Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение нового семейства генов su(mg) у Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика
Автореферат диссертации по теме "Изучение нового семейства генов su(mg) у Drosophila melanogaster"
На правах рукописи УДК 575 22 595 773 4
КРИВЕГА ИВАН ВАЛЕРЬЕВИЧ
Изучение нового семейства генов у ОговорЫШ melanogaster.
03 00 26 - молекулярная генетика
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
ООЭ162312
Москва 2007
003162312
Работа выполнена в группе «Молекулярной генетики дрозофилы» Института биологии гена РАН
Научный руководитель
кандидат биологических наук Головнин Антон Клеменсович Официальные оппоненты
доктор биологических наук, профессор Глазков Михаил Васильевич кандидат биологических наук Краснов Алексей Николаевич
Ведущая организация Институт молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН
Защита диссертации состоится 23 октября 2007 года, в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002 037 01 при Институте биологии гена РАН по адресу 119334, Москва, ул Вавилова, д 34/5
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, Москва, ул Вавилова, д 32
Автореферат разослан 20 сентября 2007 года
Ученый секретарь
Диссертационного совета,
канд фарм наук (^^^^^т^^и^иЗЕрабовская Л С
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Экспрессия гена регулируется при помощи различных цис- и транс-регуляторных элементов К цис-регуляторным элементам относятся последовательности ДНК, непосредственно прилежащие к генам, так называемые промоторы, и дистально расположенные энхансеры и сайленсеры Большинство энхансеров не обладает специфичностью по отношению к промоторам, следовательно, должна существовать система, ограничивающая активность энхансера только «правильным» промотором Предполагается, что в функционировании данной системы значительную роль могут играть инсуляторы Инсулятор представляет собой последовательность ДНК, которая, находясь между энхансером и промотором, ограничивает их взаимодействие Таким образом, инсуляторы выполняют важную функцию регуляции транскрипции, определяя какой энхансер должен активировать данный промотор
На настоящий момент механизм действия инсуляторов полностью не изучен Существует несколько моделей их функционирования, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки, но практически все они предполагают связь работы инсулятора с ядерной периферией и белками ядерного матрикса К сожалению, до сих пор не выявлены конкретные белки, входящие в эти ядерные структуры и одновременно влияющие на работу инсулятора Это направление исследований представляет большой интерес, так как рассматривает инсуляцию как составную часть глобального процесса регуляции транскрипциии в ядре в целом Выяснение функциональных связей между процессом инсуляции и белками ядерного матрикса позволит понять роль инсуляторов в образовании различных областей ядра с повышенной и пониженной активностью транскрипции
В представленной работе было продолжено изучение широко известного 8и(Н\у)-зависимого инсулятора, впервые обнаруженного в последовательности ретротранспозона МДГ4 у ОгозорЫа те1апо%,а$1ег Известно, что инсулятор 8и(Н\у) способен блокировать более 30 известных энхансеров, работающих в разных тканях и на разных этапах развития Белковый комплекс инсулятора 8и(Н\у) состоит из трех известных на данный момент белков связывающегося с ДНК белка Su(Hw),
белка Mod(mdg4) и недавно открытого белка СР190 Мутация в гене mod(mdg4) нарушает связывание кодируемого им белка Mod(mdg4)67 2 с инсуляторным комплексом Отсутствие белка Mod(mdg4)67 2 приводит к нарушегшю инсуляции в различных модельных системах Недавно в нашей лаборатории была обнаружена группа генов su(mg) (suppressor of mod(mdg4)), мутации в которых приводили к восстановлению 8и(Н\у)-зависимой инсуляции даже при отсутствии белка Mod(mdg4)67 2 Один из клонированных генов группы su(mg) кодирует белок EAST, который, как предполагается, является компонентом ядерного матрикса Изучение свойств и функций этого белка позволит более детально понять связь между инсуляцией, ядерным матриксом и транскрипцией
Цель и задачи исследования
Основной целью данной работы является изучение структуры и функций гена из семейства sn(mg), который кодирует белок EAST
В работе были поставлены следующие задачи
1 Изучить генетические взаимодействия между геном east и генами, кодирующими белки, входящие в состав инсуляторного комплекса Su(Hw)
2 Найти в составе ретортранспозона МДГ4 последовательность, отвечающую за проявление эффектов гена east
3 Доказать существование молекулярных взаимодействий между белками EAST, СР60 и белками инсуляторного комплекса
Научная новизна и практическая ценность работы. В представленной работе впервые было продемонстрировано непосредственное участие в составе инсуляторного комплекса белка СР60, который считается компонентом ядерного матрикса Впервые было показано прямое взаимодействие белков СР60 и EAST, при этом белок EAST является также одним из возможных компонентов ядерного матрикса
Также было показано, что для проявления эффектов гена east в изучаемой модельной системе, необходимы последовательности инсулятора Su(Hw) и длинного концевого повтора из ретротранспозона МДГ4
Полученные генетические данные позволяют выдвинуть гипотезу о том, что белок EAST является компонентом неизвестной ранее системы репрессии генов, находящихся в эухроматиновых районах генома
Таким образом, в представленной работе впервые было показано наличие функциональных и физических взаимодействий между белками инсуляторного комплекса и белками, предположительно входящими в состав ядерного матрикса, -EAST и СР60
Полученные в данной работе результаты позволяют лучше понять организацию транскрипции в ядре в целом и выявить области ядра с разным уровнем генной активности, что может быть полезно для создания стабильно экспрессирующих продуцентов
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции "Nuclear Structure & Dynamics" (Монпелье, Франция, 2007) и на 10-ой школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2006)
Публикации
По теме диссертации опубликованы две научные статьи
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 125 страницах, включает 7 таблиц и 27 рисунков, состоит из следующих разделов введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы, содержащий 240 цитируемых источников
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Изучение влияния гена east на функционирование инсулятора в системе аллеля у2
Ранее были обнаружены две слабые мутации в гене east, относящемся к семейству генов su(mg) east' и easf2 (Bezborodova et al, 1997) Эти мутации
вызваны встраиванием Р-элемента в промоторную область гена и приводят к незначительному снижению уровня экспрессии
Для изучения того, как ген east влияет на функционирование Su(Hw) инсулятора, были получены две линии Drosophila melanogaster В линии ^easf'w11'8, где гены yellow и white были полностью инактивированы, концентрация белка EAST снижалась благодаря наличию мутации В другой линии y!w'"8,P{east+, w*}/CyO, P{east+, w+}/TM6, Tb, где гены yellow и white также были инактивированы, концентрация белка EAST значительно возрастала из-за присутствия конструкции, содержащей геномную последовательность гена east
В качестве модельной системы для изучения участия белка EAST в инсуляции была использован аллель у2 Мутация у2 вызвана встраиванием ретротранспозона МДГ4 между энхансерами, отвечающими за экспрессию гена yellow в теле и крычьях, и промотором этого гена В результате мухи имеют желтые тело и крылья, так как входящий в состав МДГ4 инсулятор Su(Hw) блокирует взаимодействие между энхансерами и промотором гена Однако экспрессия гена yellow в щетинках не нарушена, поскольку соответствующий энхансер находится в интроне гена и не блокирован инсулятром Поэтому у мух фенотипа у2 щетинки полностью окрашены
Скрещивание линии у2 с линией у1easf'w1118 не влияет на экспрессию гена yellow Однако при введении одной или двух дополнительных копий гена east в линию у2 наблюдается почти полная репрессия гена yellow в щетинках Эффект гиперэкспрессии гена east не проявляется на диком аллеле у+ Таким образом последовательность ретротранспозона МДГ4 необходима для проявления эффектов гена east
Мутация mod(mdg4)"' нарушает связывание белка Mod(mdg4)67 2, одного из компонентов инсуляторного комплекса, с инсулятором Su(Hw) В линии у2, mod(mdg4)u1/ mod(mdg4)ul наблюдается почти полная репрессия гена yellow в щетинках мух и частичное снятие инсуляции в абдоминальных сегментах брюшка (Georgiev and Kozycina, 1996) Дестабилизация инсуляторного комплекса на фоне мутации mod(mdg4)ul превращает аллель у2 в чувствительную тест-систему,
позво тающую генетическими методами обнаруживать белки, влияющие на работу инсулятора Su(Hw)
Комбинация мутации easf и mod(mdg4)ul на фоне аллеля у2 приводит к восстановлению экспрессии гена yellow в щетинках и абдоминальных сегментах брюшка Гиперэкспрессия гена east, совмещенная с мутацией mod(mdg4)u', на фоне аллеля у2 приводит к почти полной репрессии гена yellow - абдоминальные сегменты брюшка и щетинки не окрашены Для подтверждения функциональности линии у^'"8,Р{еа$^, w'j/CyO, P{east+,w+}/TM6,Tb был проведен эксперимент по «спасению фенотипа» Одновременное сочетание мутации easf1 и гиперэкспрессии гена east в линии у\ mod(tndg4)"'/mod(mdg4)ul приводило к репрессии гена yellow в щетинках и вариабельной окраске брюшка Таким образом, мутация easf1 и гиперэкспрессия гена east компенсируют эффект друг друга, что говорит о функциональности линии y'w^^.Pfeast1, w'}/CyO,P{east*, w+}/TM6,Tb
2. Определение последовательности, ответственной за проявление EAST-зависимой репрессии
Чтобы выяснить, будет ли увеличение количества последовательностей ретротранспозона МДГ4 в предпромоторной области гена yellow приводить к усилению EAST-зависимой репрессии, в следующей серии экспериментов были использованы описанные ранее производные аллелеля у2, названные ут (Melnikova and Georgiev, 2002) Данные аллели несут терминальные обрывы хромосомы непосредственно в зоне энхансеров, контролирующих экспрессию гена yellow в теле и крыльях, дистальнее ретротранспозона МДГ4 Увеличение концентрации белка EAST не влияет на экспрессию аллеля ут, который содержит только одну копию ретротранспозона МДГ4 При увеличении количества копий МДГ4 в аллелях ут эффект действия лишних копий гена east на экспрессию yellow в щетинках становился все сильнее В линиях, содержащих 2 копии ретротранспозона МДГ4, наблюдалась частичная репрессия, то есть только часть щетинок не была окрашена Тогда как в линиях, содержащих 4-5 копий ретротранспозона МДГ4, экспрессия гена
yellow в щетинках была полностью подавлена - все щетинки у мух были неокрашены и, кроме того, наблюдалась слабая репрессия в теле и крыльях (табл 1)
Название аллетя Степень пигментации Степень пигментации Степень пигментации
кутику тарных структур кутикулярных структур кутикулярных структур
при нормальном уровне при введении 1 копии при введении 2 копий
экспрессии гена ею! трансгена Pfeast »4 трансгена P{east* w*}
Т/А/Кр ! щ Т/А/Кр | Щ Т/А/Кр ( Щ
V 2/2/2 5 2/2/2 ev 2/2/2 1
yTD( 1 копия 2/2/2 5 2/2/2 5 2/2/2 5
МДГ4)
У°(2 копии 4/4/4 5 4/4/4 wv 4/4/4 mv
МДГ4)
(4-5 копий 4/5/5 5 4/5/5 ev 3/5/4 1
МДГ4)
Таблица 1 Анализ влияния гиперэкспрессии гена east на 7го аллели В аллелях у70 в скобках указано количество копий МДГ4 в изучаемой линии Обозначения Т-тело, А-абдоминальныс сегменты Кр-крылья, Щ-щетинки Пигментация щетинок 1-все щетинки неокрашены, ev-большая часть щетинок не окрашена, mv-количество окрашенных и неокрашенных щетинок примерно одинаково, wv-большая часть щетинок окрашена, 5- все щетинки окрашены Пигментации тета, крыльев и абдоминальных сегментов оценивалась сопасно работе Gause et al, 1998, где 1-нет окраски, 5-окраска как у дикого типа
Данные результаты позволяют предположить, что в теломерных районах влияние гиперэкспрессии гена east на экспрессию гена yellow частично подавлено Возможно, теломерный белковый комплекс нейтрализует действие белка EAST Возрастание количества копий ретротранспозона МДГ4 в линиях, несущих аллель ут, приводит к увеличению расстояния между теломерным комплексом и промотором гена yellow и усилению репрессии Поэтому y1D линии, содержащие несколько копий ретротранспозона МДГ4, наиболее чувствительны к изменению концентрации белка EAST
Полученные результаты подтверждают вывод о том, что для проявления эффекта гена east в системе аллеля у2 необходимо присутствие последовательности ретротранспозона МДГ4 Исходя из генетических взаимодействий, можно предположить, что белок EAST действует как репрессор на экспрессию аллеля У
Для выявления последовательности МДГ4, необходимой для EAST-зависимой репрессии, были использованы описанные ранее частичные или полные ревертанты аллеля у2 (Georgiev et al, 1990) (рис 1)
Рисунок 1. Схематичное изображение аллелей гена уг11о'л, в которых присутствуют раз.татевге 1 последовательности ретротранспйЭОна МД1'4 Обозначения: стрелка - направление транскрипции гена yellow; петые горизонтальные прямоугольники - экзонь; гена; серые осалю - экхансеры. контролирующие : экспрессию тшаyeüow в теле (Т). крыльях (К) и щетинках (1Д); черный овал - инеулятор Su(Hw), отрезки -■ размер делеций в аллелях у'1*® и у ^
D полном ревертанге }'~1ML, вследствие делеций в ретротрансиозоне МДГ4, остается только один из его длинных .концевых повторов (ДКП), Повышение концентрации белка EAST не влияло на экспрессию аллеля yf1!ííc (табл.2). Поэтому I можно предположить, что для EAST-тавнсимой репрессии необходимо более одной по следователь кости ДКП. В частичном рервертанте уг!Ь мобильный элемент hobo встроился в последовательности инсулятора Su(Hw), что привело к его частичной инактивации, при этом другие последовательности МДГ4 остались неизмененными (рис.1) (Geyer et al., 1988). Совмещение аллеля У с двумя дополнительными копиями гена east привело к полной инактивации гена yellow в щетинках и восстановлению репрессии в теле и крыльях (тао.т. 2) Тзшм образам, увеличение концентрации белка EAST влияет на экспрессию г спя yellow во всех кути кул яр ных Структурах. В полном ревертавте встраивание мобильного элемента jockey в
последовательность МДГ4 привело к полной делении последовательностей инсулятора, в то же время другие последовательности МДГ4 были сохранены (рис.1). Увеличение концентрации белка EAST приводило к полной репрессии гена yellow в щетинках и слабой репрессии в теле и крыльях (табл.2). Исходя из
i
, структуры использованных аллелей можно предположить, что та эффект1 репрессии . отвечают первые 500 нуклеотидов последовательности длинного концевого повтора (ДКП) МДГ4, оставшаяся в адаелъуг2!4С (координаты согласно Marlor et at., 1986).
Название аллеля Степень пигментации Степень пигментации Степень пигментации
кутикулярных кутикулярныч структур кутикутярных структур
структур при при введении 1 копии при введении 2 копий
нормальном уровне трансгена Р{vast трансгена Pfeastvt*}
экспрессии гена east
Т/А/Кр 1 щ Т/А/Кр | щ Т/А/Кр | Щ
/ 2/2/2 5 та ev та i
+ ШС та 5 та 5 2/2/2 5
уи 3/3/3 5 3/3/3 ev 2/2/2 1
5/5/5 5 5/5/5 ev 5/5/5 1
Таблица 2 Анализ влияния гиперэкспрессии гена east на ревертанты аллеля у Обозначения, как в таблице 1
Согласно изложенным выше данным, гиперэкспрессия гена east, совмещенная с мутацией mod(mdg4')"', приводит к почти полной репрессии гена yellow в аллеле у2 Следовательно, наблюдаемый эффект зависит от присутствия белка Mod(mdg4)67 2, участвующего в формировании инсуляторного комплекса Su(Hw) Ранее было показано, что мутация mod(mdg4)"' никак не влияла на экспрессию у+2М^ аллеля, что говорит о взаимодействии белка Mod(mdg4)67 2 только с последовательностью инсулятора в составе МДГ4 (Georgiev and Corees, 1995) Таким образом, белок EAST оказывает влияние на функционирование инсулятора при помощи двух последовательностей инсулятора Su(Hw) и длинного концевого повтора (ДКП)
Для изучения влияния инсулятора Su(Hw) и ДКП на проявление EAST-зависимой репрессии была создана генетическая конструкция Р{ДКП-Su, w+) В состав данной конструкции входили инсулятор Su(Hw), содержащий 12 сайтов связывания для белка Su(Hw), и ДКП, содержащий первые 500 нуклеотидов (Marlor et al, 1986) Данные последовательности были встроенные между энхансерами, контролирующими экспрессию гена yellow в теле и крыльях, и промотором гена yellow (рис 2)
Рисунок 2. Схематичнее изображение генетической конструкции l'{MKH-Su:w'}. Обозначения: cepjfbjc круги -энжшссры гона yellow, черный овал - последовательность иноулятора Su(Hw) (Su), белый опал - последовательности длинного концевого повтора (ДКП), горизонтальные прямоугольники - последииательнос-ти генов yellow v. white, горизонтальные стрелки - направление транскрипции этих генов, черные вертикальные стрелки - сайты узнавания для ГЬР-рекоибннааы, белые вертикальные стрелки - сайты узнавания для CRE-рекомбиназы.
Данная генетическая конструкция была встроена в 17 различных районов генома Drosophila melanogaster. Все трансгенные линии имела максимально окрашенные щетинки. Удаление последовательности ДКП никак не влияло на экспрессию гена yt'ilo\v в щетинках. Введение гиперэкснрессии гена east приводило к подавлению экспрессии гена yellow в щетинках в половине тр autre иных линиях (таб. 3), данный эффект зависел от наличия последовательности ДКП. Введение мутации mod(mdg4)"' приводило к подавлению экспрессии гена. уе/1ом> в щетинках во всех трансгенных линиях. Репрессия ослаблялась при удалении последовательности ДКП.
Введение мутации modimdg4f" одновременно с гипергжспрессией гена east в трансгенные линий усиливало репрессвднный аффект даже в отсутствие последовательности ДКП. Полученные данные говорят о том, что последовательность ДКП необходима для проявления EAST-закисимой репрессии и усиления эффекта мутации mod(mdg4)ul, При этом на фоне мутации rnod(mdg4f пшерзкепрсссия гена east в отсутствие ДКП может оказывать репрессиовный эффект через последовательность инсулятора Su(Hw).
Обобщая полученные результаты, можно сделать вывод, что белок EAST связан с белковыми комплексами, собирающимися на последовательностях инсулятора Su(Hw) и ДКП из ретро нтраншозона МДГ4.
Генотип, исследуемых линий РЩКП suy¡ Р{&ДКП SU У}
1 ev mv wv 5 l ev mv wv 5
+/+ 0 0 0 0 17 0 0 0 0 17
mod(mdg4)"'/ mod(mdg4)"' 15 1 0 1 0 7 2 4 1 3
Pfeast*, w*¡ 3 1 3 2 8 0 0 С 5 12
P{easí\ O mod(mdg4)" /mod(mdg4)"' 16 j 1 1 0 0 14 1 2 0 0
Таблица 3 Анализ влияния гиперэкспрессии гена east на генетическую конструкцию РЩКП-Sit у>*} Обозначения Д - вырезание последовательности ДКП из конструкции Окраска щетинок оценивалась как в таблице I Цифрами в таблице указано количество линий с соответствующей окраской щетинок
3. Участие белков СР60 и EAST в функционировании инсулятора Su(Hw)
Полученные результаты позволяют предположить, что белок EAST регулирует активность инсулятора Su(Hw) в составе ретротранспозона МДГ4 Так как белок EAST в нормальных условиях не взаимодействует с хроматином (Wasser and Chía, 2007), должен существовать другой белок или белковый комплекс, обеспечивающий функциональную связь белка EAST с инсулятором Su(Hw)
Один из предполагаемых компонентов ядерного матрикса, белок СР60, колокализуется в ядре с белком EAST в межхромосомном пространстве и его локализация зависит от уровня экспрессии гена east (Wasser and Chía, 2000) Кроме того, было показано, что белок СР60 колокализуется в ядре с белком СР190, компонентом инсулятора Su(Hw) (Kellogg et al 1995 Whitfield et al 1995) Данные факты позволяют сделать предположение, что белок СР60 может выступать в роли посредника между белком EAST и инсуляторным комплексом
3.1 Взаимодействие белка СР60 с инсулятором Su(Hw) in vitro.
Используя библиотеку кДНК, созданную при помощи обратной транскрипции на РНК, выделенной из линии Oregon, была получена последовательность ДНК, кодирующая белок СР60
Анализ взаимодействия белка СР60 с компонентами инсуляторного комплекса проводили с помощью дрожжевой двугибридной системы Было показано, что белок СР60 напрямую взаимодействует с белком CP 190, но не взаимодействует с другими известными компонентами инсулятора Su(Hw) белками Su(Hw) и Mod(mdg4)67 2
Белок СР60 на К-конце содержит домен, который относится к семейству MADF, Данные домены обеспечивают взаимодействие белков с ДНК (Culler е! al., i 998). Для того чтобы выяснить, способен ли белок СР60 взаимодействовать с Д11К in vilro. был использован метод задержки в геле комплекса ДНК-белок (EMSA), В качестве тестируемых инсуляторов, были взяты следующие последовательности-йнсулятор Su(Hw) из ретротранспозона МДГ4 я эндогенный инсулятор из локуса 1А2, содержащий два сайта связывания для белка Su(Hw). Белок СР60 взаимодействует с этими последовательностями и не взаимодействует с кодирующей белок последовательностью из гена modiindg4) (рис.3).
Рисунок 3. Задержка в геле комплексов различных последовательностей ДНК с белкам СР60. А Задержка в геле белка CP6Û с последовательностью ннсуднтора Su(Hv> ) нз рстротранепозона МДГ4 . Б. Зззержкя з rc.tc белка СР60 ç последовательностью ннеулятора Su(Hw) локуеа ЕА2. Обо&Фчений МДГ4 - поеледовате.тьностъ имсулятора Su(Rw) из ретротранспоиона. МДГ4\ СОМ - последовательное™ ДНК из кодирующей белок части гена pohdldC - количество микрограмм неспецифнчеекого
конкурента polydldC. добавленного о реакционную смесь: CP60J [îs - белок СР50 с шестью гистидинами на С-концс аминокислотной последовательности. &His - антитела, узнающие последовательность шести гиствдшов: - и - - наличие или отс\тетеие данных компонентов в реакционной смеси.
При помощи упоминавшейся выше библиотеки к ДНК, выделенной из линии Drosophila melanogasier Oregon. была получена последовательность, кодирующая белок FAST. Для того, чтобы доказать прямое взаимодействие между белками СР60 и EAST, были созданы конструкции для дрожжевой двугибридной системы В результате было показано, что белок EAST способен взаимодействовать с белком СР60 своим С-концевым доменом. Таким образом, белок EAST может влиять на функционирование ипсу;опора Su(Hw) ттри помоши белка СР60,
3.2 Взаимодействие белка СР60 и инсулятора Su(Hw) in vivo в клетках
линии S2
Для изучения свойств белка СР60 были созданы конструкции, позволяющие экспрессировать данный белок с пришитым к нему FLAG-эпитопом в культуре клеток S2 и имагинальных дисках личинок Drosophila melanogaster
С помощью метода X-ChIP на клетках линии S2 было проверено взаимодействие белка CP60-FLAG с инсуляторами, которые были использованы в предыдущем эксперименте и в исследованиях Parnell et al, 2006 В качестве контроля использовалось взаимодействие белка Mod(mdg4)67 2 -FLAG с этими же инсуляторами Согласно полученным данным, белок СР60 взаимодействует с последовательностями эндогенных инсуляторов инсулятором из ретротранспозона МДГ4 in vivo и не взаимодействует с последовательностями из кодирующими белок части генов actin и ras (рис 4)
Рисунок 4 Результаты хрочатиничмунопреципитация белков CP60-FLAG и Mod(mdg4)67 2-FLAG в клетках линии S2 Показан усредненный результат треч экспериментов Результаты представлены в виде процентов от кочичества ДНК в изначальном клеточном экстракте Белым цветом показаны результаты, получившиеся с антителами к эпигоп) FLAG Серым цветом указаны результаты, получившиеся с неспецифическими антителами Обозначения gypsyl-З - последовательность инсулятора Su(Hw) и¡МДГ4, 1А2, 24D, 62D 87Е, 50А, 66Е - последовательности эндогенных инсуляторов из соответствующих локусов (Parnell et al, 2006, Golovnm et al, 2003), 1 Al, 1A6 - последовательности ДНК, не содержащие сайты связывания для белка Su(Hw), RAS - последовательность из гена ras, кодирующая беток, Act - последовательность из гена actin, кодирующая белок
Чтобы подтвердить вхождение белка СР60 в состав инсуляторного комплекса,
был проведен эксперимент по коиммунопреципитации белка CP60-FLAG и белка
Mod(mdg4)67 2, входящего в состав инсулятора Su(Hw) Положительным контролем
служила коиммунопреципитация белков Su(Hw)-FLAG и Mod(mdg4)67 2 Было
установлено, что белки CP60-FLAG и Mod(mdg4)67 2 могут входить в состав одного
12
комплекса, что подтверждает участие белка СР60 в формировании инсуляторного комплекса. Su(Hw') (рис.5).
Рисунок 5. Результат коиугтъ-с преципитации 6s л ков CP60FLAG и M«f(ií|¡fe4)6?.2 (А) и бг.ч.тон Su(Hw)FLAG и Mcd(mdg4)67.2 (Б). Обозначения: ItiPat- дорожка геля, на котирую был нанесен клеточный экстракт^ *АЬ - дорожка с элюци&й фракции ядреного экстракта, связавгаегоск с антителами к эпигону FLAG,Out+^- дорожка с экстрактом, не связавшимся с я;г: i' к эпигону FLAG -АЬ-
дорожка с jлинией фракция ядерного экстракта, связавшегося с неслецнфкческимк антителами; Oul-дорожка с ядерным экстрактом, не связавшимся с неспецифическими антителами; Mark-дорожка с маркером Молекулярной массой белков (изображена Полоса соответствующая размеру 1 СО кДа).
3.3 Изучение свойст белка СР60 in vivo в клетках Dtosopliila melatwgaster.
Участие белка С.РбО в составе инсуляторного комплекса было также проверено с помощью окрашивания политенных хромосом клеток слюнных желез Drosophila tnelanogaster, в результате было .установлено, что многие сайты связывания для белков CP60-FLAG и Mod(mdg4)67.2 кол окал изуются Щ политентах хромосомах. Однако иногда встречаются локусы, где белок CP60-FLAG находится в районах, не содержащих белки Mod(nidg4)67.2, и наоборот, локусы, содержащие сайты связывания только для белка Mod(mdg4)67.2 (цветные фотография представлена в гехсте диссертации). Таким образом, при помощи иммунного окрашивания политеппы.х хромосом слюнных желез Drosophila melanogaster было показано, что белок CP 60 ассоциирован с большинством сайтов связывания для белка Mod(mdg4)ó7,2 (цветные фотография представлена в тексте диссертации).
В ядре клетки инсуляторные белки Sn(ITw), Mod(mdg4)fi7.2 и СР190 образуют
большие комплексы, названные «инсуляторными тельцами» (Gerasimova et al, 2000;
Pai et al. 2004). Предполагается, что «инсуляторные тельца» представляют собой
совокупность Шсуляторных комплексов, связанных с ДНК. Таким образом,
участвующие в инсуляпии белки должны колокализоваться в «инсулятйрных
¡3
тельцах» или влиять на их формирование Поэтому была проверена локализация белка CP60-FLAG в клетках линии S2 и в клетках имагинальных дисков личинки Drosophria melanogaster В результате было выяснено, что белок CP60FLAG в значительной степени, но не полностью, колокализуется с белком Mod(mdg4)67 2, который был использован в качестве маркера «инсуляторных телец» (цветные фотография представлена в тексте диссертации)
Описанные выше результаты подтверждают участие белка СР60 в функционировании инсулятора Su(Hw)
Исходя из полученных результатов, можно предположить, что изменение экспрессии генов east и србО будет влиять на формирование белками Su(Hw) и Mod(mdg4)67 2 «инсуляторых телец» в ядрах клеток имагинальных дисков личинки Drosophila melanogaster Увеличение (дополнительная копия трансгена, кодирующего белок CP60-FLAG) или уменьшение (введение мутации в гене србО -србОп - в гетерозиготе) уровня экспрессии гена србО не влияло на распределение белков Su(Hw) и Mod(mdg4)67 2 в ядрах клеток имагинальных дисков Однако увеличение уровня экспрессии гена east (две копии конструкции Р{еа\С,w~}) приводило к резкому снижению количества «инсуляторных телец» и перемещению оставшихся к ядерной оболочке В то же время, частичная инактивация гена east в мухах несущих мутацию easf1, никак не влияла на распределение белков Su(Hw) и Mod(mdg4)67 2 в ядрах клеток имагинальных дисков Данные результаты указывают на взаимосвязь уровня экспрессии гена east с формированием и распределением «инсуляторных телец», образованных белками инсуляторного комплекса (цветные фотография представпена в тексте диссертации)
3.4 Функциональное взаимодействие между белками СР60 и EAST и белками инсуляторного комплекса.
Для изучения функционального взаимодействия между белками инсуляторного комплекса и белками СР60 и EAST был проведен ряд генетических скрещиваний между линиями мух, несущими мутации или дополнительные копии исследуемых генов В качестве модельной системы использовался аллель у2 Прежде всего, было
генов. В качество модельной системы использовался аллель jr. Прежде всего, было проайапнзя;равано взаимодействие гена east с геном ср}9(), кодирующим один из белковых компонентов инсуляторного комплекса (Paí et al., 2004). Мутация в гене ср190 - cps связана с нарушением рамки считывания, в результате получается укороченный нефункциональный белок. Одна или две дополнительные копии гена east приводят к почти полному подавлению экспрессии гена yellow в щетинках мух, а дополнительное введение мутации ср в гетерозиготе усиливает наблюдаемую реп р ее с ионную активность. При совместной гиперэкспрсссии генов ср!90 и east наблюдался обратный эффек-т: полное восстановление транскрипция гена yellow в щетинках.
Затем для выявления взаимодействий между белками CPñO и EAST были проведены скрещивания, приводящие к совмещению дополнительной копии гена east и мутации б гене србО - ср6(^'. Было установлено, что мутация ср60~' усиливает репрессионный эффект1 east, что говорит о наличии взаимодействия между этими генами.
Мутации ц генах ср]90 (ср'), србО (cp6(flJ и east (eastFJ) влияли на выживаемость мух. Совмещение мутаций ср3 и eastP приводило к значительному снижению выживаемости мух. Совмещение мутаций в генах cp60'v и eastF!: напротив, увеличивало выживаемость мух. Эти данные говорят о совместном влиянии изучаемых генов на развитие организма.
Для изучения взаимодействий между генами србО, east и mod(mdg4) была создана генетическая конструкция P{li-Si¡,w*}. Данная конструкция содержала геи yellow и инсулятор Su(Hw), встроенный между знхансерами, контролирующими экспрессию в теле и крыльях и промотором гена yellow (рис.6).
Рисунок 6. Схематичное, изображение генетической конструкций-? }. Обозначения, как на
рнсуикй 2.
Данная генетическая конструкция была встроена в 15 различных районов
генома Огторпйа текто§:шег. Б 9 из .15 полученных линий инсулятор частично
15
или полностью репрессировал экспрессию гена yellow в щетинках на фоне мутации mod(mdg4)ul Репрессия зависела от присутствия последовательности инсулятора Su(Hw) В трансгенных линиях easf1, modfmdg4)"'/mod(mdg4)ul уровень экспрессии гена yellow в щетинках частично восстанавливался Гиперэкспрессия гена east, напротив, усиливала репрессионный эффект мутации mod(mdg4)uI, но точько в линиях, где наблюдалась частичная репрессия в щетинках (табл 4) Данные результаты аналогичны результатам, полученным в системе аллеля у2
Генотип исследуемых линий Окраска щетинок
5 var 1 N/T
+/+ 15 0 0 0/15
mod(mdg4)" /mod(mdg4)"' 6 7 2 9/15
Pfeast*, w*},mod(mdg4)"'/mod(mdg4)u' 5 1 9 10/15
easf, mod(mdg4)l"/mod(mdg4)u' 12 3 0 3/15
србО" ,mod(mdg4)'"/mod(mdg4)'d 6 2 7 9/15
Таб чица 4 Анализ влияния генов east, србО на генетическую конструкцию P{E-Su, w*} Обозначения N - количество линий, изменивших свой фенотип по сравнению с исходной конструкцией, Т - общее чисто линий, Var-часть щетинок мух неокрашена Пигментация щетинок определялась, как в таблице 1 В таблице отражено количество линий, имеющих тот или иной фенотип щетинок
Мутация в гене србО (срб()м) на фоне мутации mod(mdg4)"' усиливала репрессию, вызванную инсулятором Su(Hw) (табл 4) Данные результаты говорят о совместном действии белков СР60 и Mod(mdg4)67 2 направленном на предотвращение репрессии, вызванной белком EAST (табл 4)
Однако в 6 из 15 полученных линий мутация mod(mdg4)ul не вызывала репрессию гена yellow Сочетание мутации mod(mdg4)ul с гиперэкспрессией гена east также не подавляло транскрипцию гена yellow в этих линиях
Полученные результаты подтверждают наличие функционального взаимодействия между белками СР60, EAST и белками инсуляторного комплекса Также можно сделать вывод, что репрессионный эффект белка EAST зависит от положения инсулятора в геноме
4. Влияние белка EAST на функционирование инсулятора в системах, отличных от аллеля у2
Генный комплекс achaete-scute (AS-комплекс) расположен рядом с геном yellow, на экспрессию которого влияет изменение концентрации белка EAST Гены achaete и scute отвечают за развитие щетинок у дрозофилы Точная работа этих генов регулируется большим количеством специфичных энхансеров (Modolell and Campuzano, 1998) Мутация вызвана встраиванием ретротранспозона МДГ4 между геном scute и частью его энхансеров, вследствие чего активность этих энхансеров блокируется инсулятором Su(Hw) (рис 7)
yellow вс sc I sc ase
сА=> =s> <=> «==> С=>
70 60 50 40 30 20 10 О - 10 - 20 - 30
Рисунок 7 Схематичное изображение аллелей генного комплекса achaete-scute, использованных в работе Обозначения координаты в AS-кочплексе указаны в тысячах пар нуклеотидов, инсулятор Sa(Hu) обозначен серым овалом, горизонтальные стрелки над осью координат указывают направление транскрипции и положение соответствующих генов, делении в аллелях sc2 и sc1 показаны горизонтальными прямоугольниками под осью координат, ориентация Р-элементов указана стрелками внутри обозначающих их прямоугольников
Мутации scmsl и sc™2 вызваны встраиванием химерного элемента, содержащего ген yellow и инсулятор Su(Hw) из локуса 1А2, окруженные Р-элементами, в регуляторную область AS-комплекса Увеличение концентрации белка EAST при скрещивании всех вышеперечисленных аллелей с линией y1wI1I8J>{east+,w+}/CyO,P{easC,w+}/TM6,Tb не влияло на их фенотипическое проявление Таким образом, можно сделать вывод, что белок EAST не влияет на экспрессию генного комплекса achaete-scute
Ранее были описаны различные мутации в гене cut, вызванные встраиванием ретротранспозона МДТ4 (Jack et al, 1991) Мутация ct6 вызвана встраиванием МДГ4 между промотором и энхансером гена cut, которые разделены 70 тысячами пар нуклеотидов Инсулятор Su(Hw), входящий в состав ретротранспозона МДГ4,
приводит к полной изоляции энхансера, который регулирует экспрессию гена си/ в крыльях. Частичная деления последовательностей инсулятора в мутации cf'' приводит х неполному восстановлению активности энхансера гена cut. Кроме того, были описаны две мутации, вызванные либо полной (cti<;), либо частичной (l/°a1v) депешей энхансера гена cut (Mogila et al., 1992) (рис.8).
cfN
Рисунок 8. Схематичное изображение аллелей гена cut, использованных в рабэте. Обозначения: горизонтальная стрелка - направление транскрипции гена cut: серый овал - энхяпсеры гена cut', черный овал - икеулятор SuO"ïw); отрезки - размер делений а аллелях cr*', , серый
треугольник - рстр01ранспозон МД1'4\ белые прямоугольники - длинные хоклевые повторы (ДЮТ); стрелки ни упри прямоугольников - направление транскрипции, 70 т.п.н. - расстояние мевду ретротранснозоном МДГ4 и промотором гена cuï. ]-1а феггография.ч представлены фенотипы аллелей, испопьзоа^шых в работе.
Увеличение концентрации белка EAST' при скрещивании мух линии y'wllls;P{easí}/CyO;P{easf }/'Ш6,ТЬ с .мухами, несущими различные аллели гена cut, приводило к значительному усилению проявления мутянтного фенотипа только тех аллелей, в которых энхансер гена cut был частично инактивирован {cfN, cfN2S) В то же время, увеличение конденсации белка EAST не влияло на ci' и ct2S мутации, в которых энхансер был полностью инактивирован Мутации easf1 и еах С2 также супресспровали мутаитное проявление только тех аллелей гена cut, в которых энхансер сохранял частичную активность. Таким образом, белок EAST регулирует активность гена cut вне зависимости от присутствия МД1"4. Возможно белок EAST взаимодействует с белковыми комплексами, непосредственно участвующими в регуляции экспрессии этого гена.
5. Изучение влияния гена east на функционирование различных риipeccионных, белковых комплексов
Так как белок EAST проявляет свойства репресеора гена yellow, была осуществлена попытка выяснить, участвует ли он в работе известных репрессий пых белковых комплексов у Drosophila metanogasier Наиболее изучен регрессионный комплекс, формируемый на последовательности PRE (Polycom b responsible element) (Chan et al., 1994). Для исследования роли белка EAST в активности белков группы Pofycomb (Ус-белки) была создана конструкция P{PRE(S)YW}, в которой PRE из локуса ubx, размером 660 пар нуклеотидов, был вставлен в регуляторкую область гена yellow (рис.9). Ген white, определяющий пигментацию глаз у дрозофилы, использовался в этой конструкции как дополнительный маркерный ген. Кроме того, PRE был отделен от промотора сена yellow инсулятором Su(Hw).
Рисунок 9. Схематичное изображение конструкции P{PRE(S)TW}. Обозначения- серый прямоугольник - РНЕ-злшсит. Остальные обозначения, как па рисунке 2.
В результате трансформации эмбрионов дрозофилы было получено 11 линий, в которых ипсулятор зшцишал промоторы генов yellow и white от PRE-зависимой репрессии. При делении инсулятора в большинстве трансгенных линий PRE индуцировал репрессию. Однако увеличение или уменьшение концентрации белка EAST ее оказывало значительного влияния на PRE-зависимую репрессию генов yellow и white. Таким образом, белок LAST не участвует в JV-зависимой репрессии (табл. 5).
Трансгенная линия Окраска глаз у мух Число линий с новым фенотипом/ Общее число линии
Кр Кор-Кр Кор 1 т Ор Ор тЖ 1 ж св Ж Б
P{PRE(S)YW} 0 0 0 0 3 2 3 3 0 0/11
easf 0 0 0 0 3 2 4 2 0 1/11
P{PRE(h)YW} 0 0 0 0 1 1 2 4 3 7/11
easf 0 0 0 0 1 2 1 4 3 8/11
Таблица 5 Анализ влияния мутации в гене east на Pc-зависимую репрессию в модельной системе гена white В левой колонке приведено название использованной в работе конструкции Обозначения S - присутствие в линии инсулятора Su(Hw), Д - вырезание Su(Hw) инсулятора из конструкции, easf' - введение в обозначенные выше линии мутации в гене east Окраска глаз у мух обозначена с помощью следующих сокращений Кр-красная, Кор-Кр-коричнево-красная, Кор-коричневая, т Ор-темно-оранжевая, Ор-оранжевая, т Ж-темно-желтая, Ж-желтая, св Ж-светто-желгая, Б-белая Цифрами в таблице указано количество линий с соответствующей окраской глаз
Затем было исследовано влияние мутации в гене east на экспрессию гена white в составе описанных ранее генетических конструкциях, встроенных в гетерохроматиновые районы теломер второй и третьей хромосом (линии 39С-5 (2L), 39С-27 (2R), 39С-31 (3R), 39С-51 (3R)) или в 4 хромосому (линии 118Е-10 (102А), 39С-34 (102А), 118Е-3 (102А), 39С-12 (102В), 39С-52 (102В-С), 118Е-19 (102D-E)) (Sun et al, 2000, Cryderman et al, 1999)
Известно, что гетерохроматиновые районы генома способны репрессировать транскрипцию встроенного в них трансгена Ранее было показано, что экспрессия трансгена, встроившегося в теломер-ассоциированные повторы (TAS), подавляется Во всех использованных линиях окраска глаз у мух была мозаичной - красные пятна и точки различной интенсивности на светло-оранжевом фоне, что свидетельствует о выраженной репрессии гена white Мутация easf не оказывала значительного влияния на экспрессию гена white во всех трансгенных линиях
Таким образом, белок EAST не участвует в репрессии, вызываемой белками группы Polycomb или прителомерным гетерохроматином Drosophila melanogaster
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Изучение влияния гена east на функционирование инсулятора в системе аллеля у2
Согласно полученным в представленной работе результатам, ген east оказывает влияние на функционирование инсулятора Su(Hvv) в модельной системе гена yellow Гиперэкспрессия гена east приводит к подавлению транскрипции гена yellow в щетинках Мутация easf восстанавливает функционирование инсулятора на фоне мутации в гене mod(mdg4), кодирующем один из компонентов инсуляторного комплекса Su(Hw) Также ген east генетически взаимодействует с геном ср190, который кодирует еще один белок, входящий в состав инсулятора Su(Hvv) Две дополнительные копии гена east приводят к подавлению экспрессии гена yellow, а дополнительное введение мутации ср3 в гетерозиготе усиливает наблюдаемую репрессионную активность При совместной гиперэкспрессии генов cpl'JO и east наблюдался обратный эффект полное восстановление транскрипции гена yellow
Анализ различных ревертантов аллеля у2 и генетических конструкций РЩКП-Su,w+J и P{E-Su,w+}, позволил установить последовательности, ответственные за проявление EAST-зависимой репрессии Этими последовательностями оказались инсулятор Su(Hw) и длинный концевой повтор из ретротранспозона МДГ4
Ранее было показано, что отличные от инсулятора последовательности МДГ4 определяют положение этого мобильного элемента на периферии ядра (Xu et al, 2004) Также ранее было показано, что длинные концевые повторы ретротранспозона Idefix и его 5'-нетранслируемая область влияют на эффект инсуляции и положение генетической конструкции в ядре (Brasset et al, 2007) Исходя из этих данных, можно предположить, что влияние белка EAST на транскрипцию гена yellow связано с положением этого гена в ядре, которое зависит от присутствия последовательностей длинных концевых повторов ретротранспозона МДГ4 Возможно, присутствие последовательностей МДГ4 в аллельных вариантах гена yellow способствует контакту между регуляторными последовательностями этого гена и белковыми факторами, аккумулированными на ядерной оболочке и
оказывающими репрессирующее влияние на ген При эюм увеличение концентрации белка EAST приводит к активизации репрессионного комплекса
2. Исследование молекулярных взаимодействий между белками EAST, СР60 и белками ипсуляторного комплекса
Ранее было показано, что белок СР60 колокализуется в ядре с белком EAST в межхромосомном пространстве и его локализация зависит от уровня экспрессии гена east (Wasser and Chía, 2000) Кроме того, было показано, что белок СР60 колокализуется в ядре с белком СР190, компонентом инсулятора Su(Hw) (Kellogg et al 1995 Whitfield et al 1995) При помощи молекулярных исследований, проведенных в данной работе, было показано присутствие белка СР60 в инсуляторном комплексе Su(Hw) Белок СР60 связывается с последовательностью ДНК инсулятора Sn(Hw) и взаимодействует с белком СР190 Также белок СР60 коиммунопреципитируется с белком Mod(mdg4)67 2, являющимся компонентом инсуляторного комплекса Su(Hw) Так как было показано наличие прямого взаимодействия между белками СР60 и EAST, можно утверждать, что белок EAST оказывает свое влияние на функционирование инсулятора Su(Hw) при помощи белка СР60
Исходя из взаимодействий между генами east, србО, mod(mdg4) и ср190, можно выдвинуть гипотезу о существовании на последовательности инсулятора Su(Hw) группы белков (СР60, СР190 и Mod(mdg4)67 2), в функции которых входит блокирование репрессионной активности белка EAST
3 Влияние белка EAST на функционирование различных репрессионных
комплексов
Согласно полученным в данной работе результатам, белок EAST не влияет на репрессию генов, вызванную белками группы Polycomb или прителомерным гетерохроматином Ранее было показано, что при гиперэкспрессии гена east изменяется компактизация и распределение хромосом в ядре (Wasser and Chía, 2000) При этом внехромосомные структуры занимают больший объем ядра, чем обычно Можно предположить, что такое перераспределение хромосом делает
регуляторные системы активно экспрессирующихся генов более доступными для влияния репрессионных компонентов ядерного матрикса Полученные результаты позволяют предположить, что белок EAST не является компонентом каких-либо репрессионных комплексов, но при этом выступает как часть глобальной системы белков ядерного матрикса, который обеспечивает правильную временную и ткаиеспецифичную экспрессию всех генов
ВЫВОДЫ
1 С помощью различных генетических модельных систем, как нативных, так и искусственно созданных, впервые была показана функциональная взаимосвязь между инсуляторными и репрессионными свойствами инсулятора Su(Hw) и уровнем экспрессии генов east и србО Было показано, что изменение уровня экспрессии генов, кодирующих входящие в инсуляторный комплекс белки, в сочетании с мутациями в генах east и србО, также меняло свойства инсулятора
2 Установлено, что для проявления эффектов, связанных с экспрессией гена east, необходимы последовательности инсулятора Su(Hw) и длинного концевого повтора из ретротранспозона МДГ4
3 Впервые показано прямое взаимодействие между белком СР60 и белком СР190, компонентом инсуляторного комплекса, а также взаимодействие между белком СР60 и белком EAST, предполагаемым компонентом ядерного матрикса Способность белка СР60 связываться с последовательностью инсулятора Su(Hw) и коиммунопреципитация белка СР60 с основным компонентом инсулятора Su(Hw) -белком Mod(mdg4)67 2 подтверждает, что белок СР60 также является компонентом инсуляторного комплекса
СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1 Л С Мельникова, И.В.Кривега, П Г Георгиев, А К Головнин Белок ядерного матрикса EAST участвует в регуляции транскрипции гена yellow у Drosophila melanogaster ДАН, 2007,415(5) 1-4
23
2 Л С Мельникова, И.В.Кривега, П Г Георгиев, А К Головнин Белок ядерного матрикса EAST влияет на транскрипцию генов Drosophila melanogaster независимо от присутствия последовательностей ретротранспозона МДГ4 Генетика 2007,43(10) 1-5
3 И.В. Кривега, Л С Мельникова, А К Головнин, П Г Георгиев Выявление нового гена супрессора mod(mdg4) и изучение его свойств Тезисы 10 Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" с 25 Пущино, 17-21 апреля 2006г
4 И.В. Кривега, MB Костюченко, ЕВ Кравченко, А К Головнин, ПГ Георгиев Создание новой модельной системы для изучения роли белков Mod(mdg4) и супрессоров mod(mdg4) в процессе инсуляции Тезисы 10 Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" с 26 Пущино, 17-21 апреля 2006 г
5 A Golovnm, L Melnikova, I. Knvega, M Kostuchenko, I Volkov, P Georgiev The nucleoskeletal proteins EAST and CP60 modulate activity of the gypsy msulator in Drosophila melanogaster "Nuclear Structure & Dynamics", Montpellier, France, 1-5 September, 2007 P-048
Автор выражает благодарность Л С Мельниковой и П Г Георгиеву за помощь в работе, консультации и обсуждение полученных результатов, а также M В Костюченко и И А Волкову за техническую помощь
Подписано в печать 17 09 2007 г Исполнено 18 09 2007 г Печать трафаретная
Заказ № 727 Тираж 100 экз
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кривега, Иван Валерьевич
Оглавление
Введение.
Цель и задачи исследования.
Список сокращений.
1. Обзор литературы.
1.1 Способы регуляции транскрипции.
1.2 Инсуляторы - регуляторные элементы высших эукариот.
1.3 Инсуляторы различных групп организмов.
1.3.1 Инсуляторы позвоночных.
1.3.1.1 Инсулятор Р-глобинового кластера.
1.3.1.2 Инсулятор igf2/hl9 локуса.
1.3.2 Барьерные элементы дрожжей.
1.3.3 Инсуляторы дрозофилы.
1.3.3.1 Инсуляторы локуса теплового шока.
1.3.3.2 Инсуляторные элементы Bithorax комплекса.
1.3.3.3 Su(Hw) инсулятор.
2. Материалы и методы.
2.1 Характеристика объекта исследования.
2.2 Генетические методы.•.
2.2.1 Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе.
2.2.2 Фенотипический анализ экспрессии генов.
2.2.3 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий.
2.2.4 Индукция сайт-специфической рекомбинации.
2.2.5 Получение мутации србО47.
2.2.6 Получение рабочих линий Drosophila melanogaster.
2.2.7 Введение мутации в генах east, србО, ср190 и гиперэкспрессии гена east в мух, несущих аллели генов yellow, scute, cut.
2.2.8 Введение мутаций в генах east, србО, mod(mdg4) и гиперэкспрессии гена east в генетические конструкции PfflKII-Su;w+} и P{E-Su;w+}.
2.2.9 Введение гиперэкспрессии гена east в линии, несущие генетическую конструкцию P{PRE(S)YW}, и генетические конструкции, втроенные в теломерные районы хромосом.
2.2.10 Введение гиперэкспрессии гена east в мух, несущих аллели гена su(var)205. 54 2.3 Биохимические методы.
2.3.1 Полимеразная цепная реакция.
2.3.2 Приготовление компетентных клеток и трансформация. Выделение плазмидной ДНК. Рестрикция, лигирование, переосаждение ДНК, гель-электрофорез.
2.3.3 Получение последовательностей кДНК генов.
2.3.4 Получение конструкций, экспрессирющих белки СР60 и Mod(mdg4)67.2.
2.3.5 Получение конструкций для дрожжевой двугибридной системы.
2.3.6 Получение генетических конструкций.
2.3.7 Выделение геномной ДНК Drosophila melanogaster.
2.3.8 Саузерн-блот-анализ.
2.2.9 Дрожжевая двугибридная система.
2.3.10 Задержка в геле комплекса ДНК-белок.
2.3.11 Окраска ядер клеток линии S2.
2.3.12 Окраска ядер клеток имагинальных дисков личинки Drosophila melanogaster
2.3.13 Детекция белков на политенных хромосомах дрозофилы.
2.3.14 Иммунопреципитация хроматина.
2.3.15 Коиммунопреципитация.
3.Результат ы.
3.1 Изучение влияния гена east на функционирование инсулятора в системе аллеля у
3.2 Определение последовательности, ответственной за проявление EAST-зависимой репрессии.
3.2.1 Влияние гиперэкспрессии гена east на аллели yTD гена yellow.
3.2.2 Влияние гиперэкспрессии гена east на производные аллеляу2.
3.4 Участие белков СР60 и EAST в функционировании инсулятора Su(Hw).
3.4.1 Взаимодействие белка СР60 с инсулятором Su(Hw) in vitro.
3.4.2 Взаимодействие белка СР60 и инсулятора Su(Hw) in vivo в клетках линии S2.
3.4.3 Изучение свойств белка СР60 in vivo в клетках Drosophila melanogaster.
3.4.4 Функциональное взаимодействие между белками СР60 и EAST и белками инсуляторного комплекса.
3.5 Влияние белка EAST на функционирование инсулятора Su(Hw) в системах отличных от аллеля у2.
3.5.1 Влияние бека EAST на функционирование генного комплекса achaete-scute.
3.5.2 Влияние белка EAST на функционирование гена cut.
3.5.3 Влияние гена east на функционирование различных репрессионных белковых комплексов.
4. Обсуждение результатов.
4.1 Изучение влияния гена east на функционирование инсулятора в системе аллеля у
4.2 Исследование молекулярных взаимодействий между белками EAST, СР60 и белками инсуляторного комплекса.
4.3 Влияние белка EAST на функционирование различных репрессионных комплексов.
5. Выводы.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение нового семейства генов su(mg) у Drosophila melanogaster"
Экспрессия гена регулируется при помощи различных цис- и транс-регуляторных элементов. К цис-регуляторным элементам относятся последовательности ДНК, непосредственно прилежащие к генам, так называемые промоторы, и дистально расположенные энхансеры и сайленсеры. Большинство энхансеров не обладает специфичностью по отношению к промоторам, следовательно должна существовать система, ограничивающая активность энхансера только «правильным» промотором. Предполагается, что в функционировании данной системы значительную роль могут играть инсуляторы. Инсулятор представляет собой последовательность ДНК, которая, находясь между энхансером и промотором, ограничивает их взаимодействие. Таким образом, инсуляторы выполняют важную функцию регуляции транскрипции, определяя какой энхансер должен активировать данный промотор.
На настоящий момент механизм действия инсуляторов полностью не изучен. Существует несколько моделей их функционирования, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки, но практически все они предполагают связь работы инсулятора с ядерной периферией и белками ядерного матрикса. К сожалению, до сих пор не выявлены конкретные белки, входящие в эти ядерные структуры и одновременно влияющие на работу инсулятора. Это направление исследований представляет большой интерес, так как рассматривает инсуляцию как составную часть глобального процесса регуляции транскрипциии в ядре в целом. Выяснение функциональных связей между процессом инсуляции и белками ядерного матрикса позволит понять роль инсуляторов в образовании различных областей ядра: с повышенной и пониженной активностью транскрипции.
В представленной работе было продолжено изучение широко известного Su(Hw)зависимого инсулятора, впервые обнаруженного в последовательности ретротранспозона
МДГ4 у Drosophila melanogaster . Известно, что инсулятор Su(Hw) способен блокировать более 30 известных энхансеров, работающих в разных тканях и на разных этапах развития. Белковый комплекс инсулятора Su(Hw) состоит из трех известных на данный момент белков: связывающегося с ДНК белка Su(Hw), белка Mod(mdg4) и недавно открытого белка CP 190. Мутация в гене mod(mdg4) нарушает связывание кодируемого им белка Mod(mdg4)67.2 с инсуляторным комплексом. Отсутствие белка Mod(mdg4)67.2 приводит к нарушению инсуляции в различных модельных системах. Недавно в нашей лаборатории была обнаружена группа генов su(mg) {suppressor of mod(mdg4)), мутации в которых приводили к восстановлению 8и(Нш)-зависимой инсуляции даже при отсутствии белка Mod(mdg4)67.2. Один из клонированных генов группы su(mg) кодирует белок EAST, который, как предполагается, является компонентом ядерного матрикса. Изучение свойств и функций этого белка позволит более детально понять связь между инсуляцией, ядерным матриксом и транскрипцией.
Цель и задачи исследования
Основной целью данной работы является изучение структуры и функций гена из семейства su(mg), который кодирует белок EAST.
В работе были поставлены следующие задачи:
1. Изучить генетические взаимодействия между геном east и генами, кодирующими белки, входящие в состав инсуляторного комплекса Su(Hw).
2. Найти в составе ретортранспозона МДГ4 последовательность, отвечающую за проявление эффектов гена east.
3. Доказать существование молекулярных взаимодействий между белками EAST, СР60 и белками инсуляторного комплекса.
Список сокращений
1. ПЦР - полимеразная цепная реакция
2. т.п.н. - тысяч пар нуклеотинов
3. п.н. - пар нуклеотидов
4. ДКП - длинный концевой повтор ретротранспозона МДГ4
5. AS-комплекс - генный комплекс achaete-scute
6. DPE - расположенный после ТАТА-бокса промоторный элемент (downstream core promoter element)
7. MTE - последовательность, содержащая 10 пар нуклеотидов, располагающаяся после инициаторной последовательности в промоторе
1. Обзор литературы
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Кривега, Иван Валерьевич
5. Выводы
1. С помощью различных генетических модельных систем, как нативных, так и искусственно созданных, впервые была показана функциональная взаимосвязь между инсуляторными и репрессионными свойствами инсулятора Su(Hw) и уровнем экспрессии генов east и србО. Было показано, что изменение уровня экспрессии генов, кодирующих входящие в инсуляторный комплекс белки, в сочетании с мутациями в генах east и србО, также меняло свойства инсулятора.
2. Установлено, что для проявления эффектов, связанных с экспрессией гена east, необходимы последовательности инсулятора Su(Hw) и длинного концевого повтора из ретротранспозона МДГ4.
3. Впервые показано прямое взаимодействие между белком СР60 и белком СР190, компонентом инсуляторного комплекса, а также взаимодействие между белком СР60 и белком EAST, предполагаемым компонентом ядерного матрикса. Способность белка СР60 связываться с последовательностью инсулятора Su(Hw) и коиммунопреципитация белка СР60 с основным компонентом инсулятора Su(Hw) -белком Mod(mdg4)67.2 подтверждает, что белок СР60 также является компонентом инсуляторного комплекса.
Благодарности
Автор выражает благодарность ЛС.Мельниковой и П.Г.Георгиеву за помощь в работе, консультации и обсуждение полученных результатов, а также М.В.Костюченко и И.А.Волкову за техническую помощь.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кривега, Иван Валерьевич, Москва
1. Ahmad К, Melnick A, Lax S, Bouchard D, Liu J, Kiang C, Mayer S, Takahashi S, Licht J, Prive G. Mechanism of SMRT corepressor recruitment by the BCL6 BTB domain. // Mol. Cell. 2003. V.12. P.1551-1564.
2. Andrulis E, Neiman A, Zappulla D, Sternglanz R. Perinuclear localization of chromatin facilitates transcriptional silencing. //Nature. 1998. V.394. P.592-595.
3. Avramova Z, Tikhonov A. Are scs and scs' 'neutral' chromatin domain boundaries of the locus?//TrendsGenet. 1999. V.15. P.138-139.
4. Babiarz J, Halley J, Rine J. Telomeric heterochromatin boundaries require NuA4-dependent acetylation of histone variant H2A.Z in Saccharomyces cerevisiae. // Genes Dev. 2006. V.20. P.700-710.
5. Baniahmad A, Steiner C, Kohne AC, Renkawitz R. Modular structure of a chicken lysozyme silencer: involvement of an unusual thyroid hormone receptor binding site. // Cell. 1990. V.61. P.505-514.
6. Bell A, Felsenfeld G. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene. // Nature. 2000. V.405. P.482-485.
7. Bell A, West A, Felsenfeld G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. // Cell. 1999. V.98. P.387-396.
8. Bell A, West A, Felsenfeld G. Insulators and boundaries: versatile regulatory elements in the eukaryotic genome. // Science. 2001. V.291. P.447-450.
9. Bezborodova E, Kulikov A, Georgiev P. A new family of genes which, when mutated, suppress the inhibitory effect of the mod(mdg4)lul mutation on y2 expression in Drosophila melanogaster. //Mol Gen Genet. 1997. V.257. P.83-90.
10. Bi X, Broach J. UASrpg can function as a heterochromatin boundary element in yeast. // Genes Dev. 1999. V.13. P.1089-1101.
11. Bi X., Broach J. Chromosomal boundaries in S. cerevisiae. // Curr.Opin.Gen.Dev. 2001. V. 11. P. 199-204.
12. Blackwood E, Kadonaga J. Going the distance: a current view of enhancer action. // Science. 1998. V.281 P.60-63.
13. Blanton J, Gaszner M, Schedl P. Protein: protein interactions and the pairing of boundary elements in vivo. // Gen.Dev. 2003. V.17. P.664-675.
14. Blobel G. Gene gating: a hypothesis.'// PNAS. 1985. V.82. P.8527-8529.
15. Bondarenko V, Liu Y, Jiang Y, Studitsky V. Communication over a large distance: enhancers and insulators. // Biochem Cell Biol. 2003 V.81. P.241-251.
16. Brasset E, Bantignies F, Court F, Cheresiz S, Conte C, Vaury C. Idefix insulator activity can be modulated by nearby regulatory elements. // Nucleic Acids Research. 2007. V.35. P.2661-2470.
17. Breathnach R, Chambon P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. // Annu Rev Biochem. 1981. V.50. P.349-383.
18. Brown C, Silver P. Transcriptional regulation at the nuclear pore complex. // Current Opinion in Genetics & Development. 2006. V.17. P. 1-7.
19. Buchner K, Roth P, Schotta G, Krauss V, Saumweber H, Reuter G, Dorn R. Genetic and molecular complexity of the position effect variegation modifier mod(mdg4) in Drosophila. // Genetics. 2000. V.155. P.141-157.
20. Bulger M, Groudine M. Looping versus linking: toward a model for long-distance gene activation. // Genes Dev. 1999. V.13. P.2465-2477.
21. Burgess-Beusse В, Farrell С, Gaszner M, Litt M, Mutskov V, Recillas-Targa F, Simpson M, West A, Felsenfeld G. The insulation of genes from external enhancers and silencing chromatin. //Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 2002. V.99. P. 16433-16437.
22. Burke T, Kadonaga J. Drosophila TFIID binds to a conserved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters. // Genes Dev. 1996. V.10. P.711-724.
23. Burley S, Roeder G. Biochemistry and structural biology of transcription factor IID (TFIID). // Annu Rev Biochem. 1996. V.65. P.769-799.
24. Busturia A, Lloyd A, Bejarano F, Zavortink M, Xin H, Sakonju S. The MCP silencer of the Drosophila Abd-B gene requires both Pleoihomeotic and GAGA factor for the maintenance of repression. //Development. 2001. V.128. P.2163-2173.
25. Butcher R, Chodagam S, Basto R, Wakefield J, Henderson D, Raff J, Whitfield W. The Drosophila centrosome-associated protein CP 190 is essential for viability but not for cell division. //J Cell Sci. 2004 V.117.P.1191-1199.
26. Cai H, Levine M. Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo. //Nature. 1995 V.376. P.533-536.
27. Cai H, Levine M. The gypsy insulator can function as a promoter-specific silencer in the Drosophila embrio. //EMBO J. 1997. V.16. P. 1732-1741.
28. Cai H, Shen P. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. // Science. V.291. P.493-495.
29. Cam H, Sugiyama T, Chen S, Chen X, Fitzgerald C, Grewal S. Comprehensive analysis of heterochromatin- and RNAi-mediated epigenetic control of the fission yeast genome. // Nat.Genet. 2005. V.37. P.809-819.
30. Capelson M, Corces V. Boundary elements and nuclear organization. // Biol.Cell. 2004. V.96. P.617-629.
31. Capelson M, Corces V. SUMO conjugation attenuates the activity of the gypsy chromatin insulator. //EMBO J. 2006. V.25. P. 1906-1914.
32. Capelson M, Corces V. The Ubiquitin Ligase dTopors Directs the Nuclear Organization of a Chromatin Insulator. // Mol Cell. 2005 V.20. P. 105-116.
33. Casolari J, Brown C, Drubin D, Rando O, Silver P. Develomentally induced changes in transcriptionally programm alter spatial organization across chromosomes. // Gen.Dev.2005. V.19. P.l 188-1198.
34. Casolari J, Brown C, Komili S, West J, Hieronimus H, Silver P. Genome-wide localization of the nuclear transport machinary couples transcriptional status and nuclear organization. //Cell. 2004. V.117. P.427-439.
35. Chan C, Rastelli L, Pirrotta V. A. Polycomb response element in the Ubx gene that determines an epigenetically inherited state of repression. //EMBO J. 1994. V13. P.2553-2564.
36. Chung J, Whitely M, Felsenfeld G. A 5' element of the chicken b-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila. //Cell. 1993. V.74. P.505-514.
37. Cleard F, Moshkin Y, Karch F, Maeda R. Probing long-distance regulatory interactions in the Drosophila melanogaster bithorax complex using Dam identification. // Nat Genet.2006. V.38. P.931-935.
38. Comet I, Savitskaya E, Schuettengruber B, Negre N, Lavrov S, Parshikov A, Jude F, Gracheva E, Georgiev P, Cavalli G. PRE-mediated bypass of two Su(Hw) insulators targets PcG proteins of a downstream promoter. //Dev. Cell. 2006. V. 11. P.l 17-124.
39. Courey A, Jia S. Transcriptional repression: the long and the short of it. // Genes Dev. 2001. V.15. P.2786-2796.
40. Cryderman D, Morris E, Biessmann H, Elgin S, Wallrath L. Silencing at Drosophila telomeres: nuclear organization and chromatin structure play critical roles. // EMBO J. 1999. V.18. P.3724-3735.
41. Cutler G, Perry K, Tjian R. Adf-1 is a nonmodular transcription factor that contains a TAF-binding Myb-like motif. // Mol. Cell Biol. 1998 V. 18. P.2252-2261.
42. Cuvier 0, Hart C, Laemmli U. Identification of a class of chromatin boundary elements. // Mol.Cell Biol. 1998. V.18. P.7478-7486.
43. Dekker J, Rippe K, Dekker M, Kleckner N. Capturing chromosome conformation. // Science. 2002. V.295. P.1306-1311.
44. Denning D, Mykytka B, Allen N, Huang L, Al B, Rexach M. The nucleoporin Nup60p functions as a Gsplp-GTP-sensitive tether for Nup2p at the nuclear pore complex. // J.Cell Biol. 2001. V.154. P.937-950.
45. Dilworth D, Suprapto A, Padovan J, Chait B, Wozniak R, Rout M, Aitchison J. Nup2p dynamically associates with the distal regions of the yeast nuclear pore complex. // J.Cell Biol. 2001. V.153. P. 1465-1478.
46. Donze D, Kamakaka R. RNA polymerase III and RNA polymerase II promoter complexes are heterochromatin barriers in Saccharomyces cerevisiae. // EMBO J. 2001. V.20. P.520-531.
47. Donze D., Adams C, Rine J, Kamakaka R. The boundaries of the silenced HMR domain in Saccharomyces cerevisiae. // Genes Dev. 1999. V.13. P.698-708.
48. Dorn R, Morawietz H, Reuter G, Saumweber H. Identification of an essential Drosophila gene that is homologous to the translation initiation factor eIF-4A of yeast and mouse. // Mol. Gen. Genet. 1993. V.237. P.233-240.
49. Dorsett D. Distant liaisons: long-range enhancer-promoter interactions in Drosophila. // Curr.Opin.Genet.Dev. 1999. V.9. P.505-514.
50. Drissen R, Palstra R, Gillemans N, Splinter E, Grosveld F, Philipsen S, de Laat W. The active spatial organization of the J3-globin locus requires the transcription factor EKLF. // Genes Dev. 2004. 18. P.2485-2490.
51. Duncan I. The bithorax complex. // Annu.Rev.Genet. 1987. V.21. P.285-319.
52. Dvir A, Conaway J, Conaway R. Mechanism of transcription initiation and promoter escape by RNA polymerase II.//Curr.Opin.Genet.Dev. 2001. V.ll. P.209-214.
53. Eggert H, Gortchakov A, Saumweber H. Identification of the Drosophilainterband-specific protein Z4 as a DNA-binding zinc-finger protein determining chromosomal structure. //J. of Cell Science. 2004. V.117. P.4253-4264.
54. Eissenberg J, Morris G, Reuter G, Hartnett T. The heterochromatin-associated protein HP-1 is an essential protein in Drosophila with dosage-dependent effects on position-effect variegation. //Genetics. 1992. V.131. P.345-352.
55. Emerson B. Specificity of gene regulation. // Cell. 2002. V.109. P.267-270.
56. Engel N, Bartolomei S. Mechanisms of insulator function in gene regulation and genomic imprinting. //Int.Rev.Cytol. 2003. V.232. P.89-127.
57. Engel N, Thorvaldsen J, Bartolomei M. CTCF binding sites promote transcription initiation and prevent DNA methylation on the maternal allele at the imprinted H19/Igf2 locus. // Hum.Mol.Genet. 2006. V.15. P.2945-2954.
58. Engel N, West A, Felsenfeld G, Bartolomei S. Antagonism between DNA hypermethylation and enhancer-blocking activity at the H19DMDis uncovered by CpG mutations. //Nat.Genet. 2004. V.36. P.883-888.
59. Erlich H. PCR technology. // Stockton Press. New York. 1989.
60. Espinas M, Jimenez-Garcia E, Vaquero A, Canudas S, Bernues J, Azorin F. The N-terminal POZ domain of GAGA mediates the formation of oligomers that bind DNA with high affinity and specificity. //J.Biol.Chem. 1999. V.274. P. 16461-16469.
61. Farkas G, Leibovitch B, Elgin S. Chromatin organization and transcriptional control of gene expression in Drosophila. // Gene. 2000. V.253. P.l 17-136.
62. Farrell C, West A, Felsenfeld G. Conserved CTCF insulator elements flank the mouse and human P-globin loci. //Mol.Cell.Biol. 2002. V.22. P.3820-3831.
63. Fedoriw A, Stein P, Svoboda P, Schultz R, Bartolomei M. Transgenic RNAi reveals essential function for CTCF in H19 gene imprinting. // Science. 2004. V.303. P.238-240.
64. Filippova G, Thienes C, Penn B, Cho D, Hu Y, Moore J, Klesert T, Lobanenkov V, Tapscott S. CTCF-binding sites flank CTG/CAG repeats and form a methylation-sensitive insulator at the DM1 locus. // Nat.Genet. 2001. V.28 P.335-343.
65. Fourel G, Boscheron C, Revardel E, Lebrun E, Hu Y, Simmen K, Muller K, Li R, Mermod N, Gilson E. An activationindependent role of transcription factors in insulator function. //EMBO Rep. 2001. V.2. P. 124-132.
66. Fourel G, Revardel E, Koering C, Gilson E. Cohabitation of insulators and silencing elements in yeast subtelomeric regions. //EMBO J. 1999. V.18. P.2522-2537.
67. Galy V, Olivo-Marin J, Scherthan H, Doye V, Rascalou N, Nehrbass U. Nuclear pore complexes in the organization of silent telomeric chromatin. // Nature. 2000. V.403. P.108-112.
68. Gaszner M, Felsenfeld G. Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. //Nature Reviews Genetics. 2006. V.7. P.703-713.
69. Gaszner M, Vazquez J, Schedl P. The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction. // Genes.Dev. 1999. V.13. P.2098-2107.
70. Gause M, Hovhannisyan H, Kan T, Kuhfittig S, Mogila V, Georgiev P. hobo Induced rearrangements in the yellow locus influence the insulation effect of the gypsy su(Hw)-binding region in Drosophila melanogaster. // Genetics. 1998 V.149. P. 1393-1405.
71. Gause M, Morcillo P, Dorsett D. Inhibition of enhancer-promoter communication by a gypsy transposon insert in the Drosophila cut gene: cooperation between Suppressor of Hairy-wing and Modifier of mdg4 proteins. //Mol.Cell Biol. 2001. V.21. P.4807-4817.
72. Gdula D, Corces V. Characterization of functional domains of the su(Hw) protein that mediate the silencing effect of mod(mdg4) mutations. // Genetics. 1997. V.145. P. 153161.
73. Georgiev P, Corces V. The Su(Hw) protein bound to gypsy sequences in one chromosome can repress enhancer-promoter interactions in the paired gene located in the other homolog. //Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1995. V.92. P.5184-5188.
74. Georgiev P, Korochkina S, Georgieva S, Gerasimova T. Mitomycin С induces genomic rearrangements involving transposable elements in Drosophila melanogaster. // Mol.Gen.Genet. 1990. V.220. P.229-233.
75. Georgiev P, Kozycina M. Interaction between mutations in the suppressor of Hairy wing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gypsy-induced mutations. // Genetics. 1996. V.142. P.425-436.
76. Gerasimova T, Byrd K, Corces V. A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA. // Mol Cell. 2000. V.6. P. 1025-1035.
77. Gerasimova T, Corces V. Polycomb and Trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator. // Cell. 1998. V.92. P.511-521.
78. Geyer P, Clark I. Protecting against promiscuity: the regulatory role of insulators. // Cell. Mol. Life Sci. 2002. V.59. P.2112-2127.
79. Geyer P, Corces V. DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein. // Genes Dev. 1992. V.6. P. 1865-1873.
80. Geyer P, Corces V. Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster. // Genes Dev. 1987. V. 1. P.996-1004.
81. Geyer P. The role of insulator elements in defining domains of gene expression. // Curr.Opin.Genet.Dev. 1997. V.7. P.242-248.
82. Ghosh D, Gerasimova T, Corces V. Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function. // EMBO J. 2001. V.20. P.2518-2527.
83. Glass С, Rosenfeld M. The coregulator exchange in transcriptional functions of nuclear receptors. // Genes Dev. 2000. V.14 P. 121-141.
84. Glover D, Leibowitz M, McLean D, Parry H. Mutations in aurora preventcentrosome separation leading to the formation of monopolar spindles. // Cell. 1995. V.81. P.95-105.
85. Golovnin A, Birukova I, Romanova 0, Silicheva M, Parshikov A, Savitskaya E, Pirrotta V, Georgiev P. An endogenous Su(Hw) insulator separates the yellow gene from the Achaetescute gene complex in Drosophila. // Development. 2003. V.130. P.3249-3258.
86. Golovnin A, Mazur A, Kopantseva M, Kurshakova M, Gulak P, Gilmore B, Whitfield W, Geyer P, Pirrotta V, Georgiev P. Integrity of the Mod(mdg4)-67.2 BTB domain is critical to insulator function in Drosophila. //.Mol.Cell Biol. 2007. V.27. P.963-974.
87. Gortchakov A, Eggert H, Gan M, Mattow J, Zhimulev I, Saumweber H. Chriz, a chromodomain protein specific for the interbands of Drosophila melanogaster polytene chromosomes. // Chromosoma. 2005. V.l 14. P.54-66.
88. Gotta M, Laroche T, Formenton A, Maillet L, Scherthan H, Gasser S. The clustering of telomeres and colocalization with Rapl, Sir3, and Sir4 proteins in wild-type Saccharomyces cerevisiae. // J.Cell Biol. 1996. V.l34 P. 1349-1363.
89. Grewal S, Elgin S. Heterochromatin: new possibilities for the inheritance of structure. // Curr.Opin.Genet.Dev. 2002. V.12. P.-178-187.
90. Guasconi V, Souidi M, Ait-Si-Ali S. Nuclear Positioning, Gene Activity and Cancer. // Cancer Biology & Therapy. 2005. V. 4. P.134-138
91. Haldar D, Kamakaka R. tRNA genes as chromatin barriers. // Nat.Struct.Mol.Biol. 2006. V.13. P.192-193.
92. Hampsey M. Molecular genetics of the RNA polymerase II general transcription machinery. // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998. V.62. P.465-503.
93. Hark A, Schoenherr C, Katz D, Ingram R, Levorse J, Tilghman S. CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus. // Nature. 2000. V.405. P.486-489.
94. Harrison D, Gdula D, Coyne R, Corces V. A leucine zipper domain of the suppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on enhancer function. // Gen.Dev. 1993. V.7. P. 1966-1978.
95. Hart C, Cuvier O, Laemmli U. Evidence for an antagonistic relationship between the boundary element-associated factor BEAF and the transcription factor DREF. // Chromosoma. 1999. V.108. P.375-383.
96. Hart C, Zhao K, Laemmli U. The scs' boundary element: characterization of boundary element-associated factors. //Mol.Cell Biol. 1997. V.17 P.999-1009.
97. Holmgren C, Kanduri C, Dell G, Ward A, Mukhopadhya R, Kanduri M, Lobanenkov V, Ohlsson R. CpGmethylation regulates the Igf2/H19 insulator. // Curr.Biol. 2001. V. 11. P. 1128-1130.
98. Holohan E, Kwong C, Adryan B, Bartkuhn M, Herald M, Renkawitz R, Russell S, White R. CTCF genomic binding sites in Drosophila and the organisation of the bithorax complex. // PLoS Genetics. 2007. V.3. P.el 12.
99. Ishii K, Arib G, Lin C, Van Houwe G, Laemmli U. Chromatin boundaries in budding yeast: the nuclear pore connection. // Cell. 2002. V.109. P.551-562.
100. Jack J, Dorsett D, Delotto Y, Liu S. Expression of the cut locus in the Drosophila wing margin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer. //Development. 1991. V.113. N3 P.735-747.
101. Karch F, Galloni M, Sipos L, Gausz J, Gyurkovics H, Schedl P. Мер and Fab-7: molecular analysis of putative boundaries of cis-regulatory domains in the bithorax complex of Drosophila melanogaster. //Nucleic Acids Res. 1994. V.22. P.3138-3146.
102. Karess R, Rubin G. Analysis of P transposable element functions in Drosophila. // Cell. 1984. V.38 P.135-146.
103. Kato Y, Sasaki H. Imprinting and looping: epigenetic marks control interactions between regulatory elements. // BioEssays. 2005. V.27. P. 1-4.
104. Katsani K, Hajibagheri M, Verrijzer C. Co-operative DNA binding by GAGA transcription factor requires the conserved BTB/POZ domain and reorganizes promoter topology. // EMBO J. 1999. V. 18. P.698-708.
105. Kellogg D, Oegema K, RafF J, Schneider K, Alberts В. CP60: a microtubule-associated protein that is localized to the centrosome in a cell cycle-specific manner. //Mol.Biol.Cell. 1995. V.6. P. 1673-1684.
106. Kellum R, Schedl P. A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. //Mol. Cell-Biol. 1992. V.12. P.2424-2431.
107. Kim J, Shen B, Rosen C, Dorsett D. The DNA-binding and enhancer-blocking domains of the Drosophila suppressor of hairy-wing protein. // MCB. 1996. V.16. P.3381-3392.
108. Kimura A, Horikoshi M. Partition of distinct chromosomal regions: negotiable border and fixed border. // Genes Cells 2004. V.9. P.499-508.
109. Kimura A, Umehara T, Horikoshi M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. // Nat.Genet. 2002. V.32. P.370-377.
110. Kobor M, Venkatasubrahmanyam S, Meneghini M, Gin J, Jennings J, Link A, Madhani H, Rine J. A protein complex containing the conserved Swi2/Snf2-related ATPase Swrlp deposits histone variant H2A.Z into euchromatin. // PLoS Biol. 2004. V.2. P.E131.
111. Kurshakova M, Maksimenko O, Golovnin A Pulina M, Georgieva S, Georgiev P, Krasnov A. Evolutionarily conserved E(y)2/Susl protein is essential for the barrier activity of Su(Hw)-dependent insulators in Drosophila. // Mol Cell. 2007. V.27. P.332-338.
112. Kyrchanova O, Toshchakov S, Parshikov A, Georgiev P. Drosophila bithorax complex: effects of insulator pairing on the enhancer-promoter communication. // Mol Cell Biol. 2007 V.27. P.3035-3043.
113. Labrador M, Corces, V. Setting the boundaries of chromatin domains and nuclear organization. // Cell. 2002. V.l 11. P. 151-154.
114. Lee J. Molecular links between X-inactivation and autosomal imprinting: X-inactivation as a driving force for the evolution of imprinting? // Curr Biol. 2003. V.13. P.R242-R254.
115. Lee T, Young R. Transcription of eukaryotic protein-coding genes. // Annu Rev Genet. 2000. V.34. P.77-137.
116. Lefstin J, Yamamoto K. Allosteric effects of DNA on transcriptional regulators. // Nature. 1998. V.392 P.885-888.
117. Lei E, Corces V. RNA interference machinery influences the nuclear organization of a chromatin insulator. // Nat Genet. 2006. V.38. P.936-941.
118. Lemon B, Tjian R. Orchestrated response: a symphony of transcription factors for gene control. // Genes Dev. 2000. V.14. P.2551-2569.
119. Lewis A, Mitsuya K, Constancia M, Reik W. Tandem repeat hypothesis in imprinting: deletion of a conserved direct repeat element upstream of hl9 has no effect on imprinting in the igf2-hl9 region. // Mol.Cell.Biol. 2004. V.24. P.5650-5656.
120. Lieb J, Liu X, Botstein D, Brown P. Promoter-specific binding of Rapl revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. //Nat.Genet. 2001. V.28. P.327-334.
121. Lim C, Santoso B, Boulay T, Dong E, Ohler U, Kadonaga J. The MTE, a new core promoter element for transcription by RNA polymerase II. // Genes Dev. 2004. V. 18. P. 1606-1617.
122. Lindsley D, Zimm G. The genome of Drosophila melanogaster. // Academic Press. New York. 1992.
123. Ling J, Li T, Hu J, Vu T, Chen H, Qiu X, Cherry A, Hoffman A. CTCF Mediates Interchromosomal Colocalization Between Igf2/H19 and Wsbl/Nfl. // Science. 2006. V.312. P.269-272.
124. Lucchesi J, Kelly W, Panning B. Chromatin remodeling in dosage compensation. // Annu Rev Genet. 2005. V.39. P.615-651.
125. Lutz M, Burke L, LeFevre P, Myers F, Thome A, Crane-Robinson C, Bonifer C, Filippova G, Lobanenkov V, Renkawitz R. Thyroid hormone-regulated enhancer blocking: cooperation of CTCF and thyroid hormone receptor. // EMBO J. 2003. V.22. P. 1579-1587.
126. Maillet L, Gaden F, Brevet V, Fourel G, Martin S, Dubrana K, Gasser S, Gilson E. Ku-deficient yeast strains exhibit alternative states of silencing competence. // EMBO Rep. 2001. V.2. P.203-210.
127. Marlor R, Parkhurst S, Corces V. The Drosophila melanogaster gypsy transposable element encodes putative gene products homologous to retroviral proteins. // Mol Cell Biol. 1986. V.6. P. 1129-1134.
128. Mazo A., Mizrokhi L., Karavanov A. Sedkov Y, Krichevskaja A, Ilyin Y. Suppression in Drosophila: su(Hw) and su(f) gene products interact with a region of mdg4 (gypsy) regulating its transcriptional activity. //EMBO J. 1989. V.8. P.903-911.
129. McKenna N, O'Malley B. Combinatorial control of gene expression by nuclear receptors and coregulators. // Cell. 2002. V.108. P.465-474.
130. Melnick A, Carlile G, Ahmad K, Kiang C, Corcoran C, Bardwell V, Prive G, Licht J. Critical residues within the BTB domain of PLZF and Bcl-6 modulate interaction with corepressors. //MCB. 2002. V.22. P. 1804-1818.
131. Melnikova L, Georgiev P. Drosophila telomeres: the non-telomerase alternative. H Chromosome Res. 2005. V.13. P.431-441.
132. Melnikova L, Georgiev P. Enhancer of terminal gene conversion, a new mutation in Drosophila melanogaster that induces telomere elongation by gene conversion. II Genetics. 2002. V.162. P. 1301-1312.
133. Meneghini M, Wu M, Madhani H. Conserved histone variant H2A.Z protects euchromatin from the ectopic spread of silent heterochromatin. // Cell. 2003. V.l 12. P.725-736.
134. Mihaly J, Hogga I, Barges S, Galloni M, Mishra R, Hagstrom K, Muller M, Schedl P, Sipos L, Gausz J, Gyurkovics H, Karch F. Chromatin domain boundaries in the bithorax complex. // Cell Mol. Life Sci. 1998. V.54. P.60-70.
135. Mikhailovsky S, Belenkaya T, Georgiev P. Broken chromosomal ends can be elongated by conversion in Drosophila melanogaster. // Chromosoma. 1999. V.l08. P. 114-120.
136. Minervini C, Marsano R, Casieri P, Fanti L, Caizzi R, Pimpinelli S, Rocchi M, Viggiano L. Heterochromatin protein 1 interacts with 5'UTR of transposable element ZAM in a sequence-specific fashion. // Gene. 2007. V.393. P.l-10.
137. Modolell J, Campuzano S. The achaete-scute complex as an integrating device. // Int J Dev Biol. 1998. V.42. N3. P.275-282.
138. Mogila V, Ladvishenko A, Simonova O, Gerasimova T. Intragenic suppression: Stalker, a retrovirus-like transposable element, can compensate for a deficiency at the cut locus of Drosophila melanogaster. // Genetica. 1992. V.86. P.305-311.
139. Muller M, Hagstrom K, Gyurkovics H, Pirrotta V, Schedl P. The Мер element from the Drosophila melanogaster bithorax complex mediates long-distance regulatory interactions. //Genetics. 1999. V.153. P.1333-1356.
140. Muravyova E, Golovnin A, Gracheva E, Parshikov A, Belenkaya T, Pirrotta V, Georgiev P. Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. // Science. 2001. V.291. P.495-498.
141. Murrell A, Heeson S, Reik W. Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and HI9 into parent-specific chromatin loops. // 2004. Nat.Genet. V.36. P.889-893.
142. Mutskov V, Farrell C, Wade P, Wolffe A, Felsenfeld G. The barrier function of an insulator couples high histone acetylation levels with specific protection of promoter DNA from methylation. // Genes Dev. 2002. V.16. P.1540-1554.
143. Myer VE, Young RA. RNA polymerase II holoenzymes and subcomplexes. // J Biol Chem. 1998. V. 273. P.27757-27760.
144. Nabirochkin S, Ossokina M, Heidmann T. A nuclear matrix/scaffold attachment region co-localizes with the gypsy retrotransposon insulator sequence. // J.Biol.Chem. 1998. V.273. P.2473-2479.
145. Narlikar G, Fan H, Kingston R. Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and transcription. // Cell. 2002. V.108. P.475-487.
146. Noma K, Allis C, Grewal S. Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. // Science. 2001. V.293. P.l 150-1155.
147. Noma К, Cam H, Maraia R, Grewal S. A Role for TFIIIC transcription factor complex in genome organization. // Cell. 2006. V.125. P.859-872.
148. Oegema K, Marshall W, Sedat J, Alberts B. Two proteins that cycle asynchronously between centrosomes and nuclear structures: Drosophila CP60 and CP 190. //Journal of Cell Science. 1997. V.110. P.1573-1583.
149. Oki M, Kamakaka R. Barrier function at HMR. // Mol.Cell. 2005. V.19. P.707-716.
150. Oki M, Valenzuela L, Chiba T, Ito T, Kamakaka T. Barrier proteins remodel and modify chromatin to restrict silenced domains. // Mol.Cell.Biol. 2004. V.24. P.1956-1967.
151. Orphanides G, Lagrange T, Reinberg D. The general transcription factors of RNA polymerase II. // Genes Dev. 1996. V. 10 P.2657-2683.
152. Orphanides G, Reinberg D. A unified theory of gene expression // Cell. 2002. V.108 P.439-451.
153. Pagans S, Ortiz-Lombardia M, Espinas M, Bernues J, Azorin F. The Drosophila transcription factor tramtrack (TTK) interacts with Trithorax-like (GAGA) and represses GAGA-mediated activation. //NAR. 2002. V.30. P.4406-4413.
154. Pai C, Lei E, Ghosh D, Corces V. The centrosomal protein CP 190 is a component of the gypsy chromatin insulator. //Mol.Cell. 2004. V.16. P.737-748.
155. Parnell T, Kuhn E, Gilmore B, Helou C, Wold M, Geyer P. Identification of Genomic Sites That Bind the Drosophila Suppressor of Hairy-wing Insulator Protein. // Mol.Cell.Biol. 2006. V.26. N.16. P.5983-5993.
156. Paule M, White R. Survey and summary: transcription by RNA polymerases I and III. //NAR. 2000. V.28. P. 1283-1298.
157. Pryde F, Louis E. Limitations of silencing at native yeast telomeres. // EMBO J.1999. V.18. P.2538-2550.
158. Ptashne M. Gene regulation by proteins acting nearby and at a distance. // Nature. 1986. V.322. P.697-701.
159. Qi H, Rath U, Ding Y, Ji Y, Blacketer J, Girton J, Johansen J, Johansen K. EAST interacts with Megator and localizes to the putative spindle matrix during mitosis in Drosophila. // J Cell Biochem. 2005. V.95. P. 1284-1291.
160. Raisner R, Madhani H. Patterning chromatin: form and function for H2A.Z variant nucleosomes. // Curr.Opin.Genet.Dev. 2006. V.16. P.l 19-124.
161. Ramos E, Ghosh D, Baxter E, Corces V. Genomic organization of gypsy-like chromatin insulators in Drosophila melanogaster. // Genetics. 2006. V.172. P.2337-2349.
162. Reed M, Riggs A Mann J. Deletion of a direct repeat element has no effect on Igf2 and HI9 imprinting. //Mamm.G.enome. 2001. V.12. P.873-876.
163. Ripoche M, Chantal K, Poirier F, Dandolo L. Deletion of the HI 9 transcription unit reveals the existence of a putative imprinting control element. // Genes Dev. 1997. V. 11. P. 1596-1604.
164. Roeder R. Role of general and gene-specific cofactors in the regulation of eukaryotic transcription. // Cold Spring Harbor Symp Quant Biol. 1998. V.58. P.201-218.
165. Roseman R., Pirrotta V., Geyer P. The Su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects. // EMBO J. 1993. V.12. P.435-442.
166. Rubin G, Sprandling A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. // Science. 1982. V.218. P.348-353.
167. Rusche L, Kirchmaier A, Rine J. The establishment, inheritance, and function of silenced chromatin in Saccharomyces cerevisiae. // Annu. Rev.Biochem. 2003. V.12. P.481-516.
168. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. Molecular Cloning. A laboratory manual. // CSHL Press. 2001.
169. Schmid M, Arib G, Laemmli C, Nishikawa J, Durussel T, Laemmli U. Nup-PI: The nucleopore-promoter interaction genes in yeast. // Mol.Cell. 2006. V.21. P.379-391.
170. Schoenherr C, Levorse J, Tilghman S. CTCF maintains differential methylation at the Igf2/H19 locus. //Nat.Genet. 2003. V.33. P.66-69.
171. Schweinsberg S, Hagstrom K, Gohl D, Schedl P, Kumar R, Mishra R, Karch F. The enhancerblocking activity of the Fab-7 boundary from the Drosophila bithorax complex requires GAGA-factor-binding sites. // Genetics. 2004. V.168. P.1371-1384.
172. Schweinsberg S, Schedl P. Developmental modulation of Fab-7 boundary function. //Development. 2004. V.131. P.4743-4749.
173. Scott K, Merrett S, Willard H. A heterochromatin barrier partitions the fission yeast centromere into discrete chromatin domains. // Curr.Biol. 2006. V.16. P. 119-129.
174. Scott К., Geyer P. Effects of the Su(Hw) insulator protein on the expression of the divergently transcribed Drosophila yolk protein genes. // EMBO J. 1995. V.14. P.6258-6279.
175. Scott K., Taubman A., Geyer P. Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength. // Genetics. 1999. V. 153. P. 787-798.
176. Shen B, Kim J, Dorsett D. The enhancer-blocking suppressor of hairy-wing zinc finger protein of Drosophila melanogaster alters DNA structure. // MCB. 1994. V.14. P.5645-5652.
177. Sipos L, Gyurkovics H. Long-distance interactions between enhancers and promoters. // FEBS J. 2005. V.272. P.3253-3259.
178. Smale S. Core promoters: active contributors to combinatorial gene regulation. // Genes Dev. 2001. V. 15. P. 2503-2508.
179. Smale S. Transcription initiation from TATA-less promoters within eukaryotic protein-coding genes. // Biochim Biophys Acta. 1997. V.1351 P.73-88.
180. Smith P., Corces V. The suppressor of Hairy-wing binding region is required for gypsy mutagenesis. //Mol.Gen.Genet. 1992. V.233. P.65-70.
181. Spana C, Corces V. DNA bending is a determinant of binding specificity for a Drosophila zink finger protein. // Genes Dev. 1990. V.4. P.1505-1515.
182. Spana C, Harrison D, Corces V. The Drosophila melanogaster supressor of Hairy wing protein binds to specific sequences of the gypsy retrotransposon. // Genes Dev. 1988. V.2. P. 1414-1423.
183. Sparago A, Cerrato F, Vernucci M, Ferrero G, Silengo M, Riccio A. Microdeletions in the human H19 DMR result in loss of IGF2 imprinting and Beckwith-Wiedemann syndrome. //Nat.Genet. 2004. V.36. P.958-960.
184. Splinter E, Heath H, Kooren J, Palstra R, Klous P, Grosveld F, Galjart N, de Laat W. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the P-globin locus. // Gen.Dev. 2006. V.20. P.2349-2354.
185. Stadnick M, Pieracci F, Cranston M, Taksel E, Thorvaldsen J, Bartolomei M. Role of a 461 bp G-rich repetitive element in H19 transgene imprinting. // Dev.Genes Evo. 1999. V.209. P.239-248.
186. Strahl B, Allis C. The language of covalent histone modifications. // Nature. 2000. V.403. P.41-45.
187. Strambio-de-Castillia C, Blobel G, Rout M. Proteins connecting the nuclear pore complex with the nuclear interior. // J.Cell Biol. 1999. V.144. P.839-855.
188. Struhl K. Promoters, activator proteins, and the mechanism of transcriptional initiation in yeast. //Cell. 1987. V.49. P.295-297.
189. Struhl, K. Fundamentally different logic of gene regulation in eukaryotes and prokaryotes. // Cell. 1999. V.98. P. 1-4.
190. Suka N, Luo K, Grunstein M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 Iysinel6 and spreading of heterochromatin. // Nat.Genet. 2002. V.32. P.378-383.
191. Sun F, Cuaycong M, Craig C, Wallrath L, Locke J, Elgin S. The fourth chromosome of Drosophila melanogaster: interspersed euchromatic and heterochromatic domains. // Proc. Natl. Acad. Sci. 2000. V.97. P.5340-5345.
192. Sun F, Elgin S. Putting boundaries on silence. // Cell. 1999. V.99. P.459-462.
193. Szabo P, Tang S, Rentsendorj A, Pfeifer G, Mann J. Maternal-specific footprints at putative CTCF sites in the HI 9 imprinting control region give evidence for insulator function. // Curr.Biol. 2000. V.10. P.607-610.
194. Szabo P, Tang S, Silva F, Tsark W, Mann J. Role of CTCF binding sites in the Igf2/H19 imprinting control region. // Mol.Cell.Biol. 2004. V.24. P.4791-4800.
195. Tackett A, Dilworth D, Davey M, O'Donnell M, Aitchison J, Rout M, Chait B. Proteomic and genomic characterization of chromatin complexes at a boundary. // J. Cell Biol. 2005. V. 169. P.35-47.
196. Tanimoto K, Sugiura A, Omori A, Felsenfeld G, Engel J, Fukamizu A Human b-globin locus control region HS5 contains CTCF- and developmental stage-dependent enhancer-blocking activity in erythroid cells. //Mol Cell Biol. 2003. V.23. P.8946-8952.
197. Thorvaldsen J, Duran K, Bartolomei M. Deletion of the H19 differentially methylated domain results in loss of imprinted expression of HI 9 and Igf2. // Genes Dev. 1998. V.12. P.3693-3702.
198. Thorvaldsen J, Mann M, Nwoko 0, Duran K, Bartolomei M. Analysis of sequence upstream of the endogenous HI9 gene reveals elements both essential and dispensable for imprinting. //Mol. Cell. Biol. 2002. V.22. P.2450-2462.
199. Tolhuis B, Palstra R, Splinter'E, Grosveld F, de Laat W. Looping and interaction between hypersensitive sites in the active P-globin locus. // Mol.Cell. 2002. V.10. P. 1453-1465.
200. Tremblay K, Duran K, Bartolomei M. A 5' 2-kilobase-pair region of the imprinted mouse HI9 gene exhibits exclusive paternal methylation throughout development. // Mol.Cell.Biol. 1997. V.17. P.4322-4329.
201. Udvardy A. Dividing the empire: boundary chromatin elements delimit the territory of enhancers. // EMBO J. 1999. V. 18. P. 1-8.
202. Vakoc С, Letting D, Gheldof N, Sawado T, Bender M, Groudine M, Weiss M, Dekker J, Blobel G. Proximity among distant regulatory elements at the p-globin locus requires GATA-1 and FOG-1. //Mol.Cell. 2005. V.17. P.453-462.
203. Vazquez J, Muller M, Pirrotta V, Sedat J. The Мер element mediates stable long-range chromosome-chromosome interactions in Drosophila. // Mol.Biol.Cell. 2006. V.17. P.2158-2165.
204. Verona R, Mann M, Bartolomei M. Genomic imprinting: intricacies of epigenetic regulation in clusters. // Annu.Rev.Cell Dev.Biol. 2003. V.19. P.237-259.
205. Vostrov A, Quitschke W. The zinc finger protein CTCF binds to the APBb domain of the amyloid b-protein precursor promoter. Evidence for a role in transcriptional activation. //J Biol Chem. 1997. V.272. P.33353-33359.
206. Wasser M, Chia W. The Drosophila EAST protein associates with a nuclear remnant during mitosis and constrains chromosome mobility. // J Cell Sci. 2003. V.l 16. P.1733-1743.
207. Wasser M, Chia W. The EAST protein of Drosophila controls an expandable nuclear endoskeleton. //Nat Cell Biol. 2000. V.2. P.268-275.
208. Wasser M, Chia W. The extrachromosomal EAST protein of Drosophila protein can associate with polytene chromosomes and regulate gene expression. // PLoS ONE. 2007. V.2. P.e412.
209. Wasser M, Osman Z, Chia W. EAST and Chromator control the destruction and remodeling of muscles during Drosophila metamorphosis. // Dev Biol. 2007. V.307. P.380-393.
210. Weinmann R, Roeder R. Role of DNA-dependent RNA polymerase 3 in the transcription ofthetRNAand 5S RNA genes. //PNAS. 1974. V.71. P. 1790-1794.
211. Weis L, Reinberg D. Transcription by RNA polymerase II: initiator-directed formation of transcription-competent complexes. FASEB J. 1992 V.6. P.3300-3309.
212. Wells W. Searching for a spindle matrix. I I J Cell Biol. 2001. V.154. P. 11021104.
213. West A, Huang S, Gaszner M, Litt M, Felsenfeld G. Recruitment of histone modifications by USF proteins at a vertebrate barrier element. // Mol.Cell. 2004. V.16. P.453-463.
214. West A, Gaszner M, Felsenfeld G. Insulators: many functions, many mechanisms. // Genes Dev. 2002. V.16. P.271-288.
215. Wood V, Gwilliam R, Rajandream M, Lyne M, Lyne R, et al. The genome sequence of Schizosaccharomyces pombe. //Nature. 2002. V.415. P.871-880.
216. Xu Q., Li M., Adams J., Cai H. Nuclear location of a chromatin insulator in Drosophila melanogaster. //J Cell Sci. 2004. V.l 17. P. 1025-1032.
217. Yoon Y, Jeong S, Rong Q, Chung J, Pfeifer K. Analysis of the H19ICR Insulator. //Mol.Cell Biol. 2007 V.27. P.3499-3510.
218. Yu Q, Qiu R, Foland T, Griesen D, Galloway C, Chiu Y, Sandmeier J, Broach J, Bi X. Raplp and other transcriptional regulators can function in defining distinct domains of gene expression. //Nucleic Acids Res. 2003. V.31. P.1224-1233.
219. Yusufzai T, Tagami H, Nakatani Y, Felsenfeld G. CTCF tethers an insulator to subnuclear sites, suggesting shared insulator mechanisms across species. // Mol.Cell. 2004. V.13. P.291-298.
220. Zhang Y, Reinberg D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. // Genes Dev. 2001. V.15. P.2343-2360.
-
Кривега, Иван Валерьевич
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2007
-
ВАК 03.00.26
- Закономерности политенизации гетерохроматиновых районов хромосом у Drosophila melanogaster
- Генетический полиморфизм мультилокусных маркеров и генных последовательностей ДНК в природных популяциях Drosophila melanogaster Северной Евразии
- hobo-элемент как фактор нестабильности генома Drosophila melanogaster в клетках генеративных и соматических тканей
- Микроинъекции ДНК онкогенных вирусов в полярную плазму ранних эмбрионов Drosophila melanogaster : эмбриологические и генетические эффекты
- Ретротранспозон МДГ4 и его роль в генетической нестабильности в мутаторной линии Drosophila melanogaster
