Изучение функциональных активностей инсуляторов из регуляторных областей генов yellow и white у D. melanogaster

Ерохин, Максим Максимович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение функциональных активностей инсуляторов из регуляторных областей генов yellow и white у D. melanogaster
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение функциональных активностей инсуляторов из регуляторных областей генов yellow и white у D. melanogaster"

На правах рукописи УДК 577.214.4:575.22

illllllllllllllllllllll

I 0034У9081

Ерохин Максим Максимович

Изучение функциональных активностей инсуляторов из регуляторных областей генов yellow» white у D. melanogaster

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

- о опт 2009

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва

2009

Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН

Научный руководитель: академик РАН, доктор биологических наук,

профессор П.Г. Георгиев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Е. Н. Набирочкина

доктор биологических наук, профессор М. В. Глазков

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится ^ октября 2009 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан ^сентября 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

канд. фарм. наук

Грабовская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Транскрипция является ключевым этапом, на котором контролируется уровень экспрессии генов. Инициация и регуляция транскрипции ДНК у высших эукариот с участием РНК-полимеразы II зависит от множества факторов: от цис-действующих регуляторных ДНК-последовательностей и транс-действующих белков. Цис-действующие регуляторные ДНК-последовательности включают энхансеры, сайленсеры, базальный промотор, инсуляторы. Энхансеры - ДНК-последовательности, представляющие собой сайты связывания белков-активаторов транскрипции. Энхансеры высших эукариот могут располагаться па разном расстоянии от промотора контролируемого ими гена. Так, некоторые энхансеры способны активировать гены на больших расстояниях, достигающих нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов. Энхансеры действуют вне зависимости от положения относительно направления транскрипции гена. Сайленсеры - элементы, оказывающие негативное влияние на транскрипцию генов; на них собираются белковые комплексы, подавляющие экспрессию генов. К сайленсерам относятся ДНК-элементы для сборки комплекса белков группы Polycomb (PRE - Polycomb Response Element). Так же как и энхансеры, сайленсеры действуют вне зависимости от их положения относительно направления транскрипции гена и не обладают специфичностью действия. Предполагается, что важная роль в контроле специфичности действия энхансеров и сайленсеров принадлежит инсуляторам. В настоящее время сформулированы два независимых критерия, по которым регуляторный элемент может быть отнесен к инсуляторам: способность блокировать энхансеры и служить барьером между транскрипционно активным хроматином и гетерохроматином. Инсуляторы блокируют активность энхансера, но это происходит только в том случае, если инсулятор находится между энхансером и промотором гена. При этом инсуляторы не влияют непосредственно на активность энхансера и промотора, то есть энхансер сохраняет способность влиять на незаблокированный инсулятором промотор, а промотор может быть активирован другим энхансером. Для некоторых инсуляторов показана способность блокировать репрессию, опосредованную сайленсерами.

В настоящее время существует две группы моделей функционирования инсуляторов. Модели первой группы предполагают физическое прикрепление белков, взаимодействующих с ДНК-последовательностью инсулятора либо к ядерному матриксу, либо к ядерной оболочке и/или стабильные взаимодействия между белковыми компонентами инсуляторов, что приводит к образованию петель, являющихся независимыми доменами транскрипции генов. Модели второй группы постулируют, что инсуляторы блокируют передачу (прием) сигнала от энхансера к промотору. Предполагается существование нестабильных взаимодействий между белками, взаимодействующими с инсуляторами и белками других регуляторных элементов (энхансеров или промоторов).

Несмотря на большое количество накопленной информации, ни одна из этих моделей не может объяснить все свойства инсуляторов. Становится очевидным, что как дальнейшее изучение многообразия инсуляторов, так и изучение их функциональных свойств необходимо для понимания механизма их действия и роли в регуляции транскрипции.

Данная работа посвящена изучению свойств Wari- и 1А2-инсуляторов D. melanogaster. В геноме Wari-инсулятор находится между расположенными друг за другом генами while и CG32795, в непосредственной близости от З'-конца гена white. 1А2-инсулятор был обнаружен между геном yellow и achaete-scute генным комплексом, в непосредственной близости от З'-конца гена yellow. В данной работе показано, что Wari-инсулятор обладает сайленсер-блокирующей активностью. Продемонстрировано, что Wari- и 1А2-инсуляторы взаимодействуют с промоторами генов white и yellow, соответственно. Разработана новая модельная система для тестирования ДНК-последовательностей на инсуляторную активность.

Цель и задачи исследования. Основной целью работы явилось изучение свойств Wari-и 1А2-инсуляторов.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) Выяснить способность Wari-инсулятора блокировать сайленсер из регуляторной области гена {/far.

2) Определить входят ли инсуляторные белки СР190 и Е(у)2 в состав белкового комплекса Wari-инсулятора.

3) Выяснить возможность взаимодействия Wari- и 1А2-инсуляторов с промоторами генов while и yellow, соответственно.

4) Разработать модельную систему для тестирования ДНК-последовательностей на инсуляторную активность в клеточных культурах D. melanogaster.

Научная иовизна и практическая ценность работы. В работе впервые показано наличие у Wari-инсулятора сайленсер-блокирующей активности. Показано, что инсуляторные белки CP 190 и Е(у)2 являются белковыми компонентами Wari-инсулятора. Продемонстрировано прямое участие Е(у)2 в сайленсер-блокирующей, но не в энхансер-блокирующей активности Wari-инсулятора. В данной работе показано, что инсуляторы Wari и 1А2 взаимодействуют с промоторами генов white и yellow, соответственно. Разработана новая модельная система для быстрого анализа ДНК-последовательностей на наличие инсуляторной активности. Результаты данной работы позволяют объяснить механизм действия инсуляров через их способность непосредственно взаимодействовать с промоторами генов.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2008» (7-11 апреля 2008 года) и «Ломоносов-2009» (13-18 апреля 2009 года); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11-15 мая 2008 года); на 13-ой международной конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009); на международных конференциях 9th Young Scientist Forum Labyrinth of cells and molecules (YSF, Prague) July 2-4 2009 and 34rd FEBS Congress "Life's Molecular Interactions", Prague, Czech Republic, 4-9 july, 2009; EMBO conference Nuclear Structure and Dynamics, France, Isle sur la Sorgue, 30 Sept - 4 Oct, 2009.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Из них статей - 1, тезисов устных и стендовых сообщений на конференциях - 7.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 136 страницах, содержит 33 рисунка и 2 таблицы, состоит из введения, обзора литературных данных, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 144 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА I. Изучение сайленсер-блокирующей активности Wari-инcyлятopa Л melanogaster.

1) \Уап-инсулятор обладает сайленсер-блокирующей активностью

Исследование способности \Уап-инсулятора блокировать Рс-в-зависимые сайленсеры проводилось на ранее разработанной модельной системе в трансгенных линиях £>. те1апо$аИег. Для этого конструкции, содержащие необходимый набор регуляторных элементов, были фланкированы 5'- и З'-концами Р-элемента, включающими концевые

инвертированные повторы, необходимые для интеграции конструкций в геном D. melanogaster.

Для изучения сайленсер-блокирующей активности Wari-инсулятора был использован известный сайленсер размером 660 п. н. из регуляторной области гена Ullrabithorax (PRE Ubx). Известно, что с этим участком in vivo связываются белки группы Polycomb. Распространение гетерохроматина, обусловленное присутствием PRE Ubx, приводит к репрессии промоторов генов в составе трансгена. В качестве репортерных генов использовались гены yellow и white. Ген white отвечает за пигментацию глаз, ген yellow - за пигментацию кутикулярных структур личинки и имаго.

В модельной системе присутствовали энхансеры, определяющие экспрессию гена yellow в кутикуле тела, в крыловых пластинках и в щетинках (далее энхансеры тела (В), крыльев (W) и энхансер щетинок (Вг)). Энхансеры тела и крыльев гена находились с 5'-стороны от гена yellow, энхансер щетинок - в интроне гена yellow. Сайленсер был встроен между энхансерами тела и крыльев в положение -1870 по отношению к старту транскрипции гена yellow. Wari-инсулятор длиной 825 п.н. был встроен в положение -893 по отношению к старту транскрипции гена yellow между сайленсером и промоторами расположенных друг за другом генов yellow и white [(PRE)(Wari)YW] (рис.1 А). Известно, что взаимодействие между двумя копиями Wari-инсуляторэ усиливает энхансер-блокирующую активность данного элемента. Для того чтобы оценить влияние взаимодействия Wari-инсуляторов на блокирование PRE, была сконструирована вторая конструкция, в которой Wari-инсулятор, находящийся за геном white, был делетирован [(PRE)(Wari)YWA] (рис.1 Б).

В данной системе сайленсер был фланкирован FRT-сайтами для сайт-специфической рекомбиназы Flp, тестируемый Wari-инсулятор LOX-сайтами для сайт-специфической рекомбиназы Сге. Индукция сайт-специфической рекомбинации между FRT-сайтами (LOX-сайтами) позволяет удалить фланкированный этими сайтами участок in vivo, в результате чего можно сравнить экспрессию генов в присутствии и в отсутствие тестируемого элемента в одном и том же месте генома.

При таком расположении элементов в модельной системе, в случае присутствия у тестируемого фрагмента ДНК сайленсер-блокирующей активности, он будет защищать экспрессию гена yellow в щетинках и экспрессию гена white в глазах мух, в то время как экспрессия гена yellow в теле и крыльях будет подвержена репрессии, так как данные энхансеры не защищены инсулятором.

Уровень экспрессии гена yellow в щетинках оценивался путем визуального анализа пигментации щетинок по шкале, в которой 5 соответствует уровню пигментации дикого типа, 1 соответствует отсутствию пигментации (инактивация тени yellow), var - вариабельная пигментация (пигментирована только часть щетинок). Экспрессия гена white оценивалась путем визуальной оценки пигментации глаз по стандартной шкале: красная окраска является пигментацией глаз мух дикого типа (экспрессия гена white при стимуляции тканеспецифичным энхансером); желтая и темно-желтая окраска - среднестатистическое проявление базовой пигментации (экспрессия гена white в отсутствие тканеспецифичного энхансера), белая окраска глаз наблюдается в отсутствие пигментации (полная инактивация гена white).

Так как используемый сайленсер функционально активен только в =50% трансгенных линий, для анализа были выбраны линии, в которых экспрессия гена yellow в теле и в крыльях исчезала после делеции сайленсера. Фенотипический анализ проводился на трансгенных самцах в линиях гетерозиготных по конструкции в присутствии и в отсутствие сайленсера или Wari-инсулятора (рис. 1 А, Б).

fit fit lox lox

white f-

(PRE)(w«rl)YW

(PRE)YW

(Wari)YW

5 var 1 Ид/Пр Kp iKop Kop rOp Op т'Ж Ж [Ж Б lh/Пр

1_ 7 2 j 7.7 Т 1/7

ни: 7 ; О 2/7 О: 7/7

Br yellow

white

•-^PRjjPji^p

_5__var 1 Из/Пр КртКор Кор тОр Op тЖ Ж сЖ Е Iii/Up

fit fit

(PRE)(w.ri)Ym . (PRE)YWA A

мта J В

~preé3

fit fit

(PRE)(w,ri)YVV

(PRE)YW

(w.ri)YW

5_2 2 ±

8_ 1]

7/9 3/9

2/9 7/9

Br yellow

,1,1

lox lox

white

_5_vaMJJi'Hp_К]>тКо|) Ky).lOp„Pí_T"'K ® '(LÜ i1"!?

2 30 12 2 30 0/12 U 1 12/12

1 1 £ 4 12

1 В 12/12

2 416 7/12

(ej^jol

fit fit

Br yellow

►r-| whl

lox

■hite"

fete^ \Wh¡

5 var 1 Hi/iip КртКор Кор тОр Op тЖ Ж сЖ Б иупр

(PRE)(w«H)YWA i 33 8 1 О 8

(PRE)YWü А зЗ 08 II 4/8

(Wari)Ym J Z 1 8/8 1 £■* 88

Рис. 1. Сайлеисер-блокирующая активность Wari-инсулятора. Конструкции: А - (PRE)(Wari)YW, Б - (PRE)(Wari)YWA, В - (PRE)Y(Wari)W, Г - (PRE)Y(Wari)WA. (А-Г) Сверху представлена схема конструкции, под схемой суммированы результаты по анализу фенотипов трансгенных линий мух в щетинках (yellow) и глазах (white), несущих данную конструкцию и ее производных. Обозначения: серые и белые прямоугольники - гены yellow и white, соответственно, горизонтальные стрелки указывают направление транскрипции генов. Whiteд- Wari-инсулятор делегирован за геном white. PRE - сайленсер из регуляторной области гена Ubx. Серые круги - тканеспецифичные энхансеры гена yellow, обеспечивающие высокий уровень экспрессии в крыльях (W), теле (В) и щетинках (Вг). Черный пятиугольник - Wari-инсулятор; острый угол указывает его ориентацию в трансгенной конструкции относительно его ориентации в геноме за геном white. Вертикальными стрелками отмечены сайты FRT и LOX для сайт-специфических рекомбиназ Flp и Сге, соответственно. Пигментация глаз, зависящая от уровня экспрессии гена white: Кр - красный; тКор - темно-коричневый; Кор - коричневый; тОр - темно-оранжевый; Ор - оранжевый; тЖ - темно-желтый; Ж -желтый; сЖ - светло-желтый; Б - белый. Пигментация щетинок, зависящая от уровня экспрессии

гена yellow. 1 - отсутствие пигментации, var - вариабельная окраска, окрашена только часть щетинок; 5 - уровень пигментации, соответствующий энхансер-зависимой экспрессии гена. Цифры в строках -число линий с соответствующей пигментацией. Из/Пр - отношение числа линий, в которых наблюдалось изменение (Из) пигментации при удалении исследуемого элемента, к общему числу проанализированных линий (Пр). Серым курсором на цифровой панели указано среднее значение фенотипов в проанализированных линиях мух.

Анализ трансгенных линий мух, несущих конструкцию [(PRE)(Wari)YW] (рис.1 А) показал, что Wari-инсулятор эффективно защищает транскрипцию гена yellow. Так, пигментация щетинок большинства линий мух в присутствии Wari-инсулятора соответствовала энхансер-зависимой экспрессии гена yellow, при делеции Wari-инсулятора во всех линиях происходила репрессия гена yellow в щетинках (рис.1 А). Отсутствие второй копии Wari-инсулятора [(PRE)(Wari)YWA] незначительно повлияло на сайленсер-блокирующую активность тестируемого Wari-инсулятора в отношении гена yellow (рис. 1 Б).

В отличие от гена yellow, Wari-инсулятор в обеих конструкциях, [(PRE)(Wari)YW] и [(PRE)(Wari)YWA], практически не защищал ген white от репрессии сайленсером. Делеция Wari-инсулятора показала, что он был активен только в двух из семи линий мух, несущих конструкцию [(PRE)(Wari)YW] и в двух из девяти линий с конструкцией [(PRE)(Wari)YWA],

В проанализированных конструкциях ген yellow находился на расстоянии 893 п.н. от Wari-инсулятора; ген white был удален от тестируемого Wari-инсулятора на расстояние около 5 т.п.н. (длина гена yellow). Для того чтобы проверить, влияет ли расстояние между Wari-инсулятором и промотором репортерного гена на способность защищать данный промотор от репрессии были сделаны две конструкции, в которых тестируемый Wari-инсулятор был встроен между генами yellow и white [конструкции (PRE)Y(Wari)W (рис. 1В) и (PRE)Y(Wari)WA (рис.1 Г)]. Расположение остальных элементов соответствовало первым двум конструкциям. В конструкции [(PRE)Y(Wari)WA] Wari-инсулятор за геном white был удален (рис.1 Г).

В трансгенных линиях, несущих конструкцию [(PRE)Y(Wari)W) экспрессия гена white была защищена от репрессии сайленсером во всех линиях, что было подтверждено делецией Wari-инсулятора (рис. 1В). В конструкции [(PRE)Y(Wari)WA] Wari-инсулятор защищал экспрессию гена white только в 50% линий, что свидетельствует о том, что Wari-инсулятор, расположенный за геном white, необходим для эффективного блокирования сайленсера PRE (рис.1 Г). В обеих конструкциях ген yellow был зарепрессирован, так как не был защищен инсулятором (рис.1 В, Г). Таким образом, сайленсер-блокирующая активность Wari-инсулятора зависит от расстояния между ним и защищаемым промотором. При этом, в случае, когда два Wari-инсулятора фланкировали ген white, для сайленсер-блокирующей активности была важна вторая копия инсулятора.

2) Фрагмент Wari-инсулятора длиной 368 п.н. достаточен для энхансер-блокирующей и сайленсер-блокирующей активностей инсулятора.

Ранее была установлена функциональная область Wari-инсулятора длиной 368 п.н., необходимая для энхансер-блокирующей активности. Для того чтобы проверить, является ли данная область достаточной для сайленсер-блокирующей активности Wari-инсулятора, были протестированы разные ДНК-фрагменты Wari-инсулятора на способность защищать экспрессию гена yellow от сайленсер-опосредованной репрессии. Фрагменты инсулятора исследовались в конструкциях, которые были аналогичны конструкции (PRE)(Wari)YW (рис.2А). Тестируемые фрагменты были фланкированы LOX-сайтами и вставлены в положение -893 относительно начала транскрипции гена yellow между сайленсером и промотором гена yellow. Способность фрагментов Wari-инсуляторэ блокировать сайленсер-опосредованную репрессию во всех конструкциях была подтверждена их делецией в трансгенных линиях. Всего было протестировано три фрагмента Wari-инсулятора: функциональная область Wari-инсулятора длиной 368 п.н., необходимая для энхансер-

блокирующей активности; З'-область полноразмерного Wari-инсуляторэ длиной 191 п.н.; фрагмент длиной 215 п.н., являющийся частью 368 п.н. фрагмента (рис.2Б).

В 10 из 11 линий, несущих трансгенную конструкцию с 368 п.н. Wari-инсулятором (PRE)(W3f,8)YW, экспрессия гена yellow в щетинках была эффективно защищена от репрессии сайленсером (рис.2Б). В то же время, ни укороченный фрагмент 215 п.н., обладающий слабой способность блокировать энхансеры, ни 191 п.н. З'-область Wari-инсулятора анти-сайленсерной активностью не обладали. Таким образом, функциональный участок Wari-инсулятора длиной 368 п.н. достаточен не только для энхансер-блокирующей, но и для сайленсер-блокирующей активности инсулятора.

frt frt lox

фра> мент War i

frt frt Тестируемые фрагметы

í Br i yellow i

white j—

PRE-блокирующаи активность Из/Пр

Энхансер-блокирующая активность Из/Пр

+3048-

368 мн

+3198-+3565

■ +3751

+ +

191 пп +3561-+3751

215 пн +3198-+3412

7/7 + 14/15

10/11 + 13/15

0/16 - 0/9

0/15 +/- 6/14

Рис. 2. Функциональная область Wari-инсулятора, отвечающая за сайленсер-блокнрующую активность. А) Модельная система для тестирования ДНК-фрагментов Wari-инсулятора на способность блокировать сайленсер PRE Ubx. Б) Тестирование различных областей Wari-инсулятора на сайленсер-блокирующую активность. Цифрами обозначено положение анализируемых ДНК-фрагментов относительно старта транскрипции гена mini-white в плазмидном векторе pCaSpeR. Сверху схематически изображенных фрагментов обозначена их длина. «+» - фрагменты, обладающие энхаисер- или сайленсер-блокирующей активностью; «-» - фрагменты, не обладающие соответствующей активностью. Из/Пр - отношение числа линий, в которых наблюдалось изменение (Из) пигментации при удалении исследуемого элемента, к общему числу проанализированных линий (Пр). * - данные по энхансер-блокирующей активности Wari-инсуляторэ, полученные ранее в нашей лаборатории.

3) Инсуляторные белки Е(у)2 и СР190 взаимодействуют с Wari-инсулятором in

vivo.

Ранее было показано, что известные ДНК-связывающие инсуляторные белки, Su(Hw), dCTCF, Zw5 и GAF не взаимодействуют с последовательностью ДНК Wari-инсулятора. В тоже время, Wari-инсулятор способен функционально взаимодействовать с Su(Hw)-зависимыми инсуляторами gypsy и 1А2. Возможным объяснением этих результатов является наличие общих белковых компонентов у данных инсуляторов. Одним из кандидатов является белок СР190, который не связывается с ДНК напрямую. В настоящее время показано, что он взаимодействует с Su(Hw)-, CTCF- и BEAF-зависимыми инсуляторами. Вторым потенциальным компонентом белкового комплекса Wari-исуляторэ является белок E(y)2/Susl, необходимый для сайленсер-блокирующей активности 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов. Белок E(y)2/Susl может рекрутироваться на инсуляторах путем взаимодействия с ДНК-связывающим белком инсуляторного комплекса.

Поэтому следующей задачей данного исследования стала проверка взаимодействия инсуляторных белков Е(у)2 и СР190 с последовательностью Wari-инсулятора с помощью метода иммунопреципитации хроматина (X-ChIP).

Прежде всего, было проверено, взаимодействуют ли данные белки с Wari-инсулятором на эмбриональной клеточной линии D. melanogaster S2. Хроматин был иммунопреципитирован с использованием антител против Е(у)2 и CP 190, либо против неспецифических антител (рис.3). Результаты экспериментов X-ChIP детектировались с помощью метода ПЦР в реальном времени. Во всех приведенных данных сигнал преципитации с неспецифическими антителами вычтен из представленных результатов. В качестве положительного контроля был выбран известный инсулятор gypsy, взаимодействующий с данными белками, в качестве отрицательного - кодирующая область гена ras. В результате анализа экспериментов по иммунопреципитации хроматина с помощью данных антител было выявлено обогащение ДНК-последовательности Wari-инсулятора (рис.3). Таким образом, белки Е(у)2 и CP 190 связываются с последовательностью Wari-инсулятора в культуре клеток S2 in vivo.

YY'ari ras gypsy Cpl90

Wari ras gypsy E(y)2

Рис.3. Иммунопреципитация хроматина, выделенного из культуры клеток S2 D. melanogaster. По оси X - анализ экспериментов X-ChIP с разных геномных областей. По оси Y - процент обогащения различных последовательностей относительно Input. Здесь и далее в рисунках с данными по иммунопреципитации хроматина показаны усредненные результаты трех экспериментов с учетом среднеквадратичных отклонений. Использованы антитела против белков Е(у)2 и СР190. ras -отрицательный контроль, gypsy - положительный.

На следующем этапе было проверено связывание белков Е(у)2 и CP 190 с Wari-инсулятором на разных стадиях развития D. melanogaster (рис.4). В качестве материала для экспериментов X-ChIP были выбраны 4 стадии: эмбриона (0-16 часов после откладки яиц), поздней личинки, средней куколки и имаго. Для всех стадий использовались мухи дикого типа. В качестве положительного контроля были выбраны инсулятор gypsy и 1А2, в качестве отрицательного - кодирующие области генов ras и RpL32 (рис.4). Оказалось, что обогащение ДНК-последовательности Wari-инсулятора при иммунопреципитации хроматина с использованием антител против Е(у)2 и CP 190 наблюдалось только на эмбриональной и взрослой стадиях (рис.4). Таким образом, взаимодействие белков Е(у)2 и СР190 с Wari-инсулятором может быть стадио-специфичным.

•м 35 Я

п. зо

25 20 15 10 5 0

СР190 т

i 1 1 i 1

I 1 1 _ _ 1 1 1

I 3 а 31 > а. £е X " эмбрионы •г Г4 ; N личинки i 3 S з I " х й куколки 'С ^ 2 ^ >» 1 3 2 < 1 * ё » имаго

5 4,5 4

g. 3,5 J= з

2,5 2 1,5 1 0,5 0

Е(у)2 "

-1-й........|-|~1-

I 2 2 < а

* ё а

эмбрионы

личинки

о:

куколки

г ч

а.

имаго

Рис.4. Связывание белков Е(у)2 и СР190 с VVari-инсулятором на разных стадиях развития d. melanogaster. По оси Y - процент обогащения различных последовательностей относительно Input. По оси X - анализ экспериментов X-ChIP с разных геномных областей на разных стадиях, ras и RpL32 — отрицательные контроли, gypsy и 1А2 - положительные. Иммунопреципитация с использованием антител против CP 190 (А) и Е(у)2 (Б).

Чтобы продемонстрировать, что белки Е(у)2 и CP 190 взаимодействуют с 368 п.н. функциональным участком Wari-инсулятора была выбрана трансгенная линия мух (PRE)(W36S)YW, несущая 368 п.н. Wari-инсулятор между PRE и промотором гена yellow. В качестве положительного контроля был выбран инсулятор 1A2, в качестве отрицательного контроля были выбраны кодирующие области генов RpL32 и yellow (mid-y) (рис.5). Эффективное обогащение наблюдалось только для области 368 п.н. Wari-инсулятора в составе трансгена, но не для кодирующих областей протестированных генов (рис.5). Таким образом, белки Е(у)2 и CP 190 взаимодействуют с 368 п.н. функциональным участком Wari-инсулятора.

Rpl.32

Рис.5. Связывание белков Е(у)2 и СР190 с 368 п.н. функциональной областью Wari-инсуляторя в составе трансгенной конструкции. Иммунопреципитация с использованием антител против СР190 (А) и Е(у)2 (Б). Хроматин был выделен из гомозиготной линии мух D. melanogaster на стадии имаго, несущей конструкцию PRE(W36S)YW. По оси Y - процент обогащения различных последовательностей относительно Input. По оси X - анализ экспериментов X-ChIP с разных геномных областей на разных стадиях. W168 - 368 п.н. функциональная область Wari-инсулятора в составе трансгена; mid-y - кодирующая область гена yellow, входящего в состав трансгена; RpL32 -отрицательный контроль; 1А2 - положительный контроль.

5) Снижение уровня экспрессии гена е(у)2 влияет на PRE-блокирующую, но не на энхансер-блокирующую активность Wari-инсулятора in vivo.

Чтобы выяснить роль белка Е(у)2 в активности Wari-инсулятора, влияние мутации гена е(у)2 было проверено генетически. Для этого использовалась мутация е(у)2"\ полученная инсерцией мобильного элемента Stalker в предпромоторную область гена е(у)2 и приводящая к трехкратному снижению экспрессии данного гена.

Влияние мутации е(у)2"' было проанализировано на трансгенных линиях, содержащих конструкцию (PRE)(Wari)YW или конструкцию (PRE)(W )YW (рис.6). Оказалось, что в четырех из семи проанализированных линий с конструкцией (PRE)(Wari)YW и в шести из 11 проанализированных линий с конструкцией (PRE)(W3f,8)YW, мутация е(у)2"' ослабляла способность Wari-инсулятора блокировать сайленсер (рис.6). В то же время, данная мутация не влияла на пигментацию щетинок в производных линиях с делецией либо Wari-инсулятора, либо сайленсера, что свидетельствует о прямом влиянии мутации е(у)2"' на функционирование Wari-инсулятора (рис.6). Дополнительно было протестировано влияние данной мутации на энхансер-блокирующую активность Wari-инсулятора. Были протестированы линии, полученные ранее в нашей лаборатории и содержащие Wari-инсулятор или функциональную область Wari-инсулятора между тканеспецифичными энхансерами и промоторами генов yellow и while. Однако данная мутация не влияла на энхансер-блокирующую активность Wari-инсулятора.

Таким образом, мутация гена е(у)2 влияет только на PRE-блокирующую, но не на энхансер-блокирующую активность Wari-инсулятора.

t\ _

white

frt frt l°x

5 var 1 Из/Пр

(PRE)(Wari)Y\V

le(y)2al (PREWW

(VVari)YW

le(y)2ul

С1 1

3 J 1 ill

2 3 7/7

2J 0/7

1 1/7

1 0/7

white

frt frt lox lox

5 var 1 ">'np

(PRE)(w3i's)YW

le(y)2"1 (PRE)YW

-.nl

le(y)2l "16S)YW le(y)2u

9~ 11 11

4 3 2 6/11

1 3l7 10/11

1 3~7 0/11

Ifl 2/11

ß 0/11

Рис. 6. Влияние мутации гена е(у)2 на сайленсер-блокирующую активность Wari-инсулятора.

Все обозначения как на рис.1, и рис.5., кроме того, что под фенотипами исходных линий мух и их производных указаны фенотипы данных линий, несущих мутацию е(у)2"'. Мутация е(у)2"' вызвана инсерцией мобильного элемента Stalker в предпромоторную область гена е(у)2 и приводит к трехкратному снижению экспрессии гена е(у)2.

ГЛАВА II. Изучение взаимодействия между инсуляторами и промоторами у D. melanogaster.

1) Wari- и 1А2-инсуляторы функционально взаимодействуют с промоторами генов white и yellow, соответственно.

Несмотря на большое количество данных о функционировании инсуляторов до сих пор остается не ясным вопрос о механизме действия регуляторных элементов этого класса. Одно из возможных объяснений явления инсуляции заключается в том, что инсуляторы напрямую взаимодействуют с промоторами генов.

Для проверки возможности физического сближения инсуляторов с промоторными областями генов нами была разработана модельная система, основанная на неспособности белка-активатора дрожжей GAL4 стимулировать промотор гена-мишени в случае, если его сайты связывания находятся на большом расстоянии от промотора. В качестве тестируемых пар промотор-инсулятор нами были выбраны: промотор гена yellow и 1А2-инсулятор; промотор гена white и Wari-инсулятор. Были созданы конструкции двух типов: с геном yellow и инсулятором 1А2, с геном white и инсулятором Wari (рис.7). С 3'- стороны от генов были встроены 10 сайтов связывания белка-активатора GAL4. В этих конструкциях 1А2- и Wari-инсуляторы, фланкированные LOX-сайтами, были расположены за генами и сайтами

для белка-активатора дрожжей в ориентации, соответствующей их расположению в геноме [конструкции \¥д04(\Уап), Ув4(1 А2)] (рис.7 А, 7В). В данной системе в случае наличия функционального взаимодействия между тестируемыми парами регуляторных элементов предполагалось, что ОАЬ4-активатор будет приближаться к промотору гена и активировать транскрипцию. Для того чтобы проверить влияние ориентации инсулятора в системе были дополнительно сделаны 2 конструкции [конструкции \Ул04(\Уап-Я), У04(1А2-11); здесь и далее сокращение «Я» означает обратную ориентацию инсулятора относительно внутригеномной (рис.7Б, 7Г). Для экспрессии белка-активатора вАЬ4 , трансгенные линии мух скрещивались с линией мух, несущей ген ОАЬ4-активатора под постоянно и повсеместно функционирующим тубулиновым промотором.

white A kT0>G

lox lox

lox

I WAG4(vvar¡) +GAL VVaG4

КртКор Кор тОр Op тЖ Ж сЖ Б Ид/Пр

lox

tiefen... 5 4 3 2 1 Иа/Пр

4 Ii

Г 3_6

+GAL

Б -„

Из

4_2 2

11 11/11 2 9/9 9/9

YG4(IA2) И и

+gal 5_6 и/и

YG4 ñ 0/10

+gal О 1/10

whiteL

Vox 1

10xG4

i i

lox lox

hite

ÍFc7/.„

Kp тКор Кор тОр Op тЖ Ж сЖ Б iii/ilp

5 4 3 2 1 Из/Ир

(Wari-R)

+GAL 10:

VVAG4 ' +GAL

2 2 2 _8 2 4 19

54 1 19/19

3 215......1 8/11

4 111 9/11

I YG4(ia2-r) +gal

YG4 +gal

lj 9

3 j 2 7/9

0 0/9

1 "8 0/9

Рис.7. Исследование инсулятор-промоторных взаимодействий с использованием разработанной модельной системы. Серым и черным пятиугольниками обозначены инсуляторы 1А2 и Wari, соответственно; острый угол указывает направление элемента относительно его внутригеномной ориентации по отношению к генам yellow и white, соответственно. Белым овалом обозначены 10 сайтов связывания для активатора дрожжей GAL4. "+ GAL" - результат скрещивания трансгенных линий мух с линией, экспрессирующей белок-активатор дрожжей GAL4. Пигментация тела и крыльев, зависящая от уровня экспресии гена yellow. 1 - отсутствие пигментации; 5 - уровень пигментации, соответствующий энхансер-зависимой экспрессии гена; 2-4 - промежуточные уровни. Цифры в строках - число линий с соответствующей пигментацией. Остальные обозначения как на рис.1.

Пигментация глаз трансгенных линий мух, несущих конструкцию WAG4(Wari), была на уровне базовой экспрессии гена white (рис.7А). Введение ОАЬ4-активатора в трансгеннные линии мух привело к значительному усилению пигментации глаз во всех протестированных линиях, т.е. ОАЬ4-активатор эффективно стимулировал транскрипцию гена white (рис.7А). В отсутствие Wari-инсулятора эффективной активации не наблюдалось (рис.7А). Анализ трансгенных линий мух с конструкцией WAG4(Wari-R) показал, что функциональное взаимодействия инсулятора с промотором не зависит от ориентации инсулятора (рис.7Б).

Функциональное взаимодействие инсулятора с промотором было также показано и при анализе конструкций с геном yellow и 1А2-инсулятором [YG4(1A2), YG4(1A2-R)] (рис.7В, Г). В данных конструкциях уровень экспрессии гена yellow оценивался визуально по пигментации тела и крыльев мух по пятибалльной шкале: 5 - соответствует уровню пигментации дикого типа (экспрессия гена yellow при стимуляции гена энхансерами тела и крыльев), 2 соответствует базовому уровню пигментации (экспрессия гена yellow в отсутствие энхансеров), 1 соответствует отсутствию пигментации (у1 аллель - полная инактивация гена yellow), 3 и 4 - частичная активация энхансерами базовой транскрипции.

Введение ОАЬ4-активатора в трансгешшые линии мух привело к значительному усилению пигментации тела и крыльев почти во всех протестированных линиях, т.е. GAL4-активатор эффективно стимулировал транскрипцию гена yellow (рис.7В). В отсутствие 1А2-инсулятора остаточная активации наблюдалась только в одной из линий (рис.7В). Анализ трансгенных линий мух с конструкцией YG4(1A2-R) показал, что функциональное взаимодействия инсулятора с промотором, как и в случае инсулятор-промоторной пары гена white, не зависит от ориеитации инсулятора (рис.7Г).

Таким образом, с использованием разработанной нами системы было показано, что инсулятор Wari способен функционально взаимодействовать с промотором гена white, а 1А2-инсулятор - с промотором гена yellow.

А -» В

white'

—■

' lox

lox

1А2>т<1(Ш> lox lox

hite

WA(w.ri)G4

Kp тКор Кор тОр Op тЖ Ж сЖ Б Из/Пр

VVa(wari-r)G4

КртКор Кор тОр Ор тЖ Ж сЖ Б ш/пр

+GAL WÜG4 +GAL

3 С311 ¡3 13 3 1 2 1~2 1 1

'3.3'.......i::o:

4/13 3/7 4/7

5 4 3 2 1 Из/Пр

I Y(ia2)G4 +GAL

YG4 +GAL

lj 8

1J 0/8

О о/б

3 i/6

5 4 3 2 1 Из/Пр

I Y(ia2-r)G4

+GAL 'I YG4 +GAL

13 9 13 0/9

13 о/б

1/6

Рис.8. Зависимость стимуляции транскрипции САЬ4-актнватором от порядка расположения элементов в конструкции. Все обозначения как на рис.7.

Можно предположить, что при взаимодействии инсулятора с промотором гена, ДНК между ними выпетливается, как это происходит в случае взаимодействий инсулятор-инсулятор или промотор-энхансер. В случае проанализированных конструкций ОАЬ4-активатор расположен внутри петли, образуемой взаимодействующими инсулятором и промотором. Если ОАЬ4-активатор будет расположен с 3'-стороны от инсулятора, то при взаимодействии инсулятора с промотором гена, ОАЕ4-активатор будет находиться вне образуемой петли. Для того чтобы подтвердить важность расположения регуляторных

элементов в системе было сделано 4 конструкции, аналогичные описанным выше, в которых сайты связывания ОАЬ4-активатора находились с З'-стороны от инсулятора [конструкции WA(Wari)G4, WA(Wari-R)G4, Y(1 A2)G4, Y(1A2-R)G4] (рис.8). Результат анализа трансгенных линий мух показал, что при таком расположении элементов в системе, ОАЬ4-активатор не способен эффективно стимулировать транскрипцию генов white и yellow ни в одной из конструкций.

3) 1А2-инсулятор способен взаимодействовать с двумя промоторами в одной системе.

Известно, что несколько инсуляторов способны взаимодействовать друг с другом одновременно. Было решено проверить, может ли инсулятор одновременно взаимодействовать с двумя промоторами в одной системе. Для этого была создана конструкция с геном yellow и 1А2-инсулятором (рис. 9А). В положении «голова-к-голове» относительно промотора гена yellow находился ген р-галактозидазы под контролем минимального промотора гена теплового шока 70, для которого характерен низкий, но постоянный уровень транскрипции. При этом САЬ4-активатор способен сильно стимулировать транскрипцию, идущую с минимального промотора гена теплового шока 70. Сайты связывания белка активатора GAL4 находились между 1А2-инсулятором и промотором гена yellow (конструкция hL-YG4(lA2)) (рис.9А). В качестве контроля была сделана аналогичная конструкция, в которой ОАЬ4-сайты располагались позади 1А2-инсулятора (конструкция hL-Y(lA2)G4) (рис. 9Б).

—| lacZ-hsp70mirt |—|

Iyg/fe;

yellov

|<i0iG{>T<lA2l-lox lox

5 4 3 2 1 1Ь'Пр

hL-YG4(iA2) 6. 6

+GAL 3_2 1 5/6

HL-YG4 <[ 0/6

+GAL <Е 0/6

s i ¡0.« ■¿•0,6 10,4

?0,2 x

lacZ-hsp70min

yellow

IrSifc-

i0lg4>-

д.

1 1

1 Т т ГП

в L.

5= 31 = < s <о >0 -S- § 1 3 3

lox lox

i 1,2 i

5 4 3 2 1 nnip

hL-Y(lA2)G4 1 7

+GAL 1 0/7

HL-YG4 i 0/7

+GAL i 0/7

Рнс.9. Анализ взаимодействия инсулятора 1A2 с двумя промоторами в одной системе. Светлосерым прямоугольником обозначен ген р-галактозидазы под контролем минимального промотора гена теплового шока 70 (hsp70min-lacZ), горизонтальной стрелкой указано направление транскрипции. Справа от схематического изображения конструкций и данных по экспрессии гена yellow приведены усредненные результаты измерения активности Р-галактозидазы, нормированные на общее количество белка в пробе. Для всех независимых линий, несущих трансгенную

конструкцию (шесть линий для конструкции hL-YG4(lA2) и семь линий для конструкции hL-Y(1A2)G4, и их производных были проанализированы гомогенаты из 15 взрослых мух. На диаграмме представлены усредненные данные для проанализированных линий, указан разброс полученных значений. Остальные обозначения как на рис. 7.

Оказалось, что в конструкции hL-YG4(lA2) ОАЬ4-активатор сильно стимулировал экспрессию как гена yellow, так и гена )3-галактозидазы (рис.9А). Вероятно, 1А2-инсулятор в этом случае непосредственно взаимодействовал с минимальным промотором гена теплового шока 70. Напротив, в контрольной конструкции hL-Y(lA2)G4 не наблюдалось эффективной активации ни гена yellow, ни гена р-галактозидазы (рис. 9Б). Таким образом, 1А2-инсулятор способен одновременно взаимодействовать с двумя промоторами в одной системе. Как и в случае взаимодействия инсулятора с одним промотором, ключевую роль играет порядок расположения элементов в системе.

2) Четырех сайтов связывания для белка Su(Hw) достаточно для обеспечения активации промотора гена yellow САЕ4-активатором.

В составе последовательностей ДНК инсуляторов 1А2 и Wari длиной 454 п.н. и 825 п.н., соответственно, могут находиться сайты связывания не только для инсуляторных белков. Поэтому нельзя исключать возможности того, что за взаимодействие с промотором ответственны не инсуляторные белки. Ранее было показано, что белок Su(Hw) является ДНК-связывающим компонентом 1А2-инсулятора, Всего 1А2-инсулятор содержит 2 сайта связывания белка Su(Hw). В настоящее время известно, что основными белковыми компонентами 1А2-инсулятора являются белки Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2, необходимые для энхансер-блокирующей активности 1А2-инсулятора, и белок Е(у)2, который, наравне с белком Su(Hw), участвует в барьерной активности 1А2-инсулятора. Поэтому следующей задачей было подтвердить, что именно инсуляторный белковый комплекс, собирающийся на сайтах связывания для белка Su(Hw), независимо от остальных последовательностей инсулятора, способен взаимодействовать с 5'-регуляторной областью гена yellow. Для этого вместо 1 А2-инсулятора был взят четырехкратный повтор третьего сайта связывания белка Su(Hw) из инсулятора gypsy. Чтобы подтвердить, что именно четырехкратный повтор сайтов связывания белка Su(Hw) отвечает за способность ОАЬ4-активатора стимулировать экспрессию гена yellow, он был фланкирован LOX-сайтами, позволяющими делетировать его in vivo [конструкция YG4(4xSu)] (рис.10).

• <ih«>j (4xSu) I ■ ....... lox lox

Yell.,.

5 4 3 2 1 Hi/rip

YG4(4xSu) [8j 8

+GAL !"4~2........21 6/8

YG4 ш 0/8

+GAL ! 1 3; 1/8

Рис.10. Участок ДНК, содержащий четыре сайта связывания для белка Su(Hw), способен взаимодействовать с промотором гена yellow. Серым кругом показаны четыре сайта связывания для белка Su(Hw). Остальные обозначения как на рис.7.

Анализ трансгенных линий мух, несущих конструкцию YG4(4xSu), показал, что при наличии белка-активатора GAL4, экспрессия гена yellow усиливалась примерно так же, как и в случае присутствия 1А2-инсулятора (рис.10). Таким образом, инсуляторный белковый комплекс, собирающийся на участке ДНК с сайтами связывания для белка Su(Hw), самостоятельно способен взаимодействовать с промотором гена yellow.

4) Белок СР190 присутствует па минимальном промоторе гена теплового шока при взаимодействии промотора с 1А2-инсулятором.

Полученные данные предполагают, что инсулятор и промотор физически взаимодействуют друг с другом. Для получения дополнительного экспериментального подтверждения прямого взаимодействия между инсулятором и промотором был поставлен эксперимент с использованием метода иммунопреципитации хроматина (X-ChIP), в ходе которого проводилась оценка уровня обогащения инсуляторных белков на промоторе гена yellow. Так, если инсулятор 1А2 и промотор гена yellow взаимодействуют in vivo, то по результатам экспериментов X-ChIP на промоторе можно увидеть обогащение инсуляторных белков, которые «пришиваются» формальдегидом к ДНК-последовательности промотора. Эксперименты проводились на двух стадиях развития D. melanogaster - личинках и куколках. Однако значимого обогащения инсуляторных белков на промоторе гена yellow обнаружено не было. Наиболее вероятным объяснением отрицательного результата является тканеспецифичная экспрессия гена yellow только в клетках эктодермы, которые составляют незначительную часть от общего числа клеток, взятых в анализ в составе личинки или куколки. Так как в клетках с неактивным геном yellow взаимодействие между инсулятором и промотором, скорее всего, отсутствует, то можно предположить, что чувствительности метода X-ChIP не хватает для идентификации статистически значимого повышения связывания инсуляторных белков с промоторной областью гена yellow.

Как известно, ген теплового шока экспрессируется повсеместно, то есть транскрипция с этого промотора идет во всех клетках. В случае, если наше предположение верно, то взаимодействие 1А2-инсулятора с минимальным промотором гена теплового шока в конструкции hL-YG4(lA2) будет реализовываться в большом числе клеток организма D. melanogaster. Поэтому была проведена оценка связывания инсуляторных белков на минимальном промоторе гена теплового шока в конструкции hL-YG4(lA2) в присутствии и в отсутствие инсулятора 1А2 в трансгенной конструкции в одном и том же месте генома (рис.11). Для экспериментов были выбраны две независимые трансгенные линии, в одной из которых для получения хроматина использовались поздние личинки, в другой - средние куколки.

Результаты X-ChIP-экспериментов были проанализированы с помощью ПЦР в реальном времени. Праймеры для анализа результатов экспериментов были подобраны к минимальному промотору гена теплового шока в составе трансгена (pr-h). Кроме того, были проанализированы и другие участки ДНК в составе трансгена: промотор (pr-у) и кодирующая область (mid-y) гена yellow, находящаяся на удалении как от обоих промоторов, так и от инсулятора 1А2. В качестве положительного и отрицательного контролей использовались праймеры к описанной в других работах области 62D, содержащей три сильных сайта связывания для белка Su(IIw), и кодирующей области гена RpL32, соответственно. Хроматин был иммунопреципитирован с использованием антител против белка СР190, являющегося белковыми компонентом 1А2-инсулятора. В результате было показано, что сигнал обогащения присутствует только на минимальном промоторе гена теплового шока, но не на промоторе и не на кодирующей области гена yellow (рис.11). При делеции 1А2-инсулятора обогащение белка CP 190 на минимальном промоторе гена теплового шока 70 исчезало, что свидетельствует о том, что данный сигнал опосредован присутствием 1А2-инсулятора в составе трансгена. Следовательно, при взаимодействии инсулятора и промотора происходит пространственное сближение этих элементов.

теплового шока 70. По оси X представлены результаты ПЦР в реальном времени с разных пар праймеров. Геномные области 62D и RpL32 - положительный и отрицательный контроли, соответственно. Остальные пары праймеров специфичны к ДНК-последовательностям в составе трансгенной конструкции, pr-h, pr-у и mid-y - проанализированные области конструкции, соответствующие минимальному промотору гена теплового шока 70 (pr-h), промотору гена yellow (pr-у) и кодирующей части гена yellow (mid-y), удаленной на расстояние около 2 т. п. н. как от промотора, так и от 1А2-инсулятора. Хроматин выделялся из поздних личинок для одной линии (А) и из средних куколок для другой линии (Б), несущих конструкцию hL-YG4(lA2), а также из производных этих линий с делегированным 1А2-инсулятором на соответствующих стадиях развития (производные hL-YG4). Иммунопреципитация проводилась с использованием антител против белка CP 190 и неспецифических антител. Результаты экспериментов для конструкций и их производных нормированы на значение положительного контроля (62D). Остальные обозначения как на рис. 3.

ГЛАВА III. Создание новой системы для исследования инсуляторов D. melanogaster.

Тестирование ДНК-последовательностей на инсуляторную активность в настоящее время проводят с использованием трансгенных модельных систем, что является трудоемким, занимающим много времени процессом. Для быстрого анализа регуляторных элементов на инсуляторную активность и для обнаружения белковых компонентов инсуляторов необходимо создание эффективных экспресс-систем. Поэтому следующей задачей данного

исследования было разработать быструю и удобную в использовании тест-систему для исследования инсуляторов на эмбриональных клеточных линиях О. melanogaster.

Культуры эмбриональных клеточных линий дрозофила представляют собой мало изученную систему. Поэтому, на первом этапе исследования было необходимо выбрать активаторы транскрипции и промоторы, которые способны функционировать в данных клеточных линиях. Для идентификации активности исследуемых регуляторных элементов были использованы гены люциферазы светлячка и люциферазы И.епП1а. Уровень экспрессии данных генов легко оценивать по эффективности люминесценции, измеряемой при определенных длинах волн. Для введения генов люцифераз, находящихся под контролем различных регуляторных элементов, в клетки эмбриональных линий О. melanogaster применялся метод транзиентной трансфекции. Плазмидный вектор, содержащий ген люциферазы светлячка без промотора, использовался для подбора необходимых регуляторных элементов тест-системы. Для контроля уровня эффективности трансфекции клетки были котрансфецированы плазмидным вектором, содержащим кодирующую часть гена люциферазы ЛепШа под контролем актинового промотора. Специфический сигнал определялся по отношению активности люциферазы светлячка к активности люциферазы ЯепШа (Р1ис/Шис).

Рис.12. Тестирование промоторов и активаторов на функциональную активность в клеточной линии Sg4 D. melanogaster. По оси У - относительная активность люциферазы светлячка, нормированная на активность люциферазы Renilla (Fluc/Rluc). По оси X — значения люминесценции для разных конструкций. Все эксперименты проведены как минимум в трех повторах. Обозначения конструкций: Пр\У, ПрУ, Пр - ген люциферазы светлячка под контролем промоторов генов white, yellow, CG32795, соответственно; glass-Пр, 1аЬ8-Пр, Ак-Пр - перед промотором гена CG32795 встроены активаторы glass, Iab8 и PRE Ubx, соответственно.

Вначале были протестированы промоторы двух хорошо изученных маркерных генов white и yellow, которые экспрессируются в эмбрионах D. melanogaster, и ранее часто использовались для исследования активности инсуляторов. Для этого были созданы конструкции, в которых ген люциферазы светлячка находился под контролем промоторов данных генов (конструкции FIpW и ПрУ, соответственно). К сожалению, оказалось, что промоторы генов white и yellow не способны стимулировать экспрессию репортерного гена в клеточных линиях дрозофила S2 и Sg4 (рис. 12). Поэтому в анализе был использован промотор гена CG32 79S, который, как было показано ранее, способен эффективно активировать транскрипцию репортерного гена в S2 клетках D. melanogaster. Действительно, данный промотор эффективно функционировал не только в клеточной линии S2, но и в линии Sg4 (конструкция Пр, рис. 12). При поиске активатора, который способен усиливать

транскрипцию с промотора гена CG32795, были проверены несколько известных элементов: glass, Iab8 и элемент PRE Ubx из регуляторной области гена Ubx (конструкции glass-Пр, 1аЬ8-Пр и Ак-Пр, соответственно). Полученные данные свидетельствуют о том, что способностью активировать транскрипцию с промотора гена CG32795 обладал лишь элемент PRE Ubx. В эмбриональной клеточной линии S2 при наличии данного активатора (конструкция Ак-Пр) уровень экспрессии гена люциферазы светлячка увеличивался примерно в 2.5-3 раза; в эмбриональной клеточной линии Sg4 - примерно в 3-3.5 раза. Исходя из полученных данных, в дальнейших экспериментах использовалась клеточная линия Sg4.

Для проверки способности элемента PRE Ubx активировать промотор на расстоянии, были созданы конструкции, в которых между активатором и промотором располагались спейсерные участки ДНК. В качестве спейсеров были выбраны кодирующая область гена eGFP (= 700 п. н.; конструкция (Ак-(700)-Пр) и участок ДНК из фага X (= 2000 п. н.; конструкция Ак-(2000)-Пр ). Оказалось, что вставки этих фрагментов ДНК практически не снижали уровень активации промотора гена CG32795; некоторое уменьшение активации в случае конструкции Ак-(2000)-Пр можно объяснить значительным увеличением длины плазмиды на 25%) и, как следствие, снижением эффективности трансфекции. Таким образом, полученные данные свидетельствует о способности элемента из регуляторной области гена Ubx активировать транскрипцию при увеличении расстояния между ним и промотором.

60 -

а 5= а С 1 а. С

л £ i О Г"- Y о о о п

< С & <

И <

Рис.13. Проверка способности различных инсулнторов блокировать действие активатора в описываемой тест-системе. По оси Y - относительная активность люциферазы светлячка, нормированная на активность люциферазы Renilla (Fluc/Rluc). По оси X - значения люминесценции для разных конструкций. Все эксперименты проведены как минимум в трех повторах. Обозначения конструкций: Пр - ген люциферазы светлячка под контролем промотора гена CG32795; Ак-Пр — перед промотором гена CG32795 встроен активатор PRE Ubx; Ак-gyp-np, Ак-!А2-Пр, Ак-РаЬ8-Пр, AK-Wari-Пр - между активатором и промотором встроены инсуляторы gypsy, 1А2, Fab8 и Wari, соответственно; Ак-(700)-Пр, Ак-(2000)-Пр - между активатором и промотором встроены спейсерные участки длиной 700 п.н. и 2000 п.н., соответственно.

Для проверки адекватности выбранной нами модельной системы были протестированы четыре хорошо изученных инсулятора £>. melanogaster на способность

блокировать активацию промотора гена CG32795 элементом PRE Ubx: gypsy, 1А2, Fab8 и Wari. Инеулятор Fab8 находится в регуляторной области гена AbdB и содержит два сайта связывания для белка dCTCF. Все эти инсуляторы были способны блокировать активацию промотора в созданной системе. Важно отметить, что эффективность блокирования активатора разными инсуляторами была сравнима с данными, полученными ранее на трансгенных конструкциях и описанными в литературе. Таким образом, созданная модельная система может быть использована для тестирования инсуляторов D. melanogaster.

Обсуждение.

Глава I. Барьерная активность и инсуляторный комплекс Wari-инсулятора.

В данной работе установлено, что Wari-инсулятор обладает сайленсер-блокирующей активностью. Так, он способен защищать гены yellow и white от репрессии сайленсера из регуляторной области гена Ubx. Как и в случае энхансер-блокирующей активности, хотя и не так эффективно, вторая копия Wari-инсулятора усиливает сайленсер-блокирующую активность этого элемента. Однако, в отличие от энхансер-блокирующей активности, сайленсер-блокирующая активность Wari-инсулятора зависит от расстояния между ним и промотором гена. Вместе с тем, участок Wari-инсулятора длиной 368 п. н. достаточен как для сайленсер-блокирующей, так и для энхансер-блокирующей активностей. Можно предположить, что зависимость от расстояния обусловлена тем, что, подобно энхансерам, Polycomb-зависимые сайленсеры обладают способностью непосредственно взаимодействовать с промотором гена white. Одним из вероятных объяснений дистанционной зависимости активности Wari-инсулятора является возможность взаимодействия с ним комплекса ремоделинга хроматина (см. ниже).

В данной работе показано, что с Wari-инсулятором in vivo взаимодействуют белки CP 190 и Е(у)2. Известно, что белок CP 190 взаимодействует с разными инсуляторами D. melanogaster, такими как Su(Hw), dCTCF и BEAF-зависимыми инсуляторами. Е(у)2 участвует в сайленсер-блокирующей активности 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов. Вероятно, белки CP 190 и Е(у)2 взаимодействуют с пока не известным ДНК-связывающим компонентом Wari-инсулятора. Результат данной работы свидетельствует о том, что Е(у)2, также как и СР190, может являться общим компонентом для большого числа инсуляторов, активность которых зависит от разных ДНК-связывающих транскрипционных факторов. Важно отметить, что как и в случае 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов, белок Е(у)2 определяет способность Wari-инсулятора блокировать активность сайленсеров, но не энхансеров.

Недавно было показано, что Е(у)2 является компонентом SAGA/TFTC-комплекса. Вполне возможно, что Е(у)2 обеспечивает присутствие этого комплекса на Wari- и Su(Hw)-зависимых инсуляторах. Таким образом, сайленсер-блокирующая активность инсуляторов может определяться компонентами SAGA/TFTC-комплекса, содержащим в своем составе гистон-ацетилтрансферазы (HATs), детерминирующие локальный статус активного хроматина. Можно предположить, что гистон-ацетилтрансферазы данного комплекса, связывающиеся с последовательностью Wari-инсулятора, могут изменять статус хроматина только на относительно небольшом расстоянии. Это может объяснить дистанционную зависимость активности Wari-инсуляторэ при блокировании сайленсера.

Ранее было показано, что хотя Wari-инсулятор не взаимодействует с белком Su(Hw), он способен функционально взаимодействовать с 8и(Н\у)-зависимыми инсуляторами, gypsy и 1А2. Наличие общих белковых компонентов данных инсуляторов может объяснить их способность к функциональному взаимодействию.

В данной работе была исследована стадиоспецифичность взаимодействий белков СР190 и Е(у)2 с Wari-инсулятором. На эмбриональной и взрослой стадиях развития D. melanogaster, также как и в культуре клеток, наблюдалось сильное обогащение белков CP 190 и Е(у)2 на последовательности ДНК Wari-инсулятора. Вместе с тем, на стадиях личинки и куколки связывания этих белков зафиксировано не было. Таким образом, вероятно, что

связывание инсуляторных белков может быть стадио-специфичным. Так как белок Е(у)2 необходим для защиты экспрессии гена yellow от репрессии на стадии куколки, то отсутствие белка Е(у)2 на Wari-инсуляторе можно объяснить тем, что чувствительности метода X-ChIP не хватает для детекции связывания белка Е(у)2 (также, как и CP 190) с Wari-инсулятором на этой стадии в достаточно небольшом проценте клеток. Вместе с тем, нельзя исключить возможности того, что на данных стадиях эти белки экранированы другими белковыми факторами и не доступны для антител. Исходя из того, что антитела против белков CP 190 и Е(у)2, используемые для экспериментов X-ChIP в этой работе, являлись поликлональными, более вероятным является стадио- и тканеспецифичное связывание данных белков с Wari-инсулятором. В подтверждение этого свидетельствует и тот факт, что разные культуры клеток D.melanogaster имеют разные профили связывания инсуляторных белков. Таким образом, связывание инсуляторных белков с Wari-инсулятором является ткане- и стадиоспецифичным процессом; возможно, этот процесс имеет весьма тонкую регуляцию в ходе развития D.melanogaster.

Глава II. Взаимодействие инсуляторов с промоторами генов.

Для проверки возможности прямого взаимодействия инсуляторов с промоторами генов в данной работе была разработана модельная система, основанная на неспособности GAL4-aKTvmaTopa стимулировать промотор гена, если сайты связывания для GAL4-активатора расположены с З'-стороны относительно данного гена. На примере генов yellow и white D. melanogaster было показано, что инсуляторы 1А2 и Wari способны взаимодействовать с промоторами соответствующих генов.

Рис.14. Способность САЬ4-яктиватора стимулировать транскрипцию гена посредством инсулятора зависит от взаимного расположения сайтов связывания активатора и инсулятора внутри системы. А. САЬ4-активатор стимулирует транскрипцию гена. Б. ОЛЬ4-активатор заблокирован инсулятором.

В данной работе показано, что способность ОАЕ4-активатора стимулировать транскрипцию гена посредством инсулятора зависит от взаимного расположения сайтов связывания активатора и инсулятора внутри системы. Вероятнее всего, данное свойство объясняется тем, что если инсулятор находится с З'-стороны от сайтов связывания активатора, то при взаимодействии инсулятора с промотором гена, ОАЬ4-активатор находится внутри образуемой петли (рис.МА). Если ОАЬ4-активатор находится с З'-стороны

GAL4 активатор

от инсулятора, то при взаимодействии инсулятора с промотором он будет стерически вынесен за пределы петли и изолирован инсулятором (рис.14Б).

Было показано, что для взаимодействия с промотором гена yellow достаточно сайтов связывания белка Su(Hw), а, следовательно, инсуляторного комплекса.

Для прямого доказательства физического сближения участков ДНК инсуляторов и промоторов генов был использован метод иммунопреципитации хроматина. Показано, что в присутствии 1А2-инсулятора в трансгенной системе с двумя генами наблюдалось обогащение белка CP 190 на минимальном промоторе гена теплового шока 70, но не на промоторе гена yellow. В случае промотора гена yellow можно предположить, что сигнала обогащения на нем не наблюдалось вследствие тканеспецифичной экспрессии этого гена. Так, с минимального промотора гена теплового шока транскрипция идет повсеместно. Это, по-видимому, приводит к тому, что инсулятор способен взаимодействовать с данным промотором во всех типах клеток. Таким образом, можно предположить, что взаимодействие инсуляторного комплекса с промотором зависит от транскрипционного статуса промотора.

Способность инсуляторов взаимодействовать с промоторами подтверждает выдвинутую ранее гипотезу «ловушки промотора», по которой инсулятор, взаимодействуя с промотором, лишает промотор валентностей на взаимодействие с энхансером (рис.15).

Рис.15. «Ловушка» промотора. А. Энхансер стимулирует транскрипцию. Б. Энхансер не способен стимулировать транскрипцию, так как промотор заблокирован инсулятором.

Пока остается не известным, какие белковые факторы необходимы для инсулятор-промоторных взаимодействий. Можно предположить, что в этом процессе могут играть роль некие общие белки, которые связываются как с инсулятором, так и с промотором. В качестве претендентов на эту роль выступают компоненты SAGA-комплекса, такие как белок Е(у)2, который, вероятно, входит в состав как промоторных, так и инсуляторных комплексов.

Глава III. Создание системы для исследования инсуляторов на клеточных линиях D. melanogaster.

Одним из основных методов исследования инсуляторов D. melanogaster является создание и анализ трансгенных организмов. В результате на анализ множества трансгенных линий тратится много времени и сил. В данной работе описывается модельная система для изучения инсуляторов на клеточных линиях D. melanogaster. Использование метода транзиентной трансфекции клеточных линий сильно сокращает затрачиваемое время на исследование инсуляторов. Адекватность системы проверена с использованием ряда инсуляторов D. melanogaster, принадлежащих к разным классам.

—:,л- .

Заключение

В данной работе проведено изучение свойств инсуляторов 1А2 и Wari из областей генов yellow и white D. melanogaster. Показано, что Wari-инсулятор, также как и 1А2 (что было известно ранее), обладает сайленсер-блокирующей активностью. Несмотря на различные ДНК-связывающие компоненты, оба эти инсулятора обладают рядом общих белковых факторов, в том числе CP 190 и Е(у)2. При этом как для одного, так и для другого инсулятора белок Е(у)2 необходим только для барьерной, но не для энхансер-блокирующей активности. Показано, что взаимодействие белков CP 190 и Е(у)2 с ДНК-последовательностью Wari-инсулятора является стадиоспецифичным. С целью лучшего понимания механизма действия инсуляторов разработана трансгенная система для изучения взаимодействий инсуляторов и промоторов. Показано, что Wari-инсулятор функционально взаимодействует с промотором гена white, а 1А2-инсулятор - с промотором гена yellow. При этом для взаимодействия с промотором гена yellow достаточен только инсуляторный комплекс. Продемонстрировано, что 1А2-инсулятор способен взаимодействовать с двумя промоторами в одной системе. Методом иммунопреципитации хроматина подтверждено наличие прямого взаимодействия между инсулятором 1А2 и минимальным промотором гена теплового шока 70. Для сокращения затрачиваемого времени на исследование инсуляторов разработана удобная модельная система, с помощью которой можно изучать и осуществлять поиск инсуляторов в клеточных культурах D. melanogaster.

Выводы

1) Показано, что Wari-инсулятор способен блокировать сайленсер из регуляторной области гена Ubx.

2) Установленно, что белки CP 190 и Е(у)2 взаимодействуют с Wari-инсулятором in vivo. При этом белок Е(у)2 необходим только для сайленсер-блокирующей активности Wari-инсулятора.

3) Разработана модельная система для изучения взаимодействия инсуляторов с промоторами генов. С использованием этой системы показано, что Wari- и 1А2-инсуляторы взаимодействуют с промоторами генов white и yellow, соответственно. Продемонстрировано, что белковый комплекс, собирающийся на сайтах связывания для белка Su(Hw), достаточен для взаимодействия с промотором гена yellow.

4) Показано физическое взаимодействие инсулятора 1А2 с минимальным промотором гена теплового шока 70.

5) Разработана новая модельная система для идентификации инсуляторов и исследования их свойств на культурах клеток D. melanogaster.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах:

1) М. М. Ерохин. П. Г. Георгиев, Д. А. Четверина. Создание новой системы для исследования инсуляторов Drosophila melanogaster. ДАН. 2009. том 428 (1): 115-117.

Тезисы конференций:

1) М. Erokhin. D. Chetverina and P. Georgiev. Analysis of the barrier activity of Wari insulator in D. melanogaster. EMBO conference Nuclear Structure and Dynamics, France, Isle sur la Sorgue, 30 Sept - 4 Oct, 2009

2) Четверина Д.А., Ерохин M.M. Георгиев П.Г. Новые свойства 1А2- и Wari-инсуляторов Drosophila melanogaster. Пущино. 28 сентября - 2 октября 2009.

3) D.Chetverina, M.Erokhin and P.Georgiev. Characterization of the barrier activity of Wari insulator in D. melanogaster. 34rd FEBS Congress "Life's Molecular Interactions". Prague, Czech Republic, 4-9 july, 2009.

4) M.Erokhin. D.Chetverina and P.Georgiev. New insights into the role of 1A2 and Wari insulators in D.melanogaster. 9th Young Scientist Forum Labyrinth of cells and molecules (YSF Prague) July 2-4 2009 and 34rd FEBS Congress "Life's Molecular Interactions". Prague, Czech Republic, 4-9 july, 2009.

5) Ерохин M.M. Изучение взаимодействия инсуляторов 1A2 и Wari с промоторами генов у D. melanogaster. Материалы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2009". 13-18 апреля 2009.

6) Четверина Д.А., Ерохин М.М.. Максименко О.Г., Георгиев П.Г. Изучение функциональных активностей Wari-инсулятора D.melanogaster. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая, 2008.

7) Ерохин М.М.. Четверина Д.А., Георгиев П.Г. Изучение барьерной активности WARI-инсулятора у Drosophila melanogaster. Материалы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008». Москва. 7-11 апреля, 2008.

Заказ № 130-а/09/09 Подписано в печать 18.09.2009 Тираж 110 экз. Усл. п.л. 1,5

:;>ооо "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 )) www.cfr.ru ; е-таП:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ерохин, Максим Максимович

Список используемых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цель и задачи исследования

Научная новизна и практическая ценность работы

Апробация работы

Публикации

Благодарности

ГЛАВА I. Роль инсуляторов в регуляции транскрипции генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II у D.melanogaster (ОБЗОР

ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ)

1. Регуляторные элементы ДНК и РНК-полимеразаП-зависимая транскрипция

1.1. Промотор

1.2. Активация и репрессия транскрипции 16 1.2.1 Энхансеры 17 1.2.2. PRE/TRE-элементы и сайленсинг

1.3. Инсуляторы

2. Характеристика инсуляторов Drosophila melanogaster

2.1. Инсуляторы генов теплового шока (scs и scs')

2.2. Sи(Ну/)-содержащие инсуляторы

2.2.1. 8и(Нуу)-инсулятор

2.2.2.1А2-инсулятор

2.2.3. Другие 8и(Нл¥)-связывающие инсуляторы

2.3. Инсуляторы регуляторной области Abd-B гена

2.3.1. Fab7 (Frontabdominal-7)

2.3.2. МСР

2.3.3. Fab

2.4. Инсулятор Wari

2.5. Другие инсуляторы Drosophila 48 3. Модели энхансер-блокирующей активности инсуляторов

3.1. Структурные модели

3.2. Транскрипционные модели

3.3. «Нейтрализация» энхансер-блокирующей активности инсуляторов

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Генетические методы 59 1.1.1. Линии Drosophila melanogaster, использованные в данной работе

1.2. Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение' трансгенных линий

1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и mini-white в трансгенных линиях

1.4. Генетические скрещивания

2. Биохимические методы

2.1. Работа с бактериальной линией Е. coli DH5а

2.1.1. Среды для культивирования

2.1.2. Приготовление компетентных клеток линии E.coli DH5a

2.1.3. Трансформация плазмидной ДНК в бактерии линии E.coli DH5a

2.2. Методы работы с ДНК

2.2.1. Рестрикция ДНК, тупление «липких» концов, дефосфорилирование и лигирование фрагментов ДНК

2.2.2. Определение концентрации ДНК

2.2.3. Спиртовое осаждение ДНК

2.2.4. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле

2.2.5. Выделение фрагментов ДНК из геля

2.2.6. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса из бактериальных клеток линии E.coli DH5a 71 2.2.6.1 .Минипрепаративное выделение плазмидной ДНК

2.2.6.2.Максипрепаративное выделение плазмидной ДНК

2.2.7. Выделение геномной ДНК из мух с использованием DEPC

2.3. Саузерн-блот-анализ

2.4. Метод полимеразной цепной реакции (ПНР)

2.4.1. ПЦР с использованием Taq ДНК-полимеразы

2.4.2. ПЦР с колоний E.coli DH5a, несущих плазмиду, с использованием Taq ДНК-полимеразы

2.4.3. ПЦР с использованием Pfu ДНК-полимеразы

2.4.4. ПЦР с использованием Hot-Start Taq-ДНК-полимеразы

2.5. Трансфекция клеток S2 Drosophila и анализ активности люцифераз

2.6. Анализ активности гена (3-галактозидазы в мухах 79 Создание трансгенных конструкций

3.1. Конструкции для тестирования инсулятора Wari на сайленсер-блокирующую активность

3.2. Конструкции для тестирования взаимодействий инсуляторов и промоторов

3.3. Получение конструкций для изучения инсуляторов на клеточных линиях дрозофила

Иммунопреципитация хроматина

4.1. Иммунопреципитация хроматина, выделенного из клеточной культуры дрозофила S

4.2. Иммунопреципитация хроматина на разных стадиях развития дрозофила

4.3. Праймеры, использованные для анализа материала методом ПЦР в реальном времени, полученного при иммунопреципитации хроматина

ГЛАВА III. Результаты исследования

1. Изучение сайленсер-блокирующей активности Wari-инсулятора D. melanogaster

1.1. Wari-инсулятор обладает сайленсер-блокирующей активностью

1.2. Фрагмент Wari-инсулятора длиной 368 п.н. достаточен для энхансер-блокирующей и сайленсер-блокирующей активностей инсулятора

1.3. Инсуляторные белки Е(у)2 и CP 190 взаимодействуют с Wari-инсулятором in vivo

1.4. Снижение уровня экспрессии гена е(у)2 влияет на PRE-блокирующую, но не на энхансер-блокирующую активность Wari-инсулятора in vivo

2. Изучение взаимодействия между инсуляторами и промоторами у D. melanogaster

2.1. Wari- и 1А2-инсуляторы функционально взаимодействуют с промоторами генов white и yellow, соответственно

2.2. 1А2-инсулятор способен взаимодействовать с двумя промоторами в одной системе

2.3. Четырех сайтов связывания для белка Su(Hw) достаточно для обеспечения активации промотора гена yellow GAL4-активатором

2.4. Белок CP 190 присутствует на минимальном промоторе гена теплового шока при взаимодействии промотора с 1А2инсулятором 109 3. Создание новой системы для исследования инсуляторов D. melanogaster

ГЛАВА IV. Обсуяедения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение функциональных активностей инсуляторов из регуляторных областей генов yellow и white у D. melanogaster"

Актуальность проблемы

Транскрипция является ключевым этапом, на котором контролируется уровень экспрессии генов. Инициация и регуляция транскрипции ДНК у высших эукариот с участием РНК-полимеразы II зависит от множества факторов: от цис-действующих регуляторных ДНК-последовательностей и-транс-действующих белков. Цис-действующие регуляторные ДНК-последовательности включают энхансеры, сайленсеры, базальный промотор, инсуляторы. Энхансеры - ДНК-последовательности, представляющие собой сайты связывания белков-активаторов транскрипции. Энхансеры высших эукариот могут располагаться на разном расстоянии от промотора контролируемого ими гена. Так, некоторые энхансеры способны активировать гены на больших расстояниях, достигающих нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов. Энхансеры действуют вне зависимости от положения относительно направления транскрипции гена. Сайленсеры — элементы, оказывающие негативное влияние на транскрипцию генов; на них собираются белковые комплексы, подавляющие экспрессию генов. К сайленсерам относятся ДНК-элементы для сборки комплекса белков группы Polycomb (PRE - Polycomb Response Element). Так же как и энхансеры, сайленсеры действуют вне зависимости от их положения относительно направления транскрипции гена и не обладают специфичностью действия. Предполагается, что важная роль в контроле специфичности действия энхансеров и сайленсеров принадлежит инсуляторам. В настоящее время сформулированы два независимых критерия, по которым регуляторный элемент может быть отнесен к инсуляторам: способность блокировать энхансеры и служить барьером между транскрипционно активным хроматином и гетерохроматином. Инсуляторы блокируют активность энхансера, но это происходит только в том случае, если инсулятор находится между энхансером и промотором гена. При этом инсуляторы не влияют непосредственно на активность энхансера и промотора, то есть энхансер сохраняет способность влиять на незаблокированный инсулятором промотор, а промотор может быть активирован другим энхансером. Для некоторых инсуляторов показана способность блокировать репрессию, опосредованную сайленсерами.

В настоящее время существует две группы моделей функционирования инсуляторов. Модели первой группы предполагают физическое прикрепление белков, взаимодействующих с ДНК-последовательностью, инсулятора либо к ядерному матриксу, либо к ядерной оболочке и/или стабильные взаимодействия между белковыми компонентами инсуляторов, что приводит к образованию петель, являющихся независимыми доменами транскрипции генов. Модели второй группы постулируют, что инсуляторы блокируют передачу (прием) сигнала от энхансера к промотору. Предполагается существование нестабильных взаимодействий между белками, взаимодействующими с инсуляторами и белками других регуляторных элементов (энхансеров или промоторов).

Несмотря на большое количество накопленной информации, ни одна из. этих моделей не может объяснить все свойства инсуляторов. Становится очевидным, что как дальнейшее изучение многообразия инсуляторов, так и изучение их функциональных свойств необходимо для понимания механизма их действия и роли в регуляции транскрипции.

Данная работа посвящена изучению свойств Wari- и 1А2-инсуляторов D. melanogaster. В геноме Wari-инсулятор находится между расположенными друг за другом генами white и CG32795, в непосредственной близости от З'-конца гена white. 1А2-инсулятор был обнаружен между геном yellow и achaete-scute генным комплексом, в. непосредственной близости от З'-конца гена yellow. В данной работе показано, что Wari-инсулятор обладает сайленсер-блокирующей активностью. Продемонстрировано, что Wari- и 1 А2-инсуляторы взаимодействуют с промоторами генов white и yellow, соответственно. Разработана новая модельная система для тестирования ДНК-последовательностей на инсуляторную активность.

Цель и задачи исследования

Основной целью работы явилось изучение свойств Wari- и 1А2-инсуляторов.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) Выяснить способность Wari-инсулятора блокировать сайленсер из регуляторной области гена Ubx.

2) Определить входят ли инсуляторные белки CP 190 и Е(у)2 в состав белкового комплекса Wari-инсулятора.

3) Выяснить возможность взаимодействия Wari- и 1А2-инсуляторов с промоторами генов white и yellow, соответственно.

Научная новизна и практическая ценность работы

В работе впервые показано наличие у Wari-инсулятора сайленсер-блокирующей активности. Показано, что инсуляторные белки CP 190 и Е(у)2 являются белковыми компонентами Wari-инсулятора. Продемонстрировано прямое участие Е(у)2 в сайленсер-блокирующей, но не в энхансер-блокирующей активности Wari-инсулятора. В данной работе показано, что инсуляторы Wari и 1А2 взаимодействуют с промоторами генов white и yellow, соответственно. Разработана новая модельная система для быстрого анализа ДНК-последовательностей на наличие инсуляторной активности. Результаты данной работы позволяют объяснить механизм действия инсуляров через их способность непосредственно взаимодействовать с промоторами генов. Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2008» (7-11 апреля 2008 года) и «Ломоносов-2009» (13-18 апреля 2009 года); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11-15 мая 2008 года); на 13-ой международной конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2009); на международных конференциях 9th Young Scientist Forum Labyrinth of cells and molecules (YSF, Prague) July 2-4 2009 and 34rd FEBS Congress "Life's Molecular Interactions", Prague, Czech Republic, 4-9 july, 2009; EMBO conference Nuclear Structure and Dynamics, France, Isle sur la Sorgue, 30 Sept - 4 Oct, 2009.

Публикации

Статьи в научных журналах:

1) М. М. Ерохин, П. Г. Георгиев, Д. А. Четверина. Создание новой системы для исследования инсуляторов Drosophila melanogaster. ДАН. 2009. том 428 (1): 115-117. Тезисы конференций:

1) М. Erokhin, D. Chetverina and P. Georgiev. Analysis of the barrier activity' of Wari insulator in D. melanogaster. EMBO conference Nuclear Structure and Dynamics, France, Isle sur la Sorgue, 30 Sept - 4 Oct, 2009

2) Четверина Д.А., Ерохин M.M, Георгиев П.Г. Новые свойства. 1А2- и Wari-инсуляторов Drosophila melanogaster. Пущино. 28 сентября - 2 октября 2009.

4) M.Erokhin, D.Chetverina and P.Georgiev. New insights into the role of 1A2 and Wari insulators in D.melanogaster. 9th Young Scientist Forum Labyrinth of cells and molecules (YSF Prague) July 2-4 2009 and 34rd FEBS Congress "Life's Molecular Interactions". Prague, Czech Republic, 4-9 july, 2009.

5) Ерохин M.M. Изучение взаимодействия инсуляторов 1A2 и Wari с. промоторами генов у D. melanogaster. Материалы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2009". 13-18 апреля 2009.

6) Четверина Д.А., Ерохин М.М., Максименко О.Г., Георгиев П.Г. Изучение функциональных активностей Wari-инсулятора D. melanogaster. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая, 2008.

7) Ерохин М.М., Четверина Д.А., Георгиев П.Г. Изучение барьерной активности WARI-инсулятора у Drosophila melanogaster. Материалы. Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008». Москва. 7-11 апреля, 2008.

Благодарности

Автор выражает огромную благодарность своему научному руководителю Георгиеву Павлу Георгиевичу и Четвериной Дарье Александровне за предоставленную тему исследований, плодотворные дискуссии, ценные замечания. Автор благодарит сотрудников лаборатории регуляции генетических процессов за создание и поддержание дружеской и. творческой атмосферы внутри коллектива. Автор благодарит своих коллег за любезно предоставленные антитела: Антона Головнина, Маргариту Костюченко, Софью Георгиеву, Алексея Краснова, Дарью Копытову. Автор благодарит дирекцию Института Биологии гена за предоставление возможности проведения научных исследований. Отдельную благодарность автор выражает Грабовской Любовь Сергеевне за понимание и поддержку на всех этапах подготовки диссертационной работы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Ерохин, Максим Максимович

выводы

1) Показано, что Wari-инсулятор способен блокировать сайленсер из регуляторной области гена Ubx.

4) Показано физическое взаимодействие инсулятора 1А2 с минимальным промотором гена теплового шока 70.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе проведено изучение свойств инсуляторов 1А2 и Wari из областей генов yellow и white D. melanogaster. Показано, что Wari-инсулятор, также как и 1А2 (что было известно ранее), обладает сайленсер-блокирующей активностью. Несмотря на различные ДНК-связывающие компоненты, оба эти инсулятора обладают рядом общих белковых факторов, в том числе CP 190 и Е(у)2. При этом как для одного, так и для другого инсулятора белок Е(у)2 необходим только для барьерной, но не для энхансер-блокирующей активности. Показано, что взаимодействие белков CP 190 и Е(у)2 с ДНК-последовательностью Wari-инсулятора является стадиоспецифичным. С целью лучшего понимания механизма действия инсуляторов разработана трансгенная система для изучения взаимодействий инсуляторов и промоторов. Показано, что Wari-инсулятор функционально взаимодействует с промотором гена white, а 1А2-инсулятор — с промотором гена yellow. При этом для взаимодействия с промотором гена yellow достаточен только инсуляторный комплекс. Продемонстрировано, что 1А2-инсулятор способен взаимодействовать с двумя промоторами в одной системе. Методом иммунопреципитации хроматина подтверждено наличие прямого взаимодействия между инсулятором 1А2 и минимальным промотором гена теплового шока 70. Для сокращения затрачиваемого времени на исследование инсуляторов разработана удобная модельная система, с помощью которой можно изучать и осуществлять поиск инсуляторов в клеточных культурах D. melanogaster.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ерохин, Максим Максимович, Москва

1. (2006) Свойства, механизмы действия инсуляторов высших эукариот и их роль в регуляции транскрипции. Генетика 42 (8), 1029-1044.

2. Ряховский АА, Тиллиб СВ. (2007) Иммунопреципитационное картирование TRX-ассоциированных участков хромосом в промоторе гена fkh в клетках слюнных желез Drosophila melanogaster. Генетика 43 (9), 1181-1189.

3. Bartkuhn М, Straub Т, Herold М, Herrmann М, Rathke С, Saumweber Н, Gilfillan GD, Becker PB, Renkawitz R. (2009) Active promoters and insulators are marked by the centrosomal protein 190. EMBOJ. 28: 877-888.

4. Belozerov VE, Majumder P, Shen P, Cai HN. (2003) A novel boundary element may facilitate independent gene regulation in the Antennapedia complex of Drosophila. EMBOJ. 22: 3113-3121.

5. Blanton J, Gaszner M, Schedl P. (2003) Protein: protein interactions and the pairing of boundary elements in vivo. Genes Dev. 17: 664-675.

6. Brasset E, and Vaury C. (2005) Insulators arc fundamental components of the eukaryotic genomes. Heredity 94: 571-576.

7. Brown JL, Mucci D, Whiteley M, Dirksen ML, Kassis JA. (1998) The Drosophila Polycomb group gene pleiohomeotic encodes a DNA binding protein with homology to the transcription factor YY1. Mo I Cell 1:1057-1064.

8. Buchner K, Roth P, Schotta G, Krauss V, Saumweber H, Reuter G, Dorn R. (2000) Genetic and molecular complexity of the position effect variegation modifier mod(mdg4) in Drosophila. Genetics 155: 141—157.

9. Burke TW, Kadonaga JT. (1996) Drosophila TFIID binds to a conserved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters. Genes Dev. 10:711-724.

10. Burke TW, Kadonaga JT. (1997) The downstream core promoter element, DPE, is conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAFII60 of Drosophila. Genes Dev. 11:3020-3031.

11. Bushey AM, Dorman ER, Corces VG (2008) Chromatin insulators: regulatory mechanisms and epigenetic inheritance. Mol Cell 32:1-9

12. Bushey AM, Ramos E, Corces VG. (2009) Three subclasses of a Drosophila insulator show distinct and cell type-specific genomic distributions. Genes Dev. 23:1338-1350.

13. Busturia A, Lloyd A, Bejarario F, Zavortink M, Xin H, Sakonju S. (2001) The MCP silencer of the Drosophila Abd-B gene requires both Pleiohomeotic and GAGA factor for the maintenance of repression. Development. 128:2163-2173.

14. Butler JE, Kadonaga JT. (2001) Enhancer-promoter specificity mediated by DPE or TATA core promoter motifs. Genes Dev. 15:2515-2519.

15. Butler JE, Kadonaga JT. (2002) The RNA polymerase II core promoter: a key component in the regulation of gene expression. Genes Dev. 16:2583-2592

16. Byrd K, Corces VG. (2003) Visualization of chromatin domains created by the gypsy insulator of Drosophila. J. Cell Biol. 162: 565-574.

17. Cai HN, Levine M. (1997) The gypsy insulator can function as a promoter-specific silencer in the Drosophila embryo. EMBO J. 16:1732-1741

18. Cai H, and Levine M. (1995) Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo. Nature 376: 533-536.

19. Cai H, and Shen P. (2001) Effects on cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. Science 291: 493-495.

20. Capelson M. and Corces V. (2005) The ubiquitin ligase dTopors directs the nuclear organization of a chromatin insulator. Mol Cell 20: 105-116.

21. Capelson M. and Corces V.G. (2004) Boundary elements and nuclear organization. Biol. Cell 96: 617-629.

22. Conte C, Dastugue B, Vaury C. (2002b) Promoter competition as a mechanism of transcriptional interference mediated by retrotransposons. EMBO J. 21:3908-3916

23. Conte C, Dastugue B, and Vaury C. (2002a) Coupling of enhancer and insulator properties identified in two retrotransposons modulates their mutagenic impact on nearby genes .Mol. Cell Biol. 22: 1767-1777.

24. Cramer P. (2004) RNA polymerase II structure: from core to functional complexes. Curr Opin Genet Dev. 14:218-226 •

25. Cuvier О, Hart CM, Kas E, Laemmli UK. (2002) Identification of a multicopy chromatin boundary element at the borders of silenced chromosomal domains. Chromosoma. 110: 519-531.

26. Cuvier O, Hart CM, Laemmli UK. (1998) Identification of a class of chromatin boundary elements. Mol. Cell. Biol. 18: 7478-7486.

27. Dejardin J, and Cavalli G. (2004). Chromatin inheritance upon Zestemediated Brahma recruitment at a minimal cellular memory module. EMBO J. 23: 857-868.

28. Dorman E, Bushey A, Corces V. (2007) The role of insulator elements in large-scale chromatin structure in interphase. Curr Opin Genet Dev. 18 : 682-690.

29. Dorsett D. (1993) Distance-independent inactivation of an enhancer by the suppressor of Hairy-wing DNA-binding protein of Drosophila. Genetics. 134:1135-1144.

30. Gaszner M, and Felsenfeld G. (2006) Insulators: Exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. Nat. Rev. Genet. 7: 703-713.

31. Gaszner M, Vazquez J, Schedl P. (1999) The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction. Genes Dev.13:2098-2107.

32. Gause M, Hovhannisyan H, Kan T, Kuhfittig S, Mogila V, Georgiev P. (1998) hobo. Induced rearrangements in the yellow locus influence the insulation effect of the gypsy su(Hw)-binding region in Drosophila melanogaster. Genetics. 149:1393-1405.

33. Gause M, Morcillo P, Dorsett D. (2001) Insulation of enhancer-promoter communication by a gypsy transposon insert in the Drosophila cut gene: cooperation between suppressor of hairy-wing and modifier of mdg4 proteins. Mol. Cell. Biol. 21: 4807—4817.

34. Gdula DA, Corces VG. (1997) Characterization of functional domains of the su(Hw) protein that mediate the silencing effect of mod(mdg4) mutations. Genetics. 145: 153161.

35. Gerasimova TI, Corces VG. (1998) Polycomb and Trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator. Cell 92: 511-521.

36. Gerasimova TI, Lei EP, Bushey AM, Corces VG. (2007) Coordinated control of dCTCF and gypsy chromatin insulators in Drosophila. Mol Cell 28:761-772.

37. Gerasimova TI, Gdula DA, Gerasimov DV, Simonova O, Corces VG. (1995). A Drosophila protein that imparts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation. Cell 82: 587-597.

38. Geyer PK, Corces VG. (1992) DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev. 6:1865-1873.

39. Geyer PK, and Corces VG. (1987) Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in' Drosophila melanogaster. Genes Dev. 1: 996-1004.

40. Ghosh D, Gerasimova TI, Corces VG. (2001) Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function. EMBOJ. 20: 2518-2527.

41. Golic KG, and Lindquist S. (1989) The FLP recombinasc of yeast catalyzes site-specific recombination in thq Drosophila genome. Cell 59: 499-509.

42. Golovnin A, Melnikova L, Volkov I, Kostuchenko M, Galkin AV, Georgiev P. (2008) 'Insulator bodies' are aggregates of proteins but not of insulators. EMBO Rep. 9:440-445.

43. Golovnin A., Melnick E., Mazur A., Georgiev P. (2005) Drosophila Su(Hw) insulator can stimulate transcription of a weakened yellow promoter over a distance. Genetics. 170: 1133-1142.

44. Golovnin A, Birukova I, Romanova O, Silicheva M, Parshikov A, Savitskaya E, Pirrotta, V and Georgiev P. (2003) An endogenous Su(Hw) insulator separates the yellow gene from the Achaete-scute gene complex in Drosophila. Development 130: 3249-3258.

45. Grimaud C, Negre N, Cavalli G. (2006) From genetics to epigenetics: the tale of Polycomb group and trithorax group genes. Chromosome Res. 2006. 14: 363-375.

46. Guelman S, Suganuma T, Florens L, Weake V, Swanson SK, Washburn MP, Abmayr SM, Wokrman JL (2006) The essential gene wda encodes a WD40 repeat subunit of Drosophila SAGA required for histone H3 acetylation. Mol. Cell Biol. 26:7178-7189.

47. Gyurkovics H, Gausz J, Kummer J, Karch F. (1990) A new homeotic mutation in the Drosophila bithorax complex removes a boundary separating two domains of regulation. EMBO J. 9:2579-2585.

48. Hagstrom K, Muller M, Schedl P. (1997) A Polycomb and GAGA dependent silencer adjoins the Fab-7 boundary in the Drosophila bithorax complex. Genetics. 146:13651380.

49. Hagstrom K, Muller M, and Schedl P. (1996) Fab-7 functions as a chromatin domain boundary to ensure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex. Genes Dev. 10:3202—3215.

50. Hahn S. (2004) Structure and mechanism of the RNA polymerase II transcription machinery. Nat Struct Mol Biol. 11:394-403.

51. Harrison DA, Gdula DA, Coyne RS, Corces VG. (1993). A leucine zipper domain of the suppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on enhancer function.• Genes Dev. 7: 1966-1978.

52. Hart CM, Cuvier O, Laemmli UK. (1999) Evidence for an antagonistic relationship between the boundary element-associated factor' BEAF and the transcription factor DREF. Chromosoma. 108: 375-383.

53. Hart CM, Zhao K, Laemmli UK. (1997) The scs' boundary element: characterization of boundary element-associated factors. Mol Cell Biol. 17:999-1009.

54. IIirose F, Yamaguchi M, Kuroda K, Omori A, Hachiya T, Ikeda M, Nishimoto Y, Matsukage A. (1996) Isolation and characterization of eDNA for DREF, a promoter-activating factor for Drosophila DNA replication-related genes. J Biol Chem. 271:39303937.

55. Hochheimer A, Tjian R. (2003) Diversified transcription initiation complexes expand promoter selectivity and tissue-specific gene expression. Genes Dev. 17:1309-1320.

56. Hochheimer A, Zhou S, Zheng S, Holmes MC, Tjian R. (2002) TRF2 associates with DREF and directs promoter-selective gene expression in Drosophila. Nature 420:439445.

57. Holohan EE, Kwong C, Adryan B, Bartkuhn M, Herold M, Renkawitz R, Russell S, White R. (2007) CTCF genomic binding sites in Drosophila and the organization of the bithorax complex. PLoS Genet. 3, el 12.

58. Dorsett D, Delotto Y, Liu S. (1991) Expression of the cut locus in the Drosophila wing margin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer. Development. 113:735-747.

59. Kadauke S, Blobel. (2009) Chromatin loops in gene regulation. Biochimica et Biophysica Acta. 1789: 17-25.

60. Kadonaga JT. (2002) The DPE, a core promoter element for transcription by RNA polymerase II. Exp Mol Med. 34:259-264.

61. Kadonaga JT. (2004) Regulation of RNA polymerase II transcription by sequence-specific DNA binding factors. Cell. 116:247-257.

62. Karch F, Galloni M, Sipos L, Gausz J, Gyurkovics H, Schedl P. (1994) Мер and Fab-7: molecular analysis of putative boundaries of cis-regulatory domains in the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 22:3138-3146.

63. Karess RE and Rubin GM. (1984) Analysis of P transposable element functions in Drosophila. Cell 38: 135-146.

64. Kellum R and Schedl P. (1991) A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains. Cell 64: 941-950.

65. Kellum R and Schedl P. (1992) A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. Mol. Cell Biol. 12: 2424-2431.

66. Kim J, Shen B, Rosen C, Dorsett D. (1996) The DNA-binding and enhancer-blocking domains of the Drosophila suppressor of Hairy-wing protein. Mol. Cell Biol. 16: 33813392.

67. Krasnov AN, Kurshakova MM, Ramensky VE, Mardanov PV, Nabirochkina EN, Georgieva SG. (2005) A retrocopy of a gene can functionally displace the source gene in evolution. Nucleic Acids Res. 33:6654-6661.

68. Kuhn EJ, Hart CM, Geyer PK. (2004) Studies of the role of the Drosophila scs and scs1' insulators in defining boundaries of a chromosome puff. Mol Cell Biol. 24(4): 1470-1480.

69. Kuhn, E.J., and Geyer, P.K. (2003) Genomic insulators: Connecting properties to mechanism. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 259-265.

70. Kutach AK, Kadonaga JT. (2000) The downstream promoter element DPE appears to be as widely used as the TATA box in Drosophila core promoters. Mol Cell Biol. 20:47544764.

71. Kyrchanova O, Chetverina D, Maksimenko O, Kullyev A, Georgiev P. (2008) Orientation-dependent interaction between Drosophila insulators is a property of this class of regulatory elements. Nucleic Acids Res. 36:7019-7028.

72. Lagrange T, Kapanidis AN, Tang H, Reinberg D, Ebright RH. (1998) New core promoter element in RNA polymerase II-dependent transcription: sequence-specific DNA binding by transcription factor IIB. Genes Dev. 12:34-44.

73. Levine M, Tjian R. (2003) Transcription regulation and animal diversity. Nature. 424:147-151.

74. Lim CY, Santoso B, Boulay T, Dong E, Ohler U, Kadonaga JT. (2004) The MTE, a new core promoter element for transcription by RNA polymerase II. Genes Dev. 18:1606' 1617.

75. Lin Q, Chen Q, Lin L, Zhou J. (2004) The promoter targeting sequence mediates epigenetically heritable transcription memory. Genes Dev. 18: 2639-2651.

76. Lin Q, Wu D, Zhou J. (2003) The promoter targeting sequence facilitates and restricts a . distant enhancer to a single promoter in the Drosophila embryo. Development 130: 519526.

77. Lindslcy DL, and Zimm GG. (1992) The genome of Drosophila melanogaster. (Academic Press, New York).

78. Maeda R, Karch F. (2007) Making connections: boundaries and insulators in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 17: 394-399.

79. Majumder P, Cai HN. (2003) The functional analysis of insulator interactions in the Drosophila embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5223-5228.

80. Mallin DR, Myung JS, Patton JS, Geyer PK. (1998) Polycomb group repression is blocked by the Drosophila suppressor of Hairy-wing su(Hw). insulator. Genetics.148:331-339.

81. Mazo AM, Mizrokhi LJ, Karavanov AA, Sedkov YA, Krichevskaja AA, Ilyin YV. (1989) Suppression in Drosophila: su(Hw) and su(f) gene products internet with a region gypsy (mdg4) regulating its transcriptional activity. EMBO J. 8: 903-911.

82. Melnikova L, Gause M, Georgiev P. (2002) The gypsy insulators flanking yellow enhancers do not form a separate transcriptional domain in Drosophila melanogaster. the enhancers can activate an isolated yellow promoter. Genetics 160(4): 1549-1560.

83. Mihaly J, Hogga I, Barges S, Galloni M, Mishra RK, Hagstrom K, Miiller M, Schedl P, Sipos L, Gausz J, Gyurkovics H, Karch F. (1998) Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex. Cell. Mol. Life Sci. 54: 60-70.

84. Mohan M, Bartkuhn M, Herold M, Philippen A, Heinl N, Bardenhagen I, Leers J, White RA, Renkawitz-Pohl R, Saumweber H, Renkawitz R. (2007) The Drosophila insulator proteins CTCF and CP 190 link enhancer blocking to body patterning. EMBO J. 26:42034214.

85. Muravyova E, Golovnin A, Gracheva E, Parshikov A, Belenkaya T, Pirrotta V and Georgiev P. (2001) Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. Science 291: 495-498.

86. Nabirochkin S, Ossokina M, Heidmann T. (1998) A nuclear matrix/scaffold attachment region co-localizes with the gypsy retrotransposon insulator sequence. J. Biol. Chem. 273: 2473-2479.

87. Ohtsuki S, Levine M, Cai HN. (1998) Different core promoters possess distinct regulatory activities in the Drosophila embryo. Genes Dev. 12:547-556.

88. Pai C, Lei C, Ghosh D, Corces V. (2004) The centrosomal protein CP 190 is a component of the gypsy chromatin insulator. Mol. Cell. 16: 737-748.

89. Panning B, Taatjes D. (2008) Transcriptional Regulation: it takes a village. Mol Cell. 31: 622-629.

90. Park SY, Kim YS, Yang DJ, Yoo MA. (2004) Transcriptional regulation of the Drosophila catalase gene by the DRE/DREF system. Nucleic Acids Res. 32:1318-24.

91. Parnell T, Kuhn E, Gilmore B, Helou C, Wold M, and Geyer P. (2006) Identification of genomic sites that bind the Drosophila suppressor of Hairy-wing insulator protein. Mol. Cell Biol. 26: 5983-5993.

92. Parnell TJ, Viering MM, Skjesol A, Helou C, Kuhn EJ and Geyer PK. (2003) An endogenous suppressor of haiiy-wing insulator separates regulatory domains in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 13436-13441.

93. Petruk S, Sedkov Y, Riley KM, Hodgson J, Schweisguth F, Hirose S, Jaynes JB, Brock HW, Mazo A. (2006) Transcription of bxd noncoding RNAs promoted by trithorax represses Ubx in cis by transcriptional interference. Cell 127:1209-1221.

94. Pick L, Schier A, Affolter M, Schmidt-Glenewinkel T, Gehring WJ. (1990) Analysis of the ftz upstream element: germ layer-specific enhancers are independently autoregulated. Genes Dev. 4:1224-1239.

95. Pirrotta V, Steller H, Bozzetti MP. (1985) Multiple upstream regulatory elements control the expression of the Drosophila white, gene. EMBO J. 4:3501-3508.

96. Pirrotta V. (1988) Vectors for P-mediated transformation in Drosophila. Biotechnology 10: 437-456.

97. Ramos E, Ghosh D, Baxter E and Corces V. (2006) Genomic organization of gypsy chromatin insulators in Drosophila melanogaster. Genetics 172: 2337-2349.

98. Rodin S, Kyrchanova O, Pomerantseva E, Parshikov A, Georgiev P. (2007) New properties of Drosophila fab-7 insulator. Genetics 177:113-121.

99. Rodin S, Georgiev P. (2005) Handling three regulatory elements in one transgene: Combined use of cre-lox, FLP-FRT, and I-Scel recombination systems. Biotechniques 39: 871-876.

100. Roseman RR, Pirrotta V, and Geyer PK. (1993) The su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects. EMBO J. 12: 435^142.

101. Rubin GM, and Spradling AC. (1982) Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science 218: 348-353.

102. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a Laboratory Manual, Ed.2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

103. Sanchez-Eisner T, Gou D, Kremmer E, Sauer F. (2006). Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ashl to Ultrabithorax. Science 311:11181123.

104. Schuettengruber B, Chourrout D, Vervoort M, Leblanc B, Cavalli G. (2007) Genome regulation by polycomb and trithorax proteins. Cell 128:735-745

105. Schweinsberg S, Hagstrom K, Gohl D, Schedl P, Kumar RP, Mishra R, Karch F. (2004) The enhancer-blocking activity of the Fab-7 boundary from the Drosophila bithorax complex requires GAGA-factor-binding sites. Genetics 168:1371-84.

106. Scott KS, Taubman AD, Geyer PK. (1999) Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength. Genetics 153: 787-798.

107. Siegal ML, Hartl DL. (2000) Application of Cre/loxP in Drosophila. Site-specific recombination and transgene co-placement. Methods Mol. Biol. 136: 487-495.

108. Sigrist CJ and Pirrotta V. (1997) Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by the Drosophila polycomb response element (PRE) but allow trans interactions between PREs on different chromosomes. Genetics 147: 209-221.

109. Smale ST, Kadonaga JT. (2003) The RNA polymerase II core promoter. Annu Rev Biochem. 72:449-479.

110. Smale ST. (2001) Core promoters: active contributors to combinatorial gene regulation. Genes Dev. 15:2503-2508.

111. Smith P A, Corces VG. (1995) The suppressor of Hairy-wing protein regulates the tissue-specific expression of the Drosophila gypsy retrotransposon. Genetics 139: 215— 228.

112. Soshnev AA, Li X, Wehling MD, Geyer PK. (2008) Context differences reveal insulator and activator functions of a Su(Hw) binding region. PLoS Genet. 4: el000159.

113. Spradling AC and Rubin GM. (1982) Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science 218: 341—347.

114. Stogios PJ, Downs GS, Jauhal JS, Nandra SK, Prive GG. (2005) Sequence and structural analysis of BTB domain proteins. Genome Biol. 6: R82.

115. Strutt H, Cavalli G, Paro R. (1997) Co-localization of Polycomb protein and GAGA factor on regulatory elements responsible for the maintenance of homeotic gene expression. EMBO J. 16:3621-3632.

116. Szutorisz H, Dillon N, Тога L. (2005) The role of enhancers as centres for general transcription factor recruitment. Trends Biochem Sci. 30:593-599.

117. Udvardy A, Maine E, Schedl P. (1985) The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains. J. Mol. Biol. 185: 341-358.

118. Valenzuela L, Kamakaka RT. (2006) Chromatin insulators. Annu. Rev. Genet. 40: 107-138.

119. Vazquez J, Schedl P. (1994) Sequences required for enhancer blocking activity of scs are located within two nuclcase-hypersensitive regions. EMBO J. 13: 5984-5993.

120. Vazquez J, Schedl P. (2000) Deletion of an insulator element by the mutation facet-strawberry in Drosophila melanogaster. Genetics. 155: 1297—1311.

121. Wallace J, Felsenfeld G. (2007) We gather together: insulators and genome organization. Curr Opin Genet Dev. 17: 400-407.

122. Wei W, Brennan MD. (2001) The gypsy insulator can act as a promoter-specific transcriptional stimulator. Mol. Cell. Biol. 21: 7714-7720.

123. Weis L, Reinberg D. (1992) Transcription by RNA polymerase II: initiator-directed formation of transcription-competent complexes. FASEB J. 6:3300-3309.

124. Wendt KS, Yoshida K, Itoh T, Bando M, Koch B, Schirghuber E, Tsutsumi S, Nagae G, Ishihara K, Mishiro T, Yahata K, Imamoto F, Aburatani II, Nakao M, Imamoto N, Maeshima K, Shirahige K, Peters JM. Nature 451:796-801.

125. West AG and Fraser P. (2005) Remote control of gene transcription. Hum. Mol. Genet. 14: 101-111.

126. Zhao H, Dean A. (2005) Organizing the genome: enhancers and insulators. Biochem Cell Biol. 83:516-524.

127. Zhao K, Hart CM, Laemmli UK. (1995) Visualization of chromosomal domains with boundary element-associated factor BEAF-32. Cell. 81: 879-889.

128. Zhou J, Ashe H, Burks C, Levine M. (1999) Characterization of the transvection mediating region of the abdominal-B locus in Drosophila. Development. 126:3057-3065.

129. Zhou J, Levine M. (1999) A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embryo. Cell. 99:567-575.

130. Zhou J, Barolo S, Szymanski P, Levine M. (1996) The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo. Genes Dev. 10: 3195-3201.

Информация о работе

Ерохин, Максим Максимович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.26

Диссертация

Изучение функциональных активностей инсуляторов из регуляторных областей генов yellow и white у D. melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы