Новые свойства Su(Hw) инсулятора: влияние на Flp зависимую рекомбинацию, транспозиции P-элемента и промотор гена yellow у Drosophila melanogaster

Каракозова, Марина Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые свойства Su(Hw) инсулятора: влияние на Flp зависимую рекомбинацию, транспозиции P-элемента и промотор гена yellow у Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Новые свойства Su(Hw) инсулятора: влияние на Flp зависимую рекомбинацию, транспозиции P-элемента и промотор гена yellow у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 575.22:595.773.4.

Каракозова Марина Викторовна

Новые свойства Su(Hw) инсулятора: влияние на Flp-зависимую рекомбинацию, транспозиции Р-элемента и промотор гена yellow у Drosophila melanogaster.

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Института биологии гена РАН

Научный руководитель:

Чл.-корр. РАН., доктор биологических наук, профессор Георгиев П.Г.

Официальные оппоненты:

Чл.-корр. РАН., доктор медицинских наук, профессор Корочкин Л.И. Кандидат биологических наук Куликов А.М.

Ведущая организация'. Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Защита диссертации состоится } ноября 2003 года в час. на заседа!

Диссертационного совета Д 002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 1193 Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан

// октября 2003 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

канд. фарм. наук / / __ / ~ Грабовская Л.С.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Одной из особенностей регуляции транскрипции высших эукариот является способность энхансеров активировать промотор на расстоянии, достигающем нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов. Несмотря на огромное количество информации о различных уровнях регуляции транскрипции, механизм взаимодействия между энхансером и промотором на больших дистанциях остается открытым.

Большая часть существующих экспериментальных данных согласуется с тем, что белки, связанные с энхансером, непосредственно взаимодействуют с белками основного транскрипционного комплекса или вспомогательными белками, собранными на промоторе, при этом ДНК между ними образует петлю. Возникает вопрос, каким образом энхансер может взаимодействовать с промотором на больших дистанциях и при этом правильно узнавать свой промотор. Хотя к настоящему моменту описано огромное количество энхансеров и промоторов, изучено множество факторов транскрипции, вопрос о механизме взаимодействия между энхансером и промотором остается открытым.

В понимании механизмов дальних взаимодействий между регуляторными элементами большую роль могут сыграть инсуляторы. Инсуляторами называются регуляторные элементы, которые блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, если находятся между ними. При этом инсуляторы не влияют непосредственно на активность эпхансера и промотора, т.е. промотор может быть активирован любым другим энхансером, а энхансер может активировать любой другой промотор.

В 1991 году были открыты первые два инсулятора дрозофилы, ses и ses', которые окружают ген теплового шока hsp70 дрозофилы. В настоящее время открыто большое число инсуляторов у разных организмов от дрозофилы до человека, показана универсальность и кооперативность их действия. •. *

Изучение действия инсуляторов представляет интерес как в научном плане - для выяснения принципов организации генома и регуляции экспрессии генов, гак и в прикладном плане - для создания векторов, которые способны поддерживать стабильную экспрессию генов вне зависимости от места инсерции в геноме. Важным доказательством необходимости инсуляторов в поддержании транскрипционной автономии служит то, что врожденная форма миотонической дистрофии вызвана

потерей функционального ДМ 1 инсулятора (Filippova et al. 2001), ответственного за предупреждение чрезмерной активации энхансером ДМРК гена. Появление связи между инсуляторами и болезнями людей демонстрирует важность для понимания механизмов инсуляторного взаимодействия.

Цели и задачи исследования: Основной целью данного исследования являлось исследование свойств Su(Hw) инсулятора.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучение механизма репрессии транскрипции гена yellow Su(Hw) инсулятором в отсутствии белка Mod(mdg4).

2. Выяснение влияния Su(Hw) инсулятора на транспозиции Р-элемента.

3. Анализ роли взаимодействия между Su(Hw) инсуляторами в регуляции рекомбинации между сайтами для Flp рекомбиназы дрожжей.

Научная новизна и практическое значение работы.

В результате проведенного исследования было впервые показано, что Su(Hw) инсулятор участвует в спаривании гомологичных хромосом. Продемонстрировано, что Su(Hw) эффективно взаимодействует как в половых, так и в соматических клетках и может блокировать взаимодействия между белками, отвечающими за рекомбинацию и транспозиции мобильных элементов. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют против общепринятой концепции, что в отсутствии белка Mod(mdg4) Su(Hw) инсулятор индуцирует структурные изменения хроматина, которые приводят к репрессии транскрипции вблизи расположенных генов.

Результаты, полученные в работе, имеют большое практическое значение. Так в настоящее время Р-транспозоны, содержащие Su(Hw) инсулятор широко используются для мутирования всех генов дрозофилы. В данной работе показано, что инактивация белка Mod(mdg4) в мутации mod(mdg4)ul полностью супрессирует блокирование транспозиций Р-элемента Su(Hw) инсулятором. Таким образом, создана генетическая система, которая позволяет преодолеть проблему, связанную с ингибированием транспозиций Р-элемента встроенным Su(Hw) инсулятором. На примере Su(Hw) инсулятора показало, что иисуляторы могут влиять на свойства конструкций интегрироваться в геномы. Этот результат имеет большое значение для генной терапии, в которой инсуляторы находят все большее применение.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), VI международной конференции "Drosophila Heterochromatm"(TaBe;nio, Италия, 2003), 44

международной конференции по исследованию на дрозофиле (Чикаго, США, 2003) и межлабораторном семинаре ИБГ РАН (Москва, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликованы четыре печатные работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на $3 страницах, включает 4 таблицы и 19 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов н методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 95 источников.

Результаты

1. Изучение механизма репрессии транскрипции гена yellow Su(Hw) инсулятором в отсутствии белка Mod(mdg4).

1.1. Создание модельной системы для исследования факторов, влияющих на степень репрессии гена yellow Su(Hw) инсулятором в отсутствии белка Mod(mdg4).

Мутация mod(mdg4)l"', которая инактивирует только одну изоформу Mod(mdg4) белка, нарушает связывание белка Mod(mdg4) с Su(Hw). Это приводит в некоторых случаях к потере способности блокировать энхансеры, а в других - к превращению Su(Hw) инсулятора в репрессор, который может непосредственно инактивировать промотор и неизолированные энхансеры (Georgiev and Kozycina 1996; Cai and Levine 1997; Gerasimova et al. 1995).

Наиболее изученным примером превращения Su(Hw) инсулятора в репрессор является мутация у2, индуцированная инсерцией МДГ4 в регуляторную область гена yellow, который отвечает за пигментацию кутикулярных структур личинки и имаго и контролируется несколькими тканеспецифичными энхансерами (Geyer and Corees 1987). Энхансеры, определяющие экспрессию в кутикуле тела и крыловых пластинок (в дальнейшем - энхансеры тела и крыльев) расположены перед промотором гена, а энхансер, отвечающий за экспрессию в щетинках - в интроне. В результате энхансеры, ответственные за экспрессию гена в теле и крыльях, оказываются изолированными от промотора Su(Hw) инсулятором, что фенотипически выражается в отсутствии пигмента в крыльях и кутикуле тела (желтое тело и крылья) в то же время ген yellow нормально экспрессируется в щетинках (черные щетинки), так как соответствующий энхансер находится в интроне гена. Комбинирование mod(mdg4)lмутации с у2 аллелем

приводит к инактивации гена yellow в щетинках, что можно объяснить прямым ингибированием промотора (Georgiev and Kozycina 1996; Gerasimova et al. 1995).

Для подробного изучения этого явления была создана модельная система с использованием трансгенных конструкций. За основу был взят трапспозон CaSpeR3, содержащий репортерный ген miniwhite, позволяющий отбирать трансгенных мух. В качестве Su(Hw) инсулятора был использован фрагмент, полученный с помощью ПЦР на матрице МДГ 4, длиной 430 п.н., содержащий 12 сайтов связывания для белка Su(Hw).

Для подтверждения адекватности созданной модельной системы была получена конструкция ES(-893)YW. В ES(-893)YW конструкции Su(Hw) инсулятор был встроен в положение -893 п.н., относительно промотора гена yellow между энхансерами тела и крыльев и промотором (рис. 1). Маркерный ген white, определяющий цвет глаз был встроен позади гена yellow.

En-w Fn-Ь suCHw) ___

Hm-И--F^— I----F1— ~1---<

-893 yellow white

Рис. 1. Схема конструкции ES(-893)YW.

Обозначения: Энхансеры, активирующие гen yellow в крыльях (E-w) и теле (Е-Ь) дрозофилы; Su(Hw), инсулятор Su(Hw); yellow, полноразмерная копия гена yellow, miniwhite, ген while с частичной делецией первого интрона. Стрелки указывают направление транскрипции yellow и miniwhite генов; черные треугольники на концах конструкции обозначают последовательности Р-элемента.

В результате трансформации в эмбрионы дрозофилы (Kares and Rubin 1984) было получено 18 ES(-893)YW трансгенных линий содержащих единственную вставку, что было проверено с помощью Саузерн-блот анализа. Все линии имели ^-подобный фенотип (желтые тело и крылья и окрашенные щетинки), что связано с блокированием энхансеров тела и крыльев Su(Hw) инсулятором (рис. 2). В ES(-893)YW линии была введена мутация mod(mdg4)"s как описано в (Georgiev and Kozycina 1996). Только в 5 ES(-893)YW линиях mod(mdg4)u' мутация индуцировала полную репрессию транскрипции гена yellow. В 4 линиях mod(mdg4)"' не имела эффекта, а 9 других степень репрессии варьировала от слабой (только отдельные щетинки желтые) до средней (около половины щетинок либо желтые либо черные). Таким образом, полученные результаты предполагают, что степень репрессии зависит от положения конструкции в геноме.

Для статистической достоверности результатов были получены дополнительные инсерции ES(-893)YW с помощью индукции транспозиций с X хромосомы на аутосомы на фоне мутации mod(mdg4)ul. В результате было получено дополнительно 36 ES(-893)YW линий с одной инсерцией, в которых наблюдалось примерно такое же распределение трансгенных линий (рис. 2).

® yellow Ah

5 4 3 2

+/+ m/m +/+ m/m

+/+m/m +i+m/m +/+rn/tn +/+m/m +/+m/m +/+m/m

EsC-893) Es(-S93) E5(-343) EsC-1629) Es(-T868) eySW yw транспозиция yw yw yw

ESC-893) LS(-IS6S) S(-89j)YW ЕРГХ2C-1868) YSW YSW E.Pr(-l868) SC-893)YW

yellow ВГ

W-V

m-v e-v

+/+m/m +/+ m/m +/+m/m +/+m/m +/+m/m +/+m/m +/+m'm +/+m/m +/+m/m +/+m/m

ESC-893) Es(-893)YWEsC-343) EsC-1629is(-1868) EYSW ES(-893IESC-1868)EPr(-]8M) EPrxZC-1868) YW транспозиция YW YW YW YSW YSW S(-89i)YVfiC~893)YW

Рис. 2. Экспрессия гена_уе//ои< в трансгенных линиях.

а - Экспрессия гена yellow в последних сегментах брюшка. Фенотипическое проявление гена yellow: Уровень экспрессии гена yellow в последних сегментах брюшка обозначены цифрами ( 1 - отсутствие экспрессии гена yellow (у'-фенотип); 5 - соо тветствует нормальному уровню экспрессии гена yellow (у*-фенотип). АЬ - пигментация брюшка.

б - Экспрессия гена yellow в грудных щетинках и волосках. Уровень экспрессии гена yellow в грудных щетинках и волосках обозначены цифрами (1 - все щетинки и волоски желтые (у'-фенотип); w-v, волоски и одна-две щетинки желтые; ш-v, волоски и половина щетинок желтые; e-v, большая часть щетинок желтые; 5 — соответствует нормальному уровню экспрессии (у+-фенотип). Вг - пигментация грудных щетинок. Цифры внутри прямоугольников указывают на число линий, соответствующих данному фенотипу. Сокращения: m, mod(mdg4)"J; +, mod(mdg4).

1.2. Степень репрессии зависит от локализации Su(IIw) кнсулятора относительно промотора гена yellow.

Следующей задачей было исследовать зависимость эффективности репрессии от локализации Su(Hw) инсулятора относительно промотора гена yellow. С этой целью были сделаны конструкции, содержащие Su(Hw) инсулятор в положении -343 п.н., -1629 п.н., (внутри энхансера тела), -1868 п.н., (между энхансером тела и крыльев) и с 3' стороны гена yellow (рис. 3).

En-wEn-b su(mw)____________

-343 yellow white

En-w Lri Lju(НИ)

-1629 yellow white

yellow white

SU(HW)

—

yellow white

Рис. 3. Схемы конструкций ES(-343)YW, ES(-1629)YW, ES(-1868)YW и EYSW.

Трансгенные линии, содержащие одну вставку любой из конструкций, были получены как в результате трансформации, так и с помощью индукции транспозиций конструкций с X хромосомы на аутосомы. Наиболее сильно мутация mod(mdg4)ul репрессировала ген yellow в линиях, в которых Su(Hw) находился рядом с промотором гена (ES(-893)YW) и наиболее слабо в EYSW линиях, в которых Su(Hw) инсулятор находился с 3' стороны гена yellow (рис. 2). Таким образом, степень репрессии прямо коррелирует с удаленностью Su(Hw) инсулятора от промотора гена yellow. Интересно, что в ES(-1868)YW линиях мутация mod(mdg4)ul индуцировала сильную репрессию гена yellow в щетинках, но не в теле и крыльях, экспрессия в которых контролировалась энхансером, расположенным в непосредственной близости от Su(Hw) инсулятора (рис. 2). В ES(-1629)YW линиях мутация mod(mdg4)ul более эффективно репрессировала транскрипцию гена yellow в теле, что возможно связано с частичной инактивацией энхансера тела инсерцией Su(Hw) инсулятора. Следует также отметить, что степень репрессии для всех конструкций сильно зависела от места инсерции трансгена.

1.3. В отличие от других известных репрессоров, два Su(Hw) инсулятора только незначительно увеличивают степень репрессии гена yellow.

Известные репрессоры, действующие через изменение структуры хроматина, имеют кооперативный эффект (Pirrota 1998). Для выяснения будут ли две копии Su(Hw) инсулятора кооперативно репрессировать транскрипцию, были созданы ES(-1868)YSW и ES(-893)YSW конструкции, содержащие одновременно два Su(Hw) инсулятора, окружающих кодирующую часть гена yellow (рис. 4).

en-wEn-b suChw) _ su(Hw)

>—i i h-a-1 i—n—E

whi te

5 u(mv)__

]-E3—

yellow white

Рис. 4. Схемы конструкций ES(-893)YSW, ES(-1868)YSW.

В результате было получено в общей сложности 19 ES(-1868)YSW линий и 24 ES(-893)YSW линий, в которых распределение эффекта действия mod(mdg4)ul между трансгенными линиями было примерно таким же как в ES(-1868)YW и ES(-893)YW линиях, которые не имели Su(Hvv) инсулятора с 3' стороны гена yellow. Таким образом, пк^(гг^4)и1-зависимая репрессия, индуцированная Su(Hw) инсулятором, не имеет выраженного кооперативного эффекта (рис. 2).

1.4. Дополнительные промоторы гена yellow приводят к значительному уменьшению репрессии транскрипции гена yellow.

Ранее было высказано предположение (Georgiev and Kozycina 1996), что в отсутствии белка Mod(mdg4) Su(Hw) инсулятор непосредственно ипгибирует промотор гена yellow за счет прямого взаимодействия кислого С-концевого домена белка Su(Hw) с одним из факторов транскрипционного комплекса. Можно предположить, что в этом случае присутствие дополнительных промоторов гена yellow может супрессировать mod(mdg4)ul-3aBHCHMyK> репрессию транскрипции. Для проверки этой гипотезы были созданы конструкции, в которых один, EPr(-1868)S(-893)YW, или два, EPrx2(-1868)S(-893)YW, промотора гена yellow были встроены в положение -1868 п.н., между энхансерами тела и крыльев.

Одновременно эти конструкции содержали Su(Hw) инсулятор в положении -893 п.н., (рис. 5).

FI1-W" [ГП-П SUCHWJ ___

►-чзхгь-ш—I-- ~1---F~-—-

-893 yellow white

Рг Рг

En-wpr Еп-b suCHw)_____

yellow white

Рис. 5. Схемы конструкций EPr(-1868)S(-893)YW, EPrx2(-1868)S(-893)YW.

В шести из 17 полученных EPr(-1868)S(-893)YW трансгенных линий происходило слабое увеличение экспрессии гена yellow в теле (рис. 2). Степень репрессии, индуцированная мутацией mod(mdg4)ul, была незначительно уменьшена по сравнению с ES(-893)YW линиями, не содержащими в области энханссров дополнительного промотора гена yellow.

В двенадцати из 26 EPrx2(-1868)S(-893)YW трансгенных линий экспрессия гена yellow в теле была увеличена, что предполагает роль двух промоторов гена yellow в деблокировании энхансеров (рис. 2). Механизм этого явления пока остается непонятным. Мутация mod(mdg4)ul индуцировала только слабую репрессию в 6 линиях. Следовательно, инсерция двух дополнительных промоторов гена yellow в область энхансеров, значительно супрессирует негативное действие мутации mod(mdg4)ul на транскрипцию гена yellow. Можно предположить, что дополнительные промоторы являются конкурентами промотора гена yellow за сигнал репрессии, индуцированной Su(Hw) инсулятором в присутствии mod(mdg4)ul мутации.

2. Выяснение влияния Su(Hw) инсулятора на транспозиции Р-элемента.

2.1. Разработка генетической модели для исследования влияния Su(Hw) инсулятора на взаимодействия мевду белковыми комплексами, обеспечивающих транспозиции Р-элемсита.

Наиболее распространенная модель предполагает, что инсуляторы подразделяют хромосомы эукариот на функционально и структурно автономные домены (West et al. 2002; Gerasímova and Corees 2001). Эта модель имеет цитологическое подтверждение, так как белки Su(Hw) и Mod(mdg4) находятся в ядре в виде больших белковых скоплений или «инсуляторных тел» на периферии ядра (Gerasimova et al. 2000). Также было показано, что два Su(Hw) инсулятора, которые находятся между энхансером и

промотором, взаимодействуют между собой, что приводит к потере способности инсулировать и в некоторых случаях способствует взаимодействию между энхансером и промотором (Cai and Shen 2001; Muravyova et al. 2001). Если блокирование энхансеров происходит за счет взаимодействия между Su(Hw) инсуляторами, то можно ожидать, что в результате взаимодействия между Su(I-Iw) инсуляторами может происходить либо блокирование либо улучшение взаимодействия между белками, которые не участвуют в транскрипции.

Для проверки этого предположения были использованы две модели. В первой модели была проанализирована способность Su(Hw) инсулятора блокировать взаимодействие между белковыми комплексами, которые связываются с концами Р-элемента и ответственны за его перемещения. Для осуществления транспозиции Р-эдемента необходимы примерно 150 п.н., на терминальных концах элемента. Транспозаза связывается с последовательностью, длиной 10 п.н., расположенной рядом с инвертированным повтором 31 п.н., Транспозиция происходит по принципу "вырезание-встраивание". Для транспозиции Р-элемента необходимо взаимодействие между белковыми комплексами, включающими транспозазу, па обоих концах Р-элемента. Предполагается, что при взаимодействии концов Р-элемента формируется синаптический комплекс и образование тстрамера транспозазы переводит ее в активное состояние. Таким образом, если Su(Hw) инсулятор блокирует взаимодействие между транспозазными комплексами, то происходит супрессия транспозиций.

2.2. Su(Hw) инсулятор супрессирует транспозиции Р-элемента.

Для изучения роли Su(Hw) инсулятора в блокировании взаимодействия между транспозазными комплексами Р-элемента в первой серии экспериментов были использованы ранее полученные трансгенные линии, содержащие конструкции с маркерными генами yellow и white на X хромосоме. В ES(-893)YW конструкции Su(Hw) инсулятор находился в —893 п.н., относительно начала транскрипции гена yellow. В ES(-893)YSW конструкции yellow ген, был окружен Su(Hw) инсуляторами, один в позиции -893, а другой за yellow геном. В общей сложности в эксперименте было использовано четыре ES(-893)YSW трансгенных линий и три ES(-893)YW линии, которые содержат конструкцию на X хромосоме.

Была также создана конструкция WS, в которой Su(Hw) инсулятор находится с 3' конца white гена (рис. 6). В результате трансформации в эмбрионы дрозофилы было получено две независимых WS трансгенных линии, которые имели инсерцию на X

хромосоме. Структура транспозона в трангенных линиях и их количество было проверено с помощью Саузерн- блот анализа.

El-WEn-b 5U(HW) ___

►—гн г—ш—I--- i-i-- I-4

yellow white

En-WEn-b su(hw) _ su(Hw) _

>—1ГО-Ш-1---I--Щ-F".......I-4

yellow white

_ SUCHW)

V-1-—• I—о—4

white

Рис. 6. Схема конструкции WS в сравнении с ранее описанными конструкциями ES(-893) YW и ES(-893)YSW.

Таким образом, Р-элемент бьш мобилизован в трех ES(-893)YW линиях, четырех ES(-893)YSW, и двух WS линиях по схеме описанной в Kares and Rubin (1984). В результате было обнаружено, что частота транспозиций Р-элемента с X хромосомы на аутосому была значительно ниже в большинстве экспериментальных трансгенных линиях, чем ожидалось. Снижение частоты транспозиций можно было объяснить негативной ролью одной или двух копий Su(Hw) инсулятора, встроенных между концами Р-элемента. Так как Mod(mdg4) белок является функциональным компонентом Su(Hw) инсулятора, была исследована частота траспозиций Р-элемента в присутствии гомозиготной mod(mdg4)"' мутации. В результате было обнаружено, что инактивация белка Mod(mdg4) приводит к возрастанию частоты транспозиций от 3- до 100-раз в зависимости от трансгенной линии. На основе этих результатов мы предположили, что Mod(mdg4) является необходимым для супрессии транспозиции Р-элемента, содержащего одну или две копии Su(llw) инсулятора.

2.3. Белок Mod(mdg4) является ключевым в супрессии транспозиций Р-элемента Su(Hw) инсулятором.

Помимо белка Mod(mdg4) с Su(Hw) инсулятором могут связываться другие белки, которые также могут супрессировать транспозиции Р-элемента. Чтобы выяснить роль других компонентов Su(Hw) инсулятора в блокировании транспозиций Р-элемента, были созданы конструкции в которых один Su(Hw) инсулятор бьш вставлен либо в -893 п.н., E(S)YW; или между yellow и white генами, EY(S)W (рис. 7).

----1-- . ~П-4

white

5U(Hw)

-a • I - i-i

white

Рис. 7. Схемы конструкций E(S)YW и EY(S)W.

Su(Hw) инсулятор был фланкирован сайтами узнавания для Сге рекомбиназы (LOX), что позволяет вырезать Su(Hw) инсулятор в результате гомологичной рекомбинаии между LOX сайтами в присутствии Сге рекомбиназы (Siegal and Hartl 2000). Для анализа были отобраны три EY(S)W и две E(S)YW трансгенные линии, которые содержат одиночные инсерции конструкции на X хромосоме. Частота транспозиций была исследована по стандартной схеме (Kares and Rubin (1984)) на этих трансгенных линиях и их производных, полученных в результате делеции Su(Hw) инсулятора. Оказалось, что делеция Su(Hw) инсулятора значительно увеличивает частоту транспозиций, что согласуется с ролью Su(Hw) инсулятора в блокировании взаимодействия между белковыми комплексами на концах Р-элемснта. Однако, при повторении эксперимента в присутствии гомозиготной mod(mdg4)"' мутации частоты транспозиций в конструкциях с Su(Hw) инсулятором и без него были примерно одинаковыми. Таким образом, результаты показывают, что основную роль в блокировании транспозиций Su(Hw) инсулятором играет белок Mod(mdg4).

Теоретически существует также вероятность, что другая, возможно доминантная мутация, содержащаяся на хромосоме вместе с mod(mdg4)"' отвечает за супрессию активности Su(Hw) инсулятора. Поэтому, для подтверждения роли белка Mod(mdg4) в супрессии транспозиций, мы сравнили частоту транспозиций Р-элемента в двух E(S)YW трансгенных линиях на фоне mod(mdg4)ul/mod(mdg4')* и mod(mdg4)*/mod(mdg4)*. Исходя из сравнительно низкой подвижности Р-транспозиций в диком типе и на фоне mod(mdg4)ul/mod(mdg4)* мы предположили, что влияние mod(mdg4)"' является рецессивным. Затем, мы исследовали частоту транспозиций в тех же линиях на фоне mod(mdg4)T6/mod(mdg4)"' , где аллель mod(mdg4)T6 продуцирует усеченную версию Mod(mdg4)-67.2 белка, который как и в случае mod(mdg4)"' мутации, не способен связываться с Su(Hw) белком (Mongelard et al. 2002). Оказалось, что mod(mdg4)T6/mod(mdg4)"1 трапс-гетерозиготы восстанавливали частоту транспозиций в E(S)YW трансгенных линиях в той же степени, как и mod(mdg4)"' гомозиготы. Так как mod(mdg4)ul и mod(mdg4)16 мутации имеют различное

En-wEn-b supw)

LOX LOX

yellow

Ln-W En-b

►—I I I-E

yel low

происхождение, то можно исключить возможность существования другой мутации на третьей хромосоме, которая влияет на частоту транспозиций. Таким образом, все полученные результаты подтверждают основную роль белка Mod(mdg4) в супрессии транспозиций транспозона, содержащего одну или две копии Su(Hw) инсулятора.

2.4. Взаимодействие между двумя копиями Su(Hw) инсулятора не приводят к нейтрализации блокирования транспозиций Р- транспозона.

Недавно было продемонстрировано, что два Su(Hw) могут взаимодействовать таким образом, что нейтрализуют энхансер-блокирующую активность друг друга (Gause et al. 1998; Cai and Shen 2001; Muravyova et al. 2001). Для сравнения частоты транспозиций Р-транспозона, содержащего одну или две копии Su(Hw) инсулятора были использованы 3 ESY(S)W трансгенные линии, которые содержат единичные инсерции транспозона на X хромосоме (рис. 8). Также была создана (S)WS конструкция. В этой конструкции Su(Hw) инсулятор был помещен между LOX сайтами, что позволяет сравнивать транспозиции конструкции в присутствии одной и двух копий Su(Hw) инсулятора в одном и том же геномном положении. В результате трансформации в эмбрионы дрозофилы было получено две независимые трансгенныс (S)WS линии, которые содержат одну инсерцию транспозона на X хромосоме (рис. 8).

Еп-\у Еп-Ь 5Ц(№)

^—I I I—и-

Рис. 8. Схемы конструкций (8)\УБ и Е8У(8^.

Частота транспозиций была исследована в двух (Б^Б и трех ЕБУ(8)\У трансгенных линиях до и после вырезания 8и(Н\у) инсулятора. Оказалось, что частота транспозиций была приблизительно одинаковой в присутствии одного или двух копий 8и(Н\у) инсулятора. Как и в ранее проведенных экспериментах, частота транспозиций резко увеличивалась в присутствии гомозиготной мутации тос1(тс1%4)и1. Таким образом, взаимодействие между двумя 8и(Ниг) инсуляторами не влияет значительно на способность блокировать транспозиции.

su(Hw)

LOX LOX

SU(HW)

yellow

LOX LOX

SU(HW)

whi te

white

3. Анализ роли взаимодействия меяеду Su(Hw) инсуляторами в регуляции рекомбинации .между сайтами для Flp рекомбнназы дрожжей.

3.1. Создание модельной системы для изучения роли взаимодействия между Su(Hw) инсуляторами в модулировании частоты рекомбинации между FRT сайтами.

Второй моделью для изучения роли взаимодействия между Su(Hw) инсуляторами была выбрана рекомбинация между FRT сайтами для Flp рекомбиназы (рис. 9). Ранее было продемонстрировано, что если FRT участки помещены в одинаковой ориентации с обеих сторон while гена, то происходит вырезании гена white в результате рекомбинации между FRT сайтами. Однако невозможно различить происходит ли рекомбинация между FRT сайтами, которые находятся в одной хроматиде или в сестринских хроматидах (рис. 9). По этой причине была изучена рекомбинация между FRT участками, которые находятся в инвертированной (противоположной) ориентации относительно друг друга.

Рис. 9. Схема возможных вариантов рекомбинации между FRT сайтами, которые находятся в противоположной ориентации.

Схематичное изображение различных путей рекомбинации между FRT участками, находящимися в инвертированной ориентации 1, рекомбинация между FRT участками (черные стрелки) находящихся на одной хроматиде, образуются инверсии, что приводит либо к репрессии либо к активации гена white 2, неравная рекомбинация между FRT участками, находящихся на сестринских хроматидах, образуются дицентрические хромосомы, что приводит к гибели клеток; 3, гомологичная рекомбинация между FRT участками, находящимися на сестринских хроматидах, не изменяет структуры гена white, и поэтому эти события невозможно фиксировать.

Раньше было показано (рис. 9) что рекомбинация между FRT участками, находящимися в инвертированной ориентации вызывает инверсии, в то время как неравный сестринский хроматидный обмен вызванный рекомбинацией между FRT представлен дицептрическими хромосомами (Golic 1994; Ahmad and Golic 1998).

Формирование дицентрических хромосом в течение личиночной или ранней кукольной стадии приводит к различным дефектам развития: низкой выживаемости и стерильности. Таким образом, можно различить рекомбинацию в одной хромосоме и неравную рекомбинацию в сестринских хроматидах. Однако равная рекомбинация между FRT участками в сестринских хроматидах, не может быть идентифицирована с помощью генетических методов анализа (рис. 9).

Для анализа рекомбинации между FRT сайтами был использован ген while. Экспрессия гена white в клетках автономна, что позволяет оценивать white экспрессию в индивидуальных клетках. Как маркер для выявления трансгенных линий был использован ген yellow. В контрольной w-FRT конструкции (рис. 10) два FRT участка были встроены в противоположной ориентации в четвертый интрон между 3' сторонами white гена. Таким образом, расстояние между FRT было около 1700 п.н. В результате трансформации в эмбрионы дрозофилы были получены три трансгенные линии, несущие единичную вставку конструкции w-FRT на второй хромосоме.

Ь—I П-1----1--i

yellow 5 -white 3'-white

5 -white -вэз 3'-white-®»

Рис. JO. Схемы конструкций w-FRT, w-FRT-in и w-FRT-out.

Для индукции рекомбинации между FRT сайтами самцы, содержащие w-FRT конструкцию в гомозиготе, были скрещены с самками, несущими FLP рекомбиназу, находящуюся под температуро-чувствительным промотором P[hs FLP] на СуО хромосоме (Golic and Lindquist, 1989). Для индукции достаточного уровня Fip рекомбиназы, тепловой шок был сделан два раза по два часа в течение поздней эмбриональной - ранней личиночной стадии развития дрозофилы. В результате индуцированной рекомбинации между FRT сайтами в w-FRT конструкции у Fi самцов наблюдались выраженные дефекты развития: сильный Су фенотип, глазные дефекты, низкая выживаемость и фертильность. Как было ранее показано, эти дефекты являются следствием гибели клеток после образования дицентрических хромосом в результате неравной рекомбинации между FRT сайтами, которые находятся в сестринских

хроматидах. Одновременно у F1 самцов наблюдалась достаточно сильная мозаичность в глазах (m-v - 2 уровень мозаичности), состоящая из белых и красных пятен, что говорит о рекомбинации между FRT сайтами в соматических клетках глаз. Наконец в F2 потомках самцов, содержащих w-FRT конструкцию и ген для Flp рекомбиназы, наблюдалось появление как самцов с окрашенными глазами (нет рекомбинации между FRT сайтами) так и самцов с белыми глазами (произошла рекомбинация между FRT сайтами, которая привела к инактивации гена white). По соотношению самцов с окрашенными и белыми глазами можно судить об интенсивности рекомбинации между FRT сайтами в половых клетках. Таким образом, полученная модельная система позволяет анализировать рекомбинацию между FRT сайтами в половых и соматических клетках, а также не гомологичную рекомбинацию между FRT сайтами, которые находятся в сестринских хроматидах.

3.2. Взаимодействие между Su(Hw) ннсуляторами блокирует неравную рекомбинацию между FRT сайтами на сестринских хроматидах.

Для изучения роли взаимодействия между Su(Hw) ннсуляторами в модулировании рекомбинации между FRT сайтами были созданы две конструкции: w-FRT-in и w-FRT-out, несущие два Su(Hw) инсулятора (рис. 10). В обеих конструкциях один Su(Hw) инсулятор, заключенный между LOX-сайтами, был встроен в четвертый интрон гена white таким образом, чтобы разделить FRT сайты. Второй Su(Hw) инсулятор был вставлен либо с наружной стороны от FRT сайтов (w- FRT-out) либо между FRT сайтами (w-FRT-in). В результате FRT сайты были разделены одним Su(Hw) инсулятором в w-FRT- out или двумя Su(Hw) ннсуляторами в w-FRT-in (рис. 10). В ходе трансформации эмбрионов дрозофилы были получены трансгенные линии w-FRT-in (4 линии) и w-FRT-out (3 линии), имеющие единичную вставку конструкции на второй хромосоме. Далее были получены производные трансгенные линии w-FRT-in Asu и w-FRT-out Asu, у которых был делетирован Su(Hw) инсулятор, окруженный LOX сайтами. Все исходные линии и их производные были проанализированы с помощью Саузерн-блот анализа для проверки их структуры.

Если взаимодействие между Su(Hw) влияет на взаимодействие между FRT сайтами, то можно ожидать значительную разницу в частоте рекомбинации между FRT сайтами в w-FRT-in и w-FRT-out трансгенных линиях.

Уровень рекомбинации при введении гена Flp-рекомбиназы был определен по фенотипу глазных пятен. Такое фенотипическое проявление является мерой Flp-белок-белковых взаимодействий в соматических клетках глаз у F1-самцов.

Неожиданно оказалось, что введение гена для Flp рекомбиназы в трансгенные линии, содержащие Su(Hw) инсулятор, не приводит к появлению дефектов в развитии, что предполагает супрессию неравного обмена между сестринскими хроматидами. На основе полученного результата можно предположить, что Su(Hw) инсулятор супрессирует неравную рекомбинацию между сестринскими хроматидами. Для проверки этой гипотезы Flp-зависимая рекомбинация была индуцирована на фоне инактивации su(Hw) гена. В качестве контроля использовали линии w-FRT-outASu(Hw)" и w-FRT-outSu(Hw)". В результате Fl-самцы имели множественные дефекты развития, сильный Су фенотип, низкую выживаемость и фертильность, что подтверждает роль Su(Hw) инсулятора а не специфичность места инсериии конструкции в блокировании негомологичной рекомбинации между FRT сайтами.

Интересно, что супрессия негомологичной рекомбинации происходила как в w-FRT-in Asu так и w-FRT-out Asu трансгенных линиях. Таким образом, Su(Hw) инсулятор блокировал неравную рекомбинацию вне зависимости от того был ли Su(Hw) инсулятор между FRT сайтами или нет. Однако полученный результат можно также интерпретировать, что используемый источник Flp транспозазы не достаточно эффективен для выявления разницы в эффективности действия Su(Hw) инсулятора внутри и снаружи от FRT сайтов.

Для более достоверной оценки эффективности действия Su(Hw) инсулятора в блокировании негомологичного обмена между сестринскими хроматидами был использован Flp ген, который имел сильную экспрессию исключительно в голове. В результате, введение XX -Flp гена в линии с контрольной w-FRT конструкцией приводило к 100% гибели на стадии куколки. Исключительные мухи, изолированные из поздней куколки были без головы или имели очень маленькие глаза. Таким образом, высокий уровень Flp увеличивает эффективность клеточной смерти в отсутствии Su(Hw) инсулятора.

Для определения роли Su(Hw) инсулятора мы получили производные линии от исходных w-FRT- in и w-FRT-out с делегированным Su(Hw) инсулятором (w-FRT-inAsu w-FRT-outAsu) или с инвертированным white фрагментом, находящимся между FRT y4acTKaMn(d-w-FRT-in, d-w-FRT-out, d-w-FRT-inAsu, d-w-FRT-outAsu). В результате было обнаружено, что если конструкция включает один или два Su(Hw) инсулятора между FRT участками, мухи из трансгенных линий в комбинации с XX -Fip имели нормальную форму глаз и выживаемость. Тогда как в w-FRT-outAsu и d-w-FRT-outAsu линиях высокий уровень Flp рекомбиназы приводил к 100% летальности как в контрольных w-FRT линиях.

Таким образом, только один или два Su(Hw) инсулятора, находящиеся между FRT сайтами, эффективно блокируют неравную рекомбинацию между сестринскими хроматидами.

3.3. Взаимодействие между Su(Hw) инсуляторами регулирует рекомбинацию меаду FRT сайтами внутри хроматиды.

Рекомбинация между FRT сайгами приводит к появлению мозаичности глаз, что является удобной моделью для изучения факторов регулирующих рекомбинацию между FRT сайтами в соматических клетках. Во всех трех тестируемых контрольных w-FRT трансгенных линиях, Flp рекомбиназа индуцировала средний уровень мозаичности в глазах (уровень 3). В следующем поколении (F2) от15-20 % самцов в зависимости от w-FRT линий имели белые глаза. Таким образом, существует корреляция между рекомбинацией в половых и соматических клетках.

Ранее было показано, что одна копия Su(Hw) инсулятора не влияет на рекомбинацию между FRT участками, находящимися в одной ориентации (Pamell and Geyer 2000). Для сравнения влияния одной копии Su(Hw) инсулятора на рекомбинацию между FRT участками, вставленными в инвертированной ориентации, мы сравнили уровень FLP рекомбинации в w-FRT-in Asu и w-FRT-out Asu трансгенных линиях (Таблица 1). В результате оказалось, что хотя w-FRT-in Asu в линиях рекомбинация была несколько выше, чем в w-FRT-out Asu линиях достоверно значимых различий не было. Одновременно во всех трансгенпых линиях частота рекомбинации была значительно снижена относительно контрольных w-FRT трансгенных линий. Роль Su(Hw) инсулятора в репрессии Flp-зависимой рекомбинации была подтверждена значительным увеличением рекомбинации на Su(Hw)' фоне. Таким образом, одна копия Su(Hw) инсулятора теряет способность блокировать взаимодействие между двумя сайтами для Flp рекомбиназы по механизму классической инсуляции.

Таблица 1. Изучение влияния количества копий 8и(Нлу) инсулятора на рекомбинацию между И1Т сайтами.

-43—41

w-FRT-out

w-FRT-outASu(Hw)

w-FRT-out Su(Hw) ^Jk_áml i.

w-FRT-oul ASu(Hw) SufHw)'

Ch-

w-FKMi ASu(l Iw)

-4]—D^

№___ Уровень мозаичности Сильный Су-фен. красный белый сумма частота погрешность

3-1 1511 457 1968 23,22 1,87

6-1 red-^rn-v Да 879 204 1083 18,84 2,33

7-1 860 302 1162 25,99 2,52

2-1 242 355 597 59,46 3,94

2-2 red->-s-v нет 131 393 524 75 3,71

12-1 309 306 615 49,76 3,95

2-1 486 32 518 6,18 2,07

2-2 red ->-w-v нет 483 45 528 8,52 2,38

12-1 506 27 533 5,07 1,86

2-1 394 55 449 12,25 3,03

2-2 red H^-m-v да 225 52 277 18,77 4,59

12-1 181 73 254 28,74 5,57

2-1 397 132 529 24,95 3,69

2-2 red->m-v да 204 56 260 21,54 4,99

12-1 185 66 251 26,29 5,45

2-1 454 18 472 3,81 1,73

2-2 red -P-e-v нет 908 27 935 2,89 1,07

12-1 1017 40 1057 3,78 1,15

2 513 26 539 4,82 1,81

3 red ->-w-v нет 628 52 680 7,65 1,99

4 570 72 642 11,21 2,44

5' 879 98 977 10,03 1,88

2 409 7 416 1,68 1,24

3 red-*-w-v нет 488 18 506 3,56 1,61

4 445 5 450 1,11 0,97

5 560 24 584 4,11 1,61

2 407 6 413 1,45 1,15

3 red ->e-v нет 533 37 570 6,49 2,02

4 469 15 484 3,09 1,54

5 658 42 700 6 1,76

Для выяснения роли взаимодействия между рядом расположенных 8и(Н\у) инсуляторов и в регуляции эффективности рекомбинации между Н<Т сайтами было проведено сравнение степени рекомбинации в \v-FRT-in и w-FRT-out трансгснных линиях, которые имеют две копии 8ц(Нуу) инсулятора. В обеих сериях трансгенных линиях присутствие второго инсулятора увеличивало эффективность рекомбинации между РЯТ сайтами по сравнению с производными трансгенными линиями, содержащими один Б^Нуу) инсулятор. Частота рекомбинации возрастала как в половых, так и в соматических клетках. Таким образом, взаимодействие между 8и(Н\у) инсуляторами облегчает рекомбинацию между БЯТ сайтами, находящихся в одной хроматиде. Однако в \v-FRT-out линиях уровень рекомбинации был в несколько раз выше, чем в \v-FRT-in линиях. Нужно отметить, что эта разница не связана с эффектом

положения конструкций в геноме: при инактивации su(Hw) гена в линиях w-FRT-in и w-FRT-out наблюдался одинаковый уровень рекомбинации, который сравним с рекомбинацией в контрольных w-FRT трансгенных линиях. Таким образом, полученные результаты однозначно показывают, что взаимодействие между Su(Hw) инсуляторами определяет эффективность рекомбинации между FRT сайтами.

3.4. Роль белка Mod(mdg4) в регуляции рекомбинации между FRT сайтами Su(Hw) инсулятором.

В ряде недавних работ было показано, что возможность формирования Mod(mdg4)-67.2 мультимерных комплексов является критической для взаимодействия между Su(Hw) инсуляторами (Ghosh et al.2001; Gause et al. 2001; Gerasimova et al. 2000). Для изучения роли Mod(mdg4)-67.2 в модуляции рекомбинации, мы сравнили уровень рекомбинации во всех основных трансгенных линиях на фоне mod(mdg4)"'. Инактивация Mod(mdg4) так же влияла на уровень рекомбинации, как и Su(Hw) белок, однако, в несколько меньшей степени. Этот результат предполагает, что могут существовать так же другие белки, помимо Mod(mdg4), опосредующие взаимодействие между Su(Hw) инсуляторами.

Обсуждение результатов

1. Возможные механизмы превращения Su(Hw) инсулятора в сайленсер в отсутствии функционального белка Mod(mdg4).

В выяснении механизма действия инсуляторов большую роль сыграло определение белков, отвечающих за их функцию. С наиболее хорошо изученным инсулятором дрозофилы, повторяющимся 12 раз сайтом связывания бета Su(Hw), взаимодействуют два белка, Su(Hw) и Mod(mdg4) (Gerasimova and Corees 2001). В отсутствии белка Mod(mdg4) Su(Hw) инсулятор превращается в репрессор, который ингибирует некоторые промоторы (Georgiev and Kozycina 1996; Cai and Levine 1997; Gerasimova et al. 1995). Было предложено две модели механизма репрессии инсулятором Su(Hw) промоторов.

Наиболее хорошо феномен прямой репрессии был описан на примере у2 мутации (Georgiev and Kozycina 1996; Gerasimova et al. 1995). Транскрипция гена yellow регулируется набором тканеспецифи'шых энхансеров и уровень экспрессии можно наблюдать визуально по степени пигментации кутикулы имаго (Geyer and Corees 1987). В у2 мутации мобильный элемент МДГ 4 встроился в регуляторную область гена yellow. В результате энхансеры, ответственные за экспрессию гена в теле и крыльях, оказываются изолированными от его промотора su(Hw) инсулятором. В то же время ген yellow нормально экспрессируется в других зонах кутикулы, так как

соответствующие энхансеры находятся либо непосредственно в зоне промотора, либо в интроне гена, как, например, энхансер, ответственный за экспрессию гена yellow в щетинках. Комбинирование mod(mdg4)Iй' мутации с у2 аллелем приводит к репрессии транскрипции гена yellow в щетинках, что можно объяснить прямым ингибированием промотора гена yellow (Georgiev and Kozycina 1996; Gerasimova et al. 1995). Одновременно с репрессией гена yellow в щетинках наблюдалась сильная вариабельность в пигментации брюшных ссгмснтов самцов: темные пигментные пятна на неокрашенном фоне. Окраска щетинок была тоже вариабельна: одни щетинки были пигментированы, другие - желтые. Аналогичным образом происходит экспрессия генов в районе гетерохроматина или в результате репрессии белками группы Polycomb. На основе мозаичной экспрессии гена yellow в у2 аллеле в комбинации с mod(radg4)ul мутацией было выдвинуто предположение, что в отсутствии белка Mod(mdg4) Su(IIw) компактизует хроматин (Gerasimova et al. 1995). Предполагалось, что в присутствии белка Mod(mdg4) Su(Hw) инсулятор имеет направленное действие и компактизует область только энхансеров, в то время как при инактивации Mod(mdg4) белка Su(Hw) инсулятор превращается в сайленсер, который репрессирует промоторы и энхансеры по механизму компастизации хроматина.

Вторая модель предполагает, что в отсутствии Mod(mdg4) белка Su(Hw) инсулятор непосредственно репрессирует промоторы генов. В пользу этой модели говорит наблюдение, что Su(Hw) инсулятор может ингибировать только некоторые промоторы. Например, Su(Hw) инсулятор не репрессирует промотор гена white на стадии куколки (Георгиев П.Г., неопубликованное наблюдение). Так же было показано (Georgiev and Kozycina 1996), что ингибирование транскрипции гена yellow зависит от наличия С-концевого домена белка Su(Hw). Можно предположить, что Mod(mdg4) связываясь с Su(Hw) белком, маскирует его С-концевой домен, который в присутствие мутации mod(mdg4)ul может негативно влиять на активность транскрипционных факторов, связанных с промотором тепа, yellow.

В настоящем исследовании была предпринята попытка выяснения факторов, влияющих на степень репрессии гена yellow Su(Hw) инсулятором в отсутствии белка Mod(mdg4). В результате было показало, что степень репрессии зависит от положения конструкции в геноме и расстояния между Su(Hw) инсулятором и промотором гена yellow. В отличие от других известных сайленсеров, которые формируют более компактный хроматин, два Su(Hw) инсулятора только незначительно увеличивают степень репрессии. Наконец, дополнительные промоторы гена yellow приводят к значительному уменьшению репрессии транскрипции гена yellow. Следовательно,

инсерция двух дополнительных промоторов гена yellow в область энхансеров, значительно супрессярует негативное действие мутации mod(indg4)ul на транскрипцию гена yellow. Можно предположить, что дополнительные промоторы являются конкурентами промотора гена yellow за сигнал репрессии, индуцированной Su(Hw) инсулятором в присутствии mod(mdg4)ul мутации. Таким образом, полученные результаты наиболее хорошо согласуются с моделью, которая объясняет mod(mdg4)ul-зависимую репрессию как непосредственное взаимодействие между С-концом белка Su(Hw) и базовьми транскрипционными факторами на промоторе.

С позиции образования Su(Hw) инсулятором компактного хроматина в отсутствии белка Mod(mdg4) трудно объяснить многие полученные в данной работе результаты: отсутствие репрессии энхансеров тела и крьитьев в ES(-1868)YW и ES(-1868)YSW трансгенных линиях; супрессии mod(mdg4)u'-3aBHCHMoñ репрессии в присутствии дополнительных копий промотора, отсутствие кооперативного действия двух Su(Hw) инсуляторов в репрессии транскрипции. Неожиданным результатом оказалась зависимость репрессии индуцированной Su(Hw) инсулятором в присутствии mod(mdg4)ul мутации от локализации конструкции в геноме. Возможно, структура окружающего хроматина является определяющей в mod(mdg4)ul-3aBHCHMoñ репрессии транскрипции гена yellow. Дальнейшие исследования необходимы для понимания механизмов, которые определяют высокую степень зависимости репрессии от места инсерции конструкции в геноме (эффект положения).

2. Su(Hw) инсулятор модулирует взаимодеистпия между белками, участвующими в процессе транспозиции Р -элемента.

Впервые белки, которые блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, были охарактеризованы для Su(IIw) инсулятора (Gerasimova and Corees 2001). Инактивация белка Su(Hw) приводит к потере инсуляции. За инсуляцию отвечает домен, расположенный между цинковыми пальцами и С-концевым кислым доменом белка Su(Hw) (Kim et al. 1996; Harrison et al. 1993). В то же время два кислых домена, расположенных на концах белка Su(Hw), не имели большого значения для инсуляции. Другой компонент Su(Hw) инсулятора, белок Mod(mdg4) связывается своим С-концом с доменом белка Su(Hw), который необходим для инсуляции (Gause et al. 2001; Ghosh et al. 2001). На N-конце белка Mod(mdg4) находится так называемый BTB/POZ домен, который отвечает за мультимеризацию белка и, как предполагается, нужен для взаимодействия между несколькими Su(Hw) инсуляторами (Labrador and Corees 2002; Pai and Corees 2002). Мутация mod(mdg4)lul нарушает связывание белка Mod(mdg4) с Su(Hw), что приводит в некоторых случаях к потере способности

блокировать энхансеры. В других случаях белок Мо<1(тс^4) не нужен для инсуляции, что предполагает наличие нескольких факторов, которые связываются с 8и(Н\у) инсулятором и участвуют в блокировании энхансеров.

В настоящем исследовании нами было показано, что инсерция одной или двух копий 8и(Н\у) инсулятора в Р-транспозон в несколько раз снижает частоту его перемещений. Так как для транспозиции Р-элемента необходима ассоциация его концов с образованием тетрамерного комплекса транспозазой, то можно предположить, что Би(Н\у) инсулятор блокирует взаимодействия между белковыми комплексами, связанными с концами Р-элемента. Интересно, что главную, а может и единственную роль в блокировании транспозиций имеет белок Мос1(п^4). Ранее было показано, что дупликация 8и(П\у) инсуляторов между энхансером и промотором ведет к нейтрализации их способности блокировать энхансеры (Мигаууцуа е1 а1. 2001; Са1 е1 а1. 2001). Наиболее вероятно, что локальное взаимодействие между двумя 8и(Нуу) инсуляторами может не блокировать, а наоборот способствовать взаимодействию между энхансером и промотором. Однако, инсерция двух копий 8и(Н\\0 инсулятора между концами Р-элемента имеет такой же негативный эффект на транспозиции как и один Би(Нш) инсулятор. Этот результат можно объяснить специфичностью механизма транспозиций Р-элемента. Транспозиции Р- элемента, которые блокируются 8и(Н\у) инсулятором, происходят на предмеотической стадии в период активной репликации генома. Таким образом, впервые показано, что 8и(Н\у) инсулятор может функционировать на этой стадии развития дрозофилы. Можно предположить, что в период постоянного удвоения ДНК взаимодействия между рядом расположенными 8и(Н\у) инсуляторами имеют другой характер, чем в соматических клетках, когда происходит блокирование энхансеров. Наиболее вероятно, что белок Мо<1(тс1£4) непосредственно взаимодействует с белками транспозазного комплекса, что приводит к инактивации его способности осуществлять транспозиции. Альтернативным объяснением ключевой роли Мо<1(тс1£4) белка в супрессии транспозиций может быть то, что в предмеотических клетках только белок Мос1(п^4) определяет взаимодействие между ЭиЩуу) инсуляторами. Однако, несущественная роль белка Мос1(т(^4) в модилуровании рекомбинации между БЫТ сайтами 8и(Н\у) инсулятором, которая также происходит в премеотических клетках, не согласуется с таким предположением.

3. Взаимодействие между Su(Hw) инсуляторами регулирует рекомбинацию между FRT сайтами в половых н соматических клетка*.

Полученные в работе результаты по рекомбинации между FRT сайтами подтверждают способность Su(Hw) инсулятора регулировать взаимодействия между не транскрипционными белками как в половых так и соматических клетках.

Взаимодействия между Su(Hw) инсуляторами, находящимися в сестринских хроматидах в процессе удвоения ДНК, блокируют неравную рекомбинацию между FRT сайтами. На основании этого результата можно предположить, что взаимодействие между Su(Hw) инсуляторами, расположенных на сестринских хроматидах или гомологичных хромосомах, может играть важную роль в таких процессах как спаривание гомологичных хромосом в процессе мейоза и в соматических клетках.

Ранее на системе ооцитов лягушки было продемонстрировано, что ses и ses' инсуляторы не блокируют рекомбинацию между FRT сайтами (Dunaway et al. 1997). Однако, в этой работе свойства ses и ses' элементов дрозофилы были проанализированы в гетерологичной системе ооцитов лягушки. Также отсутствие влияния на рекомбинацию между FRT сайтами Su(Hw) и ses инсуляторов было продемонстрировано на модельной системе гена white (Partiell and Geyer 2000). В этой работе была исследована рекомбинация между FRT сайтами, находящимися в одной ориентации. В результате рекомбинации между FRT сайтами локализованными в одной хромосоме или неравной рекомбинации между FRT сайтами, расположенными в сестринских хроматидах, должны возникать одинаковые делеции гена white. Таким образом, не возможно различить внутри- и меж- хромосомную рекомбинацию. При локализации FRT сайтов в противоположной ориентации удается различить эти события.

В результате нами было показано, что инсерция одной копии Su(Hw) инсулятора внутри или сбоку от FRT сайтов имеет одинаковый репрессирующий эффект на частоту рекомбинаций между FRT сайтами. Таким образом, одна копия Su(Hw) инсулятора не репрессирует рекомбинацию между FRT сайтами по механизму инсулятора, что согласуется с результатами, полученными в работе Parnell and Geyer 2000. Одним из объяснений репрессии рекомбинации между FRT сайтами на одной хромосоме может быть предположение, что локализация Su(Hw) инсулятора рядом с одним из FRT сайтов усиливает его взаимодействие с FRT сайтом, который находится на сестринской хроматиде. В результате преобладает гомологичная рекомбинация между FRT сайтами, находящимися на сестринских хроматидах. Такие события не могут быть

зафиксированы генетическими методами, так как они не изменяют структуры аллелей и, следовательно, не имеют фенотипического проявления.

Альтернативно, 8и(Н*у) инсулятор может влиять па структуру хроматина в локальной области ближайшего ЖТ сайта, что может изменить эффективность связывания Р1р рекомбиназы с этим сайтом.

В присутствии двух 8и(Н\¥) инсуляторов был получен неожиданный результат. В конструкции, когда между двумя ПСТ сайтами находился только один 8и(Н\у) инсулятор частота рекомбинации была в три раза выше, чем когда два 8и(Н\у) инсулятора находилось между РЯТ сайтами. Данный результат был получен как в половых, так и в соматических клетках. Как ранее было показано, взаимодействие между энхансером и промотором восстанавливалось только в том случае если два 8и(Н\у) инсулятора находились между энхансером и промотором (Мигаууоуа е1 а1. 2001; Са1 е1 а1. 2001). Наиболее вероятно, что транскрипционные комплексы в отличие от И1р рекомбиназы, имеют большие размеры и могут определять взаимодействие между 8и(Н\у) инсуляторами, в результате этого 8и(Н\у) инсуляторы эффективно взаимодействуют только если находятся с внутренней стороны от энхансера и промотора. Напротив, Р1р рекомбипаза не влияет на взаимодействие между 8и(Н\¥) инсуляторами. При этом само взаимодействие может иметь любой направление.

4 В заключение следует отметить, что белок Мос1(тс^4) не имеет определяющего значения в модулировании рекомбинаций между ГШ сайтами. Таким образом, взаимодействие между 8и(Н\у) инсуляторами определяется также другими белками помимо Мос1(тс1£4). Различие в функциональной значимости белка Мос1(тс^4) в случае блокирования транспозиций Р-эяемента и регуляции рекомбинации между БЯТ сайтами, можно объяснить либо тем, что Моё(тё£4) непосредственно взаимодействует с транспозазным комплексом Р-элемента, либо тем, что транспозиции Р-элемента и Ь'1р рекомбинация происходят в основном на разных стадиях клеточного цикла, на которых с 8и(Н\у) инсулятором связываются разные белки. Дальнейшее молекулярно-генетическое исследование необходимо для прояснения этой проблемы.

выводы

1. Показано, что взаимодействие между 8и(Н\у) инсуляторами определяет частоту Р1р-зависимой рекомбинации между РИТ сайтами как в половых так и в соматических клетках. Частота рекомбинации зависит от взаимного расположения 8и(Н\у) инсуляторов и БЯТ сайтов. Белок Мос1(пк^4) не имеет определяющего значения в регуляции взаимодействии между БЯТ сайтами.

2. Продемонстрировано, что взаимодействие между 8и(1-^) инсуляторами, находящимися на сестринских хроматидах, супрессирует негомологичное спаривание в половых и соматических клетках. Инактивация Мос1(тс1£4) только частично иакативирует эту активность 8и(Н\у) инсулятора.

3. Выявлено, что один или два 8и(Н\у) инсулятора, которые расположены между концами Р-элемента, эффективно блокируют транспозиции Р-элемента в половых клетках самцов. Этот эффект полностью определяется белком Мос1(тс1£4).

4. Проведенные исследования показывают, что 8и(Н\у) инсулятор в отсутствии белка Мос1(тс^4) непосредствешю может репрессировать промотор, а не приводит к индукции репрессированного хроматина.

5. Показано, что репрессия, индуцированная 8и(Н\л') инсулятором в отсутствии белка Мос1(п^4) зависит от локализации конструкции в геноме.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Каракозова М.В., Савицкая Е.Е., Паршиков А.Ф., член-корр. РАН Георгиев П.Г. Цис-модификаторы репрессии гена yellow, индуцированной Su(Hw) инсулятором в отсутствие белка Mod(mdg4) у Drosophila melanogaster.J\AR. 2003, 389, PI 10-113. Karakozova M., Savitskaya E., Georgiev P. The (gypsy) insulator modulates transpositions P elements in Drosophila melanogaster. Internation conference "Molecular genetics of eucaryotes", 4-7 февраля 2003, Москва, P.31.

Georgiev P., Savitskaya E., Karakozova M. The Su(Hw) insulator modulates the recombination between FRT sites and transposition P element in Drosophila melanogaster. Sixth International conference on Drosophila heterochromatin. 25-31 мая 2003, Равелло, Италия.

Каракозова М. В., Савицкая Е. Е. Изучение механизмов влияния Su(Hw) на процессы транспозиции и рекомбинации у Drosophila melanogaster. Ill Съезда Биохимического общества. Санкт-Петербург. 2002, 402.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каракозова, Марина Викторовна

Список сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Определение и общие свойства инсуляторов.

2.2. Структура и функции инсуляторов.

2.2.1. Su(Hw)-HHcyjMTop.

2.2.2. Инсуляторы локуса теплового шока hsp70 - ses и scs\

2.2.3. Инсуляторы регуляторной области Abd-B гена.

2.2.4. Куриный р-глобиновый инсулятор.

2.3. Модели действия инсуляторов.

2.3.1. Структурные модели.

2.3.2. Транскрипционные модели.

3. Материалы и методы.

3.1. Генетические методы.

3.1.1. Линии и мутации Drosophila melanogaster, использованные в данной работе.

3.1.2. Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий.

3.1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite в трансгенных линиях.

3.1.4. Генетические скрещивания.

3.2. Биохимические методы.

3.2.1. Выделение ДНК из дрозофилы.

3.2.2. Саузерн-блот-анализ.

3.2.3. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

3.2.4. Секвенирование плазмид и ПЦР-продуктов.

3.2.5. Молекулярное клонирование.

3.2.6. Трансформация бактериальных клеток плазмидами.

3.2.7. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса.

3.2.8. Создание конструкций.

3.3. Статистическая обработка полученных результатов.

3.4. Фотографирование результатов.

4. Результаты.

4.1. Изучение механизма репрессии транскрипции гена yellow Su(Hw) инсулятором в отсутствии белка Mod(mdg4).

4.1.1. Создание модельной системы для исследования факторов, влияющих на степень , репрессии тень yellow Su(Hw) инсулятором в отсутствии белка Mod(mdg4).

4.1.2. Степень репрессии зависит от локализации Su(Hw) инсулятора относительно промотора гена yellow.

• 4.1.3. В отличие от других известных репрессоров, два Su(Hw) инсулятора только незначительно увеличивают степень репрессии гена yellow.

4.1.4. Дополнительные промоторы тена yellow приводят к значительному уменьшению репрессии транскрипции тема, yellow,

4.2. Выяснение влияния Su(Hw) на транспозицию Р-элемента.

4.2.1. Разработка генетической модели для исследования влияния Su(Hw) инсулятора на взаимодействия между белковыми комплексами, обеспечивающих транспозиции Р-элемента.

4.2.2. Su(Hw) инсулятор супрессирует транспозиции Р-элемента.

4.2.3. Белок Mod(mdg4) является ключевым в супрессии транспозиций Р-элемента Su(Hw) инсулятором.

4.2.4. Взаимодействие между двумя копиями Su(Hw) инсулятора не приводят к нейтрализации блокирования транспозиций Р-транспозона.

4.3. Анализ роли взаимодействия между 8и(Нду) инсуляторами в регуляции рекомбинации между сайтами для Б1р рекомбиназы дрожжей.

4.3.1. Создание модельной системы для изучения роли взаимодействия между 8и(Н\у) инсулятором в модулировании частоты рекомбинации между РИ.Т сайтами.

4.3.2. Взаимодействие между 8и(Нлу) инсуляторами блокирует неравную рекомбинацию между БИТ сайтами на сестринских хроматидах.

4.3.3. Взаимодействие между 8и(Н\у) инсуляторами регулирует рекомбинацию между БЯТ сайтами внутри хроматиды.

4.3.4 Роль белка Мос1(тс^4) в регуляции рекомбинации между РЫТ сайтами 8и(Н\у) инсулятором.

5. Обсуждение результатов.

5.1. Возможные механизмы превращения 8и(Ь^)-инсулятора в сайленсер в отсутствии функционального белка Моё(тс

§4).

5.2. 8и(Н\у)-инсулятор модулирует взаимодействие между белками, участвующими в процессе транспозиции Р-элемента.

5.3. Взаимодействие между 8и(1^)-инсуляторами регулирует рекомбинацию между БЯТ-сайтами в половых и соматических клетках.

6. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые свойства Su(Hw) инсулятора: влияние на Flp зависимую рекомбинацию, транспозиции P-элемента и промотор гена yellow у Drosophila melanogaster"

Одной из особенностей регуляции транскрипции высших эукариот является способность энхансеров активировать промотор на расстоянии, достигающем нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов. Несмотря на огромное количество информации о различных уровнях регуляции транскрипции, механизм взаимодействия между энхансером и I промотором на больших дистанциях остается открытым.

В понимании механизмов дальних взаимодействий между регуляторными элементами большую роль могут сыграть инсуляторы. Инсуляторами называются регуляторные элементы, которые блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, если находятся между ними. При этом инсуляторы не влияют непосредственно на активность энхансера и промотора, т.е. промотор может быть активирован любым другим энхансером, а энхансер может активировать любой другой промотор.

В 1991 году были открыты первые два инсулятора дрозофилы, ses и ses', которые окружают ген теплового шока hsp70 дрозофилы. Почти одновременно в регуляторной области ретротранспозона дрозофилы МДГ4 был обнаружен 8и(Н\у) инсулятор.' В настоящее время открыто большое число инсуляторов у разных организмов от дрозофилы до человека, показана универсальность и кооперативность их действия.

Изучение действия инсуляторов представляет интерес как в научном плане — для выяснения принципов организации генома и регуляции экспрессии генов, так и в прикладном плане - для создания векторов, которые способны поддерживать стабильную экспрессию генов вне зависимости от места инсерции в геноме. Важным доказательством необходимости инсуляторов в поддержании транскрипционной автономии служит то, что врожденная форма миотонической дистрофии вызвана потерей функционального ДМ1 инсулятора (БШрроуа е1, а1. 2001), ответственного за предупреждение чрезмерной активации энхансером ДМРК гена. Появление связи между инсуляторами и болезнями людей демонстрирует важность для понимания механизмов инсуляторного взаимодействия.

В настоящем исследовании продолжено изучение свойств 8и(Нш) инсулятора. В результате было показано, что 8и(Нлу) инсулятор может регулировать взаимодействия между белковыми комплексами, участвующими в транспозиции мобильных элементов, а также оказывать влияние на рекомбинацию. Получены экспериментальные данные подтверждающие модель, по которой 8и(Нлу) инсулятор способен непосредственно ингибировать некоторые промоторы в отсутствии белка Мос1(тс1§4).

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ИНСУЛЯТОРЫ - НОВЫЕ РЕГУЛЯТОРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ВЫСШИХ

ЭУКАРИОТ

Энхансерами принято называть последовательности ДНК, которые способны активировать транскрипцию независимо от ориентации и расстояния до точки начала транскрипции. Ярким примером может служить энхансер wing margin локуса cut дрозофилы, который активирует транскрипцию находясь на расстоянии 85 т.п.н. от промотора (Jack et al. 1991) . Несмотря на то, что к настоящему времени описано большое количество энхансеров и промоторов, остается много вопросов относительно механизмов их взаимодействия. В частности неизвестно, каким образом белки, связывающиеся с энхансером, взаимодействуют с транскрипционным комплексом, собранным на промоторе, минуя большие расстояния, и каким образом происходит взаимодействие между «правильными» энхансером и промотором. Многие из существующих экспериментальных данных косвенно согласуются с тем, что белки, связанные с энхансером, непосредственно взаимодействуют с белками основного транскрипционного комплекса или вспомогательными белками, собранными на промоторе, при этом ДНК между ними образует петлю (Blackwood and Kadonaga 1998). Существуют также другие модели взаимодействия между энхансером и промотором. Например, одна из моделей предполагает существование белков посредников, которые способны кооперативно взаимодействовать между собой, а также с большим количеством сайтов на ДНК, что приводит к притягиванию, собранных на энхансере и промоторе белковых комплексов друг к другу (Dorsett 1999).

В понимании механизмов дальних взаимодействий между регуляторными элементами большую роль могут сыграть инсуляторы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Каракозова, Марина Викторовна

выводы

1. Показано, что взаимодействие между 8и(Н\у) инсуляторами определяет частоту Независимой рекомбинации между И1Т сайтами как в половых так и в соматических клетках. Частота рекомбинации зависит от взаимного расположения 8и(Н\у) инсуляторов и БЯТ сайтов. Белок Мос1(тс1§4) не имеет определяющего значения в регуляции взаимодействии между БЯТ сайтами.

2. Продемонстрировано, что взаимодействие между 8и(Н\у) инсуляторами, находящимися на сестринских хроматидах, супрессирует негомологичное спаривание в половых и соматических клетках. Инактивация Мос1(шё§4) только частично иакативирует эту активность 8и(Н\у) инсулятора.

4. Проведенные исследования показывают, что 8и(Н\у) инсулятор в отсутствии белка Мос1(п^4) непосредственно может репрессировать промотор, а не приводит к индукции репрессированного хроматина.

5. Показано, что репрессия, индуцированная 8и(Н\у) инсулятором в отсутствии белка I

Мо<1(тс1§4) зависит от локализации конструкции в геноме.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каракозова, Марина Викторовна, Москва

1. Глазков М.В. Границы структурно-функциональных единиц транскрипции (доменов) в хромосомах эукариот//Генетика. 1998. Т. 34. С. 593-604.

2. Ahmad К and Golic С. The transmission of fragmented chromosomes in Drosophila melanogaster. Genetics. 1998 V148(2), P.775-92.

3. Barges S., Mihaly J., Galloni M. et al. The Fab-8 boundary defines the distal limit of the bithorax complex iab-1 domain and insulated iab-1 from initiation elements and a PRE in the adjacent iab-8 domain // Development. 2000. V. 127 P.779-790.

4. Bell A. C., West A. G., Felsenfeld G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators // Cell. 1999. V. 98. P. 387-396.

5. Bell A.C., Felsenfeld G. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Ig/2 gene // Nature. 2000. V.405. P.482-485.

6. Bell A., West G., Felsenfeld G. Insulators and boundaries: versatile regulatory elements in the eukaryotic genome // Science. 2001. V.291. P.447-450.

7. Bi X., Broach J. Chromosomal boundaries in S. cerevisiae II Curr. Opin. Gen. Dev. 2001. V. 11. P. 199-204.

8. Bi X., Broach J. UAS rpg can function as a heterochromatin boundary element in yeast // Genes Dev. 1999. V. 13. P.1089-1101.

9. Blackwood E.M., Kagonaga I.T. Going the distance: a current view of enhancer action. Since. 1998. 281 (5373). P.61-63.

10. Breiling A., Bonte S., Ferrari P. et al. The Drosophila polycomb protein interacts with nucleosomal core particles in vitro via its repression domain // Mol. Cell. Biol. 1999. V.19. P.8451-8460.

11. Buchner K., Roth P., Schotta G., Krauss V., Saumweber H., Reuter G., Dorn R. Genetic and4molecular complexity of the position effect variegation modifier mod(mdg4) in Drosophila II Genetics. 2000. V.155. P.141-157.

12. Cai H., Levine M. Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo // Nature. 1995. V. 376. P. 533-536.

13. Cai H., Levine M. The gypsy insulator can function as a promoter-specific silencer in the Drosophila embrio IIEMBO J. 1997. V.16. P. 1732-1741.

14. Cai H., Shen P. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity // Science. 2001. V.291. P.293-295.

15. Chiang J., Whitely M., Felsenfeld G. A 5' element of the chicken (J-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila II Cell. 1993. V. 74. P. 505-514.

16. Chung J., Bell A., Felsenfeld G. Characterization of the chicken beta-globin insulator // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997 V.94. P.575-580.

17. Cuvier O., Hart C., Laemmli U. Identification of a class of chromatin boundary elements // Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P. 7478-7486.

18. Dunaway M., Hwang J., Xiong M., Yuen H. The activity of the scs and scs' insulator elements is not dependent on chromosomal context// Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P. 182-189.

19. Donze D., Adams C.R., Rine J. et al. The boundaries of the silenced HMR domain in Saccharomyces cerevisiae II Genes Dev. 1999. V. 13. P.698-708.

20. Dorsett D. Distant liaisons: long range enhancer-promoter interactions in Drosophila I I Curr. Opin.Genet. Dev. 1999. V. 9. P. 505-514.

21. Farkas G., Leibovitch B., Elgin S. Chromatin organization and transcriptional control of gene expression in Drosophila II Gene. 2000. V.253.P.l 17-136.

22. Georgiev P., Kozycina M Interaction between mutations in the suppressor of Hairy wing andmodifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gypjy-induced mutations // Genetics. 1996. V. 142. P. 425-436.

23. Georgiev P., Corces V. The Su(Hw) protein bound to gypsy sequences in one chromosome can repress enhancer-promoter interactions in the paired gene located in the other homolog // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V.92. P.5184-5188.

24. Gerasimova T., Corces V. Polycomb and Trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator // Cell. 1998. V. 92. P.511-521.

25. Gerasimova, T. I, and Corces, V. G. 2001. Chromatin insulators and boundaries: effects on transcription and nuclear organization. Annu. Rev. Genet. 35, P. 193-208.

26. Gerasimova T., Gdula D., Gerasimov D., Simonova O., Corces V. A Drosophila protein that impacts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation // Cell. 1995. V. 82. P.587-597.

27. Gerasimova T., Byrd K., Corces V. A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA // Mol.Cell. 2000. V.6. P.1025-1035.

28. Geyer P. The role of insulator elements in defining domains of gene expression // Curr. Opin. Genet Dev. 1997. V. 7. P. 242-248.

29. Geyer P., Corces V. DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila, zinc finger protein // Genes Dev. 1992. V.6. P. 1865-1873.

30. Geyer P., Corces V. Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster II Genes Dev. 1987. V. 1. P.996-1004.

31. Gdula D., Corces V. Characterization of functional domains of the Su(Hw) protein that mediate the silencing effect oimod(mdg4) mutations // Genetics. 1997. V.145. P.153-161.

32. Ghosh D., Gerasimova T., Corces V. Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function // EMBO J. 2001. V.20. P.2518-2527.

33. Golic K., Lindquist S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome // Cell. 1989. V.59. P.499-509.

34. Gorczyca M., Popova X., Budnik V. The gene mod(mdg4) affects synapse specificity and structure in Drosophila II J.Neurobiol. 1999. V.39. P.447-460.

35. Hagstrom K., Muller M., Schedl P. Fab-7 functions as a chromatin domain boundary to ensure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex // Genes Dev. 1996. V.10. P.3202-3215.

36. Hark A., Schoenherr C., Katz D. et al. CTCF mediates methilation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus //Nature. 2000. V.405. P.486-489.m

37. Harrison D., Gdula D., Coyne R., Corces V. A leucine zipper domain of the suppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on enhancer function // Genes Dev. 1993.'V.7. P. 1966-1978.

38. Hart C., Zhao K., Laemmli U. The scs' boundary element: characterization of boundary element-assaciated factors // Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P.999-1009.

39. Holdridge C., Dorsett D. Repression of hsp70 heat shock gene transcription by the suppressor of Hairy-wing protein of Drosophila melanogaster // Mol. Cell. Biol. 1991. V.l 1. P. 1894-1900.

40. Jack J., Dorsett D., DeLotto Y. et al. Expression of the cut locus in the Drosophila wing margin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer // Development. 1991. V.l 13. P.735-747.

41. Kares R., Rubin G. Analysis of P transposable element functions in Drosophila II Cell. 1984. V.38. P.135-146.

42. Kellum R., Schedl P. A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomaldomains II Cell. 1991. V. 64. P.941-950.

43. Kellum R., Schedl P. A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay II Mol. CeL BioL 1992. V. 12. P. 2424-2431.

44. Kim J., Shen B., Rosen C., Dorsett D. The DNA-binding and enhancer-blocking domains of the

45. Drosophila suppressor of Hairy-wing protein // MoL Cell. Biol. 1996. V. 16. P.3381-3392.

46. Krebs J. E., Dunaway M. Insulator elements impart a cis requirement on enhancer-promoter interactions // Mol. Cell. 1998. V. 1. P. 301-308.

47. Labrador M., Corces V.G. Setting the boundaries of chromatin domains and nuclear organization. Cell. 2002; 111(2) P.151-154.

48. Lu L., Tower J. A transcriptional insulator element, the su(Hw) binding site, protects a chromosomal DNA replication origin from position effects // Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P.2202-2206.

49. Lindsley D., Zimm G. The genome of Drosophila melanogaster. Academic Press, New York. // 1992.

50. Mallin D., Myung J., Patton J. et al. Polycomb group gene repression is blocked by the Drosophila suppressor of Hairy-wing Su(Hw. insulator//Genetics. 1998. V.148. P.331-339.

51. Mazo A., Mizrokhi L., Karavanov A. et al. Suppression in Drosophila-. su(Hw) and su(f) gene products interact with a region of mdg4 (gypsy) regulating its transcriptional activity // EMBO J. 1989. V.8.P.903-911.

52. Mihaly J., Hogga I., Barges S., Gallon M., Mishra R., Hagstrom K., Muller M., Schedl P., Sipos L., Gausz J., Gyurkovics H., Karch F. Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex // Cell. Mol. Life Sci. 1998. V. 54. P. 60-70.

53. Mongelard F., Corces V. Two insulators are not better than one // Nat. Struct, biol. 2001- V.8. P.192-194.

54. Mongelard F., Labrador M., Baxter E.M., Gerasimova T.I., Corces V. Trans-splising as a novel meshanism to explain interallelic complementation in Drosophila. Genetics. 2002. 160. 4. P. 14811487.

55. Morcillo P., Rosen C., Baylies M., Dorsett D. Chip, a widely expressed chromosomal protein required for segmentation and activity of a remote wing margin enhancer in Drosophila II Genes Dev. 1997. V.ll. P.2729-2740.

56. Morcillo P., Rosen C., Dorsett D. Genes regulating the remote wing margin enhancer in the Drosophila cut locus // Genetics. 1996. V.144. P.l 143-1154.

57. Muller M., Hangstrom K., Gyurkovics H., Pirrotta V., Schedl P. The Mcp element from the Drosophila melanogaster bithorax complex mediates long-distance regulatory interactions // Genetics. 1999. V.153. P.1333-1356.

58. Muravyova, E., Golovnin, A., Gracheva, E., Parshikov, P., Belenkaya, T., Pirrotta, V. and Georgiev, P. (2001). Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. Science 291, 495-497.

59. Nabirochkin S., Ossokina M., Heidmann T. A nuclear matrix/scaffold attachment region co-localizes with the gypsy retrotransposon insulator sequence // J.Biol.Chem. 1998. V.273. P.2473-2479.

60. Pai C.Y., Corces V.G., The nuclear pore complex and chromatin boundaries. Trends Cell Biol. 2002 10 P.452-455.

61. Palla F., Melfi R., Anello L., Di Bernardo M., Spinelli G. Enhancer blocking activity located near the 3* end of the sea urchin early H2A histone gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P.2272-2277.

62. Parnell T., Geyer P. Differences in insulator properties revealed by enhancer blocking assays on episomes // EMBO J. 2000. V.19. P.5864-5874.

63. Pikaart M., Recillas-targa F., Felsenfeld G. Loss of transcriptional activity of a transgene is accompanied by DNA methilation and histone deacetylation and is prevented by insulators // Genes Dev. 1998. V.12. P.2852-2862.

64. Pirrotta V. Polycomb silencing and the maintenance of stable chromatin states // Results Probl. Cell Differ. 1999. V.25. P.205-228.

65. Pirrotta V. PcG complexes and chromatin silencing //Curr.Opin.Gen.Dev. 1997. V.7. P.249-258.

66. Recillas-Targa F., Bell A., Felsenfeld G. Positional enhancer-blocking activity of the chicken Piglobin insulator in transiently transfected cells // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1999. V.96. P.14354-14359.

67. Rollins S., Morsillo P., Dorsett D. Nipped-B, a Drosophila homologue of chromosomal adherins, participates in activation by remote enhancers in the cut and Ultrabithorax genes // Genetics. 1999. V.152. P.577-593.

68. Roseman R, Pirrotta V., Geyer P. The Su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects //EMBO J. 1993. V. 12. P.435-442.

69. Rubin G., Sprandling A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors // Science. 1982. V.218. P.348-353.

70. Sanger F., Nicken S., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V.74. P.5463-5487.t

71. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual, Ed.2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY // 1989.

72. Scott K., Geyer P. Effects of the Su(Hw) insulator protein on the expression of the divergently transcribed Drosophila yolk protein genes // EMBO J. 1995. V.14. P.6258-6279.

73. Scott K., Taubman A., Geyer P. Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength // Genetics. 1999. V.153. P.787-798.

74. Shao Z., Raible R., Mollaaghababa R. et al. Stabilization of chromatin structure by PRC1, a polycomb complex // Cell. 1999. V.98. P.37-46.

75. Sigrist C., Pirrotta V. Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by the Drosophila Polycomb Response Element (PRE) but allow trans interactions between PREs on different chromosomes // Genetics. 1997. V.147. P.209-221.

76. Smith P., Corces V. The suppressor of Hairy-wing binding region is required for gypsy mutagenesis // Mol.Gen.Genet. 1992. V.233. P.65-70.

77. Spana C., Harrison D., Corces V. The Drosophila melanogaster supressor of Hairy wing protein binds to specific sequences of the gypsy retrotransposon // Genes Dev. 1988. V.2. P.1414-1423.

78. Spana C., Corces V. DNA bending is a determinant of binding specificity for a Drosophila zink finger protein // Genes Dev. 1990. V.4. P.1505-1515.

79. Sun F.-L., Elgin S. Putting boundaries on silence // Cell. 1999. V.99. P.459-462.

80. Newsome T.P., Asling B., Dickson B.J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guiidance in eye-specific mosaics. Development 2000.127. P.851-860.

81. Udvardy A., Maine E., Schedl P. The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains // J. Mol. Biol. 1985. V.185. P.341-358.

82. Vazquez J., Schedl P. Deletion of an insulator element by the mutation facet-strawberry in Drosophila melanogaster II Genetics. 2000. V.155. P.1297-1311.

83. Webber A., Ingram R., Levorse J. et al. Location of enhancers is essential for imprinting of HI9 and Igf2 II Nature. 1998. V.391. P.711-715.

84. West, A.G., Gaszner, M. and Felsenfeld, G. (2002). Insulators: many functions, many mechanisms. Genes Dev. 16,271-288.

85. Zhao K., Hart C. M, Laemmli U. Visualization of chromosomal domains with boundary element-associated factor BEAF-32 // Cell. 1995. V. 81. P. 879-889.

86. Zhong X., Krangel M. An enhancer-blocking element between alpha and delta gene segments within the human T cell receptor alpha/delta locus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P.5219-5224.

87. Zhou J., Barolo S., Szymanski P. et al. The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo // Genes Dev. 1996. V.10. P.3195-3201.

88. Zhou J., Levine M. A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activityin the Drosophila embryo II Cell. 1999. V. 99. P.567-575.1. Благодарности

89. Автор благодарит своего научного руководителя чл.-корр. РАН., д.б.н., профессора

90. П.Г. Георгиева за предложенную тему диссертации, помощь в проведении экспериментов и ценные замечания по работе.

91. Автор выражает искреннюю благодарность всему коллективу лаборатории регуляции4генетических процессов за моральную поддержку и за проявленный к работе интерес.

Информация о работе

Каракозова, Марина Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.26

Диссертация

Новые свойства Su(Hw) инсулятора: влияние на Flp зависимую рекомбинацию, транспозиции P-элемента и промотор гена yellow у Drosophila melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы