Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональное исследование регуляторного элемента Frontabdominal-7 гена Abdominal-B у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Функциональное исследование регуляторного элемента Frontabdominal-7 гена Abdominal-B у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 575.22:595.773.4.

РОДИН СЕРГЕЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯТОРНОГО ЭЛЕМЕНТА ПЮКТАВООМШАЬ-7 ГЕНА АВйОМШАЬ-В У БКОЮРНИА МЕ1АЫОСА$ТЕК Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории регуляции i енетических процессов Института биологии гена РАН

Научный руководитель:

Чл.-корр. РАН., доктор биологических наук, профессор Георгиев П.Г. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Чуриков Н. А. кандидат биологических наук Быстрицкий A.A.

Ведущая организация: Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Защита диссертации состоится 15 10 . 2005 года в 11 час. на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан и. 4 4. 2005 года.

Ученый секретарь

У^н jue 4Kb 6

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Взаимосвязь между организацией хроматина внутри ядра и регуляцией генной экспрессии является одним из важнейших и интереснейших вопросов современной биологии. Хрома 1ин внутри ядра эукариотической клетки организован в функциональные домены, содержащие индивидуальные или группы генов (Dillon and Sabbattini 2000) Гены внутри функционального домена имеют определенный во времени и процессе развития и независимый от окружающих последовательностей уровень экспрессии Основными регуляторами активности гена являются энхансеры и сайленсеры, которые могут располагаться на больших расстояниях от регулируемого ими гена.

Энхансерами принято называть послсдова1ельности ДНК, которые способны активировать транскрипцию независимо от ориентации и расстояния до точки начала транскрипции. Обнаружение этого класса регуляторных элементов поставило вопрос о том, каким образом клетка ограничивает действие этих регуляторных элементов только определенным набором промоторов, специфическим для различных тканей и периодов жизненного цикла клетки. Как показали эксперименты на трансгенпых организмах и линиях трансгенных клеток (далее - трансгенах), лишь небольшая часть энхансеров имеет специфичность к определенным промоторам (Butler and Kadonaga 2001, Smale 2001), тогда как большинство из них могут активировать экспрессию широкого спектра генов Было предположено, что геном эукариотической клетки организован в функциональные домены. Эта гипотеза предсказала существование граничных элементов, кочорые не позволяют энхансерам активировать «чужие» промоторы Такие элементы были найдены и получили название инсуляторы. Инсуляторы способны нарушать взаимодействие между энхансером и промотором, но только в том случае, если находятся между ними. Примером таких инсуляторов является Su(Hw) В то же время не все подобные регуляторные элементы обладают столь очевидными свойствами.

Гомеозисный ген Abdominal-B Удалее в тексте - Abd-B) участвует в образовании парасегментов дрозофилы (Mihaly et al 1998) Его регуляторная область размером примерно 50 т.п.н. находится на 3' конце гена и состоит из отдельных регуляторных доменов, каждый из них содержит один энхансер и регулирует экспрессию Abd-B гена только в одном из парасегментов дрозофилы Предполагается, что инсуляторы окружают каждый энхансер и образуют ряд независимых регуляторных доменов. Например, один из таких доменов окружен инсуляторами Frontabdominal-7 и Frontabdominal-8 (далее в тексте - Fab-7 и Fab-8, соответственно). Исходя из определения инсулятора, трудно объяснить каким образом энхансер, окруженный двумя инсуляторами,

ранскрипцию гена Ahd-B MtväoHAJif БИБЛИОТЕКА CfUmpfypr OS

Следовательно, элемент Fab-7, хоть и проявляет инсуляторные свойства в экспериментах на трансгенах (Hagstrom et al 1996), имеет более сложную структуру и функции

Одной из самых больших проблем при исследованиях на трансгенах является эффект положения. Эффект положения генетической конструкции в геноме приводит к тому, что экспрессия генов одной и той же генетической конструкции может существенно различаться у разных трансгенных линий Причиной эгого служит влияние регуля горных элементов, окружающих точку встраивания конструкции в геном Следовательно, при исследовании, например, взаимодействия между регуляторными элементами необходимо иметь возможность удалять каждый из этих элементов из генетических конструкций. Для этою используют Cre/loxP и Flp/frt- рскомбиназные системы (Golic and Lindquist 1989, Siegal and Hartl 1996), которые позволяют удалять части конструкций из генома трансгенных мух Однако, для проведения mhoi их современных исследований, двух этих систем недостаточно Например, для исследования взаимодействий между инсуляторами, требуется "вырезать" все инсуляторы (не менее двух) и энхансеры маркерных генов конструкции Следовательно, создание новых систем для in-vivo редактирования последовательностей генетических конструкций позволит облегчить исследования сложных регуляторных систем, например инсуляторов регуляторной области гена Abd-B.

Цель и задачи исследования.

Основная цель работы состояла в изучении структуры и описании новых функций регуляторного элемента Fab-7 Drosophila melanogaster

В работе были поставлены следующие задачи'

1 Создагь новый метод делеции заданной последовательности в трансгенных линиях Drosophila melanogaster.

2 Изучить внутреннюю структуру элемента Fab-7 Drosophila melanogaster

3. Изучить функциональную значимость сооавных частей элемента Fab-7

4. Исследовать возможность функционального взаимодействия между двумя копиями Fab-7 инсулятора.

Научная новизна и практическое значение работы,

В работе разработан новый метод, позволяющий удалять заданную последовательность в трансгенных линиях Drosophila melanogaster Это позволит существенно облегчить изучение ряда вопросов современной молекулярной биоло> ии, 1аких как, например, изучение сложных регуляторных систем

Впервые показано, что два элемента Fab-7 могут функционально взаимодействовать между собой Также впервые показано, чго инсуляторные свойства элемента Fab-7 зависят от положения в конструкции Эти результаты помогут исследователям понять, каким образом

энхансеры могут стимулировать промотор через несколько инсуляторов в процессе регуляции гомеозисяого гена Abd-B.

Апробация работы. Основные научные результаты диссертационной работы были представлены на III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004) и на 9-ой международной Пущинской школе- конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущипо, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и тезисов научных сообщений.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 52-Страницах, включает 7 таблиц и 15 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 115 источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1 Фрагмент Fab-7264, в отличие от фрагмента Fab-7858, обладает свойствами PRE.

Основной задачей работы является исследование структуры регуляторного элемента Fab-7 Как известно из литературы (Hagstrom et al 1997, 7hou et al 1996), он имеет сложное устройство как с точки зрения упаковки окружающего его хроматина, так и с точки зрения функционирования его различных частей Было показано, что сайты связывания белков группы Polycomb локализуются в области третьего сайта гиперчувствигельности к обработке ДНКазой-I (HS3, рис 1), фрагмент Fab-7264 Это позволило сделать предположение о существовании элемента PRF (Polycomb Responsible Element - последовательности ДНК, с которыми связываются белки группы Polycomb) в этой области

- Fab-71

- Fab 72

- Fab-73

Fab-7 264

_Fab-7 858_;

_Fab-7"03_

_Fab-7 909_

Fab-7603 --Fab-7 681

Fab-7400

Рис 1. Фрагменты Fab-7, исследуемые в работе Выше приведена схема регуляторного элемента ГаЬ-7 и мутантных аллелей Fab-71, Fab-72 и Fab-73 Флажок - место локализации транспозона Bluetail. HS1, HS2 и HS3 - сайты гиперчувствительности к обработке ДНК-азой I.

Существуют несколько признаков, которые характерны для всех элементов PRF Во-первых эти элементы являются сайленсерами, т е подавляют экспрессию окружающих генов Белки группы Polycomb (Рс-белки) взаимодействуют с PRF, образуя мультимерные

комплексы Pc-белки, связавшись с ДНК, могут распространяться на большие расстояния и подавлять экспрессию окружающих генов Механизм их действия не известен, однако неактивное состояние генов может наследоваться следующими поколениями Во-вторых, сайленсерная активность PRE увеличивается для организмов (в нашем случае мух), гомозиготных по аллелю, несущему элемент PRF Например, если PRE в генетической конструкции (далее просто конструкции) расположен перед геном miniwhite, то цвет глаз у мух, гомозиготных по аллелю с этой конструкцией, как правило, светлее, чем у Iетерозиготных. В-третьих, степень подавления генов, окружающих PRE, зависит от дополнительных мутаций, нарушающих действие Рс-белков. Так, сайленсерная активность PRE может уменьшаться в присутствии мутации ph410, которая затрагивает ген polyhomeotic (его продукт является белком группы Pc). В-четвсртых, Рс-зависимое подавление экспрессии генов становится более эффективным при увеличении температуры.

Для исследования свойств предполагаемого PRE (фрагмент Fab-7264) из регуляторного элемента Fab-7 была создана конструкция Eny(Ene)F7264YW (см рис 2) Здесь фрагмент Fab-7264 (на рисунке - Г264) был помещен между энхансерами тела (Е(Ь)) и крыльев (E(w)) и промотором гена yellow в положении -893 пн относительно старта транскрипции гена Энхансер гена был окружен сайтами для рекомбиназы Flp (на рисунке - fit) и встроен между энхансерами тела и крыльев Фрагмент Fab-7264 был ориентирован своей дистальной (по положению в хромосоме) частью к промотору гена yellow.

В результате трансформации в эмбрионы линии y'w"ls было получено 19 независимых трана енных линий, содержащих одиночную инсерцию конструкции Eny(Ene)F7264YW Для проверки функциональности элемента PRE мы сравнили уровень экспрессии гена white у мух i етерозиготных и гомозиготных по конструкции Eny(Ene)F7264YW (ем таб 1) Здесь и далее пигментацию глаз оценивали в соответствии со следующей шкалой- белые (аллель w"18 - полная инактивация гена white, далее в таблицах -Б), светло-желтые (далее в таблицах - СЖ), желтые (Ж), темно-желтые (ТЖ), оранжевые (Ор), темно-оранжевые (ТОр), коричневые (К), темно-коричневые (ТК), красные (уровень пигментации дикого типа, в таблицах - Кр) В таблице - число трансгенных линий имеющих соответствующую окраску глаз у мух, гетерозиготных и гомозиготных по конструкции Eny(Ene)F7264YW. В 11 из 19 трансгенных линий интенсивность окраски глаз у гомозиготных мух была ниже, чем у гетерозиготных. В 6 случаях наблюдался противоположный эффект, в двух случаях окраска глаз гетерозиготных и гомозиготных мух не отличалась. Это означает, что в нашей системе фрагмент F7264 проявляет свойства PRE. Независимо от нас, в лаборатории проф Кавалли был протестирован этот же фрагмент и

показано, что on обладает всеми четырьмя свойствами, характерными для элементов PRE (Dejardin and C'avalli, 2004)

E(e) E(br)

E(w) A E(b) F264 r yellow mirawhite

-" i ">-0 " "

~ J« ^ и

fit frt

Рис. 2. Схема конструкции Eny(Ene)F7264YW

Другая картина наблюдалась для фрагмент ГаЬ-7858. Эта часть Fab-7 покрывает первый и второй сайты гиперчувствительности к обработке ДНКазой-I (HS1 и HS2, рис. 1) и является дополнительной к Fab-7264. Находясь в том же положении в конструкции (анализ

OfЛ А£6 QCO

конструкции (En)(F7 )Y(F7 )W, деления дистального Fab-7 ), этот элемент не проявляет свойств PRE - во всех линиях мухи гомозиготные по эюй конструкции имею! более интенсивную окраску глаз, чем гетерозиготы. Таким образом, Fab-7 был разделен на две части одна из них является полноценным PRE, а дру1ая не несет в себе сай юн связывания для Рс- белков и не проявляет характерных свойств, т е не является PRE.

Таблица 1 Феногапы мух гетерозиготных и гомозиготных линий по конструкции Eny(Ene)F7264YW (сокращения в тексте).

Б СЖ Ж тж Ор ТОр к тк Кр

гетерозиготные мухи 0 1 2 3 2 6 4 1 0

гомозиготные мухи 2 6 3 0 0 3 1 0 4

2. Создание нового метода делении заданной последовательности в трансгенных линиях Drosophila melanogaster.

В настоящее время изучение регуляции экспрессии генов у высших эукариот перешло на новый уровень от исследования активности отдельных шхансеров или промогоров к исследованию сложных регуляторных систем, состоящих из нескольких элементов Примером таких сложных регуляторных систем может являться элемент Fab-7 - он имеет сложную структуру и различные его части выполняют иногда противоположные функции (см. ниже) Эффект положения генетической конструкции в геноме приводит к тому, что экспрессия генов одной и той же генетической конструкции может существенно различаться у разных трансгенных линий Причиной этого служит влияние регуляторных элементов, окружающих точку веграивания конструкции в геном. Для решения этой проблемы

используют Cre/loxP- и Flp/frt- рекомбиназные системы, которые позволяют удалять части конструкций из генома трапсгенных мух Однако, современные исследования сложных регуляторных элементов требуют большего числа подобных систем (см выше) Нами был разработан новый метод, который основан на использовании дрожжевой эндонуклеазы 1-Scel Этот фермент делает двухцепочечные разрывы по специфичной последовательности длиной 18 пн.

Ген, кодирующий эндонуклеазу I-Scel, находится в интроне большой митохоидриальной рРНК дрожжей (Dujon, 1988) Биохимические эксперименты показали, что этот фермент связывается со специфической последовательностью длиной 18 пн и вносит двойной разрыв, оставляя одноцепочечную 5'-последовательность длиной 4 пн (Colleaux et al 1988) Как было показано ранее (Gong and Golic 2003), дрожжевая эндонуклеаза I-Scel может успешно разрезать ДНК в геноме Drosophila melanogaster. Однако, ген yellow, окруженный сайтами узнавания I-Scel, вырезался с частотой 2-7% (Gong and Golic 2003). С другой стороны, когда сайт 1-SceI был окружен с двух сторон гомологичной последовательностью, двухцепочечные разрывы, индуцируемые I-Scel экзонуклеазой, эффективно репарировались (около 80% потомков) при помощи рекомбинации между гомологичными повторами (Rong and Golic 2003) Похожая частота гомологичной рекомбинации индуцируется вырезанием Р-элемента, окруженного двумя прямыми повторами (Preston et al. 2002). Для получения более высокой частоты вырезания, мы окружили I-Scel сайты прямыми повторами длиной 126 пн Предполагалось, чго двухнитевой разрыв, индуцируемый I-Scel эндонуклеазой, будет репарироваться с использованием гомологичных повторов, расположенных на одной и той же хроматиде В результате, должна происходить делеция последовательности, которая находится между повторами.

Для подтверждения этого предположения было создана конструкция (En)YW (см рис 3) Здесь глазной энхансер был встроен между энхансерами крыльев и тела Фрагмент ДНК размером около 3 тпн, содержащий энхансеры, был встроены между сайтами I-Scel (на рисунке - прямоугольники с падписью I-Scel), которые снаружи были окружены прямыми повторами длиной 126 пн (па рисунке - жирные короткие стрелки) Если ферментативная активность эндонуклеазы I-Scel приводит к делении всей последовательности ДНК заключенной между сайтами узнавания I-Scel, то удаление всех энхансеров приводит к резкому снижению экспрессии генов yellow и while, что коррелирует с изменением фенотипа трансгеных мух- тело и крылья становятся желтыми, глаза - слабо пигментированными

Е(е)

E(w) к E(b)

Elbr)

yellow

miniwhrte

Э1 '"Scel

J l-Scel I ^

Рис 3. Схема конструкции (En)YW.

В результате трансформации в эмбрионы дрозофилы было получено 16 трансгенных линий, содержащих единичную копию конструкции (En)YW В качестве источника эндонукпеазы I-Scel, была использована ранее созданная линия v;P{v*hsp70I-SteI}, несущая ген эндонуклеазы I-Scel под промотором теплового шока (Rong and Golic, 2000) Для сравнения частот вырезания в различном генетическом окружении, мы исследовали все 16 трансгенных линий. Для получения самцов содержащих (En)YW и hsp70-I-SteI мы проводили скрещивания мух, несущих эти конструкции. Для индукции экспрессии гена hsp70-l-SceI, потомство, полученное после скрещивания (на первый день развития эмбрионов) обрабатывали тепловым шоком в течение одного часа Степень мозаичности окраски тел и глаз в самцах Fi отражала частоту вырезания в соматических клетках. Для определения частоты вырезания в половых клетках, самцы Fi скрещивались с самками y'w"ls, которые имеют неокрашенные глаза и тело Анализируя это скрещивание, мы обнаружили, что часть потомков (примерно 8-12 %) имели желтое тело и крылья и слабо пигментированные глаза, что является следствием делении энхансеров. Таким образом, во всех трансгенных линиях конструкции (En)YW эндонуклеаза I-Scel может индуцировать вырезания энхансеров.

Для дальнейшего анализа, мы выбрали по две линии, показавшие наибольшую (В1 и В2) и наименьшую (HI и Н2) частоту вырезания в предыдущем эксперименте. Для повышения частоты вырезания, мы увеличили время теплового шока до двух часов и выполняли его либо на первый, либо второй, либо третий день после начала кладки яиц. Мы обнаружили, что большинство самцов Fi имели высокую мозаичность глаз и тела, что свидетельствует о высокой частоте вырезания в соматических клетках. В потомстве самцов Fi, мы обнаружили от 20% до 50% мух, имеющих окраску кутикулы и глаз как у мух без энхансеров (см. таб. 2). Только 2% потомства имело промежуточную степень пигментации тела и глаз, что связано с частичной потерей энхансеров

* 4 ± А

Рис. 4. А. Схемы конструкции (Еп)У>У и ее производных после вырезания при помощи эндонуклеазы 1-8се1. Под схемами производных приблизительная доля (в процентах от общего количества мух с вырезаниями) каждого варианта. Б. ПЦР - анализ ДНК независимо выбранных мух с новым фенотипом Полосы длиной 920 пн отмечены стрелками, случай не полного вырезания - звездочкой.

Молекулярный анализ событий вырезания проводился с использованием метода ПЦР (Рис. 4). Для этого случайным образом бьио выбрано 93 независимых линии мух, имеющих фенотип отличный от начального Амплификация ДНК между нраймерами окружающими прямые повторы дала полосу в 760 пн (77 трансгенных линий) и 920 пн (15 трансгенных

9

линий), в то время как размер между этими праймерами в начальной конструкции был 3,5 тпн (Рис 4) Секвенирование четырех полос длиной 760 пн показало, что они имеют один прямой повтор на месте делеции Секвенирование двух полос по 920 пн показало, что их появление связано с восстановлением одного сайта ЬБсеТ между двумя повторами по 126 пн. Амплификация ДНК между этими же праймерами в линии с промежуточным феношпом дала полосу 2 тпн, что подтвердило предположение о частичной потере энхансеров Таким образом, показано, что примерно в 98% случаев двухцепочечный разрыв, индуцируемый эндонуклеазой Т-ЯсеТ. приводил к потере энхансеров, оставляя или один прямой повтор или один сайт для 1-8се1 и два прямых повтора длиной 126 пн Полученные данные демонстрируют, что 1-8се1 индуцирует в подавляющем количестве случаев полную делецию энхансеров.

Таблица 2. Эффективность вырезания энхансеров в половых клетках мух конструкции (Еп)У\У.

Трансгенная Условия проведения Общее Число мух с Частота

линия теплового шока", число вырезанными вырезания

ч/день мух энхансерами6 энхансеров, %

Н1 2/1 449 170 38

2/2 399 115 29

2/3 380 102 27

2/3 раза 662 560(5) 85

В1 2/1 373 132 35

2/2 425 96 23

2/3 589 175 30

2 / 3 раза 715 634(10) 89

В2 2/1 354 152 43

2/2 467 240 51

2/3 805 392 49

2/3 раза 620 564 (6) 91

Н2 2/1 127 26 20

2/2 851 315 37

2/3 290 77 27

Примечание. а условия проведения теплового шока' 2 часа на первый (2/1), второй (2/2), третий день (2/3) или трижды в течении первых трех дней после начала развития эмбрионов (2/3 раза).6 в скобках - число мух с частичной потерей энхансера.

Для определения влияния уровня экспрессии эндонуклеазы I-Scel на частоту вырезания, мы выполняли тепловой шок по два часа трижды на 1-3 день после начала кладки яиц Все самцы Fi имели экстремально высокую степень мозаичности глаз и тела, что означает высокую частоту вырезания в соматических клетках R потомстве самцов F| 85-90% мух имели желтые глаза и неокрашенное тело, то есть имели фенотип как у мух бе) энхансеров тела и глаз Таким образом, система на основе эндонуклеазы I-Scel может быгь использована, наряду с ранее описанными Сге/loxP- и Flp/frt- системами, для вырезания части конструкции из трансгенных мух Наши результаты свидетельствуют о том, что и другие редкощепящие эндонуклеазы также могут быть использованы для этой цели, что открывает возможность создания множества подобных систем Существование нескольких систем для in-vivo редактирования позволят, например, проводить изучение сложных регуляторных систем, несмофя на эффект положения в геноме Кроме того, TScel система, в отличии от Сге/loxP- и Пр/frt- систем, дает 1-2% неполных вырезаний, что позволяет использовать ее для проведения экспериментов по исследованию функционально значимых участков энхансеров.

3. Фра1мешы Fab-71103 блокируют взаимодействие между энхапсером и промотором и функционально взаимодействуют между собой.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что элементы МСР (Miscadastral pigmentation) и инсуляторы su(Hw) могут функционально взаимодействовать друг с другом (Muravyova et al. 2001; Gruzdeva et al 2005). Поскольку такое взаимодействие може! игран, важную роль в регуляции экспрессии гена Abd-B мы, используя новую систему для вырезания части конструкции из трансгенных мух, исследовали возможность и причины функционального взаимодействия между различными фрагментами элемента Fab-7

Известно, что фрагмент длиной 3.6 тпн, включающий в себя Fab-7, может взаимодействовать с таким же эндогенным фрагментом и с друюй конструкцией, также содержащей этот фрагмент (Bantignies et al 2003) Учитывая способность элементов PRE усиливать свое действие в гомозиготе, авторы предположили, что этот эффект основан ro многом, на взаимодействии Рс-белков Для проверки этой гипотезы нами были созданы несколько конструкций.

В конструкции (En)(F7ll03)Y(F7l,03)W (см рис. 5), фрагменты Fab-71103 (на рисунке -F1103) были встроены с разных сторон от гена yellow и в противоположной друг к другу ориентации- один в -893 относительно начала транскрипции гена yellow (проксимальный), второй - между генами yellow и white (дистальный) Дистальный фрагмент был окружен сайтами для рекомбиназы Сге (на рисунке - 1ох) Проксимальный окружали сайты для рекомбиназы Flp Онхасеры, в свою очередь, были помещены между прямыми повторами и

сайтами узнавания эндонуклеазы I-Scel, как в конструкции (En)YW. При этом оба фрагмента находились в такой ориентации, что сайленсерные части были расположены со стороны гена yellow

Таблица 3. Фенотипы грансгенных линий конструкции (Еп)(Р71103)У(Р71103)\У (Еп)(Р71|03)У(Р7||03)\У, (Еп)У(Р7П03)\У, (En)(F7и03)YW и (Еп)У\У означает исходную конструкцию, производную без проксимального РаЬ-71103, дистального РаЬ-71'03 и без обоих, соответственно. В таблице - число трансгенных линий, имеющих соответствующий цвет глаз.

Б СЖ Ж ТЖ Ор ТОр К ТК Кр

(En)(F7"ui)Y(F7'"JJ)W 0 0 2 4 1 3 3 6 2

(En)Y(F7MU3)W 0 0 1 4 3 2 4 6 1

(En)(F7ll,u)YW 0 1 2 6 4 6 0 2 0

(En)YW 0 0 0 2 0 4 6 6 3

Е(е) Е(Ы)

E(w) A E(b) F1103 П ув11ст m03 mlniwhlte

- I- н::^ t-^^и—г-

see see fit fit kx km

Рис. 5. Схема конструкции (EnXF7' l03)Y(F7' 103)W.

Сначала мы изучили способность элемента Fab-71103 блокировать взаимодействие между энхансером и промотором Делеция проксимального Fab-7"03, если дистальный уже удален, снижает уровень экспрессии гена white в 20 из 21 полученных трансгенных линий, причем в 16 из них степень пигментации глаз изменяется очень существенно (на несколько степеней градации). Это означает, что проксимальный фрагмент Fab-71'03 является хорошим инсулятором. С другой стороны, удаление дистального фрагмента, при заранее удаленном проксимальном, только в 4 случаях приводит к серьезному изменению степени пигментации глаз. В 7 трансгенных линиях уровень экспрессии лишь немного повысился, а в 10 из 21 линий цвет глаз не изменился вообще. Такое различие в свойствах дистального и проксимального фрагментов Fab-71103 можно объяснить либо полярностью элемента Fab-7"03 (он включает в себя элемент PRE), либо зависимостью его инсуляторпых свойств от положения в трансгене (см. ниже)

Делеция дистального Fab-71103 существенно снижает уровень пигментации глаз в 14 из 21 трансгенных линий (см. таб. 3.). С другой стороны, удаление дистального Fab-71103 не

12

влияет на пигментацию глаз, если удален проксимальный фрагмент и все энхансеры Следовательно, дистальный фрагмент сам по себе не влияет на уровень экспрессии рядом расположенного гена white. Тогда увеличение экспрессии гена white в присутствии двух копий Fab-7 инсулятора в 14 трансгенных линиях можно объяснить частичной нейтрализацией блокирующей активности фрагментов Fab-71'03 при их взаимодействии Таким образом, на основе полученных данных можно сделать вывод, что инсуляторы Fab-71103 функционально взаимодействуют, а это предполагает также и их физическое взаимодействие. Однако эффективность такого взаимодействия, выражающегося во взаимной нейтрализации инсуляторной активности, значительно ниже, чем было ранее показано для инсулятора Su(Hw). Наиболее вероятно, что эти различия связаны не с эффективностью физического взаимодействия между этими инсуляторами, а скорее с различиями в их свойствах и механизме действия.

С другой стороны, способность энхансера глаз в исходных линиях, несмотря на два PRE, активировать ген white, означает, что элемент Fab-7 способен ограничивать негативное действие Рс- белков.

4. Элементы PRE не влияют на функциональное взаимодействие инсуляторов

Fab-7.

Для определения роли PRE в способности элементов Fab-71103 функционально взаимодействовать между собой была создана конструкция (En)F7858(F7264)Y(F72M)F7858W (см. рис 6). Фрагмент Fab-71103 был разделен на две части (см. рис. 1.): Fab-7264, который заключает в себе сайты связывания для Рс- белков и проявляет все свойства PRE, и Fab-7858, который не является PRE Фрагменты Fab-7858 и Fab-7264, окруженный в одном случае сайтами для Сге- рекомбиназы, а в другом - для Flp- рекомбиназы, были соединены между собой. Затем они были встроены с разных сторон от гена yellow и в противоположной друг к другу ориентации: один в -893 относительно начала транскрипции гена yellow (проксимальный), второй - между генами yellow и white (дистальный). Энхансеры тела, крыльев и глазной энхансер были помещены между прямыми повторами и сайтами узнавания эндонуклеазы I-Scel, как в конструкции (En)YW.

mmiwhlte

yellow

F858

see see frt frt lox lox

Рис. 6. Схема конструкции (En)F785!(F7264)Y(F7264)F7858W.

В результате трансформации в эмбрионы линии y'w1"8 было получено 18 независимых трансгенных линий, содержащих одиночную ипсерцию конструкции (En)F7858(F7264)Y(F7264)F78s8W. В II из 18 трансгенных линий кооперативное действие PRE приводило к пожелтению щетинок у мух. Уровень экспрессии гена yellow в теле и крыльях также был снижен, что можно объяснить как инсуляторной активностью фра! ментов Fab-7, так и прямой репрессией промотора гена yellow Уровень экспрессии гена white напротив был достаточно высок, на уровне экспрессии в конструкции (En)YW В общем, фенотипы трансгенных линий были похожи на фенотипы линий конструкции (En)(F7"03)Y(F7"01)W, а значит изменение во внутренней структуре элемента Fab-7 (за счет введения сайтов узнавания рекомбиназ) не оказало влияния на ею функцию Удаление как одного из элементов Fab-7264 (PRE), гак и обоих сразу не привело к заметным изменениям в сгеиени пигментации глаз ни у одной из 18 трансгенных линий ни в поколении F3 (первое поколение после удаления фрагментов), ни в одном из последующих поколений В 9 из 11 линий, у которых щетинки изначально не были окрашены, удаление обоих PRE привело к потемнению щетинок Уровень экспрессии гена yellow оставался неизменным во всех производных исходных линий. Таким образом, на основе полученных данных можно сделать вывод, что элементы PRE не влияют на способность Fab-71'01 функционально взаимодействовать между собой Следовательно, такой же способностью должны обладать ботее короткие фрагменты Fab-7858 Для проверки этого предположения, была создана конструкция (F.n)(F7S58)Y(F7858)W.

5. Фрагменты Fab-7858 блокируют взаимодействие между энхансером и промоюром, функционально взаимодействуют между собой, не обладают полярностью и их ипсуляторныс свойства зависит оi положения в конструкции.

Конструкция (En)(F7858)Y(F78S8)W (см рис 7) была построена по той же схеме, что и (fcn)(F7'l03)Y(F71,03)W, только вместо фрагмента Fab-71103 был взят фрагмент hab-7858. Для 11 трансгенных линий, содержащих одиночную инсерцию конструкции (En)(F7858)Y(F7858)W, нами было проанализировано все восемь возможных конфигураций трансгенов (см таб 4)

Как и предполагалось заранее, мухи всех 11 линий имели темные щетинки - фрагмент Fab-7858 не обладает свойствами PRE Уровень экспрессии гена yellow в теле и крыльях, напротив, был снижен, что можно объяснить инсуляторной активностью фрагменюв Fab-7т Во всех линиях мухи имели высокий уровень экспрессии гена white в глазах. Делсция энхансеров приводила к резкому снижению степени окраски глаз, а значит, глазной энхансер способен эффективно стимулировать промотор через два Fab-7858 Причем, степень пигментации глаз у производных без обоих Fab-7858 была такой же, как и у исходных линий (см таб 4) Таким образом, два фрагмента Fab-7858 не оказывали существенного влияния на

взаимодействие между энхансером и промотором, и их функциональное взаимодействие приводило к потере ими инсуляюрных свойс!в Для изучения инсуляторных свойсхв отдельного Fab-7858, мы сравнили степень пигментации глаз у производных с делецией сначала дистального, а затем проксимального Fab-7858 с линиями без обоих элементов. Как и в случае с конструкцией (Fn)(F7"M)Y(F7"03)W, были обнаружены сущей венные различия только проксимальный Fab-7SS8 эффективно блокировал глазной энхансср во всех 11 линиях, в то время как дистальный Fab-7858 в этих же 11 линиях не оказывал почти никакого влияния на взаимодействие между энхансером и промотором Это! вывод был подтвержден при изучении уровня экспрессии гена while в семенииках. Мухи исходных линий, линий без проксимального Fab-7858 и без обоих инсуляторов имели высокую степень пигментации семенников И наоборот, цвет семенников у мух линий без дистального инсулятора и всех производных без энхансеров был белым Используя возможности трех систем для удаления частей из конструкции, путем сравнения различных конфигураций фансгена в одном и том же генетическом окружении, мы показали, что ни дистальный, ни проксимальный фрагменты ГаЬ-7858 не могут непосредственно влиять на уровень экспрессии гена white ни в глазах, ни в семенниках. Тотда различия в свойствах двух Fab-7858 можно объясншь либо полярностью инсуляторов, либо зависимость их свойств от положения в конструкции

Таблица 4 Фенотипы трансгенных линий конструкции (En)(F7s58)Y(F7858)W (En)(F7858)Y(F7858)W, (En)Y(F7858)W, (En)(F7i58)YW и (En)YW означает исходную конструкцию, производную без проксимального Fab-7858, дистального Fab-7858 и без обоих, соответственно (F7858)Y(F78,8)W, Y(F7S,8)W, (F7858)YW и YW соответствующие производные без энхансеров В таблице - число трансгенных линий, имеющих соответствующий цвет глаз

Б СЖ Ж ТЖ Op TOp к ТК Кр

(En)(F7sl'8)Y(F7l"8)W 0 0 0 0 2 4 3 2 0

(F7*5*)Y(F7*w)W 0 1 6 4 0 0 0 0 0

(En)YW 0 0 0 0 1 4 5 1 1

(En)Y(F78;")W 0 0 0 1 2 6 1 1 0

0 1 8 2 0 0 0 0 0

(En)(F78i8)YW 0 0 5 2 2 1 0 0 0

(F7858)YW 0 4 6 1 0 0 0 0 0

YW 0 1 9 1 0 0 0 0 0

E(e) E(br)

yellow F858 mlniwhite

E(w) A E(b) F858

I "

♦ 111 *

■lb

'J ♦ ♦

see see frt frt lox lox

Рис 7 Схема конструкции (En)(F785S)Y(F7858)W

Для изучения полярности этого инсулятора было создано две конструкции. Первая конструкция (Еп)(Г7к58КЕ\')У(Р785^ (см рис. 8) была создана по той же схеме, что и (Еп)(Р7858)У(Р7858)№, но ориен!ация проксимального РаЬ-7858 была изменена на обратную. Фенотипы 17 трансгенных линий (см. таб. 5), а также фенотипы их производных, не отличались от соответствующих для конструкции (ЕпХР?858^^?858^. Несмотря на изменение ориентации, проксимальный инсулятор не потерял способности блокировать взаимодействие между энхансером и промотором гена и>/«7е

Таблица 5. Фенотипы трана енных линий конструкции (ЕпЭрт^ЯЕУ^Р?858^.

Б СЖ Ж ТЖ Ор ГОр К ТК Кр

(En)(F7"eREV)Y(F7i"e)W 0 0 0 1 3 6 4 1 2

(En)Y(F7S58)W 0 0 0 3 2 5 6 0 1

(En)(F78,8REV)YW 0 3 7 1 4 2 0 0 0

Е(е) Е(Ы)

E(w) к E(b) F858 Г yellow F858 mlniwhite

\

♦ * 4 ♦ *

SCO frt frt lox lox

Рис 8 Схема конструкции (En)(F78,8REV)Y(r7858)W

Во второй конструкции (En)YF78S8REVW (см. рис 9) фрагмент Fab-7858 был вставлен в обратной ориентации (относительно днегального Fab-7858 н (En)(F7858REV)Y(F78,8)W) между генами yellow и white Энхансеры, как и в большинстве предыдущих конструкций, были помещены между прямыми повторами длиной 126 пн и сайтами узнавания эндонуклеазы I-Scel.

В результате трансформации в эмбрионы линии y'w,us было получено 13 независимых трансгенных линий, содержащих одиночную инсерцию конструкции (En)YF7858REVW. Делеция энхансеров в 11 из 13 линий приводила к резкому уменьшению

уровня экспрессии гена white в глазах (см таб 6) Следовательно, глазной энхансер способен эффективно стимулировать промотор гена через Fab-7858 и этот элемент, находясь в "диетальном" положении, не проявляет инсуля горных свойств в обеих возможных ориентациях.

Таблица 6. Фенотипы трансгенных линий конструкции (En)YF7858REVW.

Б СЖ ж тж Op TOp К ТК Кр

(En)YF7s:"lREVW 0 0 2 0 1 5 4 1 0

YF785SREVW 0 0 10 2 1 0 0 0 0

Е(е) Е(Ы)

ЕМ к Е(Ь)

Mr 1 i

^ - 1 - п !

1 I ♦

see see

yellcw

F858

minlwhite

Рис 9. Схема конструкции (En)YF7s,8REVW

Таким образом, инсуля горные свойства Fab-7858 не зависят or его ориентации относительно направления транскрипции генов yellow и white ни в "диетальном", ни в "проксимальном" положении и определяются положением в конструкции.

6. Фрагмент Fab-79IW способен защитить промотор от негативного действия PRE.

Как было показано ранее при анализе конструкции (bn)(F7ll03)Y(F71103)W, Fab-7 инсучятор способен полностью блокировав активность слабого PRE Следующей задачей исследование было проанализировать степень эффективности действия Fab-7 инсулятора при блокировании сайленсеров С этой целью был выбран наиболее сильный PRE, который регулирует активность энхансеров Ubx 1ена (Sigrist ct al. 1997)

Для изучения способности Fab-7 блокировать активность PRE нами была создана конструкция Eny(PRE)(F790')YEneW (см. рис 10).

E(bi) 2хЕ(е)

E(w) E(b) F909 yellow кк mlniwlvte

—- "С ,—HI ^ Ц l .._Гу

* ♦ ♦ ♦ j ft

frt frt lox lox

Рис. 10. Схема конструкции Eny(PRE)(F7909)YEneW.

Конструкция содержала PRF длиной 1,3 тпн из регуляторной части гена Ubx по куса Bithorax complex, любезно предоставленный проф Пирротой Этот фрагмент был окружен сайтами для FIp- рекомбиназы и вставлен между энхансерами тела и крыльев. Исследуемый фрагмент Fab-7909, в свою очередь, был окружен сайтами для Сге- рекомбиназы и встроен в положение -893 относительно начала транскрипции гена yellow Эпхансер глаз был удвоен и помещен между генами white и yellow

Таким образом, исследуемый фрагмент находился между PRE и промотором гена yellow, причем энхансер щетинок был расположен в нитроне гена yellow ниже точки начала транскрипции и moi активировать ген, если бы действие PRE ограничивалось Fab-7909 Было предположено, что, в случае положительного результата, найдется часть трансгенных линий, у которых изначально темные щетинки будут светлеть при вырезании фрагмента Fab-7909.

В результате трансформации в эмбрионы линии y'w"18 было получено 15 независимых трансгенных линий, содержащих одиночную инсерцию конструкции (bn)YF7858REVW Было обнаружено три класса линий В 9 из 15 линий степень пигментации щет инок была достаточно высокой, в то время как тело и крылья были окрашены слабо (от 1 до 3 по пятибалльной шкале) Делеция фрагмента Fab-7909 в 7 из 9 линий приводила к пожелтению щетинок Другими словами, в этих линиях элемент PRF имел возможность репрессировать промотор гена yellow но его воздействие было ограничено послсдовате гыгостью Fab-7909 Степень пигментации тела у производных без инсулятора в ряде случаев (3 линии) также уменьшилась, причем, как правило, это сопровождалось появлением мозаичности в окраске тела. Особенно хорошо этот эффект проявлялся при сравнении гомозигот, что характерно для PRE. В 2 т 9 линий, несмотря на удаление инсулятора, щетинки оставались интенсивно пигментированными Отсутствие репрессии в этих линиях объясняется тем, что окружающие место инссрции конструкции регуляторные элементы могут подавлять способность PRE репрессировать транскрипцию

Мухи второго класса линий (2 из 15) имели высокий уровень экспрессии как гена white в глазах, так и гена yellow в геле, крыльях и щетинках Причем, степень пигментации не изменялась при удалении различных частей конструкции

В 4 из 15 линий мухи имели окраску тела, крыльев и щетинок на уровне аллеля у1 (полная инактивация гена yellow) Это можно объяснить влиянием i енетического окружения и кооперативным усилением репрессии при взаимодействии с эндоюнными PRF Причем, мухи этих линий имели высокий уровень экспрессии гена white в глазах, но в 3 из 4 случаев окраска глаз была мозаичной. Удаление, как исследуемого фрагмента, так и элемента PRE не приводило к изменениям в уровне экспрессии yellow В дальнейшем, анализируя подобные линии в похожей конструкции Eny(PRE)(F7i03)YEneW (см ниже) мы обнаружили, что при

вырезании инсулятора степень пигментации глаз иногда уменьшаться и стновиться мозаичной Удаление инсулятора и PRE приводило к восстановлению уровня экспрессии i ена white в глазах. Следовательно, в некоторых случаях, на фоне усиления репрессии за счет генетического окружения, PRE может негативно влиять даже на ген white, несмотря на два глазных эпхансера, коюрые расположены между ними

Таким образом, было установлено, что фрагмент ГаЬ-7909 может защитить промотор от негативного влияния PRE. Было установлено три вида эффектов, которые, в рамках выбранной системы, позволяют сделать такой вывод'

- пожелтение изначально темных щетинок при вырезании фрагмента Fab-7

- уменьшение степени пигментации тела и появление мозаичности при вырезании элемента Fab-7

- появление мозаичности окраски глаз в линиях фенотипа у' при вырезании фрагмента

Fab-7.

7. Идентификация минимального элемента в Fab-7 инсуляторе, который блокирует активность PRE.

Используя разработанную систему, был проведен поиск наименьшего фрагмента, способного ограничивать действие PRE Для решения этой задачи были созданы три конструкции: Eny(PRE)(F7681)YEneW, Eny(PRE)(F7603)YEneW и bny(PRE)(F7400)YEneW. Все они являются аналогами конструкции Eny(PRE)(F7909)YEneW и отличаются друг ог друга лишь последовательностью Fab-7 в положении -893 относительно начала транскрипции гена yellow

Мухи трансгенных линий всех трех конструкций, полученные в результате трансформации в эмбрионы линии y'w",s, принадлежали к трем описанным для линий конструкции Eny(PRE)(F7909)YEneW классам Для конструкции Eny(PRE)(F7M1)YEneW у 12 из 26 линий, в результате анализа различных производных, были обнаружены черты, которые свидетельствуют о том, что элемент Fab-7603 может защитить промотор от негативного действия PRE (см таб 7) Для конструкций Eny(PRE)(F76il)YEneW и Eny(PRE)(F7400)YEneW таких линий было 3 и 2 соответственно, причем эффекты проявлялись более слабо, чем в первом случае Следовательно, только Fab-7603 может полноценно защитить промотор (см рис. 11). Из рисунка видно, что ни последовательности первого сайта гиперчувствительности к обработке ДНК-азой I (HS1, см гл 3 4), ни второго не могут сами по себе выполнять эту функцию

Таблица 7. Анализ трансгенных линий, содержащих конструкции Eny(PR£)(F768')YEneW, Eny(PRE)(F7603)YF.neW и Eny(PRE)(F7400)YEneW. В таблице -количество линий у которых при вырезании соответствующего фрагмента Fab-7 пожелтели щетинки (столбец "щетинки"), изменилась окраска тела ("тело") или уменьшилась интенсивность пигментации глаз ("глаза") В столбце "всего" указанно общее количество линий.

щетинки гело 1лаза всего

Eny(PRE)(F76l")YEneW 6 3 3 26

Eny(PRE)(F76S 1 )YEneW 0 2 1 23

Eny(PRE)(F74UU)YEneW 0 1 1 16

Fab-7909

Fab-7 603

Fab-7681

Fab-7400

Рис 11 Схема регуляторного элемента Fab-7 и его части, использованные в работе по защите о г PRE. Черные прямоугольники - фра1 менты, которые могут ограничивать распространение Рс- белков, белые прямоугольники - фра1 менгы, которые таких свойств не показали.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. 1. Новая система делении заданной последовательности в трансгенных линиях Drosophila melanogaster. Перспективы применения для решения различных задач современной биологии.

Для изучения функционального взаимодействия инсуляторов Fab-7 нам потребовалось иметь возможность удалить из одной и той же генетической конструкции не только два этих элемента, но и энхансеры маркерных генов Ранее существовало две системы, которые позволяли удалять части конструкций из генома трапаенных мух (Cre/loxP- и Flp/frt- рекомбиназные системы) Мы создали новую систему, которая с сопоставимой эффективностью может решить эту проблему Возможность анализа различных производных конструкции в одном и том же генетическом окружении позволила не только установить факт функционального взаимодействия, но и показать, что элементы сами по себе не могут активировать или репрессировать транскрипцию маркерных генов и, тем самым, существенно повысила надежность полученных результатов Также это позволило открыть новый эффект - зависимость инсуляторных свойств Fab-7 от места локализации в конструкции

Применение новой I-Scel- системы, в сочетании с ранее известными рекомбшшными системами, позволило решить проблему эффекта положения конструкции в геноме Эффект положения является одной из самых больших проблем при исследованиях на трансгенных организмах (в нашем случае - мухах) Одним из альтернативных способов решения этой проблемы может быть создание для конструкции собственного транскрипционного домена. Для этого на 3'- и 5'- концах конструкции размещают сильные инсуляторы, например Su(Hw) Такой подход имеет ряд недостатков, инсуляторы Su(Hw) взаимодействуют между собой и это может влиять как на процесс интеграции конструкции в геном (не случайные места встраивания в геном), так и нарушать картину дальних взаимодействий между конструкцией и геномом трансгенных мух.

Наши результаты свидетельствуют о том, что и другие редкощенящие эндонуклеазы также могут быть использованы для создания новых систем для in-vivo редактирования, что открывает возможность создания множества подобных систем Существование нескольких таких систем позволит, например, проводить изучение взаимодействий на больших расстояниях, когда потребуется анализировать несколько конструкций в одной мухе

Кроме того, I-Scel- система, в отличие от СгеЯохР- и Flp/frt- систем, дает 1-2% неполных вырезаний, что позволяет надеяться использовать ее для получения мутаций (делеций) в рамках сданной последовательности (которая находится между прямыми повторами и сайтами для эндонуклеазы I-Scel) Такая задача может возникнуть, например,

при поиске функционально значимых участков энхансеров Несомненным плюсом такого подхода может служить простота получения большого количества различных делений в одном и том же случайном генетическом окружении, что невозможно в рамках существующих подходов к решению этой задачи

2. Новые свойства и возможный механизм действия регуляторных элементов гена Abd-B.

Хорошо известно, что Abd-B ген участвует в образовании парасегмснтов дрозофилы (Mihaly el al 1998). Его регуляторная область размером примерно 50 т.п.н. находится на Т конце гена и состоит из отдельных регуляторных доменов Каждый из них содержит один энхансер, iab, и регулирует экспрессию Abd-B гена только в одном из парасегментов дрозофилы Например, энхансер ¡ab7 определяют экспрессию в парасегменте PS 12 При этом регуляторные домены расположены на хромосоме в том же порядке, в котором чередуются парасегменты вдоль оси эмбриона.

Регуляция Abd-B гена происходит в два этапа. Во время раннего эмбриогенеза регуляторные белки, отвечающие за первые этапы дифференцировки, активируют в каждом парасегменте определенный энхансер гена Abd-B Например, набор белков, присутствующих в области парасегмента PS11, способен активировать только iab6 энхансер, но не iab7 или iab8 что и приводит к правильному уровню экспрессии Abd-B гена в парасегменте PS 11.

Установленный активный или неактивный статус регуляторных доменов в определенном парасегменте поддерживается и после исчезновения первичных факторов дифференцировки. За это отвечают белки группы Polycomb и их антагонисты из группы trx (tri tórax).

Рассмотрим оба случая на примере iab-7. Если в регуляторный домен iab-7 неактивен, то с его элементами PRE связаны Рс-белки, которые не позволяют соответствующему энхансеру tab активировать ген Abd-B. Однако, элементы PRE способны распространять свое действие на большие дистанции и, если бы не показанная в работе способность фрагментов Fab-7 ограничивать это распространение, Рс- белки полностью выключили бы экспрессию гена Abd-B. Таким образом, эта функция элемента Fab-7 позволяет поддерживать независимый статус всех регуляторных доменов, содержащих энхансеры гена Abd-B. Ранее было показано, что граница Fab-8, расположенная на другом конце регуляторного домена энхансера iab-7, также имеет способность блокировать репрессию, вызываемую Рс-белками (Barges et al. 2000) Это позволяет предположить, что такой способностью обладают все границы в регуляторной области гена Abd-B

Если регуляторный домен iab-7 активен, то его энхансер должен активировать промотор гена Abd-B Но, как было показано ранее, Fab-7 является инсулятором (Hagstrom et

al 1996) и должен препятствовав взаимодействию энхансера и промотора. Однако, как было показано в этой работе, свойства Fab-7 зависят от места положения и конструкции Другими словами, существует возможность "выключить" это! инсулятор Механизм такого "выключения" пока не известен и это один из самых интересных вопросов, на который еще преде юи г найти ответ. В качестве кандидата можно предположить, например, транскрипцию последовательностей Fab-7. Как известно, в состав комплекса РНК-полимеразы II входят белки, способные модифицировать гистоны, входа щи с в состав нуклеосом, и влиять на структуру хроматина транскрибируемой последовательности. Это, в

• свою очередь, может приводить к изменению состава белков, связанных с ней и, как следствие, влиять на ее функцию Во всех конструкциях (см рис 7, 8, 9), где Fab-7 не влиял на взаимодействие между энхансером и промоюром, он находился в "дистальном" положении, т е сразу за кодирующей частью гена yellow Учитывая возможность не полной терминашш транскрипции гена yellow, можно предположить, что комплекс РНК-полимеразы II мог транскрибировать последовательность дисгального Fab-7 И наоборот, во всех конструкциях проксимальный Fab-7 не попадал в зону действия промоторов генов yellow и while, т к находился выше точки начала их ]ранскрипции Нельзя исключат], также возможность влияния на процесс инсуляции либо расстояний от энхансера до инсулятора и от инсулятора до промотора, либо их соо гношений

Ранее в нашей лаборатории было показано, что два элемента MCP moi у г взаимодействовать между собой В этой работе было показано, что такой способностью обладают также два элемента Fab-7 Возможно, такая способность может облегчать взаимодействие между энхансерами iab и промотором за счст сокращения расстояний между ними.

Таким образом, элемент Fab-7 является не просто инсулятором, но является сложным

* регуляторным элементом, который активно участвует в процессе управления экспрессией гена Abd-B.

Выводы:

1. Разработан новый меюд делеции заданной последовательности в трансгенных линиях Drosophila melanogaster, который позволит существенно облегчить исследования сложных регуляторных элементов

2 Впервые показано, что два Fab-7 инсулятора из регуляторной области гена Abd-B функционально взаимодействуют между собой.

3 Впервые продемонстрировано, что активность Fab-7 инсулятора сильно зависит от места инсерции между энхансером и промотором

4. Идентифицирован минимальный Fab-7 элемент, который способен блокировав активность сильного сайленсера PRE.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. С.А. Родин, О.В. Кырчанова, П.Г Георгиев. И (учение структуры регуляторного элемента Fab-7 и его роли в прос фане ¡венной организации хроматина внутри ядра. Тезисы стендовых сообщений III съезда биофизиков России (Воронеж, 24-29 июня 2004)

2 CA Родин, О.В. Кырчанова, ПГ. Георгиев. Белки группы Polycomb влияют на инсуляторную функцию регуляторного элемента Fab-7. Тезисы стендовых сообщений 9-ой международной Путинской школы- конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 18-22 апреля 2005).

3. С А. Родин, П Г Георгиев. Изучение свойств Fab-7 инсулятора у Drosophila melanogaster. ДАН, 2005, т. 404(2), с 263-266.

4. С А. Родин, П.Г. Георгиев. Новый метод делеции заданной последовательности в трансгенных линиях Drosophila melanogailer ДАН, 2005, т. 404(3), с 419-421.

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 10.10.2005 г.

22104

РНБ Русский фонд

2006-4 19735

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Родин, Сергей Алексеевич

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Общие вопросы регуляции экспрессии генов эукариот.

1.2 Определение и общие свойства инсуляторов.

1.3 Структура и функции инсуляторов.

1.3.1 Инсулятор Su(Hw).

1.3.2 Инсуляторы локуса теплового шока hsp70 - scs и scs'.

1.3.3 Инсуляторы регуляторной области гена Abd-B.

1.3.4 Инсулятор Fab-7.

1.3.5 Куриный Р-глобиновый инсулятор.

1.4 Модели действия инсуляторов.

1.4.1 Структурные модели.

1.4.2 Транскрипционные модели.

2. Материалы и методы. 34 2.1 Генетические методы.

2.1.1 Линии и мутации Drosophila melanogaster, использованные при генетических скрещиваниях в работе.

2.1.2 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий.

2.1.3 Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite в трансгенных линиях.

2.1.4 Генетические скрещивания. 37 2.2. Биохимические методы.

2.2.1. Выделение ДНК из дрозофилы.

2.2.2. Саузерн-блот-анализ.

2.2.3. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.2.4. Секвенирование плазмид и ПЦР продуктов.

2.2.5. Молекулярное клонирование.

2.2.6. Трансформация бактериальных клеток плазмидами.

2.2.7. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса.

2.2.8. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

2.2.9. Создание конструкций.

3. Результаты. л /г л о с о

3.1 Фрагмент Fab-7 , в отличие от фрагмента Fab-7 , обладает свойствами PRE.

3.2 Создание нового метода делеции заданной последовательности в трансгенных линиях Drosophila melanogaster.

3.3. Фрагменты Fab-71103 блокируют взаимодействие между энхансером и промотором и функционально взаимодействуют между собой.

3.4. Элементы PRE не влияют на функциональное взаимодействие инсуляторов Fab-7.

3.5. Фрагменты Fab-7858 блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, функционально взаимодействуют между собой, не обладают полярностью и их инсуляторные свойства зависят от положения в конструкции.

3.6. Фрагмент Fab-7909 способен защитить промотор от негативного действия PRE.

3.7. Идентификация минимального элемента в Fab-7 инсуляторе, который блокирует активность PRE.

4. Обсуждение.

4.1. Новая система делеции заданной последовательности в трансгенных линиях Drosophila melanogaster. Перспективы применения для решения различных задач современной биологии.

4.2. Новые свойства и возможный механизм действия регуляторных элементов гена Abd-B.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональное исследование регуляторного элемента Frontabdominal-7 гена Abdominal-B у Drosophila melanogaster"

Основными регуляторами активности гена эукариотической клетки являются энхансеры и сайленсеры, которые могут располагаться на больших расстояниях от регулируемого ими гена. Инсуляторы способны ограничивать их влияние и разделять геном эукариот на функциональные домены, содержащие один или несколько генов. Поэтому существенный научный интерес представляет изучение механизмов действия инсуляторов, энхансеров и сайленсеров на молекулярном уровне. Однако, несмотря на многочисленность научных исследований в этой области, существует несколько альтернативных моделей, объясняющих эти процессы.

Энхансерами принято называть последовательности ДНК, которые способны активировать транскрипцию независимо от ориентации и расстояния до точки начала транскрипции. Обнаружение этого класса регуляторных элементов поставило вопрос о том, каким образом клетка ограничивает действие этих регуляторных элементов только определенным набором промоторов, специфическим для различных тканей и периодов жизненного цикла клетки. Как показали эксперименты на трансгенных организмах и линиях трансгенных клеток (далее - трансгенах), лишь небольшая часть энхансеров имеет специфичность к определенным промоторам (Butler and Kadonaga 2001, Smale 2001), тогда как большинство из них могут активировать экспрессию широкого спектра генов. Было предположено, что геном эукариотической клетки организован в функциональные домены. Эта гипотеза предсказала существование граничных элементов, которые не позволяют энхансерам активировать «чужие» промоторы. Такие элементы были найдены и получили название инсуляторы. Инсуляторы способны нарушать взаимодействие между энхансером и промотором, но только в том случае, если находятся между ними. Примером таких инсуляторов является Su(Hw). В то же время не все подобные регуляторные элементы обладают столь очевидными свойствами.

Гомеозисный ген Abd-B участвует в образовании парасегментов дрозофилы (Mihaly et al. 1998). Его регуляторная область размером примерно 50 т.п.н. находится на 3' конце гена и состоит из отдельных регуляторных доменов, каждый из них содержит один энхансер и регулирует экспрессию Abd-B гена только в одном из парасегментов дрозофилы. Предполагается, что инсуляторы окружают каждый энхансер и образуют ряд независимых регуляторных доменов. Например, один из таких доменов окружен инсуляторами Fab-7 и Fab-8. Исходя из определения инсулятора, трудно объяснить каким образом энхансер, окруженный двумя инсуляторами, может активировать транскрипцию гена Abd-B. Следовательно, элемент Fab-7, хоть и проявляет инсуляторные свойства в экспериментах на трансгенах (Hagstrom et al. 1996), имеет более сложную структуру и функции.

Целью настоящей работы было изучение необычных свойств и структуры регуляторного элемента Fab-7. Используя молекулярный анализ мутаций этого элемента и поиск сайтов связывания известных белков с его последовательностью, мы предположили структуру элемента Fab-7 и, используя трансгенных мух, изучили их функции.

Одной из самых больших проблем при исследованиях на трансгенах является эффект положения. Эффект положения генетической конструкции в геноме приводит к тому, что экспрессия генов одной и той же генетической конструкции может существенно различаться у разных трансгенных линий. Причиной этого служит влияние регуляторных элементов, окружающих точку встраивания конструкции в геном.

Следовательно, при исследовании, например, взаимодействия между регуляторными элементами необходимо иметь возможность удалять каждый из этих элементов из генетических конструкций. Для этого используют Cre/loxP и Flp/frt рекомбиназные системы, которые позволяют удалять части конструкций из генома трансгенных мух. Однако, для проведения многих современных исследований, двух этих систем недостаточно. Например, для исследования взаимодействий между инсуляторами, требуется "вырезать" все инсуляторы (не менее двух) и энхансеры маркерных генов конструкции. Следовательно, создание новых систем для in-vivo редактирования последовательностей генетических конструкций позволит облегчить исследования сложных регуляторных систем, например инсуляторов регуляторной области гена Abd-B.

Нами была создана новая система на основе эндонуклеазы I-Scel, которая, наряду с ранее описанными Cre/loxP- и Flp/frt- системами, может быть использована для вырезания части конструкции из трансгенных мух. Наши результаты свидетельствуют о том, что и другие редкощепящие эндонуклеазы также могут быть использованы для этой цели, что открывает возможность создания множества подобных систем.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Родин, Сергей Алексеевич

Выводы.

1. Разработан новый метод делеции заданной последовательности в трансгенных линиях Drosophila melanogaster, который позволит существенно облегчить исследования сложных регуляторных элементов.

2. Впервые показано, что два инсулятора Fab-7 из регуляторной области гена Abd-B функционально взаимодействуют между собой.

3. Впервые продемонстрировано, что активность инсулятора Fab-7 сильно зависит от места инсерции между энхансером и промотором.

4. Идентифицирован минимальный фрагмент элемента Fab-7, который способен блокировать активность наиболее сильного PRE сайленсера.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Родин, Сергей Алексеевич, Москва

1. Bantignies F, Grimaud С, Lavrov S, Gabut M, Cavalli G. Inheritance of Polycomb-dependent chromosomal interactions in Drosophila II Genes Dev. 2003. V. 17. P. 2406-20.

2. Barges S., Mihaly J., Galloni M. et al. The Fab-8 boundary defines the distal limit of the bithorax complex iab-1 domain and insulated iab-1 from initiation elements and a PRE in the adjacent iab-8 domain // Development. 2000. V. 127 P.779-790.

3. Bell A. C., West A. G., Felsenfeld G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators // Cell. 1999. V. 98. P. 387-396.

4. Bell A.C., Felsenfeld G. Stopped at the border: boundaries and insulators // Curr. Opin. Genet. Dev. 1999. V. 9. P.191-198.

5. Bell A.C., Felsenfeld G. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene // Nature. 2000. V.405. P.482-485.

6. Bell A., West G., Felsenfeld G. Insulators and boundaries: versatile regulatory elements in the eukaryotic genome // Science. 2001. V.291. P.447-450.

7. Bi X., Broach J. Chromosomal boundaries in S. cerevisiae II Curr. Opin. Gen. Dev. 2001. V.ll. P.199-204.

8. Bi X., Broach J. UAS rpg can function as a heterochromatin boundary element in yeast // Genes Dev. 1999. V. 13. P.1089-1101.

9. Butler J., Kadonaga J. Enhancer-promoter specificity mediates by DPE or TATA core promoter motifs. // Genes and Dev. 2001. V. 15. P. 25152519.

10. Cai H., Levine M. Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo // Nature. 1995. V. 376. P. 533-536.

11. Cai H., Levine M. The gypsy insulator can function as a promoter-specific silencer in the Drosophila embrio // EMBO J. 1997. V.16. P.1732-1741.

12. Cai H., Shen P. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity // Science. 2001. V.291. P.293-295.

13. Chervitz S., Aravind L., Sherlock et al. Composition of the complete protein sets of worm and yeast: orthology and divergence // Science. 1998. V.282. P.2022-2028.

14. Chung J., Whitely M., Felsenfeld G. A 5' element of the chicken p-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila II Cell. 1993. V. 74. P. 505-514.

15. Chung J., Bell A., Felsenfeld G. Characterization of the chicken beta-globin insulator // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.94. P.575-580.

16. Colleaux L, D'Auriol L, Galibert F, Dujon B. Recognition and cleavage site of the intron-encoded omega transposase. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1988. V. 85. P. 6022-6.

17. Cuvier O., Hart C., Laemmli U. Identification of a class of chromatin boundary elements //Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P. 7478-7486.

18. Dejardin J, Cavalli G. Chromatin inheritance upon Zeste-mediated Brahma recruitment at a minimal cellular memory module. // EMBO. 2004. V. 23 P. 857-68.

19. Dillon N, Sabbattini P. Functional gene expression domain: defining the functional unit of eukaryotic gene regulation // Bioessays. 2000. V. 22. P. 657-665.

20. Donze D., Adams C.R., Rine J. et al. The boundaries of the silenced HMR domain in Saccharomyces cerevisiae И Genes Dev. 1999. V.13. P.698-708.

21. Dorsett D. Distant liaisons: long range enhancer-promoter interactions in Drosophilall Curr. Opin.Genet. Dev. 1999. V. 9. P. 505-514.

22. Dujon, B. Group I introns as mobile genetic elements: facts and mechanistic speculations // Gene 1988. V. 82. P. 91-114.

23. Dunaway M., Hwang J., Xiong M., Yuen H. The activity of the scs and scs' insulator elements is not dependent on chromosomal context // Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P.182-189.

24. Farkas G., Leibovitch В., Elgin S. Chromatin organization and transcriptional control of gene expression in Drosophila II Gene. 2000. V.253.P.117-136.

25. Galloni M., Gyurckovics H., Schedl P., Karch F. The bluetail transposon: evidence of independent m-regulatory domains and domain boundaries in the bithorax complex. // EMBO. 1993. V. 12. P. 1078-1097.

26. Gaszner M., Vazquez J., Schedl P. The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction // Genes Dev. 1999. V. 13. P. 2098-2107.

27. Georgiev P., Kozycina M. Interaction between mutations in the suppressor of Hairy wing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gypsy-induced mutations // Genetics. 1996. V. 142. P. 425-436.

28. Georgiev P., Corces V. The Su(Hw) protein bound to gypsy sequences in one chromosome can repress enhancer-promoter interactions in thepaired gene located in the other homolog // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V.92. P.5184-5188.

29. Gerasimova Т., Corces V. Polycomb and Trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator // Cell. 1998. V. 92. P.511-521.

30. Gerasimova Т., Gdula D., Gerasimov D., Simonova O., Corces V. A Drosophila protein that impacts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation //Cell. 1995. V. 82. P.587-597.

31. Gerasimova Т., Kyrd K., Corces V. A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA // Mol.Cell. V.6. P. 1025-1035.

32. Geyer P. The role of insulator elements in defining domains of gene expression//Curr. Opin. Genet. Dev. 1997. V. 7. P. 242-248.

33. Geyer P., Corces V. DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein // Genes Dev. 1992. V.6. P.1865-1873.

34. Geyer P., Corces V. Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster II Genes Dev. 1987. V.l. P.996-1004.

35. Gdula D., Corces V. Characterization of functional domains of the Su(Hw) protein that mediate the silencing effect of mod(mdg4) mutations // Genetics. 1997. V.145. P.153-161.

36. Ghosh D., Gerasimova Т., Corces V. Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function // EMBO J. 2001. V.20. P.2518-2527.

37. Golic K., Lindquist S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome // Cell. 1989. V.59. P.499-509.

38. Gong WJ, Golic KG. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila//Proc. Natl. Acad. Sci. 2003 V. 100. P. 2556-61.

39. Gorczyca M., Popova X., Budnik V. The gene mod(mdg4) affects synapse specificity and structure in Drosophila II J.Neurobiol. 1999. V.39. P.447-460.

40. Gyurkovics H., Gausz J., Kummer J., Karch F. A new homeotic mutation in the Drosophila bithorax complex removes a boundary separating two domains of regulation. //EMBO. 1990. V. 9. P. 2579-2585.

41. Hagstrom K., Muller M., Schedl P. Fab-7 functions as a chromatin domain boundary to ensure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex // Genes Dev. 1996. V.10. P.3202-3215.

42. Hagstrom K., Muller M., Schedl P. A Polycomb and GAGA dependent silencer adjoins the Fab-7 boundary in the Drosophila bithorax complex // Genetics. 1997. V. 146. P. 1365-1380.

43. Hark A., Schoenherr C., Katz D. et al. CTCF mediates methilation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus // Nature. 2000. V.405. P.486-489.

44. Harrison D., Gdula D., Coyne R., Corces V. A leucine zipper domain of the suppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on enhancer function // Genes Dev. 1993. V.7. P.1966-1978.

45. Hart C., Zhao K., Laemmli U. The scs' boundary element: characterization of boundary element-assaciated factors // Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P.999-1009.

46. Holdridge С., Dorsett D. Repression of hsp70 heat shock gene transcription by the suppressor of Hairy-wing protein of Drosophila melanogaster IIMol. Cell. Biol. V.ll. P.1894-1900.

47. Jack J., Dorsett D., DeLotto Y. et al. Expression of the cut locus in the Drosophila wing margin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer // Development. 1991. V. 113. P.735-747.

48. Katsani K., Hajibagheri M., Verrijzer C. Cooperative DNA binding by GAGA transcription factor requires the conserved BTB/POZ domain and reorganizes promoter topology // EMBO J. 1999. V.18. P.698-708.

49. Kares R., Rubin G. Analysis of P transposable element functions in Drosophila // Cell. 1984. V.38. P.135-146.

50. Kellum R., Schedl P. A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains // Cell. 1991. V. 64. P.941-950.

51. Kellum R., Schedl P. A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay // Mol. Cel. Biol. 1992. V. 12. P. 2424-2431.

52. Kim J., Shen В., Rosen C., Dorsett D. The DNA-binding and enhancer-blocking domains of the Drosophila suppressor of Hairy-wing protein // Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P.3381-3392.

53. Krebs J. E., Dunaway M. Insulator elements impart a cis requirement on enhancer-promoter interactions//Mol. Cell. 1998. V. 1. P. 301-308.

54. Lu L., Tower J. A transcriptional insulator element, the su(Hw) binding site, protects a chromosomal DNA replication origin from position effects // Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P.2202-2206.

55. Lindsley D., Zimm G. The genome of Drosophila melanogaster. Academic Press, New York. // 1992.

56. Mallin D., Myung J., Patton J. Polycomb group gene repression is blocked by the Drosophila suppressor of Hairy-wing Su(Hw. insulator // Genetics. 1998. V.148. P.331-339.

57. Mazo A., Mizrokhi L., Karavanov A. et al. Suppression in Drosophila: su(Hw) and su(f) gene products interact with a region of mdg4 (gypsy) regulating its transcriptional activity // EMBO J. 1989. V.8. P.903-911.

58. Mihaly J., Hogga I., Barges S., Gallon M., Mishra R., Hagstrom K., Muller M., Schedl P., Sipos L., Gausz J., Gyurkovics H., Karch F. Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex // Cell. Mol. Life Sci. 1998. V. 54. P. 60-70.

59. Mongelard F., Corces V. Two insulators are not better than one // Nat. Struct, biol. 2001. V.8. P.192-194.

60. Morcillo P., Rosen C., Baylies M., Dorsett D. Chip, a widely expressed chromosomal protein required for segmentation and activity of a remote wing margin enhancer in Drosophila I I Genes Dev. 1997. V.ll. P.2729-2740.

61. Morcillo P., Rosen C., Dorsett D. Genes regulating the remote wing margin enhancer in the Drosophila cut locus // Genetics. 1996. V.144. P.1143-1154.

62. Muller M., Hangstrom K., Gyurkovics H., Pirrotta V., Schedl P. The Мер element from the Drosophila melanogaster bithorax complexmediates long-distance regulatory interactions // Genetics. 1999. V.153. P.1333-1356.

63. Muravyova E, Golovnin A, Gracheva E, Parshikov A, Belenkaya T, Pirrotta V, Georgiev P. Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators // Science. 2001 V. 291. P. 495-8.

64. Palla F., Melfi R., Anello L., Di Bernardo M., Spinelli G. Enhancer blocking activity located near the 3' end of the sea urchin early H2A histone gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P.2272-2277.

65. Parnell Т., Geyer P. Differences in insulator properties revealed by enhancer blocking assays on episomes // EMBO J. 2000. V.19. P.5864-5874.

66. Pikaart M., Recillas-targa F., Felsenfeld G. Loss of transcriptional activity of a transgene is accompanied by DNA methilation and histone deacetylation and is prevented by insulators // Genes Dev. 1998. V.12. P.2852-2862.

67. Pirrotta V., Steller H., Bozzetti M. Multiple upstream regulatory elements control the expression of the Drosophila white gene // EMBO J. 1985. V.4. P.3501-3508.

68. Pirrotta V., Manrt E., Hardon E., Bickel S., Benson M. Structure and sequence of the Drosophila zeste gene // EMBO J. 1987. V.6. P.791-799.

69. Pirrotta V. Poly comb silencing and the maintenance of stable chromatin states // Results Probl. Cell Differ. 1999. V.25. P.205-228.

70. Pirrotta V. PcG complexes and chromatin silencing // Curr.Opin.Gen.Dev. 1997. V.7. P.249-258.

71. Preston, C. R., W. Engels, and C. Flores. Efficient repair of DNA breaks in Drosophila: evidence for single-strand annealing and competition with other repair pathways // Genetics. 2002. V. 161 P. 711-720.

72. Qian S., Varjavand В., Pirrotta V. Molecular analysis of the zeste-white interaction reveals a promoter-proximal element essential for distant enhancer-promoter communication// Genetics. 1992. V.131. P.79-90.

73. Recillas-Targa F., Bell A., Felsenfeld G. Positional enhancer-blocking activity of the chicken p-globin insulator in transiently transfected cells // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1999. V.96. P.14354-14359.

74. Robinett C., O'Connor A., Dunaway M. The repeat organizer, a specialized insulator element within the intergenic spacer of the Xenopus rRNA genes//Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P.2866-2875.

75. Rollins S., Morsillo P., Dorsett D. Nipped-B, a Drosophila homologue of chromosomal adherins, participates in activation by remote enhancers in the cut and Ultrabithorax genes // Genetics. 1999. V.152. P.577-593.

76. Rong YS, Golic KG. The homologous chromosome is an effective template for the repair of mitotic DNA double-strand breaks in Drosophila //Genetics. 2003. V. 165. P. 1831-42.

77. Rong YS, Golic KG. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila It Science. 2000. V. 288 P. 2013-8.

78. Roseman R, Pirrotta V., Geyer P. The Su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects // EMBO J. 1993. V. 12. P.435-442.

79. Rubin G., Sprandling A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors // Science. 1982. V.218. P.348-353.

80. Sanger F., Nicken S., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V.74. P.5463-5487.

81. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual, Ed.2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY // 1989.

82. Schmitt S, Prestel M, Paro R. Intergenic transcription through a polycomb group response element counteracts silencing // Genes Dev. 2005 V. 19. P. 697-708.

83. Scott K., Geyer P. Effects of the Su(Hw) insulator protein on the expression of the divergently transcribed Drosophila yolk protein genes // EMBO J. 1995. V.14. P.6258-6279.

84. Scott K., Taubman A., Geyer P. Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength // Genetics. 1999. V.153. P.787-798.

85. Sigrist C., Pirrotta V. Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by the Drosophila Polycomb Response Element (PRE) butallow trans interactions between PREs on different chromosomes // Genetics. 1997. V.147. P.209-221.

86. Spana C., Harrison D., Corces V. The Drosophila melanogastersupressor of Hairy wing protein binds to specific sequences of the gypsyretrotransposon // Genes Dev. 1988. V.2. P.1414-1423.

87. Spana C., Corces V. DNA bending is a determinant of bindingspecificity for a Drosophila zink finger protein // Genes Dev. 1990. V.4.1. P.1505-1515.

88. Sun F.-L., Elgin S. Putting boundaries on silence // Cell. 1999. V.99. P.459-462.

89. Udvardy A., Maine E., Schedl P. The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains // J. Mol. Biol. 1985. V.185. P.341-358.

90. Vazquez J., Schedl P. Deletion of an insulator element by the mutation facet-strawberry in Drosophila melanogaster II Genetics. 2000. V.155. P.1297-1311.

91. Yoshida C., Tokumasu F., Hohmura K. et al. Long range interaction of cis-DNA elements mediated by architectural transcription factor Bachl // Genes Cells. 1999. V. 4 P.643-655.

92. Zhong X., Krangel M. An enhancer-blocking element between alpha and delta gene segments within the human T cell receptor alpha/delta locus //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P.5219-5224.

93. Zhou J., Barolo S., Szymanski P. et al. The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo I I Genes Dev. 1996. V. 10. P.3195-3201.

94. Zhou J., Levine M. A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embryo I I Cell. 1999. V. 99. P.567-575.

95. Zhou J., Ashe H., Burks C. et al. Characterization of the transvection mediating region of the Abdominal-B locus in Drosophila // Development. 1999. V.126. P.3057-3065.