Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизмов взаимодействия между промотором и энхансером у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов взаимодействия между промотором и энхансером у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 575 22 595 773 4

КОСТЮЧЕНКО МАРГАРИТА ВЛАДИМИРОВНА

Изучение механизмов взаимодействия между промотором и энхансером у ВгоъоркИа ntelanogaster

Специальность 03 00 26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Института биологии гена РАН

Научный руководитель'

Чл -корр РАН, доктор биологических наук, профессор Георгиев П Г

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук Любомирская Н В

Кандидат биологических наук Набирочкина Е Н

Ведущая организация Институт общей генетики им Н И Вавилова РАН

Защита диссертации состоится ^^ декабря 2005 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002 037 01 при Институте биологии гена РАН по адресу 119334, Москва, ул Вавилова, д. 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, д. 32

Автореферат разослан ноября 2005 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

канд фарм наук

2160124

Л9Л69

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Координированная работа (экспрессия) большого числа генов у эукариот возможна лишь благодаря наличию тонких регуляторных механизмов, определяющих место, время и уровень экспрессии конкретного гена или группы генов Для того чтобы экспрессия гена была регулируемой, он должен содержать индивидуальные последовательности ДНК, по которым компоненты генетической системы клетки могли бы безошибочно оказать на него необходимое воздействие Благодаря факторам транскрипции и регуляторным последовательностям генов становится возможным специфический синтез РНК и осуществляется регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции (Li et al, 2004, Butler et al, 2002) Цис-регуляторные элементы генов эукариот - это последовательности ДНК, расположенные вблизи промотора (от 30 до нескольких сотен пар оснований перед точкой инициации), а также дистальные элементы (энхансеры и сайленсеры) Оба класса таких последовательностей содержат сайты связывания белков, модулирующих транскрипцию (Cosma, 2002, Патрушев, 2000) Одной из особенностей регуляции транскрипции высших эукариот является способность энхансеров активировать транскрипцию гена независимо от ориентации, и находясь от промотора на расстоянии, которое может достигать нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов (Dorsett, 1999) Многие энхансеры не имеют специфичности к определенному промотору и способны активировать транскрипцию целого ряда генов (Butler et al, 2001) Так как в геноме гены располагаются часто достаточно близко друг к другу, возникает вопрос, каким образом энхансер взаимодействует с промотором своего гена и как предотвращается активация нежелательных промоторов, которые могут находиться в непосредственной близости от энхансера Несмотря на большое количество информации о различных уровнях регуляции транскрипции, механизм взаимодействия между энхансером и промотором на больших дистанциях остается до конца невыясненным

Известно, что в ряде случаев в обеспечении коммуникации между энхансером и промотором важную роль играют цис-регуляторные последовательности ДНК, найденные в промоторных областях эукариотических генов (Hapgood et al, 2001) Характеристика таких цис-регуляторных последовательностей и связывающихся с ними белковых факторов поможет лучше понять механизм энхансер-зависимой тканеспецифичной активации генов

В данной работе была поставлена задача картировать и изучить цис-регулягорные последовательности ДНК промоторных областей генов yellow и mmiwhite Drosophila melanogaster, которые могут отвечать за взаимодействие с энхансерами

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящего исследования являлось картирование и изучение в области промотора генов yellow и white Drosophila melanogaster цис-регуляторных последовательностей, которые могут определять активированную транскрипцию гена за счет коммуникации с энхансером и привлечения его к промотору

В работе были поставлены следующие задачи:

1 Создать модельную систему для изучения взаимодействия между энхансером и промотором на основе генов yellow и miruwhite Drosophila melanogaster, которая позволила бы m vivo оценивать и различать вклад тех или иных цис- i регуляторных элементов в энхансер-зависимый и базовый уровень экспрессии

генов.

2 Картировать и изучтъ в промоторной области генов yellow и minhvhite регуляторные последовательности, которые могут влиять на эффективность взаимодействия между энхансером и промотором

3 Изучить роль цис-регуляторных последовательностей ДНК в промоторных областях генов yellow и mmiwhite в обеспечении специфичности взаимодействия между энхансером и промотором

4 Уточнить роль белка Zeste в активации транскрипции гена mmrwhite при увеличении расстояния между энхансером и промотором по сравнению с исходным локусом и при делеции в области промотора

Научная новизна и практическое значение работы. В работе на основе генов yellow и mintwhite Drosophila melanogaster создана модельная система, которая позволяет in vivo изучать вклад цис-регуляторных элементов в энхансер-зависимую активацию транскрипции генов благодаря тому, что можно сравнивать экспрессию гена в трансгенных линиях мух в присутствии и в отсутствии энхансеров в одном и том же месте генома

Для гена yellow охарактеризованы ранее неизученные цис-регуляторные последовательности в области промотора, показано, что они обладают сходными функциями в обеспечении коммуникации между энхансерами и промотором и отсутствие одного может '

компенсировать другой элемент

В промоторной области гена mintwhite выявлена последовательность ДНК, которая является более сильным коммуникатором между энхансером и промотором гена mintwhite, чем исходная регуляторная область гена

Результаты, полученные в данной работе, свидетельствуют о том, что цис-регуляторные элементы в промоторных областях генов необходимы для успешной коммуникации между энхансером и промотором, что в свою очередь способствует

эффективной активации транскрипции, это может быть использовано для обеспечения специфичной активации экспрессии трансгенов в генно-инженерных конструкциях у разных организмов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Третьем съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров "Генетика в XXI веке' современное состояние и перспективы развития" (Москва, 2004), на Международной конференции "Химические и биологические проблемы протеомики" i (Новосибирск, 2004) и на межлабораторном семинаре ИБГ РАН (2005)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы Из них 2 статьи и 2 тезисов докладов и материалов конференций

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 107 страницах, включает 9 таблиц и 36 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 130 источников

Результаты исследования Анализ цис-регуляторных элементов в области промотора гена yellow.

Ген yellow Drosophila melanogaster экспрессируется на стадии средней и поздней куколки и определяет пигментацию тела, крыльев и производных кутикулы дрозофилы (Nash, Yarkin,1974, Geyer and Corees, 1987) Энхансеры, отвечающие за экспрессию гена yellow в теле и крыльях, были локализованы соответственно за 1,3-2,0 и 1,8-2,9 тп н перед началом транскрипции гена Энхансер, который определяет экспрессию гена в щетинках, половых гребешках и коготках, был локализован в интроне гена В присутствии энхансеров мухи имеют фенотип у* - черную пигментацию тела, крыльев и щетинок. В отсутствии энхансеров или при мутации в промоторе мухи имеют у' фенотип - желтую пигментацию тела, крыльев и щетинок В отсутствии энхансеров тела и крыльев - En(b) и En(w) - мухи имеют желтую окраску тела и крыльев и черные щетинки - у2 фенотип Было показано, что уровень экспрессии гена yellow прямо коррелирует с интенсивностью пигментации кутикулы, поэтому степень экспрессии гена можно определять с помощью простого визуального анализа фенотипа мух (Geyer and Corees, 1987, Martín et al., 1989). Таким образом, ген yellow регулируется набором тканеспецифичных энхансеров и его экспрессию легко оценивать визуально, что делает этот ген интересной моделью для изучения взаимодействия между энхансерами и промотором

Целью данной работы было картирование и изучение в области промотора гена yellow регуляторных последовательностей, которые могут определять активированную транскрипцию гена за счет коммуникации с энхансером и привлечения его к промотору, т к для гена yellow Drosophila melcmogaster такие цис-регуляторные последовательности неизвестны В результате сравнения последовательностей ДНК регуляторной области гена yellow у D melcmogaster и других видов Drosophila, кроме базовых элементов промотора -TATA-box и Inr был выявлен ряд элементов, содержащих последовательности ДНК, несущие короткие повторы, которые могут служить потенциальными сайтами связывания для регуляторных белков, участвующих в активации транскрипции гена (рис 1)

Узкая тканеспецифичность экспрессии гена yellow и отсутствие культур специализированных клеток у Drosophila melanogaster не позволяют применять стандартные методы поиска регуляторных последовательностей в области промотора, такие как, метод торможения в геле и футпринтинг Поэтому для тестирования предполагаемых цис-регуляторных последовательностей ДНК была создана модельная система с использованием трансгенных конструкций (Rubin et al, 1982, Kares et al, 1984) Для получения трансгенных линий мух был использован вектор на основе Р-транспозона CaSpeR3 Этот вектор содержит ген mintwhite, который определяет пигментацию глаз и служит маркером для отбора трансформантов В вектор был встроен фрагмент ДНК, содержащий кодирующую область гена yellow (Geyer et al, 1987) Перед кодирующей областью гена yellow в CaSpeR клонировали регуляторную область гена, содержащую энхансеры тела и крыльев, окруженные сайтами FLP-рекомбиназы дрожжей - FRT-сайтами Сайт-специфичная рекомбинация между FRT-сайтами дает возможность удалять изучаемый элемент, и, таким образом, сравнивать экспрессию гена в трансгенных линиях мух в присутствии и в отсутствии энхансеров в одном и том же месте генома (Golic et al, 1989)

•т

tagggtaccgaaaggtatttcggcacaaatcagcgcagttttaaatgtcgatgaaggccaaaaatcataccaaacccagcgaa

aggtgatgtctgactcattaaattgggggattcgagtgtatttattaaacatgcgtgaaaatcaatcatggaagacaaaacgcaaa

"1f4 -142 -118 -100

qttfloccpatctatqggaaclpcataa jCCACOgattacccgaacactgaalCCACCtcgaatcactaaaalCCACCIga t t -146

.82 - 86 -60_-J3

aqltdGCGCGCGCfcttcqttttcattttcattqgcctiGTCTTCGTCTTCtogaaaaaaaaaccttcaTATAAAAcgcg -70 J7 |ТАТА-Ь«|

gccgacatattatggccaccagtcgtt

И

Рис.1. Фрагмент нуклеотидной последовательности промоторной области гена yellow Drosophila melanogaster. Обозначения TATA-box и старт транскрипции (Inr), взяты в рамку, последовательности ДНК перед промотором, содержащие короткие повторы Цифрами указаны расстояния от старта транскрипции гена и границы делеций (отмечены стрелками)

Созданная на основе данного вектора модельная система имеет важное преимущество, тк позволяет т vivo оценивать и различать вклад тех или иных цис-регуляторных элементов в энхансер-зависимый и базовый уровень экспрессии гена yellow

На основе CaSpeR вектора, содержащего гены miniwhite, yellow и его регуляторную область, несущую энхансеры тела и крыльев, окруженные FRT-сайтами, был создан ряд конструкций с различными делециями в регуляторной области гена yellow у-Д270, у-Д76, у-Д23, у-Д54 и у-А53 (рис 2) При помощи микроинъекций в эмбрионы конструкции были интегрированы в геном Drosophila melanogaster, затем трансформантов выявляли по окраске глаз С помощью Саузерн-блот анализа отбирались только те линии, которые содержали единичные инсерции полноценной конструкции в геноме Для анализа фенотипов в исходных трансгенных линиях и в производных использовали 3-5 дневных гетерозиготных самцов, результаты сравнивали с контрольными мухами с известным фенотипом

Трансгенная конструкция у-Д270 содержала делецию 270 п н в регуляторной области гена yellow от -340 п н до -70 п н относительно старта транскрипции Таким образом, оставался только проксимальный GTCTTC - мотив (положение -49 - -60 п н), a GC -богатая последовательность (позиция -85 + -92 п н) и 3 элемента, содержащие CCACC-мотив (область -100 -142 пн), были удалены (рис 2) В результате введения данной конструкции в геном Drosophila бьши получены трансформанты, которые обладали низким уровнем пигментации тела, крыльев и щетинок, имели У фенотип (табл 1) При индукции вырезания энхансеров тела и крыльев с помощью сайт-специфичной рекомбинации по FRT-сайгам степень пигментации мух не изменялась (табл 1) Необходимо отметить, что энхансер щетинок, находящийся в первом интроне гена, также не действовал на промотор - щетинки всех мух были желтые По-видимому, такая делеция от -340 п н до -90 п н относительно старта транскрипции в регуляторной области гена yellow влияет не только на способность энхансеров стимулировать промотор, но и на активность и функциональность самого промотора, и одного GTCTTC - мотива недостаточно для компенсации данной делеции

Для дальнейшего изучения регуляторной области гена yellow была сделана конструкция у-Д76, которая имела делецию 76 п н от -70 п н до -146 п н относительно начала транскрипции гена (рис 2) Трансформанты, содержащие такую делецию, имели промежуточную окраску щетинок и желтую окраску тела и крыловых пластинок (табл 1) При вырезании по FRT-сайтам энхансеров тела и крыльев фенотипы мух не изменялись В отличие от у-Д270 конструкции делеция у-Д76 почти не затрагивала функциональности промотора, так как в большинстве линий энхансер щетинок был способен активировать промотор yellow (табл 1) Однако, так же одного GTCTTC - мотива (положение -49 - -60 п н) было недостаточно для полной активации промотора всеми энхансерами

У-Д270

-5ТС- У*»««

+1 В®«

исходный фвнотил ЛЕп(л-»Ь) фенотип

yi yi

yellow mliriwhte

"^TWSssl "1 .1" Г^ейй [=—" -У2 -П

Jf / yHow mWwhte*

Rtl FRI

y^ -- , .52;---► ** У2

<5^ y«How

У-Д53 ■*—!C"X~'J-v 1111 | 'o ' > y+ y2

J^SbSf-1« -i*5* * y

FRi mi

Рис.2. Схемы конструкций у-Д270, у-Д76, у-Д23, у-Д54 и у-Д53 Обозначения стрелками на концах схем отмечены концы Р элемента, необходимые для интеграции конструкции в геном Энхансеры крыльев, тела и щетинок гена yellow - En(w), En(b) и En(br), соответственно, а также короткими вертикальными стрелками отмечены сайты узнавания Flp - (FRT) рекомбиназы Стрелками указаны направления транскрипции генов yellow и mmiwhile Блоками выделены предполагаемые регуляторные элементы в области промотора, цифрами обозначены границы делеций.

Таким образом, было показано, что последовательности, которые находятся между -70 п н и -146 п н, вероятно содержат регуляторные элементы, которые важны для активации энхансерами тела и крыльев промотора гена yellow

Следующая конструкция у-Д23, имела делецию элемента с -70 по -47 п н, в состав которого входил GTCTTC - мотив, таким образом, можно было выяснить функциональную значимость данной последовательности, а также проверить достаточно ли оставшихся предполагаемых элементов для активации транскрипции гена (рис 2) В результате трансформации в эмбрионы дрозофилы были получены линии, в которых все мухи имели темную пигментацию - у* фенотип При вырезании энхансеров тела и крыльев с помощью рекомбинации по FRT-сайтам трансформанты во всех линиях приобретали у* фенотип (табл 1) Это подтверждало активацию транскрипции гена энхансерами и позволило оценить влияние предполагаемых регуляторных элементов на энхансер-активируемую транскрипцию гена yellow А также показало, что двух дистальных элементов - GC - богатой

последовательности (-85 - -92 п н) и области, содержащей 3 ССАСС-мотива (-100 - -142 п н), достаточно для успешной активации промотора гена yellow При этом продемонстрировано, что последовательность с -70 по -47 п н, в состав которой входит GTCTTC - мотив, не является функционально важной ни для базовой, ни для активируемой транскрипции гена

Табл.1. Фенотипы трансгенных линий у-Д270, у-Д76, у-Д23, у-Д54 и у-Д53 Указано число исходно полученных линий и изменения в линиях при удалении энхансеров тела и крыльев - AEn(wb)

У-Д270 У-А16 у-£23 У-Д54 у-Д53

Ипс ¿En (wb) Исх. 11 Исх. II Исх ¿En Ш Исх ¿En <wb)

f - 16 линий 17 ДИКИЙ 9 линий

У1 8 ПИ1ЛПГ 8 лвихн 1« JSKKK - 17 люскк 9 лкяжй

f 12 jramat 12 лннкй 3 лпскк 3 лвняк - - - - - -

Для более детального изучения регуляторных последовательностей ДНК в области промотора были сделаны конструкции с небольшими делециями, затрагивающими только один из предполагаемых элементов Первая - конструкция у-Д54 содержала делецию 54 п н в регуляторной области с -154 п н по -100 п н относительно начала транскрипции гена, т е отсутствовала только область, содержащая 3 элемента с ССАСС-мотивом (-100 - -142 п н) (рис 2) В результате трансформации этой конструкции были получены трансгенные линии, в которых все мухи имели у* фенотип, следовательно, все энхансеры были способны успешно активировать транскрипцию гена (табл 1) При удалении по FRT-сайтам энхансеров тела и крыльев мухи становились у2 фенотипа, что продемонстрировало роль энхансеров в активации транскрипции, а также показало, что регуляторных элементов, расположенных проксимальнее точки -102 п н относительно старта транскрипции, достаточно для активации гена yellow.

Еще одна трансгенная конструкция у-Д53 была сделана для проверки роли самого дальнего от ТАТА-box предполагаемого рсгуляторного элемента в осуществлении коммуникации между энхансерами и промотором гена yellow - области, содержащей 3 ССАСС-мотива (-100 - -142 пн) Делеция 53 пн, созданная в этой конструкции, затрагивала последовательности от-100по-47пн относительно старта транскрипции, в эту область попадала и CG-богатая последовательность (рис 2) Были получены трансгенные линии мух, имевших у+ фенотип (табл 1) Таким образом, делеция проксимального района также не оказывала видимого эффекта на транскрипцию гена yellow, а вырезание энхансеров по FRT-сайтам, так же как и в предыдущих двух конструкциях, приводило к падению пигментации тела и крыльев мух (табл 1)

Роль регуляторных элементов промоторной области гена yellow в присутствии промотора гена white.

В экспериментах на трансгенных конструкциях у Drosophila melanogaster при исследовании специфичности действия энхансеров по отношению к типу промотора было показано, что существуют энхансеры, обладающие специфичностью к TATA или DPE типу промотора, или способностью активировать оба типа промоторов (Butleret al, 2001) Возможно, что в некоторых случаях цис-регуляторные последовательности ДНК в промоторных областях генов могут играть роль в обеспечении специфичности действия энхансера по отношению к типу базового промотора Поэтому, чтобы проверить это предположение, были созданы трансгенные конструкции, в которых TATA промотор гена yellow был заменен на чужеродный промотор гена white, относящийся к DPE типу промоторов Ранее, J Moms с соавторами (Morris et al, 2004) было показано, что если путем гомологичной рекомбинации заменять промотор гена yellow на чужеродный промотор, например, white, то такие мухи имеют темную пигментацию тела, крыльев и щетинок Это предполагает, что энхансеры гена yellow способны активировать промотор white до уровня у', те вероятно энхансеры тела и крыльев способны активировать оба типа промоторов (Morris et al, 2004) Необходимо отметить, что в данном случае, последовательность с -69 по +137 п н регуляторной области гена yellow была заменена на фрагмент с -63 по + 130 п н из промоторной области гена white Таким образом, отсутствовали ТАТА-Ьох и инициатор, но сохранялись старт кодон, кодирующая часть гена и ряд предпромоторных элементов гена yellow (рис 3) Основываясь на этих данных, нами была создана система трансгенных конструкций, содержащих ген minxwhite и ген yellow, включающий регуляторную область (с энхансерами тела и крыльев, окруженными FRT-сайтами) и несущий замену в промоторной области, на фрагмент промоторной области гена white Трансгенная конструкция y-A23-Pr(w) содержала участок регуляторной области гена yellow - 85 - -142 п н, в котором расположены оба предполагаемых регуляторных элемента GC - богатая последовательность (GC-box) и 3 элемента с ССАСС-мотивом (рис 4) Таким образом, в системе трансгенных конструкций воспроизводилась, полученная ранее в эндогенном локусе замена в регуляторной области гена yellow на фрагмент из промоторной области гена white В результате трансформации этой конструкции в геном Drosophila были получены линии мух с у* фенотипом, следовательно, все энхансеры были способны успешно активировать транскрипцию гена (табл 2) При вырезании энхансеров тела и крыльев с помощью рекомбинации по FRT-сайтам трансформанты во всех линиях приобретали у2 фенотип (табл 2) Это подтверждало, что активация транскрипции гена осуществляется именно энхансерами, а не является результатом конститутивной активации промотора гена white в

данной трансгенной системе Полученные данные показали, что области дистальнее -85 п н достаточно для осуществления успешной коммуникации между энхансерами и промотором в обеспечении активации гена yellow под контролем промотора white, что согласуется с результатами, полученными нами при делеционном анализе промоторной области гена

yellow. ytdow - 70

-иг -118 -100 -92 - 86 I

aadtXACCItqa//gaaC^CCbqa//aaajccACCfaaagttcCcacaC3Ct:tteqttttcatttt Irgctacotc

+1 -63 white

cgctatctctttcgccaccgtttgtagcgttacctagegteaatgtccgcct^ca£ttjge*etttgtcagcggttt

___ . tnr whK*

DPE promoter white .130

cgtfeaegaag|ctecaagcggtttacgccatcaatta//gtga>gttaegagtgattgtcagcttagagctaagtgc

yclfow t

aggttc yeiow+138

8UH Coiioil

Рис.3, Фрагмент нуклеотидной последовательности регуляторной области гена yellow Drosophila melcmogaster, содержащей промотор гена white Указаны последовательности, относящиеся к yellow (рамками выделены старт кодон и предполагаемые регуляторные элементы ССАСС и GC-box) Взяты в скобки последовательности гена white (рамками отмечен инициатор транскрипции и DPE промотор) Цифрами указаны расстояния различных элементов относительно старта транскрипции для каждого гена

у-Д23 Pr(w) исходный фмотип ДВМтЬ) ф.нотип

,о

рг*то<*г

¡ей ' у+ у2

гаг тт

Рис.4. Схема конструкций у-Д23-Рг(ду) Обозначения как на рис 2 Стрелками указаны направления транскрипции генов уеЧспч-Рг^) и ттту/Ьпе Блоками выделены предполагаемые регуляторные элементы в области промотора

Табл.2. Фенотипы трансгенных линий у-Д23-Рг(\у), у-Д53-Рг(\у), и у-Д54-Рг(\у) Указано число исходно полученных линий и изменения в линиях при удалении энхансеров тела и крыльев - ДЕп(шЬ)

Федо y-A23-Pjiw) y-AB-Pifw) y-A54-Pr(w)

Исх ДЕп (иЪ) Исх ¿En Исх АЕи ш

У* 12 линий - - - 15 линий

У3 - 12 линии 20 линий 20 линий - 15 линий

У1 - • - - - -

Для дальнейшего исследования нами была создана трансгенная конструкция у-Д53-Pr(w), которая содержала замену с -99 по +137 п н относительно старта транскрипции yellow на фрагмент с -63 по + 130 п н из промоторной области гена white (рис 5) В результате трансформации данной конструкции в геном Drosophila были получены трансформанты, которые обладали низким уровнем пигментации тела и крыльев, это говорило о том, что

9

оставшейся регуляторной области гена недостаточно для активации энхансерами тела и

крыльев промотора гена white

-а

♦1 DPE

tttgtagcgttacctagcgtcaatgtccgcct|tcagT^caetttgtcagcggtttcgt|gacgaä^tccaagcggttta

tnrvrtit» proaotw

cgecatcaattaaacacaaagtgctgtgecaaaaetcctctegcttettatttttgtttgttttttgagtgattggggtg

«Mit св<и

gtga>gttaagagtgattgtcagcttagagctaagtgca|ätg|tt<; +1Э0 yotlow

исходный фенотип ¿£n(w*b) фонотип

mlniwMu

1---► у+ у2

Рис.5. Схемы конструкций y-A53-Pr(w) и y-A54-Pr(w) Обозначения как на рис 2 Стрелками указаны направления транскрипции генов yellow-Pr(w) и mimwhite Блоками выделены предполагаемые регуляторные элементы в области промотора, цифрами обозначены границы делеции Для y-A53-Pr(w) конструкции приведен фрагмент нуклеотидной последовательности промоторной области гена yellow с заменой на промотор white для данной конструкции, все остальные обозначения как на рис 3

При вырезании по FRT-сайтам энхансеров тела и крыльев фенотипы мух не изменялись (табл 2) В отличие от данных, полученных при делеционном анализе, последовательности -100 - -142 п н, содержащей 3 ССАСС-мотива, в системе с чужеродным промотором оказалось недостаточно для привлечения энхансеров тела и крыльев к промотору

Для определения зависимости эффекта активации энхансерами гена yellow, находящегося под white промотором, от присутствия предполагаемого элемента регуляторной области - (GC-box) (позиция -85 - -92 п н ) была создана конструкция у-Д54-Pr(w), содержавшая делецию трех ССАСС-мотивов (-100 - -154 пн) (рис 5) Все трансформанты имели у* фенотип, следовательно, энхансеры были способны эффективно активировать транскрипцию гена (табл 2) При удалении по FRT-сайтам энхансеров тела и крыльев мухи становились у2 фенотипа, что продемонстрировало зависимость активации

У-Д54 Pr(w)

promoter

транскрипции гена от энхансеров, а также показало, что регуляторного элемента GC-box, расположенного -85 - -92 п н относительно старта транскрипции, достаточно для активации гена yellow, находящегося под контролем white промотора

Анализ нуклеотидной последовательности 5' регуляторной области гена white Drosophila melanogaster.

Ген white Drosophila melanogaster отвечает за пигментацию глаз и контролируется тканеспецифичным энхансером, обеспечивающим экспрессию в глазах мух (в дальнейшем -энхансер глаз) и в семенниках (Pirrotta et al, 1985) Транскрипция гена в глазном имагинальном диске определяется энхансером, который находится на расстоянии -1185 п н и -1454 п н пн от начала транскрипции гена white В присутствии энхансера глаза окрашены в ярко красный цвет, в его отсутствии глаза мух имеют оранжевый цвет (Pirrotta et al, 1985) Ген miniwhite был получен in vitro путем делеции значительной части первого интрона гена white. Ген miniwhite сохраняет способность активироваться энхансером и вследствие небольшого размера (около 4,5 т п н ) является популярной модельной системой для трансленных исследований у Drosophila melanogaster (Desset et al, 2005; Kassis, 2002, Qian et al, 1995) Промотор гена white (рис 6) относится к классу внутренних (DPE) промоторов, основой которых является последовательность между +26 и +32 пни сайт инициации транскрипции (Butler et al, 2001) В области промотора гена white были идентифицированы два сайта связывания для белка Zeste (-137 и -120 п н, соответственно). Белок Zeste был найден только у дрозофилы и часто имеет множественные сайты связывания (с канонической последовательностью Pyr-GAG-Pyr-G или САСТСА) в области энхансеров и промоторов генов (Pirrotta, 1991). Последовательность энхансера глаз гена white также содержит 5 сайтов для белка Zeste (Pirrotta, 1991) В некоторых случаях Zeste белок необходим для эффекта трансвекции, т е для взаимодействия между энхансером и промотором, находящихся на разных хромосомах (Pirrotta et al, 1999) В экспериментах in vitro было показано, что белок Zeste образует мультимерные комплексы, что может способствовать взаимодействию между энхансером и промотором (Pirrotta, 1991, Chen et al, 1993) На основании этого факта было сделано предположение, что Zeste определяет взаимодействие между энхансером и промотором гена white (Qian et al, 1992) Однако, инактивация гена zeste - мутация zv77h - приводит только к небольшому снижению транскрипции гена white (Pirrotta, 1991) Также необходимо отметить, что в экспериментах на трансгенных конструкциях было показано, что делеция двух сайтов связывания для белка Zeste, расположенных в промоторной области гена, не влияет на способность энхансера успешно активировать промотор гена white даже на фоне мутации zv77h (Qian et al, 1992)

mte 7W

a^GAGTftcaataaatttffiaartecaaaaa^aMflcarf^OTGbpttaptpalii^^

маидшплмкп MttHpawMa

attaacattjajgiaj«ccataagt}tc«ttrSlS£âia«ai<ttsjtOg«g9{jaaaÎaSISia«/-1179 -Ш.,,,

¡ИВ-Ш 1«Ц -1» J. I

прмтриоя

•MjtTvwkl»

caccgtttglagcgttacdag^caat^ccgccfMgt^cacttt^cagcg^ttcgt^x gaagfoccaagcgçfttacgccatcaattaaacacaaagtgctg

f

t

InrwMt

pfoniottr

tgccaaaadccictcg^cttep^gagfgattgggglgglgattggtfflgggtgggtaagcaggggaaaglglgaaaaatcccggce^tl^gc

Рис.6. Фрагмент нуклеотидной последовательности энхансера глаз и промоторной области гена minrwhite Drosophila melcmogaster. Наклонными линиями (с -1179 по -146 п н ) отмечено пропущенное на схеме расстояние между энхансером и промоторной областью гена Рамками выделены DPE-промотор, инициатор начала транскрипции и старт кодон, а также сайты связывания белка Zeste (5 сайтов узнавания в области энхансера и 2 сайта в области промотора гена) Квадратными скобками обозначена регуляторная последовательность в области промотора (-113 - -17) Стрелками указана делеция в промоторной области (-111 - -33) Цифрами указаны расстояния различных элементов относительно старта транскрипции гена

С помощью делеций в регуляторной области гена white было показано, что Zeste, по-видимому, не является единственным белком, обеспечивающим взаимодействие между энхансером глаз и промотором гена white (Pirrotta, 1991) Было продемонстрировано, что в коммуникации между энхансером и промотором гена white может также участвовать область, расположенная между -113 и -17 пн относительно старта транскрипции (Qian et al, 1992) (рис 6)

В этой связи, целью нашего исследования было уточнить роль белка Zeste в активации транскрипции гена miniwhite, а также картировать и изучить промоторную область гена для поиска других регуляторных последовательностей, которые могут влиять на эффективность взаимодействия между энхансером глаз и промотором гена

Для изучения роли белка Zeste во взаимодействии между энхансером и промотором гена minrwhite была создана модельная система с использованием трансгенных конструкций на базе вектора CaSpeR3 (Rubin and Sprandling 1982, Kares and Rubin 1984), содержащая ген minrwhite и энхансер глаз Еп(е), который был окружен сайтами FLP-рекомбиназы дрожжей -FRT-сайтами Это давало возможность индуцировать при помощи теплового шока вырезание

Значение белка Zeste во взаимодействии между энхансером и промотором гена miniwhite Drosophila melanogaster зависит от расстояния между регуляторными элементами.

данного элемента и сравнивать экспрессию гена miniwhite в трансгенных линиях мух в присутствии и в отсутствии энхансера в одном и том же месте генома При помощи микроинъекций в эмбрионы, конструкции были интегрированы в геном Drosophila melcmogaster Определение фенотипов линий с единичными инсерциями полноценной конструкции в геноме проводили у 3-5 дневных самцов, в анализ брались гетерозиготы, что позволяло исключить возможные транс-эффекты между трансгенами сестринских хромосом В качестве контроля была создана конструкция En(e)-w, в которой энхансер глаз был встроен в полилинкер плазмиды CaSpeR3, что соответствовало расстоянию -425 п н от старта транскрипции гена mintwhite и было меньше, чем расстояние в исходном локусе (рис 7). При анализе экспрессии гена miniwhite в En(e)-w конструкции было показано, что мухи из всех трансгенных линий имели ярко окрашенные глаза (красного и ярко-красного цвета) Делеция энхансера глаз по FRT-сайтам приводила к снижению пигментации глаз мух из всех трансгенных линий до оранжевого и темно-оранжевого цвета, что соответствовало базовому уровню транскрипции гена mintwhite и продемонстрировало возможность активации промотора гена mintwhite энхансером глаз (табл 3) Как и ожидалось, введение мутации zy77h (полная инактивация гена zeste) не оказывало видимого эффекта на транскрипцию гена mintwhite, глаза у мух оставались красного и ярко-красного цвета Таким образом, в конструкции En(e)-w при близком расположении энхансера и промотора активированный энхансером уровень транскрипции гена miniwhite не зависел от белка Zeste Также мутация z"77h не влияла на степень окраски глаз, те сохранялась оранжевая пигментация глаз, в производных трансгенных линиях, в которых был делегирован энхансер глаз, т е базовый уровень транскрипции гена не зависел от мутации zy77h (рис 7), (табл 3) Полученные результаты согласовались с ранее полученными данными (Qian et al, 1992) и продемонстрировали адекватность созданной модельной системы для изучения взаимодействия энхансера и промотора гена mintwhite

Для выяснения будет ли белок Zeste необходим для взаимодействия между энхансером и промотором гена mmiwhite на расстоянии большем, чем в исходном локусе, нами была создана конструкция En(e)-X-w, в которой энхансер и промотор гена miniwhite были разделены фрагментом ДНК фага лямбда длиной около 3 т п н (Рис 7) Мухи из всех трансгенных линий имели ярко окрашенные глаза, при индукции вырезания энхансера глаз с помощью сайт-специфичной рекомбинации по FRT-сайтам, степень пигментации глаз падала во всех случаях, т е на расстоянии 3 т п н энхансер успешно активировал промотор (табл 3)

En(.)

miniwhit*

En(e)-w

En(.)

mintwhfte

xdna

FUT ^^^Htt

En(e)-À-w

ГЯГ

XDNA

« ,—

' ' ~ V* -

sîoM

miniwtiit«

En(e)-A-wS

Рис.7. Схемы конструкций En(e)-w, En(e)-l-w и En(e)-X-wS Обозначения стрелками на концах схем отмечены концы Р элемента, необходимые для интеграции конструкции в геном Энхансер гена miniwhite - En(e), Su(Hw) инсулятор - Su(Hw), фрагмент ДНК фага X равный 3 т п н - X DNA. Вертикальными линиями обозначены сайты связывания белка Zeste - 5 сайтов в области энхансера Еп(е) и 2 сайта в промоторной области, короткими стрелками отмечены сайты узнавания Flp рекомбиназы - (FRT), прямоугольником обозначена регуляторная последовательность в области промотора

Однако, при вырезании энхансера в половине исследованных линий пигментация падала до базового уровня транскрипции (табл 3) В то время как в другой половине линий с делегированным энхансером уровень транскрипции гена падал ниже базового, глаза мух становились светло-желтого или желтого цвета, наблюдалась мозаичность окраски (табл 3)

Надо отметить, что недостатком гена miniwhite как модельной системы для анализа взаимодействия между энхансером и промотором является чувствительность его экспрессии к влиянию окружающих регуляторных последовательностей, т е эффекту положения (Roseman, et al, 1993) Поэтому для защиты экспрессии гена от негативных эффектов окружающего хроматина с З'-конца гена miniwhite последующих конструкций встраивали Su(Hw) инсулятор (Roseman, et al, 1993). Для исследования роли белка Zeste в En(e)-X-w конструкции бьша использована мутация z°77h При введении данной мутации в 4 из 8 линий было отмечено значительное снижение пигментации глаз до уровня без энхансера и ниже, но в то же время в половине линий степень пигментации глаз оставалась прежней - красного или ярко-красного цвета (табл 3)

Для дальнейшего исследования на базе En(e)-X-w была создана конструкция Еп(е)-А,-wS, в которой с З'-конца гена miniwhite был встроен Su(Hw) инсулятор (рис 7) При трансформации этой конструкции в геном мух во всех линиях наблюдалась активация энхансером транскрипции гена miniwhite (табл 3) При вырезании по FRT-сайгам энхансера глаз фенотип мух изменялся - глаза становились оранжевого и темно-оранжевого цвета, таким образом, в присутствии Su(Hw) инсулятора при удалении энхансера во всех линиях наблюдался базовый уровень транскрипции

Табл.3. Фенотипическое проявление гена ттт>ИНе в исследованных трансгенных линиях Еп(е)-ш, Еп(е)А-\у и Ел^-Х-тув Указано число исходно полученных линий и изменения в производных линиях' с делегированным энхансером гена ттмИие ДЕ(е), с мутацией г"7П и одновременным ДЕе, г"т Для каждой конструкции указано количество линий, имевших данный тип окраски глаз

окраска глаз конструкций-^, и ее производны6\ белая светло-желтая желтая оранжевая ô S _ s 1Ï е 1 коричневая красно-коричневая красная ярко красная

En(e)-w - - - - - - - 4 12

ДЕп(е) - - - 10 6 - - - -

zv77h - - - - - - - 4 12

ДЕп(е)/77" - - - 10 6 - - - -

En(e)-X-w - - - - - - - 3 5

ДЕп(е) - 2 2 4 - - - - -

v77A Z - 1 1 2 - - - 2 2

- 2 2 4 - - - - -

En(e)-^wS - - - - - - - 2 18

ДЕп(е) - - - 16 4 - - - -

v77h Z - - - 2 3 2 2 2 9

ДЕп(е)/77" - - - 16 4 - - - -

Введение мутации zv77h в ряде линий влияло на способность энхансера активировать промотор: в 5 линиях степень пигментации глаз падала до уровня без энхансера, в 4 линиях наблюдалась промежуточная степень окраски глаз - коричневая и красно-коричневая, т е энхансер мог только частично активировать промотор гена mimwhtte В остальных 11 линиях мух на фоне мутации zv77h степень окраски глаз не изменялась, сохранялась яркая пигментация глаз На основе полученных данных, можно предположить, что в ряде случаев белок Zeste необходим для поддержания взаимодействия между энхансером и промотором гена mmiwhile на расстоянии 3 т п.н

Следующим шагом исследования была проверка роли белка Zeste в трансгенной конструкции En(e)-y-w, где в качестве расстояния между энхансером и промотором гена miniwhite использовалась последовательность гена yellow - около 6,5 тпн Энхансер глаз был окружен сайтами FLP-рекомбиназы дрожжей, FRT-сайтами, и был встроен между энхансерами тела и крыльев гена yellow (рис 8).

Рис.8. Схема конструкции En(e)-y-w Отмечена последовательность rem yellow равная 6,5 т.п.н -yellow, все остальные обозначения как на рис 7

В результате трансформации En(e)-y-w конструкции были получены трансгенные линии мух с ярко окрашенными глазами, что предполагает активацию промотора гена энхансером (табл 4) При удалении энхансера гена miniwhite у всех трансформантов Еп(е)-у-w конструкции наблюдалось падение степени пигментации глаз до базового уровня, что подтвердило роль энхансера глаз в активации транскрипции Введение мутации zv77h сильно влияло на способность энхансера активировать промотор, степень пигментации глаз падала до уровня без энхансера во всех исследованных линиях (табл 4) Полученные данные показали, что при увеличении расстояния между энхансером и промотором гена miniwhite до 6,5 т п н активация транскрипции становится строго зависимой от присутствия белка Zeste

Табл.4. Фенотипическое проявление гена miniwhite в исследованных трансгенных линиях En(e)-y-w Обозначения как в табл 3

\окраска гдаз колет- рукция иее\ производные белая светло желтая желтая оранжевая темно-оранжевая коричневая красно-коричневая красная ярко красная

En(e)-y-w - - - - - - - 4 8

ДЕп(е) - - - 10 2 - - - -

zv77h - - - 10 2 - - - -

àEn(é),z""h - - - 10 2 - - - -

Роль белка Zeste во взаимодействии между энхансером и промотором гена miniwhite при делеции в регуляторной области гена.

Как было показано ранее, участок между -113 и -17 пн относительно старта транскрипции также может участвовать в коммуникации между энхансером и промотором гена miniwhite (Qian et al, 1992) (рис 6) В системе трансгенных конструкций при делеции данной области было показано, что если энхансер глаз расположен близко к промотору, то отсутствие белка Zeste незначительно снижает транскрипцию гена miniwhite (Qian et al, 1992) Для выяснения, насколько зависимой от белка Zeste будет система, содержащая делецию регуляторной последовательности от -111 п н до -33 п н в области промотора (рис 6), при увеличении расстояния между энхансером и промотором, была сделана конструкция En(e)-X-A-wS (Рис 9) Трансформанты имели красную, красно-коричневую пигментацию глаз, что было на 1-2 балла ниже уровня окраски глаз дикого типа, но, тем не менее, показывало, что энхансер глаз действует на промотор, т к при делеции энхансера во всех линиях мух пигментация падала до базового уровня (табл 5) Мутация zv77h существенно снижала степень пигментации глаз во всех исследованных линиях до уровня без энхансера Таким образом, инактивация белка Zeste в En(e)-X-à-wS конструкции оказывала сильное

влияние на способность энхансера активировать промотор гена тт\vhUe даже на расстоянии 3 т п н. (Рис 9), (табл 5)

Ш ИРМА УШУ**

0ЯШШШШШШШШШШЛЩ НА——ищ-Еп(в)-А-Д^3

Рис.9. Схема конструкции Еп(е)-Х-Д-\у8. Все обозначения как на рис 7

Табл.5. Фенотипическое проявление гена ттткие в исследованных трансгенных линиях Еп(е)-Х-Д-\у8 Обозначения как в табл 3

\окраска ко нет- рукция и ее\ производные белая светло желтая желтая оранжевая темно-оранжевая коричневая красно-коричневая красная ярко красная

En(e)-X-A-wS - - - - - - 6 3 -

ДЕп(е) - - 4 5 - - - - -

zv7Jh - - 4 5 - - - - -

ДЕп(е),г"//я - - 4 5 - - - - -

В то же время базовый уровень активности промотора гена mimwhite, содержащего делецию, также не зависел от белка Zeste, те фенотипы производных линий ДЕп(е) и ДЕп(е)^"77'1 не отличались Полученные данные подтверждают существенную роль белка Zeste в поддержании коммуникации между энхансером и промотором, данный механизм способен обеспечивать успешное взаимодействие между регуляторными элементами при делеции в области промотора гена miniwhite.

Su(Hw) иисуляторов недостаточно для осуществления взаимодействия между энхансером и промотором гена miniwhite при делеции в регуляторной области гена.

Как было показано ранее, два Su(Hw) инсулятора, расположенные между энхансером и промотором гена, нейтрализуют действие друг друга и способны организовывать локальные взаимодействия между регуляторными элементами в геноме Таким образом, не исключено, что инсуляторы могут способствовать коммуникации энхансера и промотора на больших дистанциях (Muravyova, 2001). Основываясь на этих данных, мы предполагали, что без специфичных для локуса регуляторных элементов, те при делеции в промоторной области и на фоне мутации z'77h, энхансер глаз, тем не менее, будет способен активировать промотор гена miniwhite в присутствии двух Su(Hw) инсуляторов (рис 10)

В этой связи бьша создана трансгенная конструкция En(e)-S-y-S-Aw, которая содержала делецию -111 п н - -33 п н в регуляторной области гена miniwhite (рис 10) В качестве расстояния между энхансером и промотором гена miniwhite использовалась последовательность гена yellow - около 6,5 т п н Энхансер глаз был окружен сайтами FLP-

17

рекомбиназы дрожжей, FRT-сайтами, и был встроен между энхансерами тела и крыльев гена yellow Кроме этого En(e)-S-y-S-Aw конструкция содержала два Su(Hw) инсулятора один Su(Hw) инсулятор был расположен между группой энхансеров и промотором гена yellow, а другой - между генами yellow и miniwhite (рис 10) При трансформации En(e)-S-y-S-Aw конструкции в геном мух были получены трансгенные линии, глаза мух большинства линий имели темную окраску красную или красно-коричневую, что свидетельствовало об активации транскрипции гена miniwhite

Еп{<

ь Ч

Su(Ww)

H

En(e)-S-y-S-iiw

Рис.10. Схема конструкции En(e)-X-A-wS Отмечена последовательность гена yellow, все остальные обозначения как на рис 7.

Для оценки активации транскрипции энхансером, во всех линиях была индуцирована сайт-специфическая рекомбинация по FRT-сайтам, что позволило делегировать энхансер Во всех полученных линиях наблюдалось снижение пигментации глаз до базового уровня (табл 6) При введении мутации zy77h во всех исследованных линиях степень пигментации глаз падала до уровня окраски без энхансера, те для успешной коммуникации между энхансером и промотором были необходимы специфичные для гена miniwhite механизмы, связанные с белком Zeste и регуляторной последовательностью в области промотора Таким образом, было показано, что пара инсуляторов скорее создает возможность взаимодействий, каким-то образом организует локус (нейтральный по отношению к транскрипции структурный элемент), а непосредственная коммуникация обеспечивается за счет механизмов свойственных только данной энхансер-промоторной паре

Табл.б. Фенотипическое проявление гена miniwhite в исследованных трансгенных линиях En(e)-S-y-S-Aw. Обозначения как в табл 3

\окраска конст-\, рукция и ее\ производные белая светло желтая 1 желтая оранжевая темно-оранжевая коричневая красно-коричневая 1 красная ярко красная

En(e) S-y-S-Aw - - - - - - 6 4 -

ДЕп(е) - - 3 7 - - - - -

zv77h - - 3 7 - - - - -

ДЕп {€)/"" - - 3 7 - - - - -

Роль цис-регуляторных элементов во взаимодействии между энхансером и промотором гена miniwhite.

Как было показано ранее, последовательность между -113 и -17 пн относительно старта транскрипции также может участвовать в коммуникации между энхансером и

18

промотором гена mmiwhite (Qian et al , 1992) Область перед промотором гена mmiwhite от -111 пн до -33 пн содержит два элемента ДНК с высокой степенью гомологии -CTCTTTCGCC (Рис 6), которые предположительно могут участвовать в поддержании взаимодействия между энхансером и промотором гена Чтобы проверить, обладает ли возможный регуляторный сайт функциональностью, была создана трансгенная конструкция En(e)-X-4R-wS (рис 11) В данной конструкции последовательность гена mimwhite между -111 п н и -33 п н бьша замещена на ДНК фрагмент, состоящий из 4-х копий GCCGTCTCTTTCGCCGCTG последовательности (позиция -59 - -78 пн) (рис6), расположенных в одной ориентации и встроенных в место делеции с учетом ориентации исходной последовательности в промоторной области В результате трансформации Еп(е)-Х-4R-wS в эмбрионы дрозофилы были получены трансгенные линии, в которых все мухи имели ярко окрашенные глаза (табл 7) При вырезании энхансера глаз с помощью рекомбинации по FRT-сайтам, трансформаты во всех линиях имели оранжевую окраску глаз, что соответствовало базовому уровню транскрипции и подтверждало роль энхансера в активации транскрипции гена, а также продемонстрировало, что 4-х кратный GCCGTCTCTTTCGCCGCTG элемент не является активаторной последовательностью При введении мутации г"77'1 выяснилось, что отсутствие белка Zeste не оказывало видимого эффекта на транскрипцию гена mimwhite (табл 7) Таким образом, в конструкции En(e)A-4R-wS активированный энхансером уровень транскрипции гена mimwhite не зависел от белка Zeste Полученные результаты позволяют предположить, что 4-х кратный GCCGTCTCTTTCGCCGCTG фрагмент (позиция -59 - -78 п н ) является более сильным коммуникатором между энхансером и промотором гена mmiwhite, чем исходная регуляторная область от -111 п и до -33 п н , и способен полностью компенсировать как делецию перед промотором, так и увеличение расстояния между энхансером и промотором гена mimwhite

Рис.11. Схема конструкции En(e)-X-4R-wS Прямоугольниками обозначены мультиплицированные сайты предполагаемого регуляторного элемента, все остальные обозначения как на рис 7

Для дальнейшего выяснения роли регуляторной последовательности в области промотора (-111 - -33 пн) и мультиплицированного GCCGTCTCTTTCGCCGCTG элемента (позиция -59 - -78 п н ) в коммуникации между энхансером и промотором гена mimwhite оба фрагмента были окружены lox-сайтами, которые узнаются Сге рекомбиназой

Еп(*>

ни •«,»"

Табл.7. Фенотипическое проявление гена тттШе в исследованных трансгенных линиях Еп(е)-Х-4К-\у8, Еп(е)-^-Д1<,х-\у8 и Еп(е)-Х-4К|м^5. Обозначения как в табл 3

окраска глаз конструида-и^е производные белая светло-желтая желтая оранжевая темно-оранжевая коричневая 6 £ в|я красная ярко красная

Еп(е)-Х-4Я^8 - - - - - - - 3 9

ДЕп(е) - - - 8 4 - - - -

- - - - - - - 3 9

ДЕп(е)/77'' - - - 8 4 - - - -

Еп(е)-Зи-Д1ох-\*8 - - 1 2 1 - - - -

ДЕп(е) - - 1 2 1 - - - -

г"77'1 - - 1 2 1 - - - -

ДЕп(е)/77" - - 1 2 1 - - - -

Еп(е)-Хт4Ио*^8 - - 4 2 2 - - - -

ДЕп(е) - - 4 2 2 - - - -

у77/| 2 - - 4 2 2 - - - -

ДЕп(е)/77'' - - 4 2 2 - - - -

Это дает возможность удалять исследуемые элементы из трансгенных линий мух, и сравнивать экспрессию гена ттмШе в присутствии и отсутствии этих элементов (Siegal, 2000) С этой целью были созданы трансгенные конструкции Еп(е)-Х-Д1о*-л¥8 и Еп(е)-Х-4К|ох-ууБ, в которых последовательность гена ттюИие между -111 п н и -33 п н была окружена 1ох-сайтами или замещена на 4-х кратный (ЗССОТСТСI"1 "IСССССЗСТО фрагмент, также окруженный 1ох-сайтами (рис 12) В результате введения конструкций в эмбрионы дрозофилы были получены трансформанты, имеющие пигментацию глаз близкую к базовому уровню экспрессии гена тттЪНе При удалении по ШТ-сайтам энхансера глаз, а также при индукции сайт-специфичного вырезания изучаемого элемента по 1ох-сайтам, степень пигментации глаз во всех трансгенных линиях не изменялась (табл 7) Полученные данные позволяют предположить, что пигментация глаз в данных линиях определялась базовой транскрипцией с промотора и не активировалась энхансером глаз.

Рис.12. Схема конструкций Еп(е)-Х-Д1ох-\у8 и Еп(е)-Х-4Я1ох-\у8 Обозначения короткими стрелками отмечены сайты узнавания Ир - (ИЯТ) и Сге - (1ох) рекомбиназ, все остальные обозначения как на рис 7

Таким образом, промотор гена mimwhite в и En(e)-X-4R0X-wS линиях

был не способен взаимодействовать с энхансером Это можно объяснить тем, что в результате инсерции изучаемых фрагментов, окруженных lox-сайтами, происходит отдаление регуляторных элементов (сайтов белка Zeste и CTCTTTCGCC-элементов) от промотора, что в итоге приводит к нарушению расстояний и расположения регуляторных последовательностей относительно промотора Таким образом, полученные данные демонстрируют, что локализация регуляторных последовательностей перед промотором является строго детерминированной и увеличение расстояния примерно на 100 п н (длина одного lox-сайта) приводит к полной их инактивации

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изучение взаимодействия между энхансером и промотором в модельной системе гена yellow.

В данной работе на основе гена yellow Drosophila melanogaster нами создана модельная система, которая позволяет m vivo оценивать и различать вклад тех или иных цис-регуляторных элементов в энхансер-зависимый и базовый уровень экспрессии гена yellow благодаря тому, что можно сравнивать экспрессию гена в трансгенных линиях мух в присутствии и в отсутствии энхансеров в одном и том же месте генома

В результате делеционного анализа в промоторной области гена yellow Drosophila melanogaster был выявлен ряд цис-регуляторных элементов, которые могут служить потенциальными сайтами связывания для регуляторных белков, участвующих в энхансер-зависимой активации транскрипции гена Наиболее важной для успешной активации транскрипции гена энхансерами, является область -85 - -142 п н, которая содержит два регуляторных элемента GC - богатую последовательность (GC-box) и 3 элемента, содержащих ССАСС-мотив Интересно отметить, что нуклеотидные последовательности этих элементов полностью отличаются, однако они обладают сходными функциями в обеспечении коммуникации между энхансерами и промотором в модельной системе гена yellow, и отсутствие одного может компенсировать другой элемент

В системе с чужеродным промотором (при замене на промотор гена white), найденные регуляторные элементы отвечают за активацию транскрипции гена, за коммуникацию с энхансерами и привлечением их к промотору, т е обеспечивают специфичность взаимодействия В отличие от данных, полученных при делеционном анализе, последовательности -100 - -142 пн, содержащей 3 ССАСС-мотива, в системе с чужеродным промотором оказалось недостаточно для привлечения энхансеров тела и

крыльев к промотору Показано, что предположительные регуляторные сайты являются взаимозаменяемыми в контексте нативного промотора гена yellow, а в условиях чужеродного промотора, только GC-богатая последовательность способна отвечать за привлечение энхансера к промотору Вероятно, что данная последовательность может обеспечивать активацию транскрипции гена вне зависимости от типа промотора (TATA или DPE), тогда так второй элемент (область -100 - -142 п н), по-видимому, специфичен в отношении yellow промотора При сравнении нуклеотидных последовательностей промоторных областей гена yellow у разных видов Drosophila, филогенетически близких и отдаленных от Drosophila melanogaster - район, содержащий GC-богатую последовательность наиболее консервативен, возможно, данный цис-регуляторный элемент является более эволюционно древним

Согласно литературным данным GC-богатые элементы часто встречаются в регуляторных областях генов и могут участвовать в активации транскрипции (Hapgood et al, 2001) В частности, у млекопитающих метилирование остатков С в CpG-последовательности может оказывать влияние на транскрипцию как непосредственно через изменение эффективности связывания позитивных и негативных факторов транскрипции со своими регуляторными участками на ДНК, так и опосредованно через формирование неактивных в транскрипционном отношении участков хроматина (Zhao et а!, 2005) Кроме того, CpG-островки часто содержат сайты связывания фактора транскрипции Spl, который, взаимодействуя как с метилированными, так и неметилированными сайтами, предотвращает их исходное или дальнейшее метилирование (Brandéis et al, 1994) Полагают, что именно этот фактор может играть ключевую роль в постоянном поддержании генов домашнего хозяйства в неметилированном активном состоянии (Zhao et al, 2005) В ряде исследований показано, что транскрипционный фактор Spl связывается в непосредственной близости от промотора и может взаимодействовать с белками, связывающими последовательность энхансера, и тем самым образовывать функциональную петлю ДНК, в результате которой энхансер, взаимодействуя с промотором, стимулирует транскрипцию (Li et al, 1991, Li et al, 2004) Так же показано, что белок Spl сам по себе способен образовывать петлю ДНК за счет кооперативного связывания с двумя своими дистально расположенными сайтами (Su et al, 1991) Гомологи Spl белка найдены и у Drosophila melanogaster• buttonhead и /J-Spl гены участвуют в закладке сегментов головы и в развитии сенсорных органов дрозофилы (Wimmer et al, 1993)

Изучение взаимодействия между энхансером и промотором в модельной системе гена white.

При изучении взаимодействия между энхансером и промотором в модельной системе гена mimwhite Drosophila melanogaster, исследовали влияние увеличения расстояния между энхансером и промотором по сравнению с исходным локусом на активацию гена mmiwhite А также в промоторной области гена выявили регуляторную последовательность, которая может влиять на эффективность взаимодействия между энхансером и промотором гена mimwhite

В результате проведенного исследования нами было показано, что в ряде случаев белок Zeste необходим для поддержания эффективного взаимодействия между энхансером глаз и промотором гена mmiwhite на расстоянии 3 т п н , а при увеличении расстояния между энхансером и промотором гена до 6,5 т п н активация транскрипции становится строго зависимой от присутствия белка Zeste Полученные данные подтверждают существенную роль белка Zeste в поддержании коммуникации между энхансером и промотором, а также показывают, что данный механизм способен обеспечивать успешное взаимодействие между регуляторными элементами при делеции регуляторной последовательности (от -111 пи до -33 п н ) в области промотора гена mimwhite.

Как было показано ранее, последовательность между -113 и -17 пн относительно старта транскрипции также может участвовать в коммуникации между энхансером и промотором гена mmiwhite (Qian et al, 1992) При анализе последовательности от -111 п н до -33 п н перед промотором гена mmiwhite, обнаружено, что данная область содержит два элемента ДНК с высокой степенью гомологии - CTCTTTCGCC, которые предположительно могут участвовать в поддержании взаимодействия между энхансером и промотором гена Замена регуляторной последовательности гена mimwhite между -111 и -33 п н на 4 копии сайта предположительно ответственного за коммуникацию, приводит к более эффективному взаимодействию между энхансером и промотором гена mimwhite, которое, при этом, не зависит от белка Zeste Полученные результаты продемонстрировали, что 4-х кратный GCCGTCTCTTTCGCCGCTG фрагмент (позиция -59 - -78 п н ) является более сильным коммуникатором между энхансером и промотором гена mmiwhite, чем исходная регуляторная область от -111 п н до -33 пни способен полностью компенсировать как делецию перед промотором, так и увеличение расстояния между энхансером и промотором гена mimwhite

Таким образом, взаимодействие между энхансером и промотором гена mimwhite осуществляется при помощи двух возможных механизмов- через белки, связывающиеся с GCCGTCTCTTTCGCCGCTG-сайтами, или через белок Zeste Специфичность

взаимодействия между энхансером и промотором гена mimwhite также зависит от данных механизмов, т к использование других регуляторных элементов, таких как Su(Hw) инсуляторы, скорее создает возможность взаимодействий, каким-то образом организует локус (нейтральный по отношению к транскрипции структурный элемент), а непосредственная коммуникация обеспечивается за счет механизмов свойственных только данной энхансер-промоторной паре

Для коммуникации энхансера и промотора гена miniwhite также очень важны расстояния и взаимное расположение регуляторных последовательностей перед промотором, т к изменение расстояния между регуляторными элементами в промоторной области приводит к полной их инактивации

На основе полученных данных в модельных системах генов yellow и miniwhite Drosophila melanogaster можно предположить, что цис-регуляторньге элементы в промоторных областях генов необходимы для успешной коммуникации между энхансером и промотором, что в свою очередь способствует эффективной активации транскрипции Интересно отметить, что для генов yellow и mimwhite показана избыточность цис-регуляторных элементов, возможно, таким образом осуществляется подстраховка систем активации транскрипции генов эукариот Также показано, что специфичность взаимодействия между энхансером и промотором в изученных генах осуществляется за счет механизмов, свойственных только самой энхансер-промоторной паре, и определяется цис-регуляторными элементами Таким образом, характеристика цис-регуляторных элементов является первым шагом в исследовании и понимании механизмов взаимодействия между энхансером и промотором на расстоянии В дальнейшем, необходимо охарактеризовать тканеспецифичные белковые факторы, зная последовательности ДНК, можно проводить скрининги кДНК библиотек, например, в одногибридной дрожжевой системе или анализ делеционных наборов линий Drosophila melanogaster для поиска возможных транскрипционных факторов

ВЫВОДЫ

1 Созданы модельные системы для изучения взаимодействия между энхансером и промотором на основе генов yellow и miniwhite Drosophila melanogaster

2 В области промотора гена yellow выявлены два регуляторных элемента в положении -85 - -92 пн и -100 - -142 пн относительно старта транскрипции, которые участвуют в коммуникации между энхансерами и промотором гена

3 Для гена miniwhite установлено, что белок Zeste становится необходим для эффективного взаимодействия между энхансером и промотором гена в случае, если они находятся на расстоянии 3 т п н и больше и при делеции (от -111 п н до -33 п н ) в области промотора

4 В регуляторной области гена mimwhite выявлена последовательность ДНК (позиция -59 - -78 п н ), отвечающая за коммуникацию между энхансером и промотором Показано, что для взаимодействия энхансера и промотора гена miniwhite также важны расстояния и взаимное расположение регуляторных элементов перед промотором

5 Показано, что цис-регуляторные элементы, участвующие во взаимодействии между энхансером и промотором в системах генов yellow и miniwhite, являются избыточными, те каждый из них способен поддерживать нормальный уровень экспрессии соответствующего гена

6 Для генов yellow и mimwhite показан вклад цис-регуляторных элементов промоторных областей в обеспечение специфичности взаимодействия между энхансером и промотором

1 Костюченко М В , Савицкая Е Е, Каракозова М В , П Г Георгиев Исследование регуляторной области гена white Drosophila melcmogaster ДАН 2005 т405 №1

2 Костюченко М В , Георгиев П Г, Савицкая Е Е Промоторная область гена yellow Drosophila melcmogaster содержит избыточные регуляторные элементы ДАН 2004 т 399. №5 с 696-697.

3 Kostyuchenko М, Savitskaya Е, Georgiev Р Role of regulatory DNA sequences in mechanism of long-distance enhancer-promoter interactions in Drosophila melanogaster P 92 International Conference "Chemical & Biological Problems of Proteomics" (CBPP-2004) Russia, Novosibirsk 5-9 July 2004

4 Костюченко M В, Савицкая E E, Георгиев П Г Изучение механизмов взаимодействия между промотором и энхансером у Drosophila melanogaster Стр 311 Третий съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров "Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы развития" 6-12 июня 2004

список работ, опубликованных по теме диссертации

с 128-132

Для заметок

Для заметок

Для заметок

Заказ Mb 2200 Подписано в печать 22.11.2005 Тираж 80 экз. Усл. п.л. 1,05

ООО "Цифровичок", тел. (095) 797-75-76; (095) 778-22-20 '\V. j) www. cfr. ru; e-mail: mfo@cfr. ru

№ 2 5 1 7 f

РНБ Русский фонд

2006-4 29269

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Костюченко, Маргарита Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Базовые элементы эукариотических промоторов.

2.2. Проксимальные и дистальные регуляторные элементы эукариотических генов.

2.2.1. CpG островки.

2.2.2. UAS/URS элементы.

2.2.3. Энхансеры.

2.3. Регуляторные элементы ДНК, влияющие на экспрессию гена.

2.3.1. Пограничные последовательности.

2.3.2. Регуляторные области локусов (LCR).

2.3.3. Инсуляторы.

8и(Н\у)-инсулятор.

Инсуляторы регуляторной области Abd-B гена.

3 -глобиновый инсулятор.

2.4. Модели влияния инсуляторов на взаимодействие между энхансером и промотором.

2.5. Примеры взаимодействия энхансера и промотора на расстоянии.

2.5.1. Трансвекция.

2.5.2. Кооперативное действие цис-регуляторных элементов. GAGA-фактор.

2.5.3. Цис-регуляторные элементы в сложных локусах генов.

2.6. Исследование взаимодействия хроматина на больших дистанциях.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Генетические методы.

3.1.1. Линии и мутации Drosophila melanogaster, использованные в данной работе.

3.1.2. Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий.

3.1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite в трансгенных линиях.

3.1.4. Генетические скрещивания.

3.2. Программное обеспечение. Базы данных.

3.3. Биохимические методы.

3.3.1. Выделение ДНК из дрозофилы.

3.3.2. Саузерн-блотанализ.

3.3.3. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

3.3.4. Секвенирование плазмид и ПЦР продуктов.

3.3.5. Молекулярное клонирование.

3.3.6. Трансформация бактериальных клеток плазмидами.

3.3.7. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса.

3.3.8. Создание конструкций.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1.1. Анализ нуклеотидной последовательности 5' регуляторной области гена yellow Drosophila melanogaster.

4.1.2. Анализ цис-регуляторных элементов в области промотора гена yellow.

4.1.3. Роль регуляторных элементов промоторной области гена yellow в присутствии промотора гена white.

4.2.1. Анализ нуклеотидной последовательности 5' регуляторной области гена white Drosophila melanogaster.

4.2.2. Значение белка Zeste во взаимодействии между энхансером и промотором гена miniwhite Drosophila melanogaster зависит от расстояния между регуляторными элементами.

4.2.3. Роль белка Zeste во взаимодействии между энхансером и промотором гена miniwhite при делеции в регуляторной области гена.

4.2.4. Su(Hw) инсуляторов недостаточно для осуществления взаимодействия между энхансером и промотором гена miniwhite при делеции в регуляторной области гена.

4.2.4. Роль цис-регуляторных элементов во взаимодействии между энхансером и промотором гена miniwhite.

5.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1. Изучение взаимодействия между энхансером и промотором в модельной системе гена yellow.

5.2. Изучение взаимодействия между энхансером и промотором в модельной системе гена white.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизмов взаимодействия между промотором и энхансером у Drosophila melanogaster"

Координированная работа (экспрессия) большого числа генов у эукариот возможна лишь благодаря наличию тонких регуляторных механизмов, определяющих место, время и уровень экспрессии конкретного гена или группы генов. Для того чтобы экспрессия гена была регулируемой, он должен содержать индивидуальные последовательности ДНК, по которым компоненты генетической системы клетки могли бы безошибочно оказать на него необходимое воздействие. Благодаря факторам транскрипции и регуляторным последовательностям генов становится возможным специфический синтез РНК и осуществляется регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции (Levine et al., 2003; Butler et al., 2002). Цис-регуляторные элементы генов эукариот - это последовательности ДНК, расположенные вблизи промотора (от 30 до нескольких сотен пар оснований перед точкой инициации), а также дистальные элементы (энхансеры и сайленсеры). Оба класса таких последовательностей содержат сайты связывания белков, модулирующих транскрипцию (Cosma, 2002; Патрушев, 2000). Одной из особенностей регуляции транскрипции высших эукариот является способность энхансеров активировать транскрипцию гена независимо от ориентации, и находясь от промотора на расстоянии, которое может достигать нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов (Dorsett, 1999). Многие энхансеры не имеют специфичности к определенному промотору и способны активировать транскрипцию целого ряда генов (Butler et al., 2001). Так как в геноме гены располагаются часто достаточно близко друг к другу, возникает вопрос, каким образом энхансер взаимодействует с промотором своего гена и как предотвращается активация нежелательных промоторов, которые могут находиться в непосредственной близости от энхансера. Несмотря на большое количество информации о различных уровнях регуляции транскрипции, механизм взаимодействия между энхансером и промотором на больших дистанциях остается до конца невыясненным.

Известно, что в ряде случаев в обеспечении коммуникации между энхансером и промотором важную роль играют цис-регуляторные последовательности ДНК, найденные в промоторных областях эукариотических генов (Hapgood et al., 2001). Характеристика таких цис-регуляторных последовательностей и связывающихся с ними белковых факторов поможет лучше понять механизм энхансер-зависимой тканеспецифичной активации генов.

В данной работе была поставлена задача картировать и изучить цис-регуляторные последовательности ДНК промоторных областей генов yellow и miniwhite Drosophila melanogaster, которые могут отвечать за взаимодействие с энхансерами.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Костюченко, Маргарита Владимировна

6. выводы

1. Созданы модельные системы для изучения взаимодействия между энхансером и промотором на основе генов yellow и miniwhite Drosophila melanogaster.

2. В области промотора гена yellow выявлены два регуляторных элемента: в положении — 85 -92 п.н. и —100 ^ -142 п.н. относительно старта транскрипции, которые участвуют в коммуникации между энхансерами и промотором гена.

3. Для гена miniwhite установлено, что белок Zeste становится необходим для эффективного взаимодействия между энхансером и промотором гена в случае, если они находятся на расстоянии 3 т.п.н. и больше и при делеции (от -111 п.н. до -33 п.н.) в области промотора.

4. В регуляторной области гена miniwhite выявлена последовательность ДНК (позиция — 59 -78 п.н.), отвечающая за коммуникацию между энхансером и промотором. Показано, что для взаимодействия энхансера и промотора гена miniwhite также важны расстояния и взаимное расположение регуляторных элементов перед промотором.

5. Показано, что цис-регуляторные элементы, участвующие во взаимодействии между энхансером и промотором в системах генов yellow и miniwhite, являются избыточными, т.е. каждый из них способен поддерживать нормальный уровень экспрессии соответствующего гена.

6. Для генов yellow и miniwhite показан вклад цис-регуляторных элементов промоторных областей в обеспечение специфичности взаимодействия между энхансером и промотором.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Костюченко, Маргарита Владимировна, Москва

1. Belenkaya Т., Barseguyan K., Hovahannisyan H., Biryukova I., Kochieva E., Georgiev P. Pelement sequences can compensate for a deletion of the yellow regulatory region in Drosophilamelanogaster II Mol Gen Genet. 1998. V.259(l). P.79-87.

2. Bell A., West A., Felsenfeld G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators // Cell. 1999. V. 98. P. 387-396.

3. Bell A., West G., Felsenfeld G. Insulators and boundaries: versatile regulatory elements in the eukaryotic genome // Science. 2001. V.291. P.447-450.

4. Bell A., Felsenfeld G. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene // Nature. 2000. V.405. P.482-485.

5. Belozerov V., Majumder P., Shen P and Cai H. A novel boundary element may facilitate independent gene regulation in the Antennapedia complex of Drosophila II EMBO J. 2003. V.22.P.3113-3121.

6. Bi X. and Broach J. Chromosomal boundaries in S. cerevisiae // Curr. Opin. Genet. Dev. 2001. V. 11. P. 199-204.

7. Blackwood E., Kadonaga J. Going the distance: a current view of the enhancer action // Science. 1998. V.281. P.60-63.

8. Brandeis M., Frank D., Keshet I., Siegfried Z., Mendelsohn M., Nemes A. Spl elements protect a CpG island from de novo methylation // Nature. 1994. V.371. P.435-438.

9. Brasset E. and Vaury C. Insulators are fundamental components of the eukaryotic genomes // Heredity. 2005. V.94. P.571-576.

10. Butler J., Kadonaga J.T. The RNA polymerase II core promoter: a key component in theregulation of gene expression// Genes Dev. 2002. V.16. P.2583-2592.

11. Butler J., Kadonaga J.T. Enhancer-promoter specificity mediated by DPE or TATA corepromoter motifs // Genes Dev. 2001. V.15. P.2515-2519.

12. Cai H., Levine M. Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo //Nature. 1995. V.376. P.533-536.

13. Cai H. and Shen P. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity // Science. 2001. V.291. P.493-495.

14. Calhoun V. and Levine M. Long-range enhancer-promoter interactions in the Scr-Antp interval of the Drosophila Antennapedia complex // PNAS. 2003. V.100. P.9878-9883.

15. Capelson M., Corces V. Boundary elements and nuclear organization // Biology of the Cell. 2004. V.96. P. 617-629.

16. Chen J., Pirrotta V. Multimerization of the Drosophila zeste protein is required for efficient

17. DNA binding // EMBO J. 1993. V.12(5). P.2075-83.

18. Chung J., Whiteley M. and Felsenfeld G. A 5' element of the chicken beta-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila II Cell. 1993. V.74 P.505-514.

19. Chung J., Bell A., Felsenfeld G. Characterization of the chicken beta-globin insulator // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P.575-580.

20. Dean A. Chromatin remodelling and the interaction between enhancers and promoters in the beta-globin locus // Brief Funct Genomic Proteomic. 2004. V.2(4). P.344-354.

21. Dekker J., Rippe K., Dekker M. and Kleckner N. Capturing chromosome conformation // Science. 2002. V.295. P. 1306-1311.

22. Desset S., Vaury C. Transcriptional interference mediated by retrotransposons within the genome of their host: lessons from alleles of the white gene from Drosophila melanogaster II Cytogenet Genome Res. 2005. V.l 10. P.209-214.

23. Donze D. and Kamakaka R. Braking the silence: how heterochromatic gene repression is stopped in its tracks // Bioessays. 2002. V.24. P.344-349.

24. Dorsett D. Distant liaisons: long range enhancer-promoter interactions in Drosophila II Curr. Opin.Genet. Dev. 1999. V. 9. P. 505-514.

25. Duncan I. Transvection effects in Drosophila // Annu. Rev. Genet. 2002. V.36. P.521-556.

26. Engel J., Tanimoto K. Looping, linking, and chromatin activity: new insights into beta-globin locus regulation // Cell. 2000. V.l00. P.499-502.

27. Evans R., Fairley J. and Roberts S. Activator-mediated disruption of sequence-specific DNA contacts by the general transcription factor TFIIB // Genes Dev. 2001. V.15. P.2945- 2949.

28. Farkas G., Leibovitch В., Elgin S. Chromatin organization and transcriptional control of gene expression in Drosophila II Gene. 2000. V.253.P.117-136.

29. Farkas G., Gausz J., Galloni M., Reuter G., Gyurkovics H., Karch F. The Trithorax-like gene encodes the Drosophila GAGA factor // Nature. 1994. V.371. P.806-808.

30. Ferrari S., Carmine-Simmen K., Dusserre Y., Muller K., Fourel G., Gilson E. and Mermod N. Chromatin domain boundaries delimited by a histone-binding protein in yeast // J. Biol. Chem. 2004. V.279. P.55520-55530.

31. Festenstein R., Tolaini M., Corbella P., Mamalaki C., Parrington J., Miliou A. and Kioussis D. Locus control region function and heterochromatin-induced position effect variegation // Science. 1996. V.271. P.l 123-1125.

32. Fraser P., Grosveld F. Locus control regions, chromatin activation and transcription // Curr Opin Cell Biol. 1998. V.10. P.361-365.

33. Geyer P. The role of insulator elements in defining domains of gene expression // Curr. Opin. Genet. Dev. 1997. V.7. P.242-248.

34. Geyer P., Corces V. DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein // Genes Dev. 1992. V.6. P.1865-1873.

35. Geyer P., Corces V. Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of thq yellow locus in Drosophila melanogaster II Genes Dev. 1987. V.l. P.996-1004.

36. Geyer P., Green M., Corces V. Tissue-specific transcriptional enhancers may act in trans on the gene located in the homologous chromosome: the molecular basis of transvection in Drosophila IIEMBO J. 1990. V.9. P.2247-2256.

37. Golic K., Lindquist S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome 11 Cell. 1989. V.59. P.499-509.

38. Grosveld F. Activation by locus control regions? // Curr Opin Genet Dev. 1999. V.9. P. 152157.

39. Guarente L. Transcriptional coactivators in yeast and beyond // Trends Biochem. Sci. 1995. V.20. P.517-521.

40. Gubb D., Ashburner M., Roote J., Davis T. A novel transvection phenomenon affecting the white gene of Drosophila melanogaster I I Genetics. 1990. V.126. P.167—176.

41. Hapgood J., Riedemann J. and Scherer D. Regulation of gene expression by GC-rich DNA cis-elements. // Cell Biology International. 2001. V.25(l). P.17-31.

42. Hardison R. and Groudine M. A complex chromatin landscape revealed by patterns of nuclease sensitivity and histone modification within the mouse beta-globin locus // Mol. Cell. Biol. 2003. V.23. P.5234-5244.

43. Hark A., Schoenherr C., Katz D. CTCF mediates methilation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus // Nature. 2000. V.405. P.486-489.

44. Hu S. and Manley J. DNA sequence required for initiation of transcription in vitro from the major late promoter of adenovirus 2 // Proc. Nat. Acad. Sci. USA Biochemistry. 1981. V.78(2). P. 820-824.

45. Ishii K., Arib G., Lin C., Van Houwe G. and Laemmli U. Chromatin boundaries in budding yeast: the nuclear pore connection // Cell. 2002. V.109. P.551-562.

46. Jack J., Dorsett D., DeLotto Y. Expression of the cut locus in the Drosophila wing margin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer // Development. 1991. V. 113. P.735-747.

47. Kares R., Rubin G. Analysis of P transposable element functions in Drosophila II Cell. 1984.1. V.38. P.135-146.

48. Kassis JA. Pairing-sensitive silencing, polycomb group response elements, and transposon homing in Drosophila II Adv Genet. 2002. V.46. P.421-438.

49. Katsani K., Hajibagheri M., Verrijzer C. Cooperative DNA binding by GAGA transcription factor requires the conserved BTB/POZ domain and reorganizes promoter topology // EMBO J. 1999. V.18. P.698-708.

50. Kellum R., Schedl P. A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay//Mol. Cel. Biol. 1992. V.12. P.2424-2431.

51. Kennison J., Southworth J. Transvection in Drosophila II Adv. Genet. 2002. V.46. P.399-420.

52. Kennison J. The Polycomb and trithorax group proteins of Drosophila: trans-regulators of homeotic gene function//Annu. Rev. Genet. 1995. V.29. P.289-303.

53. Kioussis D. and Festensteint R. Locus control regions: overcoming heterochromatin-gene inactivation in mammals // Curr. Opin. Genetics & Development. 1997.V.7.P.614-619.

54. Kioussis D., Vanin E., deLange Т., Flavell R. and Grosveld F. Beta-globin gene inactivationby DNA translocation in gamma beta-thalassaemia // Nature. 1983. V.306. P.662-666.

55. Kornezos A, Chia W. Apical secretion and association of the Drosophila yellow gene product with developing larval cuticle structures during embryogenesis // Mol Gen Genet. 1992. V.235(2-3). P.397-405.

56. Kutach A. and Kadonaga J.T. The downstream promoter element DPE appears to be as widely used as the TATA box in Drosophila core promoters // Mol. Cell. Biol. 2000. V.20. P.4754-4764.

57. Lagrange Т., Kapanidis A., Tang H., Reinberg D. and Ebright R. New core promoter element in RNA polymerase Il-dependent transcription: Sequence-specific DNA binding by transcription factor IIB // Genes Dev. 1998. V.12. P.34-44.

58. Lehmann M. Anything else but GAGA: a nonhistone protein complex reshapes chromatin structure // Trends in Genetics. 2004. V.20(l). P. 15.-22.

59. Levine M., Tjian R. Transcription regulation and animal diversity // Nature. 2003. V.424. P.147-151.

60. Lewis E. The theory and application of a new method of detecting chromosomal rearrangements in Drosophila melanogaster И Am. Nat. 1954. V.88. P.225-239.

61. Li L., He S., Sun J., Davie J. Gene regulation by Spl and Sp3 // Biochem Cell Biol. 2004. V.82(4). P.460-471.

62. Li Q., Kenneth R. Fang X. and Stamatoyannopoulos G. Locus control regions // Blood. 2002. V. 100(9). P.3077-3086.

63. Li R., Knight D., Jackson S., Tjian R. and Botchan M. Direct interaction between Spl and the BPV enhancer E2 protein mediates synergistic activation of transcription // Cell. 1991. V.65. P.493-505.

64. Lin Q., Wu D. and Zhou J. The promoter targeting sequence facilitates and restricts a distant enhancer to a single promoter in the Drosophila embryo // Development. 2003. V.130. P.519-526.

65. Lindsley D., Zimm G. The genome of Drosophila melanogaster И Academic Press, New1. York. //1992.

66. Lis J. Promoter-associated pausing in promoter architecture and postinitiation transcriptional regulation//Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1998. V.63. P.347-356.

67. Lu L., Tower J. A transcriptional insulator element, the su(Hw) binding site, protects a chromosomal DNA replication origin from position effects // Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P.2202-2206.

68. Mahmoudi T. and Verrijzer C. Chromatin silencing and activation by Poly comb and trithorax group proteins // Oncogene. 2001. V.20. P.3055-3066.

69. Mahmoudi Т., Katsany K., Verrijzer C. GAGA can mediate enhancer function in trans by linking two separate DNA molecules // EMBO J. 2002. V.21. P. 1775-1781.

70. Marshall W., Fung J., Sedat J. Deconstructing the nucleus: global architecture from local interactions // Curr. Opin. Genet. Dev. 1997. V.7. P.259-263.

71. Martin M., Meng YB., Chia W. Regulatory elements involved in the tissue-specificexpression of the yellow gene of Drosophila II Mol Gen Genet. 1989. V.218(1). P. 118-26.

72. Martinez-Laborda A., Gonzalez-Reyes A., Morata G. Trans regulation in the Ultrabithorax gene of Drosophila: alterations in the promoter enhance transvection // EMBO J. 1992. V.l 1. P.3645-3652.

73. Mazo A., Mizrokhi L., Karavanov A. Suppression in Drosophila: su(Hw) and su(f) gene products interact with a region of mdg4 (gypsy) regulating its transcriptional activity // EMBO J. 1989. V.8. P.903-911.

74. Mihaly J., Hogga I., Barges S., Gallon M., Mishra R., Hagstrom К., Muller M., Schedl P., Sipos L., Gausz J., Gyurkovics H., Karch F. Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex // Cell. Mol. Life Sci. 1998. V.54. P.60-70.

75. Milot E., Strouboulis J., Trimborn Т., Wijgerde M., de Boer E., Langeveld A., Tan-Un K., Vergeer W., Yannoutsos N, Grosveld F. Heterochromatin effects on the frequency andduration of LCR-mediated gene transcription // Cell. 1996. V.87. P.105-114.

76. Morris J., Petrov D., Lee A., Chao-ting Wu. Enhancer choice in Cis and in Trans in

77. Drosophila melanogaster. role of the promoter // Genetics. 2004. V167. P.1739—1747

78. Morris J., Chen J., Filandrinos S., Dunn R., Fisk R., Geyer P., Wu C. An analysis of transvection at thq yellow locus of Drosophila melanogaster II Genetics. 1999. V.151. P.633-651.

79. Morris J., Chen J., Geyer P., Wu C. Two modes of transvection: enhancer action in trans and bypass of a chromatin insulator in cis II Proc Natl Acad Sci USA. 1998. V.95. P.10740-10745.

80. Muravyova E., Golovnin A., Gracheva E., Parshikov A., Belenkaya Т., Pirrotta V., Georgiev

81. P. Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulator // Science. 2001. V.291.1. P.495-498.

82. Mutskov V., Farrell C., Wade P., Wolffe A. and Felsenfeld G. The barrier function of an insulator couples high histone acetylation levels with specific protection of promoter DNA from methylation // Genes Dev. 2002. V.16. P. 1540-1554.

83. Nash N., Yarkin R. Genetic regulation and pattern formation: a study of the yellow locus in Drosophila melanogaster II Genet Res. 1974. V.24(l). P.l9-26

84. Orihara M., Hosono C., Kojima Т., Saigo K. Identification of engrailed promoter elements essential for interactions with a stripe enhancer in Drosophila embryos // Genes Cells. 1999. V. 4. P.205-218.

85. Osborne C., Chakalova L., Brown K., Carter D., Horton A., Debrand E., Goyenechea В., Mitchell J., Lopes S., Reik W. Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription//Nat. Genet. 2004. V.36. P.1065-1071.

86. Palla F., Melfi R., Anello L., Di Bernardo M., Spinelli G. Enhancer blocking activity located near the 31 end of the sea urchin early H2A histone gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. V.2212-2211.

87. Parnell Т., Geyer P. Differences in insulator properties revealed by enhancer blocking assays on episomes // EMBO J. 2000. V.19. P.5864-5874.

88. Pikaart M., Recillas-targa F., Felsenfeld G. Loss of transcriptional activity of a transgene is accompanied by DNA methilation and histone deacetylation and is prevented by insulators // Genes Dev. 1998. V.12. P.2852-2862.

89. Pirrotta V. The genetics and molecular biology of zeste in Drosophila melanogaster II Adv Genet. 1991. V.29. P.301-348.

90. Pirrotta V. Transvection and chromosomal trans-interaction effects // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V.1424. P.M1-M8.

91. Pirrotta V., Manrt E., Hardon E., Bickel S., Benson M. Structure and sequence of the Drosophila zeste gene // EMBO J. 1987. V.6. P.791-799.

92. Pirrotta V., Steller H., Bozzetti M. Multiple upstream regulatory elements control the expression of the Drosophila white gene // EMBO J. 1985. V.4. P.3501-3508.

93. Qian S, Pirrotta V. Dosage compensation of the Drosophila white gene requires both the X chromosome environment and multiple intragenic elements // Genetics. 1995. V.139(2).P.733-744.

94. Qian S., Varjavand В., Pirrotta V. Molecular analysis of the zeste-white interaction reveals a promoter-proximal element essential for distant enhancer-promoter communication // Genetics. 1992. V.131(1). P.79-90.

95. Raff J., Kellum R., Alberts B. The Drosophila GAGA transcriptional factor is associated with specific regions of heterochromatin throughout the cell cycle // EMBO J. 1994. V.13. P.5977-5983.

96. Reuter G, Spierer P. Position effect variegation and chromatin proteins // Bioessays. 1992.1. V.14. P.605-612.

97. Ringrose L., Chabanis S., Angrand P., Woodroofe C., Stewart A. Quantitative comparison of DNA looping in vitro and in vivo: chromatin increases effective DNA flexibility at short distances // EMBO J. 1999.V.18. P.6630-6641.

98. Rippe K. Making contacts on a nucleic acid polymer // Trends Biochem. Sci. 2001.V.26. P. 733-740.

99. Robinett C., O'Connor A., Dunaway M. The repeat organizer, a specialized insulator element within the intergenic spacer of the Xenopus rRNA genes // Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P.2866-2875.

100. Roseman R, Pirrotta V., Geyer P. The Su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects // EMBO J. 1993. V.12. P.435-442.

101. Rubin G., Sprandling A. Genetic transformation of Drosophila with transposable elementvectors // Science. 1982. V.218. P.348-353.

102. Sabbattini P., Georgiou A., Sinclair C., Dillon N. Analysis of mice with single and multiple copies of transgenes reveals a novel arrangement for the lambda5-VpreBl locus control region // Mol Cell Biol. 1999. V.19. P.671-679.

103. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual, Ed.2. Cold

104. Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY // 1989.

105. Sanger F., Nicken S., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc

106. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V.74. P.5463-5487.

107. Scott K., Geyer P. Effects of the Su(Hw) insulator protein on the expression of the divergently transcribed Drosophila yolk protein genes // EMBO J. 1995. V.14. P.6258-6279.

108. Siegal M., Hartl D. Application of Cre/loxP in Drosophila. Site-specific recombination andtransgene coplacement//Methods Mol Biol. 2000. V.136. P.487-495.

109. Su W., Jackson S., Tjian R., Echols H. DNA looping between sites for transcriptional activation: self-association of DNA-bound Spl // Genes Dev. 1991.V.5 P.820-826.

110. Suzuki Y., Tsunoda Т., Sese J., Taira H., Mizushima-Sugano J., Hata H., Ota Т., Isogai Т., Tanaka Т., Nakamura Y. Identification and characterization of the potential promoter regions of 1031 kinds of human genes // Genome Res. 2001. V.l 1. P.677-684.

111. Tolhuis В., Palstra R., Splinter E., Grosveld F. and de Laat W. Looping and interaction between hypersensitive sites in the active beta-globin locus // Mol. Cell. 2002. V.10. P. 1453— 1465.

112. Travers A. Chromatin modification by DNA tracking // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V.96. P.13634-13637.

113. Udvary A. Dividing the empire: Boundary chromatin elements delimit the territory of enhancers // EMBO J. 1999. V.l8. P. 1-8.

114. Walter M., Black В., Afshar G., Kermabon A., Wright Т., Biessmann H. Temporal andspatial expression of the yellow gene in correlation with cuticle formation and dopadecarboxylase activity in Drosophila development. // Dev Biol. 1991. V.147.P.32-45.

115. Webber A., Ingram R., Levorse J. et al. Location of enhancers is essential for imprinting of HI9 and Ig/2 // Nature. 1998. V.391. P.711-715.

116. West A. and Fraser P. Remote control of gene transcription // Human Molecular Genetics.2005. V.14(l). P.101-111.

117. West A., Gaszner M. and Felsenfeld G. Insulators: many functions, many mechanisms // Genes Dev. 2002. V.16. P.271-288.

118. Wilkins R. and Lis J. Dynamics of potentiation and activation: GAGA factor and its role in heat shock gene regulation // Nucleic Acids Res. 1997. V.25. P.3963-3968.

119. Wimmer E., Jackie H., Pfeifle C., Cohen S. A Drosophila homologue of human Spl is ahead-specific segmentation gene // Nature.1993. V.16(6456). P.690-694.

120. Wu C. and Morris J. Transvection and other homology effects // Curr. Opin. Genet. Dev. 1999. V.9. P.237-246.

121. Zhao C., Meng A. Spl-like transcription factors are regulators of embryonic development in vertebrates // Dev Growth Differ. 2005. V.47(4).P.201-211.

122. Zhong X., Krangel M. An enhancer-blocking element between alpha and delta gene segments within the human T cell receptor alpha/delta locus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P.5219-5224.

123. Zhou J., Levine M. A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embiyo // Cell. 1999. V. 99. P.567-575.

124. Муравьева E., Головнин А., Паршиков А., Георгиев П. Новые свойства Su(Hw) инсулятора // ДАН. 2001. т.378. №3. с.398-402

125. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. Наука. Москва// 2000

126. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. Мир. Москва // 1998