Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новый энхансер локуса cut у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлова, Галина Валериевна, Москва



ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА

ПАВЛОВА ГАЛИНА ВАЛЕРИЕВНА

НОВЫЙ ЭНХАНСЕР ЛОКУСА CUT

У DROSOPHILA MELANOGASTER.

у

03.00.26- МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА

ДИССЕРТАЦИЯ

НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: ЧЛЕН-КОРР., Д.Б.Н., ПРОФ., А.П.РЫСКОВ

К.Б.Н. Н.Г.ШОСТАК

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

УДК 577.218 + 595.773.4

МОСКВА, 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Глава 1 Введение..................................1

Глава 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................4

2.1 Проблемы нейрогенеза у дрозофилы.........4

2.2 Фазы нейрогенеза у дрозофилы.............б

2.3 Формирование нейрогенной закладки........7

2.4 Локус cut ..............................11

2.5 Границы локуса cut......................19

2.6 "Горячие" точки локуса cut..............20

2.7 Повторяющиеся последовательности в локусе..................................20

2.8 Функции локуса..........................22

Глава 3. Материалы и методы.......................37

Глава 4. Результаты...............................48

4.1 Клонирование последовательности BamHI-EcoRI.............................48

4.2 Получение линии имеющий дополнительный BamHI-ficoRI фрагмент....................51

4.3 Метод гистохимического выявления активности бета-галактозидазы с помощью

X-gal...................................51

4.4 Торможение ДНК в геле...................59

4.5 Исследование методом футпринтинга.......64

Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ...............................69

Глава б. ВЫВОДЫ...................................79

Глава 7. ЛИТЕРАТУРА...............................80

Благодарности.....................................92

Введение

В последнее время достигнуты значительные успехи в изучении молекулярно-генетических механизмов регуляции активности генов в процессе развития. Обнаружены последовательности ДНК, ответственные за активацию или инактивацию сложных структурных генов (энхансеры, сайленсеры и др.)•

При изучении молекулярных механизмов онтогенеза были обнаружены энхансеры, ответственные за специфичность экспрессии гена в том или другом органе или ткани. При этом каждому органо- или тканеспецифическому гену "соответствует" "свой" энхансер.

В связи с этим становится особенно актуальным выявление новых энхансеров, стимулирующих "ключевые" гены, которые контролируют ход основных событий в индивидуальном развитии.

В геноме дрозофилы к таковым относятся, например, системы генов, детерминирующих выбор клеткой пути ее специализации. Из них особенно хорошо известны гены связанные с развитием нервной системы, такие как гены Notch, AS-C-комплекса, а также cut. Это достаточно сложные локусы, характеризующиеся

наличием ряда энхансеров со специфическим функциональным назначением.

Среди них наше внимание привлек локус cut. Этот локус - один из генетически наиболее хорошо изученных сложных локусов дрозофилы (Morgan, Bridges, Stertevant, 1925; Johnson, Judd, 1979). Он является одним из наиболее мутабильных участков Х-хромосомы (Schalet,1949), и играет важную роль в развитии (Santamaría, García-Bellido, 1975). Цель и задачи исследования.

Основная цель данной работы состояла в исследовании района ct6 локуса cut.

В работе были поставлены следующие задачи:

1). Получить трансгенных мух, в геном которых введен ген

бактериальной бета- галактозидазы под хит-шоковым промотором и

,6

исследуемыи нами район ct.

2). С помощью специфического X-gal окрашивания исследовать влияние участка ct6 на экспрессию репортерного гена на разных стадиях развития трансгенной дрозофилы.

3). Просеквенировать фрагмент ДНК, содержащий район ct6

в дикой линии Oregon R и в двух ct-мутантах ct(MRlKl) и ct(MRpN17).

4). С помощью методов торможения и футпринтинга исследовать новый энхансер для выявления признаков, характерных для LCR.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Проблемы нейрогенеза у дрозофилы

Под нейрогенезом понимают процесс формирования в ходе индивидуального развития нервных сетей и тех анатомических структур, в состав которых они входят. Проблема эта давняя. Уже Альберт Великий (1206-1280) в своих зоологических трудах с увлечением излагал удивительные факты из жизни насекомых, смесь правды и выдумки об их поведении, их повадках, проявлениях ума и глупости, осторожности и прозорливости,проницательности и лукавства. А Ян Сваммердам во 2-й половине 17-го века впервые описал (и с достаточной тщательностью) нервную систему жука-носорога (Oryctes nasicorius) на разных стадиях его развития. В дальнейшем поведение насекомых и особенности обусловливающей его нервной системы вызывали неизменный интерес биологов. Однако, серьезно анализировать строение и развитие нервной системы у этих объектов начали относительно недавно, с особенной интенсивностью с конца прошлого века (см. обзор Strausfeld, 1976), а с 70-х годов нашего века нейробиологические исследования насекомых вступили в фазу расцвета. В 40-е годы было дано детальное анатомическое и гистологическое описание мозга дрозофилы (Power, 1943, 1948), что позволило использовать для

решения ряда принципиально важных проблем и этот вид, особенно удобный, благодаря его хорошей генетической изученности.

Следует отметить, что становление нервной системы насекомых характеризуется как естественным сходством, так и различиями по сравнению с нейрогенезом позвоночных. Действительно, чем характеризуется развитие нервной системы позвоночных? 1.Нервная закладка выделяется у них в виде комплекса тесно связанных клеток нейральной пластинки, которая ведет себя в ходе морфогенетических движений как единое целое. 2. Детерминация нервной пластинки тесно связана с индуцирующими влияниями, исходящими из хордомезодермы (см Jacobson, 1978) . У насекомых, в том числе и у дрозофилы: 1. Клетки нейрогенной закладки сегрегируют индивидуально и последовательно движутся внутрь зародыша изолированными группами. 2. Индуктивные влияния мезодермы не кажутся в этом случае важными, так как программа нейрогенеза развертывается и в отсутствие мезодермы (Campos-Ortеда, Hartenstein, 1985; Wilkins, 1986).

В последнее время описаны многочисленные мутации, затрагивающие нервную систему, ее строение и развитие

(Hawse, 1975; Ward, 1977; Quinn, Gould, 1979; Hall, 1982; Harris, 1985; Ganetzky, Wu, 1986).

Это стимулировало объединение усилий генетиков, эмбриологов и молекулярных биологов направленных на расшифровку механизмов генетической регуляции нейрогенеза у насекомых. Результаты проведенных исследований нашли отражение в ряде сборников и материалах многочисленных конференций (см. Например, Cold Spring Harbor Symp. On Quant. Biol., 1985; Molecular Neurobiology of Drosophila, 1986) и позволяют выделить фазы нейрогенеза у дрозофилы и других насекомых и рассмотреть роль генетических систем в осуществлении каждой из этих фаз.

Фазы нейрогенеза у дрозофилы.

Весь процесс нейрогенеза у дрозофилы (как и у других насекомых можно грубо и приблизительно подразделить на две стадии: 1. Формирование нейрогенной закладки. 2.Преобразование нервной закладки в систему нервных сетей. Первая стадия в свою очередь может быть разделена на три стадии: а. Отделение части эктодермы как нейрогенной закладки; б. Происхождение из нее предшественников нервных клеток; в. Морфогенетические

движения, выводящие этих предшественников на их конечную позицию в нейрогенной закладке. Формирование нейрогенной закладки.

Дробление яйца Drosophila melanogaster

поверхостное. Тридцать синхронных делений дробления между оплодотворением и целлюляризацией на стадии бластодермы дают начало 5500 клеткам бластодермы, 175 вителлофагам и 36 полярным клеткам (Zalokar, Erk, 1976). Вскоре после целлюляризации (около 2,5 часов после оплодотворения при 25 градусах) клетки мезодермальной закладки инвагинируют, формируя вентральную бороздку и через несколько минут две группы клеток: передне-вентральная и задне-дорзальная, также инвагинируют и образующих закладку средней кишки (Poulson, 1950; Campos - Ortega, Hartenstein, 1985).

Первые признаки нейрогенеза описаны Поулсоном (Poulson, 1950). Они связаны с разделением эктодермальной закладки на дорзальную и вентральную (2 часа 50 мин. - 3 часа после оплодотворения) . Клетки дорзальной эктодермы утрачивают потенции к образованию нейральных элементов, из вентральной эктодермы возникают нейральные и эпидермальные производные. "Выселяющиеся" клетки формируют вентральную нейрогенную закладку (vNR). Она содержит 1800 клеток. Из них 450 клеток сегрегируют

как нейробласты, 1350 - будущие эпидермальные клетки и их производные. На нейрогенную область каждого полусегмента приходится 60 клеток (Campos-Ortega, 1985). Несколько митотических циклов в период формирования нейробластов увеличивает количество этих клеток по крайней мере в два раза (Hartenstein, Campos-Ortega, 1985) .

Обычная "доля" нейробластов, возникающих из нейрогенных эктодермальных клеток (nECs) 13-16 на сегмент - (Hartenstein, Campos-Ortega, 1984). Многие из остающихся клеток нейрогенной области становятся покровными клетками, которые позднее составляют вентральный эпидермис (Technau, Campos-Ortega, 1985) . В целом в мезоторакальном полусегменте у Drosophila примерно 60 nECs генерируют примерно 2 0 нейробластов (NBs), они продуцируют примерно 125 ганглиозных материнских клеток (GMCs), в результате деления которых возникает примерно 250 нейронов.

Нейрогенная область до сегрегации нейробластов содержит около 100 поперечных рядов из 79 клеток на каждой стороне вдоль зародышевой полоски (см. Hartenstein, Campos-Ortega, 1984, 1985; Hartenstein et al., 1985; Technau, Campos-Ortega, 1985).

Когда конец зародышевой полоски достигает 50-54% длины эмбриона, нейрогенная область дифференцируется на обеих сторонах эмбриона на три продольно ориентированных подразделения - ЫИт (медиальная часть), Ыг1 (промежуточная часть) и Ш1 (латеральная часть). Большинство клеток в ЫИт и ЖЪ увеличивается в дальнейшем в размере, лишь немногие клетки остаются неизменными. В ЫИт и ШЬ до сегрегации нейробластов митозы не обнаруживаются. Напротив, в N131 многие клетки становятся мельче и некоторые из них делятся . Мелкие и митотически делящиеся клетки группируются вместе в кластеры и распределяются довольно правильным способом вдоль Ш1. Восемь таких кластеров размещаются на правильном расстоянии примерно 4 0 микрон в каудальных 2/3 зародышевой полоски. Между клеточными кластерами в N1*1 присутствуют большие клетки, морфологически сходные с подобными клетками ЫИт и ЖЬ. В целом, границы нейрогенной области до сегментации нейробластов со всеми ее региональными различиями очень сходны с распределением нейробластов на более поздних стадиях.

Таким образом, на первом этапе эмбрионального развития эктодермальная закладка разделяется на две части - вентральную, способную развиваться как в нейральном, так и в эпидермальном направлении, и

дорзальную, в которой способность к нейрализации подавлена. Следовательно, можно предположить

существование специальной генетической системы, обеспечивающей такое разделение эктодермальной закладки в ходе онтогенеза.

Реализация генетической программы нейрогенеза на ранних стадиях эмбриогенеза подготавливает клетки к вступлению на нейральный или эпидермальный путь развития. В этих условиях перед 1800 клетками, составляющими вентральную нейрогенную закладку, встает вопрос - "кем быть", нейроном или эпидермальной клеткой? Каждая клетка стоит перед таким выбором и делает его. И, как оказалось, выбор этот определяется специфической генетической системой, которая представлена двумя группами локусов. Их обозначают как: 1. Нейрогенные и 2. Антинейрогенные (Jimenez, Campos-Ortega, 1979; Hatenstein, Campos-Ortega, 1984 ; Campos-Ortega, 1985; «Molecular Neurobiology of Drosophila», 198 6 ).

Нейрогенные локусы - это те гены, мутации которых вызывают гипернейрализацию в вентральной нейрогенной закладке. Показана топологическая специфичность их действия: они не влияют на судьбу закладок трахеальных плакод, на судьбу всего дорзального эпидермиса как на торакальном, так и на абдоминальном уровне, всей задней

кишки и частично передней кишки, всех мезодермальных и эктодермальных производных (Campos-Ortega, 1983).

Антинейрогенные локусы - это такие локусы, мутации в которых, в противоположность нейрогенным локусам, обуславливают недоразвитие нервной системы,

проявляющееся в разной степени и в разные периоды становления дрозофилы (Jimenez, Campos-Ortega, 1979). В отличие от нейрогенных локусов, «разбросанных» по геному, антинейрогенные в основном собраны в кластер в районе 1В Х-хромосомы. К ним принадлежат следующие гены : achaete-scute (Ac-Sc), Ее-4, elav, ventral nervous system condensation defective (vnd) и ген denerved , локализованный в цитологическом районе 31АВ 2-й хромосомы (Jimenez, Campos-Ortega, 1979, 1987; Campos-Ortega, Jimenez, 1980; Brand et al. 1986).

Кроме того мутации и делеции еще около 20 генов вызывают аномалии в развитии периферической нервной системы, к таким, в частности, относятся stg, cut, lz и др. (Jan et al., 1986; Stocker, Gendre, 1986; Campos-Ortega, Jimenez, 1980).

Нас заинтересовал локус cut. Локус cut.

В последние годы особое внимание молекулярных генетиков привлекают регуляторные области ДНК,

контролирующие тканеспецифическую экспрессию генов. Одной из удобных моделей для исследований такого рода является локус cut дрозофилы. Ген cut был открыт Морганом, Бриджесом и Стертевантом в 1925 году с фенотипическими признаками у cut- мутантов, такими как: перекрученные бедра, вырезки на крыльях и эмбриональные или личиночные летали, (показано на рис. 1).

Локус cut дрозофилы является сложным генетическим локусом, который расположен в X хромосоме в районе 7В1-8 (рис.2) . Локус cut занимает около 220 kb. Он полностью проклонирован Чуриковым и др., 1986, а также Блохлингером и др., 1988, включающая всю его жизненно важную кодирующую область.

Последовательность локуса cut содержит 4 субрегиона мутаций, два из них включают мутации изменяющие некоторые ткани, а два остальных содержат мутации которые изменяют целый ряд тканей (Jack, 1991). Локус cut дрозофилы является комплексом генов, чьи функции интересны своим влиянием на клеточную спецификацию и морфогенез внешних сенсорных органов. В эмбрионе, где отсутствует cut функция, 95% клеток, предназначенных при нормальном эмбриогенезе для

\

Рис 1. Фенотипическая вариабельность в проявлении мутации cut. Внизу крыло контрольной мухи из Linds^ey ^ а.Grell. о ; ' ,

*

' ' >. ■ •'

In (I) et HA"

* \ v \ ¿^Щк

In CI) ctИАЧ*

;_______

7» IW

^ •......!

си¥

Рис 2. Определение ориентации клонированной области в X-хромосоме. [3Н]-никтранслированная ДНК сЗ гибридизовалась in situ с политенными хромосомами из

1п(1) с^1:б(а) и 1п(1)сЬ569 (Ь) . Приведены районы X-хромосомы, где обнаруживается метка. Схематически указаны разрывы инверсий (в)

образования сенсорных органов с внешней кутикулярной структурой, дифференцируется в другой класс сенсорных органов, называющийся хордотональными органами (Bodmer et. al., 1987). Хордотональные органы морфологически отличаются от внешних сенсорных органов. Они прикрепляются внутри эпидермиса и экспрессируют разлиные антигены. Каждый сенсорный орган любого типа происходит из единственного эпидермального

предшественника - клетки, которая продуцирует один или иногда больше нейронов и имеет обычно три сопровождающих клетки (Bate, 1978; Hartenstain, 1988)

строение(рис.3,рис.4,рис.5). Локус cut также

экспрессируется в других тканях, где его функции хуже исследованы. Экспрессия cut также отмечена в Мальпигиевых сосудах, щетинках, ЦНС, и в некоторых других тканях.

Локус cut - один из генетически наиболее хорошо изученных сложных локусов дрозофилы (Morgan, Bridges,Stertevant, 1925; Johnson, Sudd, 1979). Он является одним из наиболее мутабильных участков X-хромосомы (Schalet, 1949) и играет важную роль в развитии дрозофилы.

es organ

ch organ

trichoma

thocog«.. —

»., ^.caraogo«

•>«( nouroao

/ etil

icolopol* coll

ch neurone '"■•lil*»eac cell

Рис 3. Схема строения внешнего сенсорного органа (es) и хордотонального органа (ch). Виден выход рецепторного отростка "наружу" в 1-м случае и его "погружение" во вспомогательные клетки - во втором. Обозначены нейроны и вспомогательные клетки. По Alain Ghysen.f "XJ?'

cell lineage

o<

»•могу ■other coll

'**• «uppers etil aupperc coll

О -

•heech coli

triches«* cop coll

согао|ов 11(меяс coll

thecogea (colopolo coll

о« мигом ch oourooo

К

Рис 4. Схема происхождения клеток, составляющих внешний сенсорный (es) и хордотональный (ch) рецепторные органы. По Alain Ghysen.i С <f Çt }

хмвк

Рис 5. Эффект гена cut ( указано стрелкой ) и других генов на процессы выбора пути дифференцировки нервными клетками дрозофилы. Э - эктодермальные клетки, ГП - гены поляризации, ВНЗ - клетки вентральной нейральной закладки, НГ - ^ейрогенные локусы, ЭП - эпидермальные клетки, ПЧО - предшественники чувствительных органов, BP - клетки внешних рецепторов, X - клетки хордотональных органов, МДК - клетки многодендритных рецепторов, .5с -ген scute, cut - ген cut, 1(3)183 - ген lethal(3)183, da-ген danyhterless. По Корочкину, 1989.

Молекулярные характеристики локуса cut.

■ а

*f2

ctJVfit«

et?

0.033 0.007

0.16

0.07

-к/о

s M,„cf» ^ у»- ^

et ■:■..■'■ чаи

gypey indict30* 8C/D

pt' ■j

-160 -140 -120 -100

-60

-60 -40

TEUDMERE

I ■J0 • V

A HSS

3.7 kb repeat

CENTROMERE

Scythian

Рис.6 Физическая карта cut:

а. генетическая карта локуса (Johnson, Judd, 1979). Указаны рекомбинантные расстояния (сМ);

локализация и природа «классических» ct-мутантов. Звездочки указывают 2?coRl - фрагменты, измененные в ctn; В - EcoRl - карта клонированного сегмента ДНК из линии Oregon RC. Проведена шкала в kb. Нулевая точка «прогулки» находится в исходном клоне Н55, полученном Чуриковым. Последовательности, расположенные от нулевой точки слева и справа, имеют координаты со знаками «-» и «+», соответственно.

Границы локуса cut

Дистальная левая граница локуса cut располо