Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия между регуляторными элементами генома у Drosophila melanogaster в модельных системах генов yellow и white

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия между регуляторными элементами генома у Drosophila melanogaster в модельных системах генов yellow и white"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

На правах рукописи

померанцева екатерина алексеевна « изучение взаимодействия между регуляторными элементами

генома у Drosophila melanogaster в модельных системах генов

yellow и white »

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Института биологии гена Российской академии наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Мельникова Л.С. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Крамеров Д.А. доктор биологических наук, профессор Глазков М.В.

Ведущая организация: Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Защита диссертации состоится 21 декабря 2006 года в 12 час. на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан ■/ У и? 2006 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

канд.фарм.наук

Общая характеристика работы ,

Актуальность проблемы. Перемещение мобильных элементов - транспозонов играет важную роль в обеспечении генотипического разнообразия у эукариот. В настоящее время подробно изучены транспозоны, обнаруженные в геноме плодовой мушки Drosophila melanogaster. Более половины спонтанных мутаций, возникающих в геноме дрозофилы, вызваны встраиванием транспозона в тот или иной ген. Наиболее исследованным мобильным элементом у Drosophila melanogaster является Р элемент, который имеет на концах короткие инвертированные повторы. Ранее в нашей лаборатории были открыты супернестабильные мутации, которые возникали с высокой частотой в результате мобилизации активности Р элемента. Бьио показано, что такие мутации вызваны химерным элементом, состоящим из уникальных участков генома, окруженных делегированными копиями Р элемента. Мобилизация активности Р элемента приводила к инверсиям последовательности между Р элементами, увеличению или уменьшению фрагментов генома, входящих в состав химерных элементов. При этом внутренние части химерного элемента, содержащие регуляторные последовательности, могли влиять на экспрессию рядом расположенного гена, что приводило к проявлению мутантного фенотипа. Таким образом, химерные элементы способны, играть значительную роль в эволюции регуляторных последовательностей, участвуя в создании наиболее эффективно действующей регуляторной системы для конкретного гена. В представленной работе было продолжено изучение механизмов возникновения и распространения химерных элементов. Кроме того, химерные элементы были использованы для выявления новых регуляторных последовательностей и изучения взаимодействия между ними.

Также, в работе было продолжено исследование наиболее изученного инсулятора дрозофилы, состоящего из 12 сайтов связывания для белка Su(Hw). Известно, что одна копия Su(Hw) инсулятора в составе трансгенной конструкции полностью блокирует взаимодействие между энхансерами тела и крыльев и промотором гена yellow, . если находится между ними. Ранее в нашей лаборатории было показано, что две копии Su(Hw) инсулятора, расположенные между энхансером и промотором, не могут блокировать их взаимодействие. В представленной работе с помощью модельной системы гена yellow Drosophila melanogaster было доказано, что Su(Hw) инсуляторы не формируют независимых транскрипционных доменов, а степень инсуляции зависит от расстояния между ними.

Цели и задачи исследования. Основными целями данного исследования являлись:

(1) изучение регуляторных элементов, входящих в состав химерных элементов;

(2) изучение зависимости взаимодействия между регуляторными элементами от их взаимного расположения и расстояния между ними.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить механизмы возникновения химерных мобильных элементов, состоящих из Р элементов и уникальных фрагментов генома и механизмы их транспозиций. . •

2. Исследовать влияние перемещения химерных элементов из одного локуса в другой на регуляцию генной экспрессии.

3. Исследовать свойства регуляторных элементов, входящих в состав химерных элементов.

4. Выяснить, как расстояние между двумя Su(Hw) инсуляторами, окружающими энхансеры, влияет на их способность блокировать взаимодействие между энхансерами и изолированным промотором гена yellow Drosophila melanogaster.

Научная новизна и практическое значение работы. В представленной работе были подробно изучены механизмы образования и транспозиции химерных мобильных элементов. Было показано, что химерные элементы могут включать в свой состав как инсуляторы, так и энхансеры, которые регулируют активность рядом расположенных генов. В составе изученного химерного элемента были обнаружены энхансер и промотор для гена CG3777 дрозофилы. Было показано, что регуляторный элемент размером 325 п.н., включающий промотор гена CG3777, является специфичным инсулятором для гена yellow. Также впервые были получены данные о функциональном взаимодействии между промоторами: продемонстрирована способность промоторов генов yellow и CG3777 взаимодействовать на сверхбольших дистанциях. Кроме того, было продемонстрировано, что расстояние между Su(Hw) инсуляторами, окружающими энхансеры гена yellow, является фактором, влияющим на инсуляцию в данной модельной системе. Энхансеры, окруженные Su(Hw) инсуляторами, расположенными на большом расстоянии, сохраняют способность взаимодействовать с изолированным промотором. Таким образом, впервые доказано, что взаимодействие между Su(Hw) инсуляторами не приводит к созданию независимых транскрипционных доменов.

В настоящее время мобильные элементы и инсуляторы находят все большее

применение при создании генно-инженерных конструкций. Зависимость свойств регуляторного элемента от геномного окружения и способность различных регуляторных элементов взаимодействовать на больших дистанциях должны приниматься во внимание при использовании трансгенов, содержащих регуляторные элементы, в генотерапии, а также при проведении экспериментов по эктопической интеграции генетического материала в геномы различных организмов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции Advances in Molecular Cell Biology (Москва, 2004), на XVIII зимней молодежной научной школе (Москва, 2006), на 46 и 47 Ежегодных конференциях по исследованиям на дрозофиле (Сан-Диего, США, 2005 и Хьюстон, США, 2006), на 10-ой школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2006) и на межлабораторном семинаре ИБГ РАН (2005).

Публикации. По теме диссертации опубликованы две научные статьи и тезисы, представленные на пяти конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 105 страницах, включает 8 рисунков и сводную таблицу полученных результатов, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 134 источника.

Результаты исследования

1. Изучение новых регуляторных элементов из 1А района X хромосомы Drosophila melanogaster.

1.1 Обнаружение новых регуляторных элементов при помощи Р элемент-зависимой генетической нестабильности. Ранее, при индукции Р-М гибридного дисгенеза, в нашей лаборатории были получены и охарактеризованы на молекулярном уровне супернестабильные мутации в локусе yellow (Georgiev et al. 1992). У Drosophila melanogaster ген yellow необходим для пигментации кутикулы и ее производных (Nash and Yarkin 1974). Его экспрессия, в зависимости от типа ткани и стадии развития, регулируется пятью энхансерами (Geyer and Corees 1987). Выявленные супернестабильные мутации были вызваны инсерциями химерных элементов в положение -69 п.н. (здесь и далее, в т.ч. на рисунках, нумерация в локусе yellow идет от сайта инициации транскрипции гена). Химерные элементы содержали разноразмерные последовательности

геномной ДНК, гомологичные различным участкам X хромосомы и окруженные частично делегированными Р элементами (Georgiev et al. 1997).

Для исследования механизмов влияния химерного элемента на экспрессию расположенного рядом гена yellow был выбран супернестабильный аллель у(рис 1 А), который был получен в результате индукции гибридного дисгенеза в линии, содержащей мутацию у2. В аллеле у2 между промотором и энхансерами тела и крыльев гена yellow находится ретротранспозон МДГ4 (gypsy) (Geyer et al. 1986). Инсулятор Su(Hw), расположенный в регуляторной области МДГ4, блокирует активацию гена yellow только энхансерами тела и крыльев (ЭнТ и ЭнК), а энхансер щетинок (ЭнЩ), расположенный в интроне, сохраняет способность стимулировать транскрипцию в щетинках. Мутация у** была вызвана внедрением химерного элемента размером 5.4 т.п.н. в положение -69 п.н. и одновременной делецией yellow последовательностей между -146 и -70 п.н. Химерный элемент состоит из Р элементов (/Ч и Р2), размером 1.2 т.п.н. каждый, расположенных «хвост к хвосту», и заключенной между ними последовательности ДНК длиной 3030 п.н. (рис. 1А). Эта последовательность является дупликацией 1А района X хромосомы, расположенного дистальнее локуса yellow. При изучении производных аплеля у*5 в 1А районе Х-хромосомы были найдены новые регуляторные элементы 1A-RE и Eni А.

Рис 1. Схематичное изображение локуса yellow и структуры аллелей у", у2' и у2'3. В гене yellow черными прямоугольниками обозначены экзоны, белым — интрон, энхансеры - кружками. Треугольниками показаны инссрции мобильных элементов. Черными стрелками обозначены Р элементы. Внутренняя часть химерных элементов показана серым прямоугольником, дополнительная последовательность в у2" и у2'2 — белым прямоугольником. Сайты рестриктаз обозначены вертикальными штрихами с символами: R, £coRI; X, XhcA; S, Sail; P, PsiV, H, HindlU. Прочие пояснения в тексте.

1.2 Структура и свойства нового энхансера EnlA и? 1А района X хромосомы Drosophila melanogaster. Мухи, несущие аллель у*', * имеют темную окраску. Следовательно, при перемещении врегуляторную часть гена yellow участка ДНК * из 1А района X хромосомы активируется экспрессия гена в теле и крыльях, несмотря на то, что соответствующие энхансеры заблокированы инсулятором Su(Hw). При помощи трансгенных конструкций (рис. 2) в перемещенной последовательности ДНК был локализован генетический элемент, названный нами энхансер 1A (Eni А).

у yellow , х

<«_^ Г I (З^1 " —1

PslhPiull

Д11 £<-oRI-Psü

ПЗ

* гг/'/м* white

tv 1($зп~ [Г I

....■vrW/nH' . ч. white

•1« ..... ф I:: II аэ-аб

Рис 2. Схемы конструкций, созданных для картирования и исследования свойств EnlA энхансера. Стрелками показано направление транскрипции генов yellow и white. Серыми прямоугольниками обозначены экзоны, белым — интрон и кружком - энхансер щетинок. Вертикальными штрихами обозначены позиции фрагментов EnlA, цифры под ними нумеруют нуклеотиды относительно старта транскрипции гена yellow. Название фрагментов En] А совпадает с названиями конструкций и написано рядом. Фигурные скобки обозначают сайты распознавания рекомбиназ.

Сначала для проверки способности стимулировать экспрессию yellow в составе трансгенной конструкции были выбраны два рестриктных фрагмента: EcoR l-Pstl длиной 771 п.н. и Pstl-PvuU длиной 1748 п.н., перекрывающие вместе большую часть дупликации из 1А района (рис. 6). Эти фрагменты были помещены перед геном, лишенным энхансеров тела и крыльев. Изучались трансгенные линии, содержащие в геноме одну копию конструкции. В линиях, содержащих конструкцию «EcoRl-Pstl», в 19 случаях из 20 мухи имели неокрашенные тело и крылья. Фенотип мух, несущих конструкцию «Pstl-Pvull», был близок к дикому типу в 23 из 31 полученной линии, что доказывает способность этого фрагмента функционально заменять энхансеры гена yellow. Следовательно, в пределах рестриктного фрагмента />i-rI-Pv«II находится энхансер транскрипции, который получил название EnlA.

Для точной локализации Eni А был создан ряд генетических конструкций, которые содержали различные фрагменты химерного элемента в том же положении, что и в конструкции «Pstl-Pvull». Фрагмент длиной 1681 п.н. - от сайта рестриктазы HindlU внутри химерного элемента до сайта рестриктазы HindlU в Р элементе из аллеля у*' -оказался лишен энхансерных свойств: в 10 из 10 полученных линий, трансгенных по конструкции <<Hindlll~y*'», тело и крылья у мух были неокрашены. Вследствие этого был сделан вывод, что Eni А должен находиться между сайтами Pstl и Hindlll.

При помощи компьютерного анализа в этом районе был проведен поиск потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов. В результате был выделен фрагмент размером 362 п.н., включающий вырожденные консенсусы для связывания белков. Этот фрагмент был получен при помощи ПЦР с использованием праймеров а5 и аб (рис. 6) и вставлен в положение -343 п.н. перед промотором гена yellow. Фрагмент был окружен сайтами для Сге рекомбиназы (1ох сайты), позволяющими вырезать исследуемый элемент in vivo (Siegal and Hartl 2000). Для создания конструкции «En а5-а6» была использована кДНК гена yellow, которая не содержала энхансеров тела, крыльев и щетинок. Было получено 17 трансгенных линий. Во всех линиях мухи имели желтую окраску тела и крыльев, но щетинки были темными, несмотря на отсутствие энхансера щетинок. При вырезании последовательности, заключенной между 1ох сайтами, в 12 линиях из 15 пигментация щетинок исчезала. Таким образом, стимуляция экспрессии гена в щетинках связана с фрагментом а5-аб.

На основании полученных результатов мы предположили, что энхансер Eni А имеет неоднородную структуру. Одна часть, размером 365 п.н., получившая название «коммуникаторной», сама по себе стимулирует экспрессию гена yellow только в щетинках, однако она необходима для стимуляции . полноразмерным энхансером экспрессии yellow в теле и крыльях. Другая часть размером 1383 п.н. сама по себе не влияет на экспрессию гена yellow, но в комбинации с коммуникаторной частью индуцирует высокий уровень экспрессии в теле и крыльях. Возможно, в этой части содержатся сайты связывания для активаторов транскрипции тека yellow в теле и крыльях, поэтому она была названа «активаторной». Полный EnlA, размером 1748 п.н., активирует транскрипцию гена yellow во всех кутикулярных структурах.

1.3 Исследование регуляторного элемента 1A-RE и] 1А района X хромосомы Drosophila melanogaster. Новый регуляторный элемент 1A-RE был обнаружен в ходе дальнейшей работы с аллелем у*'. В результате активации гибридного дисгенеза были получены производные этого аллеля - у2*' и y2iJ (рис. 1Б). Структура производных аллелей была изучена с помощью молекулярных методов исследования (анализ продуктов ПЦР и секвенирование ДНК). Выяснилось, что появление новых аллелей у2'' и у2*2 вызвано увеличением последовательности ДНК из 1А района X хромосомы, входящей в состав химерного элемента, на 126 и 570 п.н. соответственно. Фенотипическое проявление этих аллелей такое же как в аллеле у2 ( неокрашенные тело и крылья, темные щетинки). Следовательно, активность энхансера EnlA, входящего в состав химерных элементов в производных у2'1 и у2'2, заблокирована. Было сделано предположение, что de novo дуплицированный фрагмент из района 1А содержит регулятор экспрессии yellow. Предполагаемый регуляторный элемент был назван 1A-RE, (Regulatory Element from 1А region). Его влияние на экспрессию гена yellow изучалось при помощи экспериментов с трансгенными линиями дрозофилы.

В первую очередь, изучалась инсуляторная активность 1A-RE элемента. В трансгенных конструкциях фрагмент EcoRI-ftfl длиной 594 п.н., предположительно содержащий 1A-RE (рис. 6), помещали в различное положение относительно энхансеров и промотора гена yellow. В двух первых конструкциях исследуемый фрагмент находился между промотором и энхансерами тела и крыльев гена yellow в положениях -893 п.н, и -343 п.н. (рис. 3). Было получено 6 линий, трансгенных по конструкции «-343 1A-RE», и 9 линий, трансгенных по конструкции «-893 1A-RE» (4 в прямой и 5 в обратной ориентации относительно нативного положения фрагмента EcoRI-fsfl). В большинстве полученных линий - 6 из 6 для конструкции «-343 1A-RE» и 3 + 4 из 9 для конструкции «-893 IA-RE» - пигментация тела и крыльев были значительно снижены, что предполагает частичную инактивацию энхансеров. Однако в конструкциях, где фрагмент 1A-RE находился в положениях -2207 п.н. и +797 п.н., окраска тела и крыльев у мух практически соответствовали дикому типу. Следовательно, фрагмент 1A-RE проявляет свойства инсулятора, если располагается между энхансерами тела и крыльев и промотором гена yellow, независимо от ориентации. Окраска щетинок оставалось темной во всех трансгенных линиях. Возможно, фрагмент 1A-RE не способен блокировать активность энхансера щетинок или же 1A-RE способен стимулировать экспрессию yellow в щетинках.

Следующей задачей являлось уточнение локализации инсулятора внутри фрагмента EcoR\-Pstl. Сначала была исследована инсуляторная способность субфрагмента Sall-Pstl размером 206 п.н. (рис. 6) в положении -893 п.н. (рис. 3). Но 13 из 16 линий, трансгенных по конструкции *Saü-Pstl», имели интенсивно окрашенные тело и крылья. Следовательно, фрагмент Sall-Pstl не обладает способностью блокировать энхансеры тела и крыльев гена yellow. Далее был исследован участок длиной 325 п.н., расположенный между праймерами а7-а8 и содержащий сайт Sail (рис. 6). В конструкции «1A-RE 325» (рис. 3) этот фрагмент был помещен в положение -893 п.н. в окружении 1ох сайтов, обеспечивающих возможность его вырезания in vivo. Для проверки специфичности инсуляторного действия 1A-RE в той же конструкции энхансер глаз ЭнГ, контролирующий экспрессию гена white в глазах (Qian el al. 1992), был вставлен между ЭнТ и ЭнК. Чтобы обеспечить возможность вырезания, ЭнГ был окружен сайтами FRT, которые распознаются рекомбиназой Flp (Golic and Lindquist 1989). Как и в случае с фрагментом ¿fcoRI-As/I, пигментация тела и крыльев в линиях, несущих конструкцию «1A-RE 325», была резко снижена. Удаление фрагмента 1A-RE 325 усиливало пигментацию в 14 из 15 трансгенных линий, из чего можно сделать вывод, что фрагмент 325 п.н. содержит функциональный 1A-RE инсулятор.

тт

■пт -км .J« [' :> 1 ............ 11 о»

i-»""1""_ г»"

ГГЩ^шП—UZZ

)

(' —<> 1 ФртмгНА-RE PrttírelU Ь Pwj ФрйПюнг Snil-Pitl

j ии.- j ¡Д-Я£ ДЗЧ I -..it

[т^} Ф^йгМйШ I А Р.П :l.H.

T

zrmEz:

«—

i

1Ц1 ГНХ i

EE)

lA-Rb I4VRY«

wtiiw

=Lh

{'rt41if!HT>

ÍR.T ГКТ

ж

Х_д

É2

yrltai* TATA» Jes* v i

У. cQqziE:

JL

•3»

.»vhit*

1A-RKmVt.w ТлТ.А-1<-.ч

yellmo ОИГ y »■

gi........1 .......iCZ

-yh>

r*

-SC

1f±—i

X@E

T-lf

IA-RK РГ ' Í HÍ A

Рис 3. Схемы конструкций, созданных для исследования 1Л-ЯЕ. Обозначения см. на рис. 1 и 2.

При вырезании фрагмента 1a-re ни в одной из исследованных линий окраска глаз у мух не изменилась. Таким образом, 1a-re не способен изолировать энхансер глаз от гена white и, следовательно, 1a-re является специфичным инсулятором для гена yellow. Вырезание энхансера гена white заметно ослабило пигментацию глаз, что позволяет исключить вариант функциональной неполноценности использованного энхансера.

Затем была изучена способность фрагмента 1A-RE активировать экспрессию гена yellow на большом расстоянии. При помощи молекулярных методов анализа было показано, что активация Р элемента в линии у?*1 с высокой частотой вызывала инверсии химерного элемента, заключенного между элементами Р1 и Р2 (рис. 4А). В результате инверсии были получены несколько линий, получивших название у*'1, в которых окраска крыльев и тела у дрозофил была темнее, чем в линии у2''. Затем, в одной из таких линий-у*''2 - снова было активировано перемещение Р элементов. Полученная таким образом производная линия y2p>21sc" имела измененный sc фенотип, выраженный в исчезновении многих щетинок. С помощью молекулярных методов анализа была определена структура области yellow-ac-sc в этом аллеле. Выяснилось, что мутация в аллеле y2ps2'sc" была вызвана инверсией между Р2 элементом и одним из Р элементов длиной 1.2 т.п.н., изначально находившимся в положении 261789 (координаты Р элементов здесь и далее приводятся по сиквенсу X хромосомы Drosophila melanogaster GenBank scaffold AE003417.3 в AS-C) (рис. 4Б). Ha основании полученных результатов был сделан вывод, что исходно два Р элемента длиной 1.2 т.п.н. располагались в AS-C в позициях 262509 (он получил название РЗ) и 262703 (Р4) и были ориентированы «хвост к хвосту». Они были разделены последовательностью 194 п.н. из AS-C. В результате инверсии между Р элементами из областей yellow и AS-C, Р2 оказался рядом с последовательностью AS-C, а с другой стороны от инверсии регуляторная последовательность yellow обрывалась на -69 п.н. относительно старта транскрипции. Подвижные элементы РЗ и РА оказались между кодирующей областью гена yellow и энхансерами AS-C (рис. 4Б).

Ранее в нашей лаборатории были описаны инверсии между yellow и AS-C, при которых регуляторная область AS-C репрессировала экспрессию yellow в щетинках (Gotovnin et al. 1999). Но у мух линии y2pl21sc" щетинки были пигментированы. Было сделано предположение, что в этом аллеле химерный элемент способен стимулировать экспрессию в щетинках, хотя и располагается на большом расстоянии 40 т.п.н. от гена yellow. Для картирования регуляторного элемента, отвечающего за этот эффект, решено

было снова индуцировать перемещения Р элементов в линии yf^'sc". Среди полученных производных обнаружилось пять У-подобных аллелей, в которых репрессия yellow была практически полной. Анализ молекулярной структуры этих аллелей выявил в четырех из них, названных yls21asc", полную делецию последовательности из IA района, расположенной между Р\ и Р2 элементами. Следовательно, эта последовательность необходима для стимуляции экспрессии yellow в щетинках. В пятом аллеле y'*2,bsc" произошла относительно небольшая деления ДНК из 1А района (длиной 660 п.н.), включавшая 1A-RE (рис. 4В). Это позволило сделать вывод, что именно фрагмент 1A-RE участвует в активации yellow в щетинках на расстоянии 40 т.п.н.

Ml* У SC-

ts t

y"msc"

Рис 4. Схема аллелей у , ур' sc", у sc" и у sc". Прямая линия показывает последовательность X хромосомы с нумерацией тысяч пар нуклеотидов в' соответствии с сиквенсом GenBank scaffold АЕ003417.3.Черные стрелки над ней обозначают гены yellow, ас и sc. AOR, ОС, SC, ANP энханссры помечены как sc энхднееры. Прочие обозначения как на рис. 1.

Чтобы подтвердить, что 1A-RE может стимулировать экспрессию в щетинках, фрагмент EcoTH-Pstl из 1А района был использован для создания генетических конструкций. Ожидалось, что в трансгенных линиях мух этот фрагмент будет способен компенсировать отсутствие энхансера щетинок. Как было показано ранее, если ген yellow лишен интрона, в котором находится энхансер щетинок, то окраска щетинок у мух желтая (Geyer and Corees 1987). Была создана контрольная конструкция «Yil», несущая безинтронный ген yellow. В 16 линиях из 20, трансгеннных по этой конструкции, экспрессия в щетинках полностью отсутствовала. Затем в конструкцию «Yil» в позицию -893 п.н. был вставлен фрагмент Psll-F.coM. В 12 трансгенных линиях из 14, несущих полученную конструкцию «1 A-RE P-S-R Yil» (рис. 3), пигментация щетинок варьировала от частичной до соответствующей дикому типу. Следовательно, 1A-RE активирует экспрессию yellow в щетинках даже в отсутствии соответствующего энхансера.

Далее было проверено, способен ли 1A-RE блокировать энхансеры AS-C. В результате мобилизации Р элементов в линии у1"21 se' был получен производный аллель y2ps2irsc"s (рис. 5А). В нем произошла частичная реверсия мутантного sc-фенотипа. С помощью молекулярного анализа было установлено, что в этом случае произошла реинверсия всей области, заключенной между Я1 и Р4 элементами. Таким образом, 194 п.н. последовательность ДНК из AS-C, окруженная РЗ и Р4 элементами, переместилась в локус yellow, а химерный элемент в окружении Р\ и Р2 переместился в район AS-C .

У мух линии y2ps21csc1Я было частично или полностью подавлено формирование нескольких типов щетинок. Химерный элемент в этом аллеле располагался между энхансерами AS-C и промоторами генов ас и se (Campuzano et al., 1985). Была выдвинута гипотеза, согласно которой в этом случае взаимодействие между энхансерами и промоторами генов AS-C нарушено вследствие инсуляторной активности IA-RE. Для проверки гипотезы в линии y2¡"21cscws были проведены мобилизация активности Р элемента и поиск производных линий, в которых мутантный se фенотип ревертировал к норме. Было получено пять аллелей с полной, и три аллеля с частичной реверсией мутации scws. С помощью молекулярных методов анализа было установлено, что полные ревертанты y2"'2Jsc" возникли в результате делеции последовательности 1А между Р2 и РЗ элементами. Причиной двух y2ps2uschl частичных реверсий фенотипа стала делеция Р2, а третьей )?palcsch2 - делеция участка последовательности 1А между 200041 и 200697, не содержащей 1A-RE (рис. 5В). Поскольку реверсия мутантного sc-фенотипа не связана с

делецией 1A-RE, был сделан вывод о неспособности 1A-RE блокировать энхансеры AS-C.

У мух линии наблюдалась слабая вариабельность в окраске щетинок. В

результате активации гибридного дисгенеза в линии y2pl2Jcscws было получено четыре производных аллеля y2l21cscw' с окраской щетинок, соответствующей дикому типу. При помощи секвенирования последовательности ДНК между F1 и РЗ элементами было установлено, что участок ДНК длиной 194 п.н., прежде заключенный между ними, в y2s21cscw' делегирован (рис. 5Б). Предположительно, именно этот 194 п.н. фрагмент содержит регуляторныи элемент из AS-C, влияющий на экспрессию yellow в щетинках.

Рис 5. Схемы аллелей у2"'1lrsc"", y2"'2"sc", y2/"2'rsc''' и y2p,1,csch\ Обозначения как на рис. 1 и 4.

1.4 Изучение роли регуляторных элементов 1A-RE и EnlA в естественном генетическом окружении. Был поставлен вопрос, какую функцию обнаруженные нами в составе химерного элемента регуляторные последовательности могут выполнять в том месте генома, где они находились исходно. Используя программу FlyBase BLAST, удалось

выяснить, что ооа изучаемых элемента расположены в пределах малоизученного гена GC3777. Этот ген имеет размер 70502 п.н., но длина самого большого транскрипта из трех обнаруженных - GC3777-RC - составляет всего 3400 н. Вероятно, при определении границ гена последовательности первого экзона и первого интрона были включены в него ошибочно, на самом же деле ген начинается со второго из экзонов, отмеченных в базе данных. Если допустить, что истинное начало гена GC3777 находится во втором экзоне, то фрагмент 1A-RE находится в промоторной области этого гена, a EnlA - в нитроне.

В таком случае все полученные данные позволяют выдвинуть следующую гипотезу: EnlA, скорее всего, служит энхансером гена GC3777, т.к. энхансеры генов могут располагаться в интронах, как в случае того же гена yellow. Интересно, что активаторная часть EnlA в отсутствие коммуникаторной восполняет отсутствие именно интронного энхансера yellow, стимулируя экспрессию гена только в щетинках. С другой стороны, специфичность инсуляторного действия 1A-RE по отношению к yellow заставляет предположить, что в исходном месте генома этот регуляторный элемент не является инсулятором, но в определенном генетическом окружении приобретает инсуляторные свойства.

> км

а? я9 а» РхЛ Sail EcoRl

Фрагменты, нсигшмошштше r конструкциях для щучешю EnlA

Т>

а5 Psll

I аб ¿oRl

зшд

i

!

Pvull EcoR.I

«III

Psll-l-'vitU I

J Ecv&I'Pst!

mdin-y

En aS-a6

-11A-RE '

.йаЛ-ДЯ! D 1 A-RE 325 п.л, (a7-aS) 1A-R1; 22? п.н. (a7-a9) ,

фрагменты, исполмомнные в конструкциях .тая нчучеяи» IA-RE

Рис. 6. Схема гена СС3777 с наложением границ мутаций в изученных аллелях и фрагментов, использованных в конструкциях.

Далее была проверена способность 1A-RE выполнять функцию промотора.

Промоторная активность 1A-RE была исследована при помощи трансгенных конструкций (рис. 3). Для первичной проверки способности 1A-RE активировать транскрипцию с ослабленных промоторов генов yellow и white был использован фрагмент 1A-RE длиной 325 п.н. В конструкции «1 A-RE yellow TATA-lcss» этот фрагмент был встроен перед геном yellow, ТАТА-бокс которого был мутирован. В линиях, несущих yellow TATA-less трансген, мухи имели желтую окраску тела, крыльев и щетинок. В 9 из 10 полученных «1A-RE yellow TATA-less» трансгенных линиях, мухи имели окрашенные щетинки. Таким образом, фрагмент 1A-RE способен выполнять функции ТАТА-промотора тени yellow. Для исследования способности 1A-RE активировать промотор гена white была создана конструкция «1 A-RE del white», в которой важные для транскрипции участки, находящиеся непосредственно перед промотором гена white, были делегированы, поэтому экспрессия white в глазах была ослаблена. Во всех 22 полученных линиях фрагмент 1A-RE размером 325 п.н., расположенный перед геном, восстанавливал фенотип while до уровня, близкого к дикому типу в присутствии ЭнГ, или до базального уровня после in vivo вырезания ЭнГ.

Для окончательного подтверждения промоторной функции 1A-RE была создана конструкция «1A-RE Рг», в которой открытая рамка считывания гена yellow прилежала исследуемому элементу. В этой конструкции использовался фрагмент 1A-RE длиной 226 п.н., расположенный между праймерами а7-а9 (рис. 6). В 14 полученных линиях, несущих конструкцию «1A-RE Рг», все кутикулярные .структуры дрозофил были интенсивно пигментированы. Таким образом, элемент 1A-RE является промотором, который при изменении местоположения в геноме начинает проявлять свойства инсулятора.

Затем была изучена способность 1A-RE взаимодействовать с EnlA. Анализ гена GC3777 позволил предположить, что EnlA служит энхансером этого гена, активирующим транскрипцию с промотора 1A-RE. Для проверки этого предположения была создана конструкция «IA-RE Рг + EnlA», в которой энхансеры тела и крыльев теки yellow были заменены на полноразмерный EnlA, окруженный 1ох сайтами, позволяющими удалять его in vivo (рис. 3). Мухи всех 22 полученных линий имели пигментированные тело и крылья. При вырезании EnlA у 15 из 17 линий пигментация сохранялась только в щетинках.

Следовательно, генетические элементы 1A-RE и EnlA взаимодействуют и энхансер

En] А является естественным регулятором активности промотора 1A-RE.

2. Исследование зависимости активности Su(Hw) инсуляторов от их взаимного расположения и расстояния между ними.

В следующей части работы с помощью модельной системы гена yellow изучалось влияние взаимного расположения двух инсуляторов и расстояния между на Su(Hw)-зависимую инсуляцию, Известно, что одиночная копия Su(Hw) в составе трансгеннон конструкции полностью блокирует энхансеры тела и крыльев, если находится между этими энхансерами и промотором гена yellow. Фенотип трансгенных мух - у2, то есть светлые тело и крылья, темные щетинки. Однако ранее в нашей лаборатории было показано (Muravyova et al. 2001), что две копии инсулятора в положении между промотором и энхансерами теряют способность блокировать взаимодействие между ними и позволяют энхансерам активировать промотор. С другой стороны, когда два Su(Hw) инсулятора окружают энхансеры гена yellow, они полностью блокируют взаимодействие энхансеров с промотором, который находится вне домена, образуемого инсуляторами. Предположительно, блокирование активности энхансеров происходит в результате стерической изоляции энхансеров от промотора, возникающей вследствие взаимодействия между белковыми комплексами, связанными с Su(Hw) инсуляторами. Была выдвинута гипотеза, что при увеличении расстояния между взаимодействующими инсуляторами будет происходить восстановление активности энхансеров. Для проверки этой гипотезы был создан ряд трансгенных конструкций (рис. 7), в которых присутствовал спейсер длиной 6 т.п.н. В качестве спейсера использовался фрагмент кодирующей последовательности ретротранспозона МДГ4.

В конструкциях Su(Hw)A и Su(Hw)B спейсер располагался между энхансерами тела и крыльев и инсулятором Su(Hw), находящимся в позиции -893 п.н. В конструкции Su(Hw)A вторая копия инсулятора в окружении 1ох-сайтов для in vivo вырезания была поставлена за геном yellow, таким образом расстояние между двумя копиями Su(Hw) составляло 6 т.п.н. Было получено 30 линий, несущих конструкцию Su(Hw)A. Во всех линиях мухи имели у2-фенотнп, что свидетельствует о полном блокировании энхансеров тела и крыльев, В 7 линий с помощью генетических скрещиваний была введена мутация белка Su(Hw), необходимого для инсуляторной активности. В 6 из них произошло восстановление экспрессии yellow в теле и крыльях. Следовательно, энхансеры тела и крыльев сохраняют способность активировать промотор yellow в большинстве мест

генома, даже если находятся от него на расстоянии 7 т.п.н. Вырезание второй копии инсулятора не изменяло фенотип мух в 28 из 30 линий. Таким образом, одиночная копия Su(Hw) способна эффективно блокировать энхансеры, находящиеся на расстоянии 7 т.п.н.

В конструкции Su(Hw)B вторая копия инсулятора была помещена на расстоянии 1.8 т.п.н. перед энхансерами тела и крыльев, Инсуляторы окружали энхансеры и были удалены друг от друга на,расстояние 10 т.п.н. В 6 из 7 полученных линий наблюдалась промежуточная пигментация тела и крыльев. После введения мутации белка Su(Hw) в 5 линиях тело и крылья у мух становились темнее. Следовательно, в этом случае активность энхансеров, окруженных двумя инсуляторами, находящимися на большом расстоянии, только частично заблокирована.

Чтобы проверить, происходит ли активация экспрессии yellow в линиях, несущих конструкцию Su(Hw)B, за счет энхансеров тела и крыльев, либо за счет взаимодействия между двумя копиями инсулятора, в контрольной конструкции Su(Hw)D энхансеры были удалены. Все 17 трансгенных линий, несущих конструкцию D, имели фенотип у2. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что частичное взаимодействие между энхансерами и промотором становится возможным вопреки инсулятору Su(Hw), находящемуся между ними, если есть второй вышележащий инсулятор, находящийся от первого на расстоянии 10 т.п.н.

Было решено объединить элементы конструкции Su(Hw)A и Su(Hw)B в одну -Su(Hw)C, несущую 3 копии инсулятора, расположенные на большом расстоянии друг от друга, и проанализировать вклад третьей копии в эффект инсуляции. В 22 линиях, трансгенных по конструкции Su(Hw)C, мухи имели у2 или близкий к нему фенотип. Вырезание инсулятора, расположенного за геном yellow, приводило к усилению пигментации в 14 линиях, что соответствует данным, полученным при работе с конструкцией Su(Hw)B. Следовательно, именно третья нижележащая копия Su(Hw) оказывает значительное влияние на взаимодействие двух вышележащих копий инсулятора, окружающих энхансеры, в результате чего инсуляция полностью восстанавливается.

Комбинация регуляторных элементов, аналогичная присутствующей в конструкции Su(Hw)A, была воспроизведена в конструкции Su(Hw)E, однако расстояние между двумя копиями инсулятора, окружающими ген yellow было увеличено до 12 т.п.н. Предполагалось, что увеличение расстояния между инсуляторами может привести к частичной нейтрализации эффекта инсуляции, как и в конструкции Su(Hw)B. Однако

фенотипический анализ мух, несущих конструкцию Su(Hw)E, не выявил различий в сравнении с конструкцией Su(Hw)A (мухи имели фенотип у2). Полученные данные позволяют предположить, что в этом случае последовательность гена yellow, расположенная между двумя копиями инсулятора, влияет на их взаимодействие.

Для завершения серии конструкций, несущих несколько копий 8и(Н\у)-инсулятора, расположенных на различных расстояниях по отношению друг к другу и регуляторным элементам гена yellow, была сделана конструкция Su(Hw)F. В отличии от конструкции Su(Hw)B, расстояние между инсуляторами, окружающими энхансеры гена yellow было сокращено до 4 т.п.н. Во всех 18 полученных линиях, трансгенных по конструкции Su(Hw)F, мухи имели фенотип у2, что свидетельствует о полном блокировании энхансеров yellow в отличии от частичной инсуляции, наблюдаемой в конструкции Su(Hw)B.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что расстояние между инсуляторами Su(Hw), окружающими энхансеры тела и крыльев, влияет на способность инсуляторов блокировать взаимодействие между этими энхансерами и промотором гена yellow.

Su(llw)A

Sn(Hw)B

Su(IIw)C

Su(Kw)D

Su(HwJE

Рис 7. Схемы конструкций, посвященных изучению взаимодействия между инсуляторами 5и(>^), находящимися на различных дистанциях. Инсуляторы изображены в виде черных ромбов, спейсер обозначен пунктирной линией. Остальные обозначения см. рис. 1 и 2.

YrHtttV

__ ^ ^ _ 6 [.I1.H. [

-^bllA^Wn— я Ш »* »j . w^fr. t...... I t . I 1 ([ф j >>

1.8 ГП.Н. ____Л I'.n Н. Г^ , III I I

< t ф бпЮ^^^-ч:« » «»«•••»« ш ««»■« ф I I "1 I »

ч. vetbnv

I.Sfll.K. __ 6r.Ii.li. r^ <C ф :.:.:ш:ж:яс.».. .:» .-ж.«:.-. м.ф *......... *........* ' ^ ф

1 .X ТП II Л ¥.11 II Г" -............. . ж Я

•vvri

I,«Т.П.». 6r.li.H- r^

v If

. J.S I.tl >1. ^^^ 6Г.11.К. Г^

--<3><2>4-........ ж........ I i ii

Обсуждение результатов исследования

1. Исследование структуры и свойств регуляторных элементов, входящих в состав химерных элементов.

Одной из целей представленной работы являлось изучение процесса образования

(

химерных элементов и перемещения их из одного локуса в другой. Было показано, что перемещения химерного элемента из локуса yellow в локус AS-C и 194 п.н. регуляторного фрагмента из локуса AS-C в локус yellow произошли в результате нескольких последовательных рекомбинаций между Р элементами. А именно, перегруппировку претерпели Р элементы, окружающие химерный элемент в гене yellow с одной стороны, и два Р элемента в AS-C, с другой стороны.

Как было продемонстрировано ранее, вторичная интеграция Р элемента - частое событие, которое преимущественно происходит вблизи места первичной интеграции (Hawley el al. 1988). В таких случаях образуются пары Р элементов. Если происходит рекомбинация между внешними копиями Р элементов двух таких пар, то последовательность ДНК, расположенная между двумя парами Р элементов, инвертируется. Последующая рекомбинация уже внутренних Р элементов ведет к реинверсии этой последовательности, а фрагменты ДНК, заключенные внутри каждой пары Р элементов, меняются местами. В результате последовательность ДНК, в состав которой могут входить регуляторные элементы, перемещается от одного гена к другому. В представленной работе была исследована 194 п.н. регуляторная последовательность, переместившаяся из AS-C в регуляторную область гена yellow, в результате чего подавлялась экспрессия yellow в щетинках. В то же время, перемещение 1А химерного элемента в AS-C оказывает влияние на активность некоторых энхансеров AS-C. Этот пример свидетельствует, что мутации, связанные с перемещениями Р элементов, в процессе естественного отбора могут служить источником создания генетического и фенотипического разнообразия.

При индукции генетической нестабильности с участием химерного элемента, содержащего ДНК из 1А района X хромосомы, была получена коллекция линий дрозофилы с разнообразными фенотипами гена yellow. Изучение мутаций химерного элемента позволило обнаружить два новых регуляторных элемента 1A-RE и Eni А, по-видимому, являющихся в исходном генетическом окружении промотором и энхансером одного гена GC3777. Обнаруженный регуляторный элемент 1A-RE является примером

промотора, который при изменении местоположения в геноме начинает проявлять свойства инсулятора, приобретая способность блокировать энхансеры гена yellow.

Недавно было показано, что инсулятор Su(Hw) способен на большом расстоянии активировать экспрессию гена yellow с ослабленным промотором (Golovnin et al. 2005). Вполне вероятно, что и другие регуляторные элементы совмещают способность блокировать энхансеры и активировать промотор на большом расстоянии.

Результаты проведенных исследований позволяют предположить, что некоторые регуляторные элементы потенциально способны к различным регуляторным активностям. Этот набор свойств может не полностью реализовываться в естественном генетическом окружении и проявляется только при перемещении регуляторного элемента. Функциональные свойства регуляторного элемента зависят от генетического окружения, в том числе от присутствия и взаимного расположения других регуляторных элементов.

2. Взаимодействующие Su(IIw) инсуляторы не формируют независимых доменов транскрипции.

Также в представленной работе была исследована способность двух Su(Hw) инсуляторов, окружающих энхансеры гена yellow, блокировать их взаимодействие с промотором гена yellow, который находится вне домена, созданного инсуляторами. Оказалось, что когда Su(Hw) инсуляторы находились на расстоянии 4 т.п.н, они полностью блокировали активность энхансеров. Однако при увеличении расстояния между инсуляторами до 10т.п.н энхансеры гена yellow могли частично активировать промотор. В то же время, одна копия Su(Hw) инсулятора полностью блокировала активность энхансеров, если располагалась между ними и промотором.,

Когда расстояние между взаимодействующими инсуляторами достаточно мало, энхансеры, расположенные между ними, не могут взаимодействовать с изолированным промотором в результате стерических/топологических проблем, созданных взаимодействующими инсуляторами. При увеличении расстояния между инсуляторами роль стерических/топологических препятствий уменьшается, что приводит к восстановлению взаимодействия между энхансерами и промотором. Таким образом, полученные в работе результаты свидетельствуют, что взаимодействующие инсуляторы не приводят к созданию функционально изолированных доменов, как предполагалось ранее.

Выводы

1. Продемонстрирован один из механизмов образования химерных элементов н их перемещения. Такие события происходят в результате последовательных рекомбинаций между Р элементами химерного элемента из регуляторной области гена yellow и Р элементами, которые находятся в регуляторной области AS-C комплекса.

2. В химерном элементе обнаружен энхансер Eni А, который был перенесен в химерный элемент из дистального 1А района X хромосомы. Энхансер Eni А имеет неоднородную структуру: состоит из активаторной и коммуникаторной частей, которые вместе способны компенсировать отсутствие собственных энхансеров гена yellow и активировать экспрессию гена yellow во всех кутикулярных структурах.

3. При изучении мутационных изменений химерного элемента был обнаружен регуляторный элемент 1A-RE, который активирует экспрессию yellow на большом расстоянии и является инсулятором, специфичным для гена yellow. Исследование 1A-RE при помощи трансгенных конструкций позволило выдвинуть гипотезу, что 1A-RE в исходном генетическом окружении в 1А районе X хромосомы выполняет функцию промотора гена CG3777 и взаимодействует с Eni А, расположенным в интроне этого гена.

4. Показано, что одна копия Su(Hw) инсулятора может эффективно блокировать взаимодействие между энхансером и промотором, которые находятся на расстоянии 7-9 т.п.н. друг от друга. Однако добавление второй копии инсулятора, в результате чего энхансеры оказываются между двумя Su(Hw) инсуляторами, расположенными на расстоянии 10 т.п.н. друг от друга, приводит к восстановлению взаимодействия между энхансером и промотором (нейтрализации активности инсулятора). Таким образом, взаимодействующие Su(Hw) инсуляторы не формируют независимых доменов транскрипции, как предполагалось ранее.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Pomerantseva Е, Biryukova Г, Silicheva R, Savitskaya Е, Golovnin A, Georgiev P. Transposition of regulatory elements by P element-mediated rearrangements in Drosophila melanogaster. Genetics. 2006, V. 172 P. 2283-2291.

2. Savitskaya E, Melnikova L, Kostuchenko M, Kravchenko E, Pomerantseva E, Boikova T, Chetverina D, Parshikov A, Zobacheva P, Gracheva E, Galkin A, Georgiev P. Study of longdistance functional interactions between Su(Hw) insulators that can regulate enhancer-promoter communication in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2006, V. 26 P. 754-761.

3. E.A. Померанцева, П. Г. Георгиев. Структура и свойства нового энхансера из 1А района Х-хромосомы Drosophila melanogaster. Тезисы 10 Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXX века"с. 42. Пущино, 17-21 апреля 2006г.

4. Е.А. Померанцева, П. Г. Георгиев. Изучение нового регуляторного элемента 1А-RE Drosophila melanogaster. Тезисы докладов XV11I зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", 1.97 с.15 Москва, 7-10 февраля 2006 г.

5. Ekaterina Pomerantseva, Pavel Georgiev. Promoter Performs As An Insulator Being Moved To An Ectopic Position By Means Of P Element Transposition. 47th Annual Drosophila Research Conference, Houston, USA, March 29 - April 2, 2006. Abstract 339В P.48

6. L. Melnikova, E. Pomerantseva, E. Gracheva, P. Georgiev. Enhancer blocking depends on the size of the chromatin domain formed by the Su(Hw) insulators. 46th Annual Drosophila Research Conference, San Diego, USA, March 30 - April 3, 2005. Abstract 359В P.48

7. P. Georgiev, E. Savitskaya, A. Golovnin, L. Melnikova, M. Kostuchenko, E. Kravchenko, D. Chetverina, E. Pomerantseva, A. Parshikov, The gypsy insulator - models of insulator function. Advances in Molecular Cell Biology. Moscow, June 17-18, 2004 Abstract P.8

Формат 60 х 90 'Л 6 Тираж 100 экз.

Объем 1,5 п.л. Заказ 1183

Отпечатано с готовых оригинал-макетов в типографии Издательства «Учеба» МИСиС, 117419, Москва, ул. Орджоникидзе, 8/9

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Померанцева, Екатерина Алексеевна

Оглавление.

Введение.

Цели и задачи исследования.

Список сокращений.

1 Обзор литературы.

1.1 Общая характеристика инсуляторов Drosophila melanogaster.

1.1.1 Инсуляторы генов теплового шока (scs и scs').

1.1.2 Su(Hw)-coдержащие инсуляторы.

1.1.3 Инсуляторы в регуляторной области Abd-B гена.

1.1.4 Краткий обзор других инсуляторов дрозофилы.

1.2 Инсуляторы позвоночных.

1.3 Механизмы действия инсуляторов и их роль в регуляции транскрипции.

2 Материалы и методы.

2.0 Характеристика объекта исследования.

2.1 Генетические методы.

2.1.1 Линии и мутации Drosophila melanogaster, использованные в работе.

2.1.2 Фенотипический анализ экспрессии генов.

2.1.3 Индукция перемещений Р элемента.

2.1.4 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий.

2.1.5 Индукция сайт-специфической рекомбинации.

2.1.6 Введение мутации по гену Su(Hw).

2.2 Биохимические методы.

2.2.1 Выделение ДНК дрозофилы.

2.2.2 Саузерн-блот-анализ.

2.2.3 Метод ПЦР.

2.2.4 Секвенирование плазмид.

2.2.5. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса.

2.2.6 Выделение фрагментов ДНК из геля.

2.2.7 Создание генетических конструкций.

2.2.8 Конструкции, созданные для картирования и исследования свойств энхансера EnlA.

2.2.9 Конструкции, созданные для картирования и исследования свойств регуляторного элемента 1A-RE.

2.2.10 Конструкции, созданные для исследования взаимодействия между Su(Hw) инсуляторами.

3 Результаты исследования.

3.1 Изучение новых регуляторных элементов из 1А района X хромосомы Drosophila melanogaster.

3.1.1 Обнаружение новых регуляторных элементов при помощи Р элемент-зависимой генетической нестабильности.

3.1.2 Структура и свойства нового энхансера EnlA из 1А района X хромосомы Drosophila melanogaster.

3.1.3 Исследование регуляторного элемента 1A-RE из 1А района X хромосомы Drosophila melanogaster.

3.1.4 Изучение роли 1A-RE и EnlA в естественном генетическом окружении.

3.2 Исследование зависимости активности Su(Hw) инсуляторов от их взаимного расположения и расстояния между ними.

4 Обсуждение результатов исследования.

4.1 Исследование структуры и свойств регуляторных элементов, входящих в состав химерных элементов.

4.2 Взаимодействующие Su(Hw) инсуляторы не формируют независимых доменов транскрипции.

5 Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение взаимодействия между регуляторными элементами генома у Drosophila melanogaster в модельных системах генов yellow и white"

Перемещение мобильных элементов - транспозонов играет важную роль в обеспечении генотипического разнообразия у эукариот. В настоящее время подробно изучены транспозоны, обнаруженные в геноме плодовой мушки Drosophila melanogaster. Более половины спонтанных мутаций, возникающих в геноме дрозофилы, вызваны встраиванием транспозона в тот или иной ген. Наиболее исследованным мобильным элементом у Drosophila melanogaster является Р элемент, который имеет на концах короткие инвертированные повторы. Ранее в нашей лаборатории были открыты супернестабильные мутации, которые возникали с высокой частотой в результате мобилизации активности Р элемента. Было показано, что такие мутации индуцированы химерным элементом, состоящим из уникальных участков генома, окруженных делетированными копиями Р элемента. Мобилизация активности Р элемента приводила к инверсиям последовательности между Р элементами, увеличению или уменьшению фрагментов генома, входящих в состав химерных элементов. При этом внутренние части химерного элемента, содержащие регуляторные последовательности, могли влиять на экспрессию рядом расположенного гена, что приводило к проявлению мутантного фенотипа. Таким образом, химерные элементы способны играть значительную роль в эволюции регуляторных последовательностей, участвуя в создании наиболее эффективно действующей регуляторной системы для конкретного гена. В представленной работе было продолжено изучение механизмов возникновения и распространения химерных элементов, кроме того, химерные элементы были использованы для выявления новых регуляторных последовательностей и изучения взаимодействия между ними.

Также в работе было продолжено исследование наиболее изученного инсулятора дрозофилы, состоящего из 12 сайтов связывания для белка Su(Hw). Известно, что одна 3 копия Su(Hw) инсулятора в составе трансгенной конструкции полностью блокирует взаимодействие между энхансерами тела и крыльев и промотором гена yellow, если находится между ними. Ранее в нашей лаборатории было показано, что две копии Su(Hw) инсулятора, расположенные между энхансером и промотором, не могут блокировать их взаимодействие. В представленной работе с помощью модельной системы гена yellow Drosophila melanogaster было доказано, что Su(Hw) инсуляторы не формируют независимых транскрипционных доменов, а степень инсуляции зависит от расстояния между ними.

Цели и задачи исследования

Основными целями данного исследования являлись:

1) изучение регуляторных элементов, входящих в состав химерных элементов;

2) изучение зависимости взаимодействия между регуляторными элементами от их взаимного расположения и расстояния между ними.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить механизмы возникновения химерных мобильных элементов, состоящих из Р элементов и уникальных фрагментов генома и механизмы их транспозиций.

2. Исследовать влияние перемещения химерных элементов из одного локуса в другой на регуляцию генной экспрессии.

3. Исследовать свойства регуляторных элементов, входящих в состав химерных элементов.

4. Выяснить, как расстояние между двумя Su(Hw) инсуляторами, окружающими энхансеры, влияет на их способность блокировать взаимодействие между энхансерами и изолированным промотором гена yellow Drosophila melanogaster.

Список сокращений

Su(Hw) - инсулятор Drosophila melanogaster, состоящий из 12 сайтов связывания для белка Su(Hw).

AS-C - комплекс генов achaete и scute Drosophila melanogaster п., п.н., т.п.». - соответственно: нуклеотиды, пары нуклеотидов, тысячи пар нуклеотидов - единицы измерения длины последовательностей ДНК и РНК

ПЦР - полимеразная цепная реакция

1A-RE - регуляторный элемент из 1А района X хромосомы Drosophila melanogaster, (Regulatory Element from 1A region)

Enl A - энхансер из 1А района X хромосомы Drosophila melanogaster

1 Обзор литературы

У высших эукариот энхансер может активировать промотор на расстоянии, достигающем нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов (West and Fraser 2005; West et al. 2002; de Laat and Grosveld 2003; Bondarenko et al. 2003; Sipos and Gyurkovics, 2005; Dorsett 1999). Недавно для некоторых энхансеров млекопитающих было продемонстрировано, что белки, связанные с энхансером, непосредственно взаимодействуют с белками основного транскрипционного комплекса или вспомогательными белками, собранными на промоторе, при этом ДНК между ними образует петлю (Tolhuis et al., 2002; de Laat and Grosveld 2003). Возникает вопрос, каким образом энхансер может взаимодействовать с промотором на больших дистанциях и при этом правильно узнавать свой промотор. Несмотря на то, что к настоящему моменту описано огромное количество энхансеров и промоторов, изучено множество факторов транскрипции, вопрос о механизме специфичности взаимодействия между энхансером и промотором остается открытым.

В понимании механизмов дальних взаимодействий между регуляторными элементами большую роль может сыграть изучение инсуляторов. Инсуляторами были названы регуляторные элементы, которые блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, если находятся между ними (Capelson and Corces 2004; Geyer and Clark 2002; West et al. 2002; Kuhn and Geyer 2003). При этом инсуляторы не влияют непосредственно на активность энхансера и промотора, т.е. промотор может быть активирован любым другим энхансером, а энхансер может активировать любой другой промотор. Наиболее хорошо инсуляторы исследованы у дрозофилы и позвоночных, именно они представлены в данном обзоре.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Померанцева, Екатерина Алексеевна

5 Выводы

1. Продемонстрирован один из механизмов образования химерных элементов и их перемещения. Такие события происходят в результате последовательных рекомбинаций между Р элементами химерного элемента из регуляторной области гена yellow и Р элементами, которые находятся в регуляторной области AS-C комплекса.

2. В химерном элементе обнаружен энхансер EnlA, который был перенесен в химерный элемент из дистального 1А района X хромосомы. Энхансер EnlA имеет неоднородную структуру: состоит из активаторной и коммуникаторной частей, которые вместе способны компенсировать отсутствие собственных энхансеров гена yellow и активировать экспрессию reHajye/W во всех кутикулярных структурах.

3. При изучении мутационных изменений химерного элемента был обнаружен регуляторный элемент 1A-RE, который активирует экспрессию yellow на большом расстоянии и является инсулятором, специфичным для гена yellow. Исследование 1А-RE при помощи трансгенных конструкций позволило выдвинуть гипотезу, что 1A-RE в исходном генетическом окружении в 1А районе X хромосомы выполняет функцию промотора гена CG3777 и взаимодействует с EnlA, расположенным в интроне этого гена.

4. Показано, что одна копия Su(Hw) инсулятора может эффективно блокировать взаимодействие между энхансером и промотором, которые находятся на расстоянии 7-9 т.п.н. друг от друга. Однако добавление второй копии инсулятора, в результате чего энхансеры оказываются между двумя Su(Hw) инсуляторами, расположенными на расстоянии 10 т.п.н. друг от друга, приводит к восстановлению взаимодействия между энхансером и промотором (нейтрализации активности инсулятора). Таким образом, взаимодействующие Su(Hw) инсуляторы не формируют независимых доменов транскрипции, как предполагалось ранее.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Померанцева, Екатерина Алексеевна, Москва

1. Ameres S. L., Drueppel L., Pfleiderer K., Schmidt A., Hillen W., Berens C. Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer // EMBO J. 2005. V. 24. P. 358-367.

2. Bantignies F., Grimaud C., Lavrov S. et al. Inheritance of Polycomb-dependent chromosomal interactions in Drosophila// Genes Dev. 2003. V. 17. P. 2406-2420.

3. Barges S., Mihaly J., Galloni M. et al. The Fab-8 boundary defines the distal limit of the bithorax complex iab-7 domain and insulated iab-7 from initiation elements and a PRE in the adjacent iab-8 domain // Development. 2000. V. 127. P. 779-790.

4. Bell A. C., West A. G., Felsenfeld G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators // Cell. 1999. V. 98. P. 387-396.

5. Bell A.C., Felsenfeld G. Stopped at the bordenboundaries and insulators // Curr. Opin. Genet. Dev. 1999. V. 9. P.191-198.

6. Belozerov V.E., Majumder P., Shen P., Cai H.N. A novel boundary element may facilitate independent gene regulation in the Antennapedia complex of Drosophila // EMBO J. 2003. V. 22. P. 3113-3121.

7. Bender M.A., Reik A., Close J. et al. Description and targeted deletion of 5' hypersensitive site 5 and 6 of the mouse P-globin locus control region // Blood. 1998. V. 92. P. 4394-4403.

8. Bingham, P. M., Kidwell M. G., Rubin G. M. The molecular basis of P-M hybrid dysgenesis: the role of the P element, a P-strain-specific transposon family // Cell. 1982. V. 29 P. 993-1004.

9. Blanton J., Gaszner M., Schedl P. Protein : protein interactions and the pairing ofboundary elements in vivo // Genes Dev. 2003. V. 17. P. 664-675.

10. Bondarenko V. A., Liu Y. V., Jiang Y. I., Studitsky V. M. Communication over a lage distance: enhancers and insulators // Biochem. Cell. Biol. V. 81. P. 241-251.

11. Bondarenko V. A., Jiang Y. I., Studitsky V. M. Rationally designed insulator-like elements can block enhancer action in vitro // EMBO J. 2003. V. 22. P. 4728^1737.

12. Buchner K., Roth P., Schotta G., Krauss V., Saumweber H., Reuter G., Dorn R. Genetic and molecular complexity of the position effect variegation modifier mod(mdg4) in Drosophila // Genetics. 2000. V. 155. P. 141-157.

13. Burgess-Beusse В., Farrell C., Gaszner M. et al. The insulation of genes from external enhancers and silencing chromatin // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 16433-16437.

14. Burke L.J., Zhang R., Bartkuhn M. et al. CTCF binding and higher order chromatin structure of the HI9 locus are maintained in mitotic chromatin // EMBO J. 2005. V. 24. P. 3291-3300.

15. Byrd K., Corces V. G. Visualization of chromatin domains created by the gypsy insulator of Drosophila//J. Cell Biol. 2003. V. 162. P. 565-574.

16. Cai H., Levine M. Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo//Nature. 1995. V. 376. P. 533-536. 3

17. Cai H. N., Shen P. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity// Science. 2001. 291. P. 493-495.

18. Capelson, M., and V. G. Corces. 2004. Boundary elements and nuclear organization // Biol. Cell. 2004. V. 96. P.617-629.

19. Capelson M., Corces V. The ubiquitin ligase dTopors directs the nuclear organization of a chromatin insulator// Mol. Cell. 2005. V. 20. P. 105-16.

20. Chen Q., Lin L., Smith S. et al. Multiple promoter targeting sequences exist in Abdominal-B to regulate long-range gene activation // Dev. Biol. 2005. V. 286. P. 629-636.

21. Chung J.H., Bell A.C., Felsenfeld G. Characterization of the chicken P-globin insulator// Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 575-580.

22. Conte C., Dastugue В., Vaury C. Coupling of enhancer and insulator properties identified in two retrotransposons modulates their mutagenic impact on nearby genes // Mol. Cell. Biol. 2002. V. 22. P. 1767-1777.

23. Cuvier O., Hart C.M., Laemmli U.K. Identification of a class of chromatin boundary elements // Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P. 7478-7486.

24. Cuvier O., Hart C.M., Kas E., Laemmli U.K. Identification of a multicopy chromatin boundary element at the borders of silenced chromosomal domains // Chromosoma. 2002. V. 110. P. 519-531.

25. Defossez P.-A., Kelly K.F., Filion G., et al. The human enhancer-blocker CTCF interacts with the transcription factor Kaiso // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 4301743023.

26. Dorsett D. Distant liaisons: long range enhancer-promoter interactions in Drosophila // Curr. Opin. Genet. Dev. 1999. V. 9. P. 505-514 1

27. Drewell R.A., Goddard C.J., Thomas J.O., Surani M.A. Methylation-dependent silencing at the HI9 imprinting control region by MeCP2 // Nucl. Ac. Res. 2002. V. 30. P.1139-1144.

28. Dunn K.L., Zhao H., Davie J.R. The insulator binding protein CTCF associates with the nuclear matrix // Exp. Cell Res. 2003. V. 288. P. 218-223.

29. Epner E., Reik A., Cimbora D., et al. The P-globin LCR is not necessary for an openchromatin structure or developmentally regulated transcription of the native mouse (3-globin locus // Mol. Cell. 1998. V. 2. P. 447 455.

30. Erlich, H. A., PCR technology. Stockton Press, New York, NY. // 1989.

31. Farrell C.M., West A.G., Felsenfeld G. Conserved CTCF Insulator Elements Flank the Mouse and Human p-Globin Loci // Mol. Cell. Biol. 2002. V. 22. P. 3820-3831.

32. Garcia-Bellido, A., Genetic analysis of the achaete-scute system of Drosophila melanogaste. II Genetics. 1979 V. 91. P. 491-520.

33. Gaszner M., Vazquez J., Schedl P. The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction // Genes Dev. 1999. V. 13. P. 2098-2107.

34. Gdula D.A., Corces V.G. Characterization of functional domains of the su(Hw) protein that mediate the silencing effect of mod(mdg4) mutations // Genetics. 1997. V. 145. P. 153-161.

35. Gerasimova T.I., Corces V.G. Polycomb and Trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator// Cell. 1998. V. 92. P.511-521.

36. Gerasimova Т. I., Byrd K., Corces V. G. A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA // Mol. Cell. 2000. V. 6. P. 1025-1035.

37. Georgiev, P., Tikhomirova Т., Yelagin V., Belenkaya Т., Gracheva E., et al Insertions of hybrid P elements in the yellow gene of Drosophila cause a large variety of mutant phenotypes // Genetics. 1997. V. 146 P. 583-594.

38. Geyer, P. К., Spana С., Corces V. G. On the molecular mechanism of gypsy-induced mutations at the yellow locus of Drosophila melanogaster II EMBO J. 1986. V. 5 P. 2657-2662.

39. Geyer P., Corces V. Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster I I Genes Dev. 1987. V.l. P.996-1004.

40. Geyer P. K., Clark I. Protecting against promiscuity: the regulatory role of insulators // Cell Mol. Life Sci. 2002. V. 59. P. 2112-2127.

41. Ghosh D., Gerasimova T.I., Corces V.G. Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function // EMBO J. 2001. V. 20. P. 2518-2527.

42. Golic K., Lindquist S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome // Cell. 1989. V.59. P.499-509.

43. Golovnin, A., Gause M., Georgieva S., Gracheva E., Georgiev P. Su(Hw) insulator can disrupt enhancer-promoter interactions when located more than 20 kilobases away from the Drosophila achaete-scute complex // Mol. Cell. Biol. 1999. V. 19. P. 34433456.

44. Golovnin A., Georgieva S., Hovhannisyan H., Barseguyan K., Georgiev P. P element-mediated duplications of genomic regions in Drosophila melanogaster II Chromosoma. 2002. V. 111. P. 126-138.

45. Golovnin A., Birukova I., Romanova O. Silicheva et al. An endogenous Su(Hw) insulator separates the yellow gene from the Achaete-Scute gene complex in Drosophila// Development. 2003. V. 130. P. 3249-3258.

46. Golovnin A., Melnick E., Mazur A., Georgiev P. Drosophila Su(Hw) insulator canstimulate transcription of a weakened yellow promoter over a distance // Genetics. 2005. V. 170. P. 1133-1142.

47. Gombert W.M., Farris S.D., Rubio E.D. et al. The c-myc insulator element and matrix attachment regions define the c-myc chromosomal domain // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 9338-9348.

48. Gruzdeva N., Kyrchanova O., Parshikov A. et al. The Мер element from the bithorax complex contains an insulator that is capable of pairwise interactions and can facilitate enhancer-promoter communication//Mol. Cell. Biol. 2005. V. 25. P. 3682-3689.

49. IIebbes T.R., Clayton A.L., Thome A.W., Crane-Robinson C. Core histone hyperacetilation comaps with generalized DNase I sensitivity in the chicken (3-globin chromosomal domain//EMBO J. 1994. V. 13. P. 1823-1830.

50. Hagstrom K., Muller M., Schedl P. Fab-7 functions as a chromatin domain boundary to ensure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 3202-3215.

51. Harrison D.A., Gdula D.A., Coyne R.S., Corces,V.G. A leucine zipper domain of the suppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on enhancer function // Genes Dev. 1993. V.7. P. 1966-1978.

52. Hart C.M., Cuvier O., Laemmli U.K. Evidence for an antagonistic relationship between the boundary element-associated factor BEAF and the transcription factor DREF // Chromosoma. 1999. V. 108. P. 375-383.

53. Kaffer C.R., Srivastava M., Park K.Y. et al. A transcriptional insulator at the imprinted H19/Igf2 locus // Genes Dev. 2000. V. 14. P. 1908-1919.

54. Karess, R.E., and G.M. Rubin. Analysis of P transposable element functions in Drosophila//Cell. 1984. V. 38 P. 135-146.

55. Katsani K.R., Hajibagheri M.A.N., Verrijzer C.P. Cooperative DNA binding by GAGA transcription factor requires the conserved BTB/POZ domain and reorganizes promoter topology//EMBO J. 1999. V. 18. P.698-708.

56. Kellum R., Schedl P. A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains // Cell. 1991. V. 64. P. 941-950.

57. Kellum R., Schedl P. A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay//Mol. Cell. Biol. 1992. V. 12. P. 2424-2431.

58. Kidwell, M. G., Kidwell J. F., Sved J. F. Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. a syndrome of aberrant traits including mutation, sterility and male recombination// Genetics. 1977. V. 86 P. 813-833.

59. Kim J., Shen В., Rosen C., Dorsett D. The DNA-binding and enhancer-blocking domains of the Drosophila suppressor of Haiiy-wing protein // Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P.3381-3392.

60. Kuhn E. J., Geyer P. K. Genomic insulators: connecting properties to mechanism // Curr. Opin. Cell Biol. 2003. V. 15. P. 259-265.

61. Kuhn E. J., Viering M. M., Rhodes К. M., Geyer P. K. A test of insulator interactions in Drosophila// EMBO J. 2003. V. 22. P. 2463-2471.

62. Kuhn E., Hart C., Geyer P. Studies of the role of the Drosophila scs and scs' insulators in defining boundaries of a chromosome puff // Mol. Cell. Biol. 2004. V. 24. P. 14701480.

63. De Laat W., Grosveld F. Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub // Chromosome Res. 2003. V. 11. P. 447-459.

64. Lin Q., Chen Q., Lin L., Zhou J. The Promoter Targeting Sequence mediates epigenetically heritable transcription memory // Genes Dev. 2004. V. 18. P. 2639— 2651.

65. Lindsley D., Zimm G. The genome of Drosophila melanogaster. Academic Press, New York. // 1992.

66. Lutz M., Burke L.J., Barreto G. Transcriptional repression by the insulator protein CTCF involves histone deacetylases //Nucl. Ac. Res. 2000. V. 28. P. 1707-1713.

67. Lutz M., Burke L.J., LeFevre P. et al. Thyroid hormone-regulated enhancer blocking: cooperation of CTCF and thyroid hormone receptor // EMBO J. 2003. V. 22. P. 15791587.

68. Majumder P., Cai H. N. The functional analysis of insulator interactions in the Drosophila embryo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 5223-5228.

69. Mallin D.R., Myung J. S., Patton J. S., Geyer P. K. Polycomb group repression is blocked by the Drosophila Suppressor of Hairy-wing (Su(Hw)) insulator // Genetics. 1998. V. 148. P. 331-339.

70. Mazo A. M., Mizrokhi L. J., Karavanov A. A. et al. Suppression in Drosophila: su(Hw) and su(f) gene products interact with a region gypsy (mdg4) regulating its transcriptional activity // EMBO J. 1989. V. 8. P. 903-911.

71. Melnikova L., Juge F., Gruzdeva N., et al. Interaction between the GAGA factor and Mod(mdg4) proteins promotes insulator bypass in Drosophila // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 14806-14811.

72. Mihaly J., Hogga I., Barges S., Gallon M., Mishra R.K., Hagstrom K., Muller M., Schedl P., Sipos L., Gausz J., Gyurkovics H., Karch F. Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex // Cell. Mol. Life Sci. 1998. V. 54. P. 60-70.

73. Modolell, J., Campuzano S. The achaete-scule complex as an integrating device // Int. J. Dev. Biol. 1998. V. 42. P. 275-282.

74. Moon H., Filippova G., Loukinov D., et al. CTCF is conserved from Drosophila to humans and confers enhancer blocking of the Fab-8 insulator // EMBO Rep. 2005. V. 2. P. 165-170.

75. Muller M., Hangstrom K., Gyurkovics H. et al. The Мер element from the Drosophila melanogaster bithorax complex mediates long-distance regulatory interactions // Genetics. 1999. V. 153. P. 1333-1356.

76. Mutskov V.J., Farrell C.M., Wade P.A. et al. The barrier function of an insulator couples high histone acetylation levels with specific protection of promoter DNA frommethylation // Genes Dev. 2002. V. 16. P. 1540-1554.

77. Mukhopadhyay R., Yu W.-Q., Whitehead J. et al. The binding sites for the chromatin insulator protein CTCF map to DNA methylation-free domains genome-wide // Gen. Res. 2004. V. 14. P. 1594-1602.

78. Muravyova E., Golovnin A., Gracheva E. et al. Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators // Science. 2001. V. 291. P. 495-498.

79. Nabirochkin S., Ossokina M., Heidmann T. A nuclear matrix/scaffold attachment region co-localizes with the gypsy retrotransposon insulator sequence // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 2473-2479.

80. Nash, W., and R. J.Yarkin. Genetic regulation and pattern formation: a study of the yellow locus in Drosophila melanogaster II Genet. Res. 1974. V. 24(1) P. 19-26.

81. O'Hare, K., and G. M. Rubin. Structure of P transposable elements and their sites of insertion and excision in the Drosophila melanogaster genome // Cell. 1983 V. 34 P. 25-35.

82. Oki M., Kamakaka R. T. Blockers and barriers to transcription: competing activities? Curr. Opin. Cell Biol. 2002. V. 14. P. 299-304.

83. Pai C., Lei C., Ghosh D., Corces V. The centrosomal protein CP 190 is a component of the gypsy chromatin insulator // Mol. Cell. 2004. V. 16. P. 737^18.

84. Parkhurst S.M., Harrison D.A., Remington M.P. et al. The Drosophila su(Hw) gene, which controls the phenotypic effect of the gypsy transposable element, encodes a putative DNA-binding protein // Genes Dev. 1988. V. 2. P. 1205-1215.

85. Parnell T. J., Viering M. M., Skjesol A., Helou C., Kuhn E. J., Geyer P. K. An endogenous Suppressor of hairy-wing insulator separates regulatory domains in Drosophila//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 13436-13441.

86. Pirrotta V., Steller H., Bozzetti M. Multiple upstream regulatory elements control the expression of the Drosophila white gene // EMBO J. 1985. V.4. P.3501-3508.

87. Prioleau M.-N., Nony P., Simpson M., Felsenfeld G. An insulator element and condensed chromatin region separate the chicken P-globin locus from an independently regulated erythroid-specific folate receptor gene // EMBO J. 1999. V. 18. P. 4035-4048.

88. Qian S., Varjavand В., Pirrotta V. Molecular analysis of the zeste-white interaction reveals a promoter-proximal element essential for distant enhancer-promoter communication //Genetics. 1992. V.131. P.79-90.

89. Ramos E., Ghosh D., Baxter E., Corces V. Genomic organization of gypsy-like chromatin insulators in Drosophila melanogaster // Genetics. 2006.

90. Recillas-Targa F., Pikaart M.J., Burgess-Beusse В., et al. Position-effect protection and enhancer blocking by the chicken P-globin insulator are separable activities // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 6883-6888.

91. Renaud S., Loukinov D., Bosman F.T. CTCF binds the proximal exonic region of hTERT and inhibits its transcription//Nucl. Ac. Res. 2005. V. 33. P. 6850-6860.

92. Robertson, H. M., C. R. Prestson, R. M. Phillis, D. Johnson-Schlitz, W. K. Benz, W. R. Engels, A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster II Genetics. 1988. V. 118 P. 461-470.

93. Rodin S., Georgiev P. Handling three regulatory elements in one transgene: a new I-Scel recombination system to supplement the Cre/LOX and Flp/FRT // BioTechniques. 2005. V. 39. P. 871-876.

94. Roseman R. R., Johnson E. A., Rodesch С. K., Bjerke M., Nagoshi R. N., Geyer P. K. A P element containing suppressor of Hairy-wing Binding regions has novelproperties for mutagenesis in Drosophila melanogaster // Genetics. 1995. V. 141. P. 1061-1074.

95. Rubin G., Sprandling A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors // Science. 1982. V.218. P.348-353.

96. Rubin, G., Kidwell M., Bingham P. The molecular basis of P-M hybrid dysgenesis: the nature of induced mutations // Cell. 1982. V. 29 P. 987-994.

97. Saitoh N., Bell A.C., Recillas-Targa F. Structural and functional conservation at the boundaries of the chicken D-globin domain // EMBO J. 2000. V. 19. P. 23152322.

98. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual, Ed.2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY // 1989.

99. Sanger F., Nicken S., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V.74. P.5463-5487.

100. Savitskaya E., Melnikova L., Kostuchenko M. et al. Study of long-distance functional interactions between Su(Hw) insulators that can regulate enhancer-promoter communication in Drosophila melanogaster // Mol. Cell. Biol. 2006. V. 26. P. 754-761.

101. Scott K. S., Taubman A. D., Geyer P. K. Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength // Genetics. 1999. V. 153. P. 787-798.

102. Siegal, M. L., Hartl D.L. Application of Cre/loxP in Drosophila. Site-specific recombination and transgene coplacement // Methods Mol. Biol. 2000. V. 136 P. 487495.

103. Sigrist C. J. A., Pirrotta V. Chromatin insulator elements block the silencing ofa target gene by the Drosophila Polycomb Response Element (PRE) but allow trans interactions between PREs on different chromosomes // Genetics. 1997. V. 147. P. 209-221.

104. Sipos L., Gyurkovics H. Long-distance interactions between enhancers and promoters // FEBS J. 2005. V. 272. P. 3253-3259.

105. Smith P. A., Corces V. G. The suppressor of Hairy-wing protein regulates the tissue-specific expression of the Drosophila gypsy retrotransposon // Genetics. 1995. V. 139. P. 215-228.

106. Spana C., Harrison D. A., Corces V.G. The Drosophila melanogaster suppressor of Hairy-wing protein binds to specific sequences of the gypsy retrotransposon // Genes Dev. 1988. V. 2. P. 1414-1423.

107. Spradling, A. C., Stern D. M., Kiss I., Roote J., Laverty T. et al. Gene disruptions using P transposable elements: an integral component of the Drosophila genome project // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995. V. 92. P. 10824-10830.

108. Stogios P. J., Downs G. S., Jauhal J. J. S., Nandra S. K., Prive G. G. Sequence and structural analysis of BTB domain proteins // Genome Biol. 2005. V. 6. P. R82.

109. Szabo P.E., Tang S.-H.E., Silva F.J. et al. Role of CTCF binding sites in the Igf2/H19 imprinting control region // Mol. Cell. Biol. 2004. V. 24. P. 4791- 4800.

110. Tolhuis В., Palstra R. J., Splinter E., Grosveld F., de Laat W. Looping and interaction between hypersensitive sites in the active beta-globin locus // Mol. Cell. 2002. V. 10. P. 1453-1465.

111. Torigoi E., Bennani-Baiti I.M., Rosen C. et al. Chip interacts with diverse homeodomain proteins and potentiates bicoid activity in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 2686-2691.

112. Tower, J., Karpen G. H., Craig N., Spradling A. C. Preferential transposition of Drosophila P elements to nearby chromosomal sites // Genetics. 1993. V. 133. P. 347359.

113. Udvardy A., Maine E., Schedl P. The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains // J. Mol. Biol. 1985. V. 185. P. 341-358.

114. Vazquez J., Schedl P. Sequences required for enhancer blocking activity of scs are located within two nuclease-hypersensitive regions // EMBO J. 1994. V. 13. P. 5984-5993.

115. Vazquez J., Schedl P. Deletion of an insulator element by the mutation facet-strawbeny in Drosophila melanogaster // Genetics. 2000. V. 155. P. 1297-1311.

116. Wai A.W.K., Gillemans N., Raguz-Bolognesi S. et al. HS5 of the human p-globin locus control region: a developmental stage-specific border in erythroid cells // EMBO J. 2003. V. 22. P. 4489- 4500.

117. Wei W., Brennan M. D. The gypsy insulator can act as a promoter-specific transcriptional stimulator// Mol. Cell. Biol. 2001. V. 21. P. 7714-7720.

118. West A.G., Huang S., Gaszner M. et al. Recruitment of Histone Modifications by USF Proteins at a Vertebrate Barrier Element // Mol. Cell. 2004. V. 16. P. 453463.

119. West, A.G., Gaszner M., Felsenfeld G. Insulators: many functions, many mechanisms // Genes Dev. 2002. V. 16. P. 271-288.

120. West, A. G., Fraser P. Remote control of gene transcription // Hum. Mol. Genet. 2005. V. 14. P. 101-111.

121. Xu Q., Li M., Adams J., Cai H.N. Nuclear location of a chromatin insulator in

122. Drosophila melanogaster//J. Cell Sci. 2004. V. 117. P. 1025-1032.

123. Yang Y., Quitschke W.W., Vostrov A.A., Brewer G.J. CTCF is essential for up-regulating expression from the amyloid precursor protein ptomoter during differentiation of primary hippocampal neurons // J. of Neurochem. 1999. V. 73. P. 2286-2298.

124. Yu W., Ginjala V., Pant V. et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates CTCF-dependent chromatin insulation // Nat. Genet. 2004. V. 36. P. 1105-1110.

125. Yusufzai T.M., Felsenfeld G. The 5'-HS4 chicken p-globin insulator is a CTCF-dependent nuclear matrix-associated element // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 8620-8624.

126. Yusufzai T.M., Tagami H., Nakatani Y., Felsenfeld G. CTCF tethers an insulator to subnuclear sites, suggesting shared insulator mechanisms across species // Mol. Cell. 2004. V. 13. P. 291-298.

127. Zhang, P., Spradling A. C. Efficient and dispersed local P element transposition from Drosophila females // Genetics. 1993. V. 133 P. 361-373.

128. Zhao K., Hart С. M., Laemmli U. K. Visualization of chromosomal domains with boundary element-associated factor BEAF-32 // Cell. 1995. V. 81. P. 879-889.

129. Zhou J., Barolo S., Szymanski P. et al The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 3195-3201.

130. Zhou J., Ashe H., Burks C. et al. Characterization of the transvection mediating region of the Abdominal-B locus in Drosophila // Development. 1999. V. 126. P. 3057-3065.