Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль белков Su(Hw) и Mod(mdg4)- компонентов инсулятора, в регуляции экспрессии генов Achaete-Scute комплекса у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль белков Su(Hw) и Mod(mdg4)- компонентов инсулятора, в регуляции экспрессии генов Achaete-Scute комплекса у Drosophila melanogaster"

Энхансерами принято называть последовательности ДНК, которые способны активировать транскрипцию независимо от ориентации и расстояния до точки начала транскрипции. Несмотря на то, что к настоящему времени описано большое количество энхансеров и промоторов, остается много вопросов относительно механизмов их взаимодействия. В частносш неизвестно, каким образом белки, связывающиеся с энхансером, взаимодействуют с транскрипционным комплексом, собранным на промоторе, минуя большие расстояния, и чем определяется специфичность взаимодействия энхансеров с промотором «своего» гена. Многие из существующих экспериментальных данных косвенно согласуются с тем, что белки, связанные с энхансером, непосредственно взаимодействуют с белками основного транскрипционного комплекса или вспомогательными белками, собранными на промоторе, при этом ДНК между ними образует петлю. В понимании механизмов дальних взаимодействий между регуляторными элементами большую роль могут сыграть инсуляторы. Инсуляторами называются регуляторные элементы, которые блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, если находятся между ними. При этом ни энхатсер, ни промотор, сами по себе не теряют своей функциональной активности. Другим важным свойством большинства инсуляторов является их способность определять границы между активным и неактивным хроматином.

В настоящее время наиболее изученным является инсулятор 8и(Н\у), найденный в регуляторном районе ретротранспозона МДГ4 дрозофиллы. Он состоит из 12 копий консен-сусной последовательности 5'РуРиТтаСАТАССРуЗ', с которыми связывается белок, кодируемый геном ъи(Нм>). Другим белком, участвующим в работе инсулятора, является Моё(тёд4).

Хотя 8и(Н\у) является наиболее исследованным инсулятором, на примере которого строятся все основные модели для изучения механизма действия инсуляторов, пока не известна его роль в регуляции экспрессии генов дрозофилы, и в геноме дрозофилы ранее не было найдено сайтов связывания с этим белком за исключением МДГ4.

В данной работе были обнаружены геномные сайты связывания для белка 8и(Н\¥), изучена их способность к инсуляции и проведены исследования по выяснению роли белков 8и(Нш) и Мо<3(тс1д4) в регуляции экспресии сложного генного аскае1е-$сШе комплекса (АБ-С).

2. Обзор литературы

2.1. Общая характеристика инсуляторов

Гены эукариот имеют сложно устроенные регуляторные области, содержащие большое количество регуляторных элементов. Энхансер и промотор могут взаимодействовать между собой, иногда находясь на больших расстояниях друг от друга, часто превышающих сотни тысяч п.н. (Dorsett, 1999). Несмотря на такие дистанции, энхансер специфически активирует промотор только «своего» гена, и не взаимодействует с близлежащими промоторами других генов. Возникает вопрос, каким образом энхансер может взаимодействовать с промотором на больших дистанциях, и при этом правильно узнавать свой промотор. Хотя к настоящему моменту описано огромное количество энхансеров и промоторов и изучено множество факторов транскрипции, вопрос о механизме взаимодействия между энхансером и промотором остается открытым.

В понимании механизмов дальних взаимодействий между регуляторными элементами большую роль могут сыграть инсуляторы. Инсуляторами называются регуляторные элементы, которые блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, если находятся между ними (Dorsett, 1999; Bell et al., 2001; Corees and Felsenfeld, 2000). При этом инсуляторы не влияют непосредственно на активность энхансера и промотора, т.е. промотор может быть активирован любым другим энхансером, а энхансер может активировать любой другой промотор (Cai et al. 1995; Scott and Geyer, 1995). Характерным свойством инсуляторных последовательностей является их способность делать экспрессию генов конструкции, фланкированной инсуляторами, независимой от места ее инсерции в геном.

В 1991 году были открыты первые два инсулятора дрозофилы, ses и ses', которые окружают ген теплового шока hsp70 дрозофилы (Kellum and Schedl, 1991; 1992). Почти одновременно в регуляторной области ретротранспозона дрозофилы МДГ4 был обнаружен su(Hw) инсулятор (Geyer et al., 1992). В дальнейшем у позвоночных был описан еще один инсулятор, который ограничивает глобиновые гены (Chung et al., 1993). Интересно, что он работает и в дрозофиле. Существуют данные, что ses инсулятор дрозофилы может функционировать в клетках мыши и ооцитах морского ежа (Geyer, 1997). Таким образом, инсуляторы из разных организмов должны иметь общие механизмы действия.

2.2. Инсулятор Su(Hw)

В выяснении механизма действия инсуляторов большую роль сыграло определение белков, отвечающих за функцию инсуляторов. Впервые белки, которые блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, были охарактеризованы для su(Hw) инсулятора. su(Hw)-cвязьшaющий домен находится рядом с 5' длинным концевым повтором ретротранспозона МДГ4. su(Hw) инсулятор содержит 12 сайтов связывания для одного белка, кодируемого геном su(Hw) (Mazo et al., 1989; Sparia et al., 1988; Spana and Corees 1990). Инактивация этого гена приводит к потере инсуляции. Сила инсулятора напрямую зависит от количества сайтов связывания для белка Su(Hw) (Smith and Corees 1992). Делеция даже нескольких сайтов связывания резко снижает эффективность действия инсулятора. Su(Hw) белок имеет на концах домены, обогащенные кислыми аминокислотами, и ДНК -связывающий домен, состоящий из 12 цинковых пальцев (Harrison et al., 1993; Kim et al., 1996). С помощью делеционного анализа было выявлено, что за инсуляцию отвечает домен, расположенный между цинковыми пальцами и С-концевым кислым доменом (Kim et al., 1996). В то же время кислые домены белка Su(Hw) не имели большого значения для инсуляции.

Один из белков, который кодируется геном mod(mdg4), взаимодействует с доменом белка Su(Hw), отвечающим за инсуляцию (Gause et al. 2001; Ghosh et al. 2001). Белок не содержит ДНК-связывающего домена, однако имеет ВТВ домен (по названию трех генов, кодирующих его: Broad complex, tramtrack, bric-a-brac), для которого показана возможность взаимодействия с доменом лейциновой молнии (Gerasimova et al., 1995); на карбоксильном конце белка находится кислый домен. В общей сложности с гена mod(mdg4) транскрибируется около 20 различных мРНК, образующихся в результате альтернативного сплайсинга экзонов, расположенных на 3' конце гена (Buchner et al. 2000). Независимо в лабораториях Ройтера (Dorn et al., 1993) и Корсеса (Gerasimova et al., 1995) было показано, что на N-конце всех белков, кодируемых геном mod(mdg4), находится так называемый BTB/POZ домен, который был найден у целого семейства белков, являющихся регуляторами транскрипции. ВТВ домен определяет взаимодействие между белками и приводит либо к гомополимеризации, либо реже к гетерополимеризации белков. Таким образом, все белки, кодируемые геном mod(mdg4), имеют одинаковые ВТВ-домены на N-концах и разные С-концевые домены. Предполагается, что именно С-концы определяют специфичность взаимодействия различных вариантов белка Mod(mdg4) с другими белками.

В нашей лаборатории была описана мутация mod(mdg4)u\ которая приводит к потере инсуляторных свойств белка Su(Hw) (Georgiev and Kozycina 1996). Эта мутация вызвана внедрением мобильного элемента Сталкер в 3' экзон гена mod(mdg4), что приводит к делеции С-концевой области только у одного белкового продукта данного гена (Gerasimova et al., 1995; Gause et al., 2001). Таким образом, мутация mod(mdg4)lul нарушает взаимодействие между белками Su(Hw) и Mod(mdg4), при этом все остальные белковые продукты гена mod(mdg4) сохраняются. Нужно отметить,что полная инактивация гена mod(mdg4) приводит к гибели на стадии эмбриона.(Dorn et al., 1993), а мутация mod(mdg4)ul не влияет на жизнеспособность, то позволяет изучать роль белка Mod(mdg4) в процессах инсуляции. Ген mod(mdg4) кспрессируется одинаково на всех стадиях развития, что предполагает его роль в общем оддержаши транскрипции. В литературе появляется все больше информации о роли белковых родуктов гена mod(mdg4) в совершенно различных процессах - апоптозе, формировании ышечных волокон, правильной экспрессии гомеозисных генов, супрессии эффекта гтерохроматина (Gerasimova et al., 1998; Buchner et al. 2000).

Интересно, что в присутствии мутации mod(mdg4)lul su(Hw) инсулятор может ингиби-овать активность некоторых промоторов (Georgiev et al., 1996). Ранее в лаборатории проф. орсеса было детально исследовано взаимодействие su(Hw) инсулятора с регуляторными эле-ентами гена yellow (Geyer et al., 1986; Geyer et al., 1992). Транскрипция гена yellow регули-уется набором тканеспецифичных энхансеров, и уровень экспрессии можно наблюдать визу-íibHO по степени пигментации кутикулы имаго. В у2 мутации мобильный элемент МДГ4 лроился в регуляторную область гена yellow (Geyer et al., 1986; Parkhurst and Corees 1986). В ззультате энхансеры, ответственные за экспрессию гена в теле и крыльях, оказываются изоли-эванными от его промотора su(Hw) инсулятором (рис. 2). В то же время теп yellow нормально сспрессируется в других зонах кутикулы, так как соответствующие энхансеры находятся либо гпосредственно в зоне промотора, либо в интроне гена, как, например, энхансер, гветственный за экспрессию гена yellow в щетинках (Geyer and Corees, 1987). Комбинирование od(mdg4)lul мутации с у2 аллелем приводит к усилению мутантного фенотипа и инактивации :на yellow в щетинках, что можно объяснить прямым ингибированием промотора гена yellow xeorgiev and Corees, 1995; Georgiev and Kozycina, 1996). При этом ингибирование транскрип-m гена yellow зависит от наличия С-концевого домена белка Su(Hw). Можно предположить, :о Mod(mdg4), связываясь с Su(Hw) белком, маскирует его С-концевой домен, который в присутствие мутации mod(mdg4)ul может непосредственно ингибировать транскрипцию с промотора гена yellow.

Другим свойством su(Hw) инсулятора является его способность определять границы между активным и неактивным хроматином. По современным представлениям неактивный хроматин отличается от активного степенью упаковки ДНК в нуклеосомах, что характеризуется потерей чувствительности к обработке нуклеазами и эндонуклеазами, снижением уровня ацетилирования коровых гистонов. Предполагается, что компактная структура хроматина распространяется кооперативно, а для разделения активного и неактивного хроматина должны существовать специальные регуляторные элементы. Такие элементы были выявлены у дрожжей S. cerevisiae на границе между репрессированными локусами HMR и HML и активным окружающим хроматином (Donze et al., 1999; Bi, X., and J.R. Broach (2001). Выяснилось, что один из регуляторных элементов содержал сайты связывания для белка Rapl (Bi et al., 1999). Было выдвинуто предположение, что данный белок может активно конкурировать с нуклеосомами за связывание с ДНК и в результате нарушать кооперативное распространение компактного хроматина.

Экспериментальные результаты показали, что многие (хотя и не все) инсуляторы так же способны защищать ограниченный ими ген от репрессирующего действия окружающего хроматина (Chung et al., 1993). Как упоминалось выше, таким свойством в частности обладает su(Hw) инсулятор. Транскрипция гена white, ограниченного двумя копиями su(Hw) инсулятора, наблюдается даже при инсерции конструкции в прицентромерный гетерохроматин (Roseman et al., 1993; 1995). Предполагается, что для блокирования влияния гетерохроматина на транскрипцию не нужен белок Mod(mdg4), который является ключевым в инсуляции (Т. Беленькая, Е. Муравьева, А. Головнин, неопубликованные данные). Предполагается, что большое количество белка Su(Hw), которое связывается с двенадцатью сайтами инсулятора, может нарушать кооперативное взаимодействие между нуклеосомами, блокируя эффект гетеро-хроматина. Возможно su(Hw) инсулятор подобным образом активирует и экспрессию мобильного элемента МДГ4. Белок Su(Hw) не является непосредственным активатором транскрипции, но большая масса этого белка разрушает организованную структуру нуклеосом в районе «слабого» промотора МДГ4, что приводит к его активации. Нужно отметить, что большая часть копий МДГ4 находится в области прицентромерного гетерохроматина, что делает роль Su(Hw) белка в активации транскрипции промотора МДГ4 очень актуальной.

Отдельно стоит рассмотреть способность su(Hw) инсулятора блокировать репрессию контролируемую белками группы Polycomb (Рс-белками) (Pirrotta, V., 1998 Pirrotta V. 1999). Белки этой группы образуют мультимерные комплексы на регуляторных элементах, которые сокращенно были названы PRE (Polycomb Responsible Elements). На первом этапе Рс-белки образуют мультимерные комплексы на PRE. Предполагается, что образовавшиеся комплексы могут, подобно энхансерам, репрессировать непосредственно образование транскрипционного комплекса на промоторе. Возможно, важную роль в репрессии играют деацетилазы, которые привлекаются Рс белками. За счет деацетюшрования гистонов повышается стабильность нуклеосом, что приводит к уменьшению доступности сайтов связывания на энхансерах и промоторах для регуляторных факторов и, как следствие, к репрессии транскрипции. Возможно, что репрессионный комплекс также может непосредственно блокировать сборку основного комплекса транскрипции на промоторе. На втором этапе Рс-белки совместно с гистонами образуют еще более конденсированный хроматин, что приводит к полному подавлению транскрипции. Для эффективного блокирования действия Рс-комплексов необходимы функции обоих белков - Su(Hw) и Mod(mdg4) (Sigrist and Pirrotta, 1997; Mallin et al., 1998). При этом можно предположить, что белок Mod(mdg4) блокирует непосредственное взаимодействие между белками репрессионного комплекса и факторами транскрипции на промоторе, т.е. вьшолняет функции инсулятора, в то время как белок Su(Hw) предотвращает кооперативное распространение образования более компактной структуры нуклеосом в области промотора.

2.3. Ses' и Ses инсуляторы

Ses, Ses ' элементы были обнаружены в результате цитологического исследования пуфов, образующихся на политенных хромосомах в районах гена теплового шока. Ses ' - это самый слабый инсулятор, который только частично блокирует взаимодействие между энхансерами и промоторами и не является границей между активным и репрессированным хроматином (Kellum and Schedl, 1991; 1992). Размер данного инсулятора 700 п.н., а коровая часть состоит из многократно повторяющегося сайта связывания для белка BEAF. С ses' связывается комплекс, в состав которого входят две субъединицы BEAF32A и субъединица BEAF32B (Zhao et al. 1995). Хотя один сайт связывания для белка BEAF не способен блокировать взаимодействие между энхансером и промотором, однако при мультимеризации сайта связывания инсуляторные свойства элемента воотанавливаются (Zhao et al. 1995). Было также показано, что ses' инсулятор почти не блокирует репрессию, вызванную белками группы Polycomb (Sigrist and Pirrotta, 1997). Следовательно, scs'-инсулятор является слабым по отношению к энхансер-промоторной паре репортерного гена, так как содержит только два сайта связывания для белка BEAF. В геноме были найдены два других участка связывания для белка BEAF, которые также могут блокировать взаимодействие между энхансером и промотором (Cuvier et al. 1998).

Scs-инсулятор имеет размер 1600 п.н. и обладает близкой к Su(Hw) инсулятору эффективностью действия (Geyer 1997). Он был разделен на три фрагмента, которые по отдельности являются слабыми инсуляторами (Kellum and Schedl, 1991; 1992). В одном из фрагментов были найдены два сайта связывания для Zw5 белка, который кодируется геном zeste-white 5 (Gaszner et al., 1999). Было показано, что 4 сайта связывания этого белка имеют инсуляторную активность, сравнимую с полноценным ses элементом. Однако, Scs-инсулятор отличается от su(Hw) неспособностью блокировать репрессию, вызванную компактизацией хроматина. Таким образом он не является эффективной границей между активным и неактивным хроматином в прицентромерном гетерохроматине (Roseman et al., 1993; 1995). Возможно данное явление объясняется недостаточным количеством сайтов для Zw5 белка. В то же время ses инсулятор способен эффективно блокировать репрессию индуцируемую репрессионными комплексами, связывающимися с PRE элементами (Sigrist and Pirrotta, 1997). С помощью in situ гибридизации было продемонстрировано, что многочисленные сайты для BEAF и Zw5 белков равномерно распределены по хромосомам дрозофилы (Zhao et al., 1995; Gaszener et al., 1999). Предполагается, что они связываются преимущественно с междисками на политенных хромосомах, что может указывать на их участие в формировании независимых транскрипционных доменов.

2.4. Куриный (З-глобиновый инсулятор

Куриный р-глобиновый инсулятор расположен на 5' конце кластера и является jiejrebiM. инсулятором, открытым у позвоночных (Chung et al., 1993). Возможно, что данный инсулятор необходим для защиты (3-глобиновых генов от влияния расположенного поблизости гена фолиевого рецептора и прилегающих к нему участков конденсированного хроматина (Bell et al., 2001). Центральная часть инсулятора длиной 250 п.н. участвует в блокировании энхансеров (Chung et al., 1997), за счет связывания с белком CTCF (Bell and Felsenfeld, 1999). Белок CTCF является и активатором и репрессором транскрипции. Этот регуляторный белок имеет ДНК-связывающий домен, состоящий из 11 цинковых пальцев. CTCF взаимодействует с последовательностью СССТС, три повтора которой находятся в центральном фрагменте, при этом увеличение числа сайтов связывания увеличивает силу инсулятора (Bell and Felsenfeld, 1999). Сайты связывания для белка CTCF были найдены в нескольких других ранее идентифицированных^ позвоночных. CTCF способен взаимодействовать со своим сайтом только на неметелированной ДНК, что используется в явлении импринтинга у позвоночных, в частности в Igß/H19 локусе (Webber et al., 1998). В аллеле, унаследованном от матери, СССТС сайт неметилирован, с ним связывается CTCF и блокирует промотор гена Igf2 от удаленного энхансера, экспрессии гена не происходит. В отцовском аллеле, наоборот, метилированное состояние сайта не позволяет белку CTCF взаимодействать с ДНК, что приводит к активации транскрипции энхансером (Bell and Felsenfeld 2000). Данный пример свидетельствует о том, что метелирование может участвовать в регуляции активности инсулятора.

Кроме способности блокировать взаимодействие между энхансером от промотором, ß-глобиновый инсулятор является эффективной границей между активным и неактивным хроматином. Было продемонстрировано, что этот инсулятор защищает транскрипцию гена в эритроидной клеточной линии цыплят, от постепенной репрессии при многократных пассажах трансформированных клеток (Pikaart et al., 1998). Более того, ß-глобиновый инсулятор защищает экспрессию гена от эффекта положения у дрозофилы, что предполагает существования у дрозофилы белка, который может связываться с этим инсулятором и обеспечивать функцию границы домена транскрипции (Chung et al., 1993). Однако в выполнении функции границы между активным и репрессированным хроматином CTCF не участвует, так как инактивация сайтов его связывания не сказывается на способности блокировать эффекты положения (Bell et al., 1999). Можно предположить, что в данном случае две функции инсуляторов локализуются вместе в одном фрагменте, но обеспечиваются разными белками.

2.5. Инсуляторы расположенные на границах регуляторных доменов гена Abd-B

Abd-B ген участвует в образовании парасегментов дрозофилы (Mihaly et al. 1998). Его уляторная область размером примерно 50 т.п.н. находится на 3' конце гена и состоит из цельных регуляторных доменов. Каждый из них содержит один энхансер iab, и регулирует прессию Abd-B гена только в одном из парасегментов дрозофилы. Энхансеры iab5-iab8 эеделяют экспрессию в парасегментах PS10-PS13 соответственно (рис. 1). При этом регуля->ные домены расположены на хромосоме в том же порядке, в котором чередуются пара-менты вдоль оси эмбриона.

1СР Fab-6 Fab-7 Fab-8

• Iab-5 (PS 10)A Iab-6 (PS 11A Iab-7 (PS 12 A

PRE WPKE WPRE PTSW с. 1. Схематичное изображение регуляторных элементов в Abd-B гене. п - парасегаенты; iab-n - энхансеры, определяющие экпрессию соответствующих парасегментов; PRE -icomb Responsible Element; черные овалы обозначают границы регуляторных доменов.

Регуляция Abd-B гена происходит в два этапа. Во время раннего эмбриогенеза гуляторные белки, отвечающие за первые этапы дифференцировки, активируют в каждом ° рястгенте определенный энхансер гена Abd-B (Busturia and Bienz, 1993; Busturia et al. 1997). шример, набор белков, присутствующих в области парасегмента PS11, способен активи-вать только iab6 энхансер, но не iab7 или iab8, что и приводит к правильному уровню спрессии Abd-B гена в парасегменте PS 11.

Установленный активный или неактивный статус регуляторных доменов в данном |расегменте поддерживается и после исчезновения первичных факторов дифференцировки

Iab-8 (PS 13) Abd-B

PRE

Mihaly et al., 1997). За это отвечают уже упоминавшиеся выше Рс-белки и их антагонисты из группы trx (tritorax). В отличие от Рс-белков, которые обладают способностью оказывать негативное влияние на экспрессию генов, trx-белки, наоборот, принимают участие в активации транскрипции. По-видимому, белки обеих групп способны связываться с одними и теми же регуляторными элементами (PRE), найденными в каждом из регуляторных доменов (Mihaly et al., 1998). Хотя механизм неизвестен, предполагается, что белки, принадлежащие к Рс- и trx-группам, стабилизируют активное или неактивное состояние энхансеров в процессе клеточных делений на уровне поддержания открытой или компактной форм хроматина, хотя пока это не доказано.

Таким образом, регуляция Abd-B гена предполагает независимость структуры хроматина различных доменов, которые должны определяться границами между ними. Существование границ между регуляторными доменами было доказано с помощью делеций, затрагивающих междоменные участки, которые приводили либо к одновременной активации, либо к репрессии двух энхансеров, находящихся в соседних регуляторных доменах (Mihali et al. 1998; Barges et al. 2000). В результате молекулярно-генетического анализа были выявлены три границы между регуляторными доменами: Мер, Fab-7 и Fab-8 (Mihali et al. 1998; Zhou et al. 1999; Barges et al. 2000). Нужно отметить, что границы, имеющие размер от 400 п.н. - 800 п.н., располагаются в непосредственной близости от PRE. Для Fab-7 и Fab-8 было показано, что они являются слабыми инсуляторами, т.е. способны блокировать взаимодействие между энхансером и промотором, но в меньшей степени, чем полноразмерный Su(Hw) инсулятор (Hagstrom et al. 1996; Zhou et al. 1996; Zhou et al. 1999). Для границы Fab-8 была также установлена способность блокировать репрессию, вызываемую Рс-белками (Barges et al. 2000).

Присутствие границ/инсуляторов между регуляторными доменами создает проблему, каким образом энхансеры, окруженные инсуляторами, способны активировать промотор Abd-B гена. Например, iab-7 энхансер 01фужен инсуляторами Fab-7 и Fab-8, но при этом участвует в активации транскрипции и определяет развитие парасегмента 12. Это противоречие было объяснено предположением, что пограничные между доменами элементы являются инсуляторами только в эктопических положениях, а в контексте гена они выполняют более тонкие регуляторные функции. Так, недавно рядом с Fab-8 инсулятором был обнаружен дополнительный регуляторный элемент, названный PTS (promoter targeting sequence), который способен нейтрализовать действие инсулятора в экспериментах с репортерными генами (Zhou et al. 1999). Предполагается, что этот элемент может осуществлять коммуникацию между iab-7 энхансером и промотором Abd-B. Делеция одного PTS влияет только локально на активность iab-7 энхансера. Возможно, что в составе других энхансеров также находятся подобные элементы. Было высказано предположение, что PTS и его возможные аналоги модулируют инсуляторную активность границ доменов, которые в результате изолируют энхансер от влияния структуры хроматина соседних доменов, но не препятствуют взаимодействию энхансера с промотором.

2.6. Механизмы действия инсуляторов

Несмотря на большой прогресс в выяснение структуры белков, определяющих функцию инсуляторов, ни одна из существующих моделей не может полностью объяснить всех известных свойств инсуляторов. Возможно, это происходит из-за отсутствия единой концепции механизма взаимодействия между регуляторными элементами на больших дистанциях (Dorsett, 1999; Udvardy, 1999; Bell et al., 2001; Geyer, 1997; Mongerald and Corees, 2001). Несомненно, что выяснение механизма взаимодействия между энхансером и промотором даст ключ к пониманию действия инсуляторов, и наоборот. В целом можно выделить две принципиально различающиеся группы моделей действия инсуляторов.

При создании модели действия инсулятора необходимо объяснить все известные свойства инсуляторов: 1) инсулятор блокирует взаимодействие между энхансером и промотором только в том случае, если находится между ними; 2) инсулятор может блокировать взаимодействие между любым энхансеруИ промотором, т.е. не существует специфичности действия инсулятора; 3) изолированные инсулятором энхансер и промотор сохраняют функциональную активность; 4) эффективность действия инсулятора прямо пропорциональна количеству сайтов связывания для одного ДНК связывающего белка. Также следует принять во внимание тот факт, что инсуляторы могут функционировать в составе плазмид (Dunaway et al., 1997) или эписом (Partiell and Geyer, 2000). При этом для эффективного блокирования энхансера в составе кольцевой плазмиды необходимы две копии инсулятора с обеих сторон от энхансера.

Одна группа моделей предполагает, что инсуляторы участвуют в организации хроматина в ядре, устанавливая домены независимой транскрипции. Существует два основных альтернативных варианта: либо белки инсулятора связываются с белками ядерного матрикса, либо с белками ядерной оболочки (Udvardy, 1999; Gerasimova et al., 2000; Mongerald and Corees, 2001). Было продемонстрировано, что сайты связывания белка Su(Hw) объединяются между собой 9 большие группы на переферии ядра и колокализуются с белком ламины, который является структурным компонентом ядерного матрикса (Gerasimova and Corees, 1998; Gerasimova et al., 2000). Однако, при интерпретации этих данных надо учитывать, что гетерохроматин дрозофилы содержит многочисленные копии МДГ4, содержащие su(Hw) инсулятор, и, возможно, именно эти сайты ответственны за образование больших скоплений белка Su(Hw). Для su(Hw) инсулятора и в меньшей степени для ses инсулятора было показано, что они способствуют взаимодействию между удаленными PRE комплексами, что можно объяснить либо взаимодействием между белками инсуляторов, либо тем что инсуляторы группируются в определенных участках ядра, тем самым сближая удаленные друг от друга участки генома (Sigrist and Pirrotta, 1997; Muller et al., 1999). С помощью этой группы моделей можно адекватно интерпретировать, что инсулятор может неспецифично блокировать взаимодействие между любым энхансером и промотором только в том случае если находится между ними. Так же объясняется то, что энхансер и промотор остаются функционально активными. С другой стороны, эта группа моделей не объясняет блокирование взаимодействия между энхансером и промотором в плазмидах. Однако нельзя исключить возможности, что для активации транскрипции плазмида должна непосредственно контактировать с ядерным матриксом.

Вторая группа моделей постулирует локальное взаимодействие между белками инсулятора и белками других регуляторных элементов (Geyer et al. 1997). Наиболее популярная модель «ловушки энхансеров» предполагает, что инсулятор это псевдопромотор, который взаимодействует с белками энхансера, что приводит к изоляции энхансера от промотора. Эта группа моделей объясняет функционирование инсулятора на плазмиде, которая не интегрирована в геном. В то же время, неспецифичность действия инсулятора и способность изолированных регуляторных элементов нормально функционировать не могут быть полностью интерпретированы с позиции этой группы моделей.

Противоречия в интерпретации механизма действия инсуляторов наиболее ярко проявились при выяснении структуры и функционирования регуляторной области гена Abd-B (рис. 1), в которой каждый энхансер ограничен инсуляторами (Mikhaly et al. 1998). В результате существует неразрешимая с точки зрения существующих моделей механизма действия инсулятров проблема, каким образом энхансер взаимодействует с промотором через один или даже несколько инсуляторов.

2.7. Возможная роль ВТВ доменов в явлении инсуляции и взаимодействиях между энхансером и промотором

Недавно были получены новые экспериментальные результаты, которые трудно объяснить с позиций известных моделей действия инсуляторов. На основе у2 мутации были получены производные мутации, связанные с инсерцией мобильного элемента hobo (Gause et al., 1998). В одной из таких мутаций энхансеры, ответственные за экспрессию гена yellow в теле и крыльях, оказались между двумя копиями МДГ 4 . Несмотря на то, что энхансеры тела и крыльев были изолированы от промотора гена yellow su(Hw) инсулятором в составе МДГ 4, они активировали транскрипцию. Объяснить этот результат можно либо спариванием между гомологичными последовательностями в двух копиях МДГ4, что приводит к выпетливанию ДНК и нарушению блокирующих функций su(Hw) инсулятора, либо взаимодействием между белками su(Hw) инсуляторов, которое нейтрализует инсуляцию. Второе предположение было подтверждено с помощью терминальных делеций в регуляторной области гена yellow (Л. Мельникова, неопубликованные данные). Следовательно, два su(Hw) инсулятора могут взаимодействовать между собой, что в некоторых случаях приводит к деблокированию энхансеров (нейтрализация действия инсуляторов).

Взаимодействие между su(Hw) инсуляторами подтверждается также другими экспериментами (рис. 6а). В конструкции, содержащей ген white, отделенный от своего энхансера двумя su(Hw) инсуляторами и геном yellow, тем не менее наблюдалась значительная активация транскрипции, которая зависила от присутствия энхансера гена white (Muravyova et al., 2001). Таким образом, два su(Hw) инсулятора и теп yellow длиной около 6 т.п.н. между ними не препятствовали взаимодействию между энхансером и промотором гена white. Более того, su(Hw) инсуляторы не только ни блокировали энхансер, но и усиливали взаимодействие между энхансером и промотором гена white. Аналогичный результат был получен в конструкции, в которой ген yellow был отделен от энхансеров тела и крыльев двумя su(Hw) инсуляторами, между которыми находился white ген. В этом случае происходила активация гена yellow энхансерами, отделенными от промотора двумя su(Hw) инсуляторами. В тоже время, если два su(Hw) инсулятора ограничивали ген yellow с обеих сторон, то изолированные энхансеры, определяющие экспрессию в теле и крыльях, были блокированы. Таким образом, определенная пространственная локализация двух su(Hw) инсуляторов может привести либо к инсуляции, либо к нейтрализации инсуляции и даже организации взаимодействия между энхансером и промотором.

Косвенным подтверждением способности белков, связанных с двумя удаленными su(Hw) инсуляторами, взаимодействовать друг с другом также свидетельствует тот факт, что Su(Hw) белок был необходим для транс- взаимодействия между репресеионными Рс-комплексами, находящихся на двух удаленных друг от друга конструкциях, которые имели в своем составе su(Hw) инсулятор и PRE элемент (Sigrist and Pirrotta, 1997; Muller et al. 1999).

Возникает вопрос, какие белки определяют взаимодействие между su(Hw) инсуляторами. Наиболее вероятно, что взаимодействие осуществляется через ВТВ домен белка Mod(mdg4) (Gause et al. 2001;). Белки, имеющие ВТВ домен, были найдены у всех хорошо изученных высших эукариот и представляют собой многочисленный класс транскрипционных факторов (Dorsett, 1999). Так, секвенирование генома Caenorhabditis elegans выявило более 100 генов, которые кодировали белки, содержащие ВТВ домен (Chervitz et al, 1998) ВТВ домен отвечает за эффективную гомополимеризацию и достаточно слабую гетерополимеризацию. Белки с ВТВ доменом часто являются репрессорами транскрипции. Было предположено, что ВТВ домен взаимодействует с деацетилазой гистонов, так как деацетилирование гистонов приводит к стабилизации нуклеосом, и вследствие этого к блокированию сайтов связывания регуляторных белков. Пока данная схема репрессии транскрипции не подтверждена, и поэтому механизм действия ВТВ домена пока остается невыясненным. Кроме того, белки с ВТВ доменами могут выполнять и другие функции, которые не связаны с регуляцией транскрипции.

Наиболее хорошо исследованным ВТВ-содержащим белком является GAGA фактор, который называется так потому, что связывается с GAGA последовательностями (Katsani et al., 1999). Сайты связывания для GAGA фактора были найдены рядом с промоторами многих генов, в частности, много сайтов присутствует в промоторной области генов теплового шока. Было показано, что GAGA фактор может вытеснять нуклеосомы из промоторной области, тем самым способствуя связыванию с промотором основных факторов транскрипционного комплекса. GAGA фактор содержит на N-конце ВТВ домен, имеющий высокую степень гомологии с ВТВ доменом белка Mod(mdg4), на С-конце белка находится ДНК-связывающий домен «цинковые пальцы» (Orihara et al., 1999). Недавно было продемонстрировано, что шесть молекул GAGA фактора взаимодействуют между собой посредством ВТВ доменов, после чего образовавшийся комплекс эффективно связывается с GAGA-сайтами, которые могут находиться на расстоянии 1-2 т.п.н друг от друга (Orihara et al., 1999). В результате этого происходит выпетливание ДНК, что можно наблюдать экспериментально. Для промотора гена engrailed было показано, что GAGA сайты, расположенные рядом с энхансером и промотором, необходимы и достаточны для их взаимодействия (Ohtsuki and Levine, 1998). Более того, в некоторых случаях GAGA сайты могут выполнять инсуляторную функцию. Косвенным подтверждением роли GAGA фактора в инсуляции является присутствие GAGA сайтов в последовательностях инсуляторов, которые разделяют регуляторные домены в Abd-B гене (Mihaly et al., 1998).

При исследовании {3-глобинового LCR (locus control region), который является сильным энхансером, способным активировать транскрипцию на больших дистанциях, были выделены сайты связывания (MARE) для маленького бежа Maf. С доменом «лейциновая молния» белка Maf связывается белок Bachl, который содержит ВТВ домен. Было продемонстрировано, что ВТВ домен Bachl белка непосредственно связывает удаленные MARE сайты (Yoshida et al., 1999). На основе сведений о ВТВ доменах Bachl и GAGA белков авторами была выдвинута гипотеза, что ВТВ домены участвуют в коммуникации между удаленными регуляторными элементами (Orihara et al., 1999; Yoshida et al., 1999).

Таким образом, дальние взаимодействия между энхансером и промотором могут поддерживаться белками, содержащими ВТВ домены. Взаимодействию между энхансером и промотором могут способствовать и белки, не содержащие ВТВ домены. Так, белок zeste, который был найден только у дрозофилы, имеет часто множественные сайты связывания в области энхансеров и промоторов. В эксперементах in vitro было показано, что zeste белок может образовывать мультимерные комплексы, что может способствовать взаимодействию между энхансером и промотором (Dorsett, 1999). В некоторых случаях zeste белок необходим для эффекта трансвекции, т.е. взаимодействия между энхансером и промотором, которые находятся на разных хромосомах. Интересно, что уже много лет назад было показано, что транскриционный фактор общего характера Spl может стягивать удаленные участки генома (Dorsett, 1999). Сайты связывания для этого фактора найдены в области промоторов многих генов млекопитающих.

Рассмотренная выше модель взаимодействия между энхансером и промотором может быть использована для объяснения механизма действия инсуляторов. Сильный инсулятор состоит из большого количества сайтов связывания для одного белка, который либо сам имеет ВТВ домен (GAGA фактор), либо с ним связывается ВТВ содержащий белок, как в случае пары Su(Hw)-Mod(mdg4). Белки с ВТВ доменами, связавшиеся с двумя инсуляторными элементами, в дальнейшем могут взаимодействовать между собой, приводя к выпетливанию ДНК между ними. В зависимости от взаимного пространственного расположения энхансера, промотора и инсуляторов образование петли может оказывать различное влияние на транскрипцию. В некоторых случаях конформация петли такова, что происходит стерическая изоляция энхансера от промотора. Обычно это может происходить в тех случаях, когда два инсулятора расположены относительно недалеко друг от друга и от блокированных регуляторных элементов. При образовании петли между двумя инсуляторами происходит чисто стерическая изоляция энхансера и промотора. В других случаях образование петли никак не сказывается на эффективности взаимодействия между энхансером и промотором. Это может происходить при увеличении расстояния между взаимодействующими инсуляторами и между инсуляторами и блокированными энхансерами и промоторами. В результате при взаимодействии между инсуляторами образуется достаточно большая петля, которая не мешает разделенным регуляторным элементам взаимодействовать друг с другом. Наконец, взаимодействие между инсуляторами при образовании петли может не только ни мешать, но и способствует образованию правильных контактов между энхансером и промотором. Этот эффект может наблюдаться, если два инсулятора находятся между энхансером и промотором. В результате взаимодействия между инсуляторами в этом случае энхансер и промотор оказываются в непосредственной близости. Таким образом, инсуляторы могут выполнять функцию регуляторных элементов, которые поддерживают взаимодействие между энхансером и промотором на больших дистанциях.

Данная модель может объяснить противоречивые данные о роли инсуляторов, как границ регуляторных доменов гена АЬс1-В. Взаимодействие между инсуляторами препятствует распространению гетерохроматина и одновременно способствует сближению удаленных регуляторных доменов с промотором гена АЬс1-В. Модель легко объясняет неспецифичное действие инсулятора на любой энхансер, зависимость силы инсулятора от количества сайтов связывания только одного белка, сохранение функциональной активности блокированного энхансера. Так же модель объясняет, почему на кольцевой плазмиде для блокирования энхансера необходимо два инсулятора, которые должны быть расположены с обеих сторон от энхансера. Только в этом случае взаимодействие между белками инсуляторов приводит к выпетливанию ДНК и стерической изоляции энхансера от промотора.

3. Материалы и методы

3.1. Генетические методы

Линии Drosophila melanogaster велись при температуре используя стандартный корм: агар, дрожжи, сахар. Скрещивания проводились в стандартных стеклянных пробирках, на одну пробирку брали 2-3 самца и 10-15 самок (Lindsley and Zimm 1992).

3.1.1. Линии и мутации Drosophila melanogaster, использованные в данной работе

Обозначения аллелей даны согласно принятой символике (Lindsley and Zimm 1992)

Линии Drosophila melanogaster y'w1"8 - лабораторная линия, несущая мутацию гена yellow с нарушенным инициаторным кодоном и мутацию гена white, представляющую собой делецию значительной его части.

FM4 - лабораторная линия с балансерной хромосомой FM4, несущая запиратели кроссинговера по первой хромосоме. y'w1118; SM5 - лабораторная линия с балансерной хромосомой, несущая запиратели кроссинговера по второй хромосоме (доминантные маркеры In(2RL),CyO). y'w1118-, TMS - лабораторная линия с балансерной хромосомой, несущая запиратели кроссинговера по третьей хромосоме (доминантные маркеры ln(3LR)TM3,Sb). su(Hw)v/TM6[su(Hwf] и XXY;sii(Hw)v/su(Hw)2 - лабораторные линии, содержащие мутации белка Su(Hw). w1118;S2CyO,FLP,ISA/Sco -линия источник сайт-специфической рекомбиназы FLP. у*щ CyO,P[w+, ere]/ScO - линия источник сайт-специфической рекомбиназы CRE. w;Sb P[ry+A2-3J(99В) е /ТМб,е - линия, полученная из Bloomington stock center, А2-3(99В) - обозначение генетической конструкции, кодирующей функциональную транспозазу Р элемента (Robertson et al., 1988). Эта линия использовалась для индукции /"-мутагенеза.

C(l) RM,yf - лабораторная линия, самки которой содержат сцепленные Х-хромосомы (XX), маркированные мутациями у и /;

Мутации, используемые в работе:

Su(Hw) v - делеция локуса su(Hw), полное отсутствие белка (Harrison et al. 1993).

Su(Hwf - точечная мутация, приводящая к аминокислотной замене в одном из цинковых пальцев и снижению сродства к ДНК (Harrison et al. 1993). su(Hw)2 ~ инсерция jockey в первый интрон, сильная мутация. (Harrison et al. 1993) mod(mdg4)ul - мутация белка Mod(mdg4), вызванная встройкой ретротранспозона Stalker в третий экзон гена, вследствии этого происходит преждевременная терминация транскрипции. Затрагивается только белковый продукт, участвующий во взаимодействии с Su(Hw) (Gerasimova et al. 1995; Gause et al. 2001). sc, sc4, sc6, sc8, cV2, ac3, sc5, sc?1, ,- мутации в achaete-scute генном комплексе, их структура и свойства описаны в Lindsley and Zimm 1992. phpl - мутация в гене pleohomeotic, индуцированная инсерцией Р элемента в транскрибируемую но не транслируюмую часть гена (Belenkaya et al. 1998).

3.1.2. Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий

ДНК конструкций и /^-элемент с дефектными инвертированными повторами, использованный как источник транспозазы, P25.7wc (Kares and Rubin 1984), были инъецированы в линию y!w1118 на стадии пребластодермального эмбриона, как описано в (Rubin and Sprandling 1982). Выжившие мухи были скрещены с линией yw1118. Так как все конструкции содержали ген miniwhite, трансгенные мухи были отобраны на основе цвета глаз. Для определения хромосомы, в которую встроилась конструкция, трансформанты последовательно скрещивались с линиями y'w1118; SM5 и y'w1U8;TM3. Линии,содержащие конструкции,были огомозигочены. Количество копий определяли методом Саузерн-блот-гибридизации, используя в качестве проб фрагменты генов yellow и miniwhite. Для исследования брались только линии, содержащие одну копию конструкции на геном.

3.1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite в трансгенных линиях

Ген yellow отвечает за пигментацию тела, крыльев и производных кутикулы. Ген miniwhite определяет пигментацию глаз. Было показано, что уровень экспрессии этих генов прямо коррелирует с интенсивностью пигментации. Таким образом, можно определять степень экспрессии данных генов с помощью простого визуального анализа фенотипа. Для анализа фенотипов трансгенных мух использовали 3-5 дневных самцов, результаты сравнивали с контрольными мухами с известным фенотипом. Уровень пигментации кутикулярных структур, отражающий степень экспрессии yellow оценивался визуально по пяти-бальной шкале, где 1 соответствует отсутствию пигмента (у1 аллель - полная инактивация гена yellow), 5 - уровню пигментации дикого типа.

Пигментацию глаз оценивали в соответствии со следующей шкалой: белые (полная инактивация гена), светло-желтые; желтые, светло-оранжевые, оранжевые, темно-оранжевые, светло-коричневые, коричневые, темно-коричневые, красные (уровень пигментации дикого типа).

3.1.4. Генетические скрещивания

Мутации в генах su(Hw) и mod(mdg4) вводились в линии, которые имели инсерцию конструкции на первой (КГ) или второй (KIT) хромосоме. Введение su(Hw) мутаций в линии, содержащие конструкцию на первой хромосоме (КГ) и мутации в AS-комплексе, проводили по следующей схеме:

F0: у^и18/К1;+/+ X С?yJwnis/Y;TM3/+

Fl: <^ywnm/yWm/; su(Hw)v/TM6[su(Hwf] XC?KI/Y;TM3/+

F2: (j> y!wIU8/KI; TM3/su(Hw)v X <Sy'wins/Y; su(Hw)v/TM6[su(Hwf]

F3: (J) ylwlll>i/Kl; su(Hw)v/TM6[su(Hwf] X C?KI/Y; su(Hw)v/TM6[su(Hwf]

Введение su(Hw) мутаций в линии, содержащие конструкцию на второй хромосоме (KII), проводили по следующей схеме:

FO: Cj>/w"/s/>V/;s; KII/+; +/+ X Cfy'wim/Y; TM3/+0

Fl: ^ylw"IH/y'wniH; KII/+; TM3/+ X cfy'w"i8/Y; +/+; su(Hw)v/TM6[su(Hwf]

F2: ^y'w,,m/y1w111H;KII/+; TM3/su(Hw)v X tfy'w1118/Y; +/+; su(Hw)v/TM6[su(Hwf]

F3: <j) yV7i%Vw; Ä7//+; su(Hw)7TM6fsu(Hw/j X 0>V"Vr; KII/+; su(Hw)7TM6[su(Hwf]

Введение мутации mod(mdg4)ul в линии, содержащие конструкцию на первой хромосоме (КГ) и мутации в AS-комплексе проводили по следующей схеме:

F0: 9 у^1П8/К1; +/+ V^ylw1U8ly'w"18; ТМЗ/+

Fl: 9 XXY; mod(mdg4)ul/mod(mdg4)ulX dkl/Y; TM3/+

F2: ^ XXY; mod(mdg4)ul/mod(mdg4)ul X dklY; TM3/mod(mdg4)ul

F3: C^XXY; mod(mdg4)ul/mod(mdg4)ul X dkl/Y; mod(mdg4)ul/mod(mdg4)ul

Введение мутации mod(mdg4)ul в линии, содержащие конструкцию на второй хромосоме (KII), проводили по следующей схеме:

Fl: QXXY; mod(mdg4)ul/mod(mdg4/lX <$ylw1U8/Y; KUh; TM3/+

F2: ^ XXY; mod(mdg4)ul/mod(mdg4)uIX (fy'w1118 IY; KII/+; TM3/mod(mdg4)ul

F3: XXY; mod(mdg4)ul/mod(mdg4)ul X <$ywim/Y; KII/+; mod(mdg4)ul/mod(mdg4)ul

Индукцию сайт-специфической рекомбинации по FRT сайтам проводили по следующей схеме, независимо от того, на какой хромосоме локализована конструкция^:

FO: (^wul8;S2CyO,FLP,ISA/Sco; \- X Oy'w1118 К

Эмбрионы второй-третьей личиночных стадий подвергались тепловому шоку при температуре 37°С в течении 1 часа два дня подряд.

К/+

Индукцию сайт-специфической рекомбинации по ШХ сайтам проводили по следующей схеме, независимо от того, на какой хромосоме локализована конструкция^:

Вырезание энхансера глаз, расположенного между БИТ-сайтами и вырезание участков связывания для белка 8и(Нш), расположенных между ШХ -сайтами, подтверждали путем ПЦР и Саузерн-блот гибридизации с зондами, взятыми из последовательностей конструкции.

Индукцию перемещения Р элемента ву*$с* аллелях, проводили по следующей схеме:

В Р0 самки с соответствующей у*хс* мутацией скрещивались с самцами м>;8ЬА2-3(99В)е /ТМ1,е. В получившихся самцов с генотипом у*.ус */У;8ЬА2-3(99В)е/+ скрещивали индивидуально с 8-10 самками С(1)ЕМ,у /. В Р2 поколении искали самцов с измененным у и/или ее фенотипом и скрещивали их индивидуально с С(1)1Ш,у/ самками для размножения и уточнения их фенотипов в следующем поколении (Р3).

Комбинации мутации рк1'1 с различными .у аллелями были получены по следующей

Б0: ^ А, Су(),Р[ч>\сге]/8сО+ X ОРуЫ118 К схеме: гдеу^'с* любая исследуемая комбинация у и ее аллелей.

F2: Самцы с генотипом y*sc*phplwa (sc+ фенотип и wa оранжевые глаза) скрещивались индивидуально с самками С(1') RM,yf для дальнейшего молекулярного анализа. В F3 анализировали у самцов степень пигментации тела, крыльев и щетинок.

3.2. Биохимические методы

3.2.1. Выделение ДНК из дрозофилы

Мух (0.1-0.12г) растирали пестиком в буфере, содержащем 0.1М Tris, рН9.0; 0.1М ЭДТА, рН8.0; 1%SDS и DEPC в концентрации 1%. Смесь выдерживали 30-40 мин. при 70°С, затем добавляли КАс (1/7V 8М КАс от объема буфера) и оставляли на 30 мин. в ледяной бане, после чего центрифугировали, ДНК экстрагировали смесью фенол-хлороформа (1:1) и хлороформом. ДНК осаждали, добавляя 0.6 Y изопропанолового спирта, промывали 70% этанолом и растворяли в деионизированной воде или 1хТЕ.

3.2.2. Саузерн-блот-анализ

Выделенную геномную ДНК дрозофилы обрабатывали рестрицирующими эндонуклеазами в стандартных условиях, потом разделяли в горизонтальном 0,7% агарозном геле в 1х трис-ацетатном буфере (ТАЕ: 40 мМ трис-HCl, рН 7.6; 5 мМ ацетат натрия, 2 мМ ЭДТА). В качестве маркеров молекулярного веса фрагментов ДНК использовалась ДНК фага Л, обработанная рестриктазами HindIII или PstL Затем гель депуринизировался либо путем вымачивания 20-30 мин. в растворе 0,25 н НС1, либо 3-5 мин. экспозицией на трансиллюминаторе при коротковолновом UV-освещении, каппилярный перенос проводился в 0.4 н NaOH в течение 12-18 ч. на мембрану Hybond-N+, затем фильтр нейтрализовался 1-3 мин. в 5х SSC.

Гибридизацию блотов с меченой ДНК зондов осуществляли по стандартной методике (Sambrook et al. 1989). Фильтры инкубировали 0.5-1 ч. при 65°С в предгибридизационном растворе (0.1% БСА, 0.1% фикола, 0.1% PVP, 4xSSC, 0,2%SDS). Гибридизацию проводили при 65°С 6-18 ч. в растворе того же состава, что и для предгибридизации, но с добавлением денатурированного 32Р-ДНК зонда. Радиоактивные зонды готовились методом статистической затравки (Sambrook et al. 1989), используя меченые а[32Р]-дАТФ (ИМБ РАН, Москва). Отмывка фильтров выполнялась по схеме 30 мин. в растворе 2xSSC и 0,1% SDS при температуре 65°С, затем 30 мин. в растворе lxSSC и 0,1% SDS, затем 30 мин. в 0,lxSSC с 0,1% SDS. Далее фильтр подсушивали, заворачивали в Saran Wrap, экспонировали с рентгеновской пленкой Retina х ray в кассете с усиливающим экраном ЭУИ-1.

3.2.3. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Для получения фрагмента Su(Hw) инсулятора в качестве матрицы использовали 50 нг ДНК транспозона ЩГ4 и праймеры Sul CTGGCCACGTAATAAGTGTGCG и Su2 GGTTGGCACACCACAAATATACTG. Для проверки вырезания ДНК фрагмента по FRT сайтам использовались праймеры yl GGCTTTGCTTTCCGCCCAAGTT и у2 CAACATCAGCGGAGCGCGCTAA, матрицей служила геномная ДНК, выделенная из линий, полученных после индукции сайт-специфической рекомбинации.

Для клонировния мест стыка между последовательностями Р элемента и дупликацией теш yellow использовали следующие праймера из

Р элемента: Р1: 5'- CGTCCGCACAACCTTTCCTCT-3' yellow: Yl: 5'-CCGCCAATTCAGGCAATGTAG-3'

Программа ПЦР-амплификации включала следующие циклы: первый - 94°С 3 мин., 30 циклов поЗО сек. при 94°С, 30 сек. при 55-68°С (температура зависит от Тт праймеров) и 30 сек. при 72°С, последний - 4 мин. при72°С. Продукты амплификации анализировались электрофорезом в 1.5% агарозном геле в 1х ТАЕ-буфере. Амплификация проводилась на приборе фирм Techne РНС-3 или Perkin-Elmer2400.

3.2.4. Секвенирование плазмид и ПЦР продуктов

Первичную последовательность ДНК определяли по методу Сэнгера (Sanger et al., 1977), используя набор Sequenase II (фирмы Amersham) для секвенирования плазмид и ПЦР продуктов. Форез проводили в 6% полиакриламидном геле в lxGTGB буфере (10 мМ трис основной, 3 мМ таурин, 0.05 мМ ЭДТА).

3.2.5. Молекулярное клонирование

Рестрикция ДНК, тупление концов и дефосфорилирование фрагментов ДНК, лигирование ДНК проводили по стандартным методикам (Sambrook et al. 1989). Выделение фрагментов ДНК из агарозы и очистка ДНК от продуктов ферментативных реакций осуществлялась с помощью наборов QIAquick PCR Purifacation Kit и QIAquick Gel extraction Kit (фирмы QIAGEN).

3.2.6. Трансформация бактериальных клеток плазмидами

Для наращивания плазмид для дальнейшего молекулярного анализа использовались клетки E.coli: штамм DH-5a. Компетентные клетки готовили по стандартной методике, с использованием стандартных растворов (Sambrook et al. 1989), с последующим замораживанием в жидком азоте и хранением при -70°С. Для трансформации клетки размораживали в ледяной бане. К 200мкл клеток добавляли не больше 20 мкл лигазной смеси или 0,01мкг ДНК плазмиды и инкубировали 15-30 мин. при 0° С. Затем на 1.5 мин. пробирку помещали на 42°С и после добавления 1мл среды ЬВ, инкубировали 30 мин. при 37°С. Аликвоту высевали на чашки с ЬВ-агаром с ампициллином (до концентрации 20-60 мкг/мл ЬВ-агара) и инкубировали ночь при 37° С.

3.2.7. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса

Выросшую на ампициллиновой чашке колонию переносили в колбу с 3 мл среды ЬВ с ампициллином и выращивали в течение ночи на качалке при 37°С. 2мл среды с клетками центрифугировали 1 мин. при 12000 об/мин при 4° С. Осадок суспендировали в 200 мкл лизирующего буфера (50мМ глюкоза, 25мМ Трис-НС1, рН8,0; ЮмМ ЭДТА) и инкубировали при комнатной температуре. Затем добавляли 400 мкл денатурирующего буфера (0,2М ЫаОН; 1% БВБ) и инкубировали 5мин. при 0°С. Далее добавляли предварительно охлажденный 300 мкл 7,5М раствор N114Ас и инкубировали 5 мин. при 0°С. Центрифугировали 5 мин. при 12000 С об/мин^ при 4°С. Супер переносили в новую пробирку, добавляли 0,6У изопропанола и оставляли в течение 10 мин. при комнатной температуре. Проводили еще одно центрифугирование при 12000 об/мин. К осадку добавляли 100 мкл 2М №ЦАс, рН 7.4, встряхивали, оставляли в ледяной бане на 5 мин. После центрифугирования отбирали супер, осаждали ДНК равным объемом изопропанола, осадок промывали 70% этанолом, растворяли в 1хТЕ.

3.2.8.

Анализ связывания белка Su(Hw) с фрагментами ДНК in vitro

Анализ связывания белка с ДНК

Для получения 8и(Н\у)-связывкяцего белка в плазмиду ET 30а, была клонирована его кДНК. Ранее показано (Spana C.et. al.Genes Dev. 2:1414-1423, 1990), что экспрессия данного

OL гена в клетках Е.соН отрицательно сказывется на их жизнеспособности; (видимо промежуточные и конечные продукты экспрессии обладают цитотоксическим действием), поэтому мы использовали искусственную белоксинтезирующую систему (Promega, Cat. No LI 170, kit-TNT-T7).

Связывание с белком.

Плазмидная ДНК, содержащая^предполагаемые Su(Hw) связывющие фрагменты, обрабатывалась рестриктазами. Выделенные фрагменты, с выступающее 5'-концами, метили P32dNTP с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli ( Maniatis et.al.1982). Реакция связывания была выполнена в 25ц1 (15mM HEPES (рН7.6), ЮОтМ KCl, 5тМ MgCl2, 100 цМ ZnCb, 5 тМ DTT, 10% глицероле, и 5jtg poly [d(I-C)]) и содержала 5 jug экстракта белка и 0.5-lng меченого фрагмента. В качестве отрицательного контроля была использована Н20. Каждый фрагмент был проверен на связывание с лизатом. После 10 мин. инкубации при 4°С пробы были внесены в 5% полиакриламидный гель. Электрофорез проводили в lxTBE-буфере (Garner,M.M.and Revzin 1981. Nucleic Acids Res. 9: 3047-3060.)

3.2.9. Создание конструкций

Фрагмент ДНК длиной 430 п.н., содержащий 8и(Н>у)-связывающий район (su), был получен методом ПЦР с использованием в качестве матрицы ДНК транспозона МДГ4. Полученный ПЦР-фрагмент был секвенирован для подтверждения его нуклеотидной послецовательности. Затем su фрагмент был субклонирован в вектор CaSpeR3 (СЗ-su) и в плазмиду pSK совместно с фрагментом EcoRI-Bglll длиной 1.5 т.п.н. из второго экзона тепа yellow (F-su).

Структура и экспрессия гена описаны ранее в (Geyer and Corees 1987). 7.5 т.п.н. фрагмент, включающий ген yellow, был любезно представлен доктором Р. Geyer. Фрагмент BamHl-Bglll длиной 4.5 т.п.н., содержащий кодирующую часть гена (кч), был субклонирован в вектора CaSpeR3 oj>€aSpeR3-su (СЗ-кч or C3-su-K4). Фрагмент SaR-BamHl длиной 3 т.п.н., содержащий регуляторную часть гена yellow, был субклонирован в pGEM7 по рестриктазам BamHI и Xhol (рч).

135 п.н. ДНК фрагмент, исследуемой на предмет способности функционировать как инсулятор (135) или его 3 копии (135x3) клонировали в плазмиду между LOX сайтами (1ох(135)) или (lox(135x3)). Далее полученный фрагмент переклонировали в положение -893 перед точкой начала транскрипции по сайту Eco47III, при этом получилась плазмида рч-(lox(135x3)-893) или рч- (1ох(135)-893).

Регуляторная последовательность гена miniwhite длиной 700 п.н., содержащая энхансер глаз, была любезно предоставлена доктором V. Pirrotta (Женевский университет, Швейцария). Она была субклонирована в вектор на основе pSK между двумя FRT сайтами frt(Enwh), а затем фрагмент frt(Enwh) встраивали в плазмиду рч в положение -1868 перед точкой начала транскрипции по сайту Bglll (p4-frt(Enwh))H в p4-su(-893) по сайту Aor 51Н1 (p4-frt(Enwh)-su(-893)).

Конструкция Ey(Enwh)(135)YSW: ДНК фрагмент рч-(1ох(135)-893) был клонирован в СЗ-кч по рестриктазам Xbal-BamHI.

Конструкции Ey(Enwh)(135x3)YSW: ДНК фрагмент p4-(lox(135x3)-893) был клонирован в СЗ-кч по рестриктазам Xbal-BamHI.

Примечания: в названиях конструкций полукруглыми скобками обозначены фрагменты, окруженные сайтами для рекомбиназ.

4. Результаты

4.1. Получение производных y*ssc+ линии в результате индукции транспозиций Р элемента

Для работы были использованы ген yellow и соседний с ним achaete-scute генный комплекс (AS-C). Ген yellow экспрессируется на стадии средней-поздней куколки, что определяет пигментацию кутикулы дрозофилы. Энхансеры, активирующие yellow в теле и крыльях расположены в 5' регуляторной области гена. В интроне локализован энхансер, который обеспечивает пигментацию щетинок (Geyer and Corees 1987).

Гены ас и sc отвечают за развитие периферической нервной системы и за формирование органов чувств-щетинок и волосков. Экспрессия ас и sc генов активируется набором энхансеров, каждый из которых влияет одновременно на оба гена в определенной области имагинального диска, что определяет развитие только одного типа щетинок (Gomez-Skarmeta et al., 1985).

В основе данного исследования лежит анализ производных y2ssc+s линии, которая содержит мутации в соседних локусах yellow и scute (sc+s) (рис.2, За).

Эти мутации возникли одновременно в результате транспозиций Р элемента в исходной y2s линии. Источником транспозазы служила линия, несущая р 2-3 конструкцию (Robertson et al. 1988). Исходный аллель у2" имеет инсерцию мобильного элемента МДГ4 в регуляторную область гена yellow в позиции -700 п.н. по отношению к его старту транскрипции (рис. 2, За). МДГ4 содержит в 5' транскрибируемой нетранслируемой области сильный инсулятор, состоящий из 12 сайтов связывания для белка Su(Hw) (Mazo et al. 1989). Этот инсулятор блокирует взаимодействие между энхансерами тела и крыльев и промотором гена yellow (Geyer it al. 1986). В результате мутации у28 возникает фенотип: желтое тело и крылья и пигментированные щетинки.

Mflr4S»fflw)

У1

Х>

Эн-крЭн-т '' Эн-Щ L

Рис. 2 Схематичное изображение у2 мутации.

Начало и направление экспрессии гена yellow показаны стрелкой. Толстая линия определяет экзоны гена yellow. Эн.кр., эн.т., эн.щ.,- энхансеры, которые определяют экспрессию данного гена в крыльях, теле и щетинках, соответственно; su(Hw) - это su(Hw)-HHcyjMTOp, находящийся в 5'-области мобильного элемента МДГ4. В у2 -мутантах 8и(Н\¥)-инсулятор блокирует взаимодействие между промотором гена yellow и энхансерами тела и крыльев.

В производной y2ssc+s линии y2s мутация содержит дополнительно инсерцию Р элемента длиной 1,2 т.п.н. (Р1), который встроен в положении -69 п.н. относительно начала транскрипции гена yellow, и две копии Р элементов (Р2 и РЗ) в ориентации "голова-к-голове" (рис. 2а.). Р2 и РЗ расположены между областью, содержащей гены ас и sc, и районом, где находится большая часть активирующих их энхансеров. Данные Р-элементы (Р2, РЗ) практически не влияют на экспрессию генов AS-C, что выражается в .«^-фенотипе.

После мобилизации Р-элемента по методике (см. разд. 3.1.4.) в потомстве, наряду с другими мутациями, были независимо получены 4 дупликации последовательностей из района гена yellow в AS-C, в которых происходили изменения лофенотипа (рис. 3, 4). В трех производных возникали слабо выраженные sc1 фенотипы, а в одном случае - сильный мутантный яс-фенотип. Они были обозначены номерами от 1 до 4. В слабых 5с'(1-3) мутантах было нарушено развитие только AOR и HU щетинок. В то время как в sc(4) мутанте было частично или полностью супрессированно развитие большинства щетинок:Ни, AOR, ANP, PV,

ОС, PS, АРА, ASA, SC (см. номенклатуру щетинок на рис.4).

Для выяснения молекулярной структуры производных были выполнены блот-гибридизация по Саузерну, ПЦР-амплификация, клонирование и секвенирование амплифицированного продукта. Саузерн блот-гибридизация показала, что все производные связаны с дупликацией гена yellow между последовательностями Р элементов в AS-комплексе (рис. ЗЬ). При этом стуктура самих Р-элементов не менялась. a) v2ssc+: yellow ас so» -5—► —> Р1,Р2

Т-ГГ~1-П-П-1 I I

S PR Р НХ НН RP S

Ь)

SC% 1) sc\2) sc (4)

Р2 дчушикация yellow ^ р2

РЗ п—m—п-п

S PR Р НХ HB

У1>

1-П-г н rp s sc\ 3)

Р2 р2^ дугаисация yellow

РЗ п-гт~1-гт"

S PR Р НХ

Т н у1

I Г" Вн п г rp s

Название производной Размеры дупликации гена yellow Координаты EG:125H10.4 sc,s(D 3904 18488 scls(2) 4778 19362 scls(3) 3890 18474 sce(4) 5620 20204

Рис. 3 Схематическое изображение j^se^5 мутации и ее производных с дупликацией гена yellow. а) Изображение y2ssc:s мутации. Р-элементы представлены в виде прямоугольников. Ориентация Р-элементов показана стрелками. Аббревиатура эндонуклеаз: R - EcoRI; Н - Hindlll; G - Bglll; X - Xhol; В - ВатШ; S - Sali; Р - Pstl. Фрагменты геномной ДНК, используемые для гибридизации HindIII-ВатШ {yellow) и EcoRI-Bglll (AS-C), отмечены черными прямоугольниками. Черными треугольными стрелками указано примерное расположение праймеров, которые использовались для ПЦР-амплификации геномных фрагментов и секвенирования.

Ъ) Дупликации гена yellow в производных y2ssc's мутанта. Места разрьгеов пронумерованы в соответствии с шубликованным полным сиквенсом гена yellow в составе клона EG:125H10.4 (Европейский проект определения тервичной последовательности Д1Ж первый хромосомы Drosophila melanogaster). Стыки между 3' концом 1упликащга yellow и РЗ-элементом были клонированы при помощи ПЦР и секвенированы. геНО"ГУ!ПЫ AORANP HU PV ОС PS APA ASA SC sd*(1-3); +/+ В Б ■ □ □ □ □ □ □ su(Hwf/su(Hw)v s И ■ □ □ □ □ □ □ mod(mdg4)"1/mod(mdg4)"1 m Ш ■ □ □ □ □ □ □ sce (4); +/+ m а ■ □ в ■ ■ ■ в su(Hw)2/su(Hw)v и н ■ □ □ □ □ □ □ mod(mdg4f/mod(mdg4)u1 и в ■ □ □ □ □ □ □

Рис. 4 Фенотипы sc мутаций у самцов и их взаимодействие с мутациями по генам Su(Hw) и mod(mdg4).

Представлена стандартная номенклатура щетинок (LINDSLEY and ZIMM 1992): HU, humerals; ASA, anterior supra-alars; APA, anterior post-alars; PS-prescutellars AOR, anterior orbitals; ОС, ocellars; PV, postverticals; ANP, anterior notopleurals; SC, scutellars, MC, microchaetae, PSA, posterior supra-alars; На рисунке показаны только измененные щетинки. Полые квадраты означают наличие данной щетинки (дикий тип). Квадраты, заполненные на одну четверть, наполовину и полностью, означают, что соответствующие щетинки отсутствуют на 10, 50 и 90 процентов. Для scutellars прямоугольники, закрашенные на четверть, наполовину или полностью, означают 3-4, 2-3 или 0-1 scut el lar щетинок соответственно. Количество щетинок было определено как среднее среди ста проанализированных мух. mod(mdg4)ul- мутация в гене mod(mdg4), которая инактивирует связывание Mod(mdg4) белка с Su(Hw) белком. su(Hw)v/su(Hw)2- комбинация мутаций в гене su(Hw), которая приводит к почти полной инактивации Su(Hw) белка.

Дупликации гена yellow в производных 1-3 в район между энхансерами и промоторами ас и sc генов приводили только к слабой инактивации транскрипции в ^-комплексе. Возможно, активный промотор теш yellow частично перехватывает сигналы от энхансеров AS-комплекса, ответственных за развитие Нщ AOR и ANP щетинок. Сравнительно слабый эффект промотора теш yellow можно объяснить тем, что большинство энхансеров ^¿¡"-комплекса могут отличать "свои" промоторы от "чужих". Механизм данного явления пока неизвестен.

Саузерн-блот анализ sce(4) производной выявил, что мутация также вызвана дупликацией последовательностей гена yellow между Р элементами в ^-комплексе. Как и в случае sc мутантов, оба Р-элемента, находящиеся на краях дупликации, сохранили свою целостность (рис. 3). Для выяснения размера дупликации в этой производной, районы соединения Р-элементов и дуплицированного гена yellow были амплифицированы с помощью

1ЦР и клонированы в вектор PUC19. В результате секвенирования стыка гена yellow и Р-элемента оказалось, что в данном случае дупликация имеет размер на 842 п.н. больше чем в scl '2) производной, имеющей максимальный размер дупликации. Так как sc(A) аллель имеет структуру аналогичную 5с'-производным и отличается только увеличением размера аупликации, можно предположить, что именно данная (842п.н). последовательность, расположенная между генами yellow и ас, отвечает за сильный мутантный фенотип в sc линии.

В результате компьютерного анализа первичной последовательности 842 п.н. фрагмента ДНК были обнаружены два сайта, которые имеют более 60% гомологии с Su(Hw) связывающими участками в МДГ 4 (рис. 5). Для проверки возможной роли белка Su(Hw) в инактивации генов ^-комплекса были получены комбинации sc-мутаций с Su(Hw)v /Su(Hw)2 гетерозиготой, в которой происходит почти полная инактивация su(Hw) гена (Harrison et al. 1993). Su(Hw) мутации не влияли на фенотип scls -мутантов (рис. 4). В то же время, комбинация мутаций Su(Hw)v/Su(Hw)2 супрессировала мутантный фенотип sc до фенотипа сходного со слабыми sc1 аллелями. Этот результат позволяет предположить, что именно белок Su(Hw) индуцирует проявление мутантного фенотипа в полученной sce(4) производной. Мутация в другом гене mod(mdg4), белковый продукт которого взаимодействует с белком Su(Hw), также приводит к супрессии мутантного sc фенотипа в той же степени, что и su(Hw) мутации. В то же время mod(mdg4)ul мутация не влияет на sc'-производные. Следовательно, белок Mod(mdg4) также нужен для репрессии транскрипции генов Л ¿»-комплекса в sce( 4) мутанте.

Таким образом, в районе между генами yellow и ас находятся два функциональных сайта для белка Su(Hw). гена

Su(Hw)-l

-- (19710)-- TCCTAATTTCCTTACTTßTÄTTGCCTjACTT

TTTTGCGAGGGACTTCTATTGGCCAGTATA

TATTATG|TGTTGCAT4CTCTTGGTCACAGC-(19800)- энхансеры

Su(Hw)-2 гена achaete.

ЯНЫЙ Su(Hw)-1 лный Su(Hw)-2

T A T T G С C T А С

Т G T T G С A T A C ценный Su(Hw) в МДГ-4 С/Т A/G T T G С А T А С/Т Сайты связывания Su(Hw) белка в гене yellow. сайта связывания для Su(Hw) белка, подчеркнуты, находятся между генами yellow и ас. шение геномных сайтов с усредненным сайтом связывания для белка Su(Hw) в МДГ4.

2. Анализ способности сайтов связывания с белком Su(Hw), находящихся в 135 п.н. фрагменте, блокировать взаимодействие между энхансером и промотором генов yellow и white в трансгенных линиях

Ранее было показано, что Su(Hw) инсулятор, содержащий 12 сайтов связывания для i Su(Hw), является сильным инсулятором, который полностью блокирует взаимодействие [у энхансером и промотором генов yellow и white (Geyer and Corees 1992; Roseman et al. ). Делеция хотя бы части сайтов связывания белка Su(Hw) приводит к сильному шению инсулятора. Анализ количества участков связывания и эффективности инсуляции *ал, что для инсуляции необходимо как минимум 4 сайта связывания для белка Su(Hw) ;t and Geyer 1999). Для выяснения эффективности двух,нами обнаруженных сайтов лвания были проведены исследования в регуляторных системах генов yellow и white.

Для подробного изучения этого явления была создана модельная система с использованием трансгенных конструкций. Энхансер, обеспечивающий экспрессию гена white 'Pirrotta et al. 1985), был встроен между энхансерами тела и крыльев гена yellow. В присутствии знхансера гена white глаза обычно окрашены в ярко красный цвет, а в его отсутствии глаза мух имеют желтый или оранжевый цвет, что соответствует базовому уровню транскрипции данного гена. Для сравнения уровня экспрессии в присутствии и отсутствие энхансера, последний был помещен между FRT- сайтами для дрожжевой рекомбиназы Flp.

В качестве 8и(Н\у)-инсулятора использовался фрагмент, полученный с помощью ПЦР на матрице МДГ4 длиной 430 п.н., содержащий 12 сайтов связывания для белка Su(Hw). Данная последовательность была встроена между генами yellow и white. Ранее было показано, что если два МДГ4 инсулятора находятся между энхансером и промоторм, то взаимодействие между белками, которые связываются с последовательностями инсулятора, приводит не к блокированию, а наоборот к усилению взаимодействия между энхансером и промотором (рис. 6а) (Muravyova et al. 2001). Для изучения эффективности действия найденных двух сайтов связывания для белка Su(Hw) был использован этот эффект нейтрализации.

Для сравнения эффективности блокирования энхансеров 135 п.н. геномным фрагментом и Su(Hw) инсулятором из МДГ4 была использована, созданая ранее Муравьевой Е, контрольная конструкция Ey(Enwh)(S)YSW (рис. 6а), содержащая два полноразмерных Su(Hw) инсулятора из МДГ4: один между группой энхансеров и промотором гена yellow, а другой -между генами yellow и miniwhite . В результате один Su(Hw) инсулятор разделял энхансер и промотор TQtia yellow и два - энхансер и промотор гена miniwhite. a) Ey(En-Wh)(S)YSW

En

En-w vVh En-b

FRT FRT yellow min ¡white su(Hw) su(Hw) => LOX LOX b) Ey(En-Wh)(135)YSW

En

En-w Wh En-b

FRT FRT c) Ey(En-Wh)(3x135)YSW yellow miniwhite su(Hw) e=> 135 b.p. => LOX LOX

En-w

En

Wh En'b

FRT FRT yellow miniwhite su(Hw) 3x135 b.p.=i> LOX LOX

Рис. 6 Схема конструкций: a)Ey(En-Wh)(S)YSW, b)Ey(En-Wh)(135)YSW, c)Ey(En-Wh)(3xl35)YSW.

En-w, En-b - энхансеры, контролирующие экспрессию yellow в крыльях и теле соответственного-Wh-энхансер, контролирующий пигментацию глаз, su(Hw)-su(Hw)-инсулятор из МДГ4\ прозрачными вытянутыми прямоугольниками обозначены гены yellow и miniwhite. FRT, LOX-участки для сайт-специфических рекомбиназ. Черными треугольниками обозначены концы Р-элемента, необходимые для интеграции конструкции в геном.

При трансформации этой конструкции в геном мух было получено 14 линий, содержащих единственную копию конструкции (табл. 1). Во всех линиях экспрессия гена yellow была блокирована инсулятором и восстанавливалась при инактивации белка Su(Hw). В то же время глаза мух большинства линий имели темную окраску: красную или коричневую, что свидетельствует об активации транскрипции гена miniwhite. Чтобы показать, что за активацию ответственен энхансер глаз, в линиях была индуцирована сайт-специфическая рекомбинация по FRT-сашаи. Во всех исследованных случаях отсутствие энхансера приводило к заметному снижению пигментации глаз. пица 1. Экспрессия генов yellow и white в Ey(Enwh)(S)YSW трансгенных линиях. авание нструкции Число трансгенных линий пигментация кутикулярных структур тела крыльев ! пигментация глаз пигментация глаз в отсутствии энхансера глаз

Enwh)(S) >W 1 2(5) 2(5) ^ красный (коричневый) ; оранжевый

2 2(5) 2(5) красный (оранжевый) оранжевый

2 2(5) 2(5) красный (красный) I —'

1 ! 2 2 ' красный оранжевый

1 2 2 красный > '—

1 2(5) 2(5) коричневый (оранжевый) ; оранжевый

1 2(5) 2(5) коричневый (темно-оранж.) желтый

1 2 (5) 2(5) коричневый (оранжевый) ; —

2 2 ! 2 коричневый : — ■

2 2 2 ■ оранжевый ; . значения. Пигментация тела и крыльев описана по пятибальной шкале (5 баллов соответствуют дикому типу), а юку глаз по девяти бальной шкале: белые, светло-желтые, желтые, темно-желтые, оранжевые, темно-мсевые, коричневые, темно-коричневые, красные. В скобках представлены описания пигментации тела, 1ьев и глаз на фоне мутаций su(Hw)f/su(Hw)v

Для исследования эффективности действия инсулятора было создано 2 конструкции, в орых использовались 1 и 3 копии 135 п.н. фрагмента ДНК, содержащего два сайта Su(Hw) ;.5 Ь, с) Для выяснение их участия в регуляции экспресии, эти фрагменты ДНК были ужены LOX сайтами для дрожжевой Сге-рекомбиназы. Сге-рекомбиназа индуцирует >езание фрагмента ДНК, который находится между двумя ¿ОХ сайтами. Далее 135 фрагмент En-wh)(135)YSW (рис. 6Ь) и его трехкратное повторение Ey(En-wh)(3xl35)YSW (рис 5с) м встроены в положение -893 п.н. относительно точки начала транскрипции теш yellow, оду энхансерами тела и крыльев и промотором данного гена. Дополнительно норазмерный инсулятор МДГ4 был встроен между генами yellow и while. Предполагалось, что эффективность действия инсулятора будет измеряться по степени нейтрализация блокирующей активности полноразмерного Su(Hw) инсулятора на энхансер гена white и по степени блокирования энхансеров тта yellow.

Конструкция Ey(Enwh)(135)YSW была интегрирована в геном Drosophila melanogaster, в результате получили 12 независимых линий, содержащих, согласно блот-анализу по Саузерну, единичные копии конструкции (табл. 2). Анализ фенотипов полученных линий показал, что экспрессия yellow в теле и крыльях подавлена, как и в контрольных Ey(Enwh)(S)YSW линиях, содержащих полноразмерный инсулятор. При введении мутаций su(Hw) V/TM6, su(Hwf, приводящих к значительному снижению количества белка Su(Hw), пигментация восстанавливается до уровня дикого типа во всех семи исследуемых Ey(Enwh)( 13 5)YSW линиях. Следовательно, два сайта Su(Hw), заключенных в 135 п.н., фрагменте имеют такой же сильный эффект на энхансеры гена yellow как и полноразмерный Su(Hw) инсулятор. При этом вся инсуляции определяется связыванием белка Su(Hw).

В 9 из 12 Ey(Enwh)(135)YSW линий яркая окраска глаз предполагает, что глазной энхансер активирует промотор гена white через два инсулятора (таб.1). Для прямого доказательства роли глазного энхансера он был удален в результате рекомбинации между FRT сайтами. Делеция энхансера в Ey(En-Wh)(135)YSW линиях подтверждалась с помощью ПЦР амплификации ДНК фрагмента между праймерами, расположенными с двух сторон от энхансера white. В результате делеции глазного энхансера в шести линиях мы наблюдали сильное ослабление пигментации глаз до уровня, который характерен для экспрессии гена white в отсутствии глазного энхансера. Интересно отметить, что при введение Su(Hw) мутаций в некоторых Ey(Enwh)(135)YSW линиях происходит уменьшение пигментации глаз (линии 1, 2, 3, 5, 6, 7) (табл. 2), что предполагает участие белка Su(Hw) в поддержании взаимодействия между энхансером и промотором гена white при наличии двух Su(Hw) инсуляторов.

Аналогичные результаты были получены ранее при анализе взаимодействия между двумя полноразмерными Su(Hw) инсуляторами (Muravyouva et al. 2001). Наконец, для прямой демонстрации роли 135 п.н. фрагмента, он был делетирован в результате индукции рекомбинации между LOX сайтами во всех пяти исследованных линиях (табл. 2). Рекомбинация между LOX сайтами была подтверждена с помощью ПЦР амплификации фрагмента ДНК между праймерами, которые расположены с обеих сторон от места инсерции 135 фрагмента (-839 п.н. от точки начала транскрипции гена yellow). Фенотип таких Ey(Enwh)(A135)YSW производных был сравнен с фенотипом исходных Ey(Enwh)(135)YSW линий. В результате вырезания 135 фрагмента происходило полное блокирование энхансера глаз и полное восстановление пигментации тела и крыльев. Следовательно- 135*фрагмент блокирует взаимодействие между энхансерами и промотором гена yellow и одновременно полностью нейтрализует действие полноразмерного Su(Hw) инсулятора. Таким образом два сайта для Su(Hw) белка, содержащиеся в 135 п.н. фрагменте, обладают действием, сравнимым с полноразмерным Su(Hw) инсулятором из МДГ4, который содержит 12 сайтов связывания для белка Su(Hw).

Таблица 2. Экспрессия генов yellow и white в Ey(En-Wh)(135*)YSW трансгенных линиях. конструкци л ~ - ----- iy/w su(Hw)+ su(Hw)" ASu(Hw)* AEn(w)

V- y(b/w) 2/2 4/5 5/5 2/2 w красные темно-коричневые оранжевые оранжевые

2,3 y(b/w) 2/2 5/5 5/5 2/2 w темно-коричневые темно-оранжевые желтые желтые

4 y(b/w) 2/3 5/5 5/5 2/3 w темно-коричневые темно-коричневые оранжевые оранжевые

5,6 y(b/w) 2/3 4/5 4/5 2/3 w коричневые темно-оранжевые темно-желтые. темно-желтые.

7 y(b/w) 2/2 5/5 5/5 2/2 w красные коричневые темно-оранжевые темно-оранжевы

8 y(b/w) 2/2 ND ND ND w темно-коричневые

9 y(b/w) 2/3 ND ND ND

W коричневые

10 y(b/w) 2/2-3 ND ND ND w темно-оранжевые

11,12 y(b/w) 2/2-3 ND ND ND w оранжевые

Обозначения. ND - не определено. su(Hw) - комбинация su(Hw)f/su(Hw)v мутаций; ASu(Hw)* - деяеция 135 п.н. фрагмента; AEn(w) - делеция глазного энхансера. Пигментацию тела и крыльев оценивали по пяти бальной шкале (5 баллов соответствуют дикому типу), а окраску глаз по девяти бальной шкале: белые, светло-желтые, желтые, темно-желтые, оранжевые, темно-оранжевые, коричневые, темно-коричневые, красные.

В трехкратном 135 п.н. фрагменте (135x3) содержится уже 6 сайтов связывания для белка Su(Hw). Конструкция Ey(Enwh)(135x3)YSW была интегрирована в геном Drosophila melanogaster, и в результате было получено 6 независимых линий, содержащих, согласно блот-анализу по Саузерну, единичные копии конструкции (табл. 3). У всех 6 трансформантов наблюдали полную инактивацией гена yellow в теле и крыльях, как и в в случае Ey(Enwh)(135)YSW трансформантов. При введении мутаций su(Hw)v/TM6[su(Hwf и при делеции 135 п.н х 3 фрагмента пигментация тела и крыльев восстанавливается до уровня дикого типа. Эти результаты подтверждают способность данного фрагмента ДНК блокировать энхансеры и связывается с белком Su(Hw). Полученные трансформанты имеют яркую пигментацию глаз, что говорит о нейтрализации инсуляции. При делеции глазного энхансера наблюдалось снижение пигментации глаз.

Таким образом, полученные данные показывают, что 135 п.н. фрагмент обладает примерно такими же свойствами, как и полноразмерный Su(Hw) инсулятор.

Таблица 3. Экспрессия генов yellow и white в Ey(w)(3xl35*)YSW трансгенных линиях конструкции y/w su(Hw)+ su(Hw)- ASu(Hw)* AEn(w)

1 y(b/w) 2/2 4/4 4/4 4/4 w красные оранжевые темно- темножелтые желтые

2 y(b/w) 2/2 5/5 5/5 2/2 w красные темно- оранжевые оранжевые коричневые

3 y(b/w) 1/1 5/5 5/5 1/1 w красные оранжевые желтые желтые

4 y(b/w) 1/1 5/5 5/5 1/1 w темно-коричневые темно-коричневые темно-оранжевые темно-оранжевые

5 y(b/w) 2/3 ND 4/4 2/3 w темно-коричневые оранжевые оранжевые

6 y(b/w) 2/2 ND ND ND w темно-коричневые

Обозначения, см. табл. 2.

4.3. Su(Hw) белок связывается с каждым из двух сайтов 135 п.н. фрагмента in vitro

Полученные данные предполагают, что геномный фрагмент (135 п.н.), содержащий только два сайта связывания для бежа Su(Hw), является сильным инсулятором. Этот результат противоречит другим более ранним исследованиям для 8и(Н\у)-связываюших сайтов в МДГ4, которые показали, что для инсуляции необходимо как минимум 4 участка связывания. Для объяснения этого противоречия можно предположить, что сайты связывания в полноразмерном Su(Hw) инсуляторе (MDG4) не являются оптимальными. Для выяснения эффективности обоих сайтов связывания Su(Hw) в 135 п.н. фрагменте был проведен анализ связывания Su(Hw) белка с фрагментами ДНК in vitro. С этой целью Su(Hw) белок был наработан в трансляционной системе. Каждый из двух сайтов связывания белка Su(Hw) был амплифицирован и клонирован в плазмиду. Один из геномных сайтов Su(Hw)-l отличается от усредненного участка связывания из МДГ4, (Su(Hw)-1 - TGCCTA, усредненный из МДГ4 - v

CATA) (рис. 5). В данной работе были проведены эксперименты по связыванию с белком Hw) in vitro. В результате проведенного анализа оказалось, что оба сайта, измененный и змененный, с высокой эффективностью связывают белок Su(Hw) in vitro. Однако, юктивность этого связывания меньше чем у 135 п.н. фрагмента и намного ниже чем у норазмерного Su(Hw) инсулятора из МДГ4. Таким образом, оба сайта связывания для белка Hw) в 135 п.н. фрагменте являются функциональными. Замена в коровой по цовательности А на С не является значимой для связывания с белком Su(Hw) in vitro. юстрация Ь Связывание фрагментов ДНК с белком Su(Hw) 3, 4-дорожках нанесен фрагмент ДНК, содержащий 430 п.н. из МДГ4, в 5, 6, 7,8 дорожках - Su(Hw)-l -яный фрагмент, содержащий коревую последовательность TGCCTA, в 9, 10, 11,12 дорожках нанесен мейт Su(Hw)-l, содержащий точечную замену в коровой последовательности TGCATA. В 1, 5, 9 дорожках сены соответствующие фрагменты и вода (отрицат.контроль), в 2, 6, 10 дорожках - соответствующие Мен+ы и комплекс транскрипционных-трансляционных факторов, в 4, 8, 12 дорожках соответствующие УйМы и белок Su(Hw). Стрелками показано связывание Su(Hw) с фрагментами.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

4.4. Белки Su(Hw) и Mod(mdg4) участвуют в регуляции экспрессии генов AS-комплекса

Мутации в гене Su(Hw) полностью инактивирующие его функцию, видимо, не влияют ia экспрессию генов ^-комплекса. Это можно объяснить тем, что функции, которые исполняет белок Su(Hw) в регуляции транскрипции генов ^-комплекса, могут в его )тсутствии компенсироваться другими белками. Для выяснение возможной роли белка Su(Hw) $ регуляции экспрессии генов ^-комплекса были использованы мутации, индуцированные шбо делециями регуляторных районов А9-комплекса, либо инверсиями имеющими одну границу в регуляторной районе AS-комплекса и другую - обычно в области прицентромерного ^етерохроматина (рис. 7)

Мутация ур индуцирована инверсией с границами в районе регуляторной области гена С yellow и прицентромерного генетрохроматина (Garcia-Bellido, 1979; Campuzano et al., 1985). В результате экспрессия гена yellow нарушена в теле и крыльях, но щетинки при этом имеют нормальную пигментацию (рис. 7) при введении su(Hw)y/su(Hwf транс-гетерозиготы и гомозиготы по mod(mdg4)uI-мутации происходит частичная супрессия формирования большинства щетинок и волосков. Интересно, что фенотипу у мутации при этом не меняется. Инактивация su(Hw) имеет намного более сильный эффект, чем мутация mod(mdg4)ul.

Инверсия In(I)ac имеет второй конец в эухроматиновом 1В14-С1 районе. В результате инверсии происходит полная инактивация гена ас, так как все его энхансеры в результате инверсии оказываются удаленными от его промотора. Введение мутаций по генам su(Hw) и mod(mdg4) в 1п(1)ас не влияет на формирование щетинок.

V2 8

Границы инверсий в In(I)sc и In(I)sc находятся между генами ас иже одной стороны и в прицентромерном районе с другой стороны. Несмотря на близость гетерохроматина обе утации незначительно влияют на ^-фенотип. При введение мутаций по генам su(Hw) и nod(mdg4) происходит резкое усиление мутантного фенотипа. Видимо, введение данных мутаций негативно влияет на экспрессию обоих генов ас и se, что приводит к нарушению формирования многих макрохет и микрохет. In(I)sc приводит к почти полной потери функций ена se, так как в результате инверсии с прицентромерным гетерохроматином большая часть »нхансеров ^¿»-комплекса оказывается изолированной от промотора гена se. Мутации в генах -u(Hw) и mod(mdg4) незначительно влияют на мутантный лс-фенотип, одновременно ¡u(Hw)v/su(Hw/ транс-гетерозигота снижает выживаемость, что может быть связано с гарушением работы гена / 'se, который активирован на ранней эмбриональной стадии и, юзможно, его инактивация в данном случае,приводит к летальному эффекту (Garcia-Bellido, 1979; Campuzano et al., 1985).

Делеция в yac1 линии включает сайты связывания для Su(Hw) белка и часть энхансеров, определяющих формирование микрохет и ^-макрохет (Campuzano et al. 1985). Мутации в генах su(Hw) и mod(mdg4) не влияют на формирование щетинок и волосков в этой линии.

Делеция se6 удаляет регуляторные последовательности, отвечающие за формирование 4NP, AOR, PV и ОС - щетинок. su(Hw)v/su(Hwf транс-гетерозигота частично восстанавливает АКР щетинки и частично блокирует развитие HU и AOR. Характер формирования других щетинок при этом заметно не меняется. Эффект mod(mdg4)uI мутации был еще более незаметным: только формирование AOR было супрессировано (рис. 7).

Аллель se2, или как его еще называют ase1, индуцирован делецией регуляторный -последовательностей, которые ответственны за формирование scutellars - щетинок, а также самого гена ase (Gonzalez et al. 1989). Неожиданно оказалось, что мухи содержащие комбинацию se с su(Hw//su(Hwf гибнут на ранних этапах эмбрионального развития. дновременно mod(mdg4)ul гомозигота также имела полу-летальный эффект: 5С2; Уlod(mdg4)ul/mod(mdg4)ul мухи выживали с крайне низкой частотой и не давали потомство. >олее того, яс; mod(mdg4)ul/TMЗ, БВ самцы гетерозиготные по мутации mod(mdg4)ul, тоже вшивали с очень низкой частотой в потомстве скрещивания: С(1)КМ, у/; nod(mdg4)ul/mod(mdg4)"1 х яс2; mod(mdg4)ul/TMЗ, 5Д т.е. если родительские самки имели 1утацию mod(mdg4)ul в гомозиготе. Напротив те же mod(mdg4)uJ/TMЗ, 8В самцы выживали сорошо в потомстве скрещивания С(1)ЯМ, у/; mod(mdg4ju / ТМЗ, 8В х ; mod(mdg4) / ТМЗ, ьВ, т.е. в потомстве самок, которые были гетерозиготны по мутации mod(mdg4)uI. Полученные щнные показывают, что комбинация ви(Н\у) или то<1(тс^4) мутаций с яс аллелем приводит к шактиваиции экспрессии гена, который необходим для раннего эмбрионального развития. Гаким геном является / лг, который экспрессируется только на эмбриональной стадии и его инактивация приводит к летальному эффекту на эмбриональной стадии .

Последняя из исследованных мутаций, .ус5, индуцирована небольшой делецией в эегуляторных последовательностях, которая приводит к частичному нарушению формирования чсШеИагя щетинок. Мутации в генах mod(mdg4) и яи(Нм>) приводили к полному нарушению их формирования.

На основе полученных данных можно предположить, что белки 8и(Нд*0 и Мос1(тс^4) являются компонентами регуляторной системы ^-комплекса и их функции могут частично компенсироваться другими белками. о yellow 70 ас

60

50

40

30

I'sc i=>

20 10

-10 -20 -30

У,ас1 ac3 sc*2 scs sc sc sc sc

SC АС L У

Genotypes ни ASA PS AOR ОС rv АИР PNP SC PSA КС Д/РОС AVT р; +/+ □ □ □ □ □ □ □ □ □ □ □ □ □ + + su(Hw)7su(Hwy H в в н в El в в в в в в в + + mod(mdg)'"/mod(mdg4f В в и и □ □ □ □ в в в □ в + W

7 Df(3R)GC14/mod(mdg4)'J1 В в в в □ □ □ □ □ □ в □ в + W scv2; +/+ □ □ □ □ □ □ □ □ в □ □ □ □ + + su(Hw)'/su(Hw)" в в а в в в в в в в ■ в в + m mod(mdg)"'/mod(mdg4),J' и в в □ □ □ □ в □ ■ ■ в + m

7 Df(3R)GC14/mod(mdg4)" в □ в в в в в в ■ ■ ■ ■ в + m sc8; +/+ □ □ □ □ □ □ □ в в □ □ □ □ + + su(Hw)'/su(Hw)" в ■ в □ □ □ □ в ■ в в в в + + mod(mdg)",/mod(mdg4f В н в □ □ □ □ в ■ □ □ □ □ + + sc4; +/+ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ □ в □ □ □ + ND su(Hw)'/su(Hw)" □ в в □ □ 0.05(208) ND mod(mdg)"'/mod(mdg4f □ □ □ □ □ + ND sc6; +/+ □ □ □ в ■ ■ ■ □ □ □ □ □ □ + + su(Hw)'/su(Hw)* и □ □ ■ ■ ■ в □ □ □ □ □ □ + + mod(mdgf'/mod(mdg4f □ □ □ ■ ■ ■ ■ □ □ □ □ □ □ + + sc5; +/+ □ □ □ □ □ □ □ □ в □ □ □ □ + + su(Hw)'/su(Hw)" □ и □ в в в □ □ в □ □ □ □ + + mod(mdgf/mod(mdg4f □ □ □ □ □ □ □ □ ■ □ □ □ □ + + sc2; +/+ □ □ □ □ □ в □ □ в □ □ □ □ + + su(Hw)'/su(Hw)" letal mod(mdg)" '/mod(wdg4f' □ □ □ □ в в □ □ ■ □ □ □ □ 0.02(590) +

Рис. 7 Схематическое изображение yellow, ас и sc районов в различных мутациях и их фенотипы на фоне мутаций по генам Su(Hw), mod(mdg4), Df(3R)GC14. a) Схематичное изображение yellow, ас и sc районов в различных мутациях. Стрелки указывают направление транскрипции генов yellow, ас и sc . Система координат AS-C соответствует представленной ранее в работе Campuzano et al. Вертикальные стрелки указывают точки разрыва в инверсиях для соответствующих мутаций. Размеры делеций обозначены протяженными белыми прямоугольниками. b) Фенотипы sc мутаций у самцов и их взаимодействие с мутациями по генам Su(Hw) и mod(mdg4) и Df(3R)GC14. Стандартная номенклатура для каждой щетинки обозначена на рис 3.

4.5. Регуляции экспрессии некоторых sc аллелей, индуцированных инсерцией Р элементов, на фоне мутаций по генам su(Hw) и mod(mdg4) и php1

Все проанализированные в предыдущей главе линии, на которые действовали мутации в енах su(Hw) и mod(mdg4), содержали в Л^-комплексе либо большие инверсии, либо делеции. Гак как в прицентромерном гетерохроматине находится большое число копий МДГ4, то нельзя юключить, что именно они определяют наблюдаемый эффект su(Hw) и mod(mdg4) -мутаций на жспрессию генов ^-комплекса. Тоже самое можно предположить в случае делеций, которые логут приближать к району генов AS-комплекса сайты связывания для белка Su(Hw). Для выяснения роли белков Su(Hw) и Mod(mdg4) в регуляции генов ^-комплекса, была ютользована мутация phpl, которая индуцирует образование репрессионного комплекса на юследовательностях Р элемента.

Мутация phPI возникла в результате инсерции Р элемента в транскрибируемую, но не гранслируемую 5' область гена polyhomeotic (Belenkaya et al. 1998; Birukova et al. 1999). Этот ген кодирует белок РН, который вместе с другими белками группы Polycomb, PSC, PC и РНО, образует репрессионный комплекс на специальных регуляторных элементах, названных PRE [Polycomb Responsible Element). Аллель phP1 кодирует химерный белок (Р-РН), состоящий из ЦНК связывающего района транспозазы Р элемента и всего белка РН. Этот химерный белок способствует образованиею репрессионных комплексов на последовательностях Р элементов.

Для индукции репрессии в AS-комплексе использовалась y2sscls линия, из которой была конструирована линия дЛусь(1) phP1 (рис. 8, 9). В результате введения phP1 мутации произошло аметное усиление мутантного яс-фенотипа и изменение пигментации по yellow, что можно »бъяснить как действием мутации, так и другими модификаторами, введенными в линию в »езультате скрещиваний.

Для выяснения роли phP1 мутации в репрессии транскрипции генов J ¿'-комплекса, а шоке для получения новых производных, имеющих большое число Р элементов в AS-:омплексе, в y2"sch(l) phP1 линии были индуцированы перемещения Р. В результате индукции [естабильности были получены две произво, у которых наблюдали усиление sc-1утантного фенотипа. Одновременно были получены три ревертанта phP1 мутации, которые >тбирались по восстановлению пигментации щетинок y2ssclsph+ (рис.8). Ревертанты имели sc-[>енотип идентичный исходной y2sscls{\) линии. Таким образом, было показано, что именно мутация вызывает изменение фенотипа в y2ssc's( 1).

Структура scw мутации бьша изучена с помощью Саузерн блот анализа в y2sscws(l-1) phpl i y2sscws( 1-2) phPl линиях. В обеих линиях яс^-мутантных линиях возникала дупликация РЗ-шемента в той же ориентации (рис. 8). Других изменений в районе AS-комплекса не бьшо гайдено. Для выяснения роли дупликации Р элемента в усилении мутантного sc-фенотипа, в шниях зЛ$сш(1-1) phPI й y2sscws (1-2) phpl были активированы транспозиции Р элемента. В результате наравне с другими производными были получены два класса. Один из них был связан с реверсией phP1 мутации к мутации ph+ (линия 1-1-1, 1-2-1) (восстановление шгментации щетинок), другой - с реверсией scm мутации к исходной scs, scms (линия 1-1-2, 11-2) (рис. 8, 9). С помощью Саузерн блот гибридизации бьшо подтверждено, что в двух линиях, /xscwrs ph+( 1-1-1) и y2sscwrsph \ 1 -2-1), произошла только реверсия ph+P1 мутации. Однако, эти мутации имеют более сильное проявление мутантного sc-фенотипа, чем исходная scls мутация. vIoîkho предположить, что дупликация Р элемента перед промотором дупликации гена yellow, ' ■ .о неположенной в AS-комплексе, приводит к усилению последнего. В свою очередь, усиленный 'ellow промотор может нарушать правильное взаимодействие между энхансерами и фомоторами генов JS-комплекса.

Структура scwRs производных была исследована в y2"scwRsphF1( 1-1-2) и y2sscwRs phPI( 1-2-2) шниях. В обоих случаях аллельный переход бьш связан с делецией дуплицированной копии Р шемента. Таким образом, именно дупликация Р элемента приводит к усилению мутантного sc-|)енотипа в y2sscwRs pti''{ 1-1-2) phPI ny2sscwR phP1 s( 1-2-2) линиях.

Мутации в генах su(Hw) и mod(mdg4) были введены в исходные y2sscs~a y2ssck php\ 1) шнии и во все выше описанные производные. Как было показано ранее (Golovnin et al. 1999), в исходном scls аллеле супрессия формирования HU и частично AOR щетинок связана с дупликацией промотора гена yellow, который мешает правильной работе соответствующих энхансеров ^-комплекса. Инактивация Su(Hw) и Mod(mdg4) белков не имела эффекта, что можно объяснить слабым нарушением регуляции экспрессии генов ^-комплекса дупликацией гена yellow. Введения phP1 мутации значительно усилило мутантный sc-фенотип: дополнительно было частично супрессировано формирование ANP, ОС, PV, AVT щетинок и одновременно появились дополнительные щетинки в (A/PDC). Можно предположить, что phFI мутация привела к нарушению правильной экспрессии обоих генов ас (AVT) и se (ANP, ОС, PV). Дупликация Р элемента в scw аллелях усилила эффект phPI мутации, что привело к более заметной репрессии ас (PSA)и se (scutellars, PNP) транскрипции. Введение в линии, содержащие phP1, мутаций su(Hw) и mod(mdg4) приводило к исчезновению большинства щетинок и волосков. Мутации в обоих генах полностью супрессировали образование дополнительных щетинок в зоне A/PDC, одновременно они усиливали репрессию ас (PSA, AVT, МС). влияли негативно на формирование щетинок, за которые отвечает ген se: ASA, PS,

Я, ОС, РУ, РЫР, БС. Таким образом, инактивация белков 8и(Н\у) и Mod(mdg4) имеет [имый негативный эффект на работу большинства энхансеров, определяющих экспрессию ов ас и .Интересно, что эффект гомозиготы по mod(mdg4)ul был более заметен, чем ^/Ам^Т/и/трансгетерозиготы.

1тли yeTbw ас sc

X н ysscbphPI(l) «,Р2

1 I " ' I veTlowi I s r нхн R yeiiuw Вн r s y"sc'ph"(l-l) P2

1-2) l I II I veTlow 1 ■""*' l"'l'W

S R HXH R Уе,1и" BH R S R S A scwrsphpl (1-1-2) „ - „

1-2-2) 8 Схематическое изображение производных y^sc1* линии. Обозначения см. рис. 2.

При дупликации Р элемента в scm на фоне мутации в генах su(Hw) и mod(mdg4) »исходит более заметное блокирование энхансеров, отвечающих за развитие AOR, ОС, PV гинок, т.е. тех энхансеров, которые отделены от "своего" sc-промотора промотором игакации гена yellow. При этом mod(mdg4)ul имеет более сильный эффект, чем Hw//su(Hwf.

Более сильный эффект mod(mdg4)uJ мутации можно объяснить тем, что другие »формы белка Mod(mdg4), которые не связываются с белком Su(Hw), также участвуют в уляции генов ^-комплекса. Для выяснения возможности участия других изоформ белка ul

У[о<1(тё£4) в регуляции генов А8-комплекса была использована Df(ЗR)GC14/mod(mdg4) грансгетерозигота, в который полностью нарушено образование Мос1(тс^4)-62.7 и шачительно уменьшено образование других изоформ белка Мо<1(тс^4).

Как видно из рисунков, в большинстве случаев трангетерозигота оказывала большее влияние на ас-.ус-фенотип,чем тос1(тс1§4)и1 гомозигота, что указывает на роль других изоформ оелка Мод(тс%4) в регуляции экспрессии генов ^ ^-комплекса. y^sc'5

Genotypes sc AC HW ни ASAPS AOROC PV ANPPNPSC PSAMC AVTA/PDC

Я □ □ □ □ □ □ □ □ □ □ su(Hw)'/su(Hw): Я □ □ □ □ Q □ □ □ □ □ □ mod(mdgf/mod(mdg4)u1 я □ □ - □ □ □ □ □ □ □ □ □

Df(3R)GC 14/mod(mdg4)u1 я □ □ □ □ □ □ □ □ □ □ □

W1(1) su(Hw)7su(Hw)v ■ □ с □ □ □ □ и □ mod(mdg)u7mod(mdg4)"1 ■ □ □ □ ■ □ □ н □

Df(3R)GC 14/mod(mdg4)u1 ■ □ □ ■ □ в □ в в □ sc^ph^l-l) в н □ . ■ su(Hw)7su(Hw)v ■ в в в с в . в £] в □ mod(mdgf/mod(mdg4)u1 ■ в в в ■ в в ■ в н □

Df(3R)GC14/mod(mdg4)u1 ■ в н ■ в в ■ в в ■ в н □ y2sscwsph+(1 -1 -1/1 -2-1) в . . □ □ □ □ □ □ ■ su(Hw)7su(Hw)v ■ □ □ ■ в в □ □ в □ □ □ mod(mdg)uVmod(mdg4)u1 ■ □ □ ■ в в □ □ ■ □ □ □ □

Df(3R)GC 14/mod(mdg4f ■ □ □ ■ в в □ □ ■ □ □ □ □ y2ssc,sphp1(1-1-2/1-2-2) в □ . □ □ □ □ ■ su(Hw)7su(Hw)v ■ □ ED □ □ □ □ □ □ mod(mdg)"7mod(mdg4)u1 ■ ■ □ с □ с в □

Рис. 9 Фенотипы ее мутаций у самцов и их взаимодействие с мутациями по генам и то(1(т(^4).

Обозначения см. рис. 3.

5. Обсуждение

5.1. Два геномных сайта связывания для белка Su(Hw) создают функциональный инсулятор, который способен нейтрализовать полноразмерный Su(Hw) инсулятор из МДГ4

В представленной работе были найдены и охарактеризованы первые геномные сайты связывания для белка Su(Hw), которые находятся между соседними генами yellow и achaete.

Ранее было показано, что два Su(Hw) инсулятора, расположенные между энхансером и промотором, способны нейтрализовать действие друг друга. Данное явление было показано для двух регуляторных систем генов yellow и miniwhite (Muravyouva et al. 2001). Аналогичные результаты независимо были получены на примере регуляторных систем генов eve и white и целого ряда эмбриональных энхансеров (Cai and Shen 2001). Приведенные данные свидетельствуют об универсальности явления нейтрализации инсуляции при увеличении числа инсуляторов между энхансером и промотором. Для объяснения эффекта нейтрализации инсуляции было предположено, что несколько ближайших инсуляторов взаимодействуют друг с другом с образованием петель ДНК. Было также показано, что при нейтрализации энхансер-блокирующей способности несколькими Su(Hw) инсуляторами, каждый из них в отдельности сохраняет свои инсуляторные свойства (Muravyova et al., 2001)

Согласно данным, полученным в настоящей работе, два сайта связывания для белка Su(Hw), заключенные в 135 п.н. фрагменте, способны эффективно блокировать взаимодействие между энхансерами и промотором гена yellow и одновременно нейтрализовать золноразмерный Su(Hw) инсулятор. Таким образом, двух геномных сайтов связывания для эелка Su(Hw) достаточны для создания функционального инсулятора.

5.2. Геномные сайты связывания с Su(Hw) белком, найденные между генами yellow и achaete, эффективнее полученных на основании консенсуса сайтов связывания из МДГ4

В ранее исследованном Su(Hw) инсуляторе было найдено 12 сайтов связывания для оелка Su(Hw) (Mazo et al. 1989; Spana et al. 1988; Spana and Corees 1990). При этом эффективность действия инсулятора напрямую зависела от количества сайтов связывания для белка Su(Hw). Было показано, что инсулятор, состоящий из 7 вместо 12 сайтов связывания, намного слабее блокирует взаимодействие между энхансерами и промоторами (Flavell et al. 1990). Инсулятор, состоящий из 4-5 участков связывания для белка Su(Hw), имел очень слабую активность (Smith and Corees 1992). Существуют экспериментальные данные, что 12 участков связывания из МДГ отличаются различной связывающей способностью (Spana and Corees 1990; Kim et al. 1996). Эксперименты, проведенные in vitro, показали, что третий сайт инсулятора 5'-TGCTGCATAC-3' наиболее эффективно связывает белок Su(Hw) (Kim et al. 1996). Сайты связывания для белка Su(Hw) разделены между собой короткими АТ-богатыми последовательностями. В экспериментах in vitro было показано, что они содержат участки связывания с топоизомеразой II, а также участки взаимодействия с ядерным матриксом (Nabirochkin et al. 1998). Но данные участки не играют значимой роли в блокировании энхансера. Известно,что при инактивации белка Su(Hw) происходит полная потеря инсуляции, т.е. для функционирования инсулятора достаточно 8и(Н\у)-связывающих участков. (Scott et al. 1999).

В данном исследовании in vivo показано, что два геномных сайта связывания для белка Su(Hw) могут выполнить роль инсулятора, сравнимого по эффективности с 12 сайтами связывания из МДГ4. Таким образом, можно предположить, что Su(Hw) инсулятор содержит большое число не функциональных сайтов связывания белка Su(Hw), что согласуется с предположениями авторов (Kim et al. 1996) о связывании только 1-2 Su(Hw) белков с Su(Hw) инсулятором. Интересно, что в экспериментах по связыванию in vitro трипликация третьего сайта из МДГ4 взаимодействует с белком Su(Hw) также эффективно, как 135 п.н фрагмент, а в экспериментах in vivo у данной трипликации отсутстствует даже слабая инсуляторная активность (Scott and Geyer 1999). Этот результат можно объяснить тем, что in vivo существуют другие белки, которые конкурируют за сайты связывания с белком Su(Hw). Возможно, такие гипотетические белки лучше связываются с триплицированным сайтом, чем белок Su(Hw). С этой гипотезой согласуется также следующий факт: 12 сайтов связывания из МДГ4 взаимодействуют с белком Su(Hw) in vitro, лучше, чем 135 п.н. фрагмент. Можно предположить, что участки связывания для белка Su(Hw), найденные в 135 п.н. фрагменте, более эффективно взаимодействуют in vivo именно с белком Su(Hw), а не с его конкурентами. Возможно, на связывающую способность влияет замена А->С в коровой последовательности TGCATA (из МДГ4) на TGCCTA(b геномном сайте), что не сказывается на способности белка Su(Hw) связываться in vitro. Возможно, замена А->С в геномном фрагменте приводит к предпочтительному связыванию с белком Su(Hw), а не с его конкурентами in vivo. В настоящее время проводятся дальнейшие исследования для прояснения ситуации.

5.3. Su(Hw) и Mod(mdg4) участвуют в регуляции генов AS-комплекса

Ранее было показано, что белок Su(Hw) локализуется примерно на 200 сайтах на юлитенных хромосомах (Harrison et al. 1993; Gerasimova and Corees 1998). Интересно, что 'частей связывания для белков Su(Hw) и Mod(mdg4) в 1В районе не были найдены. Gerasimova et al. 1995; Gerasimova and Corees 1998). Возможно, существование в геноме :начительно большего числа сайтов связывания для белка Su(Hw), которые не щентифицируются на политенных хромосомах слюнных желез дрозофилы. Несмотря на 5олыпое количество геномных участков связывания, инактивация Su(Hw) белка приводит к ;равнительно слабому эффекту in vivo (стерильности самок и замедленному развитию) Harrison et al. 1993). Такой слабый эффект можно объяснить тем, что другие белки сомпенсируют отсутствие белка Su(Hw).

Полученные нами результаты показывают, что Su(Hw) и Mod(mdg4) участвуют в эегуляции экспрессии генов ^-комплекса. Гены ас и se контролируются набором цис-эегуляторных элементов, которые распределены в районе генома примерно 90 т.п.н. Campuzano et al., 1985). При этом каждый энхнасер активирует транскрипцию обоих генов и эпределяет развитие только одного типа щетинок. По супрессии формирования конкретной щетинки можно судить о степени инактивации данного энхансера. Таким образом, эегуляторная система ^-комплекса является удобной моделью для изучения механизмов взаимодействие между энхансерами и промоторами на больших дистанциях и выявлению эелков, которые участвуют в этом процессе.

Инактивация белков Su(Hw) и Mod(mdg4) усиливают репрессию ас и se генов в мутациях, вызванных инверсиями между регуляторной областью ^-комплекса и трицентромерным гетерохроматином. Близость к прицентромерному гетерохроматину обычно приводит к инактивации гена или к мозаичной экспрессии. Интересно, что инверсии с гетерохроматином не вызывают видимой инактивации генов ас и sc, что можно объяснить существованием регуляторных элементов в А^-комплексе, которые выполняют функцию эарьеров и предотвращают кооперативное распространение гетерохроматина. Из полученных результатов видно, что именно Su(Hw) и Mod(mdg4) белки возможно участвуют "» этом процессе. Ранее было показано, что конструкция, содержащая ген white, ограниченный двумя копиями Su(Hw) инсуляторрй, даже при инсерции в прицентромерный гетерохроматин

А/\ сохраняет нормальный уровень транскрипций (Roseman et al. 1993, 1995), т.е. Su(Hw) инсулятор может является эффективной границей между активным и неактивным хроматином.

Отдельно стоит рассмотреть полученные нами результаты с phpl мутацией. Как было показано ранее, phPI мутация кодирует химерный белок P-Ph, который может связываться с последовательностями Р-элемента и индуцировать образование репрессионого комплекса, состоящего из белков группы Polycomb (Belenkaya et al. 1998; Birukova et al. 1999). Можно предположить, что такой репрессионный комплекс, образовавшийся в Л^-регуляторной области, кооперативно взаимодействует с репрессорами AS— комплекса, блокируя его энхансеры. Ранее было показано, что кооперативные взаимодействия Рс-белков приводят к распространению их действия на большие расстояния, поэтому было постулировано существование границ, препятствующих репрессии. В частности, такими границами могут служить инсуляторы. В экспериментах на трансгенных конструкциях было показано, что Su(Hw) инсулятор способен блокировать репрессионное действие Рс-комплексов (Sigrist et al. 1997; Mallin et al. 1998). Причем, как для блокирования действия Рс-комплексов, так и для блокирования энхансеров, необходимы функции обоих белков - Su(Hw) и Mod(mdg4), поэтому можно предполагать сходный механизм действия Su(Hw) инсулятора в обоих процессах. Как было показано в данной работе, мутации в генах su(Hw) и mod(mdg4) приводят к значительному усилению эффекта мутации phP1: в некоторых случаях происходит частичная инактивация большинства энхансеров, ответственных за формирование щетинок. На основе таких результатов можно сделать вывод, что белки Su(Hw) и Mod(mdg4) могут выполнять барьерную функцию, т.е. разделять активные энхансеры от репрессированного хроматина.

Так как мутации в генах su(Hw) и mod(mdg4) не влияют на экспрессию генов AS-комплекса в отсутствии нарушений регуляторных элементов, можно предположить, что аналогичную функцию выполняют и другие еще не идентифицированные белки, которые связываются с границами между энхансерами в ^-комплексе. В данной работе получены предварительные экспериментальные данные, что другие изоформы белка Mod(mdg4), которые не взаимодействуют с белком Su(Hw), также могут принимать участие в регуляции генов AS-комплекса. Независимо в лабораториях Ройтера (Dorn et al. 1993) и Корсеса (Gerasimova et al. 1995) было показанл^чтоу все белки, кодируемые геном mod(mdg4), имеют одинаковый ВТВ домен на N-конце и разные С-концевые домены. Возможно, ВТВ домены белков Mod(mdg4) участвуют в регуляции взаимодействий между энхансерами и промоторами генов AS-комплекса, расположенных на больших расстояниях друг от друга. Ранее было показано, что взаимодействие между двумя Su(Hw) инсуляторами часто приводит к более эффективному взаимодействию между энхансером и промотором гена white (Muravyova et al. 2001). В данной работе показано, что мутация mod(mdg4)ul приводит к полной супрессии формирования 5см^е//аг5-щетинок на фоне мутации sc. Мутация sc индуцирована делецией, которая, скорее всего, нарушает коммуникацию между удаленным энхансером, отвечающим за формирование скутелярных щетинок, и промотором гена sc. Аналогично было продемонстрировано, что делеция sc приводит к прямой зависимости экспрессии гена lsc на эмбриональной стадии от Su(Hw) и Mod(mdg4) белков. Возможно, инактивация белка Mod(mdg4) приводит к полной потере коммуникации между энхансером и промотором. б. Выводы

1. Впервые найдены и охарактеризованы геномные сайты связывания для белка Su(Hw) у Drosophila melanogaster.

2. Показано, что два сайта связывания для белка Su(Hw) образуют функциональный инсулятор, который способен нейтрализовать полноразмерный Su(Hw) инсулятор, состоящий из 12 сайтов связывания для белка Su(Hw).

3. Продемонстрировано, что замена А С в коровой последовательности сайта связывания Su(Hw) (TGCATA -> TGCCTA) не влияет на связывание с белком Su(Hw) in vitro, но, возможно, улучшает связывание in vivo.

4. Впервые показано, что белки Su(Hw) и Mod(mdg4) участвуют в регуляции экспрессии генов ^-комплекса.

5. Продемонстрировано, что устойчивость экспрессии генов .^-комплекса к рядом расположенному прицентромерному гетерохроматину при инверсиях во многом определяется Su(Hw) и Mod(mdg4) белками.

7. Список литературы

1. Anmad, K.F., Engel, C.K., and Prive, G.G. (1998). Crystal structure of the BTB domain from PLZF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 12123-12128.

2. Ashburner, M., 1989 Drosophila: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

3. Barges S, Mihaly J, Galloni M, Hagstrom K, Muller M, Shanower G, Schedl P, Gyurkovics H, Karch F. 2000 The Fab-8 boundary defines the distal limit of the bithorax complex iab-1 domain and insulated iab-1 from initiation elements and a PRE in the adjacent iab-8 domain. Development 2000, 127:779-790.

4. T. Belenkaya, A. Soldatov, E. Nabirochkina, I. Biryukova, S. Gergieva and P. Georgiev (1998): P-Element insertion at the polyhomeotic gene leads to formation of a novel himeric protein that negatively regulates yellow gene expression in P-element-induced alelles of Drosophila melanogaster. Genetics 150: 687-697

5. Bell, A. C., A. G. West and G. Felsenfeld, 1999 The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell 98:387-396.

6. Bell, A. C., A. G. West and G. Felsenfeld, 2001 Insulators and boundaries: versatile regulatory elements in the eukaryotic genome. Science 291:447-450.

7. Bi, X., and J.R. Broach 2001 Chromosomal boundaries in S. cerevisiae. Cur. Opin. Genet. Dev. 11:199-204

8. Bi, X., and J. R. Broach, 1999 UASrpg can function as a heterochromatin boundary element in yeast. Genes Dev. 13:1089-1101.

9. Bi, X., M. Braunstein, G. J. Shei and J. R. Broach, 1999 The yeast HMLI silencer defines a heterochromatin domain boundary by directional establishment of silencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11934-11939.

10. Biryukova, T. Belenkaya, H Hovhannisyan, E. Kochieva and P.Georgiev 1999: The P-Ph protein-mediated repression of yellow gene expression depends on different cis- and trans-factors in Drosophila melanogaster. Genetics 152: 1641-1652

11. Buchner, K., P. Roth, G. Schotta, V. Krauss, H. Saumweber, G. Reuter and R. Dorn, 2000 Genetic and molecular complexity of the position effect variegation modifier mod(mdg4) in Drosophila. Genetics 155:141157.

12. Busturia, A., and Bienz, M. (1993). Silencers in Abdominal-B, a homeotic Drosophila gene. EMBO J. 12, 14151425.

13. Busturia, A., Lioyd, A., Bejarano, F., Zavortink, M., Xin, H., and Sakonju, S. (2001). The MCP silencer of the Drosophila Abd-B gene requires both Pleoihomeotic and GAGA factor for the maintenance of repression. Development 128, 2163-2173.

14. Busturia, A., Wightman, C.D., and Sakonju, S. (1997). A silencer is required for maintenance of transcriptional repression throughout Drosophila development. Development 124,4343-4350.

15. Cai HN, Shen P. Effects of eis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. Science 2001, 291:493-495.

16. Cai, H. and M. Levine. 1995. Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo. Nature 376:533-536.

17. Campuzano S., Carramolino L., Cabrera C., Ruiz-Gomez M., Villares A., Boronat A., and Modolell J. Molecular genetics of the achaete-scute gene complex of D. Melanogaster. // Cell 1985 44: 327-338

18. Celniker, S.E., Sharma, S., Keelan, D., and Lewis, E.B. (1990). The molecular genetics of the bithorax complex of Drosophila: cis-regulation in the Abdominal-B domain. EMBO J. 9, 4277-4285.

19. Chung, J. H., M. Whitely, and G. Felsenfeld, 1993. A 5' element of the chicken ?-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila. Cell 74:505-514.

20. [Chervitz, S.A., L. Aravind, G. Sherlock, et al. 1998 Composition of complete protein sets of worm and yeast: orthology and divergence. Science 282:2022-2028.

21. Corces, V. G., and G. Felsenfeld, 2000 Chromatin boundaries. In Elgin, S.C.R. and Workman, J.L. (eds), Chromatin Structure and Gene Expression. Oxford University Press, Oxford, UK, pp. 278-299.

22. Cuvier O., Hart C.M., Laemmli U.K. Identification of a class of chromatin boundary elements // Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P. 7478-7486.

23. Dunaway, M., JY Hwang, M. Xiong, and H.L. Yuen 1997 The activity of the scs and scs' insulator elements in not dependnet on chromosomal context. Mol. Cell. Biol. 17:182-189

24. Donze, D., C. R. Adams, J. Rine and R. T. Kamakaka, 1999 The boundaries of the silenced HMR domain in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 13:698-708.

25. Dorn, R., Krauss, V., Reuter, G., and Saumweber, H. (1993). The enhancer of position-effect variegation of Drosophila, E(var)3-93D, codes for a chromatin protein containing a conserved domain common to several transcriptional regulators. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11376-11380.

26. Dorsett, D., 1990 Potentiation of a polyadenylation site by a downstream protein DNA interaction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4373-4377.

27. Dorsett, D., 1999 Distant liaisons: long-range enhnacer-promoter interactions in Drosophila. Curr. Opin. Genet. Dev. 9:505-514.

28. Garcia-Bellido A 1979 Genetic analysis achaete-scute system of Drosophila Melanogaster. Genetics, 91:491-520

29. ^Gause, M., H. Hovhannisyan, T. Kahn, S. Kuhfittig, V. Mogila and P. Georgiev, 1998 hobo induced rearrangements in the yellow locus influence the insulation effect of the gypsy su(Hw)-binding region in Drosophila melanogaster. Genetics 149:1393-1405.

30. Gause, M., P. Morcillo and D. Dorsett, 2001 Insulation of enhancer-promoter communication by a gypsy transposon insert in the Drosophila cut gene: cooperation between suppressor of Hairy-wing and modifier of mdg4 proteins. Mol. Cell. Biol. 21:4807-4817.

31. Gaszner M., Vazquez J., Schedl P. The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction // Genes Dev. 1999. V. 13. P. 2098-2107.

32. Gdula, D. A., and V. G. Corces, 1997 Characterization of functional domains of the su(Hw) protein that mediate the silencing effect of mod(mdg4) mutations. Genetics 145:153-161.

33. Georgiev PG, Gerasimova TI. 1989 Novel genes influencing the expression of the yellow locus and mdg4 (gypsy) in Drosophila melanogaster. Mol. Gen. Genet. 220:121-126.

34. Georgiev, P. G., E. E. Muravyova, A. K. Golovnin, E. M. Gracheva and T. Yu. Belenkaya, 2000 Insulators and long-distance interactions between reulatory elements in higher eukaryotes. Genetika (in Russian) 36:1336-1343.

35. Georgiev, P., and M. Kozycina, 1996 Interaction between mutations in the suppressor of Hairy wing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gypsy-induced mutations. Genetics 142:425-436.

36. Gerasimova TI, Corces VG. Polycomb and trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator. Cell 1998,92:511-521.

37. Georgiev P. G., and V. G. Corces. The su(Hw) protein bound to gypsy sequences in one chromosome can repress enhancer-promoter interactions in the paired gene located in the other homolog. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995 .V. 92.P.5184-5188.

38. Gerasimova, T. I., and V. G. Corces, 1998 Polycomb and trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator. Cell 92:511-521.

39. Gerasimova, T. I., D. A. Gdula, D. V. Gerasimov, 0. B. Simonova and V. G. Corces, 1995 A Drosophila protein that impacts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation. Cell 82:587597.

40. Gerasimova, T.I., K. Byrd, and Corces V.G. 2000. A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA. Mol. Cell 6:1025-1035.

41. Geyer, P. K., 1997 The role of insulator elements in defining domains of gene expression. Curr. Opin. Genet Dev. 7:242-248.

42. Geyer, P. K., and V. G. Corces, 1987 Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster. Genes Dev. 1:996-1004.

43. Geyer, P. К., and V. G. Corces, 1992 DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev. 6:1865-1873.

44. Глазков M.B. Границы структурно-функциональных единиц транскрипции (доменов) в хромосомах эукариот // Генетика. 1998. Т. 34. С. 593-604

45. Geyer, Р. К., С. Spana and V. G. Corces, 1986 On the molecular mechanism ofgy/wy-induced mutations atsthe yellow locus of Drosophila melanogaster. EMBO J. 5:2657-2662.

46. Ghosh, D., Т. I. Gerasimova and V. G. Corces, 2001 Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function. EMBO J. 20:2518-2527.

47. Gomez-Skarmeta, J. L., I. Rodriguez, C. Martinez, J. Culi, D. Ferres-Marco, D. Beamonte, and J. Modolell. 1995. Cis-regulation of achaete and scute: shared enhancer-like elements drive their coexpression in proneural clusters of the imaginal discs. Genes Dev. 9:1869-1882.

48. Hagstrom, К., M. Muller and P. Schedl, 1996 Fab-7 functions as a chromatin domain boundary to ensure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex. Genes Dev. 10:3202-3215.

49. Harrison, D. A., D. A. Gdula, R. S. Coyne and V. G. Corces, 1993 A leucine zipper domain of the suppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on enhancer function. Genes Dev. 7:1966-1978

50. Holdridge, C., and D. Dorsett, 1991 Repression of hsp70 heat shock gene transcription by the suppressor of Hairy-wing protein of Drosophila melanogaster. Mol. Cell Biol. 11:1894-1900.

51. Kares R.E. and Rubin G.M. Analysis of P transposable element functions in Drosophila. Cell. 1984. V.38. P.135-146

52. Katsani K., Hajibagheri M., Verrijzer C. Cooperative DNA binding by GAGA transcription factor requires the conserved BTB/POZ domain and reorganizes promoter topology // EMBO J. 1999. V. 18. P.698-708.

53. Kellum, R., and P. Schedl, 1991 A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains. Cell 64:941-950.

54. Kim, J., B. Shen, C. Rosen and D. Dorsett, 1996 The DNA-binding and enhancer-blocking domains of the Drosophila suppressor of Hairy-wing protein. Mol. Cell. Biol. 16:3381-3392.

55. Lindsley, D. L., and G. G. Zimm, 1992 The Genome of Drosophila melanogaster. Academic Press, New York.

56. Mallin, D.R., Myung, J.S., Patton, J.S., and Geyer, P.K. (1998). Polycomb group repression is blocked by the Drosophila suppressor of Hairy-wing [.su(Hw)] insulator. Genetics 148, 331-339.

57. Marlor, R. L., S. M. Parkhurst and V. G. Corces, 1986 The Drosophila melanogaster gypsy transposable element encodes putative gene products homologous to retroviral proteins. Mol. Cell. Biol. 6:1129-1134.

58. Martin, C.H., Mayeda, C.A., Davis, C.A., Ericsson, C.L., Knafels, J.D., Mathog, D.R., Celniker, S.E., Lewis, E.B., and Palazzolo, M.J. (1995). Complete sequence of the bithorax complex of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8398-8402.

59. Martin, M., Y. B. Meng and W. Chia, 1989 Regulatory elements involved in the tissue-Specific expression of the yellow gene of Drosophila. Mol. Gen. Genet. 218:118-126.

60. Mazo, A. M., L. J. Mizrokhi, A. A. Karavanov, Y. A. Sedkov, A. A. Krichevskaya et al. Suppression in Drosophila : su(Hw) and su(f) gene products interact with a region of gypsy (mdg4) regulating its transcriptional activity. // EMBO J. 1989.V. 8.P.903-911.

61. Mihaly J, Hogga I, Barges S, Galloni M, Mishra RK, Hagstrom K, Muller M, Schedl P, Sipos L, Gausz J, Gyurkovics H, Karch F. (1998). Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex. Cell Mol Life Sci 1998, 54:60-70.

62. Mihaly, J., Hogga, I., Gausz, J., Gyurkovics, H., and Karch, F. (1997). In situ dissection of the Fab-7 region of the bithorax complex into a chromatin domain boundary and a Polycomb-response element. Development 124, 1809-1820.

63. Mikhailovsky, S., T. Belenkaya and P. Georgiev, 1999 Broken chromosome ends can be elongated by conversion in Drosophila melanogaster. Chromosoma 108:114-120.

64. Mongerald, F., and V. G. Corces, 2001 Two insulators are not better than one. Nature structural biology 8:192194.

65. Muller M, Hagstrom K, Gyurkovics H, Pirrotta V, Schedl P. The Mcp element from the Drosophila bithorax complex mediates long-distance regulatory interactions. Genetics 1999, 153:1333-1356.

66. Muravyova, E., A. Golovnin, E. Gracheva, A. Parshikov, T. Belenkaya, V. Pirrotta and P. Georgiev, 2001 Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. Science 291:495-497.

67. Nabirochkin S., Ossokina M., Heidmann T. A nuclear matrix/scaffold attachment region co-localizes with the gypsy retrotransposon insulator sequence // J.Biol.Chem. 1998. V.273. P.2473-2479.

68. Nash, W. G., and R J. Yarkin, 1974 Genetic regulation and pattern formation: a study of the yellow locus in Drosophila melanogaster. Genet Res. 24:19-26.

69. Ohtsuki S., Levine M. GAGA mediates the enhancer blocking activity of the eve promoter in the Drosophila embryo // Genes Dev. 1998. V.12. P.3325-3330.

70. Orihara M., Hosono C., Kojima T., Saigo K. Identification of engrailed promoter elements essential for interactions with a stripe enhancer in Drosophila embryos // Genes Cells. 1999. V. 4. P.205-218.

71. Parkhurst, S., and V. G. Corces, 1986 Interactions among the gypsy element and the yellow and suppressor of Hairy-wing loci in Drosophila melanogaster. Mol. Cell. Biol. 6:47-53.

72. Parnell T., Geyer P. Differences in insulator properties revealed by enhancer blocking assays on episomes // EMBO J. 2000. V.19. P.5864-5874.

73. Pikaart M., Recillas-targa F., Fèfàëffléld G. Loss of transcriptional activity of a transgene is accompanied by DNAjjflethilation and histone deacetylation and is prevented by insulators // Genes Dev. 1998. V.12. P.2852-2862.

74. Pirrotta, V. (1997). Pc-G complexes and chromatin silencing. Curr. Opin. Genet. Dev. 7, 249-258.

75. Pirrotta, V. (1998). Polycombing the genome: PcG, trxG, and chromatin silencing. Cell 93, 333-336.

76. Pirrotta, V., and Rastelli, L. (1994). white gene expression, repressive chromatin domains, and homeotic gene regulation in Drosophila. Bioessays 16, 549-556.

77. Pirrotta, V., Steller, H., and Bozzetti, M.P. (1985). Multiple upstream regulatory elements control the expression of the Drosophila white gene. EMBO J. 4, 3501-3508.

78. Robertson H.M., PrestsonC.R., Philips R.M. et al. H Genetics. 1988. V. 118. P. 461-470.

79. Roseman, R. R., E. A. Johnson, C. K. Rodesch, M. Bjerke, R. N. Nagoshi and P. K. Geyer, 1995 A P element containing suppressor of Hairy-wing binding region has novel properties for mutagenesis in Drosophila melanogaster. Genetics 141:1061-1074

80. Roseman, R. R., V. Pirrotta and P. K. Geyer, 1993 The su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects. EMBO J. 12:435-442.

81. Rubin, G.M., and Spradling, A.C. (1982). Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science 218, 348-353.

82. Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis, 1989 Molecular cloning: a Laboratory Manual, Ed.2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY

83. Sánchez-Herrero, E. (1991). Control of the expression of the bithorax complex abdominal-A and Abdominal-B by cis-regulatory regions in Drosophila embryos. Development 111, 437-448.

84. Scott, K. S., A. D. Taubman and P. K. Geyer, 1999 Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength. Genetics 153:787-798.

85. Scott, K. S., and P. K Geyer, 1995 Effects of the su(Hw) insulator protein on the expression of the divergently transcribed Drosophila yolk protein genes. EMBO J. 14:6258-6279.

86. Sigrist, C. J. A., and V. Pirrotta, 1997 Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by the Drosophila Polycomb Response Element (PRE) but allow trans interactions between PREs on different chromosomes. Genetics 147:209-221.

87. Sipos L, Mihaly J, Karch F, Schedl P, Gausz J, Gyurkovics H. Transvection in the Drosophila Abd-B domain: Extensive upstream sequences are involved in anchoring distant cis-regulatory regions to the promoter. Genetics 1998,149:1031-1050.

88. Smith P. T., Corces V. G. The suppressor of Hairy-wing binding region is required for gypsy mutagenesis. // Mol. Gen. Genet. 1992 .V. 233. P. 65-70.

89. Spana, C., and V. G. Corces, 1990 DNA bending is a determinant of binding specificity for a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev. 4:1505-1515.

90. Spana, C., Harrison A., and V. G. Corces. 1988 The Drosophila Melanogaster supressor of Hairy-wing protein binds to specific sequences of the gypsy retrotransposon Genes Dev. 2:1414-1423

91. Spradling, A.C., and Rubin, G.M. (1982). Transposition of cloned P elements into

92. Streck, R. D., J. E. Maccaffey and S. K. Beckendorf 1986 The structure of hobo transposable elements and their insertion sites. EMBO J. 5:3615-3623.

93. Udvardy, A., 1999 Dividing the empire: boundary chromatin elements delimit the territory of enhancers. EMBO J. 18:1-8.

94. Webber A., Ingram R., Levorse J. et al. Location of enhancers is essential for imprinting of H19 and Igf2 II Nature. 1998. V.391. P.711-715.

95. Yoshida C., Tokumasu F., Hohmura K. et al. Long range interaction of cis-DNA elements mediated by architectural transcription factor Bachl // Genes Cells. 1999. V. 4 P.643-655.

96. Zhao, K., C. M. Hart and U. K. Laemmli, 1995 Visualization of chromosomal domains with boundary element-associated factor BEAF-32. Cell 81:879-889.

97. Zhou J., H. Ashe, C. Burks and M. Levine, 1999 Characterization of the transvection mediating region of the Abdominal-B locus in Drosophila. Development 126:3057-3065.

98. Zhou, J., and M. Levine, 1999 A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embryo. Cell 99:567-575.

99. Zhou, J., S. Barolo, P. Szymanski and M. Levine, 1996 The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo. Genes Dev. 10:3195-3201.

Содержание

Введение 2

Обзор литературы 4

2.1. Общая характеристика инсуляторов 4

2.2. Инсулятор 5и(Н\у) 5

2.3. 5сз' и Без инсуляторы 10

2.4. Куриный Р-глобиновый инсулятор 11

2.5. Инсуляторы расположенные на границах регуляторных доменов гена АЪй-В 13

1.6. Механизмы действия инсуляторов 15

1.7. Возможная роль ВТВ доменов в явлении инсуляции и взаимодействиях между шхансером и промотором 18

Материалы и методы 24 $.1. Генетические методы 24

3.1.1. Линии и мутации Рго.чорЫ1а те1апога$1ег, использованные в данной работе 24

3.1.2. Трансформация эмбрионов РговорИИа тектояаь^ег и получение трансгенных линий 26

3.1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов уе!1ом> и тхпШШг в трансгенных линиях 26

3.1.4. Генетические скрещивания 27 к2. Биохимические методы 30

3.2.1. Выделение ДНК из дрозофилы 30

3.2.2. Саузерн-блот-анализ 30

3.2.3. Метод полимеразной цепной реакции (ГИДР) 31

3.2.4. Секвенирование плазмид и ПИР продуктов 32

3.2.5. Молекулярное клонирование 32

3.2.6. Трансформация бактериалькыхклеток плазмидами 32

3.2.7. Вьщеление ДНК плазмид методом щелочного лизиса 33

3.2.8. Анализ связывания белка БиГНуу) с фрагментами ДНК ш уйго 33

3.2.9. Создание конструкций 34

Результаты 36

4.1. Получение производных v2ssc+ линии в результате индукции транспозиций Р элемента 36

4.2. Анализ способности сайтов связывания с белком Sufflw). находящихся в 135 п.н. фрагменте, блокировать взаимодействие между энхансером и промотором генов yellow и white в трансгенных линиях 41

4.3. Sufflw) белок связывается с каждым из двух сайтов 135 п.н. фрагмента in vitro 48

4.4. Белки Sufflw) и Mod(mdg4) участвуют в регуляции экспрессии генов -¿¿"-комплекса 49

4.5. Регуляции экспрессии некоторых sc аллелей, индуцированных инсерцией Р элементов. на фоне мутаций по генам sit(Hw) и mod(mdg4) и phFl 54

Обсуждение 59

5.1. Два геномных сайта связывания для белка Sufflw) создают функциональный инсулятор. который способен нейтрализовать полноразмерный Sufflw) инсулятор из МДГ4 59

5.2. Геномные сайты связывания с Sufflw) белком, найденные между генами yellow и achaete. эффективнее полученных на основании консенсуса сайтов связывания из МДГ4 60

5.3. Sufflw) и Mod(mdg4) участвуют в регуляции генов AS-комплекса 62 Выводы 65 Список литературы 66 Содержание • 76