Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование функциональных взаимодействий между границами регуляторных доменов гена Abd-B у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование функциональных взаимодействий между границами регуляторных доменов гена Abd-B у Drosophila melanogaster"

Тощаков Степан Владимирович

Исследование функциональных взаимодействий между границами

регуляторных доменов ТШКАВО-В у Бюшчтл МЕИИОвАЗГЕЯ Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Учреждения Российской академии наук Институт биологии гена РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Кырчанова О.В.

Официальные оппоненты:

чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Разин C.B. кандидат биологических наук Котнова А.П.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова

Защита диссертации состоится " октября 2009 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу:

119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан "_" сентября 2009 года.

к

п

Ученый секретарь Диссертационного совета канд. фарм. наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Дифференцировка клеток многоклеточного организма происходит благодаря эффективной регуляции экспрессии генов, которая обеспечивается специфическими г/ис-регуляторными элементами активирующими транскрипцию (энхансерами) или репрессирующими ее (сайленсерами). В геноме высших эукариот энхансеры и сайленсеры зачастую находятся на больших расстояниях от контролируемого промотора. Нередко между ними находятся гены с независимой программой экспрессии. Считается, что роль границ независимых доменов экспрессии играют инсуляторы. Инсуляторы - это г/ис-регуляторные элементы, которые способны функционально изолировать промотор от энхансера, если располагаются между ними, а также ограничивать распространение репрессии (Cai et al., 1995; Gerasimova et al., 1996).

Удобной моделью для изучения механизмов взаимодействия между энхансерами и промоторами является регуляторная область Abd-B гена Drosophila melanogaster. Регуляторная область Abd-B размером около 60 тпн содержит четыре энхансера (iab-5, iab-6, iab-7, iab-8), каждый из которых определяет уровень экспрессии гена в соответствующем брюшном парасегменте. Энхансеры отделены друг от друга границами, три из которых были подробно изучены: Мер, Fab-7 и Fab-8. Было продемонстрировано, что в состав этих границ входят инсуляторы (Karch et al., 1994; Barges et al., 2000; Zhou et al., 1999; Gruzdeva et al., 2005). Таким образом энхансеры Abd-B способны активировать промотор несмотря на то, что они окружены инсуляторами. На основании этого было выдвинуто предположение о том, что инсуляторы Bithorax комплекса обладают дополнительными функциями. Продемонстрировано, что граница Fab-7 может осуществлять физическое взаимодействие с предпромоторной областью гена Abd-B в некоторых тканях (Cleard et al., 2006). Исходя из этого, можно предположить, что границы регуляторных доменов отвечают за специфичную коммуникацию между энхансерами и промотором гена Abd-B.

Таким образом, для понимания механизмов, обеспечивающих специфичную и эффективную регуляцию экспрессии генов, очень важным является исследование дистанционных взаимодействий.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование взаимодействий между границами Fab-7, Fab-8 и предпромоторной областью гена Abd-B.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать способность границы Fab-8 и ее составных частей к взаимодействию на больших дистанциях.

2. Изучить способность белка dCTCF поддерживать дистанционные взаимодействия.

3. Исследовать возможность взаимодействий между различными границами гена Abd-B (Fab-7 и Fab-8)

4. Проверить на модельной системе способность границ гена Abd-B к коммуникации с его промоторной областью.

Научная новизна и практическая значимость работы. Подтверждена способность Fab-8 инсулятора взаимодействовать со своей копией на больших дистанциях. Идентифицированы минимальные фрагменты границы Fab-8, поддерживающие дистанционные взаимодействия.

Впервые на примере Fab-7 и Fab-8 продемонстрирована способность гетерологичных инсуляторов взаимодействовать друг с другом.

На трансгенной модели показана способность границ регуляторных доменов к осуществлению коммуникации с промоторной областью Abd-B. Полученные результаты позволяют глубже понять роль инсуляторов во взаимодействиях между энхансерами и промоторами.

Показано, что дрозофилиный гомолог инсуляторного белка позвоночных CTCF (dCTCF) участвует в коммуникации границ на больших дистанциях. Получены результаты, свидетельствующие о наличии неизвестных белков, участвующих в организации дальних взаимодействий. Это является фундаментом для продолжения исследований по их идентификации.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 11-й международной школе-конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007), международной конференции молодых ученых по молекулярной биологии и генетике (Киев, 2007), первом всероссийском биологическом конгрессе «Симбиоз Россия 2008» (Казань, 2008), на пятом съезде

ВОГиС (Москва, 2009), на Конференции по структуре и динамике ядра (Марсель, Франция, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано шесть печатных работ, из них статей - 1, тезисов устных и стендовых сообщений - 5.

Структура н объем работы. Диссертация изложена на _ страницах,

включает_таблиц,_рисунков и состоит из Введения, Обзора литературы,

Материалов и методов, Результатов, Обсуждения результатов, Выводов и Списка литературы, включающего_источников.

Результаты исследования 1. Исследование способности Fab-8 инсулятора взаимодействовать на больших дистанциях

Ранее было продемонстрировано, что в трансгенных системах две копии Мер или Fab-7 инсулятора могут взаимодействовать друг с другом на большой дистанции, тем самым облегчая коммуникацию между удаленными друг от друга энхансером и промотором (Gruzdeva et al., 2005; Rodin et al., 2007). Исходя из этого, можно допустить, что Fab-8 обладает аналогичными свойствами.

Для тестирования способности элементов осуществлять взаимодействия на больших дистанциях, была использована разработанная ранее GA-white модельная система на основе генов yellow и white дрозофилы и неспецифического дрожжевого активатора GAL4 (Kyrchanova et al., 2007). Эксперименты на дрожжах показали, что уровень стимуляции GAL4 активатором снижается по мере удаления GAL4 связывающих сайтов от промотора (De Bruin et al., 2001, Guarente et al., 1984, Struhl et al., 1984). 10 ОАЬ4-связывающих сайтов (G4) были встроены в положении -893 от старта транскрипции гена yellow. В результате расстояние между G4 и промотором гена mini-white составляло около 5,5 тпн (рис 1). Были получены экспериментальные подтверждения того, что у дрозофилы GAL4 не способен активировать промотор гена mini-white, расположенного с 3' конца от гена yellow (Kyrchanova et al., 2007). Однако, если рядом с 04-сайтами и промотором гена mini-white встроить элементы, способные к коммуникации на большом расстоянии (рис. 1), при их взаимодействии 04-сайты будут подтягиваться к промотору гена mini-white и активировать его. При

этом участок ДНК, находящийся между взаимодействующими элементами, будет выпетливаться.

Экспрессия белка GAL4 в трансгенных линиях достигалась путем скрещивания с линией мух, несущей ген GAL4 под контролем тубулинового промотора, который обеспечивает экспрессию белка во всех тканях и на всех стадиях развития.

& Ш f (р

TN/T yellow К4 miniwhite •—^—I—-1ЕЯЕ31——1 >ГП-"

Рисунок 1. Схема трансгенной конструкции, используемой для тестирования различных элементов на способность к взаимодействию. Гены yellow и mini-white обозначены квадратами, направление транскрипции - стрелками. Стрелки, направленные вниз, обозначают сайты узнавания сайт-специфических рекомбиназ Flp (frt-сайты) и Сге (lox-сайты). Сайты связывания GAL4 обозначены «G4». Треугольники обозначают места инсерции тестируемых фрагментов.

В составе границы Fab-8 были идентифицированы два функционально различных элемента: Fab-8 инсулятор и PTS (Promoter Targeting Sequence) элемент (рис.2). Элемент PTS обладает свойством преодолевать активность инсулятора, позволяя энхансеру эффективно стимулировать промотор (Zhou et al., 1999). Прежде всего, на способность взаимодействовать на больших дистанциях, был испытан фрагмент включающий оба эти элемента PTS/F8. Были созданы конструкции G4(PTS/F8)Y(PTS/F8R)W и G4(PTS/F8R)Y(PTS/F8R)W (рис ЗА,Б). Так как ранее было показано, что взаимодействие между инсуляторами может быть ориентационно-зависимым (Kyrchanova et al., 2007), элементы PTS/F8 в этих конструкциях были вставлены в противоположной и в прямой ориентации относительно друг друга.

В результате трансформации эмбрионов дрозофилы конструкцией G4(PTS/F8)Y(PTS/F8R)W было получено 16 трансгенных линий, содержащих единичную инсерцию. При стимуляции транскрипции GAL4 активатором происходило значительное усиление пигментации глаз во всех 16 линиях (рис. ЗА).

Таким образом, PTS/F8 способны взаимодействовать друг с другом, позволяя GAL4 активатору эффективно стимулировать промотор гена mini-white.

Mrn Fiib.fi 9 Fah.7 PTQ/Fnh.8 JU-BA

.Proximal Distal

\

PTS/F8

F8

PTS

F8469 F8254

PTS/F8337 F8m

Рисунок 2. Схема регуляторной области Abd-B и расположения исследуемых элементов. Числа указывают координаты от начала Bithorax комплекса (согласно Martin et al., 1995). Горизонтальные стрелки, обозначенные «Proximal» и «Distal» - расположение центромеры и теломеры соответственно. Границы регуляторных доменов обозначены черными квадратами. Над схемой ВХ-С приводится схема промоторной области Abd-B и исследуемого фрагмента предпромоторной области (Астср). Внизу приведена схема границы Fab-8 и фрагментов, используемых в работе. Элемент PTS и инсулятор Fab-8 обозначены белыми и черными прямоугольниками соответственно. Сайты связывания CTCF обозначены белыми овалами, мутированные сайты связывания - черными

В результате трансформации эмбрионов дрозофилы конструкцией G4(PTS/F8r)Y(PTS/F8r)W было получено 20 трансгенных линий. Стимуляция гена mini-white GAL4 активатором приводила к изменению пигментации глаз только в 15 из 20 линий (рис. ЗБ). При этом эффективность активации была значительно слабее, чем в случае, когда элементы находились во взаимно противоположной ориентации.

G4(PTS/F8)Y(PTS/F8R)W +GAL4

Б

ДргёДргё!

G4(PTS/F8R)Y(PTS/F8R)W +GAL4

вш><ш

G4(F8)Y(F8R)W

+GAL4

г mm

G4(F8R)Y(F8R)W

+GAL4

G4(PTS)Y(PTSR)W

+GAL4

Е <pts]<PT|] G4(PTSR)Y(PTSR)W

+GAL4

mini-white

КР ТК К ТО О ТЖ ЖСЖ Б И/N

2 2 8 4 16

3 3 4 5 1 16/16

КР ТК К ТО О ТЖ ЖСЖ Б И/N

6 5 7 2 20

1 2 4 6 5 2 15/20

КР ТК К ТО О ТЖ ЖСЖ Б И/N

2 7 7 16

3 4 4 2 3 16/16

КР ТК К ТО 0 ГЖ ЖСЖ Б И/N

2 2 11 3 18

4 4 4 6 11/18

КР ТК К ТО О ГЖ ЖСЖ Б И/N

2 12 11 25

1 7 9 6 2 19/25

КР ТК к ТО О ГЖ ЖСЖ Б И/N

3 5 6 5 2 4

14 8/14

Рисунок 3. Исследование способности границы Fab-8 взаимодействовать на больших дистанциях. Уровень экспрессии гена mini-white в трансгенных линиях оценивался по интенсивности пигментации глаз: КР - красный (максимальный); ТК -темно-коричневый; К - коричневый; ТО - темно-оранжевый; ОР - оранжевый; ТЖ -темно-желтый; Ж - желтый; СЖ - светло-желтый, Б - белый (экспрессия полностью отсутствует). Цифры в строках указывают число линий с соответствующей пигментацией до (строка с названием конструкции) и после (строка + GAL4) введения GAL4 активатора. Верхний индекс «R» означает то, что тестируемый элемент вставлен в обратной ориентации относительно гена mini-white. Отношение числа линий, в которых наблюдалось изменение (И) уровня пигментации при введении GAL4, к общему числу проанализированных линий (N) указано через слеш. На приведенных схемах инсулятор Fab-8 и PTS элемент обозначены черными и белыми пятиугольниками соответственно. Направление пятиугольника обозначает ориентацию элементов в конструкции. Белыми овалами обозначены сайты связывания dCTCF.

Данный результат подтверждает способность PTS/F8 осуществлять дистанционные взаимодействия, и свидетельствует о том, что эффективность стимуляции промотора GAL4 активатором зависит от взаимной ориентации элементов.

Затем на способность к ориентационно-зависимому взаимодействию были протестированы функциональные элементы границы F8/PTS. Были созданы конструкции G4(F8)Y(F8R)W и G4(F8R)Y(F8R)W, в которых две копии Fab-8 инсулятора размером 600 пн (F8) были вставлены соответственно в противоположной и в прямой ориентации относительно друг друга (рис. ЗВ,Г).

В результате трансформации эмбрионов дрозофилы конструкцией G4(F8)Y(F8R)W было получено 16 трансгенных линий. Введение GAL4 активатора приводило к эффективной стимуляции транскрипции гена mini-white во всех 16 линиях (рис. ЗВ).

Из 18 полученных трансгенных линий, содержащих единичную инсерцию конструкции G4(F8R)Y(F8R)W, усиление пигментации глаз при стимуляции GAL4 было менее выраженным и наблюдалось всего в 11 линиях (рис. ЗГ). Таким образом, инсулятор F8 обладает способностью к ориентационно-зависимому взаимодействию.

Аналогичным образом на способность к дистанционному взаимодействию был испытан элемент PTS. Были созданы конструкции G4(PTS)Y(PTSR)W и G4(PTSR)Y(PTSR)W (рис. ЗД,Е). В результате трансформации эмбрионов дрозофилы этими конструкциями было получено соответственно 25 и 14 трансгенных линий. Независимо от ориентации PTS, активация гена mini-white при введении GAL-активатора в этих конструкциях была незначительна. Слабое взаимодействие между PTS элементами можно объяснить тем, что при делении PTS/F8 границы на PTS элемент и Fab-8 инсулятор (Zhou et al., 1999) инактивируется значимый сайт связывания неизвестного белка. С другой стороны, сайты связывания для белка dCTCF в составе элемента F8 могут способствовать связыванию неизвестного белка с последовательностью PTS. Поэтому в отсутствие F8 эффективность связывания этого белка с PTS зависит от места инсерции трансгена (эффект положения).

Таким образом, граница PTS/F8 и входящий в ее состав инсулятор F8 способны осуществлять ориентационно-зависимые дистанционные взаимодействия, (рис. ЗД,Е).

2. Наличие сайтов связывания белка dCTCF необходимо для осуществления взаимодействия между двумя копиями Fab-8 инсулятора.

В составе границы Fab-8 были идентифицированы два сайта связывания для белка dCTCF, который является дрозофилиным гомологом инсуляторного белка позвоночных (Moon et al., 2005) (рис. 2). Для определения их роли во взаимодействии на больших дистанциях, F8 инсулятор был поделен на два перекрывающихся фрагмента: небольшой фрагмент F8254 размером 254 пн содержащий оба сайта связывания белка dCTCF, и 469 пн фрагмент F8469, включающий оставшуюся часть F8 (рис. 2).

Эти элементы были испытаны на способность к коммуникации со своей копией в GA-white модельной системе. Были созданы конструкции G4(F8469)Y(F8469R)W и G4(F8254)Y(F8254R)W, в которых тестируемые элементы встраивались в противоположной относительно друг друга ориентации.

В результате трансформации эмбрионов дрозофилы конструкцией G4(F8254)Y(F8254R)W было получено 8 трансгенных линий. При скрещивании этих линий с линией мух, несущей ген GAL4 активатора, во всех линиях наблюдалась эффективная стимуляция транскрипции с промотора гена mini-white (рис. 4Б). Таким образом, фрагмент Fab-8 инсулятора размером 254 пн, содержащий сайты связывания dCTCF способен осуществлять дистанционные взаимодействия.

В 8 полученных трансгенных линиях с единичной инсерцией конструкции G4(F8469)Y(F8469R)W введение GAL4 активатора приводило к незначительной активации гена mini-white только в 4 из 8 случаев (рис. 4А). Данный результат свидетельствует в пользу того, что основная роль во взаимодействии инсулятора Fab-8 на больших дистанциях принадлежит участку, содержащему сайты связывания dCTCF.

А тхя mini-white

KP I K к ТО 0 тж ЖСЖ Б И/N

G4(F8469)Y(F8469R)W 1 1 6 8

+GAL4 1 2 1 4 4/8

Б Ilk ill

If 111 KP TK к ТО 0 тж ЖСЖ Б И/N

G4(F8254)Y(F8254R)W 1 8 6 15

+GAL4 1 2 7 2 1 1 1 15/15

B oo KP TK К ТО 0 тж ЖСЖ Б И/N

G4(F8mut)Y(F8mut R)W 2 4 3 9

+GAL4 3 1 4 1 4/9

Д 111 KP TK к то 0 тж ЖСЖ Б И/N

G4(4xCTCF)Y(4xCTCF)W 8 4 12

+GAL4 2 8 2 12/12

Рисунок 4. Исследование роли белка dCTCF во взаимодействии между Fab-8 инсуляторами. Обозначения см. на рисунке 3.

Для подтверждения участия белка dCTCF в осуществлении коммуникации между F8 инсуляторами, оба его сайта связывания были мутированы. Результаты анализа изменения электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле (рис. 5) подтвердили, что белок dCTCF эффективно связывается с Fab-8 инсулятором и не связывается с мутированным элементом (F8mut). Была создана конструкция G4(F8mut)Y(F8ml"R)W, в КОторой мутированные Fab-8 элементы находились в противоположной относительно друг друга ориентации. Было получено 9 трансгенных линий, в которых стимуляция GAL4 активатором приводила к незначительному изменению экспрессии гена mini-white: только в четырех линиях пигментация глаз стала немного интенсивнее (рис. 4В). Следовательно, dCTCF необходим для поддержания эффективного взаимодействия между F8 элементами. Такой результат означает либо то, что dCTCF непосредственно обеспечивает взаимодействие между F8 инсуляторами, либо то, что он облегчает связывание белкового комплекса, отвечающего за этот процесс.

Fab 8 Fab 7

Fab 8 Fab 8mu>

dCTCF - + -конкурент - + + лизат - - -

+

- + -

- + +

+

+

+

+

+

У

Рисунок 5. Исследование способности Fab-8, Fab-7 и Fab-8""" связывать белок dCTCF при помощи анализа изменения электрофоретической подвижности. Помеченные 32Р фрагменты F8, F7 и F8raut инкубировались с синтезированным in vitro белком dCTCF в присутствии конкурентов (холодные фрагменты Fab-8 или Fab-7, добавленные в избытке), или без них. После этого реакционная смесь подвергалась электрофоретическому разделению в 5% полиакриламидном геле. Полосы с измененной подвижностью (обозначены стрелкой) представляют собой ДНК-белковые комплексы, образуемые белком dCTCF со связывающим его фрагментом. Звездочками обозначено неспецифическое связывание dCTCF с лизатом ретикулоцитов кролика, в котором производился его синтез.

Для проверки этих предположений мы мультиплицировали сайт связывания белка dCTCF (4xCTCF). Была создана конструкция G4(4xCTCF)Y(4xCTCF)W (рис. 4Г). Во всех 12 полученных трансгенных линиях введение GAL4 приводило к сильной активации транскрипции гена mini-white, что говорит об эффективной коммуникации между двумя 4xCTCF фрагментами. Исходя из этого, можно сделать вывод, что именно белок dCTCF вовлечен в реализацию дальних взаимодействий между F8 инсуляторами.

3. Границы Fab-7 и Fab-8 способны к осуществлению функционального взаимодействия друг с другом.

Было показано, что граница Fab-7 не содержит сайтов связывания dCTCF (Holohan et al., 2007). Результаты проведенного анализа изменения электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле (рис. 5) подтвердили, что связывание dCTCF с Fab-7 инсулятором отсутствует. Однако ранее была продемонстрирована способность 858 пн Fab-7 к осуществлению ориентационно-независимых дистанционных взаимодействий (Rodin et al., 2007).

A l mini-white

Шг СИ КР тк к TO О ТЖ ЖСЖ Б И/N

G4(F7)Y(F7r)W 2 2 7 2 13

+GAL4 1 3 5 2 1 1 11/13

Б <Ц <¿0 КР ТК К ТО О ТЖ Ж СЖ Б И/N

G4(F7R)Y(F7R)W 2 8 10

+GAL4 116 2 10/10

Рисунок 6. Подтверждение способности границы Fab-7 осуществлять дистанционные взаимодействия в G4-white модельной системе. Обозначения см. на рисунке 3

Для подтверждения способности инсуляторов Fab-7 взаимодействовать друг с другом в G4-white модельной системе, были созданы конструкции G4(F7)Y(F7R)W и G4(F7R)Y(F7R)W, в которых элементы Fab-7 длиной 858 пн (F7) были вставлены в противоположной и прямой взаимной ориентации (рис. 6А,Б). В результате трансформации эмбрионов дрозофилы этими конструкциями было получено 13 (противоположная ориентация) и 10 (прямая ориентация) трансгенных линий, содержащих единичную инсерцию. Практически во всех линиях GAL4 активатор

эффективно стимулировал транскрипцию гена mini-white (рис. 6 А,Б). Это подтверждает полученные ранее данные о том, что функциональный эффект взаимодействия между Fab-7 инсуляторами не зависит от их взаимной ориентации.

Для того, чтобы проверить способность разных границ (Fab-7 и Fab-8), взаимодействовать друг с другом, были созданы конструкции G4(F7)Y(PTS/F8R)W и G4(F7R)Y(PTS/F8R)W, в которых Fab-7 и PTS/Fab-8 элементы вставлены в противоположной и в прямой относительно друг друга ориентации (рис. 7 А,Б). При стимуляции GAL4 у мух, несущих конструкцию G4(F7)Y(PTS/F8R)W интенсивность пигментации глаз в 14 из 15 полученных линий значительно усиливалась.

Стимуляция GAL4 в линиях с конструкцией G4(F7R)Y(PTS/F8R)W, в которой F7 и PTS/F8 находились в одной ориентации, также приводила к активации гена mini-white в 13 из 17 случаев (рис. 7Б). Однако по сравнению с линиями предыдущей конструкции, пигментация глаз в этих линиях была несколько ниже (рис. 7А,Б). Таким образом, границы, фланкирующие iab-7 энхансер, способны к осуществлению ориентационно-зависимого функционального взаимодействия друг с другом.

С целью картирования фрагмента границы Fab-8, отвечающего за взаимодействие с Fab-7 инсулятором, были созданы конструкции G4(F7)Y(F8R)W и G4(F7R)Y(F8R)W. При трансформации эмбрионов дрозофилы данными конструкциями было получено 18 и 7 трансгенных линий соответственно (рис. 7В,Г). Анализ полученных линий привел к неожиданному результату. Вне зависимости от взаимной ориентации Fab-7 и Fab-8 инсуляторов в большинстве полученных трансгенных линий активации транскрипции гена mini-white при введении GAL4 не возникало. Это предполагает отсутствие функционального взаимодействия между ними. Однако в 3 из 18 линий с конструкцией G4(F7)Y(F8R)W наблюдалось значительная активация транскрипции гена mini-white (рис. 7В). Удаление инсуляторов с помощью Сге и Flp рекомбиназ из данной конструкции в этих линиях приводило к потере способности стимулировать ген mini-white активатором GAL4 (рис. 7В). Это свидетельствует о том, что изредка в некоторых местах генома F7 и F8 могут функционально взаимодействовать.

А Е^ЧЩ'ЦШ КР тк К mini-white ТО О ГЖ ЖСЖ Б И/N

G4(F7)Y(PTS/F8R)W +GAL4 3 1 4 1 5 2 4 4 4 1 1 15 14/15

Б <и<вш КР тк к ТО О ГЖ ЖСЖ Б И/N

G4(F7R)Y(PTS/F8R)W +GAL4 1 2 2 5 2 4 7 2 6 2 1 17 13/17

в КР ТК к ТО О ГЖ ЖСЖ Б И/N

G4(F7)Y(F8R)W +GAL4 1 1 1 4 12 2 4 9 2 18 4/18

Г 4И<Ш1 КР ТК к ТО О ГЖ ЖСЖ Б И/N

G4(F7R)Y(F8R)W +GAL4 1 3 3 2 2 3 7 1/7

д rg»<pTsl КР ТК к то О ГЖ ЖСЖ Б И/N

G4(F7)Y(PTSR)W +GAL4 1 11 2 3 3 7 1 14 5/14

еш>41\ КР тк к то О ГЖ ЖСЖ Б И/N

G4(F7)Y(PTS/F8337R)W 1 1 3 5 3 12

+GAL4 12 7 12 12/12

Рисунок 7. Исследование функционального взаимодействия между границами Fab-8 и Fab-7. Обозначения см. на рисунке 3

Так как Fab-8 инсулятор не способен поддерживать коммуникацию с Fab-7, логично предположить, что участок, отвечающий за взаимодействие границы PTS/F8 с Fab-7, находится либо в PTS элементе, либо на границе Fab-8 инсулятора и PTS. Для проверки этого предположения была создана конструкция G4(F7)Y(PTSR)W, в которой элементы находились в противоположных относительно друг друга ориентациях. Было получено 14 трансгенных линий, несущих одну копию данной конструкции. Введение GAL4 активатора приводило к слабой стимуляции промотора mini-while в 35 % линий (рис. 7Д).

Таким образом, обе части границы Fab-8: и F8 инсулятор, и PTS, по отдельности не способны осуществлять эффективное взаимодействие с Fab-7.

Логично предположить, что элемент, необходимый для коммуникации с гетерологичной границей находится в области условной границы между F8 и PTS. Для подтверждения данного заключения на способность к взаимодействию с Fab-7 был протестирован участок границы PTS/F8 размером 337 пн, сочетающий в себе фрагмент F8254 и прилегающий к нему фрагмент элемента PTS размером 83 пн (см. рис. 2). При трансформации эмбрионов конструкцией G4(F7)Y(F8337R)W, было получено 12 линий, содержащих единичную инсерцию трансгена. Во всех линиях наблюдалась эффективная стимуляция транскрипции гена mini-white активатором GAL4 (рис. 7Е). Этот результат подтверждает, что белок, связывающийся в области границы между F8 инсулятором и PTS элементом необходим для взаимодействия с гетерологичной границей Fab-7.

4. PTS/F8 и Fab-7 способны взаимодействовать с предпромоторной областью гена Abd-B

Ранее в непосредственной близости от промотора гена Abd-B был обнаружен сайт связывания белка dCTCF (Holohan et al., 2007). Мы протестировали участок предпромоторной области Abd-B размером 370 пн, содержащий сайт связывания белка dCTCF (ACTCF, рис. 2), на способность к взаимодействию с границами Fab-7 и PTS/F8 в G4-white модельной системе.

A /frn -n mini-white

Щ4ШШЁ КР тк к ТО О ТЖ ЖСЖ Б И/N

G4(Actcf)Y(PTS/F8R)\V 1 1 3 2 7

+GAL4 1 2 1 1 1 1 7/7

Б ш® КР тк к ТО О ТЖ ЖСЖ Б И/N

G4(PTS/F8R)Y(ACTCF)W 1 3 3 7

+GAL4 1 1 1 4 7/7

в <0 <31 КР тк к ТО 0 ТЖ ЖСЖ Б И/N

G4(ACTCF)Y(F7)W 12 9 1 13

+GAL4 1 2 7 3 13/13

Рисунок 8. Исследование способности границ PTS/Fab-8 и Fab-7 осуществлять коммуникацию с промоторной областью гена Abd-B, Обозначения см. на рисунке 3

Так как ACTCF является элементом промоторной области, существовала вероятность того, что он может оказывать прямое действие на промотор гена mini-white. Для оценки этого были созданы конструкции G4(Actcf)Y(PTS/F8r)W и G4(PTS/F8r)Y(Actcf)W, в которых actcf фрагмент был вставлен либо за сайтами связывания GAL4, либо перед промотором гена mini-white соответственно. Уровень базовой транскрипции гена mini-white в полученных трансгенных линиях с конструкциями G4(Actcf)Y(PTS/F8r)W и G4(PTS/F8r)Y(Actcf)W практически не отличался, (см. рис. 8а,Б). Это говорит о том, что промоторной активностью элемент Астср не обладает.

Было получено 7 трансгенных линий, содержащих одиночные инсерции конструкции G4(Actcf)Y(PTS/F8r)W. Во всех линиях при стимуляции GAL4 наблюдалась эффективная активация промотора mini-white (рис. 8А). Таким образом, граница PTS/F8 может осуществлять стабильную коммуникацию с Астст элементом.

Расположение элемента actcf перед промотором гена mini-white в конструкции G4(PTS/F8r)Y(Actcf)W не повлияло на результат, и во всех 7 полученных трансгенных линиях наблюдалась значительная активация гена mini-white (рис. 8Б).

Аналогично на GA-white модельной системе была испытана способность границы Fab-7 взаимодействовать с АСТСР. Было получено 13 трансгенных линий. Стимуляция GAL4 во всех линиях приводила к активации промотора mini-white (рис. 8В). Таким образом, граница Fab-7 также способна к осуществлению взаимодействия с промоторной областью Abd-B.

Обсуждение результатов

Ранее в нашей лаборатории было продемонстрировано, что две копии Мер инсулятора могут взаимодействовать на больших дистанциях, приводя к стимуляции транскрипции гена mini-white дрожжевым GAL4 активатором, сайты связывания которого находятся на большом расстоянии от промотора (Kyrchanova et al., 2008). В настоящем исследовании приводятся доказательства того, что данное свойство не является уникальным для инсулятора Мер, а характерно для всех описанных границ регуляторных доменов гена Abd-B. Кроме того, показано, что, как и в случае Мер инсулятора, взаимная ориентация Fab-8 элементов имеет принципиальное значение для стимуляции транскрипции гена mini-white. Это связано с тем, что, по-видимому, с последовательностью инсулятора связывается по меньшей мере два белка, способных поддерживать коммуникацию. В результате при взаимодействии инсуляторов находящихся либо в прямой, либо в противоположной друг другу ориентации, формируются петли разной конформации (рис.9). При этом находящиеся снаружи от инсуляторов сайты связывания GAL4 и промотор mini-white, либо сближаются, либо изолируются друг от друга (рис. 9).

Рисунок 9. Взаимодействие элементов приводит к образованию петель, стерически способствующих (слева) или препятствующих (справа) коммуникации САЬ4 связывающих сайтов и промотора. Сайты связывания ОАЬ4 обозначены звездочкой. Взаимодействующие элементы - пятиугольником, направление которого соответствует ориентации элемента. Промотор активируемого гена обозначен стрелкой

Для инсулятора Fab-8 одним из этих белков является dCTCF. Наличие его сайтов связывания которого необходимо для осуществления взаимодействия между двумя копиями F8. В данной работе продемонстрировано, что F8 инсулятор, не содержащий сайтов для dCTCF, не способен взаимодействовать со своей копией. Это может быть объяснено тем, что белок dCTCF, связываясь с Fab-8, делает возможным связывание других, не идентифицированных белков. Очевидно, что сайт связывания одного из таких белков находится между F8 инсулятором и PTS элементом. Это подтверждается потерей способности границы Fab-8 при ее делении на F8 и PTS функционально взаимодействовать с инсулятором Fab-7. Функциональное взаимодействие между границей Fab-7, не связывающей dCTCF, с границей PTS/F8 и с промоторной областью Abd-B, также подтверждает существование неизвестных белков, участвующих в поддержании пространственной организации локуса Abd-B.

Недавно было показано, что регуляторные элементы Bithorax комплекса (ВХ-С), находящиеся в репрессированном состоянии, взаимодействуют друг с другом (Lanzuolo et al., 2007). Репрессионный статус генов ВХ-С поддерживается белками группы Polycomb (PcG), которые связываются с элементами PRE, прилежащими к регуляторным границам. Было показано, что транспозоны, содержащие границы Fab-7 и Мер в сочетании с PRE, способны взаимодействовать находясь на разных хромосомах (Bantignies et al., 2003; Mullcr et al., 1999; Vasques et al., 2006). Большинство исследователей предполагает, что подобная коммуникация на больших дистанциях обеспечивается белками группы Polycomb. Однако известно, что с хромосомами дрозофилы связывается множество комплексов PcG (Schwartz et al., 2006). В таком случае остается открытым вопрос: чем обеспечивается высокая специфичность дальних взаимодействий между удаленными элементами?

Все PRE, используемые в данных исследовании, содержат прилежащие к ним инсуляторы, что говорит о том, что возможно именно инсуляторные белки осуществляют дистанционные взаимодействия. Экспериментальные доказательства способности PRE без дополнительных регуляторных элементов к осуществлению дистанционных взаимодействий отсутствуют. При этом существует достаточно большое количество работ, подтверждающих участие инсуляторов в осуществлении коммуникации между удаленными хромосомными районами. Например, у дрозофилы

взаимодействие между gypsy инсуляторами способствует активации промотора гена yellow его энхансерами, находящимися на расстоянии в несколько миллионов пн (Kravchenko et al., 2005). Взаимодействие между gypsy инсуляторами обеспечивается белками Mod(mdg4)-67.2 и Su(Hw), отвечающими за его инсуляторную функцию. Взаимодействие между границами Мер обеспечивается минимальным инсулятором размером 210 пн (Kyrchanova et al., 2007), имеющим сайт связывания dCTCF. У млекопитающих взаимодействие между инсулятором из области контроля импринтинга, расположенной на седьмой хромосоме, с локусом Wsb/Nfl, расположенным на одиннадцатой хромосоме, зависит от белка CTCF (Ling et al., 2006). Продемонстрированное в данной работе эффективное взаимодействие между инсуляторами F8, а также между границами Fab-8 и Fab-7, которые не содержали в своем составе сайленсеров, также подтверждает гипотезу о роли инсуляторных белков в организации дистанционных взаимодействий.

В данной работе продемонстрировано, что разделение границы Fab-8 на два функционально различных элемента F8 и PTS (Zhou et al., 1999, 2004, 2007) не является вполне оправданным, так как при таком разделении инактивируется сайт связывания функционально значимого белка. Описанный ранее PTS элемент самостоятельно не способен к поддержанию дальних взаимодействий во взрослой стадии, однако необходим для взаимодействия с гетерологичными границами.

Способность инсуляторов взаимодействовать на больших дистанциях наводит на мысль, что в контексте Abd-B инсуляторы могут непосредственно взаимодействовать с предпромоторной областью, подтягивая /дй-энхансеры к промотору. В данной работе подтверждается способность границ Fab-7 и Fab-8 к взаимодействию с элементом, расположенным промоторной области Abd-B. Ранее при помощи Dam-метилирования было продемонстрировано, что граница Fab-7 приближается к промотору Abd-B в тканях, в которых Abd-B не экспрессируется (голова) (Cleard et al., 2006). Однако в брюшке мухи, где Abd-B активен, такое взаимодействие практически отсутствует. Опираясь на результаты нашей работы, эти данные могут быть объяснены тем, что в тканях, где Abd-B не экспрессируется, все границы и с промоторная область гена взаимодействуют друг с другом. В брюшке мухи в каждом сегменте с предпромоторной областью взаимодействует только

определенная граница. Таким образом, Fab-7 сближается с промотором только в ПС 12, поэтому сигнал метилирования размыт.

Результаты, полученные в данной работе, подтверждают модель разработанную в нашей лаборатории модель регуляции гена Abd-B. Согласно этой модели, в каждом парасегменте соответствующий инсулятор, взаимодействуя с промоторной областью гена Abd-B, подтягивает близлежащий энхансер к промотору. Этим обеспечивается специфичность взаимодействий между энхансером и промотором и нейтрализуется изолирующий эффект инсуляторов расположенных между ними. Одновременно инсулятор изолирует активный домен от репрессированных.

Выводы

1. Продемонстрирована способность Fab-8 инсулятора к поддержанию взаимодействия со своей копией на большой дистанции.

2. Показано, что функциональное проявление взаимодействия между Fab-8 инсуляторами зависит от их взаимной ориентации.

3. Белок dCTCF, связывающийся с инсулятором Fab-8, способен поддерживать дистанционные взаимодействия.

4. Впервые продемонстрировано, что гетерологичные границы, Fab-8 и Fab-7, способны взаимодействовать.

5. Показана способность границ Fab-8 и Fab-7 взаимодействовать с промоторной областью Abd-B.

список печатных работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в научных журналах:

1. Kyrchanova О, Toshchakov S. Podstreshnaya Y, Parshikov A, Georgiev P. Functional interaction between the Fab-7 and Fab-8 boundaries and the upstream promoter region in the Drosophila Abd-B gene. Mol Cell Biol. 2008, 28:4188-4195.

Тезисы конференций:

1. Toshchakov S. Kyrchanova O, Georgiev P. Analysis of interactions between chromatin domain boundaries of Abd-B gene of Drosophila melanogaster. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov, 20-22 September 2007, Kyiv, Ukraine.

2. Тощаков C.B.. Кырчанова O.B., Георгиев П.Г. Изучение взаимодействий между границами регуляторных доменов гена Abdominal-B у Drosophila melanogaster. 11-я международная школа-конференция «Биология - наука XXI века», 29 октября - 02 ноября 2007, Пущино.

3. С. Тощаков, О. Кырчанова, П. Георгиев. Исследование взаимодействий между границами регуляторных доменов Abd-B у Drosophila melanogaster. Всероссийский биологический конгресс 'СимбиозРоссия2008'. 6-10 июля 2008, Казань.

4. О.В. Кырчанова, С.В. Тощаков, Т.А. Ивлиева. Выяснение роли dCTCF в установлении дистанционных взаимодействий между регуляторными доменами гена Abd-B у Drosophila melanogaster. V съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 21-28 июня 2009, Москва.

5. О. Kyrchanova, A. Parshikov, S. Toshchakov. Т. Ivlieva, P. Georgiev. Role of dCTCF in Functional Interaction between the Boundaries and the Abd-B Promoter Region in the bithorax complex of Drosophila. EMBO Conference of Nuclear Structure & Dynamics, 30 September - 40ctober 2009, Isle la Sorgue, France.

Заказ № 1 ЗЗ-а/09/09 Подписано в печать 21.09.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ч ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30; (495) 778-22-20 <., Г^",)) \v\vw. с/г. ги; е-таИ:'т/о@с/г. ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тощаков, Степан Владимирович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Развитие Drosophila melanogaster. Роль гомеозисных генов в процессе эмбриогенеза.

1.1.1 Сегментация в процессе развития Drosophila melanogaster: генетический контроль.

1.1.2 Роль гомеозисных генов в процессе эмбриогенеза.

1.2 Регуляция Bithorax комплекса.

1.2.1 Общие положения.

1.2.2 Фазы функционирования ВХ-С.

1.2.3. Белки групп Polycomb и Trithorax и их роль в регуляции ВХ-С.

1.3 Границы регуляторных доменов гена Abd-B. Инсуляторы.21 '

1.3.1 Организация регуляторной области гена Abd-B.

1.3.2. ГраницаFab-7.23,

1.3.3 Граница Fab-8.

1.3.4 Граница Мер.

1.3.5 Граница Fab-6.

1.4 Модели регуляции гена Abd-B.

1.4.1 Взаимодействие между инсуляторами.

1.4.2 Анти-инсуляторные элементы. Promoter Targeting Sequence.

1.5 Белковые компоне! itm границ регуляторных доменов Bithorax комплекса.

1.5.1. Белок dCTCF.

1.5.2 Белок СР-190.

1.5.3 Другие белковые компоненты границ Bithorax комплекса.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Генетические методы.

2.1.1 Линии и мутации Drosophila melanogaster.

2.1.2 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий.

2.1.3 Фенотипический анализ экспрессии гена mini-white в трансгенных линиях

2.1.4 Генетические скрещивания.

2.2 Молекулярные методы.

2.2.1 Приготовление компетентных клеток линии E.coli DH5a.

2.2.2 Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК.

2.2.3 Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса.

2.2.4 Выделение геномной ДНК из дрозофилы.

2.2.5 Переосаждение ДНК.

2.2.6 Горизонтальный гель электрофорез.

2.2.7 Выделение фрагментов ДНК из геля и очистка ДНК от продуктов ферментативных реакций.

2.2.8 Определение концентрации нуклеиновых кислот.

2.2.9 Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.2.12 Рестрикция плазмидной ДНК.

2.2.13 Метод анализа изменения электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле.

2.3.14. Саузерн-блот-анализ.

2.3 Используемые в работе олигонуклеотиды.

2.4 Получение трансгенных конструкций.

2.4.1 Основные векторы, используемые в работе.

2.4.2 Создание конструкций.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Исследование способности Рав-8 инсулятора взаимодействовать на больших дистанциях.

3.2 Наличие сайтов белка ёСТСР необходимо для осуществления взаимодействия между двумя копиями Рав-8 инсулятора.

3.3 Границы Рав-7 и Рав-8 способны к осуществлению функционального взаимодействия друг с другом.

3.4 Границы Рав-7 и РТ8/Рав-8 способны взаимодействовать с предпромоторной областью гена авб-в.

4 ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование функциональных взаимодействий между границами регуляторных доменов гена Abd-B у Drosophila melanogaster"

Регуляция транскрипции генов эукариот характеризуется рядом особенностей, связанных с поддержанием координированной экспрессии генов в сложноорганизованной генетической системе. Каждый тип клеток многоклеточного организма характеризуется собственной уникальной комбинацией белковых факторов, появление которых в ходе днфференцировки обеспечивается эффективной регуляцией активности кодирующих их генов. Такая высокоэффективная пространственно-временная регуляция экспрессии генов обеспечивается за счет сложноустроенных и, как правило, протяженных регуляторных областей, которые состоят из специфических элементов, активирующих транскрипцию (энхансеров) или репрессирующих ее (сайленсеров).

Для функционирования генома очень большое значение имеет организация независимых доменов экспрессии генов. Механизмы формирования таких доменов в настоящее время мало изучены. Существует гипотеза, постулирующая, что функцию границ доменов с разными паттернами экспрессии выполняют инсуляторы. Инсуляторы - это г^орегуляторные элементы, которые способны функционально изолировать промотор от энхансера, если располагаются между ними, а также ограничивать распространение репрессии (Cai et al., 1995; Gerasimova et al., 1996).

Для запуска работы гена важно, чтобы энхансер правильно находил промотор, несмотря на то, что расстояние между ними иногда может достигать нескольких сот тпн. Существуют экспериментальные доказательства того, что в процессе активации энхансер и промотор сближаются в пространстве, а находящийся между ними участок ДНК выпетливается (West et al., 2005; de Laat et al., 2008, Maeda et. al 2007). Однако механизмы, контролирующие специфичную коммуникацию между энхансерами и промоторами на больших дистанциях, до сих пор мало изучены.

Удобной моделью для изучения механизмов взаимодействия между энхансерами и промоторами является регуляторная область Abd-B гена, входящего в состав Bithorax комплекса Drosophila melanogaster. Регуляторная область Abd-B размером около 60 тпн содержит 4 энхансера {iab-5, iab-6, iab-7, iab-8), каждый из которых определяет уровень экспрессии гена в соответствующем брюшном парасегменте (ПС10-13). Энхансеры отделены друг от друга границами, три из которых были подробно изучены: Мер. Fab-7 и Fab-8. Эти границы устроены сходным образом и содержат в своем составе инсулятор и прилегающий к нему сайленсер (Karch et al., 1994; Barges et al., 2000; Zhou et al., 1999; Gruzdeva et al.,y. 2005). Таким образом, имеет место парадоксальная ситуация, при которой окруженные инсуляторами энхансеры способны активировать свой промотор^ Исходя из этого, можно предположить, что инсуляторы Bithorax комплекса обладают дополнительными функциями. Исследование границ Мер и Fab-7 показало, что инсуляторы границ способны взаимодействовать со своими копиями на больших дистанциях (Muller et al., 1999, Bantingnies et al., 2003, Gruzdeva et al., 2005. Vazquez et al., 2006, Kyrchanova et al., 2007). Для границы Fab-7 было показано, что она сближается с предпромоторной областью гена Abd-B в некоторых тканях (Cleard et al., 2006). Таким образом, можно предположить, что границы регуляторных доменов отвечают за пространственную организацию локуса ВХ-С и специфичную коммуникацию между энхансерами и промоторами его генов.

К настоящему моменту накоплены некоторые данные о белковых компонентах границ регуляторных доменов (Moon et al. 2005; Holohan et al., 2007; Hagstrom et al., 1996; Mohan et al., 2007; Aoki et al., 2008). В частности, продемонстрировано, что с границами связываются известные инсуляторные белки дрозофилы, такие как dCTCF и CP 190. Однако их роль в регуляции работы гена Abd-B остается не совсем ясной.

Целью настоящей работы стало исследование функциональных взаимодействий между границами Fab-7 и Fab-8 и проверка их способности взаимодействовать с промоторной областью тема. Abd-B.

Экспериментальной основой данной работы послужила модельная система, разработанная в нашей лаборатории и позволяющая идентифицировать элементы, способные к коммуникации на больших дистанциях. При помощи нее мы исследовали способность границы Fab-8 и ее составных частей к взаимодействию на большом расстоянии со своей копией, с границей Fab-7 и с предпромоторной областью гена Abd-B. Кроме того, в данной работе проводится исследование роли белка dCTCF в осуществлении взаимодействий на больших дистанциях.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Тощаков, Степан Владимирович

выводы

1. Продемонстрирована способность ЕаЬ-8 инсулятора к поддержанию взаимодействия со своей копией на большой дистанции.

2. Показано, что функциональное проявление взаимодействия между ЕаЬ-8 инсуляторами зависит от их взаимной ориентации.

3. Белок <!СТСЕ, связывающийся с инсулятором ЕаЬ-8, способен поддерживать дистанционные взаимодействия.

4. Впервые продемонстрировано, что гетерологичные границы, ЕаЬ-8 и ЕаЬ-7, способны взаимодействовать.

5. Показана способность границ ЕаЬ-8 и ЕаЬ-7 взаимодействовать с промоторной областью АЬй-В.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тощаков, Степан Владимирович, Москва

1. Akbari OS, Bousum A, Bae E, Drewell RA. Unraveling cis-regulatory mechanisms at the abdominal-A and Abdominal-B genes in the Drosophila bithorax complex. Dev Biol. 2006 May 15;293(2):294-304.

2. Aoki T, Schweinsberg S, Manasson J, Schedl P. A stage-specific factor confers Fab-7 boundary activity during early embryogenesis in Drosophila. Mol Cell Biol. 2008 Feb;28(3): 1047-60.

3. Bantignies F, Goodman RH, Smolik SM. Functional interaction between the coactivator Drosophila CREB-binding protein and ASH1, a member of the trithorax group of chromatin modifiers. Mol Cell Biol. 2000 Dec;20(24):9317-30.

4. Bantignies F., Grimaud C., Lavrov S. et al. Inheritance of Polycomb-dependent chromosomal interactions in Drosophila. Genes Dev. 2003. V. 17. P. 2406-2420.

5. Beachy P.A., Helfand S.L., Hogness, D.S. Segmental distribution of Bithorax complex proteins during Drosophila development. Nature. 1985, V.313, P. 545-551.

6. Bell AC, West AG, Felsenfeld G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell. 1999 Aug 6;98(3):387-96.

7. Brown JL, Fritsch C, Mueller J, Kassis JA. The Drosophila pho-like gene encodes a YY1-related DNA binding protein that is redundant with pleiohomeotic in homeotic gene silencing. Development. 2003 Jan;130(2):285-94.

8. Brown JL, Mucci D, Whiteley M, Dirksen ML, Kassis JA. The Drosophila Polycomb group gene pleiohomeotic encodes a DNA binding protein with homology to the transcription factor YY1. Mol Cell. 1998 Jun;l(7): 1057-64.

9. Busturia A, Lloyd A, Bejarano F, Zavortink M, Xin H, Sakonju S.The MCP silencer of the Drosophila Abd-B gene requires both Pleiohomeotic and GAGA factor for the maintenance of repression. Development. 2001 Jun;128(l l):2163-73.

10. Cai H., Levine M. Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo. Nature. 1995. V.376. P. 533-536.

11. Cai HN, Shen P. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. Science. 2001 Jan 19;291(5503):493-5.

12. Celniker S.E., Sharma S., Keelan D.J., Lewis E.B. 1990. The molecular genetics of the bithorax complex of Drosophila: cw-regulation in the Abdominal-B domain. EMBO J. V.9. P.4277-4286.

13. Chen, Q., L. Lin, S. Smith, Q. Lin. and J. Zhou. 2005. Multiple promoter targeting sequences exist in Abdominal-B to regulate long-range gene activation. Dev. Biol. V.286. P.629-636.

14. Cleard, F., Moshkin Y., Karch F., Maeda R.K. Probing long-distance regulatory interactions in the Drosophila melanogaster bithorax complex using Dam identification. Nat. Genet. 2006. V.38. P.931-935.

15. Comet I. Savitskaya E, Schueltengruber B, Nègre N, Lavrov S, Parshikov A, Juge F, Gracheva E, Georgiev P, Cavalli G. PRE-mediated bypass of two Su(Hw) insulators targets PcG proteins to a downstream promoter. Dev Cell. 2006 Jul; 11(1): 117-24.

16. Cuddapah S, Jothi R, Schönes DE, Roh TY, Cui K, Zhao K. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome Res. 2009 Jan;19(l):24-32.

17. Déjardin J, Cavalli G. Chromatin inheritance upon Zeste-mediated Brahma recruitment at a minimal cellular memory module. EMBO J. 2004 Feb 25;23(4):857-68.

18. Déjardin J, Rappailles A, Cuvier O, Grimaud C. Decoville M, Locker D, Cavalli G. Recruitment of Drosophila Polycomb group proteins to chromatin by DSP1. Nature. 2005 Mar 24;434(7032):533-8.

19. Dellino GI, Tatout C, Pirrolta V. Extensive conservation of sequences and chromatin structures in the bxd polycomb response element among Drosophilid species. Int J Dev Biol. 2002 Jan;46(l):133-41.

20. Delorenzi M., Bienz M. Expression of Abdominal-B homeoproteins in Drosophila embryos. Development. 1990. V.108. P.323-329.

21. Different transcripts of the Drosophila Abd-B gene correlate with distinct genetic sub-functions. Kuziora MA, McGinnis W. EMBO J. 1988 Oct;7(10):3233-44.

22. Dillon N., Sabbattini P. Functional gene expression domains: defining the functional unit of eukaryotic gene regulation. BioEssays. 2000. V.22. P.657-665.

23. Drewell RA, Bae E, Burr J, Lewis EB. Transcription defines the embryonic domains of cis-regulatory activity at the Drosophila bithorax complex. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Dec 24;99(26): 16853-8.

24. Dunn KL, Zhao H, Davie JR. The insulator binding protein CTCF associates with the nuclear matrix. Exp Cell Res. 2003 Aug 1 ;288(1):218-23.

25. Fitzgerald D.P., Bender W. Polycomb Group Repression Reduces DNA Accessibility. // Mol Cell Biol. 2001. V.21. P.6585-6597.

26. Francis NJ, Saurin AJ, Shao Z, Kingston RE. Reconstitution of a functional core polycomb repressive complex. Mol Cell. 2001 Sep;8(3):545-56.

27. Galloni, M., Gyurkovics H., Schedl P., Karch F. The bluetail transposon: Evidence for independent c/s-regulatory domains and domain boundaries in the bithorax complex. EMBOJ. 1993.V.12. P.1087-1097.

28. Gamsjaeger R, Liew CK, Loughlin FE, Crossley M, Mackay JP. Sticky fingers: zinc-fingers as protein-recognition motifs. Trends Biochem Sci. 2007 Fcb;32(2):63-70

29. Gerasimova TI, Byrd K, Corces VG. A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA. Mol Cell. 2000 Nov;6(5): 1025-35.

30. Gerasimova TI, Corces VG. Boundary and insulator elements in chromosomes. Curr Opin Genet Dev. 1996 Apr;6(2): 185-92.

31. Grimaud C, Negre N, Cavalli G. From genetics to epigenetics: the tale of Polycomb group and trithorax group genes. Chromosome Res. 2006. V.14. P.363-375.

32. Grimaud C., Bantignies F., Pal-Bhadra M., Ghana P. Bhadra U., Cavalli G. RNAi components are required for nuclear clustering of Polycomb group response elements. // Cell. 2006. V. 124. P. 957-971.

33. Guarente L. Yeast promoters: positive and negative elements. Cell. 1984 Apr;36(4):799-800.

34. Gyurkovics H., Gausz J., Kummer J., Karch F. A new homeotic mutation in the Drosophila bithorax complex removes a boundary separating two domains of regulation. EMBO. 1990. V. 9. P. 2579-2585.

35. Hagstrom K, Muller M, Schedl P. A Polycomb and GAGA dependent silencer adjoins the Fab-7 boundary in the Drosophila bithorax complex. Genetics. 1997 Aug; 146(4): 1365-80.

36. Hagstrom K., Muller M., Schedl P. Fab-7 functions as a chromatin domain boundary to ensure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex. Genes Dev. 1996. V.10.P 3202-3215.

37. Hartenstein V. Atlas of Drosophila development. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1993.

38. Plolohan EE, Kwong C, Adryan B, Bartkuhn M, Herold M, Renkawitz R, Russell S, White R. CTCF genomic binding sites in Drosophila and the organisation of the bithorax complex. PLoS Genet. 2007 Jul;3(7):ell2.

39. Hou C, Zhao H, Tanimoto K, Dean A. CTCF-dependent enhancer-blocking by alternative chromatin loop formation. Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Dec 23;105(51):20398-403.

40. Karch F, Bender W, Weiffenbach B. abdA expression in Drosophila embryos. Genes Dev. 1990. V.4. P.1573-1587.

41. Karch F., Galloni M., Sipos L., Gausz J., Gyurkovics H., Schedl P. 1994. Mcp and Fab-7: molecular analysis of putative boundaries of c/s-regulatory domains in the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. V.22. P.3138-3146.

42. Karch F., Weiffenbach B., Pcifer M., Bender W., Duncan I., Celniker S., Crosby M., Lewis E.B. The abdominal region of the bithorax complex. Cell. 1985. V.43. P.81-96.

43. Kares R.E., Rubin G.M. Analysis of P transposable element functions in Drosophila. Cell. 1984. V.38. P.135-146.

44. Kassis JA. Pairing-sensitive silencing, polycomb group response elements, and transposon homing in Drosophila. Adv Genet. 2002;46:421-38. Review.

45. Kennison JA, Vázquez M, Brizuela BJ. Regulation of the Sex combs reduced gene in Drosophila. AnnN Y Acad Sci. 1998 Apr 15;842:28-35. Review.

46. Kim TH, Abdullaev ZK, Smith AD, Ching KA, Loukinov DT, Green RD, Zhang MQ, Lobanenkov VV, Ren B. Analysis of the vertebrate insulator protein CTCF-binding sites in the human genome. Cell. 2007 Mar 23;128(6): 1231-45.

47. Kohne AC, Baniahmad A, Renkawitz R. NePl. A ubiquitous transcription factor synergizes with v-ERBA in transcriptional silencing. J Mol Biol. 1993 Aug 5;232(3):747-55.

48. Kravchenko E, Savitskaya E, Kravchuk O, Parshikov A, Georgiev P, Savitsky M. Pairing between gypsy insulators facilitates the enhancer action in trans throughout the Drosophila genome. Mol Cell Biol. 2005 Nov;25(21):9283-91.

49. Lamka ML, Boulet AM, Sakonju S. Ectopic expression of UBX and ABD-B proteins during Drosophila embryogenesis: competition, not a functional hierarchy, explains phenotypic suppression. Development. 1992 Dec; 116(4):841-54.

50. Lanzuolo C, Roure V, Dekker J, Bantignies F, Orlando V. Polycomb response elements mediate the formation of chromosome higher-order structures in the bithorax complex. Nat Cell Biol. 2007 0ct;9(10): 1167-74.

51. Lewis E.B. A gene complex controlling segmentation in Drosophila. Mature. 1978. V. 276.P.565-570.

52. Lewis E.B. The bithorax complex: the first fifty years. Int. J. Dev. Biol. 1998. V. 42: 403-415.

53. Lin Q, Chen Q, Lin L, and J. Zhou. The promoter targeting sequence mediates epigenetically heritable transcription memory. Genes Dev. 2004. V.18. P.2639-2651.

54. Lin Q. D. Wu, and J. Zhou. The promoter targeting sequence facilitates and restricts a distant enhancer to a single promoter in the Drosophila embryo. Development. 2003. V.130. P.519-526.

55. Lindsley D., Zimm G. The genome of Drosophila melanogaster. Academic Press, New * York. 1992.

56. Ling JQ, Li T, Hu JF, Vu TH, Chen HL, Qiu XW, Cheny AM, Hoffman AR. CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsbl/Nfl. Science. 2006 Apr 14;312(5771):269-72.

57. Lipshitz HD, Peattie DA, Hogness DS. Novel transcripts from the Ultrabithorax domain of the bithorax complex. Genes Dev. 1987 May;l(3):307-22.

58. Maeda RK, Karch F. Making connections: boundaries and insulators in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 2007 Oct;17(5):394-9.

59. Mahmoudi T, Katsani KR, Verrijzer CP. GAGA can mediate enhancer function in trans by linking two separate DNA moleculcs. EMBO J. 2002 Apr 2;21(7):1775-81.

60. Martin CII, Mayeda CA, Davis CA, Ericsson CL, Knafels JD, Mathog DR, Cclniker SE, Lewis EB, Palazzolo MJ. Complete sequence of the bithorax complex of Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Aug 29;92(18):8398-402.

61. Melnikova L, Juge F, Gmzdeva N. Mazur A. Cavalli G, Georgiev P. Interaction between the GAGA factor and Mod(mdg4) proteins promotes insulator bypass in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Oct 12;101(41):14806-11.

62. Mihaly J, Barges S, Sipos L, Maeda R, Cleard F, Hogga I, Bender W, Gyurkovics H, Karch F. Dissecting the regulatory landscape of theAbd-B gene of the bithorax complex. Development. 2006. V.133. P.2983-2993.

63. Mihaly J., Hogga I., Barges S., Galloni M., Mishra R.K., Hagstrom K., Muller M., Schedl P., Sipos L., Gausz J., Gyurkovics H., Karch F. Chromatin domain boundaries in the bithorax complex. Cell Mol. Life Sci. 1998. V.54. P.60-70.

64. Mihaly J., Hogga I., Gausz J., Gyurkovics H. Karch F. In situ dissection of the Fab-7 region of the bithorax complex into a chromatin domain boundary and a Polycomb-response element. Development. 1997. V.124. P. 1809-1820.

65. Mohd-Sarip A, Cleard F, Mishra RK, Karch F, Verrijzer CP. Synergistic recognition of an epigenetic DNA element by Pleiohomeotic and a Polycomb core complex. Genes Dev. 2005 Aug l;19(15):1755-60.

66. Mohd-Sarip A, van der Knaap JA, Wyman C, Kanaar R, Schedl P, Verrijzer CP. Architecture of a polycomb nucleoprotein complex. Mol Cell. 2006 Oct 6;24(1):91-100.

67. Moon H., Filippova G., Loukinov D., et al. CTCF is conserved from Drosophila to humans and confers enhancer blocking of the Fab-8 insulator. EMBO Rep. 2005. V. 2. P. 165-170.

68. Müller J, Hart CM, Francis NJ. Vargas ML, Sengupta A, Wild B, Miller EL, O'Connor MB, Kingston RE, Simon JA. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 2002 Oct 18;lll(2):197-208.

69. Müller J, Kassis JA. Polycomb response elements and targeting of Polycomb group proteins in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 2006 Oct;16(5):476-84.

70. Muller M., Hagstrom K., Gyurkovics H., Pirrotta V., Schedl P. The Mcp element from the Drosophila melanogaster bithorax complex mediates long-distance regulatory interactions. Genetics. 1999. V.153. P. 1333-1356.

71. Muravyova E., Golovnin A., Gracheva E. et al. Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. Science. 2001. V. 291. P. 495-498.

72. Nègre N, Hennetin J, Sun LV, Lavrov S, Bellis M, White KP, Cavalli G. Chromosomal distribution ofPeG proteins during Drosophila development. PLoS Biol. 2006 Jun;4(6):el70.

73. Niisslein-Volhard C, Wieschaus E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature. 1980 Oct 30;287(5785):795-801.

74. Niisslein-Volhard C. and Wieschaus. E. Novel genes controlling segmentation at D. melanogaster. Nature. 1980. V.287 P.795 801.

75. Ohlsson R, Renkawitz R, Lobanenkov V. CTCF is a uniquely versatile transcription regulator linked to epigenetics and disease. Trends Genet. 2001 Sep;17(9):520-7.

76. Papoulas O, Beek SJ, Moseley SL, McCallum CM, Sarte M, Shearn A, Tamkun JW. The Drosophila trithorax group proteins BRM, ASH1 and ASH2 are subunits of distinct protein complexes. Development. 1998 Oct;125(20):3955-66.

77. Papp B, Mliller J. Histone trimethylation and the maintenance of transcriptional'ON and OFF states by trxG and PcG proteins. Genes Dev. 2006 Aug 1 ;20( 15):2041-54.

78. Paro R. Imprinting a determined state into the chromatin of Drosophila. Trends Genet. 1990. V. 6. P. 416-421.

79. Pérez-Lluch S, Cuartero S, Azorin F, Espinàs ML. Characterization of new regulatory elements within the Drosophila bithorax complex. Nucleic Acids Res. 2008 Dec;36(21):6926-33. Epub 2008 Oct 31.

80. Phillips JE, Corces VG. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 2009 Jun 26;137(7): 1194-211.

81. Pirrotta V, Rastelli L. White gene expression, repressive chromatin domains and homeotic gene regulation in Drosophila. Bioessays. 1994 Aug;16(8):549-56. Review.

82. Pirrotta V. PcG complexes and chromatin silencing. Curr.Opin.Gen.Dev. 1997. V.7. P.249-258.

83. Quitschke WW, Matthews JP, Kraus RJ, Vostrov AA. The initiator element and proximal upstream sequences affect transcriptional activity and start site selection in the amyloid beta-protein precursor promoter. J Biol Chem. 1996 Sep 6;271(36):22231-9.

84. Quitschke WW, Taheny MJ, Fochtmann LJ, Vostrov AA. Differential effect of zinc finger deletions on the binding of CTCF to the promoter of the amyloid precursor protein gene. Nucleic Acids Res. 2000 Sep l;28(17):3370-8.

85. Ringrose L, Paro R. Polycomb/Trithorax response elements and epigenetic memory of cell identity. Development. 2007 Jan;134(2):223-32

86. Ringrose L, Rehmsmeier M, Dura JM, Paro R. Genome-wide prediction of Polycomb/Trithorax response elements in Drosophila melanogaster. Dev Cell. 2003 Nov;5(5):759-71.

87. Rodin S, Kyrchanova O, Pomerantseva E, Parshikov A, Georgiev P. New properties of Drosophila fab-7 insulator. Genetics. 2007 Sep;177(l):l 13-21.

88. Rodin S, Kyrchanova O, Pomerantseva E, Parshikov A, Georgiev P. New properties of Drosophila fab-7 insulator. Genetics. 2007 Sep;177(l):l 13-21.

89. Rubin G., Sprandling A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 1982. V.218. P.348-353.

90. Sanchez-Eisner T., Gou D., Kremmer E., Sauer F. Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ashl to Ultrabithorax. Science. 2006. V.311. P.1118-1123.

91. Sánchez-Herrero E. Control of the expression of the bithorax complex abdominal-A and Abdominal-B by c¿s-regulatory regions in Drosophila embryos // Development. 1991. V.lll. P.437-448.

92. Sánchez-Herrero, E., Vemos, I., Marco, R. and Morata, G. Genetic organization of Drosophila bithorax complex. Nature 1985, V. 313 P.108-113.

93. Saurin AJ, Shao Z, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Kingston RE. A Drosophila Polycomb group complex includes Zeste and dTAFII proteins. Nature. 2001 Aug 9;412(6847):655-60.

94. Schmitt S, Paro R. RNA at the steering wheel. Genome Biol. 2006;7(5):218

95. Schuettengruber B, Chourrout D, Vervoort M, Leblanc B, Cavalli G Genome regulation by polycomb and trithorax proteins. Cell. 2007 Feb 23;128(4):735-45.

96. Schwartz YB, Kahn TG, Nix DA, Li XY, Bourgon R, Biggin M, Pirrotta V. Genome-wide analysis of Polycomb targets in Drosophila melanogaster. Nat Genet. 2006 Jun;38(6):700-5.

97. Schwartz YB, Pirrotta V. Polycomb complexes and epigenetic states. Curr Opin Cell Biol. 2008 Jun;20(3):266-73.

98. Schwartz YB, Pirrotta V. Polycomb silencing mechanisms and the management of genomic programmes. Nat Rev Genet. 2007 Jan;8(l):9-22.

99. Schweinsberg SE, Schedl P. Developmental modulation of Fab-7 boundary function. Development. 2004 Oct;131(19):4743-9.

100. Sipos L., Gyurkovics H. Long-distance interactions between enhancers and promoters // FEBS J. 2005. V. 272. P. 3253-3259.

101. Sipos, L., Mihaly J., Karch F., Schedl P., Gausz J., Gyurkovics H. Transvection in the Drosophila Abd-B domain: extensive upstream sequences are involved in anchoring distant cw-regulatory regions to the promoter. Genetics. 1998. V.149. P.1031-1050.

102. Splinter E, Heath H, Kooren J, Palstra R.T, Klous P, Grosveld F, Galjart N, de Laat W. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the beta-globin locus. Genes Dev. 2006 Sep l;20(17):2349-54.

103. Struhl K. Genetic properties and chromatin structure of the yeast gal regulatory element: an enhancer-like sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Dec; 81(24):7865-9.

104. Strutt H, Cavalli G, Paro R. Co-localization of Polycomb protein and GAGA factor on regulatory elements responsible for the maintenance of homeotic gene expression. EMBO J. 1997 Jun 16;16(12):3621-32.

105. Tolhuis B, de Wit E, Muijrers I, Teunissen II, Talhout W, van Steensel B, van Lohuizen M. Genome-wide profiling of PRC 1 and PRC2 Polycomb chromatin binding in Drosophila melanogaster. Nat Genet. 2006 Jun;38(6):694-9.

106. Vazquez, J., M. Muller, V. Pirrotta, and J.W. Sedat. The Mcp element mediates stable long-range chromosome-chromosome interactions in Drosophila. Mol. Biol. Cell. 2006. V.17. P.2158-2165.

107. Walters MC, Fiering S, Bouhassira EE, Scalzo D, Goeke S, Magis W, Garrick D, Whitelaw E, Martin DI. The chicken beta-globin 5'HS4 boundary element blocks enhancer-mediated suppression of silencing. Mol Cell Biol. 1999 May; 19(5):3714-26.

108. Wang L, Brown JL, Cao R, Zhang Y, Kassis JA, Jones RS. Hierarchical recruitment of polycomb group silencing complexes. Mol Cell. 2004 Jun 4;14(5):637-46.

109. West A. G., Fraser P. Remote control of gene transcription. Hum. Mol. Genet. 2005.V.14. P.101-111.

110. Yusufzai TM, Tagami H, Nakatani Y, Felsenfeld G. CTCF tethers an insulator to subnuclear sites, suggesting shared insulator mechanisms across species. Mol Cell. 2004 Jan 30;13(2):291-8.

111. Zavortink M, Sakonju S. The morphogenetic and regulatory functions of the Drosophila Abdominal-B gene are encoded in overlapping RNAs transcribed from separate promoters. Genes Dev. 1989 Dec;3(12A): 1969-81.

112. Zhou J., Ashe H., Burks C. et al. Characterization of the transvection mediating region of the Abdominal-B locus in Drosophila. Development. 1999. V.126. P.3057-3065

113. Zhou J., Levine M. A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embryo. Cell. 1999. V. 99. P.567-575.

114. Zhou, J., S. Barolo, P. Szymanski, and M. Levine. The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embiyo. Genes Dev. 1996. V.10. P.3195-3201.