Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Определение роли dCTCF в организации дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами bithorax-комплекса Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Определение роли dCTCF в организации дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами bithorax-комплекса Drosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 575.22:595.773.4

4858418

Ивлиева Татьяна Александровна

Определение роли с1С'ГСР в организации дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами ЬШюгах-комплекса Бго^ор/гНа тсЫпо^сЫег

Специальность 03.01.07 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 3 ноя 2011

Москва 2011

4858418

Работа выполнена в группе изучения механизмов активации и репрессии транскрипции Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН (ИБГ РАН)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Кырчанова О.В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Буздин А.А.

доктор биологических наук, Краснов А.Н.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится ¿0 .ноября 2011 года в II _часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан « ¿/» £>/¿777 2011 года.

Ученый секретарь Диссертационного совет канд. фарм. наук Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Для обеспечения морфологического и функционального разнообразия клеток, формируюиегося в ходе развития многоклеточного организма, геобходимы точнье и вьсокоэффективньБ механизмы регуляции экспрессии генов. Геномы эукариотических организмов шгут содержать десятки тьсяч генов, для каждого ю которых суиествует программа реализации генетической информации харакгеризукхшяся определенным врем: не ч местом и уровнем экспрессии Одним из ванетейиих ксханшмов, обеспечивают« правильную работу генов, является регуляция транскрипции За счет взаимодействия белковых факторов с промоторами генов и другими цис- регуляторными эле ментами ДНК (энхансерами или сайленсерами) происходит активация или репрессия транскрипции соответственно. Озитается, что скоординированная транскрипция обеспечивается, в частности, путем организации генов в независимые хроматиновьЕ дожны с определенными паттернами экспрессии (Spellman & Rubin 2002; DilJon & Sabbattini, 2000). Суиествует предположение о тоц что в этом процессе важную роль играют инсуляторы - ^ис-регуляторнье элементу когорьс способны блокировать акгивирукнее действие энхансера, если расположены №жцу ним и промотороц а такие являкгся барьерами предотврапвюиими распространение репрессионного хроматина (Caí & Levine, 1995; Gerasimova & Corees, 1996, Kuhn & Geyer, 2003). В последнее время появляется все боль ив данных, свидетельствующих отоц что энхансеры и промоторы сблииены в пространстве, а инсуляторы игра кг кл кневу юроль в обеспечении этих взаимодействий (Cleard F. et al., 2006).

Удобной модельюдля изучения регуляции транскрипции, является ¿¡/Аогах-комплекс (ВХ-С) Drosophila melanogaster. ГеныВХ-С: Ultrabithorax (Ubx), abdominal A (abd-Ä) и Abdominal В (Abd-B), - огвечакг за формирование части третьего грудного и всех брюшных сегментов. Эти гены регулируются тканеспецифичными энхансерами (abx/bx, bxd/pbx, iab-2 - iab-8), расположенными в порядке следования сегшнгов, которьв они контролируют, ойхансеры отделены друг от друга регуляторными границами В составе трех изученных ранее границ (Мер, Fab-7 nPTS/Fab-8) бьпи найдены инсуляторы Было показано, что инсуляторная активность PTS/Fab-8 зависит от наличия сайтов связывания белка dCTCF, который является гомологом инсуляторного белка позвоночных (Moon et al., 2005). РЬдавно сайты связьвания dCTCF бьии картированы между iab-домнами ¿//Логат-комплекса (Holohan et al., 2007). Это позволило предположить су чествование новых инсуляторов в bithorax- комплексе.

Для CTCF позвоночных была показана роль в установлении взаимодействий между удаленными участками генома. Участие dCTCF в дистанционных взаимодействиях было продемонстрировано ранее в нашей лаборатории (Kyrchanova et al., 2008). Можно предположить,

что dCTCF играет важную роль в установлении взаимодействий между регуляторными элементами в локусе ВХ-С. Исследование данного вопроса является важным для понимания механизмов регуляции транскрипции генов.

Цель и задачи исследования

Целью работы было определение роли dCTCF в функционировании границ локуса bithorax Drosophila melanogasler.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Протестировать участки границ Fab-3, Fab-4 и Fab-6, содержащие сайты связывания dCTCF, на способность к инсуляции.

2. Изучить способность границ Fab-3, Fab-4 и Fab-6 к поддержанию дистанционных взаимодействий.

3. Определить роль белка dCTCF в организации дистанционных взаимодействий между инсуляторами границ

4. Протестировать границы разных регуляторных областей (генов abd-A и Âbd-B) на способность к взаимодействию с предпромоторной областью тепа Abd-B.

5. Определить роль белка dCTCF во взаимодействиях инсуляторов границ ВХ-С с предпромоторной областью гена Abd-B.

Научная новизна и практическое значение работы

В работе исследованы фрагменты границ Fab-3, Fab-4 и Fab-6, содержащие сайты связывания dCTCF, и впервые показано, что они не проявляют энхансер-блокирующих свойств и способны поддерживать дистанционные взаимодействия. Установлено, что способность границ Мер, Fab-6 или PTS/F8 к дистанционным взаимодействиям не зависят от dCTCF. Впервые продемонстрировано, что dCTCF является одним из белков, обеспечивающих функциональную ориентационную зависимость взаимодействий между двумя копиями PTS/F8. Выявлена селективность взаимодействия предпромоторной области гена Abd-B с границами регуляторной области Fab-6, Fab-7 и PTS/F8. Получены данные, свидетельствующие о том, что помимо dCTCF, в поддержание специфических взаимодействий между этими регуляторными элементами вовлечены пока не идентифицированные белки.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 21-28 июня, 2009), на международной конференции EMBO Conférence of Nuclear Structure & Dynamics (Isle la Sorgue, France, 30 September-4 October 2009); на международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ-2010» (Москва, 12-15 апреля, 2010); на международном симпозиуме «Control of gene expression and cancer» (Moscow, Russia, 21-25 June, 2010); на 15-ой Международной

Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2011); на V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 8-12 августа, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Из них статей -2, тезисов устных и стендовых сообщений на конференциях - 6.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 31 страницах, включает 28 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I) Исследование границ РаЬ-З, РаЬ-4 и РаЬ-6 на способность блокировать взаимодействие между энхансерами и промоторами

Ранее было показано, что активность инсулятора РаЬ-8 зависит от наличия сайтов связывания <ЗСТСР. Недавно сайты связывания инсуляторного белка (ЗСТСР были картированы между /аб-доменами ЬнИогах-комплекса. Это позволило предположить существование новых инсуляторов: РаЬ-З (между /аЬ-2 и шЬ-3), ¥аЪ-4 (между шЬ-З и гаЪ-4) и БаЬ-б (между /аЬ-5 и ¡аЬ-6). Для того чтобы проверить это предположение, фрагменты границ РаЬ-З размером 626 п.н. (РЗ), РаЬ-4 - 784 п.н. (Р4) и РаЬ-6 - 425 п.н. (Р6), содержащие сайты связывания с!СТСР, были взяты для тестирования на энхансер-блокирующую активность (рис. 1).

Рисунок 1. Схема регуляторной области генов аЬЛ-А и ЛЬс!-В. Черные прямоугольники обозначают экзоны генов аЬс!-Л и АЬс!-В, стрелками указано направление их транскрипции. Черными кружками отмечены сайты связывания ёСТСР.

proximal

• - dCTCF binding sitc Щг Fab-3 (626 bp) Г^П - Fab-4 (784 bp) [♦> - Мер (340 bp) £> - Acrcf (375 bp)

- Fab-6 (425 bp)

- Fab-7 (858 bp) »*» - PTS/F8 (337 bp)

- Fab-8 (609 bp)

- PTS (625 bp)

С этой целью была использована модельная система с последовательно расположенными маркерными генами: yellow (Y), определяющим пигментацию кутикулы тела, крыльев, щетинок, и white (W), отвечающим за окраску глаз (рис. 2). Модельные системы на основе этих генов традиционно используются для исследования энхансер-блокирующей функции инсуляторов. В отличие от гена yellow, экспрессия гена white сильно зависит от окружающего хроматина (эффект положения), поэтому для оценки активности глазного энхансера он был окружен сайтами для Flp-рекомбиназы (fi-t) (Е(е)), что позволяло удалять его из трансгенных линий. Два энхансера, отвечающих за экспрессию гена yellow в кутикуле тела и крыльях дрозофилы, а также глазной энхансер, были расположены перед промотором гена yellow, тогда как энхансер, обеспечивающий активацию yellow в щетинках, располагался в интроне гена yellow (Ey(e)YW). Тестируемые элементы были встроены между промотором гена yellow и энхансерами глаз, тела и крыльев. Таким образом, энхансер щетинок являлся индикатором активности промотора гена yellow, что позволяло отличать инсулирующие свойства элементов от репрессирующих. Исследуемые фрагменты были фланкированы /о.х-сайтами для специфической рекомбинации, что позволяло удалять их in vivo и оценивать стимулируемую энхансерами экспрессию генов yellow и white в месте встройки конструкции в геном.

Jrl frl ¡ох

Рисунок 2. Схематичное изображение используемых генетических конструкций. Гены обозначены прямоугольниками белого (yellow) и черного (white) цвета, стрелками указано направление их транскрипции. Кружком обозначен глазной энхансер; пятиугольниками - энхансеры крыльев, тела, щетинок («к», «т», «щ», соответственно); треугольником обозначена позиция встройки тестируемого элемента. Вертикальными стрелками - сайты узнавания для рекомбиназы FIp (fit) и рекомбиназы Сге (/ох); в названиях конструкций эти сайты обозначены круглыми скобками.

Известно, что к инсуляторам ВХ-С прилегают сайленсеры, поэтому нельзя было исключить, что тестируемые фрагменты границ могут содержать в своем составе сайленсерные последовательности. Для предотвращения возможного прямого репрессорного действия на промоторы генов yellow и white тестируемые элементы были клонированы в обратной ориентации (R). Если бы тестируемый элемент содержал в своем составе инсулятор, то его действие должно было бы защитить промоторы генов не только от действия энхансеров yellow и white, но и от действия возможного репрессора в составе тестируемого элемента.

Для тестирования границы Fab-б была создана конструкция Ey(e)(F6)RYW. В результате

трансформации в эмбрионы линии yw было получено 25 трансгенных линий, содержащих

единичную инсерцию конструкции Ey(e)(F6)RYW. Пигментация глаз в этих линиях сильно

варьировала, что свидетельствует о нестабильной стимуляции гена white энхансером и ее

зависимости от положения конструкции в геноме (рис. ЗА). В 7 линиях из 25 делеция F6 с

помощью CRE/lox приводила к повышению уровня пигментации глаз, что свидетельствует о

4

влиянии F6 на промотор гена white. Однако в этих линиях в гомозиготном по конструкции состоянии наблюдалось снижение уровня пигментации глаз по сравнению с гетерозиготным состоянием, что является характерным проявлением действия Рс-зависимых сайленсеров. Пигментация тела в этих линиях была также снижена, и в 4 линиях из 7 наблюдалось снижение уровня экспрессии yellow в щетинках (рис. 4А). Делеция F6 восстанавливала стимулируемую энхансерами экспрессию гена yellow. Таким образом, либо фрагмент Fab-б размером 425 п.н. является сайленсером, либо инсулятор в его составе не препятствует распространению Рс-зависимой репрессии. В оставшихся 18 линиях наличие F6 в составе конструкции не влияло на уровень экспрессии генов yellow и white, что свидетельствует о неспособности фрагмента Fab-6 размером 425 п.н. блокировать энхансеры этих генов. Для изучения сайленсерных свойств F6 мы создали конструкцию Ey(e)(F6)YW, в которой F6 был встроен в ориентации, при которой предполагаемый сайленсер находился со стороны промоторов теть yellow и white (рис. ЗБ, 4Б). В 6 из 11 полученных трансгенных линий, содержащих единичную инсерцию конструкции Ey(e)(F6)YW, уровень пигментации глаз увеличивался после вырезания F6.

white

К? ТК К ТО ОР ТЖ Ж СЖ Б PSS N

А

Ey(w)(Fab-6)RYW 1 1 8 4 |6 4 1 8/25 25

Ey(w)(A)YW 1 5 Я 5 1 3 1 0 7/25

Ey(w)(Fab-6)YW I 1 3 12 1 3 6/11 »

Ey(w)(A)YW 1 3 3 11 2 1 0 6/11

Ey(w)(Fab-3)RYW 1 1 1 2 31 3 3 1 0 15

Ey(w)(A)YW 1

F.y(w)(Fab-4)RYW 1 1 2 2 |2 2 2 1 3/13 13

Ey(w)(A)YW 1 2 2 1 I 3 1 2 1 0 2/13

Рисунок 3. Исследование фрагментов границ Fab-6, Fab-З и Fab-4 на способность блокировать взаимодействие между эихаисером и промотором гена white. Результаты анализа экспрессии гена yellow в линиях, трансгенных по конструкциям Ey(e)(F6)RYW (A), Ey(e)(F6)YW (Б), Ey(e)(F3)RYW (В), Ey(e)(F4)RYW (Г) и их производных. Экспрессия гена white дикого типа обуславливает красную окраску глаз (КР); в отсутствие экспрессии гена white мухи имеют белые глаза (Б). Промежуточные уровни пигментации глаз, зависящие от уровня стимуляции гена white: ТК - темно-коричневый; К - коричневый; ТО - темно-оранжевый; ОР - оранжевый; ТЖ - темно-желтый; Ж - желтый; СЖ - светло-желтый; Б -белый. N - общее число проанализированных линий. Число линий, в которых наблюдалось изменение уровня пигментации при удалении исследуемого элемента (Д), к общему числу проанализированных линий (ЛО указано в виде дроби. В столбце PSS (pairing sensitive silencing) приведено отношение числа линий, в которых наблюдался эффект усиления репрессии гена white в гомозиготе по конструкции, к общему числу проанализированных линий (N). Надстрочной буквой «в» помечены тестируемые элементы, которые встроены в генетическую конструкцию в обратной относительно геномной ориентации. Серыми вертикальными прямоугольниками отмечены средние уровни пигментации глаз по общему количеству трансгенных линий с данной конструкцией.

тело

5 4 3 2 1

ЛЛ Ey(w)(Fab-6)RYW А lip Ey(w)(A)YW

Ey(w)(Fab-6)YW Б U-Sa Ey(w)(A)YW

Ey(w)(Fab-3)RYVV Ey(w)(A)YW Ey(w)(Fab-4)RYW Ey(w)(A)YW

7 7| 9 1 1 13 1 3 1

1 3 615

1

7 1 1 I

ГВ

815

yellow N

25

8/25

11

6/11

щетинки

5 4 3 2 1

1*3 l

!2l

1

15 15

13

N

25 4/25

11 2/11

11 1 1 15

Ч 1 1 15

If 2 1 13

111 1 1 1/13

Рисунок 4. Исследование фрагментов границ Fab-6, Fab-З и Fab-4 на способность блокировать взаимодействие между энхансерами и промотором гена yellow. Результаты анализа экспрессии гена yellow в линиях, трансгенных по конструкциям Ey(e)(F6)RYW (A), Ey(e)(F6)YW (Б), Ey(e)(F3)RYW (В), Ey(e)(F4)RYW (Г) и их производных. Пигментация тела, крыльев и щетинок, зависящая от уровня экспрессии гена yellow. 1 - отсутствие пигментации; 5 - уровень пигментации, соответствующий энхансер-зависимой экспрессии гена; 2-4 - промежуточные уровни. Цифры в строках - число линий с соответствующим уровнем пигментации. Остальные обозначения аналогичны введенным в подписи к рис. 3.

Однако это влияние было связано не с инсуляторной, а с репрессорной активностью Fab-6, так как в гомозиготных по конструкции линиях происходило усиление подавления гена white. В этих же линиях наблюдалось связанное с активностью F6 подавление экспрессии гена yellow в теле, и в 2 из 6 линий - в щетинках (рис. 4Б). В остальных 5 из 11 линий, как и в предыдущей конструкции, F6 не оказывал влияния на экспрессию yellow и white. Таким образом, содержащий сайты связывания dCTCF фрагмент Fab-6 размером 425 п.н. в модельной системе на основе генов yellow и white функционирует только как слабый сайленсер, активность которого зависит от положения в геноме.

Далее аналогичным образом были протестированы фрагменты границ Fab-З и Fab-4. Ни в одной из 15 полученных трансгенных линий, несущих конструкцию Ey(e)(F3)RYW, не наблюдалось какого-либо влияния F3 на экспрессию гена white (рис. ЗВ), и только в одной линии наблюдалось снижение экспрессии гена yellow в виде уменьшения пигментации брюшка (рис. 4В). Это можно объяснить локальными взаимодействиями F3 в конкретном месте генома, которые приводят к изоляции или подавлению энхансера тела.

В результате трансформации эмбрионов конструкцией Ey(e)(F4)RYW было получено 13 трансгенных линий. В трех из них в гомозиготном по конструкции состоянии наблюдалось характерное для Рс-зависимых сайленсеров усиление репрессии гена white (рис. ЗГ). Также только в 3 из 13 линий наблюдалось уменьшение пигментации брюшка, и в одной из этих трех -зависимое от F4 снижение окраски щетинок (рис. 4Г). Как и в случае с F6, это свидетельствует о способности элемента F4 функционировать как репрессор промотора. Наличие F4 в остальных 10

линиях не влияло на уровень экспрессии генов yellow и white. Таким образом, ни F3, ни F4 не проявляют энхансер-блокирующих свойств в модельной системе на основе генов yellow и white.

2) Fab-3, Fab-4 и Fab-6 способны поддерживать дистанционные взаимодействия

Ранее было показано, что мультиплицированные сайты связывания белка dCTCF способны поддерживать дистанционные взаимодействия, и их наличие является необходимым условием для взаимодействия между двумя копиями инсулятора Fab-8. Исходя из того, что фрагменты границ Fab-3 (F3), Fab-4 (F4) и Fab-6 (F6) содержат в своем составе сайты связывания dCTCF, мы протестировали эти фрагменты на способность к поддержанию дистанционных взаимодействий в модельной системе GALAIwhite. Эта модельная система основана на том, что дрожжевой белок-активатор GAL4 не способен активировать промотор гена white, если промотор и сайты связывания GAL4 разделены последовательностью гена yellow. Во всех описанных ниже генетических конструкциях, 10 сайтов связывания белка GAL4 были встроены в положение «-893» относительно точки старта транскрипции гена yellow (рис. 5А). Таким образом, расстояние между промотором гена white и сайтами связывания GAL4 составило почти 5 т.п.н. Для исследования возможности взаимодействия между двумя регуляторными элементами один из них был встроен вблизи сайтов связывания GAL4, второй - перед промотором гена white. При этом тестируемые элементы были окружены либо frt-сайтами узнавания рекомбиназы Flp, либо /ах-сайтами узнавания рекомбиназы Сге для возможности их удаления in vivo. Сравнение стимуляции транскрипции гена white в трансгенных линиях мух до и после удаления тестируемых элементов позволяло оценить их вклад в активацию GAL4 промотора white. Тестируемые элементы были встроены в противоположных по отношению друг к другу ориентациях, так как ранее было показано, что при таком расположении происходит более эффективная ОАЬ4-зависимая стимуляция промотора гена white (ориентационно-зависимое взаимодействие). Для экспрессии белка GAL4 мы использовали трансгенную линию мух, несущую в составе генома ген GAL4 под контролем тубулинового промотора, обеспечивающего постоянную и повсеместную экспрессию этого гена.

Для изучения возможности взаимодействия между двумя копиями границы Fab-3 была создана генетическая конструкция G4(F3)Y(F3R)W. Было получено 8 трансгенных линий, несущих единичную инсерцию конструкции. Во всех трансгенных линиях наблюдалась стимуляция гена white активатором GAL4 (рис. 5Б). При удалении каждой копии F3 из трансгенных линий in vivo GAL4 терял способность стимулировать экспрессию гена white. Таким образом, ОАЬ4-зависимая активация промотора гена white происходила благодаря взаимодействию двух копий элементов границы Fab-3.

-yellow

Б

п

jrt Jrt

white

3S5 KP TK К TO OP ТЖ Ж СЖ Б N

G4(F3)Y(F3R)W I | I 8

+ GAL4 1 2 14 1 8/8

- G4(&)Y(A)W 1 1 I 0/8

+ GAI.4 I 1 ] 0/8

в KP TK К TO OP ТЖ Ж СЖ Б N

rG4(F4)Y(F4K)W 3§2 5

GAL4 1 1 1 5/5

G4(4)Y(A)W 312 0/5

GAL4 312 0/5

KP TK К TO OP ТЖ Ж СЖ Б N

l

Г iSib

r-G4(F6)Y(F6R)W i 2

+ GAL4 1 | 1 2/2

LG4(A)Y(A)W I 2/2

+ GAL4 2 0/2

Рисунок 5. Тестирование элементов Fab-3, Fab-4 и Fab-6 на способность к дистанционным взаимодействиям в системе с использованием САЬ4-зависимой активации. Схема используемых генетических конструкций (А). Сайты связывания GAL4 (G4) находятся на расстоянии около 5 т.п.н. от промотора гена white. Результаты анализа экспрессии гена white в линиях, трансгенных по конструкциям G4(F3)Y(F3)RW (Б), G4(F4)Y(F4)RW (В), G4(F6)Y(F6)RW (Г) и их производных. В строке «+GAL» приведены данные, полученные при анализе фенотипа глаз трансгенных мух после индукции экспрессии GAL4. Обозначения аналогичны введенным в подписи к рис. 3.

Аналогичным образом была протестирована граница Fab-4. Было получено 5 трансгенных линий, содержащих генетическую конструкцию G4(F4)Y(F4R)W. Во всех линиях наблюдалась ОАЬ4-зависимая стимуляция гена white, обусловленная взаимодействием между элементами Fab-4 (рис. 5В).

Способность к поддержанию дистанционных взаимодействий была изучена также для границы F6. Как упоминалось выше, F6 содержит два сайта связывания dCTCF и обладает свойствами сайленсера. В результате две копии F6 в созданной конструкции G4(F6)Y(F6R)W настолько усиливали сайленсерную активность друг друга, что нам удалось отобрать только 2 трансгенных линии (рис. 5Г). В обеих линиях наблюдалась репрессия гена yellow (вариабельные щетинки, данные не приведены) и white (бледно-желтая окраска глаз). Удаление границы Fab-6 приводило к восстановлению экспрессии генов yellow (данные не приведены) и white. В обеих [рансгенных линиях (рис. 5Г) GAL4 стимулировал экспрессию гена white. Этот эффект исчезал при удалении F6 из трансгенных линий.

Таким образом, фрагменты границ Fab-3, Fab-4 и Fab-6, содержащие сайты связывания dCTCF, способны к поддержанию дистанционных взаимодействий и сближению активатора GAL4 и промотора гена white.

3) Способность границ Мер, Fab-6, PTS/F8 к дистанционным взаимодействиям не зависит от dCTCF

Ранее в нашей лаборатории было показано, что границы ВХ-С Мер и PTS/F8, содержащие сайты связывания dCTCF, способны взаимодействовать со своими копиями на расстоянии. Кроме этого, PTS/F8 поддерживает дистанционные взаимодействия с инсулятором Fab-7, не содержащим сайтов связывания dCTCF. Это наводит на мысль, что в поддержании взаимодействий между границами могут участвовать дополнительные белки.

С целью определения роли dCTCF в дистанционных взаимодействиях мы мутировали сайты связывания этого белка в Мер (Mm), Fab-6 (F6m) и PTS/F8 (PTS/F8ra). Эффективность мутации была подтверждена методом торможения ДНК-белковых комплексов в полиакриламидном геле (рис. 6). Для синтеза dCTCF была использована бесклеточная система трансляции на основе

PTSfF8__PTS/F6m

— + - - + -

_ + + _ + +

; м ; - » i- 4 t i »

j ' L j. i. ' v . I к ,

шШшшшш

Рисунок 6. Результаты метода торможения ДНК-белковых комплексов в геле. Сравнение результатов инкубации фрагментов границ (Мер, Fab-6 и PTS/F8) с интактными и мутированными сайтами связывания dCTCF. На дорожки нанесены (слева направо): 1) радиоактивно меченный фрагмент Мер, 2) радиоактивно меченный фрагмент Мер после инкубации с синтезированным in vitro белком dCTCF, 3) радиоактивно меченный фрагмент Мер после инкубации с лизатом ретикулоцитов кролика в отсутствии синтеза dCTCF. Для остальных фрагментов (Mcpm, Fab-6, Fab-6'", PTS/F8, PTS/F8"1) порядок нанесения образцов аналогичен. Полосы, помеченные стрелкой, соответствует ДНК-белковому комплексу, образующемуся при связывании dCTCF с интактными сайтами Мер, Fab-6 и PTS/F8. В случае с Мер™, Fab-6m, PTS/F8m такая полоса отсутствует.

Мутированные фрагменты границ были использованы для создания генетических конструкций: G4(Mm)Y(Mm)RW, G4(F6m)Y(F6m) RW, и G4(PTS/F8m)Y(PTS/F8m)RW. Неспособность dCTCF связываться с мутированными в тестируемых фрагментах сайтами была подтверждена методом иммунопреципитации хроматина (X-ChIP) куколок мух полученных трансгенных линий (рис. 7). Результат детектировался с помощью ПЦР в реальном времени. В качестве положительного контроля использовались геномные сайты связывания dCTCF на границах ВХ-С, в качестве отрицательного - кодирующая область гена Ribosomal protein L32 (rpl) и tubulin (tub).

лизата ретикулоцитов кролика.

dCTCF — + — — + — iysate — + + — + +

Fab-6 Fab-6m

+ — — + — + + — + +

Рисунок 7. Иммунопреципитация хроматина, выделенного из куколок трансгенных линий

D. melanogaster. Подтверждение того, что dCTCF не связывается с мутированными сайтами связывания в Мер™ (A), Fab-6m (Б), PTS/F81" (В). По оси X - анализ экспериментов X-ChIP на различных участках генома: tub и гр132 - кодирующая область генов tub и гр!32, соответственно; M_G, F6_G, F8_G - геномные инсуляторы Мер, Fab-6, Fab-8, соответственно; Mm_G, F6™_G, PTS/F8m_G - аналогичные фрагменты границ с мутированными сайтами из трансгенной конструкции. По оси Y - процент различных последовательностей, иммобилизованных на сефарозе, относительно Input. Показаны усредненные результаты трех экспериментов с учетом среднеквадратичных отклонений. Использованы антитела против С-концевого домена dCTCF.

Было получено 15 трансгенных линий с конструкцией G4(Mm)Y(Mm)RW. Во всех линиях фрагменты Мга обеспечивали ОАЬ4-зависимую стимуляцию промотора гена white (рис. 8А). Однако степень активации экспрессии гена была слабее по сравнению с тем, когда сайты связывания dCTCF были интактными. Таким образом, инактивация сайтов связывания dCTCF только частично влияет на способность инсулятора Мер к взаимодействию друг с другом. Это подтверждает, что в поддержание взаимодействия между двумя копиями границ Мер вовлечены дополнительные, пока не изученные, белки.

Аналогично, для изучения функциональной роли dCTCF в дистанционных взаимодействиях между двумя копиями границы Fab-б была получена генетическая конструкция G4(F6m)Y(F6m)RW. Во избежание сложности отбора трансформантов из-за репрессии маркерных генов вследствие возможной сайленсерной активности F6m, самцов F0, развившихся из трансформированных эмбрионов, скрещивали с самками y'w"18', tubulinGAL4/TM3, несущими ген GAL4 под тубулиновым промотором. Было получено 15 трансгенных линий, в большинстве из которых пигментация глаз мух соответствовала уровню экспрессии гена white ниже базального. Кроме того, во всех линиях наблюдалось усиление репрессии white в гомозиготных по конструкции линиях, что свидетельствует о наличии сайленсерных свойств у элемента F6m. Активация GAL4 приводила к стимуляции экспрессии гена white во всех протестированных трансгенных линиях (рис. 8Б). Таким образом, наличие dCTCF не является необходимым условием ни для сайленсерной активности Fab-б, ни для способности к взаимодействию между двумя копиями этой границы.

А (±> g4(mm)y(mmr)w + gal4

white

kp tk к to 01' тж ж сж б n/t

3 4 7

1 618 15 15/15

Б ry>i

g4(f6m)y(f6mr)w + gal4

кр тк к то op тж ж сж б т

2 2 14 6 15 4 7 2 2 15/15

15/15

В [одд рРО] g4(pts/f8mr)y(pts/f8m)w + gal4

кр тк к то ор тж ж сж б т

1 8| 4 13 i 4 17 1 13/13

Г

g4(pts/f8m)y(pts/f8ra)w + gal4

кр тк к то ор тж ж сж б т

2 4 1 7

7 7/7

2 21 3

Рисунок 8. Роль (1CTCF в поддержании дистанционных взаимодействий. Тестирование фрагментов границ Мер (А), Fab-б (Б), PTS/F8 (В-Г) с мутированными сайтами связывания dCTCF на способность к поддержанию дистанционных взаимодействий. Обозначения аналогичны введенным в подписи к рис. 3.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что при взаимодействии между двумя копиями элементов PTS/F8 друг с другом наблюдается ориентационная зависимость. То есть, высокий уровень активации гена white белком GAL4 наблюдается только тогда, когда элементы находятся в противоположных по отношению друг к другу ориентациях (G4(PTS/F8)Y(PTS/F8)RW). Было предположено, что такой эффект обеспечивается по меньшей мере двумя белками, связывающимися с последовательностью PTS/F8. Для выяснения роли dCTCF в обеспечении взаимодействий между копиями PTS/F8 были созданы две генетические конструкции. В конструкции G4(PTS/F8m)Y(PTS/F8m)RW копии PTS/F8m были встроены в противоположных по отношению друг к другу ориентациях, а в G4(PTS/F8m)Y(PTS/F8m)W копии элемента были сонаправлены (рис. 8В,Г). Было получено 13 и 7 трансгенных линий, соответственно. В обоих случаях во всех трансгенных линиях вне зависимости от ориентации тестируемых элементов наблюдалась ОАЬ4-зависимая стимуляции гена white. То есть, мутация сайтов связывания dCTCF не нарушила способность элементов PTS/F8 к взаимодействию друг с другом, но обусловила потерю влияния взаимной ориентации элементов на экспрессию white (рис. 8В,Г). Это свидетельствует о том, что dCTCF является только одним из белков обеспечивающих дистанционное взаимодействие между копиями PTS/F8.

4) Изучение роли dCTCF во взаимодействиях между предпромоториой областью гена Abd-B и границами PTS/Fab-8 и Fab-7

Сайт связывания dCTCF был найден перед промотором А гена Abd-B, транскрипция с которого определяет морфологические особенности сегментов брюшка дрозофилы. Ранее было

показано, что содержащий сайт связывания dCTCF участок предпромоторной области размером 375 п.н. (Actcf) способен к функциональному взаимодействию с границами PTS/F8 и Fab-7. Для изучения роли dCTCF в поддержании этих взаимодействий сайт связывания dCTCF в элементе Астст был мутирован (ACTCFm). Эффективность мутации была проверена с помощью метода торможения ДНК-белковых комплексов в геле. dCTCF связывался только с участком actcf содержащим интактные сайты связывания dCTCF. С мутированными сайтами АСТСТт белок dCTCF не связывался (рис. 9).

actcf actcfm

dCTCF + - ~ + ~

lysate — + + — + +

■ш

Рисунок 9. Результаты, полученные методом торможения ДНК-белковых комплексов в геле. На

дорожки нанесены (слева направо): 1) радиоактивно меченный фрагмент Асгс| , 2) радиоактивно меченный фрагмент АС|С| после инкубации с синтезированным in vitro белком dCTCF, 3) радиоактивно меченный фрагмент A CF после инкубации с лизатом ретикулоцитов кролика в отсутствии синтеза dCTCF. Для фрагмента ACICFm порядок нанесения образцов аналогичен. Полоса, помеченная стрелкой, соответствует ДНК-белковому комплексу, образующемуся при связывании dCTCF с интактными сайтами. В случае с детcFm связывания dCTCF мутированы) такая полоса отсутствует.

Были созданы генетические конструкции: G4(ACTCFm)Y(F7)RW и G4(ACTCFm)Y(PTS/F8)RW. В обеих конструкциях участок actcf предпромоторной области гена Abd-B с мутированным сайтом связывания dCTCF был встроен вблизи сайтов связывания GAL4. Инсуляторы Fab-7 и PTS/F8 были встроены вблизи промотора гена white (рис. 10Б,Г). Для сравнения результатов использовались созданные ранее аналогичные конструкции G4(ACTCF)Y(F7)RW и G4(Actcf)Y(PTS/F8)rW с не мутированным ACTCF.

При трансформации эмбрионов конструкцией

G4(ACTCFm)Y(F7R)W было получено 17 трансгенных линий, и в 13 из них наблюдалась ОАЬ4-зависимая стимуляция промотора гена white. Но при этом уровень стимуляции был слабее по сравнению с конструкцией G4(Actcf)Y(F7)rW (рис. 10А,Б). Таким образом, для функционального взаимодействия с Fab-7 сайт связывания dCTCF в actcf важен, хотя и не необходим.

д white

£> <ш kp тк к то op тж ж сж б nt

g4(actcf)y(f7r)w i 2 9 1 13

+ gal4 12 7 3 13/13

б & ш kp тк к то ор тж ж сж б т

g4(actcfm)y(f7r)w 2 12 3 17

+ gal4 1 5 6 4 1 13/17

15 i>i*i kp тк к то ор тж ж сж б nt

g4(actcf)y(pts/f8r)w i 1 13 2 7

+ gal4 12 1111 7/7

г £> kp тк к to ор тж ж сж б n/t

g4(actcfm)y(pts/f8r)w 3 if 7 23

+ gam 12 15 7 5 2 15/23

д kp тк к то ор тж ж сж б Ж

G4(ACTCP)Y(PTS/F8'№)VV.................... 1 1 ¡5 7

+ gal4 1 2 |2 2 7/7

Рисунок 10. Изучение взаимодействий между участком предпромоторной области гена Abil-B (ACTCF) и границами Fab-7 и PTS/F8. Сравнение взаимодействий между Fab-7 и A CF, содержащим интактные (А) и мутированные (Б) сайты связывания dCTCF. Сравнение взаимодействий между PTS/F8 и Ас1ср, содержащим интактные (В) и мутированные (Г) сайты связывания dCTCF. Взаимодействие между границей PTS/F8m с мутировг введенным в подписи к рис. 3.

границей PTS/F8m с мутированными сайтами связывания dCTCF и AcltF (Д). Обозначения аналогичны

Аналогично, было получено 23 трансгенные линии с конструкцией G4(ACTCFm)Y(PTS/F8)RW. Только в 15 линиях из 23 наблюдалась стимуляция промотора гена white активатором GAL4 (рис. ЮГ). Таким образом, как и в случае с Fab-7, мутация сайта связывания dCTCF в Астср привела к снижению уровня активации промотора white активатором GAL4 по сравнению с конструкцией G4(Actcf)Y(PTS/F8)rW, в которой GAL4 эффективно активировал white во всех линиях. Из полученных результатов следует, что сайты связывания dCTCF в АСТСР важны для взаимодействия не только с Fab-7, но также и с PTS/F8.

В отличие от описанного эксперимента, в котором был мутирован сайт связывания dCTCF в участке ACTCF, далее мы оценили влияние уровня экспрессии dCTCF на изучаемое взаимодействие. Для этого мы сравнили уровень ОАЬ4-зависимой стимуляции в трех трансгенных линиях, несущих конструкцию G4(Actcf)Y(F8/PTS)W на фоне сниженного за счет мутации уровня экспрессии dCTCF (линии СТСР'*'/ТМ6 и СТСЙ'*6/ТМб) и на фоне уровня экспрессии дикого типа. Мы обнаружили, что снижение экспрессии dCTCF не влияло на взаимодействие между границей PTS/F8 и ACTCF с интактными сайтами связывания dCTCF.

Для проверки связывания dCTCF с actcf в трансгенных мухах был использован метод иммунопреципитации хроматина (X-ChIP). Хроматин был выделен из куколок трансгенных линий мух и иммунопреципитирован с использованием антител против dCTCF. Результат детектировался с помощью ПЦР в реальном времени. В качестве положительного контроля были выбраны содержащие сайты связывания dCTCF геномный инсулятор Fab-8 и геномный элемент Астср. в

качестве отрицательного - кодирующая область гена Ribosomal protein L32 (rpl) и tubulin (tub). в результате анализа экспериментов по иммунопреципитации хроматина был выявлен высокий процент днк-поеледовательности геномного Fab-8 относительно input, что говорит об эффективном связывании белка dCTCF с этой областью. Уровень связывания dCTCF в предпромоторной области геномного actcf был существенно ниже. в то же время процент днк-последовательности участка АСТСР с интактными сайтами связывания dCTCF из генетической конструкции относительно Input был близким к нулю, то есть dCTCF не связывался с АСТС|Г в конструкции (рис. 11).

Рисунок 11, Иммунопреципнтация хроматина, выделенного из куколок трансгенных линий

D. melanogaster. По оси X - анализ экспериментов X-ChIP на кодирующей области гена tub и гр!32, геномном инсуляторе Fab-8 (F8_G), геномном участке асгст (a_G), участке астср из трансгенной конструкции (А_С). По оси Y - процент анализируемых последовательностей, иммобилизованных на сефарозе, относительно Input. Показаны усредненные результаты трех экспериментов с учетом среднеквадратичных отклонений. Использованы антитела против С-концевого домена dCTCF.

Наконец, мы протестировали влияние мутирования сайтов связывания dCTCF в составе границы PTS/F8 на взаимодействие с предпромоторной областью АСТСР. Была создана конструкция G4(ACTCF)Y(PTS/F8m)W с мутированными сайтами связывания dCTCF в PTS/F8 и получено 7 трансгенных линий. Оказалось, что мутированный PTS/F8m взаимодействует с участком АСТСР с той же эффективностью, что и граница PTS/F8 дикого типа (рис. 10В). Эти результаты указывают на то, что dCTCF не является необходимым для этого взаимодействия.

Таким образом, из полученных результатов можно сделать вывод о том, что с сайтом связывания dCTCF в предпромоторной области гена Abd-B может связываться неизвестный в настоящее время белок, который обеспечивает эффективные дистанционные взаимодействия между АСТСР и PTS/F8 или Fab-7.

5) Участок предпромогорной области гена Abtl-B селективно взаимодействует с границами своей рсгуляториой области

На способность к взаимодействию с actcf были протестированы другие границы вх-с, содержащие сайты связывания dCTCF: Fab-6, Fab-3, Fab-4 и Мер. Были созданы соответствующие генетические конструкции на основе GAL4/white модельной системы (рис. 12).

r ctcf r

В 23 из 25 полученных трансгенных линий, несущих конструкцию G4(F6) Y(A ) W, GAL4 стимулировал экспрессию гена white. Это свидетельствует о том, что Fab-б способен к функциональному взаимодействию с ACTCF (рис. 12А). Инактивация обоих сайтов связывания dCTCF в границе Fab-б (конструкция G4(F6m)RY(ACTCF)RW) не повлияла на ее способность к взаимодействию с Астст (рис. 12Б). Из этих результатов можно сделать вывод о том, что dCTCF, как и в случае с PTS/F8, не является необходимым для взаимодействий с предпромоторной областью гена Abd-B.

white

А IJiD Л КР к" Т0 0Р ТЖ Ж СЖ G Щ

G4(F6R)Y(ACTCFR)VV 2 5 f 11 25

+ GAL4 2 1 2 f И 3 23/25

Б Igaci) КР ТК* К ТО ОР ТЖ Ж СЖ Б N/T

G4(F6mR)Y(ACTCFR)W 4 8 2 10

+ G.AL4 1 1 3 § 2 2 10/10

в £> Йф КР ТК К ТО ОР ТЖ Ж СЖ Б ш

G4(ACTCF)Y(F3)W 2 S 2 9

+ GAL4 3 4 2 1/9

Г КР ТК К ТО ОР ТЖ Ж СЖ Б т

G4(ACTCTR)Y(F3)W 2 fifjlO 18

+ GAL4 4 f7 2/18

Д ей Л кр тк к то op тж ж сж б т

g4(f4)y{acrc«)w 1 3 | 4 17

+ oal4 i 5 i 4 2/17

Е g.%» £> КР.....те к......ТО ОР ТЖ Ж СЖ Б N/T

G4(M)Y(ACTCF)W 1 1 2 6

+ GAL4 I I 1 1/6

Ж С> £> КР ТК К ТО ОР ТЖ ж СЖ Б N/T

G4(ACTCr)Y(M)W 3 7§б 3 19

+ GAL4 3 if 7 1 3/19

3 Л Ef> КР ТК К ТО ОР ТЖ Ж СЖ Б N'T

G4(ACTC1-R)Y(M)W 2 6 f 4 19

+ GAL4 3 5 88 3 3/19

Рисунок 12. Изучение взаимодействий между участком Астср и элементам» границ ВХ-С, содержащими сайты связывания (1СТСК. Представлены результаты взаимодействий АС1С с элементами РаЬ-6 с интактными (А) и мутантными (Б) сайтами связывания йСТСР, РаЬ-З (В, С), РаЬ-4 (Д), Мер (Е-3). Обозначения аналогичны введенным в подписи к рис. 3.

Для тестирования границ Fab-З и Fab-4, разделяющих энхансеры регуляторной области гена abd-A, на взаимодействие с А были созданы генетические конструкции: G4(Actcf)Y(F3)W, G4(Actcf)rY(F3)W и G4(F4)Y(Actcf)rW. Однако GAU-зависимой стимуляции гена white в большинстве трансгенных линий не наблюдалось (рис. 12В,Г,Д).

Граница Мер находится между регуляторными областями генов abd-A и Abd-B. С целью изучения взаимодействий между actcf и Мер мы создали три конструкции с разными комбинациями ориентаций этих элементов: G4(M)Y(Actcf)W, G4(Actcf)Y(M)W,

f*Tf Р ft

G4(A ) Y(M)W. Ни в одном случае не наблюдалось заметной стимуляции гена white активатором GAL4 (рис. 12Е,Ж,3). Таким образом, граница Мер, разделяющая регуляторные области генов Abd-B и abd-A, не способна к взаимодействию с предпромотрной областью гена Abd-B.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Свойства новых границ Fab-3, Fab-4 и Fab-6

Все описанные инсуляторы дрозофилы состоят из компактно организованных сайтов связывания инсуляторных белков. Наличие сайтов связывания dCTCF в области границ регуляторных доменов позволило предположить существование новых инсуляторных элементов: Fab-З, Fab-4 и Fab-б. В настоящей работе показано, что изученные элементы не обладают способностью к блокированию энхансеров генов yellow и white. Это можно объяснить специфичностью действия инсуляторов на определенные энхансеры и на определенных стадиях развития. Например, ранее было показано, что аналогичный фрагмент инсулятора Fab-б блокирует энхансеры на эмбриональной стадии. Инсулятор Fab-8, так же как и Fab-б, содержит два сайта связывания белка dCTCF, но способен частично блокировать энхансер гена while на стадии куколки, причем белок dCTCF является ключевым для обеспечения этой функции. Таким образом, для блокирования энхансеров необходима комбинация dCTCF с другими, пока не идентифицированными, инсуляторными белками. Возможной причиной отсутствия инсуляции на стадии экспрессии генов yellow и white может являться либо отсутствие сайтов связывания этих белков в составе тестируемых элементов Fab-З, Fab-4 и Fab-б, либо отсутствие экспрессии генов, кодирующих эти белки.

Из литературных данных известно, что CTCF позвоночных нередко входит в состав репрессорных элементов. В результате тестирования фрагментов dCTCF-связывающих границ Fab-4 и Fab-б было показано, что они проявляют сайленсерные свойства. Мутирование сайтов связывания dCTCF в составе границ не повлияло на функциональную активность сайленсеров. Следовательно, dCTCF не является компонентом сайленсера Fab-4 и Fab-6.

Мы показали, что фрагменты границ Fab-3, Fab-4 и Fab-6 способны поддерживать дистанционные взаимодействия со своими копиями. Известно, что все изученные инсуляторы дрозофилы обладают этой способностью. Таким образом, полученный результат косвенно указывает на то, что изучаемые фрагменты границ могут содержать в своем составе инсуляторные элементы, которые не функционируют в используемой модельной системе. Кроме этого, способность Fab-3, Fab-4 и Fab-6 к поддержанию дистанционных взаимодействий говорит в пользу модели, согласно которой границы локуса ВХ-С играют важную роль в коммуникации и сближении регуляторных элементов.

Роль dCTCF в поддержании дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами в bit/югах-комплексе Drosophila meln/wgaster.

Как было показано ранее, четырех сайтов связывания белка dCTCF достаточно для поддержания дистанционных взаимодействий. Кроме этого, наличие интактных сайтов связывания dCTCF необходимо для взаимодействия между двумя копиями инсулятора Fab-8. Мы изучили роль dCTCF в поддержании дистанционных взаимодействий между различными регуляторными элементами bithorax-комплекса.

Сохранение способности границ Мер, Fab-6 и PTS/F8 к поддержанию дистанционных взаимодействий в отсутствие dCTCF говорит об участии дополнительных, пока не изученных, белков в этом процессе. Как было показано ранее, взаимная ориентация двух копий элементов Мер или PTS/F8 определяет возможность взаимодействия между ними. Была предложена модель, согласно которой, при расположении инсуляторов в противоположной по отношению друг к другу ориентации происходит формирование петли, конформация которой способствует сближению регуляторных элементов, находящихся за ее пределами (в данном случае, сайтов связывания активатора GAL4 и промотора гена white). Когда инсуляторы сонаправлены, формируется петля, конформация которой способствует изоляции ОАЬ4-связывающих сайтов и промотора гена white, что приводит к невозможности стимуляции транскрипции этого гена (рис. 13).

Рисунок. 13. Модель функционального взаимодействия между инсуляторами. Формирование петли, конформация которой способствует (слева) или препятствует (справа) сближению регуляторных элементов, находящихся за ее пределами. - сайты связывания дрожжевого активатора САЬ4.

Существует предположение о том, что такая зависимость от ориентации обеспечивается участием как минимум двух белков, связывающихся с инсуляторами, в этом процессе. Для границы PTS/F8 мы показали, что одним из белков, участвующих в поддержании дистанционных взаимодействий, является dCTCF, который обеспечивает ориентационную зависимость в этом случае.

Мы изучили способность участка предпромоторной области гена Abd-B, имеющего в составе сайт связывания dCTCF (ACTCF), к взаимодействию с границами ВХ-С и роль dCTCF в этих взаимодействиях. Ранее была показано, что Астср взаимодействует с границами Fab-7, которая не содержит сайтов связывания dCTCF, и PTS/F8. В настоящей работе продемонстрировано, что для границы PTS/F8 это взаимодействие сохраняется даже после мутирования сайтов связывания dCTCF в ее составе. Кроме этого, нами было показано, что с предпромоторной областью гена Abd-В может взаимодействовать граница Fab-6 и, также как и в случае с PTS/F8, мутация сайтов связывания dCTCF в ее составе не влияет на способность этих элементов к взаимодействию друг с другом. Таким образом, в поддержание взаимодействий между предпромоторной областью гена Abd-B и Fab-6, Fab-7 и PTS/F8 вовлечены пока не идентифицированные белки.

Примечательно, что в трансгенных конструкциях на стадии куколки белок dCTCF не связывался с Астср, несмотря на наличие сайтов связывания этого белка в данном участке. Однако при инактивации сайтов связывания в составе фрагмента Астст и тестировании его на взаимодействие с границами Fab-7 и PTS/F8 наблюдалось снижение уровня ОАЬ4-зависимой активации, что говорит о важной роли сайтов связывания dCTCF в АСТСР. В генетической конструкции интактный actcf не связывает dCTCF. Это говорит о связывании с сайтом dCTCF в предпромоторной области неизученных белков, которые обеспечивают функцию дистанционного взаимодействия. Этот вывод подтверждается тем, что сохранение сайтов связывания dCTCF в составе Астсг и мутирование их в составе PTS/F8 и Fab-6 не приводило к снижению эффективности дистанционных взаимодействий.

Селективность дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами в М/югах-комплексе

В результате тестирования границ ВХ-С на способность к взаимодействию с ACTCF была выявлена селективность взаимодействия предпромоторной области гена Abd-B с границами своей регуляторной области: Fab-6, Fab-7 и PTS/F8. Полученные результаты согласуются с моделью, предложенной в нашей лаборатории, согласно которой инсуляторы границ селективно взаимодействуют с предпромоторной областью соответствующего гена и, тем самым, способствуют коммуникации /дб-энхансера и промотора (рис. 14). Недавно было показано, что граница Fab-7 взаимодействует с областью, прилегающей к промотору Abd-B, in vivo. Граница Fab-7 способна к функциональному замещению границы Fab-8, что говорит о сходстве механизма функционирования границ. Эти данные согласуются с нашим наблюдением, что граница Fab-7 может взаимодействовать с фрагментом Астср.

Недавно был найден регуляторный элемент (РТЕ), состоящий из 255 п.н. и находящийся на расстоянии 40 п.н. от точки старта транскрипции гена АЬс1-В. Этот элемент находится между промотором гена АЬс1-В и участком Астср, изученным в настоящей работе, и способен к селективному привлечению /ай-энханеров к промотору гена АЬс1-В в трансгенных системах. Возможно, РТЕ увеличивает специфичность взаимодействий между /аб-энханерами и промотором генаЛМ-В.

Рисунок 14. Модель регуляции гена Abd-B на примере двух парасегментов. В парасегменте 11 (ПСИ) граница Fab-7 селективно взаимодействует с предпромоторной областью гена Abd-B, сближая энхансер iab-6 с промотором гена. В результате взаимодействия границ между собой происходит изоляция остальных /ai-доменов. Аналогично - для парасегмента 12 (ПС 12).

Таким образом, существует возможность, что границы и РТЕ координируют организацию взаимодействий между энхансерами и промоторами в ВХ-С. Необходим поиск и изучение новых белков, связывающихся с границами, для установления механизма промотор-энхансерной коммуникации в ВХ-С.

ВЫВОДЫ:

1. Впервые показано, что в модельной системе на основе генов yellow и white фрагменты границ Fab-3, Fab-4 и Fab-6, содержащие сайты связывания dCTCF, не проявляют свойств инсуляторов, a Fab-4 и Fab-б обладают свойствами сайленсеров.

2. Продемонстрировано, что фрагменты границ Fab-3, Fab-4 и Fab-6 способны поддерживать дистанционные взаимодействия.

3. Установлено, что способность границ Мер, Fab-6, PTS/F8 к дистанционным взаимодействиям не зависит от dCTCF.

4. Выявлена селективность взаимодействия предпромоторной области гена Abd-B с фрагментами границ своей регуляторной области

5. Показано, что dCTCF не участвует в селективных взаимодействиях предпромоторной области гена Abd-B с границами Fab-6, Fab-7 и PTS/F8.

6. Установлено, что в поддержание специфических взаимодействий между регуляторными элементами ВХ-С, помимо dCTCF, вовлечены пока не идентифицированные белки.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи в научных журналах:

1. Т.А. Ивлиева. П.Г. Георгиев, О.В. Кырчанова. Исследование способности новых границ в to/югах-комплексе Drosophila melanogaster блокировать взаимодействие между энхансерами и промоторами. Генетика. 2011, т. 47, № 9, с. 1-6.

2. Kyrchanova О., Ivlieva Т.. Toshchakov S., Parshikov A., and Georgiev P. Selective interactions of boundaries with upstream region of Abd-B promoter in Drosophila bithorax complex and role of dCTCF in this process. Nucleic Acid Research. 2010. Apr;39(8):3042-52.

Тезисы конференций:

1. О.В. Кырчанова, С.В. Тощаков, Т.А. Ивлиева. Выяснение роли dCTCF в установлении дистанционных взаимодействий между регуляторными доменами гена Abd-B у Drosophila melanogaster. V съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 21-28 июня,

2. О. Kyrchanova, A. Parshikov, S. Toshchakov, Т. Ivlieva, P. Georgiev. Role of dCTCF in Functional Interaction between the Boundaries and the Abd-B Promoter Region in the bithorax complex of Drosophila. EMBO Conference of Nuclear Structure & Dynamics. Isle la Sorgue, France, 30 September - 4 October, 2009.

3. Ивлиева Т. А.. Кырчанова О. В., Максименко О. Г., Пак Я. К. Структурно-функциональное исследование транскрипционного фактора dCTCF Drosophila melanogaster, Международный молодежный научный форум «ЛОМОНОСОВ-2010». Москва, 12-15 апреля, 2010.

4. О. Kyrchanova, Т. Ivlieva. Y. Рак, A. Parshikov, О. Maksimenko, P. Georgiev. Selective interactions of boundaries with upstream region of Abd-B promoter in Drosophila bithorax complex and role of dCTCF in this process, International Symposium "Control of gene expression and cancer". Moscow, 21-25 June, 2010.

5. Ивлиева Т.А. Кырчанова О.В, Георгиев П.Г.,. Исследование новых границ в bithorax-комплексе у Drosophila melanogaster на наличие энхансер-блокирующей способности. 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 18-22 апреля 2011.

6. Ивлиева Т.А. Бончук А.Н., Кырчанова О.В. Исследование функций доменов инсуляторного белка дрозофилы dCTCF. V Российский симпозиум «Белки и пептиды». Петрозаводск, 8-12 августа, 2011.

2009.

Заказ № 78-р Подписано в печать 18.10.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 mvw.cfr.ru; е-таП:т/о@с/г.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ивлиева, Татьяна Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Регуляция транскрипции в biihorax-KommQK.ce Drosophila melanogaster.

1.1.1. Структура ВХ-С.

1.1.2. Фазы регуляции ВХ-С.

1.1.3. Границы регуляторной области ВХ-С.

1.1.3.1. Fab-7.

1.1.3.2. Fab-8.

1.1.3.3. Мер.

1.1.3.4. Fab-6.

1.1.4. Дистанционные взаимодействия между регуляторными элементами ВХ-С.

1.1.4.1. Элемент PTS (Promotor Targeting Sequence).

1.1.4.2. Элемент PTE (Promoter Tetherig Element).

1.1.4.3. Коммуникаторная роль инсуляторов.

1.2. Белки, участвующие в поддержании дистанционных взаимодействий.

1.2.1. CTCF.

1.2.1.1. CTCF как транскрипционный фактор.

1.2.1.2. Инсуляторная роль CTCF.

1.2.1.3. CTCF и дистанционные взаимодействия.

1.2.2. Гомолог CTCF у дрозофилы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Генетические методы.

2.1.1. Линии Drosophila melanogaster.

2.1.2. Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий.

2.1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и white в трансгенных линиях.

2.1.4. Генетические скрещивания.

2.2. Биохимические методы.

2.2.1. Выделение ДНК из дрозофилы.

2.2.2. Саузерн-блот-анализ.

2.2.3. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.2.4. Молекулярное клонирование.

2.2.5. Трансформация бактериальных клеток плазмидами.

2.2.6. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса.

2.2.7. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

2.2.8. Создание конструкций.

2.2.9. Метод торможения ДНК-белковых комплексов в геле (EMSA).

2.2.10. Иммунопреципитация хроматина.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Исследование границ Fab-3, Fab-4 и Fab-6 на способность блокировать взаимодействие между энхансерами и промоторами.

3.2. Fab-3, Fab-4 и Fab-6 способны поддерживать дистанционные взаимодействия.

3.3. Способность границ Мер, Fab-6, PTS/F8 к дистанционным взаимодействиям не зависит от dCTCF.

3.4. Изучение роли dCTCF во взаимодействиях между предпромоторной областью remAbd-B и границами PTS/Fab-8 и Fab-7.

3.5. Участок предпромоторной области гена Abd-B селективно взаимодействует с границами своей регуляторной области.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Свойства новых границ Fab-3, Fab-4 и Fab-6.

4.2. Роль dCTCF в поддержании дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами в 6 zY/zorax-комплексе Drosophila melanogaster

4.3. Селективность дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами в bithorax-комплексе.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Определение роли dCTCF в организации дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами bithorax-комплекса Drosophila melanogaster"

Для обеспечения морфологического и функционального разнообразия клеток, формирующегося в ходе, развития многоклеточного организма, необходимы точные и высокоэффективные механизмы регуляции экспрессии генов. Геномы эукариотических организмов могут содержать десятки тысяч генов, для каждого из которых существует программа реализации генетической информации, характеризующаяся определенным временем, местом и уровнем экспрессии. Одним из важнейших механизмов, обеспечивающих правильную работу генов, является регуляция транскрипции. За счет взаимодействия белковых факторов с промоторами генов и другими г/мс-регуляторными элементами ДНК (энхансерами или сайленсерами) происходит активация или репрессия транскрипции, соответственно.

Считается, что скоординированная транскрипция обеспечивается, в частности, путем организации генов в независимые хроматиновые домены с определенными паттернами экспрессии (Dillon & Sabbattini, 2000, Spellman & Rubin, 2002). Существует предположение о том, что в этом процессе важную роль играют инсуляторы — z/wc-регуляторные элементы, которые обладают двумя основными свойствами: (1) они блокируют активирующее действие энхансера, если расположены между ним и промотором, а также (2) являются барьерами, предотвращающими распространение репрессионного хроматина (Cai & Levine, 1995, Gerasimova & Corees, 1996, Kuhn & Geyer, 2003). В последнее время появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что энхансеры и промоторы сближены в пространстве, а инсуляторы играют ключевую роль в обеспечении этих взаимодействий (Cleard et al., 2006).

Удобной моделью для изучения регуляции транскрипции является bithorax-комплекс (ВХ-С) Drosophila melanogaster. Гены ВХ-С: Ultrabithorax (Ubx), abdominal А (abd-A) и Abdominal В (.Abd-B), - отвечают за формирование части третьего грудного и всех брюшных сегментов. Эти гены регулируются тканеспецифичными энхансерами (abx/bx, bxd/pbx, iab-2 - iab-8), расположенными в порядке следования сегментов, которые они контролируют. Энхансеры отделены друг от друга регуляторными границами. В составе трех изученных ранее границ (Мер, Fab-7 и PTS/Fab-8) были найдены инсуляторы. Было показано, что инсуляторная активность границы PTS/Fab-8 зависит от наличия сайтов связывания белка dCTCF, который является гомологом инсуляторного белка позвоночных - CTCF (Moon et al., 2005). Недавно сайты связывания dCTCF были картированы между /об-доменами bithorax-комплекса (Holohan et al., 2007, Smith et al., 2009). Это позволило предположить существование новых инсуляторов в bithorax-комплексе (Fab-3, Fab-4 и Fab-6).

Для CTCF позвоночных была показана роль в установлении взаимодействий между удаленными участками генома (Kurukuti et al., 2006, Murrell et al., 2004, Splinter et al., 2006). Участие dCTCF в дистанционных взаимодействиях было продемонстрировано ранее в нашей лаборатории (Kyrchanova et al., 2008). Можно предположить, что dCTCF играет важную роль в установлении взаимодействий между регуляторными элементами в локусе ВХ-С. Исследование данного вопроса является важным для понимания механизмов регуляции транскрипции генов.

Целью работы стало определение роли dCTCF в функционировании границ локуса bithorax Drosophila melanogaster. Мы протестировали фрагменты границ

РаЬ-З, РаЬ-4 и РаЬ-6, содержащие сайты связывания <1СТСР, на способность к инсуляции. Кроме этого, мы изучили способность различных регуляторных элементов ВХ-С к поддержанию дистанционных взаимодействий и роль с1СТСР в этом процессе.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Ивлиева, Татьяна Александровна

выводы

1. Впервые показано, что в модельной системе на основе генов yellow и white фрагменты границ Fab-3, Fab-4 и Fab-6, содержащие сайты связывания dCTCF, не проявляют свойств инсуляторов, a Fab-4 и Fab-б обладают свойствами сайленсеров.

2. Продемонстрировано, что фрагменты границ Fab-3, Fab-4 и Fab-6 способны поддерживать дистанционные взаимодействия.

3. Установлено, что способность границ Мер, Fab-6, PTS/F8 к дистанционным взаимодействиям не зависит от dCTCF.

4. Выявлена селективность взаимодействия предпромоторной области гена Abd-B с фрагментами границ своей регуляторной области

5. Показано, что dCTCF не участвует в селективных взаимодействиях предпромоторной области тепа. Abd-B с границами Fab-6, Fab-7 и PTS/F8.

6. Установлено, что в поддержание специфических взаимодействий между регуляторными элементами ВХ-С, помимо dCTCF, вовлечены пока не идентифицированные белки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ивлиева, Татьяна Александровна, Москва

1. Akbari O.S., Bae Е., Johnsen Н., Villaluz A., Wong D. and Drewell R.A. A novel promoter-tethering element regulates enhancer-driven gene expression at the bithorax complex in the Drosophila embryo. Development. 2008. 135(1): 123-31.

2. Akbari O.S., Schiller B.J., Goetz S.E., Но M.C., Bae E. and Drewell R.A. The abdominal-B promoter tethering element mediates promoter-enhancer specificity at the Drosophila bithorax complex. Fly (Austin). 2007. 1(6): 337-9.

3. Bantignies F., Grimaud C., Lavrov S., Gabut M. and Cavalli G. Inheritance of Poly comb-dependent chromosomal interactions in Drosophila. Genes Dev. 2003. 17(19): 2406-20.

4. Barski A., Cuddapah S., Cui K., Roh T.Y., Schones D.E., Wang Z., Wei G., Chepelev I. and Zhao K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 2007. 129(4): 823-37.

5. Bartolomei M.S., Zemel S. and Tilghman S.M. Parental imprinting of the mouse HI9 gene. Nature. 1991.351(6322): 153-5.

6. Beachy P.A., Helfand S.L. and Hogness D.S. Segmental distribution of bithorax complex proteins during Drosophila development. Nature. 1985. 313(6003): 545-51.

7. Bell A.C., West A.G. and Felsenfeld G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell. 1999. 98(3): 387-96.

8. Bonchuk A., Denisov S., Georgiev P. and Maksimenko O. Drosophila BTB/POZ Domains of "ttk Group" Can Form Multimers and Selectively Interact with Each Other. J Mol Biol. 2011. 412(3): 423-36.

9. Boulet A.M., Lloyd A. and Sakonju S. Molecular definition of the morphogenetic and regulatory functions and the cis-regulatory elements of the Drosophila Abd-B homeotic gene. Development. 1991. 111(2): 393-405.

10. Busturia A., Lloyd A., Bejarano F., Zavortink M., Xin H. and Sakonju S. The MCP silencer of the Drosophila Abd-B gene requires both Pleiohomeotic and GAGA factor for the maintenance of repression. Development. 2001. 128(11): 2163-73.

11. Cai H. and Levine M. Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo. Nature. 1995. 376(6540): 533-6.

12. Cai H.N. and Shen P. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. Science. 2001. 291(5503): 493-5.

13. Capelson M. and Corces V.G. The ubiquitin ligase dTopors directs the nuclear organization of a chromatin insulator. Mol Cell. 2005. 20(1): 105-16.

14. Casanova J., Sánchez-Herrero E. and Morata G. Identification and characterization of a parasegment specific regulatory element of the abdominal-B gene of Drosophila. Cell. 1986. 47(4): 627-36.

15. Casares F., Bender W., Merriam J. and Sánchez-Herrero E. Interactions of Drosophila Ultrabithorax regulatory regions with native and foreign promoters. Genetics. 1997. 145(1): 123-37.

16. Celniker S.E., Sharma S., Keelan D.J. and Lewis E.B. The molecular genetics of the bithorax complex of Drosophila: cis-regulation in the Abdominal-B domain. EMBO J. 1990. 9(13): 4277-86.

17. Chen Q., Lin L., Smith S., Lin Q. and Zhou J. Multiple Promoter Targeting Sequences exist in Abdominal-B to regulate long-range gene activation. Dev Biol. 2005. 286(2): 629-36.

18. Cleard F., Moshkin Y., Karch F. and Maeda R.K. Probing long-distance regulatory interactions in the Drosophila melanogaster bithorax complex using Dam identification. Nat Genet. 2006. 38(8): 931-5.

19. Cuddapah S., Jothi R., Schones D.E., Roh T.Y., Cui K. and Zhao K. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome Res. 2009. 19(1): 24-32.

20. DeChiara T.M., Robertson E.J. and Efstratiadis A. Parental imprinting of the mouse insulin-like growth factor II gene. Cell. 1991. 64(4): 849-59.

21. Delorenzi M. and Bienz M. Expression of Abdominal-B homeoproteins in Drosophila embryos. Development. 1990. 108(2): 323-9.

22. Dillon N. and Sabbattini P. Functional gene expression domains: defining the functional unit of eukaryotic gene regulation. Bioessays. 2000. 22(7): 657-65.

23. Ebert A., Lein S., Schotta G. and Reuter G. Ilistone modification and the control of heterochromatic gene silencing in Drosophila. Chromosome Res. 2006.14(4): 377-92.

24. Estrada B., Casares F., Busturia A. and Sánchez-Herrero E. Genetic and molecular characterization of a novel iab-8 regulatory domain in the Abdominal-B gene of Drosophila melanogaster. Development. 2002. 129(22): 5195-204.

25. Farrell C.M., West A.G. and Felsenfeld G. Conserved CTCF insulator elements flank the mouse and human beta-globin loci. Mol Cell Biol. 2002. 22(11): 3820-31.

26. Fedoriw A.M., Stein P., Svoboda P., Schultz R.M. and Bartolomei M.S. Transgenic RNAi reveals essential function for CTCF in H19 gene imprinting. Science. 2004. 303(5655): 238-40.

27. Galloni M., Gyurkovics H., Schedl P. and Karch F. The bluetail transposon: evidence for independent cis-regulatory domains and domain boundaries in the bithorax complex. EMBO J. 1993.12(3): 1087-97.

28. Gerasimova T.I. and Corces V.G. Boundary and insulator elements in chromosomes. Curr Opin Genet Dev. 1996. 6(2): 185-92.

29. Gerasimova T.I., Lei E.P., Bushey A.M. and Corces V.G. Coordinated control of dCTCF and gypsy chromatin insulators in Drosophila. Mol Cell1. 2007. 28(5): 761-72.

30. Geyer P.K. and Corces V.G. DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev. 1992. 6(10): 1865-73.

31. Geyer P.K. and Corces V.G. Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster. Genes Dev. 1987.1(9): 996-1004.

32. Ghosh D., Gerasimova T.I. and Corces V.G. Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function. EMBO J. 2001. 20(10): 251827.

33. Golic K.G. and Lindquist S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 1989. 59(3): 499-509.

34. Grimaud C., Bantignies F., Pal-Bhadra M., Ghana P., Bhadra U. and Cavalli G. RNAi components are required for nuclear clustering of Polycomb group response elements. Cell. 2006. 124(5): 957-71.

35. Gyurkovics H., Gausz J., Kummer J. and Karch F. A new homeotic mutation in the Drosophila bithorax complex removes a boundary separating two domains of regulation. EMBO J. 1990. 9(8): 2579-85.

36. Hagstrom K., Muller M. and Schedl P. A Polycomb and GAGA dependent silencer adjoins the Fab-7 boundary in the Drosophila bithorax complex. Genetics. 1997. 146(4): 1365-80.

37. Hartenstein V. Atlas of Drosophila development // Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1993.

38. Hendrickson J.E. and Sakonju S. Cis and trans interactions between the iab regulatory regions and abdominal-A and abdominal-B in Drosophila melanogaster. Genetics. 1995. 139(2): 835-48.

39. Lamka M.L., Boulet A.M. and Sakonju S. Ectopic expression of UBX and ABD-B proteins during Drosophila embryogenesis: competition, not a functional hierarchy, explains phenotypic suppression. Development. 1992.116(4): 841-54.

40. Lei E.P. and Corces V.G. RNA interference machinery influences the nuclear organization of a chromatin insulator. Nat Genet. 2006. 38(8): 936-41.

41. Lewis E.B. A gene complex controlling segmentation in Drosophila. Nature. 1978. 276(5688): 565-70.

42. Lin Q., Chen Q., Lin L. and Zhou J. The Promoter Targeting Sequence mediates epigenetically heritable transcription memory. Genes Dev. 2004. 18(21): 2639-51.

43. Lin Q., Wu D. and Zhou J. The promoter targeting sequence facilitates and restricts a distant enhancer to a single promoter in the Drosophila embryo. Development. 2003. 130(3): 519-26.

44. Maeda R.K. and Karch F. Making connections: boundaries and insulators in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 2007. 17(5): 394-9.

45. Maeda R.K. and Karch F. The ABC of the BX-C: the bithorax complex explained. Development. 2006.133(8): 1413-22.

46. Maeda R.K. and Karch F. The bithorax complex of Drosophila an exceptional Hox cluster. Curr Top Dev Biol. 2009. 88: 1-33.

47. Mahmoudi T., Katsani K.R. and Verrijzer C.P. GAGA can mediate enhancer function in trans by linking two separate DNA molecules. EMBO J. 2002. 21(7): 1775-81.

48. Majumder P., Gomez J.A. and Boss J.M. The human major histocompatibility complex class II HLA-DRB1 and HLA-DQA1 genes are separated by a CTCF-binding enhancer-blocking element. J Biol Chem. 2006. 281(27): 18435-43.

49. Majumder P., Gomez J.A., Chadwick B.P. and Boss J.M. The insulator factor CTCF controls MHC class II gene expression and is required for the formation of long-distance chromatin interactions. J Exp Med. 2008. 205(4): 785-98.

50. McGinnis W. and Krumlauf R. Homeobox genes and axial patterning. Cell. 1992. 68(2): 283-302.

51. Melnikova L., Juge F., Gruzdeva N., Mazur A., Cavalli G. and Georgiev P. Interaction between the GAGA factor and Mod(mdg4) proteins promotes insulator bypass in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 2004. 101(41): 14806-11.

52. Mihaly J., Barges S., Sipos L., Maeda R., Cleard F., Hogga I., Bender W., Gyurkovics H. and Karch F. Dissecting the regulatory landscape of the Abd-B gene of the bithorax complex. Development. 2006. 133(15): 2983-93.

53. Mihaly J., Hogga I., Barges S., Galloni M., Mishra R.K., Hagstrom K., Muller M., Schedl P., Sipos L., Gausz J., Gyurkovics H. and Karch F. Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex. Cell Mol Life Sci. 1998. 54(1): 60-70.

54. Mihaly J., Hogga I., Gausz J., Gyurkovics H. and Karch F. In situ dissection of the Fab-7 region of the bithorax complex into a chromatin domain boundary and a Polycomb-response element. Development. 1997. 124(9): 1809-20.

55. Modolell J., Bender W. and Meselson M. Drosophila melanogaster mutations suppressible by the suppressor of Hairy-wing are insertions of a 7.3-kilobase mobile element Proc Natl Acad Sci U S A. 1983. 80(6): 1678-82.

56. Morata G., Macias A., Urquia N. and Gonzalez-Reyes A. Homoeotic genes. Semin Cell Biol. 1990. 1(3): 219-27.

57. Muller M., Hagstrom K., Gyurkovics H., Pirrotta V. and Schedl P. The mcp element from the Drosophila melanogaster bithorax complex mediates long-distance regulatory interactions. Genetics. 1999. 153(3): 1333-56.

58. Mullis K.B. and Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 1987. 155: 335-50.

59. Muravyova E., Golovnin A., Gracheva E., Parshikov A., Belenkaya T., Pirrotta V. and Georgiev P. Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. Science. 2001.291(5503): 495-8.

60. Murrell A., Heeson S. and Reik W. Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops. Nat Genet. 2004. 36(8): 889-93.

61. Ohlsson R., Renkawitz R. and Lobanenkov V. CTCF is a uniquely versatile transcription regulator linked to epigenetics and disease. Trends Genet. 2001. 17(9): 520-7.

62. Pai C.Y., Lei E.P., Ghosh D. and Corces V.G. The centrosomai protein CP190 is a component of the gypsy chromatin insulator. Mol Cell. 2004. 16(5): 737-48.

63. Palstra R.J., Tolhuis B., Splinter E., Nijmeijer R., Grosveld F. and de Laat W. The beta-globin nuclear compartment in development and erythroid differentiation. Nat Genet. 2003.35(2): 190-4.

64. Paro R. Imprinting a determined state into the chromatin of Drosophila. Trends Genet. 1990. 6(12): 416-21.

65. Perez-Lluch S., Cuartero S., Azorin F. and Espinas M.L. Characterization of new regulatory elements within the Drosophila bithorax complex. Nucleic Acids Res. 2008. 36(21): 6926-33.

66. Phillips J.E. and Corces V.G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 2009. 137(7): 1194-211.

67. Pirrotta V. PcG complexes and chromatin silencing. Curr Opin Genet Dev. 1997. 7(2): 249-58.

68. Pirrotta V. Vectors for P-mediated transformation in Drosophila. Biotechnology. 1988. 10: 437-56.

69. Pirrotta V., Steller H. and Bozzetti M.P. Multiple upstream regulatory elements control the expression of the Drosophila white gene. EMBO J. 1985. 4(13A): 3501-8.

70. Rodin S., Kyrchanova O., Pomerantseva E., Parshikov A. and Georgiev P. New properties ofDrosophila fab-7 insulator. Genetics. 2007.177(1): 113-21.

71. Rodin S.A. and Georgiev P.G. Study of the properties of the Fab-7 insulator in Drosophila melanogaster. Dokl Biochem Biophys. 2005. 404: 332-5.

72. Rubin G.M. and Spradling A.C. Genetic transformation ofDrosophila with transposable element vectors. Science. 1982. 218(4570): 348-53.

73. Saitoh N., Bell A.C., Recillas-Targa F., West A.G., Simpson ML, Pikaart M. and Felsenfeld G. Structural and functional conservation at the boundaries of the chicken beta-globin domain. EMBO J. 2000.19(10): 2315-22.

74. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual, Ed.2. // Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989.

75. Sánchez-Herrero E. Control of the expression of the bithorax complex genes abdominal-A and abdominal-B by cis-regulatory regions in Drosophila embryos. Development. 1991. 111(2): 437-49.

76. Schweinsberg S., Hagstrom K., Gohl D., Schedl P., Kumar R.P., Mishra R. and Karch F. The enhancer-blocking» activity of the Fab-7 boundary from the Drosophila bithorax complex requires GAGA-factor-binding sites. Genetics. 2004. 168(3): 1371-84.

77. Siegal M.L. and Hartl D.L. Application of Cre/loxP in Drosophila. Site-specific recombination and transgene coplacement. Methods Mol Biol. 2000. 136: 487-95.

78. Sipos L., Mihaly J., Karch F., Schedl P., Gausz J. and Gyurkovics H. Transvection in the Drosophila Abd-B domain: extensive upstream sequences are involved in anchoring distant cis-regulatory regions to the promoter. Genetics. 1998.149(2): 1031-50.

79. Spellman P.T. and Rubin G.M. Evidence for large domains of similarly expressed genes in the Drosophila genome. J Biol. 2002. 1(1): 5.

80. Splinter E., Heath H., Kooren J., Palstra R.J., Klous P., Grosveld F., Galjart N. and de Laat W. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the beta-globin locus. Genes Dev. 2006. 20(17): 2349-54.

81. Spradling A.C. and Rubin G.M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science. 1982. 218(4570): 341-7.

82. Valadez-Graham V., Razin S.V. and Recillas-Targa F. CTCF-dependent enhancer blockers at the upstream region of the chicken alpha-globin gene domain. Nucleic Acids Res. 2004. 32(4): 1354-62.

83. Vazquez J., Muller M., Pirrotta V. and Sedat J.W. The Mcp element mediates stable long-range chromosome-chromosome interactions in Drosophila. Mol Biol Cell. 2006. 17(5): 2158-65.

84. Vostrov A.A. and Quitschke W.W. The zinc finger protein CTCF binds to the APBbeta domain of the amyloid beta-protein precursor promoter. Evidence for a role in transcriptional activation. J Biol Chem. 1997. 272(52): 33353-9.

85. Yoon Y.S., Jeong S., Rong Q., Park K.Y., Chung J.H. and Pfeifer K. Analysis of the H19ICR insulator. Mol Cell Biol. 2007. 27(9): 3499-510.

86. Yusufzai T.M., Tagami H., Nakatani Y. and Felsenfeld G. CTCF tethers an insulator to subnuclear sites, suggesting shared insulator mechanisms across species. Mol Cell. 2004. 13(2): 291-8.

87. Zavortink M. and Sakonju S. The morphogenetic and regulatory functions of the Drosophila Abdominal-B gene are encoded in overlapping RNAs transcribed from separate promoters. Genes Dev. 1989. 3(12A): 1969-81.

88. Zhong X.P. and Krangel M.S. Enhancer-blocking activity within the DNase I hypersensitive site 2 to 6 region between the TCR alpha and Dadl genes. J Immunol. 1999. 163(1): 295-300.

89. Zhou J., Barolo S., Szymanski P. and Levine M. The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo. Genes Dev. 1996. 10(24): 3195-201.

90. Zhou J. and Levine M. A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embryo. Cell. 1999. 99(6): 567-75.