к тесному сплетению генетики, клеточной биологии и биологии развития, и многие гены, которые, считалось, выступают в роли регуляторов основных биологических функций клетки (гены домашнего хозяйства), оказалось, обладают специфическими регуляторными функциями в развитии. Поэтому изучение особенностей проявления генов, кодирующих эволюционно консервативные факторы транскрипции, является актуальной проблемой.

Инсерционная мутация leg-arista-wing complex (lawc) дрозофилы, нарушающая правильную экспрессию многих локусов, была обнаружена в 1992 году в лаборатории Т.И. Герасимовой (ИОГен РАН) (Симонова и др, 1992). Район исследуемой инсерции был клонирован и картирован. Позднее в 1999 году в лаборатории Тиджена (Tjan, США) у дрозофилы был открыт ген, гомологичный гену человека и кодирующий фактор базовой транскрипции ТВР related factor 2 (TRF2), который принадлежит к эволюционно консервативному семейству белков ТВР (TATA-box binding protein) (Rabenstein et al., 1999). Однако границы этого гена не были установлены. В первую очередь эти трудности обуславливались отсутствием мутаций, локализованных в этой области. И только к 2003 году, когда полностью расшифровали геном дрозофилы, стало ясно, что клонированная часть последовательности lawc лежит на расстоянии примерно 15 т.п.н. от открытой рамки считывания гена trf2. Открытие и клонирование инсерционной мутации lawif1 сыграло важную роль в установлении границ гена trf2, в частности, района начала его транскрипции (совместная работа лабораторий П.Г. Георгиева, Ю.В. Ильина, Л.И. Корочкина, ИБГ РАН) (Копытова и др., 2005). В результате оказалось, что с одной мРНК trfl могут синтезироваться две изоформы белка (полноразмерная и укороченная), отличающиеся N-концевыми последовательностями. 4

Район локализации lawc (7Е район цитологической карты X-хромосомы дрозофилы) содержит блок нескольких летальных мутаций разной природы. Поэтому стало актуально изолировать аллели, нарушающие экспрессию конкретных изоформ TRF2.

Некоторые /от ус-мутации вызывают стерильность самок, другие аллели приводят к раннему старению организма. В настоящее время старение предположительно связывают с нарушением самовоспроизведения стволовых клеток в репродуктивной системе. Гаметогенез у дрозофилы исследован очень хорошо. Однако его генетический контроль изучен недостаточно. Например, неизвестно, каким образом происходит выбор ооцита среди шестнадцати клеток цисты, хотя уже ясно, что за его спецификацию отвечает недавно открытая цитоплазматическая структура, возникающая в стволовых клетках полового пути, названная фыосомой. Поэтому изучение генетической регуляции процессов идентификации ооцита и поддержания его статуса, а также самовоспроизведения стволовых герминативных клеток и старения предполагает исследование стерильных и слабофертильных мутантов у хорошо изученных модельных организмов.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в идентификации мутаций leg-arista-wing complex, нарушающих экспрессию каждой из изоформ фактора транскрипции TRF2, и изучении их влияния на оогенез у Drosophila melanogaster.

В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1) провести серию генетических экспериментов по исследованию влияния трансгенных конструкций, экспрессирующих различные белковые изоформы гена trf2, на фенотип летальных мутаций, локализованных в районе lawc-trf2;

2) провести цитологический анализ ядра ооцита поздних и ранних стадий развития в поисках причин нерасхождения хромосом в мейозе у lawc-мутантов;

3) исследовать особенности распределения белка TRF2 на политенных хромосомах слюнных желёз личинок дрозофилы;

4) изучить функциональные особенности lawc/trf2 в репродуктивной системе самок дрозофилы с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания яичников стерильных и слабофертильных мутантов ооцитспецифичными и другими маркерами;

5) исследовать материнский эффект летальных аллелей lawc с помощью клонального анализа и флуоресцентного окрашивания.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые были изолированы летальные аллели lawc с нарушенной экспрессией полноразмерной и укороченной изоформ белка TRF2. Установлено, что эволюционно вариабельный N-концевой район полноразмерной изоформы TRF2 обладает самостоятельной функциональной нагрузкой. Обнаружено, что нерасхождение хромосом в мейозе у /awc-мутантов вызвано нарушением структуры хромоцентра и спаривания гомологичных хромосом ооцита ранних стадий развития. Впервые показано, что продукт ген lawc/trfl участвует в формировании клеточного цитоскелета и связанного с ним транспорта ооцитспецифичного белка Orb. Обнаружено влияние, уровня экспрессии lawc/trfl на организацию актина в эпителиальных клетках яичника. Установлено, что стерильность /Wc-мутантов вызвана нарушением механизма дифференцировки герминативных и соматических фолликулярных клеток. Обнаружено, что у мутантов с сокращенной продолжительностью жизни отсутствует самовоспроизведение герминативных стволовых клеток.

Полученные данные являются основой для дальнейшего изучения функции гена lawc/trfl, а также помогут решить ряд спорных вопросов, касающихся взаимосвязей сигнальных путей в оогенезе у дрозофилы. Учитывая, что у позвоночных, в том числе у млекопитающих и человека, присутствуют гомологичные гены, то можно предположить, что полученные данные будут иметь универсальное значение.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на XIV школе по биологии развития (Звенигород, 2005), VI международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород,

2005), международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва,

2006), международном семинаре «Генетика репродукции насекомых и её практическое применение» (Москва, 2006), на всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2007), международной молодёжной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007), на конференции молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2007) и на 46-й, 47-й и 49-й Ежегодных исследовательских конференциях по дрозофиле (Сан-Диего, 2005; Хьюстон, 2006; Сан-Диего, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, их них 3 статьи в рецензируемых журналах и 9 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (91 источник). Содержит 21 рисунок и 10 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Воронцова, Юлия Евгеньевна

Выводы

1. Показано, что большинство летальных мутаций lawc являются аллелями гена trß, кодирующего фактор базовой транскрипции. Идентифицированы 10 летальных мутаций lawc, которые вызваны снижением экспрессии укороченной изоформы TRF2, и три летальные мутации lawc, вызванные снижением экспрессии полноразмерной изоформы TRF2. Обнаружено, что эволюционно вариабельный N-концевой домен TRF2 D. melanogaster обладает самостоятельной функциональной активностью.

2. Впервые показано, что во время мейоза у самок /mvc-мутантов происходит нерасхождение половых хромосом. Установлено, что причиной нерасхождения является нарушение структуры хромоцентра и спаривания гомологичных хромосом ооцита. Преимущественная локализация TRF2 в хромоцен-тре подтверждает его специфическую функцию в организации структуры хромоцентра.

3. Установлено, что продукт гена lawc/trß участвует в организации актино-вых филаментов фолликулярного эпителиального слоя яичников и герминативных клеток цисты.

4. Показано, что нарушение дифференцировки ооцитов у слабофертильных самок /ан'с-мутантов происходит из-за аномальных структур цитоскелета, обеспечивающих транспорт ооцитспецифичного белка Orb.

5. Было установлено, что большинство аномалий, выявленных в оогенезе при помощи клонального анализа, затрагивают регуляцию клеточного цикла и связаны с пониженной экспрессией укороченной изоформы TRF2, однако, в эндомитозе трофоцитов могут участвовать обе изоформы, и при нехватке одной из них другая может её компенсировать.

6. Впервые обнаружено, что сильные мутации гена lawc/trß могут нарушать циклическое деление герминативных стволовых клеток и соматических фолликулярных стволовых клеток репродуктивной системы самок дрозофилы.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из литературных данных известно, что укороченная изоформа TRF2 входит в состав макромолекулярного комплекса, включающего в себя DREF (DNA-replication-related element factor), и может контролировать транскрипцию генов клеточного цикла, клеточной пролиферации и генов, ответственных за репликацию ДНК, например, гена PCNA (the proliferating cell nuclear antigen) и гена, кодирующего а-субъединицу ДНК-пол имеразы (Hochheimer et al., 2002). Для полноразмерной изоформы подобной информации нет. К тому же, мало известно о конкретных генах-мишенях фактора транскрипции TRF2, функция которого исследовалась в основном биохимическими методами, и до последнего времени не было известно ни одной гипоморфной мутации этого гена.

В результате проделанной работы мы показали, что большинство мутаций lawc являются аллелями trf2, т.к. мутанты восстанавливают фенотип на фоне дополнительной экспрессии TRF2. Мы изолировали и исследовали ги-поморфные летальные аллели lawdtrfl с нарушенной экспрессией каждого из его продуктов. Впервые было обнаружено, что эволюционно вариабельный N-концевой район полноразмерной изоформы TRF2 обладает самостоятельной функциональной нагрузкой. Исследование фенотипа погибших эмбрионов из линии с пониженной экспрессией N-концевого района выявил у них недоразвитие трахейной системы, связанное с нарушением финальных этапов её формирования: слияния трахейных ветвей в единую сеть (Симонова, Бур дина, в печати). Природа этих мутаций в настоящее время исследуется.

При том, что плейотропный эффект /awe-мутаций уже хорошо описан, нам удалось обнаружить его новое проявление: нерасхождение хромосом, вызванное, очевидно, нарушением компактной структуры хромоцентра. Локализация белка TRF2 в хромоцентре подтверждает выдвинутую другими авторами гипотезу о том, что этот белок может не только участвовать в транскрипции, но и может также выполнять структурные функции в организации хроматина.

Исследуя репродуктивную систему мозаичных самок, мы обнаружили, что снижение экспрессии каждой из двух изоформ la\vc/trf2 в соматических фолликулярных клетках приводит к нарушению структурированности их эпителиального слоя, вызванного неправильной организацией актиновых микрофиламентов. Этот факт стал для нас неожиданным, т.к., ранее было показано, что этот белок локализуется преимущественно в ядрах герминативных, а не соматических фолликулярных клеток.

Важным компонентом, контролирующим организацию актина в различных видах эпителия, включая фолликулярные клетки яичника, является киназа Abelson (Abi) (Grevengoed Е.Е. et al. 2001). По нашим данным гапло-копия гена АЫ способна усиливать фенотип lawc-мутантов, что говорит о взаимодействие этих генов (Модестова, Симонова, не опубл.). Свидетельством взаимодействия lawc/trf2 с компонентами цитоскелета могут служить и другие наши генетические данные: жизнеспособные /т^оаллели гибнут на фоне гетерозиготных делеций генов lamininA, laminin у, Paramyosin, ответственного за формирование миофибрилл, и rliea, кодирующего талин - компонент цитоскелета, необходимый для прикрепления актина к плазматической мембране и связывания интегринов (Модестова, Симонова, не опубл.).

Исследование мутантных клонов обнаружило участие короткой изоформы lawdtrfl в контроле циклического деления стволовых соматических клеток, дающих начало фолликулярному эпителию, так как снижение экспрессии этой изоформы приводило к полному отсутствию фолликулярного слоя и формированию «длинных» гермариев. Низкая экспрессии этой изоформы также вызывала нарушение самовоспроизведения стволовых герминативных клеток, о чём свидетельствуют «пустые» гермарии и отсутствие ранних цист. Анализируя яичники слабофертильных мутантов мы впервые показали, что отсутствие дифференцировки ооцита в гермарии сопровождается аномальной структурой кольцевых каналов и вызывается нарушением ооцитспецифичного транспорта, обеспечивающего ооциту его статус. Аномальные кольцевые каналы, нарушающие рост и созревание ооцита, были характерны и более зрелым мутантным яйцевым камерам, исследованным нами в ходе клонального анализа.

У мутантных клонов было выявлено много нарушений, связанных с регуляцией клеточного цикла. В основном они были в линиях с пониженной экспрессией укороченной изоформы TRF2. Однако лишний раунд деления и формирование 32-клеточных цист был характерен и для клонов линий с пониженной экспрессией полноразмерной изоформы.

Интересно проявил себя факт разноплоидности трофоцитов. Этот признак возникал при снижении экспрессии укороченной изоформы, но только при повышенной температуре развития мозаиков, и при снижении экспрессии полноразмерной изоформы, но в условиях пониженной температуры развития. Возможно, контролируя данный процесс, обе изоформы могут заменять друг друга.

В настоящее время известно несколько мутаций {Hii-li tai shao, Dynein, a-spectrin и др.), нарушающих формирование фьюсомы и ооцита. Результаты последних исследований показали, что дифференцировку ооцита также контролируют гены-регуляторы клеточного цикла {encore, stonewall, string/cdc25, tribbless и др.), так как единственная клетка, которая проходит мейоз полностью, - это ооцит, а остальные (трофоциты) подвергаются поли-плоидизации в процессе эндомитоза. Другая группа генов - гены веретена {spindle, obra, aubergine, vasa, armitage и др.) - нарушают формирование ан-териопостериальных и дорзовентральных осей и останавливают дифференцировку ооцита путём ареста формирования кариосомы, мислокализации ооцита, неспособности удерживать цитоплазматические компоненты на заднем полюсе ооцита и дифференцировки второго проооцита в ооцит. Эта группа генов участвует либо в репарации двуцепочечных разрывов ДНК, либо в регуляции трансляционного сайленсинга при помощи микро-РНК и

РНК-интерференции. Обнаружено, что поляризацию могут контролировать ряд нейроспецифических генов (Notch, Delta, neuralized, big brain, mastermind и др.). Кроме того, известно, что при контакте ооцита с соматическими фолликулярными клетками происходит его реполяризация (ген Dystroglycan).

Эти процессы были исследованы благодаря наличию мутаций в контролирующих их генах, постановке иммунохимических экспериментов и клонального анализа клеток полового пути.

Результаты данной работы лягут в основу для дальнейшего исследования функциональных особенностей сложно устроенного генного комплекса lawc-trf2, чтобы установить, какую группу генов в сложной иерархии процесса регуляции гаметогенеза дрозофилы он контролирует.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воронцова, Юлия Евгеньевна, Москва

1. Инге-Вечтомов С.Г., Введение в молекулярную генетику. М., Высшая школа, 1983, 343 с.

2. Копытова Д.В., Краснов А.Н. Семейство белков TRF (ТВР-подобных факторов) // Генетика. 2007. Т. 43, №3. С. 317-322.

3. Копытова Д.В., Краснов А.Н., Симонова О.Б., Модестова Е.А., Корочкин Л.И., Георгнева С.Г. Изучение гена lawc-trfl Drosophila melanogaster и его белкового продукта// ДАН. 2005. Т.405. №1. С.125-127.

4. Лилли Р.Д. Патологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 1969. 645 с.

5. Модестова Е.А. Получение и молекулярно-генетическое исследование летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у Drosophila melanogaster II Автореферат канд. дис. М. 2005.

6. Модестова Е.А., Воронцова Ю.Е.,. Корочкин Л.И, Симонова О.Б. Получение летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у D. melanogaster II ДАН, 2005. Т. 403, №4. С. 564-565.

7. Модестова Е.А., Копытова Д.В., Георгнева С.Г., Симонова О.Б. Использование генетической системы химерного белка P-Ph для репрессии транскрипции гена leg-arista-wing complex у дрозофилы // Генетика. 2003. Т. 39. №5. С. 713-716.

8. Петрук С.Ф., Джагаева И.В., Солдатов A.B., Симонова О.Б. Клонирование гена гена leg-arista-wing complex (lawc) и анализ его мутантных производных у дрозофилы. // Генетика, 1998, 34, №3, с. 446-448.

9. Симонова О.Б. Новый транс-регуляторный локус дрозофилы // Генетика. 2000. Т.36. N11. С.1464 1474.

10. Чубыкин В.Л. Структура и функция хромоцентра в клетках яичников Drosophila melanogaster II Доктор, диссерт., Новосибирск. 2001

11. Ashburner M., Drosophila. A laboratory handbook. II Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 a. P. 1331.

12. Ashburner M., Drosophila. A laboratory manual. // Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 b., P. 434.

13. Boyd L., Guo S., Levitan D., Stinchcomb D.T., and Kemphues K.J. PAR-2 is asymmetrically distributed and promotes association of P granules and PAR-1 with the cortex in C. elegans embryos // Development. 1996. V. 122. P. 3075-3084.

14. Bullock S.L., and Ish-Horowicz D. Conserved signals and machinery for RNA transport in Drosophila oogenesis and embryogenesis // Nature. 2001. Y. 414. P. 611-616.

15. Carpenter A. Egalitarian and the choice of cell fates in Drosophila melanogaster oogenesis // In Germline development. J. Marsh and J. Goode /Eds. Chichester: John Wiley & Sons. 1994. P. 223-246.

16. CookH.A., Koppetsch B.S., Wu, J., and Theurkauf W.E. The Drosophila SDE3 homolog armitage is required for oskar mRNA silencing and embryonic axis specification // Cell. 2004. V. 116. P. 817-829.

17. Chou T. and Perrimon N. Use of a Yeast Sitespecific Recombinase to Produce Female Germline. // Genetics. 1992, V. 131, P. 643-653.

18. Escudero L.M., Caminero E, Schidze K.L., Bellen H.J., Modolell J. Charlatan, a Zn-finger transcription factor, establishes a novel level of regulation of the proneural achaete/scute genes of Drosophila // Development. 2005. V. 132 № 6 P. 1211-1222.

19. Januschke J., Gervais L., Dass S., Kaltschmidt J.A., Lopez-Schier H., St Johnston D., Brand A.H., Roth S., and Guichet A. Polar transport in the Drosophila oocyte requires Dynein and Kinesin I cooperation // Curr. Biol. 2002. V. 12. P. 1971-198.

20. Jones D.L. Aging and the germ line: where mortality and immortality meet // Stem Cell Rev. 2007 V. 3 № 3 P: 192-200.

21. Godt D. and Tepass U. Drosophila oocyte localisation is mediated by differential cadherin-based adhesion //Nature. 1998. V. 395. P. 387-391.

22. AO.Hawkins N.C., Thorpe J., and Schüpbach T. encore, a gene required for the regulation of germ line mitosis and oocyte differentiation during Drosophila oogenesis //Development. 1996. V. 122. P. 281-290.

23. Al.Hochheimer A., Zhou S., Zheng S., Holmes MC, Tjian R. TRF2 associares with DREF and directs promoter-selective gene expression in Drosophila // Nature. 2002. V.420. P.439-445.

24. Hochheimer A. and Tijan R. Diversified transcription initiation complexes expand promoter selectivity and tissuespecific gene expression // Genes & Dev. 2003, V. 17.P.1309-1320.

25. Hong A., Lee-Kong S., Iida T., Sugimura L, and Lilly M.A. The p27(cip/kip) ortholog dacapo maintains the Drosophila oocyte in prophase of meiosis I // Development. 2003. V. 130. P. 1235-1242.

26. Hoogenraad C.C., Wulf P., Schiefermeier N., Stepanova T., Galjart N., Small J.V., Grosveld F., de Zeeuw C.I., and Akhmanova A. Bicaudal D induces selective dynein-mediated microtubule minus end-directed transport // EMBO J. 2003. V. 22. P. 6004-6015.

27. Hurov, J.B., Watkins, J.L., and Piwnica- Worms, H. Atypical PKC phosphorylates PAR-1 kinases to regulate localization and activity // Curr. Biol. 2004 V. 14. P. 736-741.

28. Huynh J.R., Shulman J.M., Benton R., and St Johnston D. PAR-1 is required for the maintenance of oocyte fate in Drosophila // Development 2001 V. 128. P. 1201-1209.

29. Huynh J.R. and St Johnston D. The role of BicD, Egl, Orb and the microtubules in the restriction of meiosis to the Drosophila oocyte // Development. 2000. V. 127. P. 2785-2794.

30. Huynh J.R. and St Johnston D. The Origin of asymmetry: Early polarisation of the Drosophila germline cyst and oocyte // Curr. Biol. 2004. V. 14. P. 438-449

31. King R.C., Rubenson A.C., Smith R.F. Oogenesis in adult Drosophila melanogaster // Growth. 1956. V. 20. P. 121-157.

32. Lambert J.D. and Nagy L.M. Asymmetric inheritance of centrosomally localized mRNAs during embryonic cleavages // Nature 2002. V. 420. P. 682-686

33. Lehmann R. Egalitarian binds dynein light chain to establish oocyte polarity and maintain oocyte fate //Nat. Cell Biol. 2004 V. 6. P. 427^135.

34. Lin H. and Spradling A.C. Fusome asymmetry and oocyte determination in Drosophila //Dev. Genet. 1995. V. 16. P. 6-12.

35. Lin H., Yue L. and Spradling A.C. The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation // Development. 1994. V. 120. P. 947-956.

36. Lindsley, D.M., Zimm, G., The genome of Drosophila melanogaster NY: Academic Press, Inc. 1992 P. 1134.

37. Lighthouse DV, Buszczak M, Spradling AC. New components of the Drosophila fusome suggest it plays novel roles in signaling and transport // Dev Biol. 2008. V. 317 № l. P. 59-71.

38. Lyczak R., Gomes J.E. and Bowerman B. Heads or tails: cell polarity and axis formation in the early Caenorhabditis elegans embryo // Dev. Cell 2002. V. 3. P. 157-166.

39. McGrail M. and Hays T.S. The microtubule motor cytoplasmic dynein is required for spindle orientation during germline cell divisions and oocyte differentiation in Drosophila//Development. 1997. V. 124. P. 2409-2419.

40. Navarro C., Puthalakath H., Adams J.M., S tras ser A. and Lehmann R. Egalitarian binds dynein light chain to establish oocyte polarity and maintain oocyte fate. //Nat. Cell Biol. (2004). V. 6. P. 427-435.

41. Neumann C. J. and Cohen S. M. A heirarchy of cross-regulation involving Notch, wingless, vestigial and cut organizes the dorsal/ventral axis of the Drosophila wing // Development. 1996. V. 122. P. 3477-3485.

42. Puro J., Nokkala S. Meitic segregation of chromosomes in Drosophila melanogaster oocytes. A cytological approach // Chromosoma. 1977. V. 63. P. 273-286.

43. Rabenstein M. D, Zhou S, Lis J. T., Tjian R. TATA box-binding protein (TBP)-related factor 2 (TRF2), a third member of the TBP family. // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. V. 96 № 9. P. 4791-4796.

44. Riechmann V., and Ephrussi A. Axis formation during Drosophila oogenesis // Curr. Opin. Genet. Dev. 2001. V. 11. P. 374-383.

45. Roper K., and Brown N.H. A Spectraplakin is enriched on the fusome and organizes microtubules during oocyte specification in Drosophila II Curr. Biol. 2004. V. 14. P. 99-110.

46. TLP/TRF2/TLF) negatively regulates cell cycle progression and is required forthe stress-mediated G(2) checkpoint // Mol Cell Biol. 2003. V. 23 P. 4106-4120.

47. Shulman J.M., Benton, R. and St. Johnston D. The Drosophila homolog of C.elegans PAR-1 organizes the oocyte cytoskeleton and directs oskar mRNAlocalisation to the posterior pole // Cell. 2000. V. 101. P. 1-20.

48. Spradling A. Developmental genetics of oogenesis // In The Development of

49. Drosophila melanogaster, 1993. V. 1, 1 Edition, M Bate and A. Martinez-Arias,eds. (New York: Cold Spring Harbor Laboratory press), P. 1-70.

50. Spradling A., Drummond-Barbosa D. and Kai T. Stem cells find their niche //

51. Kl.Theurkauf W.E. Microtubules and cytoplasm organisation during Drosophila oogenesis //Dev. Biol. 1994. V. 165. P. 352-360.- 105

52. Theurkauf W., Alberts M., Jan, Y. and Jongens T. A central role for microtubules in the differentiation of Drosophila oocytes // Development 1993. V. 118. P. 1169-1180.

53. Vaccari T., and Ephrussi A. The fusome and microtubules enrich Par-1 in the oocyte, where it effects polarization in conjunction with Par-3, BicD, Egl, and dynein // Curr. Biol. 2002 V. 12. P. 1524-1528.

54. Vas sin H., Vielmetter, Campos-Ortega J. A. Genetic interactions in early neurogenesis of Drosophila melanogaster II J. Neurogenet. 1985. V. 2. № 5. P. 291-308.

55. Vinot S., Le T., Maro B., and Louvet-Valle'e S. Two PAR6 Proteins Become Asymmetrically Localized during Establishment of Polarity in Mouse Oocytes // Curr Biol. 2004. V. 14. P. 520-525.

56. Xie T. and Spradling A.C. decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Cell. 1998 V. 94 № 2 P: 251-260.

57. Yamashita Y., Fuller M., Jones D. Signaling in stem cell niches: lessons from the Drosophila germline. // Journal of Cell Science. 2005. V. 118, P. 665-672

58. Wharton R.P., and Struhl G. Structure of the Drosophila Bicaudal-D protein and its role in localizing the posterior determinant nanos // Cell. 1989. V. 59. P. 881-892.

59. Написание этой работы было бы невозможным без поддержки множества людей. Я бесконечно благодарна своему научному руководителю, Ольге Борисовне Симоновой, за предложенную тему, ценные рекомендации, постоянное внимание и проявленное терпение.

60. Также выражаю благодарность безвременно ушедшему Леониду Ивановичу Корочкину и Галине Валерьевне Павловой за предоставленную возможность выполнить данную работу в их лаборатории, за проявленный интерес к работе и поддержку.

61. Особую благодарность хочу выразить Валерию Леонидовичу Чубыкину за любезно предоставленную методику приготовления давленых препаратов и обсуждение полученных результатов.

62. Неоценимую помощь в освоении методов иммунофлуоресцентного окрашивания мне оказали Марина Робертовна Копанцева, Александр Владимирович Ревищин, Татьяна Тимошенко и Дмитрий Пантелеев.

63. С особой признательностью благодарю Павла Васильевича Гулак за «уроки волшебства» по конфокальной микроскопии.

64. Я искренне благодарна Елене Модестовой за критические замечания при написании данной работы и Илье Мерцалову за ценные советы.

65. Выражаю благодарность Павлу Георгиевичу Георгиеву и Софье Георгиевной Георгиевой за любезно предоставленные трансгенные линии, а также Александру Владимировичу Ревищину и Евгению Цитрину за подаренные антитела.

66. И в заключение, хотелось бы поблагодарить всех сотрудников лаборатории нейрогенетики и генетики развития (ИБГ РАН), своих родных, близких и друзей, которые оказывали моральную поддержку и вдохновляли меня на «великие научные открытия».