Исследование структуры и функции элемента Мср, участвующего в регуляции гена AВD-B у Drosophila melanogaster

Кырчанова, Ольга Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование структуры и функции элемента Мср, участвующего в регуляции гена AВD-B у Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование структуры и функции элемента Мср, участвующего в регуляции гена AВD-B у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 575.22:595.773.4.

Кырчанова Ольга Викторовна

Исследование структуры и функции элемепта Мср,

участвующего в регуляции гена АВО-В у ОКО$ОРШ1Л MELANOGASTER Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

003057736

Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Института биологии гена РАЯ

Научный руководитель:

академик РАН, доктор биологических наук, профессор Георгиев П.Г.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Глазков М.В.

кандидат биологических наук Тиллиб C.B.

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится 41 апреля 2007 года в 4 7 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу:

119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан

Gl.C'j,

2007 года. .

Ученый секретарь Диссертационного совета

канд. фарм. наук абовская Л.С.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Поддержание точной пространствшной и временной программы экспрессии генов высших эукариот, подразумевает наличие сложной и высокоэффективной системы их регуляции. Работу каждого гена определяют и контролируют специальные цис-регуляторные элементы, активирующгс транскрипцию (энхансеры) или репрессирующие ее (сайленсеры). Было показано, что преимущественным механизмом осуществления координированной регуляции транскрипции, является организация генов в независимые домены с одинаковыми паттернами экспрессии (Boutanaev et al. 2002, Spellman & Rubin 2002, Dilkm & Sabbattini 2000). Принято считать, что функцию разграничения соседних доменов, выполняют инсуляторы. Инсуляторы - это i/ыс-регуляторные элементы, которые способны функционально изолировать промотор от энхансера, если располагаются между ними, а также ограничивать распространение репрессии, то есть, защищать от эффекта положения (Caí & Levine, 1995; Gerasimova & Corees, 1996). Часто цг/с-регуляторная область и промотор rem находятся на расстоянии десятков тысяч пар нуклеотидов друг от друга, кроме того, между геном и его цис-регуляториой областью может располагаться ген с другой программой экспрессии, и гены могут перекрываться. Поэтому для правильного запуска работы гена важно, чтобы энхансер активировал только «свой» специфичный промотор. Однако механизмы, которые обеспечивают специфические взаимодействия между энхансерами и промоторами на больших дистанциях до сих пор неизвестны.

Одной из наиболге удобных моделей для изучения энхансер-промоторных взаимодействий и изучения роли инсуляторов в регуляции этих взаимодействий является гомеозисный ген Abdominal-B (Abd-B) Drosophila melanogaster, который отвечает за формирование с 10 по 14 брюшные парасегменты дрозофилы. Регуляторная область Abd-B гена простирается приблизителшо на 50 тпн и включает в себя четыре парасегмент-специфичные i/кс-регуляторные единицы: iab-5 (infraabdomnal-5), iab-6, iab-7 и iab-8, каждая из которых содержит, по меньшей мере, один энхансер и ответственна за формирование соответствующего ей парасегмента Молекулярно-генетический анализ выявил наличие границ между этими регуляторными единицами: Мер (Miscadestralpigmentation), Fab-7 (Frontabdomnal-1) и Fab-8. Было показано, что Fab-7 и Fab-8 являются инсуляторами (Karch et al., 1994; Hagstrorii et al., 1996). Кроме того, к каждой границе вплотную прилегает сайленсер, включающий сайты связывания белков группы Polycomb (Polycorrib Responsible Elements или PRE). Таким образом, каждый энхансер окружен инсуляторами и сайленсерами, но при этом способен активировать промотор Abd-B. Данная противоречивая ситуация наводит на мысль о сложной структуре граничных элементов и их особенной роли в обеспечении правильных энхансер-промоторных взаимодействий. Более пристальное изучение каждой границы по отдельности позволит понять роль этих элементов в

регуляции экспрессии Abd-B гена и предположить модель, объясняющую механизм коммуникации между энхансером и промотором, разделенных несколькими инсуляторами.

Цель и задачи исследования.

Основная цель работы состояла в изучении структуры и описании функций отдельных элементов регуляторной границы Мер Drosophila melanogaster.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать функциональную значимость составных частей Мер элемента Drosophila melanogaster.

2. Создать новую модельную систему для изучения способности регуляторных элементов взаимодействовать друг с другш на больших дистанциях.

3. Изучить возможность взаимодействия и его свойства между двумя Мер элементами, расположенными на больших дистанциях друг от друга.

Научная новизна и практическое значение работы.

В составе границы Мер был впервые выделен минимальный инсулятор размером 210 пн (Мер210) и продемонстрировано, что он отвечает за взаимодействие между двумя Мер элементами. Также впервые показано влияние прилегающих последовательностей на силу инсулятора, и функциональная взаимозависимость инсулятора и рядом расположенного сайленсера в составе Мер элемента.

Разработана новая модельная система для изучения взаимодействий элементов, расположенных на больших расстояниях друг от друга в трансгенных линиях Drosophila melanogaster. С помощью такой модельной системы было впервые показано, что функциональной взаимодействие между Мер инсуляторами определяется их взаимной ориентацией относительно друг друга. Полученные результаты позволят создать удобные генетические системы для дальнейших исследований механизмов регулирующих взаимодействие между энхансерами и промоторами на больших дистанциях.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на: XIX международном конгрессе генетиков "Genomes - the Linkage to Life", (Melbourne, 2003), конференции молодых ученых по молекулярной биологии и генетике (Киев, 2003), XIX всемирном конгрессе «Molecular & Cellular Proteomics» (Montreal, 2003), конференции «Advances in Molecular Cell Biology» (Moscow, 2004), а также на межлабораторном семинаре ИБГ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и б тезисов научных сообщений.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 97 страницах, включает 8 таблиц и 16 рисунков и состоит из ведения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 110 источников.

Результаты исследования

1 Граница Мер содержит ннсулятор :

Мутация Мер (Miscadestral pigmentation) (Lewis, 1978) была описана как gain-on-function мутация, которая трансформирует ПС9 (А4) в ПС10 (А5). Оказалось, что эта мутация соответствует делеции Мер', при которой была удалена граница между iab-4 и iab-5, размером 3,6 тпн (Karch et al., 1994). Мутанты, несущие другие делеции этой области (Мсрю7 и Мсрв"6), имели такой же фенотип (Karch et al., 1994) (рис. 1). Область перекрытия всех трех делеции содержит один четко выраженный гиперчувствительный к ДНК-азе1 сайт (HS) (рис. 1). Ранее было показано, что функция Мер границы зависит от области размером 822 пн (SalX-XbaX) (Busturia et al. 1997, Muller et al. 1999), в которую входит HS сайт а также 138 пн сайленсер, содержащий сайты для связывания GAGA фактора и PHO (Karch et al 1994, Busturia et al. 2001) (рис. 1). В нашей лаборатории для исследований использовался Pstl-Pstl фрагмент Мер размером 755 пн, входящий в состав Мер822 (Gruzdeva et al. 2005), и который, как было показана, обладает полярностью, то есть в зависимости от ориентации по отношению к промотору, он либо подавляет экспрессию гена, либо изолирует промотор от вышерасположенных энхансеров. Полярность Мер предполагает присутствие в его составе граничного элемента или инсулятора, который при определенном положении экранирует близлежащий промотор от входящего в состав Мер сайленсера.

Для того чтобы картировать инсулятор в составе Мер были созданы делеционные производные Мер элемента, которые встраивались между энхансерами и промотором гена yellow в положении -893 относительно начала транафипции (рис.1, таблица 1). Способность фрагментов Мер к инсуляции оценивалась по степени изоляции энхансеров тела и крыльев и отсутствию подавления энхансера щетинок, который расположен в интроне гена yellow. Различные элементы конструкций фланкировались frt или 1ох сайтами, что позволяло их вырезать с помощью Flp или Сге рекомбиназы соответственно.

В первую очередь, были протестированы фрагменты Мер, из одного из которых был делегирован сайленсер - Мер587, а из другого было удалено 247 пн из противоположной сайленсеру части (Мер®08) (рис. 1). В конструкции Ey(e)(MSOSR)YW Мер элемент был встроен в обратной ориентации и окружен lox-сайтами для рекомбиназы Сге, в то время как в конструкции Ey(e)M587YW Мер располагался в прямой ориентации для того, чтобы убедиться в отсутствии сайленсера и репрессионного действия на промотор гена yellow (таблица I а,б).

-f

_< .Iff,,""" y.

irnRI ftfl .Vii.'l K'igif1,1 M &<;K!

I -------+4j— «мНЧ- | - i

"--Л I

I t

Мер ■ ■ ■ —ШЕДШИ

Мер**-Мер1*6

.. j« Мер

Мер5"

Мер1*'

Мер*11

Мер15'5

Мер'"5

п*4Ш>

Рисунок 1. Схема регуиягорного элемента Мер. Показано расположение сайта гиперчувствительноети к ДНК-азе] (HS) в составе Мер (белый прямоугольник) по отношению к рестрнгстазан. Овалы показывают расположение сайтов связывания РНО, вертик&льхыс брусочки - GAGA, Выше приведена карта деяеций Мер (Kirch'et at., 1994), ниже - фрагментов. используемых в работе,

В 7 из 9 линий, полученных при трансформации конструкции Ey{e)M'°!KYW в эмбрионы линии yw, которые содержали одиночную и н серии ю, уровень пигментации щетинок ЙШ равен дикому типу, в то время как тело и крылья были желтыми. В двух линиях пигментация щетинок была слабо вариабельная, но деяеция Мер5"8* с помощью Сге рекомбиназы не оказала эффект на окраску щетинок, что говорит о не причастности Mcp50iR к репрессии щетинок в данных случаях. Сравнивая цвет глаз гетеро и гомозиготных мух в подученных трансгенных линиях в присутствии и при делении мы обнаружили, что репрессия, возникающая при спаривании PRE-

еодержащда еайленсерои (pairing-sensitive silencing - PSS) возникла только в одной линии. Таким образом, сайленсер в составе Мер30® не может эффективно репрессировать промо тор генов yellow и wfti/етак как противоположная часть М=9! содержит прелюлатаемый инсулятор.

Во всех линиях конструкции Ey(e)M5i?YW наблюдался уровень пигментации щетинок равный дикому типу, и при этом 11 из 12 линий имели светлую окраску кутикулы тела и крыльев, что говорит о достаточно эффективной изоляция энхансеров гена yellow от его промотора (таблица 1 б). Кроме того, присутствие двух копий элемента в гомозиготе приводило к потемнению глаз, что подтверждает отсутствие сайленсера в составе данного элемента. Следовательно, сайленсер не участвует в инсуляториой функции Мер.

Таблица 1. Результаты оценки инсуляторной фикции Мер элементов в системе гена yellow

Название Уровеньштаевтвгаи ..

ки^щиа t-хема конструкции _тела_ щетинок ||

_' ________5 4 3 2 1 5 в 1 4

. E^VW.y^^. .J,.

6 EyWM»'YW

. EyeiM^YW . .¿L . i 2 2

4,\T 7T П ' 6 2 -

(M-)EyeYW .

Г Д M II™ 5 4 1

Схемы конструкций: энхансеры изображены в виде овалов и обозначены соответственно: W- Энхансер крыльев, Е- глаз, В- тела, Ьг- щетинок; фрагменты Мер обозначены соответственно рис. 1. Тонкие стрелочки показывают сайты 1ох или frt. Уровень экспрессии гена yellow оценивался пигментации кутикумрных структур в гетерозиготных самцах по пятибалльной шкале: i - уровень дикого типа, в -вариабельнее количество окрашенных и неокрашенных щетинок, 1 - отсутствие пигмента. Цифры в таблице показывают количество линий, имеющих тот или иной фенотип.

В результате перекрытия фрагментов Мер™ в Мср!а', был вычислен инсушггор размером 340 пн (Mcpwo) (рис, 1). С целью проверки его свойств была создана конструкция Eyc(M!40}Y\V (таблица 1 в), В 7 из 8 трансгенных линий пигментация тела к крыльев была снижена. Кроме того, Мермо эффективно изолировал энхансер гена white, так как цвет глаз всех полученньк линий транссенных мук бьш на уровне базовой гранскршндш. В тоже время уровень пишевдадни щетинок во всех полученных трансгенных линиях был равен дикому типу, что свидетельствует об отсутствии сайденсера в составе Мер340. Вырезание Мсрмо фрагмента из трансгенов приводило к повышению уровня экспрессии генов yellow и while. Для подтверждения того, что Мер340 является инсулягором, необходимо было убедиться, что при расположении Мер"0 с другой стороны от эпхансеров, он не будет оказывать влияние на экспрессию маркерных генов, поэтому была создана конструкция (M?*°)EyeYW (таблица 1 г). Во всех 10 полученных трансгенных линиях Мср34Л не адзоыъая никакого влияния на уровень экспрессии yellow и white. Таким образом, можно сделать вывод, что Мер3'10 фрагмент проявляет инсуляторную активность, не оказывая подавляющего влияния на активность энхаисеров.

Далее, с целью более точного картирования инсулятора в составе Мер, мы поделили Мер310 на две перекрываемые части: проксимальную Мер151 и дистальную Мер210 (рис.1). С этой целью были проанализированы конструкции Eye(Mtili2)Y{A)W и Eye(M2,0*)Y(A)W (таблица 1 л, е). Выяснилось, что Мер310 проявляет слабые инсуляторные свойства Так 13 из 15 полученных

трал сгонных линий конструкции Eye(M2,0R)Y(A)W имели более светлую окраску тела по сравнению с контролем (те же линии, из которых элемент Мер210 удален по fit сайтам). Элемент М151 был дуплицирован для усиления предполагаемого инсулятора, но не оказал никакого влияния на экспрессию генов yellow и white, а значит, можно сделать вывод что он не обладает ни инсуляторной, ни сайленсерной активностью.

Как было показано ранее, для осуществления энхансер блокирующей функции инсуляторами Fab-7 и SF1 необходим GAGA фактор (Belozerov et al. 2003, Schwcinsberg et al. 2004). Для того чтобы проверить, какое значение GAGA фактор оказывает на функцию Мер, мы скомбинировали Мер340 инсулятор с частью PRE, содержащую GAGA сайты (рис. 1) и протестировали на системе гена yellow (таблица 1 ж, з). Во всех линиях конструкций Eye(M4l2)Y(A)W и Eye(M4UK)Y(A)W, мухи имели значительно более светлую окраску тела и крыльев по сравнению с производными этих линий без Мер412. Таким образом, степень изоляции энхансеров от промотора была выше и стабильнее по сравнению с Мер340 и не зависела от ориентации Мер412. Исходя из этого, можно сделать вывод, 4TOGAGA фактор улучшает работу инсулятора Мер и ориентация Мер412 не влияет на экспрессию yellow.

Анализируя все вышеизложенное, можно предположить, что найденный минимальный инсулятор Мер210 является, сердцевиной целого инсуляторного комплекса, а прилегающие последовательности, содержащие сайты связывания для различных белков, в том числе GAGA фактор делают этот ишуляторный комплекс более стабильным.

2 Элементы Мер, содержащие минимальный инсулятор в своем составе, способны к функциональному взаимодействию

Ранее в нашей лаборатории на модельной системе генов yellow и white было показано функциональное взаимодействие двух копий Мер755, с образование! двух независимых доменов (репрессированного и активированного). Мы решили проверить, будут ли различные фрагменты Мер способны к подобным взаимодействиям. Прежде всего, мы решили протестировать Мер412 элемент, который содержит GAGA сайты. Ранее было показано, что GAGA фактор способен сближать удаленные друг от друга участки ДНК (Mahmoudi et al., 2002). С этой целью два элемента Мер412 встраивались в различных ориентациях относительно промоторов и относительно друг друга. Одна копия Мер412 была вставлена в положение -893 относительно старта транскрипции гена yellow. Другая вставлялась либо пиже mini-white гена, либо между генами yellow и white в положении +4964, либо в положении -343 между энхансером и промотором гена yellow (таблица 2 а, б, в).

Таблица 2. Результаты выяснения способности Мер элементов функционально взаимодействовать друг с другом.

i»

г EyeíM^VwíM412) f Eye(M4,2R)YW(A) Eye(A)YU'(4)

yellow 5 4 3 2 1

whiter

lox ' Iqx

N/T инсуляция

L2 J9.JJ 22 сильная

15 10 6 11 17/22 средняя 114 б 21 22/22 -

Л12 412

гЕуе(М )Y(M )W

[¡Eye^'V^W

L Eye(A)Y(A)W

fit lox

yellow N/x инсуляция 5 4 3 2 1

11 сильная 8/11 средняя 11/11 -

ою

rEve(M4'2XM4'2R)YWrT 4 21 7 слабая

? Еуе(М4 l2)(A)YW II 4 21 6/7 средняя

t Eye(A)(A)YW 6/7 -

I white h

fit fit ¡OX lox

yellow NjT инфляция 5 4 3 2 1 _

rEye(M340R)Y(M340)W

г Eye(M340R)Y(A)W

Eye(A)Y(A)W

2 9 6! Передняя 17 8 21 9/17 средняя

EES 17/17 -

white 1-

fil fit lox lox

yellow m инсуляция 5 4 3 2 1 _

rEye^'^YO^'V 15 7 31 Передняя f Eye(M210R)Y(A)W 12 8 4 II 10/15 слабая I Eye(A)Y(A)W

111 3 11

15/15 -

Приведены схемы конструкций и результаты оценки экспрессии гена yellow по уровню пигментации кутикулярных структур в них (см. материалы и методы). Цифры в таблице показывают количество линий, имеющих тот или иной фенотип. Дробью указано количество линий изменивших фенотип в результате вырезания исследуемых элементов (в числителе) по отношению к общему количеству линий с одиночной инсерцией конструкции в геном.

Сравнивая yellow фенотип трансгешшх мух созданных конструкций и их производных с делегированным Мер412 элементом (таблица 1 ж, з), мы обнаружили, что вторая копия Мер412, расположенная ниже гена yellow, значительно усиливает инсуляцшо этого гена, а выше -нейтрализует действие первого (таблица 2 а, б,в).

Мер340, Мер210 и Мер151 также были протестированы аналогичным способом на способность к взаимодействию. Оказалось, что две копии Мер340 или Мер210 элемента лучше блокируют энхансеры гена yellow, чем соответственно одна копия (таблица 3 г, д). Предположительно, взаимодействие между этими элементами, окружающими ген yellow, приводит к более эффективной изоляции энхансеров, которые находятся вне петли формируемой

взаимодействующими инсуляторами.

Мер'51"2 не проявлял инсуляторной активности mi отдельно, ни, в паре с Мер412. Таким образом, можно сделать вывод, что элемент Мер151, не обладающий инсуляторной активностью, также не способен взаимодействовать со второй копией Мер на расстоянии.

Кроме того, анализируя полученные результата, можно сделать вывод что GAGA фактор, повышающий силу инсулятора Мер, не является определяющим фактором при взаимодействии удаленных друг от другаМср элементов.

3 Взаимная ориентация взаимодействующих Мер элементов определяет способность глазных энхансеров стимулировать ген white

Способность глазного энхансера стимулировать промотор white оценивалась по уровню пигментации глаз в трансгенных линиях в соответствии со следующей шкалой: белые (полная инакгивавдя гена white, далее в таблицах - б), светло-желтые (сж), желтые (ж), темно-желше (тж), оранжевые (ор), темно-оранжевые (то), коричневые (к), темно-коричневые (тк), красные (кр -уровень пигментации дикого типа). Сравнивая уровень пигментации глаз мух трансгенных линий Eye(M412)y(M412)W, и линий с конструкциями Ey(e)(M340R)Y(M340)W и Ey(e)(M210R)Y(M2K>)W, становится очевидно, что не всегда взаимодействующие Мер элементы способствуют эффективной стимуляции гена white (таблица 3 а). Такой неожиданный результат мы объяснили тем, что в конструкции Eye(M412)Y(M4,2)W оба Мер412 находились в одинаковой, «прямой», ориентации, а в конструкциях Ey(e)(M340R)Y(M340)W и Ey(e)(M210R)Y(M210)W, Мер элементы располагались во взаимно противоположных ориентациях. Возможно, взаимная ориентация элементов определяла взаимодействие глазного энхансера и промотора, либо white промотор репрессировался Мер412 элементом, содержащим часть PRE. Чтобы прояснить ситуацию, мы сделали дополнительные конструкции, в которых Мер412 был вставлен в положения -893 и +4964 в различных ориентациях: «обратная-прямая», «прямая-обратная» и «обратная-обратная» (таблица 3 б,в,г). Для оценки влияния энхансеров yellow и white на экспрессию соответствующих генов на фоне изучаемых элементов, мы использовали систему вырезания на основе ресгрикгазы I-Scel., (Rodin & Georgiev, 2005). Сравнивая окраску глаз у мух из полученных трансгенных линий на фоне удаленных энхансеров, мы обнаружили, что репрессия white наблюдается только в случаях, когда Мер412 находится в положении +4964 таким образом, что GAGA сайты располагаются вплотную к промотору white. Находясь в другой ориентации, Мер412 не влияет на экспрессию white, так как предполагаемый репрессор блокируется рядом расположенным инсулятором (рис. 11, таблица 4). Однако важно отметить, что независимо от ориентации Мер412 не подавляет экспрессию гена yellow в щетинках. Во всех полученных линиях конструкций (Eye)(M412R)Y(M412)W и (Eye)(M4l2)Y(M412R)\V, в которых Мер4'2 элементы находились в противоположной друг другу ориентации, в гетерозиготе глазной энхансер сильно активировал white промотор. Причем удаление обоих инсуляторов из конструкции приводило к заметному снижению экспрессии white. Таким образом, можно сделать вывод, что взаимодействие между двумя Мер412, встроенными в противоположной друг другу ориентации, улучшает коммуникацию между энхансером и промотором гена white через ген yellow (таблица 3 б,в). Однако в некоторых гомозиготных линиях конструкции (Eye)(M412R)Y(M412)W пигментация глаз снижалась - эффект pairing sensitive silencing (PSS) (Pirrotta, 1997; Kassis, 2002).

Таблица 3. Способность энхансера глаз стимулировать экспрессию white в зависимости от взаимной ориентации Мер элементов.

white

_____________ кр кк к т а ор тж ж сж б ут

ID 11

white ^

Eye(M,,;!)Y(.M4!2)W

Хр/р

Eyqfi)Y<ilW

Хр/р

~1 I 6 I I 9/1] Till

(ЕуеКм lYi M iw pi 6" г_ 3_ X P/P ГI ""

white )-*

I 1

if(Eye)(a)Y(A)w Хр

г/?

'mm Хр ff

4¿Xü)Y(i>Víf Хр /р

tXX2X<'._;_и

Г14 2 1 1 1

ггт

1 6 ~61 19/19

16/is

СП

[ГХЗ a AT 2 1

17/19 XI 16/16 «/16 15,'I6 16/16

X р.р

í<Eye)(¿)Y(A)W Хр/р

}'ÍAl(M<11)Y(M'":li)W

X р/р

WA)Y(A)\v

Хр/р

110 Í 11

ЕШ

11 2 4 5 4]

íi» 3 ZT]

СП

ХЗ

PS' m I i \

* * 1 I

_г '"УЙМ * )Y(M -*)W 1~2" i 2 ? j 1

2_0

*Eyu{i)Y(a)W

Xp/p

16 6/16 15/16 15/16 16/16 14/16 4/16 16/16

14 14/14 8/14 1 1/14

-M'

white r*

—-—i

Eyí{MJ40R)V(MMlk Xp/p

®v«(A)Y{A)W Xp/p

[3 2 5 Г]

tXP-i i— ц

KP KK К Т р Op тж ж сж б ГС/Т

4/17 16/17 15/17

гтн~г

ггп

f'i г г i

[■ (EyeKMJ,°)Y(MJ40)W 12 5 3 2

Хр/Р

£ye)(ü)Y<iW □

Хр/р

340.

П 3 2 I 5 4 Т' 4 4 1

ВИГ

lo/ta

6/17 13/13 16/17

Хр/Р

1 1 1—T" _4j 13/13

1 4 11 1 ! 2/1 í

1 1 1 6 5 1 13/13

кр кк к то ор ТЖ Ж СЖ В к/т

l;yc(i)Y(ü)W

Хр/р

white

ÍEye)(M )Y(M 1W 4

X р. р

'fEyt)(i)Y(i)W X p/p

Хр/р

4i)(A>Y(:«W

Xp¡p

6 1 1 15

12 7/1S

[z 6 í 7 1 12/15

GS 13/15

19 4 2 1 t 16

■4 t 7 2 2 1 16/16

■г 3 4 i X] 16/16

111 i 1 X] 10/16

1 Í'-'S 3 1 16/16

Г? l 3 <í 4 ) ] 11/16

1 3 0 4 i 3/16

1 ( i 3 5 A3 16ÍIÍ.

Это возможно связано с тем, что GAGA фактор привлекает какие-то компоненты репрессионного комплекса белков Pc-G (Poux et al 2000), либо область расположения GAGA сайтов содержит дополнительные сайты для связывания пока не идентифицированного репрессора.

Экспрессия white в трансгенных линиях с. конструкциями Eye(M412R)Y(M412R)W и Eye(M412)Y(M4l2)W, в которых Мер412 находился в одной ориентации, почти не отличалась или была чуть выше, чем в производных без инсуляторов (таблица 3 г). В конструкции EyeiM^YiM412 )W этот эффект можно было объяснить наличием репрессора в составе Мер412, развернутого на промотор гена white, действие которого усиливалось в гомозиготе. Это подтверждается тем, что удаление обоих инсуляторов приводило к потемнению окраски глаз. Однако в конструкции Eye(M412R)Y(M'"2R)W, несмотря на то, что оба Мер элемента развернуты инсулягором на промотор, трансгенные мухи также имели светлую окраску глаз, то есть активность энхансера была блокирована (рис. 11 A, D; таблица 4). Полученные результаты подтверждают наше предположение о том, что взаимная ориентация взаимодействующих Мер412 элементов играет значительную роль в установлении коммуникации между энхансером и промотором гена white, обеспечивая формирование петель, которые стерически либо изолируют энхансер от промотора, либо способствуют их стабильному взаимодействию.

Далее мы решили исследовать подобным образом влияние на экспрессию white взаимодействующих Мер340 либо Мер210 элементов. Также как и в предыдущем эксперименте, мы сделали конструкции, в которых элементы Мер340 и Мер210 были поставлены в ориентациях противоположных друг к другу (конструкции Eye(M34t>R)Y(M340)W и Eye(M2",R)Y(M2K))\V)) и в одинаковых по отношению друг к другу (конструкции (Eye)(M340)Y(M340)W и (Eye)(M110)Y(MÍI0)W) ориентациях (таблица 3 д-з). В последних двух конструкциях энхансеры были фланкированы l-Scel сайтами, с целью последующего их удаления. Сравнивая пигментацию глаз в производных трансгенных линиях без энхансеров можно сделать вывод что в отличие от Мер412, ни Мер340 ни Мер210 не оказывают влияния на экспрессию white (таблица 3). Эти данные подтверждают; что небольшой фрагмент PRE, содержащий GAGA сайты, присутствующий в элементе Мер412 функционирует как слабый репрессор по отношению к промотору white.

После того, как мы убедились в отсутствии репрессорных свойств у элементов Мер340 и Мер210, мы сравнили цвет глаз полученных трансгенов на фоне стимуляции энхансером white в присутствии и в отсутствии обоих исследуемых инсуляторов. Полученные результаты были аналогичны результатам по взаимодействию Мер412, то есть, в зависимости от ориентации элементов относительно друг друга, наблюдалась либо стабильно высокая стимуляция экспрессии white, либо промотор гена white стерически изолировался. Таким образом, Мер2'0 является минимальным элементом, способным осуществлять ориентационно-зависимое взаимодействие.

4 Стимуляция white промотора активатором GAL4 также зависит от взаимной ориентации взаимодействующих Мер элементов

Как было показано на дрожжах, уровень стимуляции GAL4 активатором снижается по мере удаления "GAL4 связывающих сайтов от промотора (De Bruin et al. 2001, Guarente et al. 1984, Struhl .et al. 1984). Для того чтобы проверить, действительно ли Мер сближает удаленные друг от друга регуляторные элементы, мы использовали новую модельную систему на основе дрожжевого GAL4 активатора и генов yellow и white. В положение -893 от точки начала транскрипции мы поставили десять GAL4 связывающих сайтов (G4). Таким образом, расстояние между G4 и промотором гена mini-white составило 5 тпн. Для того чтобы экспрессировать GAL4 белок, мы использовали трансгенную линию, несущую ген GAL4 под постоянно и повсеместно работающим ту булиновым промотором. '

Для начала, мы создали конструкцию G4(M412)YfM41 iR)W в которой Мер412 элемент был встроен в положение - 343 и +4964 от точки начала транскрипции yellow в ориентации «навстречу друг к другу» (рис.2 б, таблица 4а). Во всех полученных 17 трансгенных линиях GAL4 сильно стимулировал экспрессию white. Удаление одного или обоих М412 элементов приводило к потере способности GAL4 стимулировать экспрессию white во всех линиях, однако близлежащий промотор гена yellow (на расстоянии 893 пн) эффективш стимулировался (рис. 2 б, таблица 4а). Отсюда вытекает, что в модельной системе генов yellow и white у Drosophila, также как и в дрожжах, GAL4 является дистанционно зависимым активатором, то есть, работает, только на расстоянии не более 1 тпн, и не способен воздействовать на промотор гена, находящийся на расстоянии 5 тпн. Взаимодействующие Мер412 элементы располагают GAL4 активатор напротив промотора гена white, тем самым, опосредуя его активацию.

Мы решили подтвердить влияние взаимной ориентации Мер элементов на активацию гена white в новой модельной системе. С этой целью мы создали конструкцию G4(M412R)Y(M412R)W, в которой проксимальный Мер412,находящийся рядом с GAL4, был вставлен в той же ориентации, что и дистальный элемент. Только в 6 из 14 полученных трансгенных линий была заметна слабая активация гена white, и, так же как и в предыдущем случае, удаление одного или обоих элементов приводило к полной неспособности GAL4 активировать промотор white (рис. 2 в, таблица 46). Таким образом, ориентация взаимодействующих элементов относительно друг друга, также как и в случае с энхансерами, важна для стимулирования экспрессии гена с помощью GAL4. Исходя из этих результатов, мы предположили, что взаимодействующие Мер элементы в зависимости от своей ориентации могут образовывать петли двух форм (рис.2), которые стерически либо изолируют активатор от промотора white, либо располагают их напротив друг друга. Для подтверждения этого предположения мы поместили GAL4 внутри предполагаемой петли между Мер412 и промотором гена yellow, второй Мер412 элемент мы поставили между генами yellow и white в двух ориентадаях.

с:л1.4 активация white

Рисунок 2. Проверка способности взаимодействующих Мер элементов модулировать энханеер-промоторные отношения в системе с GAL4 активатором. Представлены схемы конструкция и результат после индукции экспрессии GAL4 активатора: (-) -отсутствие стимуляции гена white, {+") -эффективная стимуляция гена white.

Как и ожидалось, s случае расположения элементов в одной ориентации, стимуляция GAL4 при иод 5 ла к сильной активации промотора while (14 из 15 линий), тогда как при расположении Мер112 в ориентации «навстречу друг к другу» стимуляция GAL4 вызывала лишь незначительное увеличение пигментации глазу 4 линий на 19 (рис 2г, д; таблица4 в, г).

Мер мы исследовали на наличие тех же свойств, что и у Mcpil2 Результаты анализа конструкций G4(M210)Y(M210R)W и G4(M2!°)Y(M2I°)W (рис.2 е, ж) подтвердили, что взаимодействующие Мер210 элеме!гш, также способствуют GAJ.4 зависимой стимуляции white, если располагаются в противоположной друг другу ориентации, и изолируют промотор, если находятся н одной ориентации (таблица 4 д, е). Аналогично на способность к коммуникация был проверен элемент Мер151,. Ни в одной из шести полученных линий конструкции G4(Ml5l)Y(M!4,R)W при индукции GAL4 ген white не активировался, что гюягверждает неспособность к взаимодействию Мер15' элементов (рис. 12 з; таблша4 ж).

Таблица 4. Результаты, показывающие влияние взаимной ориентации взаимодействующих Мер элементов на коммуникацию между GAL4 и промотором гена white.

white

кр тк к то ор тж ж сж б N/T

a rG4(M412)Y(M4l2R)W 1 2 4 8 31 17

"*»+GAL4 13 5 6 3 t 17/17

t.G4(A)Y(A)W 1 1 6 3 1 10

X+GAL4 1 2 5 31 1/10

6 rG4(M412V(M4I2V 11 1 7 3 2\ 14

[X.+GAL4 1 1 4 5 1 21 6/14

l,G4(A)Y(A)W 1 1 6 3 1 | 10

"^+GAL4 1 1 6 3 H 0/10

412 412 в M G4Y(M )W i 9 io| 19

X+GAL4 СИ 4 4 3 2 11 16/19

412 4PR r M G4Y(M ^W I 1 3 9 5 il 19

X.+GAL4 11 1 3 9 4 11 4/19

д rG4(M2I0)Y(M2I0R)W 1 1 3 1 ll 6

"^+GAL4 rv i 1 6/6

LG4(A)Y(A)W 1 1 3 1 il 6

X.+GAL4 1 2 2 1 i| 1/6

e rG4(M210)Y(M2l0)W 1 2 3 1 1 6

1 +GAL4 1 г i 2 1 1 2/6

l,G4(A)Y(A)W ! 4" 2 1 6

"^+GAL4 0/6

ж rG4(M15')Y(M,5IR)W 1 4 1 11 6

X-+GAL4 1 i 3 1 ll 1/6

l,G4(A)Y(A)W i 4 1 11 6

"t+GAL4 1 i 3 1 il 1/6

5 Мер540 способен защицать промотор от репрессирующего действия PRE

Мы решили выяснить способность инсуляторов Мер540 и Мер210 блокироать распространению репрессии. С этой целью мы создали конструкции Ey(E)M340SY(Mcp)W и Ey(E)M210SY(Mcp)W, в которых Мер элементы соединялись с 138 пн сайленсером (S) и помещались в положение -893 от начала транскрипции yellow (рис. 1, таблица 5 а, б). В качестве второго фланкирующего yellow элемента был выбран Мер755, который содержит тот же сайленсер. Оба Мер элемента находились в ориентации, при которой сайленсеры были направлены на промотор гена yellow. Способность эффективно блокировать распространение репрессии мы оценивали по степени подавления окраски глаз в линиях, в которых сайленсеры функционировали полноценно, и ген yellow в щетинках был полностью зарепрессирован.

Во всех полученных 16 трансгенных линиях с конструкцией Ey(E)M340SY(Mcp)W пигментация глаз приближалхь к уровню дикого типа и усиливалась в гомозиготе. Делеция глазного энхансера в этих линиях приводила к значительному уменьшению окраски глаз. Полученные результаты показывают, что Мер340 элемент является эффективной границей, прегоггетвуюивй распространению PRE-опосредованшй репрессии, позволяя энхансеру глаз

активировать промотор гена white через зарепрессироанный ген yellow (таблица 5 а). Однако уровень окраски глаз полученных трансгенных линий конструкции Еу(Е)М1'osY(Mcp)W свидетельствовал о нестабильной активации промотора white его энхансером и, кроме того, в половине случаев в гомозиготе наблюдался PSS, то есть, white был сильно зарепрессирован {таблица 5 б). Таким офазом, слабый инсулятор Мер210, несмотря нато, что он способен разделять энхансер и промотор, находясь между ними, и осуществлять коммуникацию на расстоянии, не способен эффективно блокировать распространение репрессии.

Таблица 5, Схемы конструкций и полученные результаты, показывающие способность элементов Мер блокировать распространение PRE.

Название и схема Окраска глаз Всего sr¡.

__инструкции__кр тк к то ор тж ж сж 6 линий

---^-----

а • ш ятм^ ¿ ь

fit Jr; fox !'■'

1 r Ev(e)M'wsY(Mcp)W 3 6 й 1 16 0/16

г Z. Ey;A)MMSY(Mcp)w_12472 it/it o/ie

- - г--» M™* .......-

6 • ш. тял^т^ щ -

frl Ji t ÍOX tux

1 , E)(c)M2106 Y(Mcp) W 16 13 5 3 19 10/19

2 * Ey{ A)MaLt>ii Y(Mcp) W _13 3 12 19/ig 10/19

__ m1"11 i » m>sín

frt fit tax lox

i r Ej(e)M''tsY(Mcp)W ) 3 5 3 l 13 13/13

г Ey(¿)M'ilsY(Mcp)W___1116 4 10/13 13/13

5/T - количество линий, проявляющих PSS к общему числу

Таким образом, Мер151, не обладающий инсуляторнымн свойствами, каким-то образом у сшивает барьерную функцию элемента Мер210, поэтому мы решили проверить, обладает ли он барьерной функцией. Анализ трансгенных линий конструкции Ey(E)MlsiSY(Mcp)W показал, что окраска глаз мух исходных линий, была светлая, то есть, элемент Мер1'" не способен осуществлять коммуникацию со второй копией Мер к тем самым обеспечивать стабильную стимуляцию промотора while его энхансером (рис. 1, таблица 5в). Кроме того, репрессия, наблюдаемая в гомозиготе, была связана с функционированием PRE в составе Мер7", что подтеердшюсь его выреганкем. Таким образом, элемент Мер'51 «мосгоятелыю не обладает барьерной функцией, экранирующей от репрессии Mcp7!í (таблица 4 в), но в сочетании с минимальным инсулятором способен усиливать инсулятор ну to и барьерную функцию.

ТаблВда 0. Результаты, показывающие способность Mcp3J0 экранировать гены yellow и white от действия PRE(i/bi).

Уровень

Название и схема Окраска глаз 2 * пигментации в

конструкции __1 тела____£ |

_кртк к тоортж ж сж б_5 4 3 2.1

Ь |Ц mmв0" 5& '.....ь

fri fii lux tax

Ey(PRE)(Mlw)YEeW 10 10 I 1 5 2 I 10

E y( AX!«*) YEe W_10 0/10 1 4 4 1 4/10

Ey (PRE)(A)YEeW 2 2 1 3 2 8/10 !0 ' o''

С целью выяснять способен да Мер"40 элемент экранировать гены yellow и white от влияния другого более мощного репрессора, мы создали конструкцию Ey(PRE)(M в которой 1,5

тля PRE из гомеотического гена Ultrabithorax (Ubx), (Chan et al. 1994) был помещен между энхансераии yellow, а Мер"0 был вставлен в положение -893 между PRE и yellow промотором. Непосредственно перед геном white были вставлены два его энхансера. Так как активность PRE очень сильно зависит от эффекта положения, учитывались только те линии, в которых удаление PRE или Мерм° приводило к каким-либо фенотипичсским изменениям Анализ полученных фан стенных линий показал, что Mcpii0 эффективно, но не абсолютно, защищает гены yellow и while от репрессии (таблица 6).

Таблица 7. Результаты влияния различных элементов Мер в сочетании со 138 пн сайленсером на

экспрессию yellow в щетинках._________________

,, Уровень пигментации

Название и схема к всего

конструкции —-4'цет"НОК^-р линий

М*

Рф va'/i»; while

Eye(MS)YW 13 4 1 i 4 EyciA)YW_18 1 1-2

* ^

) yJUnt i

И II I IM

Еу(Е)МнйТ(А)\У 4 1 2_2 S_16

__; m11* -..........» ...............^-

• W Q ЯШ -

In fit hx

Ey(E)M"mY(A)W 3 I 2 I 12 19

Mlfls f >

• I ШШ^' ■

jn In to v

Ey(E)M'>lsY(A)W 10 2 I • - 13

6 Мер210 способствует рецессии, опосредованной прилегающим сайленсером

Ранее было показано, что 138 пн сайленсер Мер достаточен для подавления активности lac-Z в имагинальных дисках (Busturia et al. 2001). Мы решили проверить, способен ли данный сайленсер самостоятельйо вызывать репрессию в системе генов yellow и white. С этой целью 138 пн сайленсер Мер был вставлен в положение -893 перед промотором гена yellow (конструкция Eye(Ms)YW) (таблица 7а).

Способность элемента вызывать репрессию оценивалась по степени пигментации щетинок в присутствии элемента и после его вырезания. Из 22 полученных трансгенных линий в 9 окраска щетинок отличалась от дикого типа, однако, в 4 из этих 9 линий удаление Mcps не приводило к потемнению щетинок, что говорит о репрессии, не связанной с Мер. Таким образом, Mcps сам по себе не способен вызывать подавление экспрессии yellow в щетинках, то есть в данной модельной системе не функционирует как репрессор.

Тогда мы решили выяснить, будет ли иметь значение присоединение инсуляторов Мер340, Мер210, либо фрагмента Мер151 к 138 пн сайленсеру. С этой целью мы проанализировали фенотип производных линий конструкций Ey(E)M340SY(A)W, Ey(E)M2i03Y(A)W и Ey(E)M15lsY(A)W, из которых был удален Мер755. Оказалось, что в положен™ -893, Mcp340S репрессировал yellow в щетинках больше, чем в половине случаев, а Мер2105 - почти во всех (таблица 7 б, в). Элемент McpIsls, также как и изолированный 138 пн сайленсер, практически не подавлял экспрессию в щетинках. Исходя из вышеизложенных данных, вытекает, что для эффективной работы сайленсера необходим минимальный инсулятор (элемент Мер210).

Обсуждение результатов

1 Идентификация инсулятора в составе Мер

Мы идентифицировали в составе Мер инсулятор размером 210 пн, который эффективно блокирует энхансеры гена white, но слабо - энхансеры гена yellow (рис. 3). В настоящее время механизм инсуляции неизвестен, но очевидно, что прилежащие к минимальному 210 пн инсулягору последовательности способны повышать инсулягорную активность. Так Мер340 более эффективно блокирует взаимодействия энхансера и промотора гена yellow и более эффективно защищает промоторы от репрессирующего действия PRE. Наличие последовательности, содержащей GAGA фактор (элемент Мер412), делает этот инсуляторный комплекс еще более сильным. Ранее было показано, что GAGA фактор является необходимым компонентом ряда инсуляторов, в том числе Fab-7 (Belozerov et al. 2003, Schweinsberg et al. 2004). Известно, что GAGA фактор привлекает белковые комплексы, которые облегчают связывание других транскрипционных факторов с рядом расположенными регуляторными участками (Orlando et al.,

1998; Tsukiyama et al., 1994). Можно предположить, что GAGA фактор облегчает связывание белков с последовательностями инсулятора, а это приводит к увеличению инсуляторной активности.

2 Минимальный инсулятор Мер210 необходим для эффективного функционирования сайлепсера

Обращает на себя внимание факт, что PRE и последовательности, усиливающие репрессию, в отсутствии инсулятора теряют способность подавлять транскрипцию. Анализируя наши данные и данные, полученные ранее (Muller et al., 1999), можно сделать вывод, что для эффективного функционирования PRE, необходимо наличие инсулятора. Одним из объяснений этого факта является модель кооперативного связывания белков инсулятора и PRE: белки инсулятора способствуют формированию открытого хроматина на рядом расположенных последовательностях PRE, что повышает эффективность рекрутирования репрсссионных комплексов. Также возможно, это это связано со способностью инсулятора осуществлять трансвзаимодействия и подтягивать сайленсер в определенные зоны ядра, тем самым, стабилизируя репрессию.

3 Изолирующая и барьерная функция инсулятора Мез540 разделены

В некоторых случаях добавление к Мер210 (или к Мер340) 138 пн сайлепсера, одновременно с усилением способности PRE подавлять энхансер, расположенный ниже (со стороны сайленсера) ослабляло способность Мер инсулятора изолировать промотор от энхансеров, расположенных выше, т.е., наблюдалась восстановление активности энхансеров в стимуляции промоторов yellow и white. При этомэнхансеры, расположенные выше Мер инсулятора были экранированы от действия сайленсера. Это наводит на мысль, что функции инсуляции, то есть, изоляции энхансера от промотора, и барьерная функция, предотвращающая распространение репрессионных факторов, в составе инсулятора разделены. Аналогичным примером разделения активностей является 5'HS4 инсулятор, который находится на границе куриного ß-глобинового локуса В этом инсуляторе энхансер блокирующие функции связаны с сайтами связывания белка CTCF, тогда как барьерные зависят от остальной части 250 пн инсуляора, с которой связывается белок USF (West et al., 2002; Recillas-Targa et al., 2002). Предполагается, что USF привлекает белковые комплексы, которые создают на нуклеосомах код соотвегствущий активному хроматину. Можно предположить, что с элементом Мер210, барьерная функция которого, выражена слабо, связываются белки инсулятора, а с рядом расположенными последовательностями (Мер151) связываются белки, которые рекрутируют модифицирующие комплексы, о чем свидетельствует усиление барьерной функции Мер340 (рис.3). Таким образом, функционирование и барьерных белков, и сайленсера зависит от наличия инсулятора Мер210. Вероятно, рекрутирующиеся на PRE белки взаимодействуют с белками элемента Мер210, отвечающими за инсуляцию, и вследствие этого, нивелируется энхансер

блокирующая функция, ко при этом барьерная функция сохраняется. Таким образом, получается, что прилегающие последовательности модулируют инсуляторные функции Мер110, а элемент Мер'10 является основой для функционирования окружающие элементов (рис. 3)

барьерная функция сайленсер

| ;\минимальный / 1 " ' * инсулятор / Ц ТцГ'р{'1

1ршН

Мер210

GAGA РНО

последовательности......f

увеличивающие силу инсулятора

Рисунок 3. Карта функциональных элементов [раницы Мер.

4 Создание модельной системы с использованием дрожжевого GAL4 активатора для проверки способности ре гуля торны* элементов взаимодействовать на больших дистанций*

Как было показано, дрожжевые энханееры (UAS) менее гибки и расположены поблизости от регулируемых промоторов, в отличие от энхансеров высших эу кар йот, и не работают на расстоянии более 1200 пн от промотора (De Bruin ei al. 2001, Guarente et al. 1984, Strohl et aL 1984). Однако существует целый класс белков, облегчающих энхансер-промоторные взаимодействия, и наличие по соседству элементов, связывающих эти белки, способствует перемещению UAS в непосредственную близость к промотору, несмотря на большие расстояния (Petiaschek et al., 2005; Mahmoudi eta!., 2002; Su et al, 1991). Мы показали, что в DrosophilaGAL4 активатор не способен активировать промотор гена while, будучи отделен от него геном yellow, т.е. расположен на расстояние 5 тпн.

5 Две конин Мер нисулятора взаимодействуют в ориентаиионно-зависимой манере н эта способность зависит от инсулятора Мер110

Изучение Мер (MulSer et al, 1999, Vazquez et aL, 2006), Fab-7 (Bamignies et al, 2003), Fab-8 (Zhou et al,, 1999) показало, что все эти элементы, расположенные в трансгенах, способны приближаться к своим копиям, находящимся в геноме. Нами было обнаружено, что за подобные взаимодействия элемента Мер отвечает минимальный инсулятор Мер110, так как делеция именно этого элемента из состава Мер приводила к неспособности к функциональному взаимодействию двух Мер и активащи гена white.

Взаимодействующие Мер элементы способствуют сближению GAL4 и white, с выпетливанием участка ДНК. Неожиданно оказалось, что ориентация элементов относительно друг друга, имеет принципиальное значение для регуляции активности гена, так как в зависимости от образующейся формы петли, происходит либо активация, либо изоляция промотора white. То

есть, если Мер элементы находятся в противоположных ориентациях и при этом GAL4 активатор находится снаружи, либо Мер элементы находятся в одной ориентации, a GAL4 активатор располагается между ними (близко к проксимальному), то создается петля, стерически устанавливающая GAL4 активатор напротив промотора white (рис. 14 а). И наоборот, если Мер элементы находятся в одной ориентации и при этом GAL4 активатор находится снаружи, либо Мер элементы находятся в противоположных ориентациях, a GAL4 активатор располагается между ними, то создается петля, стерически изолирующая GAL4 активатор от промотора white (рис. 14 б). Такое ориентационно зависимое взаимодействие может быть объяснено связыванием, по меньшей мере, двух белков с последовательностью в составе Мер210.

Подобный результат был получен и на модельной системе глазной энхансер - white промотор, между которыми находится ген yellow. В данной модельной системе для активации гена white использовался энхансер, который имеет собственную систему обеспечения коммуникации с промотором, но взаимодействие Мер элементов корректирует энхансер-промоторные взаимоотношения, делая их либо более стабильными, либо изолируя энхансер от промотора, в зависимости от ориентации элементов Мер ш отношению друг к фугу.

4 J Модель рефляции Abi-B гена

Исходя из полученных нами результатов и данных литературы, становится очевидна

принципиально важная роль инсулягоров в составе границ, разделяющих iah домены, в регуляции

экспрессии Abd-B гена. Границы Мер, Fab-7 и Fab-8 содержат в своем составе инсуляторы

(Schweinsberg et al,. 2004; Barges et al., 2000; Zhou et al., 1999), которые способны осуществлять

транс-взаимодействия со своими копиями в геноме (Muller et al., 1999; Bantignies et al., 2003).

Можно предполэжить, что инсуляторы в составе этих границ способны взаимодействовать и друг

с другом, а прилегающий PRE/TRE контролирует эту способность, в зависимости от комплекса

белков, который связался с ним в конкретном парасегменте. В соответствии с этим нами была

предложена модель, согласно которой границы гена Abd-B физически взаимодействуют друг с

другом и с предпромоторной областью, в результате чего их инсуляторная активность

нейтрализуется, и iab энхансер, находящийся внутри активной петли, может свободно

активировать промотор Abd-B гена. Одновременно взаимодействие между соседними граничными

элементами может эффективно защипать iab энхансеры, изолируя их от окружающих

зарепрессированных элементов (рис. 4). Недавно с помощью Dam метилирования было показано,

что граница Fab-7 сближается с промотором Abd-Bm (Cleard et al., 2006). Интересно, что это

взаимодействие максимально эффективно в тканях, в которых Abd-B не экспрессируется, и

практически не детектируется в брюшке, где Abd-B активен. Опираясь на нашу гипотезу, эти

данные могут быть объяснены тем, что в тканях, где Abd-B не экспрессируется, все границы

взаимодействуют друг с другом и с предпромоторной областью (это отражается в формировании

четкого сигнала метилирования). Однако в брюшке в каждом сегменте с предпромоторной областью взаимодействует только определенная граница, и Fab-7 приближается к нромоторной области только в А6, поэтому сигнал метилирования размыт. К сожалению, а этом эксперименте не проверялось, приближается ли Fab-7 к другим границам в составе ВХ-С. Однако недавно нами были получены данные о том что, действительно границы Fab-7 и Fab-8 способны взаимодействовать друг с другом (не01губликованные данные).

Можно представить, что запуск работы Abd-Bm происходит следующим образом. Как известно, позиционный сигнал представляет собой набор активаторов и репрессоров в определенной точке эмбриона, в том числе белки, связывающиеся с последовательностями энхансеров в том или ином iah домене. Связавшись с энхансером, специфичный активатор предотвращает связывание репрессоров и рекрутирует белки группы тгх, которые, в свою очередь, активируют инсулятор в составе границ. Активированный инсулятор начинает взаимодействовать с преднромоторной областью, подтягивая энхансер к промотору Abd-Bm, и одновременно изолирует активный домен от расположенных ниже репрессированных доменов. В отсутствие специфического активатора, в область jab домена рекрутируются белки группы Ре, которые, связываясь с последовательностями PRE, переключ йот работу инсулягора на поддержание стабильной репрессии. При этом инсулятор теряет способность взаимодействовать с промоторной областью Abd-B гена, но сохраняет свою барьерную функцию, защищая активный iab домен.

ПС10

*се домены репрессировании

итчирошанный домен

Рисунок 4. Модель регуляции экспрессии Abd-Bm в различных парасешентах.

Выводы

1.В составе Мер идентифицирован минимальный 210 пн инсулятор. Показано, что последовательности окружающиг минимальный инсулятор усиливают его способность блокировать изолированные энхансеры.

2.Показано, что функциональное взаимодействие между двумя элементами Мер зависит от инсулятора Мер210. Впервые продемонстрировано, что взаимная ориентация взаимодействующих ипсуляторов определяет способность энхансера стимулировать промотор.

3.Продемонстрировано, что инсуляторные и барьерные функции 340 пн Мер элемента разделены.

4. Выявлена функциональная взаимозависимость инсулятора и сайленсера в составе Мер элемента

5.Разработана новая модельная система на основе GAL4 активатора, генов yellow и white, для изучения способности регуляторных элементов взаимодействовать друг с другом на больших дистанциях.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1.1 Gruzdeva N, Kvrchanova О, Parshikov A, Kullyev A, Georgiev P. The Мер element from the bithorax complex contains an insulator that is capable of pairwise interactions and can facilitate enhancer-promoter communication // Mol Cell Biol. 2005, V. 25. P. 3682-3689.

2.Kyrchanova O. Toshchakov S, Parshikov k, Georgiev P. Study of the functional interaction between Мер insulators from the Drosophila bithorax complex: effects of insulator pairing on the enhancer-promoter communication. // Mol Cell Biol. 2007, Feb 5; [Epub ahead of print]

3.N.M. Gruzdeva, A.P. Kullyev, O.V. Kvrchanova. P.G. Georgiev // Mechanisms of Long-Distance Enhancer-Promoter Interactions in the Abdominal-B Gene (3.E.0328), - Genetics, XIX international congress of genetics "Genomes - the Linkage to Life", Melbourne, 6-11 july 2003, p. 177.

4.N.M. Gruzdeva, A.P. Kullyev, O.V. Kvrchanova. P.G. Georgiev // The Interaction Between the Regulatory Elements May Facilitate Enhancer - Promoter Interaction in ihe Abdominal-B Gene, -Molecular & Cellular Proteomics, XIX World Congress, Montreal, September 2003, Vol. 2, No. 9, p.900.

5.N.M. Gruzdeva, A.P. Kullyev, O.V. Kvrchanova. P.G. Georgiev // The Interaction Between the Regulatory Elements Can Modulate Enhancer - Promoter Interaction in the Abdominal-B Gene, -Conference for young scientists on molecular biology and genetics, Kyiv, 25-27 September, 2003, p.65.

6.N.M. Gruzdeva, A.P. Kullyev, O.V. Kvrchanova. P.G. Georgiev //Мер element from the Abdominal-B gene can participate in long distance enhancer-promoter interactions, - Advances in Molecular Cell Biology, Moscow, 17-18 June; 2004, p.26.

7-Родин C.A., Кырчанова O.B.. Георгиев П.Г. // Изучение структуры регуляторного элемента Fab-7 и его роли в пространственной организации хроматина внутри ядра, - Ш съезд биофизиков России, Воронеж, 24-29 июня 2004, стр.164.

8.Родин С.А., Кырчанова О.В.. Георгиев П.Г. // Белки группы Polycomb влияют на инсуляторную функцию регуляторного элемента Fab-7. Тезисы стендовых сообщений 9-ой международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2005).

Принято к исполнению 05/03/2007 Исполнено 06/03/2007

Заказ № 160 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кырчанова, Ольга Викторовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Основные уис-регуляторные элементы.

1.2 Регуляция эмбрионального развития Drosophila melanogaster.

1.3 Bithorax комплекс. Фазы регуляции.

1.4 Регуляция Abdominal-B гена.

1.4.1 Fab-7.

1.4.2 Fab-8.

1.4.3 Мер.

1.5 Существующие модели регуляции Л гена.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Генетические методы.

2.1.1 Линии и мутации Drosophila melanogaster.

2.1.2 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий.

2.1.3 Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite в трансгенных линиях.

2.1.4 Генетические скрещивания.

2.2 Биохимические методы.

2.2.1 Выделение ДНК из дрозофилы.

2.2.2 Саузерн-блот-анализ.

2.2.3 Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.2.4 Секвенирование плазмид и ПЦР продуктов.

2.2.5. Молекулярное клонирование.

2.2.6 Трансформация бактериальных клеток плазмидами.

2.2.7 Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса.

2.2.8 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

2.2.9 Создание конструкций.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Мер755 содержит инсулятор.

3.2 Элементы Мер, содержащие минимальный инсулятор в своем составе, способны к функциональному взаимодействию.

3.2 Взаимная ориентация взаимодействующих Мер элементов определяет способность глазных энхансеров стимулировать ген white.

3.3 Стимуляция white промотора активатором GAL4 также зависит от взаимной ориентации взаимодействующих Мер элементов.

3.4 Мер340 способен защищать промотор от репрессирующего действия PRE.

3.5 Мер способствует репрессии, опосредованной прилегающим .сайленсером

4 ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Инсулятор размером 210 пн является функциональным центром Мер.

4.2 Создание модельной системы с использованием дрожжевого GAL4 активатора для проверки способности регуляторных элементов взаимодействовать на больших дистанциях.

4.3 Модель регуляции Abd-B гена.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование структуры и функции элемента Мср, участвующего в регуляции гена AВD-B у Drosophila melanogaster"

Многообразие генов высших эукариот, одни из которых должны работать в строго определенное время и только в определенных тканях, а другие наоборот, всюду и постоянно, подразумевает наличие сложной и высокоэффективной системы регуляции их экспрессии. Работу каждого гена определяют и контролируют специальные г/нс-регуляторные элементы, активирующие транскрипцию (энхансеры) или репрессирующие ее (сайленсеры). Организация и упаковка хроматина, формирование внутри ядра определенных хромосомных территорий и компартментов, содержащих регуляторные белковые комплексы, также оказывают влияние на транскрипционный статус гена. Было показано, что геном дрозофилы организован в домены одинаковыми паттернами экспрессии генов (Boutanaev et al. 2002, Spellman & Rubin 2002). Формирование независимых функциональных доменов, предполагает наличие специальных элементов, защищающих от позитивного или негативного влияния соседствующего хроматина и модулирующих энхансер-промоторные взаимоотношения. Принято считать, что функцию разграничения доменов выполняют специальные элементы, которые называются инсуляторами. Инсуляторы - это г/г/с-регуляторные элементы, которые способны функционально изолировать промотор от энхансера, если располагаются между ними, а также ограничивать распространение репрессии, то есть, защищать от эффекта положения (Cai & Levine, 1995; Gerasimova & Corces, 1996).

Обращает на себя внимание, что очень часто г/г/с-регуляторная область и промотор гена находятся на расстоянии десятков тысяч пар нуклеотидов друг от друга, кроме того, между геном и его г/морегуляторной областью может располагаться ген с другой программой экспрессии, и гены могут перекрываться.

Поэтому для правильного запуска работы гена важно, чтобы энхансер активировал только «свой» специфичный промотор. Современные экспериментальные данные подтверждают предположение, что между активаторными белками, собранными на энхансере, и преинициаторным комплексом на промоторе происходят прямые взаимодействия с выпетливанием участка ДНК, расположенного между ними (Fraser et al, 2005; Petraschek et al., 2005; de Laat & Grosveld, 2003). Однако механизмы, которые обеспечивают специфические взаимодействия между энхансерами и промоторами на больших дистанциях до сих пор неизвестны.

Одной из наиболее удобных моделей для изучения энхансер-промоторных взаимодействий и изучения роли инсуляторов в регуляции этих взаимодействий является гомеозисный ген Abdominal-B (Abd-B) Drosophila melanogaster, который отвечает за формирование с 10 по 14 брюшные парасегменты дрозофилы. Регуляторная область Abd-B гена простирается приблизительно на 50 тпн и включает в себя четыре парасегмент-специфичные г//;с-регуляторные единицы: iab-5 (infraabdominal-5), iab-6, iab-7 и iab-8, каждая из которых содержит, по меньшей мере, один энхансер и ответственна за формирование соответствующего ей парасегмента. При этом энхансеры располагаются на хромосоме в том же порядке, что и парасегменты. Молекулярно-генетический анализ выявил наличие границ между этими регуляторными единицами: Мер (Miscadestral pigmentation), Fab-7 (Frontabdominal-1) и Fab-8. Было показано, что Fab-7 и Fab-8 являются инсуляторами (Karch et al., 1994; Hagstrom et al., 1996). Кроме того, к каждой границе вплотную прилегает сайленсер, включающий сайты связывания белков группы Polycomb (Polycomb Responsible Elements или PRE). Получается, что каждый энхансер окружен инсуляторами и сайленсерами, но при этом способен активировать свой промотор в нужное время и в нужном месте. Данная противоречивая ситуация наводит на мысль о более сложной структуре граничных элементов и их особенной роли в обеспечении правильных энхансер-промоторных взаимодействий. Более пристальное изучение каждой границы по отдельности позволит понять роль этих элементов в регуляции экспрессии Abd-B гена и предположить модель, объясняющую механизм коммуникации между энхансером и промотором, разделенных несколькими инсуляторами.

Целью настоящей работы стало изучение регуляторной границы Мер, разделяющей iab-4 и iab-5 домены (Lewis, 1978; Karch et al., 1994). На основании литературных данных мы предположили структуру Мер, и, используя молекулярно-генетический анализ этого элемента, изучили функции отдельных его элементов.

Для изучения способности Мер элементов взаимодействовать друг с другом на больших дистанциях была разработана новая модельная система с использованием дрожжевого активатора GAL4 и генов yellow и white.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Основные чмс-регуляторные элементы

Каждый тип клеток сложного многоклеточного организма характеризуется собственной уникальной комбинацией белковых факторов, появление которых в ходе дифференцировки обеспечивается эффективной регуляцией активности кодирующих их генов.

Основой координированной функциональной регуляции экспрессии генов являются различные белковые факторы, которые связываются со специфическими последовательностями ДНК и оказывают влияние на сборку основного транскрипционного комплекса на промоторе. Регуляторные последовательности ДНК, находящиеся на одной хромосоме с геном, который они регулируют, называются //мс-регуляторными элементами. К ним относятся, например, энхансеры и сайленсеры, которые могут находиться как вблизи промотора (от 30 до нескольких сотен пар оснований перед точкой инициации), так и на очень больших расстояниях (иногда равных нескольким десяткам тысяч пар нуклеотидов) от регулируемых ими промоторов. Энхансеры - это последовательности ДНК, связывающие белковые факторы, способные активировать транскрипцию независимо от ориентации и расстояния до точки начала транскрипции, причем они могут быть как специфичными (что встречается редко), так и неспецифичными по отношению к определенным промоторам (Butler & Kadonaga 2001, Smale 2001). Другими г/ггс-регуляторными последовательностями являются сайленсеры, на которых происходит сборка белковых комплексов, подавляющих экспрессию генов. Условно можно выделить два основных класса сайленсеров. Первый - это гетерохроматин центромерной и теломерных областей, который может оказывать репрессирующее действие на экспрессию встроившихся в них трансгенов. Второй - это последовательности ДНК, на которых происходит сборка репрессионных комплексов, подавляющих экспрессию генов развития. К ним относятся так называемые элементы для сборки комплекса белков группы Polycomb (PRE- Polycomb Response Element). Данные белковые комплексы «выключают» ген, когда его функция уже не нужна, и поддерживают его в зарепрессированном состоянии на протяжении всей оставшейся жизни организма. Правильная организация работы этих классов регуляторных последовательностей, которые могут функционировать, находясь по соседству, обеспечивается образованием функциональных доменов, что подтверждается данными молекулярно-генетических исследований (Mihaly et al. 1998, Dillon & Sabbattini, 2000). Это предполагает наличие специальных границ, изолирующих соседние домены, находящиеся в функционально различных статусах. Эту роль играют инсуляторы, последовательности ДНК, которые связывают специальные белки, обладающие свойством блокировать функцию энхансера, если располагается между ними, а также ограничивать распространение репрессии, то есть, защищать от эффекта положения. (Sun & Elgin, 1999, Kuhn & Geyer, 2003, Cai & Levine, 1995).

Однако существуют границы, работающие в рамках одного генного локуса для разделения программ регуляции на разных этапах развития или в разных типах тканей. Примером могут служить границы в bithorax комплексе Drosophila melanogaster, которые изолируют несколько z/мс-регуляторных доменов. Эти границы также имеют в своем составе инсуляторы, но исходя из определения инсулятора, ясно, что подобные границы являются сложноустроенными, так как в ряде случаев энхансер должен активировать промотор, который отделен от него одним или несколькими инсуляторами. Таким образом, выяснение функционального устройства границ и способа их работы поможет понять механизм регуляции экспрессии генов.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Кырчанова, Ольга Викторовна

выводы

1. В составе Мер идентифицирован минимальный 210 пн инсулятор. Показано, что последовательности окружающие минимальный инсулятор усиливают его способность блокировать изолированные энхансеры.

2. Показано, что функциональное взаимодействие между двумя элементами Мер зависит от инсулятора Мер210. Впервые продемонстрировано, что взаимная ориентация взаимодействующих инсуляторов определяет способность энхансера стимулировать промотор.

3. Продемонстрировано, что инсуляторные и барьерные функции 340 пн Мер элемента

разделены.

4. Выявлена функциональная взаимозависимость инсулятора и сайленсера в составе Мер элемента

5. Разработана новая модельная система на основе GAL4 активатора, генов yellow и white, для изучения способности регуляторных элементов взаимодействовать друг с другом на больших дистанциях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кырчанова, Ольга Викторовна, Москва

1. Adkins N.L., Hagerman Т.A., Georgel P. GAGA protein: a multi-facetedtranscription factor. Biochem // Cell Biol. 2006 V.84. P.559-567.

2. Badenhorst P., Voas M., Rebay I., Wu C. Biological functions of the ISWIchromatin remodeling complex NURF. // Genes Dev. 2002. V.16. P.3186-3198.

3. Bantignies F., Goodman R.H., Smolik S.M. Functional interaction between thecoactivator Drosophila CREB-binding protein and ASH1, a member of the trithorax group of chromatin modifiers I I Mol Cell Biol. 2000. V.20. P.9317-9330.

4. Bantignies F., Grimaud C., Lavrov S. et al. Inheritance of Polycomb-dependentchromosomal interactions in Drosophila II Genes Dev. 2003. V. 17. P.2406-2420.

5. Barges, S., Mihaly J., Galloni M., Hagstrom K., Muller M., Shanower G., Schedl

6. P., Gyurkovics H., and F. Karch. The Fab-8 boundary defines the distal limit of the bithorax complex iab-1 domain and insulates iab-7 from initiation elements and a PRE in the adjacent iab-8 domain // Development. 2000. V. 127. P.779-790.

7. Belozerov V.E., P. Majumder, P. Shen, and H. N. Cai. A novel boundary elementmay facilitate independent gene regulation in the Antennapedia complex of Drosophila. IIEMBO J. 2003. V.22. P.3113-3121.

8. Blastyak A., Mishra R.K., Karch F., Gyurkovics H. Efficient and specific targetingof Polycomb group proteins requires cooperative interaction between Grainyhead and Pleiohomeotic. // Mol Cell Biol. 2006. V.26. P. 1434-1444.

9. Boivin A., Dura J.-M. In Vivo Chromatin Accessibility Correlates With Gene

10. Silencing in Drosophila. II Genetics. 1998. V.150. P. 1539-1549.

11. Boulet, A. M., A. Lloyd, and S. Sakonju. Molecular definition of the morphogeneticand regulatory functions and the m-regulatory elements of the Drosophila Abd-B homeotic gene//Development. 1991. V.lll. P.393-405.

12. Brown L.J., Fritsch C., Mueller J., Kassis J.A. The Drosophila pho-like geneencodes a YYl-related DNA binding protein that is redundant with pleiohomeoticin in homeotic gene silencing // Development. 2003. V. 130. P. 285294.

13. Busturia A, Bienz M. Silencers in Abdominal-B, a homeotic Drosophila gene. //

14. EMBO J. 1993 V.12. P.1415-1425.

15. Busturia A, Vernos I, Macias A, Casanova J, Morata G. Different forms of

16. Ultrabithorax proteins generated by alternative splicing are functionally equivalent // EMBO J. 1990 V.9. P.3551-3555.

17. Busturia, A., A. Lloyd, F. Bejarano, M. Zavortink, H. Xin, and S. Sakonju. The

18. MCP silencer of the Drosophila Abd-B gene requires both Pleoihomeotic and GAGA factor for the maintenance of repression // Development. 2001. V.128. P.2163-2173.

19. Busturia, A., C. D. Wightman, and S. Sakonju. A silencer is required formaintenance of transcriptional repression throughout Drosophila development // Development. 1997. V.124. P.4343-4350.

20. Butler J.E., Kadonaga J.T. Enhancer-promoter specificity mediated by DPE or

21. TATA core promoter motifs // Genes Dev. 2001. V.15. P.2515-2519.

22. Cai H., Levine M. Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators inthe Drosophila embryo //Nature. 1995. V.376. P. 533-536.

23. Cao R., Wang L., Wang H., Xia L., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Jones R.S.,

24. Zhang Y. Role of histone H3 lysine 27 methylation in Polycomb-group silencing.// Science. 2002. V.298. P. 1039-1043.

25. Casanova J., Sanchez-Herrero E., Morata G. Identification and characterization of aparasegment specific regulatory element of the Abdominal-B gene of Drosophila. II Cell. 1986. V.47. P.627-636.

26. Casares F, Bender W, Merriam J, Sanchez-Herrero E. Interactions of Drosophila

27. Ultrabithorax regulatory regions with native and foreign promoters. // Genetics. 1997 V.145. P. 123-137.

28. Cavalli G., Paro R. Chromo-domain proteins: linking chromatin structure toepigenetic regulation. // Curr Opin Cell Biol. 1998. V.10. P.354-360.

29. Celniker S.E., Sharma S., Keelan D.J., Lewis E.B. 1990. The molecular genetics ofthe bithorax complex of Drosophila: ш-regulation in the Abdominal-B domain // EMBO J. V.9. P.4277-4286.

30. Chen, Q., L. Lin, S. Smith, Q. Lin, and J. Zhou. 2005. Multiple promoter targetingsequences exist in Abdominal-B to regulate long-range gene activation 11 Dev. Biol. V.286. P.629-636.

31. Cleard, F., Moshkin Y., Karch F., Maeda R.K. Probing long-distance regulatoryinteractions in the Drosophila melanogaster bithorax complex using Dam identification//Nat. Genet. 2006. V.38. P.931-935.

32. Delorenzi M., Bienz M. Expression of Abdominal-B homeoproteins in Drosophilaembryos//Development. 1990. V.108. P.323-329.

33. Dillon N., Sabbattini P. Functional gene expression domains: defining the functionalunit of eukaryotic gene regulation // BioEssays. 2000. V.22. P.657-665.

34. Estrada B. and Sanchez-Herrero E. The Hox gene Abdominal-B antagonizesappendage development in the genital disc of Drosophila II Development. 2001. V. 128, 331-339.

35. Farkas G., Gausz J., Galloni M., Reuter G., Gyurkovics H., Karch F. The

36. Trithorax-like gene encodes the Drosophila GAGA factor. // Nature. 1994. V.371. P.806-808.

37. Fitzgerald D.P., Bender W. Polycomb Group Repression Reduces DNA

38. Accessibility. //Mol Cell Biol. 2001. V.21. P.6585-6597.

39. Francis N.J., Saurin A. J., Shao Z., Kingston R.E. Reconstitution of a functional corepolycomb repressive complex. // Mol Cell. 2001. V.8. P. 545-556

40. Fyodorov D.V., Blower M.D., Karpen G.H., Kadonaga J.T. Acfl confers uniqueactivities to ACF/CHRAC and promotes the formation rather than disruption of chromatin in vivo. // Genes Dev. 2004. V.18. P. 170-183.

41. Galloni, M., Gyurkovics H., Schedl P., Karch F. The bluetail transposon: Evidencefor independent ш-regulatory domains and domain boundaries in the bithorax complex//EMBO J. 1993.V.12. P. 1087-1097.

42. Geyer, P.K., Corces V.G. Separate regulatory elements are responsible for thecomplex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster II Genes Dev. 1987. V.l. P.996-1004.

43. Golic, К. G., Lindquist S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specificrecombination in the Drosophila genome // Cell. 1989. V.59. P.499-509.

44. Grimaud C., Bantignies F., Pal-Bhadra M., Ghana P., Bhadra U., Cavalli G. RNAicomponents are required for nuclear clustering of Polycomb group response elements. // Cell. 2006. V. 124. P. 957-971.

45. Grimaud C, Negre N, Cavalli G. From genetics to epigenetics: the tale of Polycombgroup and trithorax group genes. // Chromosome Res. 2006. V.14. P.363-375.

46. Guarente L., Hoar E. Upstream activation sites of the CYC1 gene of Saccharomycescerevisiae are active when inverted but not when placed downstream of the "TATA box" //Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1984. V.81. P.7860-7864.

47. Gyurkovics H., Gausz J., Kummer J., Karch F. A new homeotic mutation in the

48. Drosophila bithorax complex removes a boundary separating two domains of regulation. // EMBO. 1990. V. 9. P. 2579-2585.

49. Hagstrom K., Muller M., Schedl P. A Polycomb and GAGA dependent silenceradjoins the Fab-7 boundary in the Drosophila bithorax complex // Genetics. 1997. V. 146. P. 1365-1380.

50. Hagstrom K., Muller M., Schedl P. Fab-7 functions as a chromatin domainboundary to ensure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex // Genes Dev. 1996. V.10. P 3202-3215.

51. Hartenstein V. Atlas of Drosophila development // Cold Spring Harbor Laboratory1. Press. 1993.

52. Hogga, I., Mihaly J., Barges S., Karch F. Replacement of Fab-7 by the gypsy or scsinsulator disrupts long-distance regulatory interactions in the Abd-B gene of the bithorax complex // Mol. Cell. 2001. V.8. P.l 145-1151.

53. Horard B, Tatout C, Poux S, Pirrotta V. Structure of a polycomb response elementand in vitro binding of polycomb group complexes containing GAGA factor // Mol Cell Biol. 2000. V.20. P.3187-3197.

54. Karch F, Bender W, Weiffenbach B. abdA expression in Drosophila embryos. //

55. Genes Dev. 1990. V.4. P. 1573-1587.

56. Karch F., Galloni M., Sipos L., Gausz J., Gyurkovics H., Schedl P. 1994. Мер and

57. Fab-7: molecular analysis of putative boundaries of ш-regulatory domains in the bithorax complex of Drosophila melanogaster II Nucleic Acids Res. V.22. P.3138-3146.

58. Karch F., Weiffenbach В., Peifer M., Bender W., Duncan I., Celniker S., Crosby

59. M., Lewis E.B. The abdominal region of the bithorax complex // Cell. 1985. V.43. P.81-96.

60. Kares R.E., Rubin G.M. Analysis of P transposable element functions in Drosophila

61. Cell. 1984. V.38. P. 135-146.

62. Kennison J.A. Tamkun J.W. Dosage-dependent modifiers of polycomb andantennapedia mutations in Drosophila. II Proc Natl Acad Sci USA. 1988. V.85. P.8136-8140.

63. Kuhn E.J., Geyer P.K. Genomic insulators: connecting properties to mechanism //

64. Curr Opin Cell Biol. 2003. V.15. P.259-265.

65. Kuziora M.A., McGinnis W. Altering the regulatory targets of the Deformed proteinin Drosophila embryos by substituting the Abdominal-B homeodomain. // Mech Dev. 1990. V.33. P.83-93.

66. Lewis E.B. A gene complex controlling segmentation in Drosophila II Nature. 1978.1. V. 276. P.565-570.

67. Lewis E.B. The bithorax complex: the first fifty years // Int. J. Dev. Biol. 1998. V.42: 403-415.

68. Lin Q, Chen Q, Lin L, and J. Zhou. The promoter targeting sequence mediatesepigenetically heritable transcription memory // Genes Dev. 2004. V.18. P.2639-2651.

69. Lin Q, D. Wu, and J. Zhou. The promoter targeting sequence facilitates and restrictsa distant enhancer to a single promoter in the Drosophila embryo // Development. 2003. V. 130. P.519-526.

70. Lindsley D., Zimm G. The genome of Drosophila melanogaster. // Academic1. Press, New York. 1992.

71. Lu Q., Leibovitch B.A., Benjamin L.R., Liu Y., Gilmour D.S., Elgin S.C. GAGAfactor and the TFIID complex collaborate in generating an open chromatin structure at the Drosophila melanogaster hsp26 promoter // Mol Cell Biol. 2002. V. 22. P.6148-6157.

72. Macias A, Casanova J, Morata G. Expression and regulation of the abd-A gene of

73. Drosophila II Development. 1990 Dec; 110(4): 1197-207

74. Mahmoudi, Т., Katsani K.R., Verrijzer C.P. GAGA can mediate enhancer functionin trans by linking two separate DNA molecules // EMBO J. 2002. V.21. P. 17751781.

75. McCall K, Bender W. Probes of chromatin accessibility in the Drosophila bithoraxcomplex respond differently to Polycomb-mediated repression. // EMBO J. 1996. V. 15. P.569-580.

76. McCall К., O'Connor M.B., Bender W. Enhancer traps in the Drosophila bithoraxcomplex mark parasegmental domains // Genetics. 1994. V.138. P.387-399.

77. McGinnis W., Krumlauf R. Homeobox genes and axial patterning. // Cell. 1992 .1. V.68. P. 283-302.

78. Mihaly J, Barges S, Sipos L, Maeda R, Cleard F, Hogga I, Bender W, Gyurkovics

79. H, Karch F. Dissecting the regulatory landscape of the Abd-B gene of the bithorax complex. // Development. 2006. V.133. P.2983-2993.

80. Mihaly J., Hogga I., Barges S., Galloni M., Mishra R.K., Hagstrom K., Muller M.,

81. Schedl P., Sipos L., Gausz J., Gyurkovics H., Karch F. Chromatin domain boundaries in the bithorax complex //. Cell Mol. Life Sci. 1998. V.54. P.60-70.

82. Mihaly J., Hogga I., Gausz J., Gyurkovics H. Karch F. In situ dissection of the Fab7 region of the bithorax complex into a chromatin domain boundary and a Polycomb-response element//Development. 1997. V.124. P. 1809-1820.

83. Muller J., Hart C.M., Francis N.J., Vargas M.L., Sengupta A., Wild В., Miller

84. E.L., O'Connor M.B., Kingston R.E., Simon J.A. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. // Cell. 2002. V. 111. P. 197-208.

85. Muller M., Hagstrom K., Gyurkovics H., Pirrotta V., Schedl P. The Мер elementfrom the Drosophila melanogaster bithorax complex mediates long-distance regulatory interactions//Genetics. 1999. V.153. P.1333-1356.

86. Orlando V., Jane E.P., Chinwalla V., Harte P.J., Paro R. Binding of trithorax and

87. Polycomb proteins to the bithorax complex: dynamic changes during early Drosophila embryogenesis // EMBO J. 1998. V.17. P.5141-5150.

88. Papoulas О, Веек SJ, Moseley SL, McCallum CM, Sarte M, Shearn A, Tamkun JW.

89. The Drosophila trithorax group proteins BRM, ASH1 and ASH2 are subunits of distinct protein complexes. // Development. 1998. V.125. P. 3955-3966.

90. Paro R. Imprinting a determined state into the chromatin of Drosophila. //Trends

91. Genet. 1990. V. 6. P. 416-421.

92. Petrascheck M., Escher D., Mahmoudi Т., Verrijer C.P., Schaffner W., Barberis A.

93. DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo // Nucleic Acids Res. 2005. V.33. P.3743-3750.

94. Petruk S., Sedkov Y., Riley K.M., Hodgson J., Schweisguth F., Hirose S., Jaynes

95. J.B., Brock H.W., Mazo A. Transcription of bxd noncoding RNAs promoted by trithorax represses Ubx in cis by transcriptional interference. // Cell. 2006. V. 127. P. 1209-1221.

96. Petruk S., Sedkov Y., Smith S., Tillib S., Kraevski V., Nakamura Т., Canaani E.,

97. Croce C.M., Mazo A. Trithorax and dCBP acting in a complex to maintain expression of a homeotic gene. // Science. 2001. V.294. P. 1331-1334.

98. Pirrotta V., Steller H., Bozzetti M. Multiple upstream regulatory elements controlthe expression of the Drosophila white gene // EMBO J. 1985. V.4. P. 3501-3508.

99. Pirrotta V. The genetics and molecular biology of zeste in Drosophila melanogaster.

100. Adv Genet. 1991. V.29. P.301-348.

101. Pirrotta V. PcG complexes and chromatin silencing // Curr.Opin.Gen.Dev. 1997.1. V.7. P.249-258.

102. Pirrotta V. Polycomb silencing and the maintenance of stable chromatin states //

103. Results Probl. Cell Differ. 1999. V.25. P.205-228.

104. Rank, G., Prestel M., Paro R. Trnascription through intergenc chromosomalmemory elements of the Drosophila bithorax complex correlates with an epigenetic switch// Mol. Cell. Biol. 2002. V.22. P.8026-8034.

105. Rastelli L., Chan C.S., Pirrotta V. Related chromosome binding sites for Zeste,

106. Suppressors of zeste and Polycomb group proteins in Drosophila and their dependence on Enhancer of zeste function. // EMBO J. 1993. V.12. P.1513-1522.

107. Recillas-Targa F., Pikaart M.J., Burgess-Beusse В., Bell A.C., Litt M.D., West

108. A.G., Gaszner M., Felsenfeld G. Position-effect protection and enhancer blocking by the chicken beta-globin insulator are separable activities // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 6883-6888.

109. Rodin S., Georgiev P. Handling three regulatory elements in one transgene:

110. Combined use of cre-lox, FLP-FRT and l-Scel recombination systems // BioTechniques. 2005. V.39. P.871-875.

111. Rubin G., Sprandling A. Genetic transformation of Drosophila with transposableelement vectors // Science. 1982. V.218. P.348-353.

112. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual, Ed.2.

113. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1989.

114. Sanchez-Eisner Т., Gou D., Kremmer E., Sauer F. Noncoding RNAs of trithoraxresponse elements recruit Drosophila Ashl to Ultrabithorax II Science. 2006. V.311. P.l 118-1123.

115. Sanchez-Herrero E. Control of the expression of the bithorax complex abdominal-Aand Abdominal-B by c/'s-regulatory regions in Drosophila embryos II Development. 1991. V.lll. P.437-448.

116. Sanger F., Nicken S., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminatinginhibitors // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V.74. P.5463-5487.

117. Saurin AJ, Shao Z, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Kingston RE. A Drosophila

118. Polycomb group complex includes Zeste and dTAFII proteins. // Nature. 2001. V.412. P.655-660.

119. Schweinsberg S, Hagstrom K, Gohl D, Schedl P, Kumar RP, Mishra R, Karch F.

120. The enhancer-blocking activity of the Fab-7 boundary from the Drosophila bithorax complex requires GAGA-factor-binding sites. // Genetics. 2004 . V.168. P. 1371-1384.

121. Schweinsberg S., Schedl P. Developmental modulation of Fab-7 boundary function

122. Development. 2004. V.131. P.4743-4749.

123. Sipos, L., Mihaly J., Karch F., Schedl P., Gausz J., Gyurkovics H. Transvection inthe Drosophila Abd-B domain: extensive upstream sequences are involved in anchoring distant ш-regulatory regions to the promoter // Genetics. 1998. V.149. P.1031-1050.

124. Smale S.T. Core promoters: active contributors to combinatorial gene regulation.//

125. Genes Dev. 2001. V.15. P.2503-2508.

126. Smith S.T., Petruk S., Sedkov Y., Cho E., Tillib S., Canaani E., Mazo A.

127. Modulation of heat shock gene expression by the TAC1 chromatin-modifying complex. // Nat Cell Biol. 2004. V. 6. P. 162-167.

128. Spellman P.T., Rubin G.M. Evidence for large domains of similarly expressed genesin the Drosophila genome // J Biol. 2002. 1:5.

129. Struhl K. Genetic properties and chromatin structure of the yeast GAL regulatoryelement: an enhancer-like sequence. // Proc Natl Acad Sci USA. 1984 V.81. P.7865-7869.

130. Su, W., Jackson S., Tjian R., Echols H. DNA looping between sites fortranscriptional activation: self-association of DNA-bound Spl. // Genes Dev. 1991. V.5. P.820-826.

131. Sun F.-L., Elgin S. Putting boundaries on silence // Cell. 1999. V.99. P.459-462

132. Tie F., Furuyama Т., Prasad-Sinha J., Jane E,. Harte P.J. The Drosophila Polycomb

133. Group proteins ESC and E(Z) are present in a complex containing the histone-binding protein p55 and the histone deacetylase RPD3. // Development. 2001. V.128. P.275-286.

134. Tillib S, Petruk S, Sedkov Y, Kuzin A, Fujioka M, Goto T, Mazo A. Trithorax- and

135. Polycomb-group response elements within an Ultrabithorax transcription maintenance unit consist of closely situated but separable sequences. // Mol Cell Biol. 1999. V.19. P.5189-5202.

136. Vazquez, J., M. Muller, V. Pirrotta, and J.W. Sedat. The Мер element mediatesstable long-range chromosome-chromosome interactions in Drosophila.// Mol. Biol. Cell. 2006. V.17. P.2158-2165.

137. Wang L., Brown J.L., Cao R., Zhang Y., Kassis J.A., Jones R.S. Hierarchicalrecruitment of polycomb group silencing complexes. // Mol Cell. 2004. V.14. P. 63 7-646.

138. West A. G., Fraser P. Remote control of gene transcription. // Hum. Mol. Genet.2005.V. 14. P.I0I-111.

139. Zavortinnk M., Sakonju S. The morphogenetic and regulatory Functions of the

140. Drosophila Abdominal-B gene are encoded in overlapping RNAs transcribed from separate promoters. // Genes Dev. 1989. V.3. P. 1969-1981.

141. Zhou J., Ashe H., Burks C. et al. Characterization of the transvection mediatingregion of the Abdominal-B locus in Drosophila II Development. 1999. V.126. P.3057-3065

142. Zhou J., Levine M. A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an antiinsulator activity in the Drosophila embryo // Cell. 1999. V. 99. P.567-575.

143. Zhou, J., S. Barolo, P. Szymanski, and M. Levine. The Fab-7 element of thebithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo. // Genes Dev. 1996. V.10. P.3195-3201.

144. Zink D, Paro R. Drosophila Polycomb-group regulated chromatin inhibits theaccessibility of a trans-activator to its target DNA. // EMBO J. 1995. V. 14. P.5660-5671.

Информация о работе

Кырчанова, Ольга Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.26

Диссертация

Исследование структуры и функции элемента Мср, участвующего в регуляции гена AВD-B у Drosophila melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы