Роль Gypsy инсулятора в процессах трансвекции у Drosophila melanogaster

Кравченко, Елена Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль Gypsy инсулятора в процессах трансвекции у Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль Gypsy инсулятора в процессах трансвекции у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 575.22 595 773.4.

КРАВЧЕНКО ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

РОЛЬ БУРБУ ИНСУЛЯТОРА В ПРОЦЕССАХ ТРАНСВЕКЦИИ

У ОЯОБОРНИА МЕЬАЫСЮАМШ

Специальность 03 00 26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Института биологии гена РАН

Научный руководитель:

Чл -корр РАН, доктор биологических наук, профессор Георгиев П Г

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Крамеров Д А

кандидат биологических наук Коробко Е В

Ведущая организация Институт биологии развития им Н К Кольцова РАН

Диссертационного совета Д 002 037 01 при Институте биологии гена РАН по адресу 119334, Москва, у л Вавилова, д 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва, у л Вавилова, д 32

Защита диссертации состоится

декабря 2005 года в

час на заседании

Автореферат разослан ноября 2005 года

Ученый секретарь

Диссертационного совета

канд фарм наук

Грабовская Л С

22601Ц

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Геном высших эукариот содержит огромное количество генов и элементов их регуляции Регуляторные последовательности, такие как промоторы, энхансеры и инсуляторы, являются элементами, которые контролируют транскрипцию в пространстве и времени Энхансеры способны активировать транскрипцию с промотора гена-мишени независимо от их ориентации и расстояния до точки начала транскрипции. Некоторые энхансеры могут быть расположены на расстоянии около 100 Kb и более от промотора-мишени (Rollins et al 2004) Однако до сих пор остаётся неясным, каким образом происходит коммуникация между энхансером и промотором, которые находятся на большом расстоянии друг от друга.

Спаривание гомологичных хромосом - процесс, который наблюдается в мейозе у всех эукариот У большинства организмов он ограничен профазой мейоза клеток зародышевой линии, но у Díptera спаривание гомологичных хромосом наблюдается и в соматических интерфазных клетках Для ряда локусов было обнаружено, что их спаривание оказывает значительное влияние на экспрессию генов Этот феномен был назван «трансвекция» -влияние гомологичных аллелей на функционирование друг друга.

Хорошо известно, что на уровень экспрессии многих генов также оказывает влияние присутствие инсуляторов Инсуляторы - класс регулятор ных элементов, которые блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, если находятся между ними При этом энхансер, изолированный от одного промотора инсулятором, тем не менее, способен активировать другой, неизолированный промотор Было показано, что два gypsy инсулятора, расположенные между энхансером и промотором, способны нейтрализовать действие друг друга Предполагается, что белки, связавшиеся с двумя gypsy инсуляторами, в дальнейшем могут взаимодействовать между собой, сближая отдельные участки ДНК В зависимости от взаимного пространственного расположения энхансера, промотора и инсуляторов сближение участков ДНК может оказывать разное влияние на транскрипцию

Для изучения регуляции генов хорошей моделью являются системы, содержащие все три класса основных регуляторных элементов К ним можно отнести системы, позволяющие смоделировать эффекты трансвекции, поскольку молекулярный механизм трансвекции напоминает способ действия энхансера, далеко отстоящего от промотора

Исследование роли инсуляторов в процессах трансвекции позволит более детально

изучить как механизмы взаимодействия между энхансером и промотором, так и способы

действия инсуляторов -----—--__

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА. „

¿-гей$

гХ

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящего исследования являлось изучение роли gypsy инсулятора в процессах трансвекции у Drosophila melcmogaster В работе были поставлены следующие задачи'

1 Изучение возможности транс-активации гена yellow в различных местах генома Drosophila melcmogaster

2 Создание модельной системы для изучения транс-взаимодействий между регуляторными элементами (промотором, энхансером и инсулятором) в геноме Drosophila melanogasier

3 Исследование роли gypsy инсулятора в регуляции уровня транс-активации энхансерами промотора

4 Изучение роли gypsy инсулятора в коммуникации между энхансером и промотором, которые находятся на большом расстоянии друг от друга

Научная новизна и практическое значение работы. В данной работе впервые показано, что уровень транс-активации энхансерами гена yellow промотора гена yellow в значительной степени зависит от места в геноме D.melanogaster и не коррелирует с уровнем цис-активации. Обнаружено, что присутствие gypsy инсулятора улучшает транс-активацию промотора гена yellow его энхансерами, расположенными на гомологичной хромосоме Результаты, полученные в данной работе, свидетельствуют, что gypsy инсулятор способен обеспечивать транс-взаимодействия между энхансером и промотором, которые находятся на больших расстояниях друг от друга

Эти данные способствуют пониманию механизма дальних взаимодействий между энхансером и промотором Предложенная нами для изучения трансвекции модельная система на основе гена yellow дает возможность дальнейшей идентификации белков, участвующих в процессах трансвекции и коммуникации между локусами

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 46th Annual Drosophila Research Conference (San Diego, California March 30 - April 3, 2005) и на межлабораторном семинаре ИБГ РАН (2005)

Публикации. По теме диссертации опубликованы четыре печатные работы Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах, включает 31 рисунок и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 128 источников

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Уровень транс-активации энхансерами гена yellow промотора гена yellow в значительной степени зависит от места в геноме D.melanogaster и не коррелирует с уровнем цис-активации.

Ген yellow отвечает за тёмную пигментацию кутикулярных структур личинки и имаго и контролируется несколькими тканеспецифичными энхансерами Как было показано в предыдущих исследованиях (Chen et al. 2002) трансвекция гена yellow наблюдается в различных местах генома D. melanogaster В работе Chen et al, которая посвящена исследованию этого факта, использовался локус yellow с окружающими его последовательностями - около 7 5 Kb с 5'-конца и 2 1 Kb с З'-конца Поэтому нельзя исключить, что во фланкирующих последовательностях могли находиться элементы, участвующие в соматическом спаривании гомологичных хромосом, что и обеспечивало стабильную транс-активацию гена yellow вне зависимости от места нахождения в геноме По этой причине вначале нами была исследована возможность транс-активации гена yellow в различных позициях генома D. melanogaster без дополнительных фланкирующих последовательностей ДНК Для этого нами была создана конструкция (E)(Y)W (см рис 1)с минимальными фланкирующими областями, содержащая кодирующую часть гена yellow, 3 Kb область его энхансеров с 5'-конца и район размером 200 пне З'-конца теш yellow Область энхансеров гена yellow была окружена FRT сайтами, а район промотора гена yellow находился между 1ох сайтами, что в дальнейшем с помощью сайтспецифичных рекомбиназ позволяло на базе одной конструкции получать различные ее производные (см рис 2) В качестве маркерного гена в конструкции использовался ген mini-white

После введения трансгенной конструкции в эмбрионы D. melanogaster было получено 12 однокопийных трансгенных линий, содержащих (EXY)W конструкцию в различных позициях генома D. melanogaster Уровень пигментации кутикулы у гетерозиготных самок (E)(Y)W/+ колебался от ожидаемого уровня пигментации близкого к дикому типу (4-5 баллов) до слабой пигментации (2 балла) Такая разница в уровне экспрессии гена yellow может быть объяснена эффектом положения (влиянием окружающего хроматина) Затем, мухи из полученных трансгенных линий были скрещены с мухами, несущими ген FLP-рекомбиназы, и в результате были отобраны потомки с делецией энхансеров renayellow

s s g saa

S g-6 « E ■

S V £

» I s SÇ2

S X a.

#l(3)#2(3)#3(3)#4(3)#5(3)#6(3)#7(3)#8(2)#9(3)#10(2)#ll(3)#12(3p|

(E)(Y)W

«■ H 5/4 4-5/3-4 4/4 3 W"4" 4/3-4 4'3 4/2-3 3'M44/3-4>'S/4'5 S/3-4 4.1/3.3

(E)(APrY)W/(AE)(Y)W

I. .¿h, -> H 3-4/3-4 3-4/3 2/2 3-4/4 1/2 1/2

; " 1/2-3 3-4/1-2 2-3/2 3/3 2/2 2-3/2 2.4/2.5

{ * white -> Ч

su(Hwf ND ND ND ND ND ND ND 3/2-3 ND 2/1-2 ND 2-3/2 ND

mod(mdg4) ND ND ND ND ND ND ND 3/2 ND 2/2 ND 2/2 ND

#13(28E9) #15(13A5) #17(52B2) #19(2) #21(2)

#14(64B12) #16(2) #18(64C9) #20(58F) #22(3)

(E)(Y)SW

™ ШШШЯ 5/5 4.5/4 4-5/4 ^ 4-5/43^/3_24-5/5 4/3_4 2"3/3 5/4.5^4^9

(E)(APrY)SW/(AEKV)SW

^^3-4/3 4/3_4 4-5/4^3-4/33^4-5/3^^2-3/3^.5 3 7/3 4

{ » white H

su(IIwf 2/2 ND 3-4/2-3 2/2 2/2 ND 3/3 1-2/1-2 ND ND 2.3/2.2

mod(mdg4) ND ND ND ND 2/2 ND 3-4/3 ND ND ND ND

#23(20E) #25(23A3) #27(29Г)4) #29(100B3) #31(74A1) #33(3)

#24(3) #26(39E3) #28(75B5) #30(68C13) #32(35DE) #34(28D2)

(E)(Y)WS _ 3-4/3-4 , 4/3 rlr 5/5, 5/4 ... 4/3 tlJ 4-5/4, .,,4.3/3.8

4/3-4 5/5 4-5/5 4/3 4/4 4-5/4

(E)(APrY)WS/(AE)(V)WS

«■■—I w 3/2 4/3з-4/з5/4.55/з-44/зд 4/З 3/2.3 4/3^3-4/3^3.9/3.1

bu(Hwf ND ND,-2/,-24/3 3/2 ND ND ND ND ш ND 3/2 2"5/1'9

mod(mdg4)' ND ND 3-4/25/4 3-1/2ND ND ND ND3-t/3j,ND4.5/338/2-9 Рис 1 Схема конструкций и оценка уровня пигментации Е - энхансеры, активирующие ген yellow S - gypsy инсулятор Белые треугольники - сайты узнавания для FLP рекомбиназы, черные треугольники - сайты узнавания для Сге рекомбиназы Указаны номера линий и в скобках место нахождения конструкции в геноме ND - для данной линии изучение не проводилось.

Для получения производных линий мух с делецией промотора мухи из исходной трансгенной линии были скрещены с мухами, несущими ген Сге рекомбиназы, в результате были получены потомки (Е)ДУ\У/+

Таким образом из всех двенадцати линий были получены линии-производные с делецией энхансеров и делецией промотора (см рис 2) Затем производные каждой линии были скрещены между собой и полученная гетерозигота содержала одновременно (Е)ДУ\У аллель и ДЕ(У)\У аллель ((Е)ДУ\У/(ДЕ(У)\У)

(E)(Y)W

> I-

производная без энхансеров

white —

(AE)(Y)W

производная без промотора

white —»Ц (E)(APrY)W

объединение производных (AE)(Y)W/(E)(APrY)W

Рис 2 Схема получения и объединения производных исходной конструкции для оценки уровня транс-взаимодействий между ними

Оценка уровня пигментации тела и крыльев у мух, содержащих эту комбинацию аллелей, позволяла выявить случаи возникновения транс-активации (рис. 1) Во всех двенадцати случаях гетерозиготные самки (Е)ДYW/(ДЕ(Y)W имели более темную пигментацию тела и крыльев (средние значения степени пигментации 2 4,2 5/ тело,крылья), чем самки AE(Y)W/+ (степень пигментации 1,1/ тело,крылья), однако воспроизведения ситуации, описанной в работе Chen et al, в которой уровень транс-активации гена yellow во всех случаях обеспечивал пигментацию кутикулярных структур близкую к уровню дикого типа, нами не наблюдалось.

При этом уровень транс-активации в гетерозиготах (E)AYW/(E)AYW никак не коррелировал с уровнем цис-активации в исходной (E)(Y)W линии (см линии 3,8 и 11,12 рис 1) В частности, при высоком уровне цис-активации уровень транс-активации может

быть различным Вероятно, уровень транс-активации зависит от степени спаривания между гомологичными хромосомами в месте инсерции трансгенной конструкции

2. Gypsy инсулятор способствует транс-активации промотора гена yellow.

Для того чтобы оценить степень участия gypsy инсулятора в процессах трансвекции, была сделана конструкция (E)(Y)SW, в которой gypsy инсулятор был встроен между генами yellow и mmi-white (рис 1) Было получено десять трансгенных однокопийных линий, для которых так же, как было описано в предыдущем случае, были созданы производные с делециями промотора или энхансеров тепа yellow

У гетерозиготных самок AE(Y)SW/(E)AYSW средний уровень пигментации составил 3 4,3 7/тело,крылья, что выше чем средний уровень пигментации тела и крыльев у гетерозиготных самок AE(Y)W/(E)AYW (2 4, 2 5/ тело,крылья) По всей видимости, присутствие gypsy инсулятора в обоих аллелях гетерозиготы улучшает транс-активацию промотора гена yellow энхансерами, расположенными на гомологичной хромосоме (рис 1) Этот эффект можно объяснить или взаимодействием между gypsy инсуляторами, или тем, что инсулятор блокирует какие-то цис-взаимодействия между энхансерами гена yellow и промотором гена mini-white, что и приводит к улучшению транс-активации

Для проверки этих предположений была сделана конструкция (E)(Y)WS (рис 1), в которой gypsy инсулятор был встроен за геном mini-white Было получено двенадцать трансгенных линий, содержащих одну копию (E)(Y)WS конструкций, для каждой из которых были получены производные без энхансеров или без промотора гена yellow так же, как было описано ранее У гетерозиготных самок AE(Y)WS/(E)AYWS средний уровень пигментации составил 3 1,3 9/тело,крылья, что сопоставимо со средним уровнем пигментации гетерозиготных самок AE(Y)SW/(E)AYSW 3 4;3 7/тело,крылья, несущих инсулятор между энхансерами гена yellow и промотором гена mini-white Эти данные свидетельствуют о том, что усиление транс-активации между производными линии (E)(Y)SW не связано с блокированием каких-либо цис-взаимодействий между энхансерами гена yellow и промотором гена mini-white, а обусловлено присутствием gypsy инсулятора в обоих аллелях гетерозиготы

Для того чтобы продемонстрировать роль gypsy инсулятора в транс-активации, в линии (E)(Y)SW, (E)(Y)WS и их производные была введена мутация, приводящая к нарушениям белка Su(Hw), который является необходимым компонентом gypsy инсулятора Отсутствие нормального белка Su(Hw) никак не повлияло на пигментацию самок AE(Y)SW/+ и AE(Y)WS/+ Но у гетерозиготных самок AE(Y)SW/(E)AYSW и AE(Y)WS/(E)AYWS в отсутствие нормального белка Su(Hw) наблюдалось понижение

уровня транс-активации до уровня гетерозиготных самок AE(Y)W/(E)AYW, отмеченного в предыдущем эксперименте, где в тесте на комплементацию использовались производные, не содержащие gypsy инсулятор.

В качестве контроля мутации, приводящие к нарушениям Su(Hw) белка, были введены в три линии (E)(Y)W и их производные, которые не содержали gypsy инсулятор У гетерозиготных самок AE(Y)W/(E)AYW отсутствие нормального Su(Hw) белка никак не сказалось на уровне транс-активации Таким образом, присутствие белка Su(Hw) не является необходимым для осуществления транс-активации

Другим важным компонентом gypsy инсулятора является белок Mod(mdg4) В производные линий (E)(Y)SW и (E)(Y)WS была введена мутация mod(mdg4)"' В результате этой мутации синтезируется белок, не способный связываться с белком Su(Hw) В гетерозиготных самках AE(Y)SW/(E)AYSW и AE(Y)WS/(E)AYWS отсутствие этого компонента gypsy инсулятора не оказало значительного влияния на уровень трансактивации гена yellow

3. Gypsy инсулятор улучшает трансвекцию между энхансерами и промотором гена yellow, расположенными в негомологичных локусах генома Drosophila melanogaster.

Согласно данным предыдущих экспериментов, присутствие gypsy инсулятора облегчало транс-активацию промотора гена yellow при объединении производных одной исходной трансгенной линии, т е находящихся в одной и той же позиции «друг напротив друга» на гомологичных хромосомах Поэтому следующим был вопрос, может ли присутствие gypsy инсулятора улучшать трансвекцию между производными различных трансгенных линий, находящихся в разных местах генома и на разных расстояниях друг от друга

В качестве контроля вначале были взяты линии производные конструкции (E)(Y)W -AE(Y)W и (E)AYW, находящиеся в различных местах генома, и самцы AE(Y)W были скрещены с самками (E)AYW, содержащими производную в другой позиции генома Таким образом, были поставлены 132 скрещивания, в результате которых были получены гетерозиготные самки с желтой окраской тела и крыльев Этот результат полностью согласуется с данными, полученными в работе Chen et al, и свидетельствует о том, что в отсутствии gypsy инсуляторов трансвекции между энхансерами и промотором, находящимися в негомологичных сайтах, не наблюдается

Затем, таким же образом нами были протестированы комбинации негомологичных производных для девяти (E)(Y)SW и двенадцати (E)(Y)WS трансгенных линий.

В итоге было поставлено 338 скрещиваний, в результате которых были получены особи, содержащие производные разных трансгенных линий в разных позициях генома В тринадцати из 338 скрещиваний гетерозиготные самки имели выраженную темную пигментацию в теле и крыльях (рис.3).

Уровень пигментации тела и крыльев этих мух, а, следовательно, и уровень трансактивации, был ниже, чем у гетерозиготных самок, у которых производные трансгенной конструкции находились в одной и той же позиции на гомологичных хромосомах В случаях негомологичной комплементации одно событие наблюдалось между производными, расположенными в разных сайтах П1 хромосомы (№ 14/№ 18), одно между производными, расположенными на Х-хромосоме и П-хромосоме (№15/№13), и петь событий между производными, расположенными в разных участках второй хромосомы (№27/№34, №27/№32, №27/№26, №32/№26, №34/№26 см рис 3)

#14/#18 ШМ14 #13/#15 #15/#13

расстояние между позиция ин

в геноме, kb 617 617 2L&X 2L&X

(E)(APrY)SW/(AE)(Y)SW

0 white

312 3/1 3-1/1-2

sufHwf ND ND ND ND

mod(mdg4)' N'D ND ND ND

расстояние между позициями в геноме, kb

(E)(APrY)WS/(AE)(Y)WS

sufflw)

mod(mdg4)

mm а ш№2 т/т т/ш ш/ш

#34/#27 #32/#26 #32/#27 #26/#27 667 667 -5334 -6334 -7755 -7755 13010 13010 13677

3/2 3/2 4/2 3-4/2 3-4/1-2 3-4/1-2 2-3/1 2-3/1 3/1

1-2/1 ND 1/1 ND 1/1 ND 1-2/1 2/1 1/1 ND ND 2-3/2 3/2 2/1 2/1 1-2/1 1-2/1 1/1

Рис 3 Уровень комплементации между производными различных трансгенных линий, находящихся в разных местах генома

Для дальнейшего изучения транс-взаимодействий между производными, находящимися в разных местах генома, нами были установлены места инсерций конструкции в геном для большинства (Е)(У)5Ш и (Е)(У)\У8 трансгенных линий (рис 1 и 4)

#25 #34 #13 #27

#32

#26 линия

5102 -^308 357~" -7755 »5334

667 13010

23A3 28D2 28Е9 29D4 35DE

39E3

место нахождения в геноме

01 #14 #18

#30

#31 #28 линия

ЛТП«;

1 617"" 6305 ^ 5650 ^ 8141 kb

64В12 64С9 68С13 74А1 75В5 место нахождения

в геноме

Рис 4 Схема расположения мест инсерций трансгенных конструкций в геноме Drosophila Чёрными стрелками указаны конструкции, производные которых способны к негомологичным транс-взаимодействиям

Локализация трансгенных конструкций в геноме позволила установить, что линейное расстояние между местами инсерций не является фактором, который однозначно определяет возможность транс-активации между негомологичными производными Например, объединение производных линий №14 и №18 (расстояние между сайтами инсерций 617 Kb) и №27 и №34 (расстояние между сайтами инсерций 667 Kb) приводили к транс-активации гена yellow

А объединение производных линии №13, сайт инсерции которой расположен между местами инсерций в линиях №27 и №34 на расстоянии 308 Kb и 359 Kb от них соответственно, с производными линий №27 и №34 не приводило к транс-активации гена yellow

Этот факт не может бьпъ объяснен тем, что в линии №13 трансгенная конструкция попала в такую область генома, в которой транс взаимодействия в силу каких-либо причин

невозможны, поскольку при объединении производных линии №13 и линии №15 (X-хромосома) транс-активация rem yellow наблюдается

Наиболее вероятно, что уровень трансвекции между производными, находящимися в негомологичных позициях генома, главным образом зависит от их расположения относительно друг друга внутри трехмерной архитектуры ядра, и в гораздо меньшей степени зависит от линейных расстояний между сайтами инсерций в пределах одной хромосомы Например, в ряде случаев транс-активация гена yellow наблюдалась при объединении производных линий, расстояния между сайтами инсерций которых были очень большими 7 16 Mb №27/№32, 5 33 Mb №26/№32, 13 01 Mb №27/№26 (рис 4)

Для того чтобы выяснить степень участия gypsy инсулятора в транс-активации между производными, находящимися в различных позициях генома, в производные, не содержащие промотор или энхансеры гена yellow, были введены мутации, приводящие к инактивации белков Su(Hw) и Mod(mdg4) На фоне мутации mod(mdg4)"', уровень трансактивации между производными, находящимися в негомологичных локусах генома, значительно снижался Отсутствие нормального белка Mod(mdg4) в большей степени влияло на уровень трансвекции, чем в случаях его отсутствия при транс-активации между производными одной линии Вероятно, транс-активация на больших расстояниях более чувствительна к присутствию всех компонентов gypsy инсулятора Отсутствие нормального белка Su(Hw) приводит к полному исчезновению транс-активации между производными, находящимися в различных местах генома Таким образом, присутствие gypsy инсулятора позволяет осуществляться транс-активации гена yellow между производными, расположенными на больших расстояниях друг от друга в негомологичных позициях генома

4. Наличие gypsy инсуляторов на обеих гомологичных хромосомах необходимо для эффективной транс-активации теня yellow.

Gypsy инсулятор принимает участие во многих процессах, происходящих в ядре Drosophila, в том числе взаимодействует с GAF и МСР элементами (Melnikova et al 2004) Также показано, что на политенных хромосомах имеется большое число сайтов связывания для белка Su(Hw) Поэтому наблюдаемый нами эффект влияния белка Su(Hw) на уровень транс-активации может быть не прямым, а отражать какие-то общие изменения в структуре или организации хроматина в отсутствие этого белка.

Для того чтобы показать, что Su(Hw) белок принимает непосредственное участие в стабилизации трансвекции за счет взаимодействий между gypsy инсуляторами, нами была сделана конструкция, производные которой содержали или не содержали gypsy инсуляторы

В конструкции (ES)Y(SW) (см рис 5) ген yellow был окружен gypsy инсуляторами, один из которых бьи встроен в положение -893 по отношению к точке начала транскрипции гена yellow, а второй находился за З'-концом тепа, yellow Фрагмент конструкции, содержащий энхансеры гена yellow, энхансеры гена white и gypsy инсулятор в положении -893, находился между FRT-сайтами Фрагмент конструкции, содержащий gypsy инсулятор с 3'-стороны от гена yellow и промотор гена mini-white, находился между 1ох-сайтами

В результате было получено семь однокопийных (ES)Y(SW) трансгенных линий, в которых не наблюдалось цис-активации энхансерами гена yellow промотора гена yellow, так как между находится gypsy инсулятор (что приводит к изоляции энхансеров от промотора), и происходила цис-активация энхансерами гена white промотора гена mini-white (мухи имели ярко-красные глаза), поскольку между ними находятся два gypsy инсулятора (которые нейтрализуют друг друга)

■ = в" isS

5 з § 5 6$

«55

UU3 S X в, В j?

(ES)Y(SW) " " ч_/ Q |

Ц white > H 1/1 1/1 1/1 1/1 1У1 1/1 1/1 fe

#35(2) #36(2) #37(2) #38(3) #39(3) #47(2) #48(3) g_ s

(ES)Y(SW)/(AES)Y(SW)

f white —> H

4/4 5/5 2-3/2-3 3-4/3 5/5 4/4 4/3-4 4.0/3.9

I white —> H

(ES)Y(SW)/(AES)Y(ASW)

fwhlte -X H

(ES)Y(ASW)/(AES)Y(SW)

»} white

3/2 3/2-3 1-2/1-2 2-3/2 3/3 2-3/2 2-3/2 2.6/2.1

I * ) white —>I) (ES)Y(ASW)/(AES)Y(ASW)

white -X Ц

3-4/4 5/5 3/2 4/3 5/5 4/4 4/3-4 4.1/3.8

t white ~к Ц

__, 2/2 3/3 1/1 2-3/2 3/3 2-3/2 2-3/2 2.4/2.1

I white X H

Рис 5 Схема конструкции (ES)Y(SW) и результаты оценки уровня пигментации гена yellow при объединении различных производных (ES)Y(SW)

При вырезании энхансеров гена yellow, энхансеров гена mim-white и gyp чу инсулятора, находящегося в положении -893 перед промотором гена yellow, в линиях (AES)Y(SW) происходило значительное падение уровня экспрессии гена mini-white и сохранение без изменений уровня экспрессии гена yellow (мухи имели желтые тело и крылья и оранжевые глаза)

При вырезании промотора гена mmi-white и инсулятора, расположенного с 3'-стороны от гена yellow перед промотором гена mini-white, были получены производные (ES)Y(ASW) и производные с двумя делениями (AES)Y(ASW) Мухи, содержащие одну из этих производных, имели белую окраску глаз Таким образом, гетерозиготы (ES)Y(SW)/+ и все линии, содержащие производные этой конструкции, имели желтую окраску тела и крыльев либо из-за присутствия gypsy инсулятора между энхансерами и промотором гена yellow, либо из-за отсутствия энхансеров в результате делеции части конструкции

Для всех семи трансгенных линий у гетерозиготных самок (AES)Y(SW)/ (ES)Y(SW) и (AES)Y(SW)/ (ES)Y(ASW) наблюдалась активация теки yellow Поскольку в исходной линии (ES)Y(SW) и производной (ES)Y(ASW) gypsy инсулятор полностью блокирует цис-активацию энхансерами промотора гена yellow, появление активации гена yellow объясняется транс-действием энхансеров (ES)Y(SW) и (ES)Y(ASW) на промотор производной (AES)Y(SW)

При дальнейшем комбинировании исходной линии и трех типов производных, было обнаружено, что наблюдается два уровня транс-активации гена yellow высокий уровень транс-активации (у гетерозиготных самок (AES)Y(SW)/ (ES)Y(SW) и (AES)Y(SW)/ (ES)Y(ASW)), когда оба аллеля содержат gypsy инсулятор, и более низкий уровень трансактивации (у гетерозиготных самок (AES)Y(ASW)/ (ES)Y(SW) и (AES)Y(ASW)/ (ES)Y(ASW)), когда один из аллелей не содержал gypsy инсулятор (рис 5) Из этих данных можно сделать вывод, что для эффективной транс-активации гена yellow необходимо присутствие gypsy инсулятора в обоих аллелях

Несмотря на высокий уровень транс-активации гена yellow у гетерозиготных самок (AES)Y(SW)/(ES)Y(ASW), транс-активации гена mint-white в этом же случае не наблюдалось Однако по сравнению с системой, в которой происходит транс-активация промотора гена yellow, взаимное расположение инсуляторов, энхансера и промотора гена mim-white в обоих аллелях совсем иное По всей видимости, отсутствие транс-активации гена mini-white связано с тем, что обе производные содержат gypsy инсулятор в таких положениях по отношению к энхансерам и промотору гена mim-white, что трансвзаимодействие инсуляторов приводит к изоляции энхансера и промотора друг от друга

5. Gypsy иисулятор способствует транс-активации промотора гена yellow. Согласно результатам наших исследований трансвекции между производными конструкции (ES)Y(SW), gypsy инсулятор, расположенный между энхансерами и промотором гена yellow, позволяет энхансерам активировать промотор гена yellow, расположенный на гомологичной хромосоме Эти результаты не согласуются с данными (Morris et al 1999), полученными на гене yellow в эндогенном локусе, о том, что в аллелях^2 и У" энхансеры гена yellow, изолированные от промотора gypsy инсулятором в составе gypsy ретротранспозона, не способны транс-активировать промотор гена yellow аллеля уне содержащего энхансеров

Это противоречие может быть объяснено тем, что спаривание между гомологичными последовательностями иногда может приводить к тому, что энхансеры способны цис-активирвать промотор, даже в присутствии между ними gypsy инсулятора (Morris et al 1998), и подобное спаривание между производными конструкции (ES)Y(SW) возможно позволяет энхансерам гена yellow преодолевать gypsy инсулятор и цис-активировать промотор

Для того чтобы убедиться, что в нашей работе мы наблюдаем транс-активацию гена yellow, а не опосредованную соматическим спариванием цис-активацию, нами были сделаны конструкции (ES)(Y)SW и (ES)(Y)W (см рис 6) Как и в ряде предыдущих конструкций в положении -893 от точки начала транскрипции гена yellow находился gypsy инсулятор, который вместе с районом энхансеров гена yellow был окружен FRT-сайтами Для того чтобы иметь возможность в части производных инактивировать ген yellow, но при этом сохранить его нормальную промоторную область, второй экзон гена yellow был окружен lox-сайтами Отличие конструкций (ES)(Y)SW и (ES)(Y)W заключалось в том, что одна из них - (ES)(Y)SW содержала второй gypsy инсулятор после 3'-конца гена yellow перед геном mim-white, а конструкция (ES)(Y)W не содержала его

Было получено семь (ESXY)SW и пять (ES)(Y)W однокопийных трансгенных линий Мухи, содержащие конструкцию, имели желтые тело и крылья, так как энхансеры были изолированы от промотора гена yellow gypsy инсулятором

Поскольку делеция энхансеров гена yellow и следующего за ними gypsy инсулятора фенотипически никак не проявлялась, отбор мух с делецией осуществлялся с помощью ПЦР-анализа потомства индивидуальных особей, полученных после скрещивания мух из исходных трансгенных линий с мухами, несущими ген FLP-рекомбиназы

* a 5 1« в.

8.3&

О 2

#40(1)#41(1)#42(2)#43(2)#44(3)#45(3)#46(3) й

(ES)(Y)SW (ES)(Y)SW/(AES)(Y)SW

(ES)(YAEX)SW/(AES)(Y)SW

white -> H 1/1 1/1 l/l l/l 1/1 1/1 1/1

5/4-5 3/3 4/3-4 3-4/3 5/4 3/2-3 2-3/2 3.7/3.2

white —> H wAta —>

(ES)(Y)W (ES)(Y)W/(AES)(Y)W

#47(1) #48(2) #49(2)#50(2) #51 (3) white-^M 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1

2-3/2-3 1/1 3/3 3/2 3/2-3

2.5/2.2

Рис 6 Схема конструкций (ES)(Y)SW и (ES)(Y)W и результаты оценки уровня пигментации гена yellow

У гетерозиготных самок (AES)(Y)SW/(ES)(Y)SW и (AES)(Y)W/(ES)(Y)W, содержащих два нормальных khz. yellow, наблюдался тот же уровень транс-активации гена yellow, что и у гетерозиготных самок (AES)(Y)SW/(ES)(YAtx2)SW и (AES)(Y)W/(ES)(Yiex2)W, содержащих только один полноценный ген yellow, расположенный in trans по отношению к энхансерам Таким образом, преодоления энхансерами цис-расположенного gypsy инсулятора и цис-активации гена yellow не наблюдается, инсулятор не препятствует транс-активации

энхансерами промотора гена yellow и наблюдаемые нами эффекты обеспечены только транс-взаимодействиями

Как и ожидалось, уровень трансвекции у гетерозиготных самок (/\ESXY)SW/(ES)(Yto,2)SW был выше, чем у (AESX^W/CESXY^W, что подтверждает роль взаимодействия между gypsy инсуляторами, расположенными на гомологичных хромосомах в обеспечении эффективной транс-активации между энхансерами и промотором гена yellow

Таким образом, нами получены доказательства возможности транс-активации гена yellow для случаев трансгенной конструкции, находящейся в различных позициях генома Drosophila melcmogaster Учитывая полученные нами данные, предыдущий результат, что энхансеры, изолированные от промотора гена yellow встройкой gypsy ретротранспозона в аллелях у2 и у69, неспособны транс-активировать промотор гена yellow аллеля у82729, можно объяснить специфическими свойствами эндогенного локуса yellow В частности, этот локус содержит недавно найденный 1А-2 инсулятор, похожий, но не идентичный gypsy инсулятору, а у2 аллель содержит целый gypsy ретротранспозон, что приводит к иному взаимному расположению регуляторных элементов в комбинации аллелей у2/ у82/29, чем расположение регуляторных элементов в производных трансгенных конструкций, используемых нами

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Транс-взаимодействие между gypsy инсуляторами улучшает локальное спаривание между гомологичными хромосомами

Нами было показано, что уровень транс-активации энхансерами гена yellow промотора гена yellow в значительной степени зависит от места в геноме D.melanogaster и не коррелирует с уровнем цис-активации Различный уровень транс-активации в различных местах генома может быть объяснен неодинаковой степенью соматического спаривания между гомологичными хромосомами и существованием специальных элементов, присутствие которых усиливает соматическое спаривание

К таким элементам можно отнести gypsy инсулятор, который, находясь на расстоянии 5КЬ и 9 Kb от промотора тепа yellow, улучшает транс-активацию промотора тепа yellow его энхансерами, расположенными на гомологичной хромосоме (см рис 7) Вероятно, трансвзаимодействие между gypsy инсуляторами улучшает локальное спаривание между гомологичными хромосомами

Последовательности, окружающие ген yellow, играют большую роль в определении эффективности транс-активации, например 1А-2 инсулятор, расположенный с 3'-конца гена (Golovnin et al 2003, Parnell et al 2003) 1A-2 инсулятор, содержащий два сайга связывания для Su(Hw) белка, не присутствовал в наших конструкциях

Таким образом, данные о воспроизводимой и эффективной транс-активации гена yellow в различных местах генома, полученные Chen et al (Chen et al 2002), могут быть объяснены присутствием в использованной ими конструкции 1А-2 инсулятора, улучшающего локальное соматическое спаривание и, таким образом, повышающим эффективность транс-активации

Несмотря на то, что известно много примеров трансвекции, природа спаривания гомологичных хромосом в ходе интерфазы остается неясной В некоторых случаях известны белки, принимающие участие в процессах трансвекции К ним относится белок Zeste - сайт специфический ДНК связывающий белок, сайты связывания которого распределены по всему геному (Benson et al 1987, Benson et al 1988, Pirrotta et al 1987) Инактивация белка Zeste приводит к нарушению спаривания между аллелями и исчезновению эффектов трансвекции для генов decapentaplegic (Gelbart and Wu 1982, Gelbart 1982), white (Babu and Bhat 1980, Blackwood and Kadonaga 1998), eyes absent (Leiserson et al 1994) и Ubx генов (Goldsborough and Romberg 1996)

(E)(Y)W (E)(APrY)W/(AE)(Y)W

(E)(Y)SW

» white —» H

» w/itfc —

}

Средний уровень » white ^ПН Г транс-активации

(E)(APrY)SW/(AE)(Y)SW

white

Высокий уровень » white ->Н 1 гРанс"аетивации

(E)(Y)WS

• white —»l-^j

(E)(APrY)WS/(AE)(Y)WS

- whlte \ Высокий уровень

» white -> j транс-активации

(ES)Y(SW)

► ► white

(ES)Y(SW)/(AES)Y(SW)

(ES)Y(SW)/(AES)Y(ASW)

(ES)Y(ASW)/(AES)Y(SW)

^ I Высокий уровень щ\ white -> N J транс-активации

» У white

Средний уровень white -x И 1 тра,1с"а1сгивации

(ES)Y(ASW)/(AES)Y(ASW)

white И ¡H ) Высокий уровень white -> h j транс-активации

Средний уровень white -X Н I транс-активации

(ES)(Y)SW_

(ES)(Y)SW/(AES)(Y)SW

) E S>

} Высокий уровень

| » white -> H j транс-активации (ES)(YAEx)SW/(AES)(Y)SW

* wMte ~»IH ) Высокий уровень m white —>~H /

white —> H J транс-активации

(ES)(Y)W

> S>

Ivhite —» H (ES)(Y)W/(AES)(Y)W

* f^'fe ^»J ) Средний уровень

» white -> Й J транс-активации

(ES)(YAEx)W/(AES)(Y)W

white H ) Средний уровень

white —> H J тРанс-активации

Рис 7 Схемы трансгенных конструкций, использованных в нашей работе, и оценка уровня транс-активации гена yellow между их производными

Е - энхансеры гена yellow, S - gypsy инсулятор; белые треугольники - сайты узнавания FLP рекомбиназы; чёрные треугольники - сайты узнавания Сге рекомбиназы

Еще один класс элементов, которые могут улучшать соматическое спаривание между гомологичными хромосомами - это последовательности ДНК, с которыми связываются белки группы Polycomb (Pc-G) - Policomb Responsible Elements (PRE) Это короткие последовательности ДНК, на которых собираются репрессионные комплексы, состоящие из белков группы Polycomb (Pirrotta 1998) В группу Polycomb входят как минимум пятнадцать белков, которые являются компонентами больших белковых комплексов, участвующих в реперессии транскрипции ряда генов В трансгенных конструкциях, содержащих PRE, степень репрессии расположенных рядом с PRE генов во многих случаях значительно возрастала в линиях мух, гомозиготных по конструкции Скорее всего два Pc-G комплекса, расположенные на гомологичных хромосомах, способны транс-взаимодействовать друг с другом, что увеличивает их стабильность, усиливает репрессионный эффект и в то же время улучшает спаривание гомологичных хромосом

Показано, что GAGA фактор также способен сближать последовательности, находящиеся in trans по отношению друг другу, что обусловлено наличием BTB/POZ

домена и способностью к олигомеризации (Mahmoudi et al 2002) При этом происходит эффективная транс-активация энхансерами промотора Так же как и для белка Su(Hw) для GAGA фактора показана множественная локализация на политенных хромосомах

Отличительной особенностью белков Zeste, GAGA, Pc-G и Su(Hw) является то, что они вовлечены в процесс организации ДНК в ядре и способны приближать друг к другу различные участки ДНК Например, Zeste может формировать из ДНК, содержащей сайты его связывания, сложно организованные структуры с образованием петель (Bickel and Pirrotta 1990) Хорошо известно, что трансгенные конструкции, содержащие MCP элемент, в состав которого входят инсулятор и PRE, и расположенные на различных хромосомах, ассоциированы в ядре вместе (Gruzdeva et al 2005, Muller et al 1999) Поэтому можно предположить, что эти белки могут принимать участие и в соматическом спаривании

Было показано, что инсуляторы ses и ses', окружающие гены теплового шока hsp70, в ядре локализуются рядом (Blanton et al 2003) и тоже могут быть вовлечены в процесс соматического спаривания Спаривание ses и ses' может быть обеспечено за счет взаимодействий между белками Zw5 и BEAF, которые связываются с ses и ses' соответственно (Blanton et al 2003). В этом случае между ses и ses' образуется петля ДНК размером около 15 Kb, в которой находятся два гена теплового шока

Так как Su(Hw) белок имеет около двухсот сайтов связывания в геноме Drosophila и оказывает влияние на эффективность трансвекции, можно полагать, что он является одним из участников процесса соматического спаривания между гомологичными хромосомами В пользу этого свидетельствуют недавние цитологические данные (Byrd and Corses 2003) о том, что gypsy инсуляторы участвуют в формировании хроматиновых петель, которые ассоциированы с ядерным матриксом, причем в формировании петли участвуют обе гомологичные хромосомы (Byrd and Corses 2003)

2. Gypsy инсулятор способен обеспечивать транс-взаимодействия между энхансером и промотором, находящимися на больших расстояниях друг от друга.

Несмотря на то, что на политенных хромосомах обнаруживаются около 200 сайтов связывания для белка Su(Hw), в ядрах регистрируется только 20-25 точек его локализации -так называемых инсуляторных телец Принимая в расчет эти данные о распределении Su(Hw) белка в ядре (Gerasimova and Corses 1998), можно предположить, что Su(Hw) белок принимает участие в установлении пространственной организации ДНК в ядре и осуществлении коммуникации между различными локусами в геноме D. melcmogaster

Однако следует отметить, что простого сближения локусов недостаточно для функционального транс-взаимодействия между элементами, входящими в них Кроме

физического сближения промотора и энхансера значительную роль играет их взаимное пространственное расположение относительно элементов, формирующих пространственную организацию ДНК в ядре

Рис 8 Модель транс-активации энхансерами промотора в присутствии gypsy инсулятров

Таким образом, в ходе нашей работы, были получены данные о том, что gypsy инсуляторы участвуют в коммуникации между удаленными друг от друга локусами и, вероятно, в регуляции соматического спаривания гомологичных хромосом Для того чтобы установить по одному или по разным механизмам осуществляются эти процессы, потребуются дальнейшие исследования Использованная нами для изучения трансвекции модельная система на основе гена yellow дает возможность дальнейшей идентификации белков, участвующих в процессах трансвекции и коммуникации между локусами

выводы

1 На основе регуляторных систем генов yellow и mini-white создана модельная система для изучения транс-взаимодействий между регуляторными элементами в геноме Drosophila melanogaster.

2 Установлено, что уровень транс-активации энхансерами гена yellow промотора гена yellow в значительной степени зависит от места в геноме D melanogaster

3 Показано, что gypsy инсуляторы, находясь на гомологичных хромосомах даже на некотором удалении от энхансер-промоторной пары, способны стабилизировать трансактивацию промотора

4 Продемонстрировано, что в ряде случаев gypsy инсуляторы участвуют в коммуникации между энхансером и промотором, которые находятся на большом расстоянии друг от друга Выявлена роль белков Su(Hw) и Mod(mdg4) в этом процессе

5 Показано, что линейное расстояние между трансгенными инсерциями в негомологичные локусы не является определяющим условием для установления трансвзаимодействия между ними

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

1 E.Kravchenko, Е Savitskaya, A Parshikov, P.Georgiev, М Savitsky Gypsy insulator facilitates enhancer action in trans throughout the Drosophila genome International Conference «Chemical & Biological Problems of Protomics», Novosibirsk July 5-9 2004

2 M Savitsky, E.Kravchenko, E Savitskaya, A Parshikov, P Georgiev The pairing between gypsy insulators located in homologous chromosomes facilitates the enhancer action in trans throughout the Drosophila genome 46lh Annual Drosophila Research Conference, San Diego, California March 30 - April 3, 2005

3 Kravchenko E, Savitskaya E, Kravchuk O, Parshikov A, Georgiev P, Savitsky M Pairing between gypsy insulators facilitates the enhancer action in trans throughout the Drosophila genome Mol Cell Biol 2005 Nov , 25(21) 9283-91

4 Кравченко E.B, Паршиков А Ф, Георгиев П Г Взаимодействие между Su(Hw) инсуляторами регулирует цис и транс активность энхансера гена white ДАН 2004, т 399, стр 392-395

Для заметок

Заказ Ng 2201 Подписано в печать 22.11.2005 Тираж 80 экз. Усл. п л. 0,88

'ООО"Цифровичок", тел. (095) 797-75-76; (095) 778-22-20 JJ www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

12 5 1 7 û

РНБ Русский фонд

2006-4 29268

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кравченко, Елена Владимировна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9 2.1 .Трансвекция в локусе yellow

2.2. Трансвекция в локусах eyes absent и decapentaplegic

2.3. Трансвекция в локусе vestigial

2.4. Трансвекция в локусе Abdominal-B

2.5. Трансвекция в локусе white, роль белка Zeste в процессах трансвекции

2.6. Трансвекция в локусе brown

2.7. Визуализация транс-взаимодействий

2.8. Роль соматического спаривания гомологичных хромосом в трансвекции

2.9. Gypsy инсулятор Drosophila melanogaster

2.10. Дальние взаимодействия между энхансерами и промоторами

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Генетические методы

3.1.1. Линии и мутации Drosophila melanogaster, использованные в работе

3.1.2. Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий

3.1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и mini-white в трансгенных линиях

3.1.4. Генетические скрещивания

3.2. Биохимические методы

3.2.1. Выделение ДНК из дрозофилы

3.2.2. Амплификация ДНК

3.2.3. Саузерн-блот-анализ

3.2.4. Секвенирование плазмид и ПНР продуктов

3.2.5. Молекулярное клонирование

3.2.6. Трансформация бактериальных клеток плазмидами

3.2.7.а Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса 49 3.2.7.6 Выделение плазмидной ДНК в больших количествах методом щелочного лизиса

3.2.8. Локализация места инсерции конструкции в геном

3.2.9. Иммуноокрашивание политенных хромосом Drosophila melanogaster50 3.2.10.In situ флуоресцентная гибридизация 51 3.2.11.Создание конструкций

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. РЕЗУЛЬТАТЫ 55 4.1.1 Уровень транс-активации энхансерами гена yellow промотора гена yellow в значительной степени зависит от места в геноме

D.melanogaster и не коррелирует с уровнем цис-активации

4.1.2. Gypsy инсулятор способствует транс-активации промотора гена yellow

4.1.3. Gypsy инсулятор улучшает трансвекцию между энхансерами и промотором тепа, yellow, расположенными в негомологичных локусах генома Drosophila melanogaster

4.1.4. Наличие gypsy инсуляторов на обеих гомологичных хромосомах необходимо для эффективной транс-активации гена yellow

4.1.5. Gypsy инсулятор позволяет энхансерам активировать промотор гена yellow, расположенный на гомологичной хромосоме

4.2. ОБСУЖДЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль Gypsy инсулятора в процессах трансвекции у Drosophila melanogaster"

В основе понимания целостной картины регуляции экспрессии генов лежит ответ на вопрос, каким образом регулируется транскрипция. Регуляторные последовательности, такие как промоторы, энхансеры и инсуляторы, являются элементами, которые контролируют транскрипцию в пространстве и времени.

Энхансеры способны активировать транскрипцию с промотора гена-мишени независимо от их ориентации и расстояния до точки начала транскрипции. Некоторые энхансеры могут быть расположены на расстоянии около 100 Kb и более от промотора-мишени (Rollins et. al 2004). Хорошо известно, что на уровень экспрессии многих генов также оказывает влияние присутствие инсуляторов. Инсуляторы - класс регуляторных элементов, которые обладают следующими свойствами (см. рис 1):

- блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, если находятся между ними (Dorsett 1999; Bell et al. 2001). При этом энхансер, изолированный от одного промотора инсулятором, тем не менее, способен активировать другой, неизолированный промотор (Cai and Levine 1995; Scott and Geyer 1995). Было показано (Muravyeva et al. 2001), что два gypsy инсулятора, способны нейтрализовать действие друг друга. Предполагается, что белки, связавшиеся с двумя gypsy инсуляторами, могут взаимодействовать между собой, сближая участки ДНК и приближая друг к другу регуляторные элементы

- определяют границы между активным и неактивным хроматином (Bell et al. 2001; Udvardy 1999; Geyer 1997) и способны защищать ограниченный ими ген от репрессирующего действия окружающего хроматина (Roseman et al. 1993; Sun and Elgin 1999).

Однако свойства инсуляторов и модели их действия описаны на системах, состоящих из цис-расположенных элементов. Возможно, инсуляторы способны оказывать влияние и на процессы, в которых принимают участие транс-расположенные элементы. Г н ti'lj 0 с sr

Рис. 1. Свойства инсуляторов. А - инсулятор блокирует взаимодействие между энхансером и промотором, если находится между ними. В - энхансер, изолированный от промотора инсулятором, способен активировать другой, неизолированный промотор. С - инсуляторы способны защищать ограниченный ими ген от репрессирующего действия окружающего хроматина. En - энхансер, Ins - инсулятор, чёрные прямоугольники - гены

Для изучения регуляции генов хорошей моделью являются системы, содержащие все три класса основных регуляторных элементов. К ним можно отнести системы, позволяющие смоделировать эффекты трансвекции, поскольку молекулярный механизм трансвекции напоминает способ действия энхансера, далеко отстоящего от промотора.

Спаривание гомологичных хромосом - процесс, который наблюдается в мейозе у всех эукариот. У большинства организмов он ограничен профазой мейоза клеток зародышевой линии, но у Díptera спаривание гомологичных хромосом наблюдается и в соматических интерфазных клетках (рис.2). Для ряда локусов было обнаружено, что их спаривание оказывает значительное влияние на экспрессию генов. Этот феномен был назван «трансвекция» -влияние гомологичных аллелей на функционирование друг друга.

Рис.2. У Drosophila гомологичные хромосомы в интерфазном ядре находятся в спаренном состоянии, а) кариотип Drosophila melanogaster b) спаренные хромосомы в интерфазе

Впервые трансвекция была описана E.B.Lewis в 1954 году для гена Ultrabitorax Drosophila melnogasier, ответственного за формирование 5 и 6 парасегментов тела дрозофилы. В настоящий момент явление граневекции описано для ряда генов Drosophila melanogaster, в том числе генов yellow, white, vestigial, генов Bitorax комплекса и др. (Geyer 1990, Coulthard 2005, Hendrickson et al. 1995, Muller et al. 1999).

31 X

Трансвекция описана и для других организмов, у которых не наблюдается значительного соматического спаривания гомологичных хромосом, например, для диплоидной стадии жизненного цикла Neurospora (Selker 2002), Ascobolus (Rossignol et al. 1994), некоторых аллелей табака (Matzke et al. 2001), в культуре клеток показаны транс-взаимодействия между аллелями ß-глобинового локуса человека (Ashe et al. 1997) и др.

По-видимому, взаимодействие между гомологичными аллелями -достаточно распространенное явление, которое следует учитывать для понимания механизмов экспрессии многих генов, поскольку трансвзаимодействия между аллелями могут приводить как к активации, так и репрессии друг друга.

Исследование роли инсуляторов в процессах трансвекции позволит более детально изучить как механизмы взаимодействия между энхансером и промотором, так и способы действия инсуляторов.

В нашей работе был использован наиболее хорошо изученный инсулятор Drosophila melanogaster — gypsy инсулятор, а для создания модельной системы были выбраны гены yellow и mini-white Drosophila melangaster.

Целью работы являлось изучение роли gypsy инсулятора в процессах трансвекции у Drosophila melanogaster. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучение возможности транс-активации гена yellow в различных местах генома Drosophila melanogaster.

2. Создание модельной системы для изучения транс-взаимодействий между регуляторными элементами (промотром, энхансером и инсулятором) в геноме Drosophila melanogaster

3. Исследование роли gypsy инсулятора в регуляции уровня трансактивации энхансерами промотора

4. Изучение роли gypsy инсулятора в коммуникации между энхансером и промотором, которые находятся на большом расстоянии друг от друга

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Трансвекция в локусе yellow

Ген yellow, расположенный на Х-хромосоме, отвечает за темную пигментацию кутикулярных структур и находится под контролем нескольких тканеспецифичных энхансеров, размещенных в 5' - области и в единственном интроне (см. рис. 3). yellow

-2873

-700

Ebr

7629bp

Рис. 3. Схема локуса yellow. Ew - энхансер, активирующий ген yellow в крыльях, ЕЬ - энхансер, активирующий ген yellow в теле, Ebr - энхансер, активирующий ген yellow в щетинках (расположен в интроне гена yellow).

Для ряда аллелей гена yellow описано явление трансвекции. Впервые трансвекция в локусе yellow была показана для аллелей у2 и ylt>H (Geyer et al. 1990). Мухи, несущие у2 аллель, имеют желтые тело и крылья и темные щетинки. Это вызвано инсерцией gypsy ретротранспозона между энхансерами, активирующими ген yellow в теле и крыльях, и промотором гена yellow (Geyer et al. 1986) (см. рис. 4). Активации гена yellow в теле и крыльях не наблюдается, поскольку в составе ретротранспозона находится gypsy инсулятор, который изолирует энхансеры от промотора, при этом ген yellow нормально экспрессируется в щетинках. gypsy

-700 yellow

Ebr ь

Ew Eb

-700 +100

IUQ а) и у (b). Красный прямоугольник - gypsy инсулятор в составе gypsy ретротранспозона. Пунктирной линией обозначен район делении.

Существуют аллели гена yellow, которые комплементируют у2 аллель. Например, у1*8 аллель. Этот аллель получен в результате делении промотора гена yellow и некоторого количества транскрибируемых последовательностей (см. рис. 4), что приводит к полной инактивации гена yellow и отсутствию пигментации во всех кутикулярных структурах.

Хотя ни в У ни в у1*3 аллелях нет экспрессии гена yellow в теле и крыльях, мухи, содержащие оба этих аллеля tf/y ) имеют пигментированные тело и крылья, близкие к уровню пигментации дикого типа (см. рис. 5). gypsy

• 1W появление темной У пигментации в теле и крыльях

ЕЬг

Рис.5. Схема трансвекции между аллелями у2 и

Комплементация между у2 и у}'48 аллелями объясняется тем, что спаренное состояние гомологичных хромосом (т.е. нахождение их в непосредственной близости друг от друга) позволяет энхансерам у1*8 аллеля транс-действовать на промотор у2 аллеля (Geyer et al. 1990) (см. рис. 5). Описан целый ряд аллелей, которые способны комплементировать у2 аллель, их отличительной чертой является делеция в области промотора гена yellow и присутствие энхансеров, активирующих ген yellow в теле и крыльях. Хорошим примером является ут аллель, который является производным у2 аллеля и возник в результате делении части ретротранспозона gypsy, содержащей инсулятор, области промотора гена yellow и 5' транскрибируемого района гена. На стадии куколки транскрипции гена yellow не наблюдается ни в гомозиготах у2/ у2, ни в / у59Ь, однако она восстанавливается в гетерозиготах у2! у59Ь'. Трансвекция между у2 и у59Ь аллелями зависит от соматического спаривания гомологичных хромосом: при перемещении у2 аллеля в другие позиции генома он переставал взаимодействовать с у59Ъ аллелем. Другая производная у2 аллеля — y88d возникла в результате делеции всего транскрибируемого района гена yellow и части ретротранспозона gypsy, содержащей инсулятор. Этот аллель также комплементирует у аллель, что свидетельствует о том, что для комплементации у2 аллеля необходимы только транс-расположенные энхансеры и больше никакие 3'-расположенные последовательности не нужны. л

Существует класс аллелей, не способных комплементировать у аллель, например аллель у1 (см. рис. 6). Этот аллель образован путем транзиции аденина в цитозин в кодоне инициации трансляции ATG, что приводит к полному отсутствию пигментации во всех кутикулярных структурах. Гетерозиготные мухи у2¡у1 имеют желтые тело и крылья, что свидетельствует об отсутствии транс-взаимодействий между этими аллелями. Возможно, в данном случае не наблюдается транс-действия энхансеров аллеля у1 из-за того, что в аллеле находится цис-расположенный промотор гена yellow, который предпочтительней для взаимодействия. Эта модель подразумевает наличие района контроля трансвекции в области промотора. Еще один аллель, не способный к комплементации у аллеля, - у69 аллель. Он является производной от у , возникшей в результате делеции промотора и части транскрибируемых последовательностей гена yellow. Однако у69 аллель содержит инсулятор в составе gypsy ретротранспозона, по-видимому, присутствие двух gypsy инсуляторов на гомологичных хромосомах в этих позициях блокирует возможность транс-активации энхансерами промотора.

Ew у1

ZL yellow ^ -Q I ■ -L

Ж Ebr

CTG gypsy

Ew \ Eb

-700

Ew Eb yellow trn Q Г Z1

Ebr yellow Г

ПхП о

ATG Ebr

CTG нет появления тёмной пигментации в теле и крыльях

Рис, 6. Схема аллеля У (а) и гетерозиготы у2/у1 (Ь)

В дальнейшем был описан у82^9 аллель, который является производным у' аллеля, возникшим в результате делеции энхансеров, активирующих ген yellow в теле и крыльях. Этот аллель также комплементируется аллелями у591'

I и о и у (см. рис. 7), демонстрируя, что присутствие gypsy инсулятора не является необходимым условием для осуществления трансвекции в локусе yellow. появление тёмной V пигментации в теле и крыльях

Рис. 7. Схема трансвекции между аллелями у82*29 и У .

Однако, у2 и у69 аллели, хотя и содержат энхансеры гена yellow, не способны комплементировать у82*29 аллель. Возможно, это связано с тем, что присутствие gypsy транспозона в этих аллелях каким-то образом приводит к 2 69 изоляции энхансеров аллелей у ну от транс-расположенного промотора.

Известен случай комплементации между аллелями у*!/с3, который нельзя объяснить транс-действием энхансеров (Morris et al. 1998). Аллель y,i ? содержит делецию промоторной области, части транскрибирующихся последовательностей и энхансера, активирующего ген yellow в теле; энхансср, активирующий ген yellow в крыльях, в у**3 присутствует (см. рис. 8). В гетерозиготе у2/у3с3 наблюдается появление темной пигментации и в теле, и в крыльях, что можно объяснить только цис-дейсгвием энхансера, активирующего гена yellow в теле, аллеля у2. При этом энхансер каким-то образом преодолевает gypsy инсулятор в составе gypsy транспозона, расположенный между энхансером и промотором.

Возможно, что область промотора и энхансер, активирующий ген yellow в теле, аллеля у2, не имея партнера для гомологичного спаривания в аллеле у?с3, выпетливается между остальными спаренными последовательностями, что приводит к сближению регуляторных элементов внутри петли и цис-активации промотора (см. рис. 8). yellow

I / 82f29

У —/ 1#8 gypsy нтгушор

У2 уЗсЗ в. gypsy IMC}'. 1*] Up

Рис, 8. Комплементация между аллелями у2!у?с3. А - структура у2!)?с3. В -модель цис-активации энхансерами промотора в присутствии между ними gypsy инсулятора. W - энхансер, активирующий ген yellow в крыльях, В -энхансер, активирующий ген yellow в теле, (из Morris et al. 1998).

Таким образом, предполагается, что соматическое спаривание гомологичных хромосом позволяет существовать двум видам трансвекции в локусе yellow, транс-действие энхансеров и цис-активация из-за выпетливания участков, не участвующих в гомологичном спаривании.

В работе Morris et al. 2004 были проведены исследования возможности транс-активациии энхансерами гена yellow промотора in trans в присутствии промотора in eis. Промоторная область гена yellow содержит ТАТА-Ьох (связывание с которым белка ТВР (TATA Binding Protein) запускает каскад событий, приводящий к формированию преинициаторного комплекса) и инициаторный элемент (Inr) — специфическую нуклеотидную последовательность, находящуюся в районе старта транскрипции. Были получены линии мух с мутациями, затрагивающими несколько нуклеотидов в области TATA-box (у'а'а), инициатора (ушг) или в обоих этих районах Для всех мутантных линий бьш измерен уровень транскрипции гена yellow по сравнению с уровнем транскрипции у+ аллеля и было показано, что в аллелях ytata, ушг и уШа~тг уровень транскрипции составил 1%, 3% и 1% от уровня дикого типа. Все эти три аллеля были способны к активации промотора, расположенного in trans. Мутантные аллели, которые не имели изменений в промоторной области, не были способны к активации трансрасположенного промотора. Затем был получен аллель, в котором промотор гена yellow был заменён на промотор гена white (yw), уровень транскрипции гена yellow в этом аллеле составил 12% от уровня дикого типа, однако мухи, содержащие этот аллель, имели непигментированные кутикулярные структуры. Возможно, замена промотора влияет на стабильность образующегося транскрипта, лимитируя возможность эффективной трансляции. Однако, несмотря на замену промотора и достаточно низкий уровень транскрипции в аллеле yw, энхансеры гена yellow аллеля yw не способны транс-активировать другой промотор. Вероятно, транскрипционная компетентность промотора, находящегося in eis по отношению к энхансерам, может ограничивать возможность активации трансрасположенного промотора.

В работе Chen (Chen et al. 2002) были проведены исследования возможности транс-активации гена yellow в различных местах генома Drosophila. Для этого была сделана трансгенная конструкция, содержащая энхансеры гена yellow, кодирующую часть гена yellow и фланкирующие локус последовательности — 7.5 Kb с 5'-конца и 2.1 Kb с 3'-конца. Район энхансеров, активирующих ген yellow в теле и крыльях, был окружен сайтами узнавания для FLP рекомбиназы, а область промотора и часть транскрибирующихся последовательностей была окружена сайтами узнавания для Сге рекомбиназы. Были получены восемь трансгенных линий, содержащих данную конструкцию. После делеции районов конструкции с помощью Сге и FLP рекомбиназ, были получены производные без энхансеров (enh") и без промоторной области (рг"). Для всех восьми позиций в геноме гетерозиготные мухи enh*/ рг' имели пигментацию в теле и крыльях близкую к уровню пигментации дикого типа, даже несмотря на то, что в одном случае местом встройки оказалась гетерохроматинизированная четвёртая хромосома, а во втором - прителомерная область, из чего был сделан вывод о возможности осуществления транс-активации гена yellow во всех местах генома Drosophila melanogaster, а не только в эндогенном локусе yellow. Затем была проверена возможность транс-активации гена yellow при условии, что enh" и рг" производные были взяты из трансгенных линий с разными местами встройки конструкции в геном, т.е. могут ли энхансеры активировать промотор, находящийся в другой негомологичной расположению энхансеров позиции генома. Во всех случаях никакой трансактивации не наблюдалось, из чего было сделано заключение, что трансвекция в локусе yellow является зависимой от соматического спаривания гомологичных хромосом.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Кравченко, Елена Владимировна

5. выводы

1. На основе регуляторных систем генов yellow и mini-white создана модельная система для изучения транс-взаимодействий между регуляторными элементами в геноме Drosophila melanogaster.

2. Установлено, что уровень транс-активации энхансерами гена yellow промотора гена yellow в значительной степени зависит от места в геноме D. melanogaster.

3. Показано, что gypsy инсуляторы, находясь на гомологичных хромосомах даже на некотором удалении от энхансер-промоторной пары, способны стабилизировать транс-активацию промотора.

4. Продемонстрировано, что в ряде случаев gypsy инсуляторы участвуют в коммуникации между энхансером и промотором, которые находятся на большом расстоянии друг от друга. Выявлена роль белков Su(Hw) и Mod(mdg4) в этом процессе.

5. Показано, что линейное расстояние между трансгенными инсерциями в негомологичные локусы не является определяющим условием для установления транс-взаимодействия между ними.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кравченко, Елена Владимировна, Москва

1. Ashe HL, Monks J, Wijgerde M, Fraser P, Proudfoot NJ. 1997. Intergenic transcription and transinduction of the human-globin locus. Genes DevA 1:2494-509

2. Babu, P., and S. Bhat. 1980. Effect of zeste on white complementation. Basic Life Sci. 16:35^10.

3. Babu P, Bhat SG. 1981. Role of zeste in transvection at the bithorax locus of Drosophila. Mol. Gen. Genet. 183:400-2

4. Babu P, Selvakumar KS, Bhosekar S. 1987. Studies on transvection at the bithorax complex in Drosophila melanogaster. Mol. Gen. Genet. 210:55763

5. Bantignies, F., C. Grimaud, S. Lavrov, M. Gabut, and G. Cavalli. 2003. Inheritance of Polycomb-dependent chromosomal interactions in Drosophila. Genes Dev. 17:2406-2420.

6. Barges S., Mihaly J., Galloni M. et al. The Fab-8 boundary defines the distal limit of the bithorax complex iab-1 domain and insulated iab-1 from initiation elements and a PRE in the adjacent iab-8 domain // Development. 2000. V.127 P.779-790.

7. Bell A., West G., Felsenfeld G. Insulators and boundaries: versatile regulatory elements in the eukaryotic genome // Science. 2001. V.291. P.447-450.

8. Benyajati C, Mueller L, Xu N, Pappano M, Gao J, Mosammaparast M, Conklin D, Granok H, Craig C, Elgin S. 1997 Multiple isoforms of GAGA factor, a critical component of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 15;25(16):3345-53

9. Berger, S.L. (2002). Histone modifications in transcriptional regulation. Curr. Opin. Genet. Dev. 12, 142-148.

10. Benson, M., and V. Pirrotta. 1987. The product of the Drosophila zeste gene binds to specific DNA sequences in white and Ubx. EMBO J. 6:1387-1392.

11. Benson, M., and V. Pirrotta. 1988. The Drosophila zeste protein binds cooperatively to sites in many gene regulatory regions: implications for transvection and gene regulation. EMBO J. 7:3907-3915.

12. Bickel, S., and V. Pirrotta. 1990. Self-association of the Drosophila zeste protein is responsible for transvection effects. EMBO J. 9:2959-2967.

13. Blackwood, E. M., and J. T. Kadonaga. 1998. Going the distance: a current view of enhancer action. Science 281:61-63.

14. Blanton, J., M. Gaszner, and P. Schedl. 2003. Protein:protein interactions and the pairing of boundary elements in vivo. Genes Dev. 17:664-675.

15. Busturia, A., and Bienz, M. (1993). Silencers in abdominal-B, a homeotic Drosophila gene. EMBO J. 12, 1415-1425.

16. Byrd, K., and V. G. Corces. 2003. Visualization of chromatin domains created by the gypsy insulator of Drosophila. J. Cell Biol. 162:565—574.

17. Cai, H. and M. Levine. 1995. Modulation of enhancer-promoter interac-tions by insulators in the Drosophila embryo. Nature 376: 533-536.

18. Cai, H. N., and P. Shen. 2001. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. Science 291:493-495.

19. Cai, H. N., Z. Zhang, J. R. Adams, and P. Shen, 2001 Genomic context modulates insulator activity through promoter competition. Development 128: 4339-47.

20. Csink AK, Henikoff S. 1996. Genetic modification of heterochromatic association and nuclear organization in Drosophila. Nature 381:529—31

21. Chen, J. L., K. L. Huisinga, M. M. Viering, S. A. Ou, C. T. Wu, and P. K. Geyer. 2002. Enhancer action in trans is permitted throughout the Drosophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:3723-3728.

22. Chen JD, Chan CS, Pirrotta V. 1992. Conserved DNA binding and self association domains of the Drosophila zeste protein. Mol. Cell. Biol. 12:598-608

23. Chubb JR, Bickmore WA: Considering nuclear compartmentalization in the light of nuclear dynamics.Cell 2003, 112:403-406.

24. Cloutier, T. E., Widom, J. (2005). DNA twisting flexibility and the formation of sharply looped protein-DNA complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102: 3645-3650

25. Cook, P.R. 1997. The transcriptional basis of chromosome pairing. J. Cell Sci. 110: 1033-1040.

26. Coulthard A.B, Nolan N, Bell J.B, Hilliker A.J 2005. Transvection at the vestigial Locus of Drosophila melanogaster. Genetics 170(4): 1711-21.

27. Dillon, N., T. Trimborn, J. Strouboulis, P. Fraser, and F. Grosveld. 1997. The effect of distance on long-range chromatin interactions. Mol. Cell 1: 131-139.

28. Dorn R, Reuter G, Loewendorf A. 2001. Transgene analysis proves mRNA ira/is-splicing at the complex mod{mdgA) locus in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9724-29

29. Dorsett, D. 1999. Distant liaisons: long-range enhancer-promoter interactions in Drosophila. Curr. Op in. Genet. Dev. 9:505-514.

30. Dreesen T.D., S. Henikoff, K. Loughney 1991 A pairing-sensitive element that mediates trans-inactivation is associated with the Drosophila brown gene, Genes Dev. 5: 331- 340.

31. Duncan, I. W. 2002. Transvection effects in Drosophila. Annu. Rev. Genet. 36:521-556.

32. Duncan I. 1987. The bithorax complex. Annu. Rev. Genet. 21: 285-319

33. Emery, D.W., Yannaki, E., Tubb, J., and Stamatoyannopoulos, G. 2000. A chromatin insulator protects retrovirus vectors from chromosomal position effects. Proc. Natl Acad. Sci. 97: 9150-9155

34. Felsenfeld, G., and McGhee, J.D. (1986). Structure of the 30 nm chromatin fiber. Cell 44, 375-377.

35. Felsenfeld, G. et al. Chromatin structure and gene expression. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93, 9384-9388 (1996).

36. Fung, J. C., W. F. Marshall, A. Dernburg, D. A. Agard, and J. W. Sedat. 1998. Homologous chromosome pairing in Drosophila melanogaster proceeds through multiple independent initiations. J. Cell Biol. 141:5—20.

37. Gause, M. , Georgiev P. 2000. Interactions between su(Hw)-binding regions in neighboring y2 and scDl alleles hinder trans-activation of the y2 promoter by yellow enhancers located on a homologous chromosome. Mol Gen Genet. 2000 Oct;264(3):222-6.

38. Gdula, D.A., T.I. Gerasimova, and V.G. Corces, 1996. Genetic and molecular analysis of the gypsy chromatin insulator of Drosophila. Proc. Natl Acad. Sci. 93: 9378-9383.

39. Gelbart, W. M. 1982. Synapsis-dependent allelic complementation at the decapentaplegic gene complex in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2636-2640.

40. Gelbart, W. M., and C. T. Wu. 1982. Interactions of zeste mutations with loci exhibiting transvection effects in Drosophila melanogaster. Genetics 102: 179-189.

41. Gemkow MJ, Verveer PJ, Arndt-Jovin DJ. 1998. Homologous association of the Bithorax-Complex during embryo-genesis: consequences for transvection in Drosophila melanogaster. Development 125:4541—52

42. Georgiev, P., and M. Kozycina. 1996. Interaction between mutations in the suppressor of Hairy wing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gypsy-induced mutations. Genetics 142: 425-436.

43. Georgiev, P. G., and T. I. Gerasimova. 1989. Novel genes influencing theexpression of the yellow locus and mdg4 (gypsy) in Drosophila melanogaster. Mol. Gen. Genet. 220:121-126.

44. Gerasimova, T. I., K. Byrd, and V. G. Corces. 2000. A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA. Mol. Cell 6:1025-1035.

45. Gerasimova, T. I., and V. G. Corces. 1998. Polycomb and trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator. Cell 92:511—521.

46. Gerasimova, T. I., and V. G. Corces. 2001. Chromatin insulators and boundaries: effects on transcription and nuclear organization. Annu. Rev. Genet. 35:193-208.

47. Gerasimova, T. I., D. A. Gdula, D. V. Gerasimov, O. Simonova, and V. G. Corces. 1995. A Drosophila protein that imparts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation. Cell 82:587-597.

48. Geyer, P. K., and V. G. Corces. 1987. Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster. Genes Dev. 1:996-1004.

49. Geyer, P. K., M. M. Green, and V. G. Corces. 1990. Tissue-specific transcriptional enhancers may act in trans on the gene located in thehomologous chromosome: the molecular basis of transvection in Drosophila. EMBOJ. 9:2247-2256.

50. Geyer, P.K. 1997. The role of insulator elements in defining domains of gene expression. Curr. Opin. Genet. Dev. 7: 242-248.

51. Ghosh, D., Т. I. Gerasimova, and V. G. Corces. 2001. Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function. EMBOJ. 20:2518-2527.

52. Goldsborough, A. S., and Т. B. Kornberg. 1996. Reduction of transcription by homologue asynapsis in Drosophila imaginal discs. Nature 381:807-810.

53. Golovnin, A., E. Melnick, A. Mazur, and P. Georgiev. 2005. Drosophila Su(Hw) insulator can stimulate transcription of a weakened yellow promoter over a distance. Genetics 170:1133-1142.

54. Gubb, D., J. Roote, J. Treaner, D. Coulson, and M. Ashburner, 1997 Topological constraints on transvection between white genes within the transposing element ТЕЗ5B in Drosophila melanogaster. Genetics 146: 91937.

55. Hendrickson, J. E. and S. Sakonju, 1995 Cis and trans interactions between iab regulatory regions and abdominal-A and Abdominal-B in Drosophila melanogaster. Genetics 139: 835-48.

56. Henikoff, S., and L. Comai. 1998. Trans-sensing effects: the ups and downs of being together. Cell 93:329-332.

57. Henikoff, S. Nuclear organization and gene expression: homologous pairing and long-range interactions. 1997 Curr.Opin.Cell Biol. 9: 388-395

58. Hiraoka, Y., A. F. Dernburg, S. J. Parmelee, M. C. Rykowski, D. A. Agard, and J. W. Sedat. 1993. The onset of homologous chromosome pairing during Drosophila melanogaster embryogenesis. J. Cell Biol. 120:591-600.

59. Hopmann R, Duncan D & Duncan I (1995) Transvection in the iab-5,6,7 region of the bithorax complex of Drosophila: homology independent interactions. Trans Genet 139, 815-833.

60. Jack JW, Judd BH. 1979. Allelic pairing and gene regulation: a model for the zeste-white interaction in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1368-72

61. Jijakli H, Ghysen A. 1992. Segmental determination in Drosophila central nervous system: analysis of the abdominal-A region of the bithorax complex. Int. J. Dev. Biol. 36:93-99

62. Karess, R. E., and G. M. Rubin. 1984. Analysis of P transposable element functions in Drosophila. Cell 38:135-146.

63. Kassis JA. 2002. Pairing-sensitive si-lencing, Polycomb group response elements, and transposon homing in Drosophila. Adv. Genet. 46:421—38

64. Kaufman, T. C., S. E. Tasaka, and D. T. Suzuki. 1973. The interaction of two complex loci, zeste and bithorax in Drosophila melanogaster. Genetics 75:299-321.

65. Kennison, J. A., and J. W. Southworth. 2002. Transvection in Drosophila. Adv. Genet. 46:399-420.

66. Kuhn, E. J., and P. K. Geyer. 2003. Genomic insulators: connecting properties to mechanism. Curr. Opin. Cell Biol. 15:259-265.

67. Kuhn, E. J., M. M. Viering, K. M. Rhodes, and P. K. Geyer. 2003. A test of insulator interactions in Drosophila. EMBO J. 22:2463-2471.

68. Lavrov, S., J. Dejardin, and G. Cavalli. 2004. Combined immunostaining and FISH analysis of polytene chromosomes. Methods Mol. Biol. 247:289303.

69. Leiserson, W. M., N. M. Bonini, and S. Benzer. 1994. Transvection at the eyes absent gene of Drosophila. Genetics 138:1171—1179.

70. Lewis, E. B. 1954. The theory and application of a new method of detecting chromosomal rearrangements in Drosophila melanogaster. Am. Nat. 88: 225-239.

71. Lewis EB. 1985. Regulation of the genes of the bithorax complex in Drosophila. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.L: 155-64

72. Lifschytz E, Green MM. 1984. The zeste white interaction: induction and genetic analysis of a novel class of zeste alleles. EMBO J. 3:999-1002

73. Lifschytz, E., and D. Hareven. 1982. Heterochromatin markers: arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster. Chromosoma 86:443-455.

74. Lindsley, D. L., and G. G. Zimm. 1992. The genome of Drosophila melanogaster. Academic Press, New York, N.Y.

75. Mahmoudi T, Katsani KR, Verrijzer CP: GAGA can mediate enhancer function in trans by linking two separate DNA molecules. EMBO J 2002, 21:1775-1781.

76. Majumder P. and Cai H. The functional analysis of insulator interactions in the Drosophila embryo 2003. PNAS vol. 100 9: 5223-5228

77. Martin, M., Y. B. Meng, and W. Chia. 1989. Regulatory elements involved inthe tissue-specific expression of the yellow gene of Drosophila. Mol. Gen.Genet. 218:118-126.

78. Martin-Morris L.E., K. Loughney, E.O. Kershisnik, G. Poortinga, S.Henikoff 1993. Characterization of sequences responsible for trans-inactivationof the Drosophila brown gene. Quant. Biol. 58 (1993) 577- 584.

79. Martinez-Laborda, A., A. Gonzalez-Reyes, and G. Morata, 1992. Trans regulation in the Ultrabithorax gene of Drosophila: Alterations in the promoter enhance transvection. EMBO J. 11: 3645-52.

80. Matzke M, Mette MF, Jakowitsch J, Kanno T, Moscone EA, et al. 2001. Atest for transvection in plants: DNA pairing may lead to /ra«s-activation or silencing of complex heteroalleles in tobacco. Genetics 158:451-61

81. Melnikova, L., F. Juge, N. Gruzdeva, A. Mazur, G. Cavalli, and P. Georgiev. 2004. Interaction between the GAGA factor and Mod(mdg4) proteins promotes insulator bypass in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 14806-14811.

82. Mihaly J, Hogga I, Gausz J, Gyurkovics H, Karch F. 1997. In situ dissection of the Fab-7 region of the bithorax complex into a chromatin domain boundary and a Po/ycomb-response element. Development 124:1809-20

83. Modolell, J., W. Bender, and M. Meselson. 1983. Drosophila melanogaster mutations suppressible by the suppressor of Hairy-wing are insertions of a 7.3-kilobase mobile element. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1678-1682.

84. Morris, J. R, J. Chen, S. T. Filandrinos, R. C. Dunn, R. Fisk, P. K. Geyer and C. Wu. 1999. An analysis of transvection at the, yellow locus of Drosophila melanogaster. Genetics 151:633-651.

85. Morris, J. R., J. L. Chen, P. K. Geyer, and C. T. Wu. 1998. Two modes of transvection: enhancer action in trans and bypass of a chromatin insulator in cis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10740-10745.

86. Morris, J. R., P. K. Geyer, and C. T. Wu. 1999. Core promoter elements can regulate transcription on a separate chromosome in trans. Genes Dev. 13: 253-258.

87. Muller, M., K. Hagstrom, H. Gyurkovics, V. Pirrotta, and P. Schedl. 1999. The mcp element from the Drosophila melanogaster bithorax complex mediates long-distance regulatory interactions. Genetics 153:1333-1356.

88. Muravyova, E., A. Golovnin, E. Gracheva, A. Parshikov, T. Belenkaya, V. Pirrotta, and P. Georgiev. 2001. Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. Science 291:495^498.

89. Pai, C. Y., E. P. Lei, D. Ghosh, and V. G. Corces. 2004. The centrosomal protein CP 190 is a component of the gypsy chromatin insulator. Mol. Cell 16:737-748.

90. Parnell, T. J., M. M. Viering, A. Skjesol, C. Helou, E. J. Kuhn, and P. K. Geyer. 2003. An endogenous suppressor of hairy-wing insulator separates regulatory domains in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 1343613441.

91. Pirrotta, V. 1998. Polycombing the genome: PcG, trxG, and chromatin silencing. Cell 93:333-336.

92. Pirrotta, V. 1999. Transvection and chromosomal trans-interaction effects. Biochim. Biophys. Acta 1424:M1-M8.

93. Pirrotta, V., E. Manet, E. Hardon, S. E. Bickel, and M. Benson. 1987. Structure and sequence of the Drosophila zeste gene. EMBO J. 6:791-799.

94. Ptashne, M. How eukaryotic transcriptional activators work. Nature 335,683-689(1988).

95. Ringrose, L., Chabanis, S., Angrand, P.O., Woodroofe, C. and Stewart, A.F. (1999) Quantitative comparison of DNA looping in vitro and in vivo: chromatin increases effective DNA flexibility at short distances. EMBO J., 18, 6630-6641.

96. Rollins, R.A., Korom, M., Aulner, N., Martens, A., and Dorsett, D. (2004). Drosophila nipped-B protein supports sister chromatid cohesion and opposes the long-range activation of the cut gene. Mol. Cell. Biol. 24, 31003111.

97. Roseman R, Pirrotta V., Geyer P. The Su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects // EMBO J. 1993. V.12. P.435-442.

98. Rossignol J-L, Faugeron G. 1994. Gene inactivation triggered by recognition between DNA repeats. Experientia 50: 307—17

99. Rothberg I, Hotaling E, Sofer W. 1991. A Drosophila Adh gene can be activated in trans by an enhancer. Nucleic Acids. Res. 19:5713-17

100. Sage BT, Jones JL, Holmes AL, Wu MD, Csink AK 2005. Sequence elements in cis influence heterochromatic silencing in trans Mol Cell Biol. 25(l):377-88.

101. Sass, G., S. Henikoff. 1999. Pairing-dependent mislocalization of a Drosophila brown gene reporter to a heterochromatic environment. Genetics 152:595-604

102. Saurin, A. J., C. Shiels, J. Williamson, D. P. Satijn, A. P. Otte, D. Sheer, and P. S. Freemont. 1998. The human polycomb group complex associates with pericentromeric heterochromatin to form a novel nuclear domain. J. Cell Biol. 142:887-898.

103. Savitsky, M., T. Kahn, E. Pomerantseva, and P. Georgiev. 2003. Transvection at the end of the truncated chromosome in Drosophila melanogaster. Genetics 163:1375—1387.

104. Scott K., Geyer P. Effects of the Su(Hw) insulator protein on the expression of the divergently transcribed Drosophila yolk protein genes I I EMBO J. 1995. V.14. P.6258-6279

105. Selker EU. 2002. Repeat-induced gene silencing in fungi. Adv. Genet. 46:439-50

106. Sigrist, C. J., and V. Pirrotta. 1997. Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by the Drosophila polycomb response element (PRE) but allow trans interactions between PREs on different chromosomes. Genetics 147:209-221.

107. Simon J, Chiang A, Bender W, Shimell MJ, O'Connor M. 1993. Elements of the Drosophila bithorax complex that mediate repression by Polycomb group products. Dev. Biol. 158:131—44

108. Sipos, L., J. Mihaly, F. Karch, P. Schedl, J. Gausz, and H. Gyurkovics, 1998 Transvection in the Drosophila Abd-B domain: extensive upstream sequences are involved in anchoring distant cis-regulatory regions to the promoter. Genetics 149: 1031-50.

109. Smolik-Utlaut SM, Gelbart WM. 1987. The effects of chromosomal rearrangements on the zeste-white interaction in Drosophila melanogaster. Genetics 116: 285-98

110. Spana, C., D. A. Harrison, and V. G. Corces. 1988. The Drosophila melanogaster suppressor of Hairy-wing protein binds to specific sequences of the gypsy retrotransposon. Genes Dev. 2:1414-1423.

111. Sun F.-L., Elgin S. Putting boundaries on silence // Cell. 1999. V.99. P.459-462.

112. Talbert PB, LeCiel CDS, Henikoff S. 1994. Modification of the Drosophila heterochromatic mutation brown Dominant by linkage alterations. Genetics 136: 559—71

113. Udvardy, A. 1999. Dividing the empire: boundary chromatin elements delimit he territory of enhancers. EMBO J. 18:1-8.

114. Wei, W., and M. D. Brennan. 2001. The gypsy insulator can act as a promoterspecific transcriptional stimulator. Mol. Cell. Biol. 21:7714-7720.

115. West, A. G., M. Gaszner, and G. Felsenfeld. 2002. Insulators: many functions, many mechanisms. Genes Dev. 16:271-288.

116. West A. and Fraser P. 2005 Remote control of gene transcription Human Molecular Genetics. Vol. 14: 101-111

117. Wu C-T (1993) Transvection, nuclear structure, and chromatin proteins. J Cell Biol 120, 587-590.

118. Wu, C. T., and J. R. Morris. 1999. Transvection and other homology effects. Curr. Opin. Genet. Dev. 9:237-246.

119. Zhou J, Ashe H, Burks C, Levine M. 1999. Characterization of the transvection mediating region of the Abdominal-B locus in Drosophila. Development 126:3057-65

Информация о работе

Кравченко, Елена Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.26

Диссертация

Роль Gypsy инсулятора в процессах трансвекции у Drosophila melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы