Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм действия Su(Hw) инсулятора Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Савицкая, Екатерина Евгеньевна

1.ВВЕДЕНИЕ.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ. Инсуляторы - новые регуляторные элементы высших эукариот.

2.1. Определение и общие свойства инсуляторов.

2.2. Структура и функции инсуляторов.

2.2.1 .Su(Hw) инсулятор.

2.2.2. Инсуляторы локуса теплового шока hsp70 - scs и scs'.

2.2.3. Инсуляторы регуляторной области Abd-B гена.

2.2.4. Куриный р-глобиновый инсулятор.

2.3. Модели действия инсуляторов.

2.3.1. Структурные модели.••.

2.3.2. Транскрипционные модели.*.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Генетические методы.

3.1.1. Линии и мутации Drosophila melanogaster, использованные в данной работе

3.1.2. Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий.

3.1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite в трасгенных линиях.

3.1.4. Генетические скрещивания.

3.2. Биохимические методы.

3.2.1. Выделение ДНК из дрозофилы.

3.2.2. Саузерн-блот анализ.

3.2.3. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

3.2.4. Секвенирование плазмид и ПЦР продуктов.

3.2.5. Молекулярное клонирование.

3.2.6. Трансформация бактериальных клеток плазмидами.

3.2.7. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса.

3.2.8. Создание конструкций.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Создание модельной системы для изучения свойств Su(Hw) инсулятора.

4.2. Два Su(Hw) инсулятора, фланкирующие либо энхансеры, либо промотор гена yellow, сохраняют способность блокировать энхансер-промоторные взаимодействия

4.3. Два Su(Hw) инсулятора, расположенные между энхансерами и промотором гена yellow, не способны блокировать взаимодействия между энхансером и промотором—

4.4. Два Su(Hw) инсулятора, расположенные между энхансерами и промотором гена miniwhite, не только не препятствуют, но и способствуют энхансер-промоторным взаимодействиям.

4.5. Исследование роли мутации mod(mdg4)Iul в экспрессии гена miniwhite в линиях EyEwSYSW.

4.6. Исследование роли белкового продукта гена zeste в экспрессии гена miniwhite в линиях EyEwSYSW.

4.7. Роль положения Su(Hw) инсуляторов и расстояния между ними в эффекте нейтрализации инсуляции.

4.8. Три Su(Hw) инсулятора, расположенные между энхансером и промотором, нейтрализуют действие друг друга.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1. В основе явлений инсуляции и нейтрализации инсуляции лежит взаимодействие между Su(Hw) инсуляторами.

5.2. Анализ существующих моделей действия инсуляторов с точки зрения полученных результатов.

5.3. Возможная роль ВТВ доменов в инсуляции и в образовании взаимодействий между энхансером и промотором.

5.4. Роль белка Zeste во взаимодействии между энхансером и промотором гена miniwhite.

5.5. Новая модель явления инсуляции.

6.ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизм действия Su(Hw) инсулятора Drosophila melanogaster"

Геном высших эукариот содержит огромное количество генов и элементов их регуляции, таких как энхансеры и сайленсеры. Принято считать, что энхансеры способны определять временную и пространственную экспрессию генов, взаимодействуя непосредственно с белками транскрипционного комплекса, которые собираются на промоторе. Энхансеры могут активировать транскрипцию гена независимо от ориентации и находясь от промотора на расстоянии, которое может достигать нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов (Dorset* 1999). Многие энхансеры не имеют специфичности к определенному промотору и способны активировать транскрипцию с целого ряда генов. Так как в геноме гены располагаются часто достаточно близко друг к другу, возникает вопрос, каким образом энхансер взаимодействует с промотором своего гена и как предотвращается активация нежелательных промоторов, которые могут находится в непосредственной близости от энхансера.

Около десяти лет назад был открыт новый тип регуляторных элементов, названных инсуляторами. Инсуляторы - это регуляторные элементы, которые способны блокировать взаимодействия между энхансером и промотором гена только в том случае, если находятся между ними. Выяснение механизмов действия инсуляторов представляет большой интерес, так как позволяет приблизиться к пониманию проблемы взаимодействия между энхансером и промотором в геноме. Кроме того, изучение действия инсуляторов является важной прикладной задачей для создания векторов, которые способны поддерживать стабильную экспрессию генов вне зависимости от места интеграции в геноме. В настоящий момент открыто большое число инсуляторов у разных организмов от дрозофилы до человека, показана универсальность и консервативность их действия. Было предложено несколько моделей механизма действия инсуляторов. Однако ни одна из них не объясняет всех известных экспериментальных данных. Следует отметить, что за последние два года были найдены случаи, в которых инсуляторы оказываются неспособными блокировать действие энхансеров на промотор (Zhou and Levine 1999; Scott et al.1999). Для объяснения таких результатов было предложено существование факторов, которые способны модулировать инсуляторную активность или даже нейтрализовать ее. Выяснение причин нейтрализации действия инсуляторов и выявление модулирующих факторов является одним из ключей ведущих к решению проблемы механизмов действия инсуляторов, а, следовательно, механизму специфичного взаимодействия между энхансером и промотором на больших дистанциях.

Недавно в нашей лаборатории на примере генетической системы гена yellow и его супернестабильных мутаций, полученных при перемещении мобильных элементов, был описан случай отсутствия инсуляторной активности при расположении энхансеров между двумя инсуляторами (Gause et al. 1998). Генетические системы являются очень удобными объектами для изучения дальних взаимодействий между регуляторными элементами, однако, их недостатком является сложность и многокомпонентность, затрудняющие интерпретацию полученных результатов. Поэтому, задачей данной работы являлось исследование способности инсуляторов блокировать взаимодействие между энхансером и промотором в зависимости от числа и расположения инсуляторов на модельной системе с помощью трансгенных конструкций.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ИНСУЛЯТОРЫ - НОВЫЕ РЕГУЛЯТОРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ВЫСШИХ

ЭУКАРИОТ

Энхансерами принято называть последовательности ДНК, которые способны активировать транскрипцию независимо от ориентации и расстояния до точки начала транскрипции. Ярким примером может служить энхансер wing margin локуса cut дрозофилы, который активирует транскрипцию находясь на расстоянии 85 т.п.н. от промотора (Jack et al. 1991) . Несмотря на то, что к настоящему времени описано большое количество энхансеров и промоторов, остается много вопросов относительно механизмов их взаимодействия. В частности неизвестно, каким образом белки, связывающиеся с энхансером, взаимодействуют с транскрипционным комплексом, собранным на промоторе, минуя большие расстояния, и каким образом происходит взаимодействие между "правильными" энхансером и промотором. Многие из существующих экспериментальных данных косвенно согласуются с тем, что белки, связанные с энхансером, непосредственно взаимодействуют с белками основного транскрипционного комплекса или вспомогательными белками, собранными на промоторе, при этом ДНК между ними образует петлю (Blackwood and Kadonaga 1998). Существуют также другие модели взаимодействия между энхансером и промотором. Например, одна из моделей предполагает существование белков посредников, которые способны кооперативно взаимодействовать между собой, а также с большим количеством сайтов на ДНК, что приводит к притягиванию, собранных на энхансере и промоторе белковых комплексов друг к другу (Dorsett 1999).

В понимании механизмов дальних взаимодействий между регуляторными элементами большую роль могут сыграть инсуляторы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Савицкая, Екатерина Евгеньевна

6. выводы

1. На основе регуляторных систем генов yellow и miniwhite создана модельная система для изучения явления инсуляции, базирующаяся на методе стабильной интеграции репортерных генов в геном Drosophila melanogaster.

I. Впервые показано, что два и три Su(Hw) инсулятора способны взаимодействовать, в некоторых ситуациях это может приводить к нейтрализации их способности блокировать взаимодействия между энхансером и промотором.

3. Продемонстрировано, что в некоторых ситуациях Su(Hw) инсуляторы участвуют в коммуникации между энхансером и промотором. Выявлена роль белков Su(Hw) и Mod(mdg4) в этом процессе.

4. Показана роль белка Zeste в коммуникации между энхансером и промотором гена miniwhite.

5. Предложена новая модель действия инсуляторов, которая основана на взаимодействии между Su(Hw) инсуляторами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савицкая, Екатерина Евгеньевна, Москва

1. Barges S., Mihaly J., Galloni M. et al. The Fab-8 boundary defines the distal limit of the thorax complex iab-1 domain and insulated iab-1 from initiation elements and a PRE in the Ijacent iab-8 domain // Development. 2000. V.127 P.779-790.

2. Bi X., Broach J. Chromosomal boundaries in S. cerevisiae II Curr. Opin. Gen. Dev. 2001. /.11. P. 199-204.

3. Bi X., Broach J. UAS rpg can function as a heterochromatin boundary element in yeast // jenes Dev. 1999. V. 13. P.1089-1101.

4. Blackwood E., Kadonaga J. Going the distance: a current view of the enhancer action // Science. 2001. V.281. P.60-63.

5. Breiling A., Bonte S., Ferrari P. et al. The Drosophila polycomb protein interacts with nucleosomal core particles in vitro via its repression domain I I Mol. Cell. Biol. 1999. V.19. P.8451-8460.

6. Buchner К., Roth P., Schotta G., Krauss V., Saumweber H., Reuter G., Dorn R. Genetic d molecular complexity of the position effect variegation modifier mod(mdg4) in Drosophila Genetics. 2000. V.155. P. 141-157.

7. Cai H., Levine M. Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the rosophilaembryo //Nature. 1995. V. 376. P. 533-536.

8. Cai H., Levine M. The gypsy insulator can function as a promoter-specific silencer in the drosophila embrio //EMBO J. 1997. V.16. P.1732-1741.

9. Cai H., Shen P. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking ctivity // Science. 2001. V.291. P.293-295.

10. Chervitz S., Aravind L., Sherlock et al. Composition of the complete protein sets of worm nd yeast: orthology and divergence // Science. 1998. V.282. P.2022-2028.

11. Chung J., Whitely M., Felsenfeld G. A 5' element of the chicken p-globin domain serves as n insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila // Cell. 993. V. 74. P. 505-514.

12. Chung J., Bell A., Felsenfeld G. Characterization of the chicken beta-globin insulator // >roc. Natl. Acad. Sci. USA. V.94. P.575-580.

13. Cuvier O., Hart C., Laemmli U. Identification of a class of chromatin boundary elements // Viol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P. 7478-7486.

14. Dunaway M., Hwang J., Xiong M., Yuen H. The activity of the scs and scs' insulator elements is not dependent on chromosomal context // Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P.182-189.

15. Donze D., Adams C.R., Rine J. et al. The boundaries of the silenced HMR domain in Saccharomyces cerevisiae II Genes Dev. 1999. V.13. P.698-708.

16. Dorsett D. Distant liaisons: long range enhancer-promoter interactions in Drosophila II Curr. Opin.Genet. Dev. 1999. V. 9. P. 505-514.

17. Farkas G., Leibovitch В., Elgin S. Chromatin organization and transcriptional control of гпе expression in Drosophila // Gene. 2000. V.253.P.117-136.

18. Georgiev P., Kozycina M Interaction between mutations in the suppressor of Hairy wing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gypsy-induced mutations // Genetics. 1996. V. 142. P. 425-436.

19. Georgiev P., Corces V. The Su(Hw) protein bound to gypsy sequences in one chromosome can repress enhancer-promoter interactions in the paired gene located in the other homolog // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V.92. P.5184-5188.

20. Gerasimova Т., Corces V. Polycomb and Trithorax group proteins mediate the function of chromatin insulator // Cell. 1998. V. 92. P.511-521.

21. Gerasimova Т., Gdula D., Gerasimov D., Simonova O., Corces V. A Drosophila protein iat impacts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation Cell. 1995. V. 82. P.587-597.

22. Gerasimova Т., Kyrd K., Corces V. A chromatin insulator determines the nuclear >calization of DNA // Mol.Cell. V.6. P.1025-1035.

23. Geyer P. The role of insulator elements in defining domains of gene expression // Curr. >pin Genet. Dev. 1997. V. 7. P. 242-248.

24. Geyer P., Corces V. DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc inger protein // Genes Dev. 1992. V.6. P.1865-1873.

25. Geyer P., Corces V. Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern >f tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila nelanogaster II Genes Dev. 1987. V.l. P.996-1004.

26. Golic K., Lindquist S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome // Cell. 1989. V.59. P.499-509.

27. Gorczyca M., Popova X., Budnik V. The gene mod(mdg4) affects synapse specificity and structure in Drosophila II J.Neurobiol. 1999. V.39. P.447-460.

28. Hagstrom К., Muller M., Schedl P. Fab-7 functions as a chromatin domain boundary to isure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex // Genes Dev. 1996. .10. P.3202-3215.

29. Hark A., Schoenherr C., Katz D. et al. CTCF mediates methilation-sensitive enhancer-locking activity at the H19/Igf2 locus // Nature. 2000. V.405. P.486-489.

30. Harrison D., Gdula D., Coyne R., Corces V. A leucine zipper domain of the suppressor of fairy-wing protein mediates its repressive effect on enhancer function // Genes Dev. 1993. r.7. P. 1966-1978.

31. Hart C., Zhao K., Laemmli U. The scs' boundary element: characterization of boundary lement-assaciated factors // Mol. Cell. Biol. 1997. Y.17. P.999-1009.

32. Holdridge C., Dorsett D. Repression of hsplO heat shock gene transcription by the uppressor of Hairy-wing protein of Drosophila melanogaster // Mol. Cell. Biol. V.l 1. P. 1894900.

33. Jack J., Dorsett D., DeLotto Y. et al. Expression of the cut locus in the Drosophila wing nargin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer // Development. 1991. V.l 13. P.735-747.

34. Katsam K., Hajibagheri M., Verrijzer C. Cooperative DNA binding by GAGA transcription factor requires the conserved BTB/POZ domain and reorganizes promoter topology // EMBO J. 1999. V.l 8. P.698-708.

35. Kares R., Rubin G. Analysis of P transposable element functions in Drosophila II Cell. 1984. V.38. P. 135-146.

36. Kellum R., Schedl P. A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains // Cell. 1991. V. 64. P.941-950.

37. Kellum R., Schedl P. A group of scs elements function as domain boundaries in an ihancer-blocking assay//MoL Cel BioL 1992. V. 12. P. 2424-2431.

38. Kim J., Shen В., Rosen С., Dorsett D. The DNA-binding and enhancer-blocking domains of ie Drosophila suppressor of Hairy-wing protein // MoL Cell Biol 1996. V. 16. P.3381-3392.

39. Krebs J. E., Dunaway M. Insulator elements impart a cis requirement on enhancer-promoter iterations //MoL Cell. 1998. V. 1. P. 301-308.

40. Lu L., Tower J. A transcriptional insulator element, the su(Hw) binding site, protects a hromosomal DNA replication origin from position effects // Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. .2202-2206.

41. Lindsley D., Zimm G. The genome of Drosophila melanogaster. Academic Press, New 'ork. //1992.

42. Mihaly J., Hogga I., Barges S., Gallon M., Mishra R., Hagstrom K., Muller M., Schedl P., Sipos L., Gausz J., Gyurkovics H., Karch F. Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex // Cell. Mol. Life Sci. 1998. V. 54. P. 60-70.

43. Mongelard F., Corces V. Two insulators are not better than one // Nat. Struct, biol. 2001. V.8. P. 192-194.

44. Morcfflo P., Rosen C., Baylies M, Dorsett D. Chip, a widely expressed chromosomal protein required for segmentation and activity of a remote wing margin enhancer in Drosophila //GenesDev. 1997. V.ll.P.2729-2740.

45. К Morcillo P., Rosen С., Dorsett D. Genes regulating the remote wing margin enhancer in the rosophila cut locus // Genetics. 1996. V.144. P. 1143-1154.

46. Muller M., Hangstrom K., Gyurkovics H., Pirrotta V., Schedl P. The Мер element from the rosophila melanogaster bithorax complex mediates long-distance regulatory interactions // enetics. 1999. V.153. P.1333-1356.

47. Nabirochkin S., Ossokina M., Heidmann T. A nuclear matrix/scaffold attachment region co-icalizes with the gypsy retrotransposon insulator sequence // J.Biol.Chem. 1998. V.273. .2473-2479.

48. Ohtsuki S., Levine M. GAGA mediates the enhancer blocking activity of the eve promoter l the Drosophila embryo // Genes Dev. 1998. V.12. P.3325-3330.

49. Orihara M., Hosono C., Kojima Т., Saigo K. Identification of engrailed promoter elements ssential for interactions with a stripe enhancer in Drosophila embryos // Genes Cells. 1999. V.1. P.205-218.

50. Palla F., Melfi R., Anello L., Di Bernardo M., Spinelli G. Enhancer blocking activity located lear the 3* end of the sea urchin early H2A histone gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. /.94. P.2272-2277.

51. Parnell Т., Geyer P. Differences in insulator properties revealed by enhancer blocking issays on episomes // EMBO J. 2000. V.19. P.5864-5874.

52. Pikaart M., Recillas-targa F., Felsenfeld G. Loss of transcriptional activity of a transgene is accompanied by DNA methilation and histone deacetylation and is prevented by insulators // Genes Dev. 1998. V.12. P.2852-2862.

53. Pirrotta V., Steller H., Bozzetti M. Multiple upstream regulatory elements control the expression of the Drosophila white gene I I EMBO J. 1985. V.4. P.3501-3508.

54. Pirrotta V., Manrt Б., Hardon E., Bickel S., Benson M. Structure and sequence of the ■osophila zeste gene // EMBO J. 1987. V.6. P.791-799.

55. Pirrotta V. Polycomb silencing and the maintenance of stable chromatin states // Results obi. Cell Differ. 1999. V.25. P.205-228.

56. Pirrotta V. PcG complexes and chromatin silencing // Curr.Opin.Gen.Dev. 1997. V.7. 249-258.

57. Pirrotta V. Transvection and chromosomal trans-interaction effects // Biochim. Biophys. eta. 1999. V. 1424. P.M1-8.

58. Qian S., Varjavand В., Pirrotta V. Molecular analysis of the zeste-white interaction reveals promoter-proximal element essential for distant enhancer-promoter communication // enetics. 1992. V.131. P.79-90.

59. Recillas-Targa F., Bell A., Felsenfeld G. Positional enhancer-blocking activity of the tiicken P-globin insulator in transiently transfected cells // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1999. r.96. P.14354-14359.

60. Robinett C., O'Connor A., Dunaway M. The repeat organizer, a specialized insulator lement within the intergenic spacer of the Xenopus rRNA genes // Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. '.2866-2875.

61. Rollins S., Morsillo P., Dorsett D. Nipped-B, a Drosophila homologue of chromosomal idherins, participates in activation by remote enhancers in the cut and Ultrabithorax genes // jenetics. 1999. V.152. P.577-593.

62. Roseman R, Pirrotta V., Geyer P. The Su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects // EMBO J. 1993. V.12. P.435-442.

63. Rubin G., Sprandling A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element jctors // Science. 1982. V.218. P.348-353.

64. Sanger F., Nicken S., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc iatl. Acad. Sci. USA. 1977. V.74. P.5463-5487.

65. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual, Ed.2. Cold pring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY //1989.

66. Scott K., Geyer P. Effects of the Su(Hw) insulator protein on the expression of the ivergently transcribed Drosophila yolk protein genes // EMBO J. 1995. V.l4. P.6258-6279.

67. Scott K., Taubman A., Geyer P. Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator iepends upon insulator anatomy and enhancer strength // Genetics. 1999. V.153. P.787-798.

68. Shao Z., Raible R., Mollaaghababa R. et al. Stabilization of chromatin structure by PRC1, a jolycomb complex // Cell. 1999. V.98. P.37-46.

69. Sigrist C., Pirrotta V. Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by he Drosophila Polycomb Response Element (PRE) but allow trans interactions between PREs ш different chromosomes // Genetics. 1997. V.l47. P.209-221.

70. Smith P., Corces V. The suppressor of Hairy-wing binding region is required for gypsy mutagenesis // Mol.Gen.Genet. 1992. V.233. P.65-70.

71. Spana C., Harrison D., Corces V. The Drosophila melanogaster supressor of Hairy wing protein binds to specific sequences of the gypsy retrotransposon // Genes Dev. 1988. V.2. P.1414-1423.

72. Spana C., Corces V. DNA bending is a determinant of binding specificity for a Drosophila zink finger protein // Genes Dev. 1990. V.4. P.1505-1515.

73. Sun F.-L., Elgin S. Putting boundaries on silence // Cell. 1999. V.99. P.459-462.

74. Udvardy A., Maine E., Schedl P. The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin ructures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains J. Mol. Biol. 1985. V.185. P.341-358.

75. Vazquez J., Schedl P. Deletion of an insulator element by the mutation facet-strawberry in drosophila melanogaster It Genetics. 2000. V.155. P.1297-1311.

76. Webber A., Ingram R., Levorse J. et al. Location of enhancers is essential for imprinting of 119 and Igf2 // Nature. 1998. V.391. P.711-715.

77. Zhao K., Hart С. M, Laemmli U. Visualization of chromosomal domains with boundary slement-associated factor BEAF-32 // Cell. 1995. V. 81. P. 879-889.

78. Yoshida C., Tokumasu F., Hohmura K. et al. Long range interaction of cis-DNA elements nediated by architectural transcription factor Bachl // Genes Cells. 1999. V. 4 P.643-655.

79. Zhong X., Krangel M. An enhancer-blocking element between alpha and delta gene segments within the human T cell receptor alpha/delta locus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P.5219-5224.

80. Zhou J., Barolo S., Szymanski P. et al. The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo // Genes Dev. 1996. V.10. P.3195-3201.

81. Zhou J., Levine M. A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embryo // Cell. 1999. V. 99. P.567-575.

82. Zhou J., Ashe H., Burks C. et al. Characterization of the transvection mediating region of e Abdominal-B locus in Drosophila II Development. 1999. V.126. P.3057-3065.