Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Обнаружение и изучение нового инсулятора у Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика
Автореферат диссертации по теме "Обнаружение и изучение нового инсулятора у Drosophila melanogaster"
На правах рукописи УДК 577 214 4 575 22
Четверина Дарья Александровна
Обнаружение и изучение нового инсулятора
у онохорниа меьамосаятен
Специальность 03 00 26 - молекулярная генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
003 16613 1
Москва 2008
003166131
Работа выполнена в лаборатории Регуляции генетических процессов Института биологии гена РАН
Научный руководитель: академик РАН, доктор биологических наук,
профессор П Г Георгиев
Официальные оппоненты, доктор биологических наук Е Н Набирочкина кандидат биологических наук Ю Я Шевелев
Ведущая организация. Институт биоорганической химии им ММ Шемякина и Ю А Овчинникова РАН
Защита диссертации состоится (€ л/г^г^^- в -/У часов на заседании
Диссертационного совета Д 002 037 01 при Институте биологии гена РАН по адресу 119334, Москва, ул Вавилова, д 34/5
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, д 32
Автореферат разослан /г ¿¿>а?г
Ученый секретарь диссертационного совета канд фарм наук
Грабовская
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы Геном эукариот обеспечивает сложнейшие программы развития и клеточной дифференцировки Эти программы осуществляются за счет четкой, последовательной активации и инактивации множества генов, белковые продукты которых взаимодействуют друг с другом На современном этапе развития молекулярной генетики и смежных с ней наук изучение принципов экспрессии генов является одной из важнейших задач За последние годы было накоплено много информации о нуклеотидной последовательности ДНК различных организмов Однако данные о нуклеотидной последовательности генома практически ничего не сообщают о роли отдельных последовательностей в регуляции экспрессии генов В настоящее время важной задачей является идентификация последовательностей, вовлеченных в регуляцию транскрипции Анализ возможностей и роли внутригеномных последовательностей несомненно необходим для понимания принципов контроля и поддержания экспрессии генов Это определяет актуальность таких работ в настоящее время
Тканеспецифичная и различающаяся на разных стадиях развития организма активация транскрипции генов высших эукариот зависит от активного статуса цис-регуляторных ДНК-элементов промотора гена, на котором собираются белки основного транскрипционного комплекса, и энхансера, который, посредством регуляторных белков, усиливает транскрипцию гена
Энхансеры высших эукариот способны активировать гены на больших расстояниях, достигающих нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов Эти регуляторные элементы действуют вне зависимости от положения относительно направления транскрипции гена Существует несколько моделей функционирования энхансеров, большинство из них предполагает, что белки, связанные с энхансером, непосредственно взаимодействуют с белками, собранными на промоторе, а ДНК между ними выпетливается Энхансеры практически не обладают специфичностью действия, следовательно, у высших эукариот должны были выработаться механизмы, контролирующие и ограничивающие способность энхансеров к активации генов, направляющие энхансер на активирование только определенного промотора, и, таким образом, определяющие специфичность его действия
Помимо энхансеров, активирующих экспрессию генов, в геноме был найден другой класс регуляторных элементов, репрессирующих транскрипцию, - сайленсеры Сайленсеры репрессируют транскрипцию генов, и так же, как и энхансеры, они действуют вне
зависимости от их положения относительно направления транскрипции гена и не обладают специфичностью действия
Предполагается, что важная роль в контроле специфичности действия энхансеров и сайленсеров принадлежит еще одному типу регуляторных ДНК элементов - инсуляторам Инсуляторы блокируют активность энхансера (сайленсера), но это происходит только в том случае, если инсулятор находится между энхансером (сайленсером) и промотором гена При этом инсуляторы не влияют непосредственно на активность энхансера, сайленсера и промотора энхансер (сайленсер) сохраняет способность влиять на незаблокированный инсулятором промотор, а промотор может быть активирован (репрессирован) другим энхансером (сайленсером) В настоящее время, несмотря на достаточно большое количество предложенных моделей действия инсуляторов, детальный механизм их функционирования остается неизвестным
Большой прогресс в выяснении принципов работы инсуляторов стал возможен в результате использования трансгенных модельных систем с репотерными генами и энхансерами Одна из популярных трансгенных систем включает использование гена mim-white (модифицированного гена white, белковый продукт которого необходим для пигментации глаз у Drosophila melanogaster) и его тканеспецифичный энхансер Однако даже хорошо изученная модельная система может преподнести «сюрпризы»
Данная работа посвящена обнаружению и изучению эхансер-блокирующей активности нового инсулятора, названного нами Wari (от White-Xbuitmg Resident Insulator - инсулятор, сопутствующий гену white) В геноме этот инсулятор находится между расположенными друг за другом генами white и CG32795 и присутствует во всех модельных системах, использующих ген mini-white Выявлена зависимость энхансер-блокирующей активности от наличия двух инсуляторов, один из которых или оба представлены Wan-инсулятором Продемонстрировано, что взаимодействие Wari-инсулятора с другими инсуляторами может реализовываться как в усилении инсуляции, так и в ее «нейтрализации»
Цель и задачи исследования Основной целью работы явилось изучение энхансер-блокирующих свойств нового инсулятора (названного впоследствии Wari), обнаруженного между генами white и CG32795 у D melanogaster В работе были поставлены следующие задачи
1) Подтвердить присутствие инсулятора за геном white у D melanogaster
2) Выяснить возможность влияния Wari-инсуляторэ на активность других инсуляторных
элементов
3) Выявить функциональную область \Уап-инсулятора
4) Проверить, входит ли в состав Wari-инсулятора промотор гена CG32795
Научная новизна и практическая ценность работы В работе впервые показано наличие инсулятора между генами white и CG32795 Продемонстрировано, что Wari-инсулятор влияет на энхансер-блокирующую активность других инсуляторов Wari (своей второй копии) и двух Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторов, Su(Hw) и 1А2 Показано, что энхансер-блокирующая активность Wari-инсулятора не связана с инсуляторными белками Su(Hw), Mod(mdg4)-67 2 Полученные данные позволили сделать модельную систему более «чистой» (удаление Wan-инсуляторэ из модельной системы позволяет избежать его влияния) и проанализировать энхансер-блокирующую активность Su(Hw)-3aBHCiiMbix инсуляторов, Su(Hw) и 1А2, в отсутствие Wari-инсулятора Результаты данной работы расширяют представление о регуляторных элементах с энхансер-блокирующими свойствами и позволяют по-новому взглянуть на механизм действия инсуляторов, опровергая упрощенные модели их функционирования
Апробация работы Результаты диссертационной работы были представлены на 10-й международной конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), на международных конференциях Meeting ot International Research Scholars HHMI (Menda, Mexico, 2005), Workshop on Molecular and Cell Biology at Spetsai (Spetses, Greece, 2006), 41'1 Elmau conference on nuclear organization, EMBO (Gosau, Austria, 2006), 48th Annual Drosophila Research Conference (Philadelphia, PA, 2007), 7th Young Scientist Foium and 32nd FEBS Congress (Vienna, Austria, 2007), Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Kyiv, Ukraine, 2007)
Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ Из них статей — 2, тезисов устных и стендовых сообщений на конференциях - 7
Структура и объем работы Диссертация изложена на 127 страницах, содержит 27 рисунков и 3 таблицы, состоит из Введения, Обзора литературных данных, Материалов и методов, Результатов исследования, Обсуждения, Выводов и Списка литературы, включающего 138 источников
Содержание работы
ГЛАВА I. Новый инсулятор обнаружен непосредственно за геном white
Для создания трасгенных конструкций во многих лабораториях мира часто используют плазмидный вектор pCaSpeR Он содержит ген mini-white между 5' и З'-концами Р-элемента, включающими концевые инвертированные повторы, необходимые для интеграции конструкции в геном Drosophila melanogaster После кодирующей части гена mmi-white данный вектор содержит последовательность ДНК генома Drosophila melanogaster длиной почти 1 т п н (Рис 1) В геноме эта последовательность находится между расположенными друг за другом генами white и CG32795 В нашей лаборатории при изучении роли инсуляторов (их свойства блокировать энхансеры) время от времени появлялись данные, позволяющие предположить возможность существования за геном mini-white, используемого в качестве репортерного гена в трансгенных конструкциях, инсулятор-подобного элемента Таким образом, первой задачей настоящего исследования было выяснение присутствия инсулятора за геном mim-white.
Рис 1 Схематичекое изображение плазмидного вектора pCaSpeR Отмечен 825 п н фрагмент, тестируемый на энхансер-блокирующую активность Цифрами обозначены первый и последний нуклеотиды тестируемого фрагмента относительно старта транскрипции гена mini-white Белые прямоугольники обозначают некодирующие области гена mim-white, черные - кодирующие области гена mini-white, заштрихованные - концы Р-элемента
Чтобы проверить даное предположение, мы использовали стандартную тест-систему, содержащую ген mini-white и его тканеспецифичный энхансер Ген mim-white представляет собой ген white, у которого делетирована значительная часть первого интрона Ген white отвечает за пигментацию глаз, он находится под контролем тканеспецифичного энхансера, обеспечивающего высокую экспрессию гена white в глазах мух (Ееп. далее энхансер глаз) Энхансер глаз гена white способен активировать экспрессию гена mini-white Уровень экспрессии гена mim-white легко оценивать фенотипически по пигментации глаз красная окраска является пигментацией глаз мух дикого типа (энхансер-зависимая экспрессия гена mim-white), желтая и темно-желтая окраски представляют собой средне-статистическое
Тестируемый фрагмент
mini-white
+3048О— -И +3872
■дшмп
проявление базовой пигментации (экспрессия гена mini-white в отсутствие энхансера), белая окраска глаз наблюдается в отсутствие пигментации (у мух с инактивированным геном mim-white)
Для тестирования на инсуляцию был выбран ДНК-фрагмент длиной 825 п н (далее «825 п н ДНК-фрагмент») из плазмидного вектора pCaSpeR, включающий участок геномной ДНК, в том числе сигнал полиаденилирования гена mini-white и 50 п н из Р-элемента (Рис 1) Этот ДНК-фрагмент был фланкирован сайтами FRT для сайт-специфической рекомбиназы Flp Индукция сайт-специфической рекомбинации между FRT-сайтами позволяет удалить фланкированный этими сайтами участок in vivo, в результате можно сравнить экспрессию гена mini-white в присутствии и в отсутствие тестируемого фрагмента в одном и том же месте генома 825 п н ДНК-фрагмент, фланкированый сайтами FRT, был вставлен между энхансером глаз гена white и геном mint-white (рис 2А) Оказалось, что пигментация глаз трансгенных линий мух, несущих такую конструкцию, находится в диапазоне от Оранжевого до Коричневого (рис 2А) Такая пигментация значительно меньше, чем при энхансер-зависимой экспрессии гена mini-white Такой результат позволил предположить, что активность энхансера скорее всего существенно заблокирована вставленной между геном и энхансером 825 п н ДНК-последовательностью Это предположение было подтверждено делецией встроенного между сайтами FRT тестируемого ДНК-фрагмента Делеция (Afrt) восстановила активацию гена энхансером, пигментация глаз стала Коричневой или Красной (рис 2А) Таким образом, тестируемый фрагмент способен предотвращать активацию промотора гена mini-white энхансером глаз
Способность тестируемого 825 п н ДНК-фрагмента предотвращать активацию генов энхансерами была подтверждена и в системе с двумя маркерными генами содержащей, кроме энхансера глаз и гена mini-white, ген yellow и его тканеспецифичные энхансеры (рис 2Б) Ген yellow отвечает за пигментацию кутикулярных структур личинки и имаго и находится под контролем нескольких тканеспецифичных энхансеров В данной конструкции присутствовали энхансеры, определяющие экспрессию гена yellow в кутикуле тела и в крыловых пластинках (далее энхансеры тела (Веп) и крыльев(\Уеп)) Изменения в экспрессии гена yellow, так же как и гена mini-white, легко оценивать фенотипически уровень пигментации кутикулярных структур оценивается по пятибалльной шкале, где 5 соответствует уровню пигментации дикого типа (энхансер-зависимая экспрессия гена yellow), 2 соответствует базовому уровню пигментации (экспрессия гена yellow в отсутствие энхансера), 1 соответствует отсутствию
пигментации (у1 аллель - полная инактивация гена yellow), 3 и 4 - частичная активация энхансерами базовой транскрипции.
fit fit
\White ....._
КртКор Кор тОр Ор тЖ Ж сЖ из/пр
Дfit
16 5 4
14............7...............5
16 16/16
* —►
825 h шшт mini-white
Yen,,
White
5 4 3 2 1 Из/Пр КртКор Кор тОр Ор тЖ Ж сЖ ш/пР
7 6 2
15
2 5 6 2
15
Рис. 2. Энхансер-блокирующая активность 825 п.н. ДЫК-фрагмента. А) Блокирование энхансера глаз гена white. Б) Блокирование энхансеров тела и крыльев гена yellow и одновременно энхансера глаз гена white.
Сверху представлена схема конструкции, под схемой суммированы результаты по фенотипам трансгенных линий мух, несущих эту конструкцию. Обозначения: Ее„ - энхансер глаз гена mini-white; We„ - энхансер крыльев гена yellow, Ben - энхансер тела гена yellow, серый и белый прямоугольники с горизонтальными стрелками сверху - гены yellow и mini-white, соответственно; горизонтальными стрелками указано направление транскрипции генов. Вертикальными стрелками отмечены сайты frt для сайт-специфической рекомбиназы Flp. Пигментация глаз, зависящая от уровня экспрессии гена mini-white: Кр - красный; тКор -темно-коричневый; Кор — коричневый; тОр - темно-оранжевый; Ор - оранжевый; тЖ -темно-желтый; Ж - желтый; сЖ - светло-желтый, Б - белый. Пигментация тела и крыльев, зависящая от уровня экспресии гена yellow. 1 — отсутствие пигментации; 5 — уровень пигментации, соответствующий энхансер-зависимой экспрессии гена; 2-4 - промежуточные уровни. Цифры в строках - число линий с соответствующей пигментацией. Из/Пр -отношение числа линий, в которых наблюдалось изменение (Из) пигментации при удатении исследуемого элемента, к общему числу проанализированных (Пр) линий.
Ген yellow был встроен перед геном mini-white. Перед промотором гена yellow находились энхансеры тела и крыльев. Между ними был встроен энхансер глаз гена white (Ееп). Исследуемый 825 п.н. ДНК-фрагмент был встроен между группой энхансеров и промотором гена yellow в положение -893 относительно начала транскрипции гена yellow.
При инсерции данной конструкции в геном Drosophila melanogaster энхансеры тела и крыльев гена yellow практически не активировали ген yellow (рис 2Б), т е энхансеры были заблокированы 825 п н ДНК-фрагментом Как и в первой конструкции, энхансер глаз гена mini-white также был заблокирован 825 п н ДНК-фрагментом Таким образом, 825 п н ДНК-фрагмент способен блокировать как энхансер глаз гена mim-white, так и энхансеры тела и крыльев гена yellow
Однако на основе полученных на данном этапе результатов невозможно утверждать, что 825 п н ДНК-фрагмент, расположенный за геном mini-white, является инсулятором, так как таким же эффектом на уровень транскрипции может обладать и сайленсер Как известно, инсуляторы ограничивают активность энхансеров в зависимости от взаимного расположения регуляторных элементов Блокирование энхансера происходит только в том случае, если инсулятор находится между энхансером и промотором гена Активность же сайленсера не обладает позиционной зависимостью Таким образом, чтобы однозначно ответить на вопрос, является ли 825 п н ДНК-фрагмент инсулятором, необходимо было выяснить, меняется ли уровень транскрипции в случае, если 825 п н ДНК-фрагмент находится не между энхансером и промотором, а с любой другой стороны от энхансер-промоторной пары Для этого были созданы 2 конструкции, аналогичные конструкции, приведенной на рис 2Б, но в одной из них 825 п н ДНК-фрагмент был встроен перед энхансерами (рис ЗА), а в другой - в интрон гена yellow (рис ЗБ)
825 п н ДНК-фрагмент был окружен LOX-сайтами для сайт-специфической рекомбиназы Сге Аналогично FRT-FIp-системе, индукция сайт-специфической рекомбинации между LOX-сайтами позволяет in vi\o удалить фрагмент, расположенный между этими сайтами Энхансеры тела и крыльев гена yellow и встроенный между ними энхансер глаз были окружены FRT-сайтами Пигментация глаз трансгенных линий мух, несущих конструкцию с 825 п н ДНК-фрагментом, встроенным перед энхансерами, не была нарушена (рис ЗА) В присутствии и в отсутствие (Д1ох) 825 п н ДНК-фрагмента способность энхансеров активировать гены yellow и num-white была одинаковой То, что энхансеры в такой конструкции активны, было дополнительно подтверждено их делецией (Afrt) При делеции энхансеров пигментация глаз, тела и крыльев соответствовала базовому уровню экспрессии генов Таким образом, 825 п и ДНК-фрагмент, находящийся перед энхансерами, никак не влиял на уровень транскрипции
В случае, если 825 п и фрагмент находился внутри интрона гена yellow (рис ЗБ), энхансеры гена yellow эффективно стимулировали ген yellow Энхансер глаз гена white был практически полностью заблокирован тестируемым фрагментом, что и должно наблюдаться,
если тестируемый фрагмент является инсулятором, так как он расположен между энхансером глаз и стимулируемым этим энхансером геном mini-white (рис. ЗБ). Как и ожидалось, делеция тестируемого фрагмента (Д1ох) не изменила уровня экспрессии гена yellow, однако восстанавила способность энхансера глаз активировать ген mini-white (рис. ЗБ).
А
-г"п
lox lox jrt
Мох A/ri Д lox Дjrt
6 t* 6
2 4 2 4
-►
тНШЕЙШЖ" mini-white
5 4 3 2 1 Из/Пр КртКор Кор гОр Op тЖ Ж сЖ Из/Пр
6 0/6 6/6 6/6
1-»•
1 h шг 825 ЦП гу-: - ^ . ■■ •■■ 1
L ,
Hfg||H№iliH
mini-white
Yelïoi - .... White . -
5 4 3 2 1 Из/Пр КртКор Кор тОр Ор тЖ Ж сЖ Из/пР
A lox
I
7 1
111J
5 3
0/8
La... з..........2
Рис. 3. Энхансер-блокирующая активность 825 п.н. ДНК фрагмента. А) 825 п.н. ДНК-фрагмент встроен перед энхансерами. Б) 825 п.н. фрагмент встроен в интрон гена yellow. Обозначения: вертикальными стрелками отмечены сайты lox и fit для сайт-специфических рекомбиназ Сге и Flp, соответственно. Остальные обозначения как на рис. 2.
Таким образом, можно однозначно утверждать, что элемент, расположенный за геном white в геноме Drosophila melanogaster, обладает энханеер-блокирущщей активностью: он способен предотвращать активацию генов энхансерами, только если расположен между энхансером и промотором гена. Было решено дать протестированному 825 п.н. ДНК-фрагменту название Wari (White-Abutting Resident Insulator). Далее этот 825 п.н. ДНК-фрагмент будет называться Wari-инсулятором.
ГЛАВА II Влияние Wari-инсулятора на активность пнсуляторных элементов
1) Влияние Wari-ннсулятора на энхансер-блокирующую активность своей второй копии, Su(Hw)- и 1А2-инсуляторов; усиление инсуляции.
Необходимо отметить, что в экспериментах, изложенных в Главе I, одновременно присутствовали сразу две копии Wari-инсулятора одна - тестируемая, вторая -расположенная за геном mini-while
Ранее для некоторых инсуляторов было продемонстрировано, что они способны функционально взаимодействовать между собой Такие взаимодействия могут приводить либо к усилению, либо к «нейтрализации» инсуляции (к неспособности инсуляторов блокировать энхансеры) Вполне возможно, что два Wari-инсулятора тоже могут взаимодействовать друг с другом
Поэтому следующей задачей стало выяснение влияния копии Wari-инсулятора, находящейся за геном mini-wlute, па энхансер-блокирующую активность тестируемого Wari-инсулятора
Для этого была создана конструкция, аналогичная используемым ранее (рис 2Б и рис 3), но отличающаяся тем, что с З'-стороны гена mini-white была делегирована последовательность, соответствующая Wari-инсулятору, (на рисунках такая делеция обозначена как WA) и заменена на точно такую же, но фланкированную LOX-сайтами (на рисунках обозначена как WA(Wari)) Второй Wari-инсулятор, окруженный FRT-сайтами, был встроен между группой энхансеров (Wen, Ве„ - энхансеры гена yellow, Ее„ - энхансер гена mmi-white) и промотором гена yellow в положении -893 относительно старта транскрипции гена yellow (рис 4)
Пигментация глаз, тела и крыльев трансгенных линий мух, несущих такую конструкцию [En(Wan)YWA(Wari)], была на уровне или чуть выше уровня базовой экспрессии генов yellow и mim-white Делеция Wari-инсулятора, находящегося за геном mini-white [En(Wari)YWA], привела к значительному усилению пигментации глаз, тела и крыльев мух, т е один Wari-инсулятор, расположенный между энхансерами и промотором гена yellow, слабо блокировал активацию генов энхансерами (рис 4) Делеция Wari-инсулятора, расположенного между энхансерами и промотором гена yellow [EnYWA(Wari)], так же как и делеция обоих Wari-инсуляторов [EnYWA], привела к полному восстановлению энхансер-зависимой активации
генов: пигментация глаз, тела и крыльев мух соответствовала пигментации мух дикого типа (рис. 4).
Таким образом, Wari-инсулятор, находящийся за геном mini-white, необходим для эффективного блокирования энхансеров Wari-инсулятором, находящимся между энхансерами и промотором гена yellow.
Этот результат отражает наличие функционального взаимодействия между двумя Wari-инсуляторами. Как говорилось выше, такое функциональное взаимодействие было показано для других инсуляторов. Наиболее вероятно, что происходит физическое взаимодействие между двумя Wari-инсуляторами, приводящее к выпетливанию участка ДНК между инсуляторами, более эффективно изолируя промоторы генов от энхансеров.
/-"Ч 1
ГЕепЩЬ Wari IT щшш _____ _______________J
mini-white
En(Wari)YWA(\Vari) En(w ari EnYWA(v\'ari) EnYWA
frt frt
Yelio, , 5 4 3 2 1
Ol
lT 3 5l0| 6~~9
lox '
lox
White
Из/пр Kp тКор Кор т()р Op тЖ Ж сЖ
15 14/15 15/15 15/15
Oil
2 4 J. 1 4
з 4 "4 2 1
3 4 J 3 1.1
Ш/Пр
14 10/14 14/14 14/14
Рис. 4. Влияние Wari-инсулятора, расположенного за геном mini-white, на энхансер-блокирующую активность Wari-инсулятора, расположенного между энхансером и промотором: усиление инсуляции. Обозначения: черный семиугольник - инсулятор Wari. Сокращения в названиях линий: En - энхансеры тела и крыльев гена yellow и энхансер глаз гена white; Y - ген yellow; W - ген white; элементы, заключенные в скобки, фланкированы сайтами frt или lox, символом Д обозначена делеция Wari-инсуляторэ за геном mini-white. Серым курсором на цифровой панели указано среднее значение фенотипа в анализируемых линиях мух. Остальные обозначения как на рис. 2.
Полученные данные о таком сильном эффекте второй копии Wari-инсуляторэ привели к закономерному вопросу о возможности влияния Wari-инсулятора,расположенного за геном mini-white, на энхансер-блокирующую активность других инсуляторов. Для ответа на это вопрос были выбраны два хорошо изученных инсулятора: Su(Hw)-HHcyjwTop из ретротранспозона МДГ4 и 1 А2-инсулятор. Активности обоих инсуляторов зависят от ДНК-связывающего белка Su(Hw).
Были созданы две аналогичные предыдущей (рис. 4) конструкции: одна - с Su(Hw)-инсулятором (рис. 5А), вторая - с 1 А2-инсулятором (рис. 5Б). Su(Hw)- и 1 А2-инсуляторы, как и Wari-инсулятор в предыдущей конструкции, были встроены между группой энхансеров и промотором гена yellow в положение -893 относительно старта транскрипции гена yellow.
(En)(Su)YVV'A(\Vari) (En)(Su)YW1 (Su)YWa
j
fit Yeiio,
S 4 3 2
s
1 8J2 311
White
Из/Пр КртКор Кор тОр Op тЖ Ж сЖ Б 31
6 7 A4 4
9/31 0/31
2 5 1
11 2.......21
6 7 14 2 2
И 5/Пр
31
11/31 2/31
Ye Ih, White
5 4 3 2 1 Из/Нр КртКор Кор тОр Ор тЖ Ж сЖ Б Из/Пр
En( 1 A2)YW (wan) En(lA2)YWA EnYWA(wari)
10 4
[ 3 To 1 Г 5
14
6/14 14/14
4 7_2 1
2 4 J Ü 3
14 8/14 14/14
Рис. 5. Влияние Wari-инсулятора, расположенного за геном mini-white, па проявляемую Su(Ihv)-niicyflHтором (А) и 1А2-инсулятором (К) энхансер-блокирующую активность: усиление инсуляции. Обозначения как на рис. 4. Вертикальные стрелки с символом «see» обозначают сайты эндонуклеазы рестрикции Seel.
Активность энхансеров в трансгенных линиях мух, несущих данные конструкции, была полностью заблокирована в ситуации с 8и(Н\у)-инсулятором (рис. 5А, f(En)(Su)VWA(Wari)]) и практически полностью заблокирована в ситуации с 1 А2-инсулятором (рис. 5Б, [En( 1 A2)YWA(Wari)]).
При делеции Wari-инсулятора наблюдалось значительное падение энхансер-блокирующей активности Su(Hw)- и 1 А2-инсуляторов (рис. 5A, [(En)(Su)YW ] и рис. 5Б, [En( 1 A2)YWa]) как для гена mini-white, так и rem yellow.
Таким образом, показано, что Wari-инсулятор, находящийся за геном mini-white, влияет на энхансер-блокирующую активность Su(Hw)- и 1А2-инсуляторов, находящихся меяеду энхансерами и промотором гена yellow, усиливая инсуляцию
2) Влияние Wari-инсулятора на энхансер-блокирующую активность Wan-, Su(Hw)-и 1А2-инсуляторов, «нейтрализация» инсуляции
Как было сказано выше, функциональные взаимодействия между инсуляторами могут приводить к «нейтрализации» инсуляции
Поэтому следующей задачей было выяснение возможности проявления функциональных взаимодействий между Wari-ннсулятором и Wari-, Su(Hw)- и 1А2-инсуляторами в эффекте «нейтрализации» инсуляции.
В других работах нашей лаборатории эффект нейтрализации инсуляции наблюдался, если два инсулятора находились между энхансером и промотором на расстоянии в несколько тысяч пар нуклеотидов друг от друга
Были созданы три конструкции, в которых попарно тестировалась способность инсуляторных элементов к нейтрализации Wari-Wari, Wari-Su(Hw), 1A2-Wan Один из инсуляторов был встроен между энхансерами и промотором гена yellow, а другой инсулятор, фланкированный LOX-сайтами, был встроен между генами yellow и mini-white (рис 6) Расстояние между инсуляторами составляло около 5 т п н
Оказалось, что, если между энхансером глаз и геном mini-white находились два инсулятора (один из которых Wari-), то во всех трех конструкциях экспрессия гена mini-white была на более высоком уровне, чем в случае, когда присутствовал только один инсулятор (рис 6) Более высокий уровень экспрессии гена mim-white в линиях с двумя инсуляторами отражает стимуляцию промотора гена mini-white энхансером глаз, присутствующим в конструкции EnWariY(Su)W\ так как удаление этого энхансера приводило к резкому падению экспрессии (конструкция EnAeWanY(Su)WA , рис 6Б) В то же время, экспрессия гена yellow не зависела от присутствия инсулятора между генами yellow и mini-white
Ее»
: I_"
Wari И шш h Wari Г mini-whiteА
EnWari Y(Wari)WA En\VariYWA
Б
Yell,,«
5 4 3 2 1 2 15 2 6~ 4
lox lox
Whin.
H i Up Kp тКор Кор тОр Op тЖ Ж сЖ Из/Пр
.....1.....1
12 1/12
1 5 2
3 3_3 3
12
8/12
fit fit
EnwariY(Su)WA
EnAe\VariY(Su)WA
EnwariYWA
в
j
Yelb,
5 4 3 2 1
4 J 1
4J 1
41 li
lox lox
White
Из/Пр Kp тКор Кор тОр Op тЖ Ж сЖ
12 0/12 0/12
12 3 3 4
4_5 2 3 1
Из/Пр 12 11/12 8/12
Enl A2Y(\vari)W EnlA2YWA ^
Yell,,,.
5 4 3 2 1 1 П 3
ЗЦТ
White
Из/Пр КртКор Кор тОр Ор тЖ Ж сЖ Б Из/Пр
16 2 2 3_6 21 16
2/16 13 6Z4 2 1] 11/16
Рис. 6. Влияние \¥ап-инсулятора на проявляемую другим Wal•¡-иIIcyлятopoм (А), 8и(1Ьу)-инсулигором (Б) и 1А2-инсулятором (В) энхансер-блокирующую активность: «нейтрализация» инсуляции. Обозначения как на рис. 5. ЕпЛе обозначает делецию энхансера глаз.
Таким образом, инсулятор, расположенный между генами yellow и mini-white, «нейтрализует» инсулятор, расположенный между энхансерами и промотором гена yellow в отношении энхансера глаз гена mini-white. Эффект «нейтрализации» инсуляции отражает наличие функциональных взаимодействий между инсуляторами. Наиболее вероятно, что инсуляторы физически взаимодействуют между собой, что, в свою очередь, приводит к
выпетливанию ДНК гена yellow, сближая, таким образом, энхансер глаз с промотором гена mmi-white В то же время, промотор гена yellow остается заблокирован инсулятором
Таким образом, функциональные взаимодействия между парами инсуляторов Wari-Wari, Wari-Su(Hw) и 1A2-Wari могут проявляться в эффекте «нейтрализации» инсуляции В нашем случае это происходит, когда оба инсулятора находятся между энхансерами и промотором гена на расстоянии 5 т п н друг от друга
3) Wari-инсулятор отличается от других найденных ранее инсуляторов
Так как инсуляторы осуществляют свои функции посредством специфических ДНК-связывающих белков, то закономерен вопрос с помощью каких белков осуществляется энхансер-блокирующая активность Wan-инсулятора и с помощью каких белков реализуется взаимодействие Wan-инсуляторэ с инсуляторами Su(Hw) и IA2 Однако анализ ДНК-последовательности Wan-инсулятора не выявил сходств ни с ДНК-последовательностями Su(Hw)- и 1А2-инсуляторов, ни с ДНК-последовательностями других регуляторных элементов, обладающими энхансер-блокирующими активностями Тестирование ДНК-последовательности Wan-инсулятора на наличие уже известных консенсусов сайтов связывания также не дало результатов используемая нами программа TRANSFAC(R) Professional г10 2 не выявила сайтов связывания для известных ДНК-связывающих инсуляторных белков Su(Hw), dCTCF, GAGA, Zw5 Этот факт отличает Wari-инсулятор от других обнаруженных инсуляторных элементов, таких как scs-инсулятор, Fab6, Fab-8 и Мер, 8и(Н\у)-инсулятор, 1А2-инсулятор, других 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов Но так как отсутствие консенсуса сайта связывания для белка не является доказательством неспособности этого белка связываться с последовательностью ДНК, то было решено дополнительно проверить, могут ли самые распространенные инсуляторные белки, а именно Su(Hw) и dCTCF, быть вовлечены в энхансер-блокирующую активность Wan-инсулятора
С использованием метода торможения ДНК-белковых комплексов в геле Wari-инсулятор был протестирован на способность связываться с белками Su(Hw) и dCTCF Белки Su(Hw) и dCTCF получали т vitro с помощью системы сопряженной транскрипции-трансляции В качестве положительного контроля были использованы 1А2-инсулятор, который имеет 2 сайта связывания белка Su(Hvv), и Fab8, который имеет 2 сайта связывания белка dCTCF В то время как белок Su(Hw) связывался с последовательностью ДНК инсулятора 1А2, а белок dCTCF связывался с последовательностью ДНК инсулятора Fab8, связывания этих белков с последовательностью ДНК Wan-инсулятора не наблюдалось
Следовательно, эти белки, по крайней мере т vitro, в отсутствие каких-либо дополнительных факторов, не связываются с последовательностью ДНК Wari-инсулятора
Эксперименты с линиями мух с мутациями в генах su(Hw) и mod(mdg4)imiKs. не выявили участия белков Su(Hw) и Mod(mdg4)-67 2 в энхансер-блокирующей активности Wari-инсулятора Белок Mod(mdg4)-67 2 является вторым белковым компонентом инсуляторного комплекса 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов, он связывается непосредственно с белком Su(Hw) и так же, как и белок Su(Hw), необходим для энхансер-блокирующей активности инсуляторов Su(Hw) и 1А2 В данной работе были использованы линии со следующими мутациями mod(mdg4)ui - мутация гена mod(mdg4), представляющая собой вставку ретротранспозона Stalker в третий экзон гена, в результате чего у белка Mod(mdg4)-67 2 отсутствует С-концевой домен, отвечающий за взаимодействие с белком Su(Hw), su(Hw)v - делеция локуса su(Hw), приводящаяся к полному отсутствию белка Su(Hw), sa(Hw)^ - инсерция мобильного элемента jockey в первый интрон, приводящая к десятикратному снижению экспрессии гена su(Hw)
Были проанализированы девять независимых линий мух, несущих мутации генов su(Hw)v/su(Hw)2 и mod(mdg4)"¡/mod(mdg4)ul и содержащих конструкцию, в которой два Wan-инсулятора фланкировали гены yellow и mim-whue (рис 4) Оказалось, что данные мутации никак не влияют на энхансер-блокирующую активность Wari-инсулятора Следовательно, белки Su(Hw) и Mod(mdg4)-67 2 не нужны для энхансер-блокирующей активности Wari-инсулятора
Таким образом, белки, отвечающие за энхансер-блокирующую активность Wari-инсулятора, и белки, посредством которых реализуется способность Wari-инсулятора взаимодействовать с инсуляторами Su(Hw) и 1А2, еще предстоит открыть Пока можно лишь утверждать, что Wari-инсулятор отличается от ранее обнаруженных инсуляторов ДНК-связывающимн белковыми компонентами, а также, что энхансер-блокирующая активность Wari-инсулятора не связана с ннсуляторными белками Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2.
ГЛАВА III Выявление функциональной области Wari-инсулятора
В геноме Drosophila melanogaster Wari-инсулятор находится между генами white и CG32795, в непосредственной близости от предсказанного начала транскрипции гена CG32795 и включает сигнал полиаденилирования гена white
Было решено более детально проанализировать 825 и н Wan инсулятор и выявить функциональную область \Уап-инсулятора.
Для сокращения функциональной области Wan-инсулятора за основу была взята тест-система с двумя маркерными генами, использованная нами для тестирования Wan-инсулятора на энхансер-блокирующую активность (рис 2Б и рис 7А), но, в отличие от предыдущей системы, энхансер глаз был фланкирован сайтами FRT для сайт-специфической рекомбиназы Яр с целью более четкого контроля активности энхансера глаз Исследуемые фрагменты Wan-инсулятора были фланкированы LOX-сайтами и встроены между энхансерами и промотором гена yellow в положение -893 относительно начала транскрипции гена yellow (рис 7А)
Для определения функциональной области Wan-инсулятора, соответствующей меньшей длине ДНК-последовательности, было протестированно 6 фрагментов ДНК Wan-инсулятора 5'-концевой фрагмент длиной 150 п н , включающий сигнал полиаденилирования гена white, фрагмент длиной 554 п н , содержащий весь Wari-инсулятор, кроме 5-концевого фрагмента длиной 150 п н и 121 п н З'-области, содержащей 50 п н Р-элемента (рис 7Б) Дополнительно фрагмент Wan-инсулятора длиной 554 п н был разбит на два фрагмента, длиной 368 пни 191 п н , и на два пересекающихся фрагмента, длиной 271 п н и 215 п н (рис 7Б)
В результате анализа трансгенных линий мух было выяснено, что делеция 150 пн области, содержащей сигнал полиаденилирования гена white, не влияла на энхансер-блокирующую активность инсулятора, так как фрагмент длиной 554 п н обладал полной инсуляторной активностью Wan-инсулятора (рис 7Б) по себе 150 п н фрагмент инсуляторной активностью не обладал (рис 7Б) Это означает, что активность Wan-инсулятора не ассоциирована с сигналом полиаденилирования гена white Дополнительная делеция З'-области Wari-инсулятора также не влияла на способность блокировать энхансеры фрагмент длиной 191 п н инсуляторной активностью не обладал (рис 7Б), в то время как фрагмент длиной 368 п н обладал полной инсуляторной активностью Wan-инсулятора (рис 7Б)
В результате проведенных экспериментов функциональная область Wan-инсулятора была сокращена до 368 п н (45% исходной длины) Однако дальнейшее сокращение Wan-инсулятора привело к резкому уменьшению способности тестируемых фрагментов блокировать энхансеры генов yellow и white Два перекрывающихся фрагмента длиной 271 п н и 215 п н лишь частично (по сравнению с полным инсулятором) блокировали энхансеры (рис 7Б)
fit fit
Б white
t
+5887
f
Тсс I iipvcMbic фр.и мин ы
CG32795
t
+6543 +7185
Блокирование энхансера
+5745-
554 il и
+5895-+6448
191 п и +6258-+6448
150 л и +5745-+5894
368 n H +5895-+6262
271 и и
+6034-+6104
215 n h +5895-+6109
+ +
+ +/-
+/-
Рис 7 Поиск функциональной области Wari-инсулятора
А) Модельная система для тестирования ДНК-фрагментов Wari-инсулятора на способность блокировать энхансеры тела и крыльев гена yellow и энхансер глаз гена mini-white Б) Сверху представлено схематическое изображение изучаемой области Черные прямоугольники - кодирующие части генов white и CG32795, белые прямоугольники - 3'-НТО и 5'-НТО генов white и CG32795, соответственно
Р* - 50 п н фрагмент Р-элемента из вектора pCaSpeR, содержащийся в 825 п н Wan-инсуляторе
Цифрами обозначено положение тестированных ДНК фрагментов в геноме относительно старта транскрипции гена white Сверху схематически изображенных фрагментов обозначена их длина Колонка справа суммирует результаты энхансер-блокирующей активности тестированных фрагментов
«+» - фрагменты Wari-инсулятора, обладающие исходной энхансер-блокирующей активностью,
«-» - фрагменты Wari-инсулятора, не способные блокировать энхансеры,
«+/-» - фрагменты Wari-инсулятора, обладающие частичной, по сравнению с полным Wan-
инсулятором, энхансер-блокирующей активностью
Таким образом, можно сделать вывод, что энхансер-блокирующая активность Wan-инсулятора не зависит от присутствия сигнала полиаденилирования гена white
Выявлена функиональнля область Wari-инсулятора. она расположена внутри 825 п н фрагмента и ее длина не превышает 368 п п.
ГЛАВА IV Проверка Wari-инсулятора на наличие в его составе промотора гена CG32795
Существует несколько моделей действия инсуляторов Часть из них основана на конкуренции инсулятора с промотором за активность энхансера Такие модели предполагают, что инсулятор может являться промотором и выступать как «псевдопромотор», перехватывая сигнал энхансера Как было сказано, в геноме Drosophila melanogaster Wari-инсутятор находится между генами white и CG32795, в непосредственной близости от предсказанного начала транскрипции гена CG32795 Таким образом, нельзя исключить, что 825 и н тестируемый фрагмент может содержать промотор гена CG32795, и что именно промоторная активность обуславливает способность Wari-инсулятора блокировать энхансеры
Для выяснения этого вопроса в данной работе применили систему определения промоторной активности в эмбриональной клеточной линии S2 Drosophila с использованием плазмид, несущих гены люциферазы светлячка и люциферазы медузы
Для тестирования промоторной активности Wan-инсулятора было выбрано 7 фрагментов ДНК полный Wan-инсулятор (длиной 825 п н), фрагменты Wari-инсулятора, использованные ранее (длиной 554 пни 191 п н ), фрагмент 1291 п н (содержащий область геномной ДНК, 5'-конец которой соответствовал 554 п н фрагменту, а З'-конец заканчивался перед инициаторным кодоном трансляции, т е данный фрагмент содержал сокращенный до 368 п н инсулятор и всю 5'-НТО гена CG32795, фрагмент длиной 736 п н , содержащий всю 5'-НТО гена CG32795, за исключением Wari-инсулятора, фрагмент длиной 285 п н, содержащий З'-конец полного Wari-инсулятора и область до предсказанного старта транскрипции гена CG32795, фрагмент длиной 93 п н, содержащий область от Wan-инсулятора до предсказанного старта транскрипции гена CG32795 (рис 8)
Все тестируемые фрагменты были встроены в плазмидный вектор pGL-3-Basic перед кодирующей областью гена люциферазы светлячка (Flue, firefly luciferase) в двух ориентациях Исходный плазмидный вектор pGL-3-Basic перед кодирующей частью гена люциферазы светлячка не содержит своего промотора Для контроля эффективности трансфекции S2 клетки были котрансфецированы тестируемыми плазмидами и плазмидой pAcRL Плазмида pAcRL содержит кодирующую часть гена люциферазы медузы (Rluc, Renilla luciferase) под контролем актинового промотора Активности люцифераз определяли
на люминометре с помощью системы детекции, позволяющей отдельно измерять активность люциферазы медузы и активность люциферазы светлячка в одной пробе
Специфический сигнал определяли по отношению активности люциферазы светлячка к активности люциферазы медузы Фоновый уровень определяли по уровню люминесценции не трансфецированных клеток Уровень люминесценции клеток, трансфецированных вектором рОЬЗ-Вавю, не содержащим промотора, был равен уровню люминесценции не трансфецированных клеток
while
t
+5887
f
+6543
+5745-
Тестируемые фрагменты 825 п н Р*
+5895-
554 п и
<-6448
+5895 -
191 п н +6258-+6448
1291 п н
CG32795
+7185
Промоторная активность
■ +7185
736 п н
+6450-+7185
285 н и +6258-+6542
93 н н +6450 -+6542
+
+
Рис 8 Определение промоторной активности Wan-инсулятора
Сверху представлено схематическое изображение изучаемой области Черные прямоугольники - кодирующие части генов white и CG32795, белые прямоугольники - 3'-НТО и 5'-НТО генов white и CG32795, соответственно Цифрами обозначено положение анализируемых ДНК-фрагментов относительно старта транскрипции гена white Сверху схематически изображенных фрагментов обозначена их длина
«+» - фрагменты, обладающие промоторной активностью, «-» - фрагменты, не обладающие промоторной активностью
В результате анализа люциферазной активности в клетках, трансфецированных тестируемыми плазмидами, нами было обнаружено, что промоторной активностью обладали только два фрагмента в прямой ориентации фрагмент длиной 1291 пни фрагмент длиной 736 п н (рис 8) Ни 825 п н фрагмент, ни другие фрагменты, не включающие 5' - НТО гена
СС32795, промоторной активностью не обладали (рис 8), что говорит о том, что промотор гена Св32795 не входит в состав \Уап-инсулятора
Следовательно, можно утверждать, что энхансер-блокирующая активность \Vari-инсулятора не ассоциирована с промоторной активностью гена СС32795
Заключение
В данной работе обнаружен новый инсулятор и изучены его свойства Этот инсулятор находится в геноме Drosophila melanogaster между генами white и CG32795 Новый инсулятор был назван Wari Оказалось, что Wari-инсулятор присутствует во всех модельных системах, содержащих ген mim-white, и расположен непосредственно за этим геном Показано, что Wari-инсулятор блокирует энхансеры тела и крыльев гена yellow и энхансер глаз гена white
Продемонстрировано, что Wari-инсулятор, находящийся за геном mini-white, усиливает инсуляцию своей собственной копии, расположенной между энхансером и промотором гена Этот эффект можно объяснить физическим взаимодействием между двумя Wari-инсуляторами Вероятно, в результате такого взаимодействия, ДНК между инсуляторами образует петлю, а блокирование энхансеров усиливается за счет образования более массивного белкового комплекса, ограничивающего энхансеры от промоторов генов
Выяснено, что белки Su(Hw) и Mod(mdg4)-67 2, являющиеся белковыми компонентами Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторов, не требуются для проявления энхансер-блокирующей активности Wari-инсулятора Тем не менее, Wari-инсулятор способен функционально взаимодействовать, хотя и слабее, чем с Wan-инсулятором (своей второй копией), с Su(Hw)- и 1А2-инсуляторами, влияя на их энхансер-блокирующую активность Это свойство Wari-инсулятора может объясняться возможным участием общих белковых компонентов инсуляторных комплексов Так, недавно в одной из работ другой лаборатории было показано, что, хотя Su(Hw) и dCTCF белки не взаимодействуют друг с другом и их сайты связывания не перекрываются на политенных хромосомах, они оба взаимодействуют с белком CP 190 Возможно, что CP 190 или другой аналогичный белок, присутствующий сразу в нескольких инсуляторных комплексах, может принимать участие во взаимодействиях между разными инсуляторами Однако какие белки взаимодействуют с Wan-инсулятором, еще предстоит выяснить
В данной работе показано, что функциональное взаимодействие Wan-инсуляторэ с Wan-, Su(Hw)- и 1А2-инсуляторами может выражаться как в усилении, так и в «нейтрализации» инсуляции Полученные данные отражают сложность функциональных взаимодействий между регуляторными элементами в геноме и подчеркивают неприемлемость упрощенных моделей их действия В любом случае, становится очевидно, что изучение функциональных свойств инсуляторов должно включать, а предлагаемые модели механизмов их действия должны учитывать возможность взаимодействия с другими инсуляторами
Одним из важных результатов данной работы является обнаружение ранее неизвестного инсулятора в трансгенной модельной системе, используемой во многих лабораториях мира Такие трансгенные системы, содержащие ген mini-white и, как оказалось, одновременно Wari-инсулятор, использовались для тестирования инсуляторов на энхансер-блокирующую активность, анти-инсуляторную активность регуляторных элементов PTS, барьерную активность инсуляторов и MAR-элементов и просто в качестве маркерного гена
Как было показано в данной работе на примере инсуляторов Su(Hw) и 1А2, обнаруженный инсулятор мог влиять на проявляемые свойства тестируемых элементов Вполне вероятно, что Wari-инсулятор мог оказывать влияние и на другие получаемые результаты, и, по-крайней мере, некоторые из них должны быть пересмотрены с учетом присутсвия в системе Wari-инсулятора и проанализированы в его отсутствие
Выводы
1 Обнаружен новый инсулятор у D melanogaster, который находится между генами white и CG32795 Этот инсулятор назван инсулятором Wari
2 Продемонстрировано, что Wari-инсулятор способен функционально взаимодействовать со своей второй копией, а также с Su(Hw)- и 1 А2-инсуляторами
3 Выяснено, что энхансер-блокирующая активность Wari-инсулятора не зависит от сигнала полиаденилирования гена white Показано, что функциональным (обладающим полной энхансер-блокирующей активностью) является участок Wari-инсулятора длиной 368 п н
4 Показано, что Wari-инсулятор не обладает промоторной активностью
Список ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в научных журналах
1 Chetverina Р. Savitskaya Е, Maksimenko О, Melnikova L, Zaytseva О, Parshikov A, Galkin AV, Georgiev P 2008 Red flag on the white reporter a versatile insulator abuts the white gene in Drosophila and is omnipresent in mini-white constructs NucI Acids Res 36, 929-937
2 Максименко О Г , Четверина Д А . Георгиев П Г 2006 Свойства, механизмы действия инсуляторов высших эукариот и их роль в регуляции транскрипции Генетика 42 (8), 10291044
Тезисы конференций
1 Darya Chetverina. Ekaterina Savitskaya, Olga Zaytseva, Alexander Parshikov, Pavel Georgiev CHARACTERIZATION OF NEW ENDOGENOUS INSULATOR FOUND BETWEEN WHITE AND CG32795 GENES IN DROSOPHILA MELANOGASTER Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120lh anniversary of M I Vavilov, 20-22 September 2007, Kyiv, Ukraine
2 D Chetverina, E Savitskaya, A Parshikov, M Karakozova and P Georgiev Characterization of new endogenous insulator located downstream the white gene in Drosophila melanogaster 7lh Young Scientist Forum Molecular Networks (YSF Vienna) July 5-7 2007 and 32nd FEBS Congress MOLECULAR MACHINES July 7-12, Vienna, Austria
3 Pavel G Georgiev, Darya Chetverina Study of an endogenous insulator found downstream of the Drosophila mini-white gene 48th Annual Drosophila Research Conference, Philadelphia, PA, March 7-11,2007
4 Dana Chetverina Properties of new insulator located at the end of the white gene in D melanogaster 4th Elmau Conference On Nuclear Organization At Gostau, Austria October 12th -October 15th 2006 EMBO Workshop on Nuclear Organization Systems Biology Meets Chromatin Function
5 Dana Chetverina Study of new insulator located downstream of the white gene in D melanogaster 40 Years' Spetsai Summer School Anniversary Workshop on Molecular and Cell Biology at Spetsai Past, Present and Future - A Forty Years Anniversary Island of Spetses, Greece - 1-5 September 2006
6 Четверина Д A . Савицкая E E , Каракозова M В , Георгиев П Г Изучение свойств нового инсулятора, локализованного в З'-нетранслируемой области гена white у D melanogaster
Материалы 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 17-21 апреля 2006 г 7 Р Georgiev, М Kostuchenko, Е Kravchenko, D Chetverina, О Maksimenko, A Parshikov, L Melnikova, A Golovnin The mechanisms of long-distance interactions and insulator action in Drosophila melanogaster HHMI, Merida, Mexico 2005
Заказ № 37/03/08 Подписано в печать 04 03 2008 Тираж 110 зкз Уел п л 15
/ Ч\ ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 , j www cfr ru, e-mail wfo@cfr ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Четверина, Дарья Александровна
Список используемых сокращений ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы Цель и задачи исследования
Научная новизна и практическая ценность работы
Апробация работы
Публикации
Благодарности
ГЛАВА I. Роль инсуляторов в регуляции транскрипции генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II у D.melanogaster (ОБЗОР
ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ)
1. Цис-действующие регуляторные последовательности генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II
1.1. Базальный промотор
1.2. Энхансеры
1.3. Сайленсеры
1.4. Инсуляторы
2. Характеристика инсуляторов Drosophila melanogaster
2.1. Инсуляторы генов теплового шока (scs и scs')
2.2. 8и(Нуу)-содержащие инсуляторы
2.2.1. Su(Hw)-инcyлятop
2.2.2. 1А2-инсулятор
2.2.3. Другие Sи(Нш)-связывающие инсуляторы
2.3. Инсуляторы регуляторной области Abd-B гена
2.3.1. Fab
2.3.2. МСР
2.3.3. Fab
2.4. Инсулятор IdefixU
2.5. Инсулятор F(fvb
2.6. Инсулятор SF1 46 3. Модели энхансер-блокирующей активности инсуляторов
3.1. Структурные модели
3.2. Транскрипционные модели
3.3. «Нейтрализация» энхансер-блокирующей активности инсуляторов
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Генетические методы
1.1. Линии Drosophila melanogaster, использованные в данной работе
1.2. Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий
1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и mini-white в трансгенных линиях
1.4. Генетические скрещивания
2. Биохимические методы
2.1. Работа с бактериальной линией E.coli DH5a
2.1.1. Среды для культивирования
2.1.2. Приготовление компетентных клеток линии E.coli DH5a
2.1.3. Трансформация плазмидной ДНК в бактерии линии
E.coli DH5a
2.2. Методы работы с ДНК
2.2.1. Рестрикция ДНК, тупление «липких» концов, дефосфорилирование и лигирование фрагментов ДНК
2.2.2. Определение концентрации ДНК
2.2.3. Спиртовое осаждение ДНК
2.2.4. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле
2.2.5. Выделение фрагментов ДНК из геля
2.2.6. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса из бактериальных клеток линии E.coli DH5a 72 2.2.6.1 .Минипрепаративное выделение плазмидной ДНК 72 2.2.6.2.Максипрепаративное выделение плазмидной ДНК
2.2.7. Выделение геномной ДНК из мух с использованием DEPC
2.3. Саузерн-блот-анализ
2.4. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2.4.1. ПЦР с использованием Taq ДНК-полимеразы
2.4.2. ПЦР с колоний E.coli DH5a, несущих плазмиду, с использованием Taq ДНК-полимеразы
2.4.3. ПЦР с использованием Pfu ДНК-полимеразы
2.5. Трансфекция клеток S2 Drosophila и анализ активности люцифераз
2.6. Метод торможения ДНК-белковых комплексов в геле (EMSA,
Electrophoretic Mobility Shift Assays)
2.6.1. In vitro транскрипция — трансляция
2.6.2. Подготовка фрагментов ДНК
2.6.3. Связывание ДНК-фрагментов с 8и(Нлу)-белком
2.6.4. Связывание ДНК-фрагментов с dCTCF-белком
2.6.5. Вертикальный полиакриламидный гель-электрофорез 82 3. Создание трансгенных конструкций
3.1. Конструкции для тестирования фрагмента длиной 825 п.н. на энхансерблокирующую активность
3.2. Конструкции для тестирования влияния Wari-инсулятора на активности других инсуляторных элементов
3.3. Праймеры, использованные для ПЦР-анализа трансгенных линий мух на наличие делеций, вызванных сайт-специфическими рекомбиназами Flp, Сге или эндонуклеазой рестрикции Seel
3.4. Фрагменты ДНК, использованные для in vitro связывания с белками
Su(Hw) и dCTCF методом торможения ДНК-белковых комплексов в геле
3.5. Плазмидные конструкции для выявления функциональной области
Wari-инсулятора
3.6. Плазмидные конструкции для тестирования промоторной активности
Wari-инсулятора
ГЛАВА III. Результаты исследования
1. Новый инсулятор обнаружен непосредственно за геном white
2. Влияние Wari-инсулятора на активность инсуляторных элементов 96 2.1. Влияние Wari-инсулятора на энхансер-блокирующую активность своей второй копии, Su(Hw)- и 1А2-инсуляторов; усиление инсуляции
2.2. Влияние Wari-инсулятора на энхансер-блокирующую активность Wari-, Su(Hw)- и 1А2-инсуляторов, «нейтрализация» инсуляции
2.3. Wari-инсулятор отличается от других найденных ранее инсуляторов
3. Выявление функциональной области Wari-инсулятора
4. Проверка Wari-инсулятора на наличие в его составе промотора гена
CG
ГЛАВА IV. Обсуждения ВЫВОДЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Обнаружение и изучение нового инсулятора у Drosophila melanogaster"
Актуальность проблемы
Геном эукариот обеспечивает сложнейшие программы развития и клеточной дифференцировки. Эти программы осуществляются за счет четкой, последовательной активации и инактивации множества генов, белковые продукты которых взаимодействуют друг с другом. На современном этапе развития молекулярной генетики и смежных с ней наук изучение принципов экспрессии генов является одной из важнейших задач. За последние годы было накоплено много информации о нуклеотидной' последовательности ДНК различных организмов. Однако данные о нуклеотидной последовательности генома практически ничего не сообщают о роли отдельных последовательностей в регуляции экспрессии генов. В настоящее время важной задачей является идентификация последовательностей, вовлеченных в регуляцию транскрипции. Анализ возможностей и роли внутригеномных последовательностей несомненно необходим для понимания принципов контроля и поддержания экспрессии генов. Это определяет актуальность таких работ в настоящее время.
Тканеспецифичная и различающаяся на разных стадиях развития организма активация транскрипции генов высших эукариот зависит от активного статуса цис-регуляторных ДНК-элементов: промотора гена, на котором собираются белки основного транскрипционного комплекса, и энхансера, который, посредством регуляторных белков, усиливает транскрипцию гена.
Энхансеры высших эукариот способны активировать гены на больших расстояниях, достигающих нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов. Эти регуляторные элементы действуют вне зависимости от положения относительно направления транскрипции гена. Существует несколько моделей функционирования энхансеров, большинство из них предполагает, что белки, связанные с энхансером, непосредственно взаимодействуют с белками, собранными на промоторе, а ДНК между ними выпетливается. Энхансеры практически не обладают специфичностью действия, следовательно, у высших эукариот должны были выработаться механизмы, контролирующие и ограничивающие способность энхансеров к активации генов, направляющие энхансер на активирование только определенного промотора, и, таким образом, определяющие специфичность его действия.
Помимо энхансеров, активирующих экспрессию генов, в геноме был найден другой класс регуляторных элементов, репрессирующих транскрипцию, - сайленсеры. Сайленсеры репрессируют транскрипцию генов, и так же, как и энхансеры, они действуют вне зависимости от их положения относительно направления транскрипции гена и не обладают специфичностью действия.
Предполагается, что важная роль в контроле специфичности действия энхансеров и сайленсеров принадлежит еще одному типу регуляторных ДНК элементов - инсуляторам. Инсуляторы блокируют активность энхансера (сайленсера), но это происходит только в том случае, если инсулятор находится между энхансером (сайленсером) и промотором гена. При этом инсуляторы не влияют непосредственно на активность энхансера, сайленсера и промотора: энхансер (сайленсер) сохраняет способность влиять на незаблокированный инсулятором промотор, а промотор может быть активирован (репрессирован) другим энхансером (сайленсером). В настоящее время, несмотря на достаточно большое количество предложенных моделей действия инсуляторов, детальный механизм их функционирования остается неизвестным.
Большой прогресс в выяснении принципов работы инсуляторов стал возможен в результате использования трансгенных модельных систем с репотерными генами и энхансерами. Одна из популярных трансгенных систем включает использование гена mini-white (модифицированного гена white, белковый продукт которого необходим для пигментации глаз у Drosophila melanogaster) и его тканеспецифичный энхансер. Однако даже хорошо изученная модельная система может преподнести «сюрпризы».
Данная работа посвящена обнаружению и изучению эхансер-блокирующей активности нового инсулятора, названного нами Wari (от White-Abutting Resident Insulator - инсулятор, сопутствующий гену white). В геноме этот инсулятор находится между расположенными друг за другом генами white и CG32795 и присутствует во всех модельных системах, использующих ген mini-white. Выявлена зависимость энхансер-блокирующей активности от наличия двух инсуляторов, один из которых или оба представлены Wari-инсулятором. Продемонстрировано, что взаимодействие Wari-инсулятора с другими инсуляторами может реализовываться как в усилении инсуляции, так и в ее «нейтрализации».
Цель и задачи исследования
Основной целью работы явилось изучение энхансер-блокирующих свойств нового инсулятора (названного впоследствии Wari), обнаруженного между генами white и CG32795 у D.melanogaster. В работе были поставлены следующие задачи:
1) Подтвердить присутствие инсулятора за геном white у D. melanogaster.
2) Выяснить возможность влияния Wari-инсулятора на активность других инсуляторных элементов.
3) Выявить функциональную область Wari-инсулятора.
4) Проверить, входит ли в состав Wari-инсулятора промотор гена CG32795.
Научная новизна и практическая ценность работы
В работе впервые показано наличие инсулятора между генами white и CG32795. Продемонстрировано, что Wari-инсулятор влияет на энхансер-блокирующую активность других инсуляторов: Wari (своей второй копии) и двух Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторов, Su(Hw) и 1А2. Показано, что энхансер-блокирующая активность Wari-инсулятора не связана с инсуляторными белками Su(Hw), Mod(mdg4)-67.2. Полученные данные позволили сделать модельную систему более «чистой» (удаление Wari-инсулятора из модельной системы позволяет избежать его влияния) и проанализировать энхансер-блокирующую активность 8и(Нш)-зависимых инсуляторов, Su(Hw) и 1А2, в отсутствие Wari-инсулятора. Результаты данной работы расширяют представление о регуляторных элементах с энхансер-блокирующими свойствами и позволяют по-новому взглянуть на механизм действия инсуляторов, опровергая упрощенные модели их функционирования.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы были представлены на 10-й международной конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века»
Пущино, 2006); на международных конференциях Meeting of International
Research Scholars HHMI (Merida, Mexico, 2005); Workshop on Molecular and Cell th
Biology at Spetsai (Spetses, Greece, 2006); 4 Elmau conference on nuclear organization, EMBO (Gosau, Austria, 2006); 48th Annual Drosophila Research Conference (Philadelphia, PA, 2007); 7th Young Scientist Forum and 32nd FEBS Congress (Vienna, Austria, 2007); Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Kyiv, Ukraine, 2007).
Публикации
Статьи в научных журналах:
1. Chetverina D, Savitskaya E, Maksimenko O, Melnikova L, Zaytseva O, Parshikov A, Galkin AV, Georgiev P. 2008. Red flag on the white reporter: a versatile insulator abuts the white gene in Drosophila and is omnipresent in mini-white constructs. Nucl. Acids Res. 36, 929-937.
2. Максименко О.Г., Четверина Д.А., Георгиев П.Г. 2006. Свойства, механизмы действия инсуляторов высших эукариот и их роль в регуляции транскрипции. Генетика 42 (8), 1029-1044.
Тезисы конференций:
1. Darya Chetverina, Ekaterina Savitskaya, Olga Zaytseva, Alexander Parshikov, Pavel Georgiev. CHARACTERIZATION OF NEW ENDOGENOUS INSULATOR FOUND BETWEEN WHITE AND CG32795 GENES IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I.Vavilov, 20-22 September 2007, Kyiv, Ukraine.
2. D. Chetverina, E. Savitskaya, A. Parshikov, M. Karakozova and P. Georgiev. Characterization of new endogenous insulator located downstream the white gene in Drosophila melanogaster. 7th Young Scientist Forum Molecular Networks (YSF Vienna) July 5-7 2007 and 32nd FEBS Congress MOLECULAR MACHINES July 712, Vienna, Austria.
3. Pavel G Georgiev, Darya Chetverina. Study of an endogenous insulator found downstream of the Drosophila mini-white gene. 48th Annual Drosophila Research Conference, Philadelphia, PA, March 7-11, 2007.
4. Daria Chetverina. Properties of new insulator located at the end of the white gene in D. melanogaster. 4th Elmau Conference On Nuclear Organization At Gostau, Austria. October 12th - October 15th 2006. EMBO Workshop on Nuclear Organization: Systems Biology Meets Chromatin Function.
5. Daria Chetverina. Study of new insulator located downstream of the white gene in D.melanogaster. 40 Years' Spetsai Summer School Anniversary. Workshop on Molecular and Cell Biology at Spetsai: Past, Present and Future - A Forty Years Anniversary. Island of Spetses, Greece - 1-5 September 2006.
6. Четверина Д.А., Савицкая' E.E., Каракозова M.B., Георгиев П.Г. Изучение свойств нового инсулятора, локализованного в З'-нетранслируемой области гена white у D.melanogaster. Материалы 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 17-21 апреля 2006 г.
7. P. Georgiev, М. Kostuchenko, Е. Kravchenko, D. Chetverina, О. Maksimenko, А. Parshikov, L. Melnikova, A. Golovnin. The mechanisms of long-distance interactions and insulator action in Drosophila melanogaster. HHMI, Merida, Mexico 2005
Благодарности
Автор выражает огромную благодарность своему научному руководителю, Георгиеву Павлу Георгиевичу, за предоставленную тему исследований, плодотворные дискуссии, ценные замечания. Автор благодарит сотрудников Лаборатории Регуляции генетических процессов за создание и поддержание дружеской и творческой атмосферы внутри коллектива. Автор благодарит своих коллег Ерохина Максима Максимовича, Максименко Оксану Геннадьевну, Тощакова Степана Владимироваича за всестороннюю помощь в процессе выполнения работы. Автор благодарит дирекцию Института Биологии гена за предоставление возможности проведения научных исследований. Отдельную благодарность автор выражает Грабовской Любовь Сергеевне за понимание и поддержку на всех этапах подготовки диссертационной работы.
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Четверина, Дарья Александровна
выводы
1. Обнаружен новый инсулятор у D.melanogaster, который находится между генами white и CG32795. Этот инсулятор назван инсулятором Wari.
2. Продемонстрировано, что Wari-инсулятор способен функционально взаимодействовать со своей второй копией, а также с Su(Hw)- и 1А2-инсуляторами.
3. Выяснено, что энхансер-блокирующая активность Wari-инсулятора не зависит от сигнала полиаденилирования гена white. Показано, что функциональным (обладающим полной энхансер-блокирующей активностью) является участок Wari-инсулятора длиной 368 п.н.
4. Показано, что Wari-инсулятор не обладает промоторной активностью.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Четверина, Дарья Александровна, Москва
1. Максименко О.Г., Четверина ДА., Георгиев П.Г. (2006) Свойства, механизмы действия инсуляторов высших эукариот и их роль в регуляции транскрипции. Генетика 42 (8), 1029-1044.
2. Максименко О.Г., и Георгиев П.Г. (2007) Изучение структуры 1А2-инсулятора Drosophila melanogaster. Доклады Академии наук. 416(3), 404-407.
3. Belozerov V.E., Majumder P., Shen P., Cai, H.N. (2003) A novel boundary element may facilitate independent gene regulation in the Antennapedia complex of Drosophila. EMBO J. 22, 3113-3121.
4. Blanton J., Gaszner M., Schedl P. (2003) Protein : protein interactions and the pairing of boundary elements in vivo. Genes Dev. V. 17. P. 664-675.
5. Brasset E., and Vaury, C. (2005) Insulators are fundamental components of the eukaryotic genomes. Heredity 94, 571-576.
6. Brasset E., Bantignies F., Court F., Cheresiz S., Conte C., Vaury C. (2007) Idefix insulator activity can be modulated by nearby regulatory elements. Nucl. Acid. Res. 35,2661-2670.
7. Brown J.L., Mucci D., Whiteley M., Dirksen M.L., Kassis J.A. (1998) The Drosophila Polycomb group gene pleiohomeotic encodes a DNA binding protein with homology to the transcription factor YY1. Mol Cell. 1(7): 1057-64.
8. Buchner K., Roth P., Schotta G., Krauss V., Saumweber H., Reuter G., Dorn R. (2000) Genetic and molecular complexity of the position effect variegation modifier mod(mdg4) in Drosophila. Genetics. V. 155. P. 141-157.
9. Burke T.W., and Kadonaga J.T. (1996) Drosophila TFIID binds to a conserved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters. Genes Dev. 10(6):711-24.
10. Burke T.W., and Kadonaga J.T. (1997) The downstream core promoter element, DPE, is conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAFII60 of Drosophila. Genes Dev. 11(22):3020-31.
11. Busturia A., Lloyd A., Bejarano F., Zavortink M., Xin H., Sakonju S. (2001) The MCP silencer of the Drosophila Abd-B gene requires both Pleiohomeotic and GAGA factor for the maintenance of repression. Development. 128(11):2163-73.
12. Butler J.E., and Kadonaga J.T. (2001). Enhancer-promoter specificity mediated by DPE or TATA core promoter motifs. Genes Dev. 15(19):2515-9
13. Butler J.E., and Kadonaga J.T. (2002) The RNA polymerase II core promoter: a key component in the regulation of gene expression. Genes Dev. 16(20):2583-92
14. Byrd K., and Corces V.G. (2003) Visualization of chromatin domains created by the gypsy insulator of Drosophila. J. Cell Biol. V. 162. P. 565-574.
15. Cai, H., and Levine, M. (1995) Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo. Nature 376, 533-536.
16. Cai, H., and Levine, M: (1997) The gypsy insulator can function as a promoter-specific silencer in the Drosophila embryo. EMBO J. 16(7):1732-41
17. Cai, H., and Shen, P. (2001) Effects on cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. Science 291, 493-495.
18. Capelson M., and Corces V. (2005) The ubiquitm ligase dTopors directs the nuclear organization of a chromatin insulator. Mol. Cell. V. 20. P. 105-16.
19. Capelson M., and Corces V.G. (2004) Boundary elements and nuclear organization. Biol. Cell 96, 617-629.
20. Chen Q., Lin L., Smith S., Lin Q., Zhou J. (2005) Multiple promoter targeting sequences exist in Abdominal-B to regulate long-range gene activation. Dev. Biol. 286, 629-636.
21. Chung J.H., Whiteley M., Felsenfeld G. (1993) A 5' element of the chicken beta-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila. Cell 74, 505-514.
22. Conte C., Dastugue В., Vaury C. (2002a) Coupling of enhancer and insulator properties identified in two retrotransposons modulates their mutagenic impact on nearby genes. Mol. Cell Biol. 22, 1767-1777.
23. Conte C., Dastugue В., Vaury C. (2002b) Promoter competition as a mechanism of transcriptional interference mediated by retrotransposons. EMBO J. 21(14):3908-16
24. Cramer P. (2004). RNA polymerase II structure: from core to functional complexes. Curr Opin Genet Dev. 14(2):218-26
25. Cuvier O., Hart C.M., Kas E., Laemmli U.K. (2002) Identification of a multicopy chromatin boundary element at the borders of silenced chromosomal domains. Chromosoma. V. 110. P. 519-531.
26. Cuvier O., Hart C.M., Laemmli U.K. (1998) Identification of a class of chromatin boundary elements. Mol. Cell. Biol. V. 18. P. 7478-7486.
27. Dorsett D. (1993) Distance-independent inactivation of an enhancer by the suppressor of Hairy-wing DNA-binding protein of Drosophila. Genetics. 134(4): 1135-44.
28. Gaszner M., and Felsenfeld G. (2006) Insulators: Exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. Nat. Rev. Genet. 7, 703-713.
29. Gaszner M., Vazquez J., Schedl P. (1999) The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction. Genes Dev. 13,2098-2107.
30. Gause m., Hovhannisyan H., Kan Т., Kuhfittig S., Mogila V., Georgiev P. (1998) hobo Induced rearrangements in the yellow locus influence the insulation effect of the gypsy su(Hw)-binding region in Drosophila melanogaster. Genetics. 149(3): 1393-405.
31. Gdula D.A., and Corces V.G. (1997) Characterization of functional domains of the su(Hw) protein that mediate the silencing effect of mod(mdg4) mutations. Genetics. V. 145. P. 153-161.
32. Georgiev, P., and Kozicina, M. (1996) Interaction between mutations in' the suppressor of Hairy wing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster^ affecting the phenotype of gypsy-induced mutations. Genetics 142, 425-436.
33. Gerasimova Т. I., Byrd K., Corces V. G. (2000) A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA. Mol. Cell. V. 6. P. 1025-1035.
34. Gerasimova T.I., and Corces V.G. (1998) Polycomb and Trithorax group proteins mediate the function of a chromatin>insulator. Cell. V. 92. P.511-521.
35. Gerasimova T.I., Gdula D.A., Gerasimov D.V., Simonova O., Corces V.G. (1995). A Drosophila protein that imparts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation. Cell 82, 587-597.
36. Geyer P.K., and Clark I. (2002) Protecting against promiscuity: the regulatory.role of insulators. Cell Mol Life Sci. 59(12):2112-27
37. Geyer P.K., and Corces V.G. (1987) Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster. Genes Dev. 1, 996-1004.
38. Geyer P.K., and Corces V.G. (1992) DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev. 6(10):1865-73
39. Ghosh D., Gerasimova T.I., Corces V.G. (2001) Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function. EMBO J. V. 20. P. 25182527.
40. Golic K.G., Lindquist S. (1989) The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell 59, 499-509.
41. Golovnin A., Birukova I., Romanova O. , Silicheva M. , Parshikov A., Savitskaya E. , Pirrotta V., Georgiev P. (2003) An endogenous Su(Hw) insulator separates the yellow gene from the Achaete-scute gene complex in Drosophila. Development 130, 3249-3258.
42. Golovnin A., Melnick E., Mazur A., Georgiev P. (2005) Drosophila Su(Hw) insulator can stimulate transcription of a weakened yellow promoter over a distance. Genetics. V. 170. P.1133-1142.
43. Gyurkovics H., Gausz J., Kummer J., Karch F. (1990) A new homeotic mutation in the Drosophila bithorax complex removes a boundary separating two domains of regulation. EMBO J. 9(8):2579-85
44. Hagstrom K., Muller M., Schedl P. (1996) Fab-7 functions as a chromatin domain boundary to ensure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex. Genes Dev. 10, 3202-3215.
45. Hagstrom K., Muller M., Schedl P. (1997) A Polycomb and GAGA dependent silencer adjoins the Fab-7 boundary in the Drosophila bithorax complex. Genetics. 146(4):1365-80
46. Hahn S. (2004) Structure and mechanism of the RNA polymerase II transcription machinery. Nat Struct Mol Biol. 11(5):394-403.
47. Harrison D.A., Gdula D.A., Coyne R.S., Corces V.G. (1993). A leucine zipper domain of the suppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on* enhancer function. Genes Dev. 7, 1966-1978.
48. Hart C.M., Cuvier O., Laemmli U.K. (1999) Evidence for an antagonistic relationship between the boundary element-associated factor BEAF and the transcription factor DREF. Chromosoma. V. 108. P. 375-383.
49. Hart C.M., Zhao K., Laemmli U.K. (1997) The scs' boundary element: characterization of boundary element-associated factors. Mol Cell Biol. 17(2):999-1009.
50. Hochheimer A., and Tjian R. (2003) Diversified; transcription initiation complexes expand promoter selectivity and tissue-specific gene expression. Genes Dev. 17(11): 1309-20.
51. Hochheimer A., Zhou S., Zheng S., Holmes M.C., Tjian R. (2002) TRF2 associates with DREF and directs promoter-selective gene expression in Drosophila. Nature. 420(6914):439-45. .
52. Holohan E.E., Kwong C., Adryan В., Bartkuhn M., Herold M., Renkawitz R., Russell S., White R. (2007) GTGF genomic binding sites in Drosophila and the organization of the bithorax complex. PLoS > Genet. 3, el;12.
53. Jack J:, Dorsett D., Dclotto Y., Liu S.( 1991) Expression of the cut locus in the Drosophila wing margin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer. Development. 113(3):735-47.
54. Jones K.A., and Kadonaga J.T. (2000) Exploring the transcription-chromatin interface. Genes Dev. 14(16): 1992-6:
55. Kadonaga J.T. (2002) The DPE, a core promoter element for transcription by RNA polymerase Ш Exp Mol Med. 34(4):259-64.
56. Kadonaga J.T. (2004) Regulation of RNA polymerase II transcription by sequence-specific DNA binding factors. Cell. 116(2):247-57.
57. Karch F., Galloni M., Sipos L., Gause J., Gyurkoviks H., Schedl P. (1994) Мер and Fab-7: molecular analysis of putative boundaries of cis-regulatory domains in the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 22(15):3138-46.
58. Karcss R.E., and Rubin G.M. (1984) Analysis of P transposable element functions in Drosophila. Cell 38, 135-146.
59. Kellum R., and Schedl P. (1991) A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains. Cell 64, 941-950.
60. Kellum R., and Schedl P. (1992) A group of scs elements function1 as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. Mol. Cell. Biol. 12, 2424-2431.
61. Kim J., Shen В., Rosen C., Dorsett D. (1996) The DNA-binding and enhancer-blocking domains of the Drosophila suppressor of Hairy-wing protein. Mol. Cell. Biol. V. 16. P.3381-3392.
62. Krasnov A.N., Kurshakova M.M., Ramensky V.E., Mardanov P.V., Nabirochkina E.N., Georgieva S.G. (2005) A retrocopy of a gene can functionally displace the source gene in evolution. Nucleic Acids Res. 33(20):6654-61. Print 2005.
63. Kuhn E.J., and Geyer, P.K. (2003) Genomic insulators: Connecting properties to mechanism. Curr. Opin. Cell Biol. 15, 259-265.
64. Kuhn E.J., Viering M.M., Rhodes K.M.", Geyer P.K. (2003) A test of insulator interactions in Drosophila. EMBO J. 22, 2463-2471.
65. Kuhn, E.J., Hart C.M., Geyer P.K. (2004) Studies of the role of the Drosophila scs and scs' insulators in defining boundaries of a chromosome puff. Mol' Cell Biol. 24(4): 1470-80.
66. Kurshakova M., Maksimenko O., Golovnin A., Pulina M., Georgieva S., Georgiev P., Krasnov A. (2007) Evolutionary conserved E(y)2/Susl protein is essential for the barrier activity of Su(Hw)-dependent insulators in Drosophila. Mol Cell. 27(2):332-8.
67. Kutach A.K. and Kadonaga J.T. (2000) The downstream promoter element DPE appears to be as widely used as the TATA box in Drosophila core promoters. Mol Cell Biol. 20(13):4754-64.
68. Labrador M., and Corces V.G. (2002) Setting the boundaries of chromatin domains and nuclear organization. Cell. 111(2): 151-4.
69. Lagrange Т., Kapanidis A.N., Tang H., Reinberg D., Ebright R.H. (1998) New core promoter element in RNA polymerase Il-dependent transcription: sequence-specific DNA binding by transcription factor IIB. Genes Dev. 12(l):34-44.
70. Levine M., and Tjian R. (2003) Transcription regulation and animal diversity. Nature. 424(6945): 147-51.
71. Lim C.Y., Santoso В., Boulay Т., Dong E., Ohler U., Kadonaga J.T. (2004) The MTE, a new core promoter element for transcription by RNA polymerase II. Genes Dev. 18(13):1606-17.
72. Lin Q., Chen Q., Lin L., Zhou J. (2004) The promoter targeting sequence4 mediates epigenetically heritable transcription memory. Genes Dev. 18, 2639-2651.
73. Lin Q., Wu D., Zhou J. (2003) The promoter targeting sequence facilitates and restricts a distant enhancer to a single promoter in the Drosophila embryo. Development 130, 519-526.
74. Lindsley D.L., and Zimm-G.G. (1992) The genome of Drosophila. melanogaster. (Academic Press, New York).
75. Majumder P., and Cai H.N. (2003) The functional analysis of insulator interactions in the Drosophila'embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 5223-5228.
76. Mallin D.R., Myung J.S., Patton J.S., Geyer P.K. (1998) Polycomb group repression is blocked by the Drosophila suppressor of Hairy-wing su(Hw). insulator. Genetics. 148(l):331-9.
77. Martin M., Meng Y. В., Chia W. (1989) Regulatory elements involved in the tissue-specific expression of the yellow gene of Drosophila. Mol. Gen. Genet. 218, 118-126.
78. Mazo A.M., Mizrokhi L.J., Karavanov A.A., Sedkov Y.A., Krichevskaya A.A., Ilyin Y.V. (1989). Suppression in Drosophila: su(Hw) and su(f) gene products interact with a region gypsy (mdg4) regulating its transcriptional activity. EMBO J. V. 8. P. 903911.
79. Melnikova L., Gause M., Georgiev P. (2002) The gypsy insulators flanking yellow enhancers do not form a separate transcriptional domain in Drosophila melanogaster: the enhancers can activate an isolated yellow promoter. Genetics. 160(4): 1549-60.
80. Mihaly J., Hogga I., Barges S., Galloni M., Mishra R.K., Hagstrom K., Muller M., Schedl P., Sipos L., Gausz J., Gyurkovics H., Karch F. (1998) Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex. Cell. Mol. Life Sci. V. 54. P. 60-70.
81. Mihaly J., Hogga I., Gausz J., Gyurkovics H., Karch F. (1997) In.situ dissection of theFab-7 region-of the bithorax complex into a chromatin domain boundary and a Polycomb-response element. Development. 124(9): 1809-20.
82. Muravyova E., Golovnin A., Gracheva E., Parshikov A., Belenkaya.T., Pirrotta V., Georgiev P. (2001) Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. Science 291,495-498.
83. Nabirochkin S., Ossokina M., Heidmann T. (1998) A nuclear matrix/scaffold attachment region co-localizes with the gypsy retrotransposon insulator sequence. J. Biol. Chem. V. 273. P. 2473-2479.
84. Namciu S.J., Blochlinger K.B., Fournier R.E.K. (1998) Human matrix attachment regions insulate transgene expression from chromosomal position effects in Drosophila melanogaster. Mol. Cell. Biol. 18; 2382-2391.
85. Pai С., Lei С., Ghosh D., Corces V. (2004) The centrosomal protein CP 190 is a component of the gypsy chromatin insulator. Mol. Cell. V. 16. P. 737-48.
86. Park S.Y., Kim Y.S., Yang D.J., Yoo M.A. (2004) Transcriptional regulation of the Drosophila catalase gene by the DRE/DREF system. Nucleic Acids Res. 32(4): 131824.
87. Parnell Т., Kuhn E., Gilmore В., Helou C., Wold M., Geyer P. (2006) Identification of genomic sites that bind the Drosophila'suppressor of Hairy-wing insulator protein. Mol. Cell Biol. 26, 5983-93.
88. Parnell T.J., Viering M.M., Skjesol A., Helou C., Kuhn E.J., Geyer P.K. (2003) An endogenous suppressor of hairy-wing insulator separates regulatory domains in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13436-13441.
89. Pick L., Schier A., Affolter M., Schmidt-Glenewinkel Т., Gehring W.J: (1990) Analysis of the ftz upstream element: germ layer-specific enhancers are independently autoregulated. Genes Dev. 4(7): 1224-39.
90. Pirrotta V. (1988) Vectors for P-mediated transformation in Drosophila. Biotechnology 10,437-456.
91. Pirrotta V., Steller H., Bozzetti M.P. (1985) Multiple upstream regulatory elements control the expression of the Drosophila white gene. EMBO J. 4(13A):3501-8.
92. Qian S., Varjavand В., Pirrotta V. (1992) Molecular analysis of the zeste-white interaction reveals a promoter-proximal element essential for distant enhancer-promoter communication. Genetics 131, 79-90.
93. Ramos E., Ghosh D., Baxter E., Corces V. (2006) Genomic organization of gypsy chromatin.insulators in Drosophila melanogaster. Genetics 172, 2337-2349.
94. Rodin S., Georgiev P. (2005) Handling three regulatory elements in one transgene: Combined use of cre-lox, FLP-FRT, and I-Scel recombination systems. Biotechniques 39, 871-876.
95. Rodin S., Kyrchanova O., Pomerantseva E., Parshikov A., Georgiev P. (2007) New properties of Drosophila fab-7 insulator. Genetics. 177(1):113-21.
96. Rong Y.S., Titen S.W., Xie H.B., Golic M.M., Bastiani M., Bandyopadhyay P., Olivera B.M., Brodsky M., Rubin G.M., Golic K.G. (2002) Targeted mutagenesis by homologous recombination in D. melanogaster. Genes Dev. Jun 15;16(12):1568-81.
97. Roseman R.R., Pirrotta V., Geyer P.K. (1993) The su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects. EMBO J. 12, 435-442.
98. Rubin G.M., and Spradling A.C. (1982) Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science 218, 348-353.
99. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a Laboratory Manual, Ed.2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
100. Schweinsberg S., Hagstrom K., Gohl D., Schedl P., Kumar R.P., Mishra R., Karch F. (2004) The enhancer-blocking activity of the Fab-7 boundary from the Drosophila bithorax complex requires GAGA-factor-binding sites. Genetics. 168(3): 1371-84.
101. Scott K.S., and Geyer P.K. (1995) Effects of the su(Hw) insulator protein on the expression of the divergently transcribed Drosophila yolk protein genes. EMBO J. 14, 6258-6267.
102. Scott K.S., Taubman A.D., Geyer P.K. (1999) Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength. Genetics. V. 153. P. 787-798.
103. Siegal M.L., and Hartl D.L. (2000) Application of Cre/loxP in Drosophila. Site-specific recombination and transgene co-placement. Methods Mol. Biol. 136, 487495.
104. Sigrist C.J., and Pirrotta V. (1997) Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by the Drosophila polycomb response element (PRE) butallow trans interactions between PREs on different chromosomes. Genetics 147, 209221.
105. Smale S.T. (2001) Core promoters: active contributors to combinatorial gene regulation. Genes Dev. 15(19):2503-8
106. Smale S.T., Kadonaga J.T. (2003) The RNA polymerase II core promoter. Annu Rev Biochem. 72:449-79.
107. Smith P. A., V. G. Corces. (1995) The suppressor of Hairy-wing protein regulates the tissue-specific expression of the Drosophila gypsy retrotransposon. Genetics. V. 139. P. 215-228.
108. Spradling A.C., and-Rubin G.M. (1982) Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science 218, 341-347.
109. Stogios P.J., Downs G.S., Jauhal J.J.S., Nandra S.K., Prive G.G. (2005) Sequence and structural analysis of BTB domain proteins. Genome Biol. V. 6. P. R82.
110. Strutt H., Cavalli G., Paro R. (1997) Co-localization of Polycomb protein and GAGA factor on regulatory elements responsible for the maintenance of homeotic gene expression. EMBO J. 16(12):3621-32.
111. Szutorisz H., Dillon N., Tora L. (2005) The role of enhancers as centres for general transcription factor recruitment. Trends Biochem Sci. 30(ll):593-9.
112. Udvardy A., Maine E., Schedl P. (1985) The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains. J. Mol. Biol. V. 185. P. 341-358.
113. Valenzuela L., and Kamakaka RT. (2006) Chromatin insulators. Annu. Rev. Genet. 40, 107-138.
114. Vazquez J., and Schedl P. (1994) Sequences required for enhancer blocking activity of scs are located within two nuclease-hypersensitive regions. EMBO J. V. 13. P. 5984-5993.
115. Vazquez J., and Schedl P. (2000) Deletion of an insulator element by the mutation facet-strawberry in Drosophila melanogaster. Genetics. V. 155. P. 1297-1311.
116. Wei W., and Brennan M. D. (2001) The gypsy insulator can act as a promoter-specific transcriptional stimulator. Mol. Cell. Biol. V. 21. P. 7714-7720.
117. Weis L., and Reinberg D. (1992) Transcription by RNA polymerase II: initiator-directed formation of transcription-competent complexes. FASEB J. 6(14):3300-9.
118. West A.G., and Fraser P. (2005) Remote control of gene transcription. Hum. Mol. Genet. 14, 101-111.
119. Zhao H., and Dean A. (2005) Organizing the genome: enhancers and insulators. Biochem Cell Biol. 83(4):516-24.
120. Zhao K., Hart С. M., Laemmli U. K. (1995) Visualization of chromosomal domains with boundary clement-associated factor BEAF-32. Cell. V. 81. P. 879-889.
121. Zhou J., and Levine M. (1999) A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embryo. Cell. 99(6):567-75.
122. Zhou J., Ashe H., Burks C., Levine M. (1999) Characterization of the transvection mediating region of the abdominal-B locus in Drosophila. Development. 126(14):3057-65.
123. Zhou J., Barolo S., Szymanski P., Levine M. (1996) The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo. Genes Dev. V. 10. P. 3195-3201.
-
Четверина, Дарья Александровна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.26
- Особенности функциональных взаимодействий SCS- и SCS'-инсуляторов, а также промоторов соседних коэкспрессирующихся генов дрозофилы
- Новые свойства Su(Hw) инсулятора: влияние на Flp зависимую рекомбинацию, транспозиции P-элемента и промотор гена yellow у Drosophila melanogaster
- Изучение функциональных активностей инсуляторов из регуляторных областей генов yellow и white у D. melanogaster
- Механизмы возникновения химерных элементов и их использование для изучения взаимодействия между регуляторными элементами на больших дистанциях у Drosophila melanogaster
- Функциональное исследование регуляторного элемента Frontabdominal-7 гена Abdominal-B у Drosophila melanogaster
