Расширение функционального домена альфа-глобиновых генов кур как следствие хромосомной перестройки

Филоненко, Елена Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Расширение функционального домена альфа-глобиновых генов кур как следствие хромосомной перестройки
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Расширение функционального домена альфа-глобиновых генов кур как следствие хромосомной перестройки"

□□3484488

На правах рукописи УДК 576.315.42

Филоненко Елена Сергеевна

РАСШИРЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ДОМЕНА АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР КАК СЛЕДСТВИЕ ХРОМОСОМНОЙ ПЕРЕСТРОЙКИ

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

2 6 НОЯ 2009

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003484488

Работа выполнена в лаборатории Структурно-функциональной организации хромосом Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук Яровая О.В.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Карпов В.Л.

кандидат биологических наук Коробко И.В.

Учреждение Российской академии наук Институт биорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится '' 2009 года в г/ час. на заседании

Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул, Вавилова, д. 32

НиОИ^рЛ:

Автореферат разослан пит ж 2009 года

Ученый секретарь диссертационногсьсйвета, Л

канд. фарм. наук ^/[ХЬУО^С&Ц^^" Л'С

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Изучение механизмов, контролирующих экспрессию генов высших эукариот, является одной из центральных задач молекулярной биологии. Согласно современным представлениям, активация транскрипции тканеспецифичных генов является многоэтапным процессом, начинающимся с изменения конформации соответствующего геномного домена и заканчивающимся сборкой преинициаторного комплекса (комплексов) на промоторе (промоторах). Геномными доменами в течение многих лет называли протяженные участки хромосом, характеризующиеся различной (зависящей от типа клеточной дифференцировки) чувствительностью к ДНКазе I. В качестве типичных моделей изучались домены бета-глобиновых генов позвоночных животных, домен гена лизоцима кур, домен гена аполипопротеина человека. Во всех этих доменах активации расположенных в них тканеспецифичных генов предшествует изменение хроматинового статуса домена (переход из ДНКазо-устойчивой в ДНКазо-чувствительную конформацию, коррелирующий с повышением уровня ацетилирования гистонов). В течение ряда лет господствовало мнение, что весь геном построен из сходно организованных структурно-функциональных блоков, подобных домену бета-глобиновых генов. Расширение спектра изучаемых геномных моделей продемонстрировало, что эта точка зрения является упрощенной. Были открыты так называемые домены «открытого типа», которые содержат перемежающиеся, а иногда и перекрывающиеся, тканеспецифичные гены и гены «домашнего хозяйства». Эта группа доменов достаточно широко представлена в геноме, и изучение принципов регуляции работы генов, расположенных в доменах «открытого типа», представляется крайне важным. Типичным примером доменов открытого типа является домен альфа-глобиновых генов. Сравнительный анализ геномов 22 видов позвоночных показал, что этот домен высоко консервативен в эволюции и включает кластер собственно альфа-глобиновых генов, расположенных в определённом порядке, и ген домашнего хозяйства сIбог/35, в котором находится главный регулягорный элемент, контролирующий работу альфа-глобиновых генов. Характерной чертой доменов «открытого типа», в том числе и доменов альфа-глобиновых генов, является независимая от транскрипционного статуса тканеспецифичных генов, входящих в состав домена, высокая чувствительность хроматина к нуклеазному гидролизу. Тем не менее, активации экспрессии альфа-глобиновых генов в эритроидных клетках также предшествуют определенные регуляторные события, осуществляющиеся на уровне всего домена и заключающиеся в изменении пространственной конформации домена и спектра сайт-специфических модификаций гистонов. Значение этих изменений в настоящее время мало изучено. То же можно сказать о принципах функциональной изоляции

различных генов в доменах «открытого» типа. Не изученными являются и механизмы разграничения доменов «открытого типа», которые, как правило, не содержат инсуляторных элементов.

Сравнительный геномный анализ окружения домена альфа-глобиновых генов у различных видов позвоночных показал, что участок, непосредственно соседствующий с альфа-глобиновыми генами, у кур претерпел хромосомную перестройку. Несколько генов-ортологов, граничащих с кластером альфа-глобиновых генов, расположены в инвертированном порядке у курицы по сравнению с человеком и рядом других позвоночных. В результате этого на одной из границ альфа-глобинового домена произошло нарушение консервативного расположения генов и перераспределение установившихся взаимодействий удалённых регуляторных элементов, при этом у кур ген ТМЕМ8 оказался в непосредственной близости к кластеру альфа-глобиновых генов, тогда как у человека он расположен на расстоянии 170 т.п.н. от него. В настоящей работе показано, что у кур регуляторные элементы гена ТМЕМ8 вовлечены в регуляторную сеть альфа-глобиновых генов, результатом чего является приобретение геном ТМЕМ8 эритроидспецифичного характера экспрессии. Таким образом, следствием эволюционной перестройки явилось расширение функциональных границ альфа-глобипового домена. Данное наблюдение углубляет наши представления как о принципах работы регуляторных систем доменов «открытого» типа, так и о путях эволюции этих доменов. Именно этим и определяется актуальность темы настоящей работы.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение структурно-функциональной организации ближайшего геномного окружения кластера альфа-глобиновых генов кур. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Охарактеризовать пространственную организацию 220 т.п.н. локуса 14 хромосомы кур, содержащего кластер альфа-глобиновых генов и фланкирующие его гены домашнего хозяйства.

2. Изучить экспрессию, структуру и хроматшювую конформацию гена ТМЕМ8, расположенного в непосредственной близости к кластеру альфа-глобиновых генов у кур.

Научная новизна и практическая ценность работы. Настоящая работа вносит существенный вклад в современные представления об организации геномных доменов «открытого» типа и регуляции экспрессии генов в этих доменах. Изучена пространственная организация протяженного фрагмента хромосомы 14 кур, включающего кластер альфа-глобиновых генов и фланкирующие его гены «домашнего» хозяйства. Впервые показано, что

у кур домен альфа-глобиновых генов содержит также не кодирующий глобиновые цепи ген ТМЕМ8, оказавшийся в непосредственной близости к кластеру альфа-глобиновых генов в результате геномной инверсии. Продемонстрировано, что ТМЕМ8 обладает эритроидспецифичным характером экспрессии. Показано, что продукт гена ТМЕМ8 корректно сплайсируется согласно предсказанной интрон-экзонной структуре, и его транскрипт накапливается при терминальной эритроидной дифференцировке. В одном из нитронов гена ТМЕМ8 кур обнаружен и охарактеризован эритроидспецифический энхансер, который взаимодействуют с регуляторными элементами альфа-глобиновых генов. В то же время продемонстрировано, что ТМЕМ8 не привлекается в активный хроматиновый блок альфа-глобиновых генов. Для активации экспрессии ТМЕМ8 собирается альтернативный хроматиновый комплекс, использующий ряд регуляторных элементов альфа-глобинового кластера. Это позволяет предположить, что данные регуляторные элементы перемещаются между двумя альтернативными хроматиновыми блоками.

Хотя работа характеризуется четко выраженной фундаментальной направленностью, полученные результаты имеют и определенное практическое значение. В последние годы все чаще стала возникать необходимость создавать клеточные линии и организмы, в геноме которых экспрессируются чужеродные гены (в частности, в биотехнологических целях и целях генной терапии). Осуществление этих задач невозможно без достаточно ясного представления о том, как организованы геномные домены, каким образом осуществляется контроль над транскрипцией генов посредством координированной работы регуляторных систем разных уровней. Результаты настоящей диссертационной работы углубляют существующие представления о геномных доменах открытого типа и, соответственно, расширяют возможности конструирования векторов, адаптированных для обеспечения работы трансгенов в таких доменах.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "JIOMOHOCOB-2008" (Москва, 2008), XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "ЛОМОНОСОВ-2009"(Москва, 2009), Международной научной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Из них статей - 3, тезисов докладов и материалов конференций - 2.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 112 страницах, содержит 12 рисунков и 4 таблицы, состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов исследования, Обсуждения результатов, Выводов и Списка литературы, включающего 209 источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ пространственной организации 220 т.п.н. геномного региона 14 хромосомы кур методом флуоресцентной гибридизации in situ. Нами было проведено исследование пространственной организации 220 т.п.н. геномного фрагмента 14 хромосомы кур, содержащего кластер альфа-глобиновых генов и ряд фланкирующих его генов (Рисунок 1А). Для решения этой задачи нами был использован метод флуоресцентной гибридизации in situ на препаратах развёрнутого хроматина (ядерных гало). Этот метод даёт возможность визуализировать петли ДНК, фиксированные своими основаниями на скелетных структурах ядра. В качестве объекта были выбраны культивируемые куриные эритробласты линии HD3 и куриные лимфоидные клетки линии DT40. Ядерные гало были приготовлены посредством солевой экстракции пермеабилизованных ядер, фиксированных на стекле. На препаратах можно видеть корону (гало) петель ДНК, прикрепленных к более ярко окрашенному ядерному матриксу (Рисунок 1). В качестве зондов для гибридизации in situ была А

811BDF №0 НВх ТМЕШ АхШ Рисунок 1. Анализ пространственной организации

—————МЦддддд^-Ш ■!-— 220 т.п.н. геномного локуса методом

С16оН35 MPRL2S флуоресцентной гибридизации in situ.

А. Схема изучаемой геномной области.

о 20 40 м m 100 120 140 160 180 200 220 RHBDp-К0ДИРУЮЩ™ эпидермальный фактор с в т.п.н роста; MPG- ген, кодирующий метиладенин-ДНК-

гликозилазу; C16orJ35 - ген домашнего хозяйства с неизвестной функцией, HBs -кластер альфа-глобиновых генов; ТМЕМ8 - ген, кодирующий трансмембранный белок 8; MPRL2S- ген, кодирующий белок L 28 митохондриальных хромросом; Axinl - ген, кодирующий аксин. Б-В. Результаты гибридизации in situ на препаратах ядерного гало для лимфоидной DT40 (Б) и эритроидной HD3 (В) линий клеток. В качестве зонда для гибридизации использована ВАС СН261-75С12.

использована ВАС-проба к исследуемой области генома, меченная биотинилированным

дезоксицитидином. Для выявления гибридизационного сигнала использовали каскад

флуоресцентно меченного авидина и биотинилированные антитела к авидину. Результаты

гибридизации, представленные на Рисунке 1, позволяют заключить, что в лимфоидных

клетках эта область генома организована в несколько петель, закрепленных на ядерном

матриксе. В эритроидных клетках большая часть локуса коллапсирована на структурах

ядерного матрикса и выявляется в виде точечного сигнала. Ранее было продемонстрировано,

что активация транскрипции тканеспецифичных генов при клеточной дифференцировке

коррелирует с пространственной реорганизацией геномных доменов, в границах которых

расположены эти гены. Эта реорганизация заключается в перемещении всего домена,

содержащего один или несколько активно транскрибирующихся генов, к ядерному матриксу (Ciejek et. al., 1983; Iarovaia et. al., 2005). В связи с этим было предположено, что наблюдаемый коллапс петли хроматина в куриных эритробластах является следствием активации тканеспецифичных генов в ходе эритроидной дифференцировки. По всей вероятности, коллапсируются не только альфа-глобиновые гены, но и их окружение.

Однако метод флуоресцентной гибридизации in situ хотя и позволяет визуализировать петельную организацию исследуемой области, но не обладает достаточной разрешающей способностью для того, чтобы можно было непосредственно картировать участки прикрепления ДНК к ядерному матриксу.

Картирование участков прикрепление к ядерному матриксу локуса 14 хромосомы кур, содержащей кластер альфа-глобиновых генов и его ближайшее окружение. Для установления топографии взаимодействий ДНК с ядерным матриксом в сегменте 14 хромосомы кур, содержащем кластер альфа-глобиновых генов и ряд фланкирующих его генов, нами был использован следующий подход: в исследуемой области были выбраны короткие тест-фрагменты, располагающиеся на расстоянии 5 т.п.н. друг от друга, и методом полуколичественного ПЦР-анализа оценивалась представленность этих фрагментов в препаратах прикреплённой к матриксу ДНК (Рисунок 2). Так как участки

О 20 40 60 60 100 120 140 160 180 200 220

пооаХ-шшшкшттавсс^сшо^йгаента я DT40 тпн

в прспарясгейоняой ДНК к иыичсшу в з^сшрате мз1р«китЯÍ0IK , HD3

Рисунок 2. Картирование участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу в границах 220 т.п.н. сегмента 14 хромосомы кур, включающего кластер альфа-глобиновых генов и ряд фланкирующих его генов.

В верхней части рисунка показана схема изучаемой геномной области. В нижней части рисунка показаны результаты ПЦР анализа. Обозначения такие же, как на Рисунке 1. Черный прямоугольник показывает протяженную область, которая целиком прикреплена к ядерному матриксу в клетках HD3. Погрешности - стандартное отклонение от величины среднего по трём независимым экспериментам.

прикрепления к ядерному матриксу разделяются на конститутивные (характерные для всех типов клеток) и тканеспецифичные, то с целью дискриминации различных типов

взаимодействий ДНК с ядерным матриксом проводилось параллельное изучение пространственной организации домена в эритроидных и неэритроидных клетках. Полученные результаты представлены на Рисунке 2 как отношение содержания исследуемых фрагментов в препаратах геномной ДНК к содержанию этих фрагментов в препаратах прилежащей к ядерному матриксу ДНК. Чем ближе к оси абсцисс полученное значение, тем выше представленность в матриксе данной последовательности. Последовательности ДНК, не связанные с матриксом и расположенные в петлях, выявляются в виде пиков. Результаты показали, что в лимфоидных клетках участки прикрепления к ядерному матриксу распределены относительно регулярно в пределах всей исследуемой области и разделяются несвязанными с ядерным матриксом фрагментами ДНК (Рисунок 2). Среднее расстояние между участками прикрепления или, иными словами, размер петель ДНК, составляет 20-30 т.п.н. Участок с координатами 35 - 100 т.п.н (Рисунок 2) организован сходным образом в клетках НОЗ и ОТ40. Эта область содержит гены домашнего хозяйства, которые экспрессируются на относительно низком уровне как в эритроидных, так и в лимфоидных клетках (1агоуа1а ей а!., 2009). В эритроидных клетках область от 100 до 170 т.п.н., составляющая большую часть исследуемого геномного фрагмента, предпочтительно представлена в препаратах прилежащей к ядерному матриксу ДНК. Анализ полученных результатов позволил заключить, что протяженный фрагмент генома с координатами от 100 до 170 т.п.н. на карте, показанной на Рисунке 2, целиком прикреплен к ядерному матриксу в эритроидных клетках. В пределах прикрепленного к ядерному матриксу протяженного геномного фрагмента локализуются домен альфа-глобиновых генов, а также гены МРР1.28, ТМЕМ8 и часть гена С15оф5.

Изучение транскрипционного статуса генов, окружающих кластер альфа-глобиновых генов кур. Нами было проведено сравнение транскрипционного профиля генов С16оф5, ТМЕМ8, МРЯЬ28 и АХШ1 в эритроидных и неэритроидных клетках кур. С этой целью была выделена тотальная РНК из эмбриональных куриных фибробластов (КЭФ), лимфоидной (ЭТ40) и эритроидной линии клеток (НОЗ). Используя метод обратной транскрипции с последующей ПЦР в реальном времени с TaqMan пробами, мы установили относительную представленность интронных регионов вышеперечисленных генов в данных образцах РНК. Результаты, представленные на Рисунке ЗБ, показали, что уровень транскрипции генов С1бог/35 и МРЯЬ28 не отличается от уровня транскрипции АХШ1, не представленного во фракции прилежащей к ядерному матриксу ДНК, во всех типах клеток. Ген ТМЕМ8, в отличие от генов, являющихся, по-видимому, генами домашнего хозяйства (С1 бог/35, МРЯЬ28 и АХ1Ы1), транскрибировался в пролиферирующих клетках НОЗ более

-!-

12,66 м.п.н

12,70 M.п.H 12,74 M,п.H. 12,78 M.n.H. 12,82 M.n.H.

C16orf35 HBZHBA2HBA1 TMEM8 MPRL28 AXIN1

C160RF35 TMEM8 Г

MPRL28 AXIN1

> H

с с с с

1 2 3 4 5 лимфоциты периферической крови

1 □ ТМЕМ интрон

2 Щ ТМЕМ экзон ЗПНВА1 интрон 40НВА1 экзон Г'Ш| бета-актин

эритроциты + гранулоциты

1 QjTMEM интрон

2 И ТМЕМ экзон ЗП бета-актин

123 123 123 желудок мышцы селезёнка

1 2 3 мозг

1 2 3 жир

1 2 3 лёгкие

12 3 сердце

12 3 12 3 печень кровь

Рисунок 3. Экспресеионный профиль КТМЕМ8 и других генов, фланкирующих кластер альфа-глобииовых генов, в различных клетках и тканях кур.

A. Схема, показывающая расположение исследуемых генов. Шкала показывает реальные расстояния на 14 хромосоме кур.

Б. Экспрессия исследуемых генов в клетках различных линий. Исследуемые гены обозначены на оси X. Столбцы на диаграмме показывают нормализованный уровень мРНК каждого исследуемого гена. Относительная единица - 0.1% от установленного числа копий 18S рРНК. Погрешности - стандартное отклонение от величины среднего по четырём независимым экспериментам.

B. Относительный уровень интронных и экзонных последовательностей РНК кТМЕМ8 и НВА1 генов, выделенной из лимфоцитов периферической крови и из образцов, содержащих смесь эритроцитов и гранулоцитов (главным образом эритроцитов), полученных из образцов крови взрослых кур. Уровень экзонных последовательностей бета-актина показан для сравнения. Результаты были нормированы как описано выше (секция «Б»), «n/d» означает, что тест-фрагменты не детектировались при анализе образцов РНК.

Г. Экспрессия кТМЕМ8 в различных тканях взрослой курицы. Все обозначения как в секции «Б».

интенсивно, чем в КЭФ и клетках линии DT40. Высокий уровень транскрипции ТМЕМ8 в эритроидных клетках и его репрессия в лимфоидных клетках позволили предположить, что по характеру экспрессии этот ген является эритроидспецифичным. Особый интерес к этому гену связан с тем, что в результате геномной инверсии этот ген в геноме кур оказался сближен с доменом альфа-глобиновых генов.

Изучение экспрессии гена ТМЕМ8 в различных типах тканей. ТМЕМ8 (а также: М83, ТМЕМ6) - высококонсервативный ген, кодирующий белок с 5 трансмембранными доменами (Motohashi et al., 2000). Белковый продукт этого гена был охарактеризован только для человека (UniProtKB: Q9HCN3). У человека ТМЕМ8 (далее обозначенный как чТМЕМ8 для ТМЕМ8 человека), экспрессируется на высоком уровне в покоящихся Т-лимфоцитах (Motohashi et. al, 2000). Чтобы проверить, сохранил ли ТМЕМ8 свои функции в куриных клетках, мы проанализировали образцы РНК, приготовленные из эритроцитов и лимфоцитов периферической крови (ЛПК) кур на предмет присутствия интронных и экзонных последовательностей ТМЕМ8 (далее обозначенный как кТМЕМ8 для ТМЕМ8 кур). Результаты анализа (Рисунок ЗВ) показали, что в куриных лимфоцитах кТМЕМ8 либо не транскрибируется, либо транскрибируется на незначительном уровне, в то время как в эритроцитах наблюдался высокий уровень транскрипции кТМЕМ8.

В следующей серии экспериментов была изучена экспрессия кТМЕМ8 в тканях взрослой курицы. Образцы РНК были выделены из тканей желудка, мышц, селезёнки, мозга, жировой ткани, лёгких, сердца, печени и периферической крови. Количественный анализ содержания интронных и экзонных последовательностей кТМЕМ8 и экзонной последовательности ß-актина в образцах РНК, был проведен с использованием метода обратной транскрипции с последующей ПЦР в реальном времени. Результаты, представленные на Рисунке ЗГ, позволили заключить, что уровень транскрипции кТМЕМ8 (как следует из сравнения обогащенности образцов РНК интронными последовательностями) как минимум в 1000 раз выше в образцах РНК из периферической крови, по сравнению с другими исследованными тканями (Рисунок ЗГ). В предыдущем эксперименте было показано, что кТМЕМ8 не экспрессируется в лимфоидных клетках. Следовательно, высокий уровень экспрессии кТМЕМ8 в периферической крови обусловлен его экспрессией в эритроцитах. Различие становится более значительным (в 10 раз) после индукции эритробластов к терминальной дифференцировке (см. следующий раздел).

Индукция экспрессии ТМЕМ8 при терминальной эритроидной дифференцировке. Трансформированные AEV куриные проэритробласты (линия HD3) являются моделью ранней стадии дифференцировки кровяных клеток кур по эритроидному пути (Beug et. al, 1979). Они не экспрессируют глобины, хотя кластер альфа-глобиновых генов находится в активной хроматиновой конформации (Klochkov et. al, 2009). После индукции дифференцировки клетки HD3 останавливают пролиферацию и начинают экспрессировать «взрослые» глобиновые гены (Gavrilov & Razin, 2008). С целью выяснить, стимулируется ли транскрипция кТМЕМ8 при дифференцировке клеток линии HD3, была

проанализирована относительная представленность интронных и экзонных последовательностей кТМЕМ8 в образцах тотальной РНК, изолированной из пролиферирующих и дифференцированных клеток линии НОЗ. Полученные результаты (Рисунок 4А) ясно показывают, что транскрипция кТМЕМ8, также как и гена НВА1, в значительной степени индуцируется при терминальной дифференцировке. Уровень экспрессии генов МРЯЬ28 и АХШ1 изменяется в процессе дифференцировки клеток линии НБЗ незначительно.

35341 33-< 32-§ о 31-

II 1

- 1 1

- гЬ Л

Рисунок 4. Индукция экспрессии кТМЕМв при терминальной дифференцировке в культуре куриных эритробластов.

А. Изменение в уровне экспрессии НВА1-глобинового гена и генов, расположенных за кластером альфа-глобиновых генов при индукции терминальной дифференцировки в линии клеток куриных эритробластов (НЭЗ). Столбцы на диаграмме представляют отношение уровня экспрессии каждого гена в индуцированных клетках линии НЭЗ к уровню экспрессии этих же генов в пролиферирующих клетках НОЗ. Погрешности представляют собой стандартное отклонение от величины среднего по 4 независимым экспериментам. Б. Изменение в уровнях экспрессии чТМЕМ8, НВА2 и генов, фланкирующих кластер альфа-глобиновых генов, при индукции терминальной эритроидной дифференцировки в линии клеток эритробластов человека К562. Обозначения такие же, как для секции «А».

В следующем эксперименте был проанализирован уровень экспрессии чТМЕМ8 в линии клеток эритролейкемии человека К562 (Ьоггю е1. а1., 1979) до и после индукции терминальной эритроидной дифференцировки. Анализ образцов РНК из пролиферирующих и дифференцированных клеток К562 (Рисунок 4Б) продемонстрировал, что уровень транскрипции чТМЕМ8 не изменяется при индукции дифференцировки К562. Таким образом, экспрессионный профиль кТМЕМ8 и чТМЕМ8 принципиально отличен.

Характеристика транскрипта кТМЕМ8. В отличие от человека, где и мРНК и белковый продукт гена чТМЕМ8 были охарактеризованы (МйоЬазЫ е1. а!., 2000), кТМЕМ8 был найден как открытая рамка считывания только биоинформатическими методами. Был поставлен вопрос о том, корректно ли сплайсируется транскрипт открытой рамки

считывания, и можно ли идентифицировать мРНК, кодируемую этим геном, методом Нозерн-блот анализа. На основании предсказанной инторон-экзонной структуре, кТМЕМ8 (Ensembl protein coding Gene: ENSGALG00000007471 (UniProtKB/TrEMBL: Q8UWG9_CHICK)) были подобраны 4 пары праймеров для ПЦР, расположенные в различных экзонах кТМЕМ8 (Рисунок 5А-В). С использованием этих праймеров

» III lili ~~пт

ампликоны ^ 1 { )2<

>3< >4<

N ампликона кДНК геномная ДНК

1 317 bp 1335 bp

2 193 bp 592 bp

3 307 bp 771 bp

380 bp 818 bp

В 1 2 3 4

5 s

о i о

а: о: bD ф СИ ce 2 fe ел D с o: í

HD3 • ■»•

6345 Ьр -

3234 Ьр -

Рисунок 5. Анализ транскрипта кТМЕМ8.

A. Схема, иллюстрирующая интрон-экзонную структур кТМЕМ8 (согласно Ensembl Genome Browser) и позиции тест-ампликонов.

Б. Ожидаемый размер ПЦР-продуктов при амплификации с кДНК и геномной ДНК.

B. Результаты ПЦР-амплификации. Номера (1 -4) над фотографией отражают номер ампликона в соответствии с секцией «А».

«RT+» - ПЦР выполненная на матрице, полученной в результате реакции обратной транскрипции; «RT-» -контрольный эксперимент, в котором ПЦР была выполнена на матрице, полученной в результате реакции обратной транскрипции без добавления ревертазы. Необходимо отметить, что ПЦР-продукты, полученные на матрице кДНК (дорожки «RT+») имеют размеры, ожидаемые для матриц с вырезанными интронами.

Г. Нозерн-блот гибридизация экзонных проб к ТМЕМ8 с поли-А+ РНК, выделенной из пролиферирующих HD3, дифференцированных HD3 (HD3ind) и клеток линии DT40. РНК кТМЕМ8 показана стрелками.

было продемонстрировано, что интроны 1, 3, 9 и 11 кТМЕМ8 сплайсируются корректно. Затем был проведён Нозерн-блот анализ образцов поли-А+ РНК, выделенных из пролиферирующих и дифференцированных клеток НОЗ. кШ£А/8-специфичная проба позволила идентифицировать один транскрипт размером ~5 т.п.н., присутствующий в обеих пробах РНК (Рисунок 5Г). Интенсивность полосы в дорожке, содержащем поли-А+ РНК из дифференцированных клеток НОЗ, была намного выше. В дорожке, содержащей поли-А+ РНК из клеток линии ОТ40, специфический транскрипт отсутствует.

Таким образом, были исследованы пространственная организация, характер прикрепления к ядерному матриксу и профиль экспрессии ближайшего геномного окружения кластера альфа-глобиновых генов. В результате этого исследования было

обнаружено, что для гена кТМЕМ8, расположенного в непосредственной близости к кластеру альфа-глобиновых генов, характерны предпочтительная экспрессия в эритроидных клетках, повышение уровня экспрессии при индукции терминальной эритроидной дифференцировки и типичные для эритроидных клеток особенности пространственной организации в клеточном ядре. Кроме того, мы показали, что транскрипт К.ТМЕМ8 сплайсируется согласно предсказанной интрон-экзонной структуре и накапливается в эритроидных клетках.

Изучение хроматиновой конформации кТМЕМ8 методом ЗС. В следующей группе экспериментов мы проверили, контролируется ли экспрессия кТМЕМ8 известными регуляторными элементами домена альфа-глобиновых генов. Ранее было показано, что в дифференцированных клетках (ЮЗ собирается активаторный комплекс (активный хроматиновый блок (ёе Ьаа1 е1. а1., 2003)), включающий расположенный перед кластером альфа-глобиновых генов главный регуляторный элемент (МЯЕ), эритроидспецифический сайт гиперчувствительности к ДНКазе I, расположенный на расстоянии 9 т.п.н. перед кластером альфа-глобиновых генов (-9 ОНБ), Срй-островок, находящийся перед кластером альфа-глобиновых генов, промотор гена НВА2 и эритроидспецифический энхансер альфа-глобинового домена (Оа\п1оу & Яагт, 2008). Простейшее предположение заключалось в том, что кТМЕМ8 также привлекается в этот хроматиновый блок. Для проверки этого предположение был проведён количественный ЗС анализ (Hagege е/. а1., 2007; СаугПоу & Яагш, 2008). Метод ЗС позволяет определить относительное расстояние между фрагментами хроматина и показать, сближены ли в пространстве те или иные удалённые регуляторные элементы. Метод основан на том, что удалённые геномные последовательности, пространственно сближенные и объединённые белковыми комплексами, могут быть химически сшиты. После обработки «сшитых» комплексов рестриктазами продукты рестрикции лигируют. «Сшитые» фрагменты ДНК лигируются друг с другом с большей эффективностью, чем другие. ПЦР в реальном времени с использованием праймера к интересующему фрагменту, обозначенного как якорный, в сочетаний с праймерами, специфичными к другим продуктам лигирования, позволяет количественно измерить частоту лигирования различных рестриктных фрагментов с якорным и таким образом оценить относительное расстояние между исследуемыми последовательностями. Было проведено параллельное исследование пространственной организации геномной области, содержащей регуляторные элементы альфа-глобинового кластера и гена кТМЕМ8, в лимфоидных клетках линии ЭТ40 и пролиферирующих и терминально дифференцированных культивируемых эритроидных клетках линии НБЗ. Для разрезания исследуемой области на фрагменты были использованы рестриктазы Ват Н1 и

В§Ш, имеющие «совместимые» липкие концы. Расположение праймеров и ТацМап проб показано на Рисунке 6А. Сначала якорь был расположен на фрагменте, содержащем МЯЕ, и анализировались частоты лигирования этого фрагмента с фрагментами, расположенными

д МНЕ -90НЗ СрС островок енхансер ТМЕМ8

__,_Г Г Г. г..........

-■II I ....... I I *-И-й-0|-•-1 II 1111 III»-

сюстрз^ НВгНВА2НВА1 Срв островок

Тар Мап пробы праймеры

12,68 ^ 12.69 контрольный регион

12,71 12.72

12.73 12.74 12.75 12.71 позиция (м.п.н.)

12.73 12,74 12.75

позиция на хромосоме (м.п.н.)

— индуцированные НРЗ

— пролиферирующие НОЗ ЭТ40

позиция (м.л.н.) е

позиция (м.п.н.)

Рисунок 6. Анализ взаимодействия кТМЕМ8 с регуляторными элементами альфа-глобинового домена в неэритроидных и эритроидных линиях клеток

А. Рестриктная карта исследуемого региона. Шкала отражает реальные расстояния на 14 хромосоме кур. Прямоугольники - гены (красными линиями обозначены экзоны, стрелки указывают направление транскрипции); красные овалы - МЯЕ и энхансер; чёрная вертикальная стрелка - -9 ВНБ; зелёные овалы - Срв островки. Длинные и короткие вертикальные линии над шкалой расстояний показывают расположение сайтов рестрикции ВатН1 и BgШ соответственно. Расположение праймеров и TaqMan проб, использованных для ЗС анализа, показано соответственно чёрными горизонтальными стрелками и прямоугольниками. Б-Е. Относительная частота взаимодействия между якорным фрагментом (Б) - МЯЕ, (В) - -9 КЬ ОНБ, (Г) - энхансером, расположенным за кластером альфа-глобиновых генов, (Д) - Срв островком, расположенным между кластером альфа-глобиновых генов и кТМЕМ8, (Е) - средней частью кТМЕМ8 и другими фрагментами исследуемого локуса. По оси «х» обозначено расположение фрагментов в соответствии со шкалой на рестриктной карте, м.п.н. - миллионы пар нуклеотидов. В верхней части каждого графика дана схема домена с такими же обозначениями как в секции «А». Результаты ЗС анализа для индуцированных НБЗ, пролиферирующих НБЗ и ЭТ40 показаны красными, синими и жёлтыми линиями соответственно. Чёрные прямоугольники на заднем фоне со значком якоря сверху демонстрируют позицию якорного фрагмента, светло-серые прямоугольники - тест-фрагментов. Границы между соседними фрагментами обозначены чёрными линиями. Области с белым фоном не анализировались. По оси «У» показаны частоты сшивки между анализируемыми фрагментами, нормированные относительно частот сшивки между фрагментами из контрольной области. Линии погрешностей соответствуют стандартному отклонению от величины среднего по 4 независимым экспериментам.

за кластером альфа-глобиновых генов начиная с энхансера. Было продемонстрировано, что в дифференцированных клетках HD3 MRE взаимодействует с энхансером, что подтверждает полученные ранее результаты (Gavrilov & Razin, 2008). Ни кТМЕМ, ни фрагменты ДНК, фланкирующие кТМЕМ8, не показали увеличения частоты лигироваиия с якорным фрагментом, содержащим MRE (Рисунок 6Б). Принципиально иная картина наблюдалась при постановке якоря на фрагмент ДНК, содержащий сайт гиперчувствительности к ДНКазе I (-9 DHS). В клетках линии HD3, помимо взаимодействия с энхансером, этот фрагмент предпочтительно взаимодействовал с двумя фрагментами, расположенными правее энхансера, а именно, с фрагментом, содержащим CpG островок, расположенным перед кТМЕМ8, и фрагментом ДНК, расположенным в середине гена кТМЕМ8. Частота дотирования -9 DHS с серединой кТМЕМ8 была одинаковой для пролиферирующих и дифференцированных HD3 клеток, в то время как частота дотирования -9 DHS с CpG островком была выше (в 3.5 раза) в дифференцированных клетках, по сравнению с пролиферирующими HD3. Ни одно из этих взаимодействий не наблюдалось для линии клеток DT40 (Рисунок 6В). При постановке якоря на эритроидспецифичный энхансер наблюдалась высокая частота дотирования якорного фрагмента с CpG-островком, расположенным перед кТМЕМ8, и со средней частью гена кТМЕМ8 в дифференцированных клетках HD3 (Рисунок 6Г). Также для этого типа клеток наблюдался повышенный уровень лигирования энхансера с -9 DHS (что согласуется с ранее опубликованными данными (Gavrilov & Razin, 2008)). Вышеописанные ассоциации не наблюдались ни для пролиферирующих клеток HD3, ни для клеток линии DT40. При одновременном анализе результатов, представленных на Рисунке 6В и Г можно заключить, что -9 DHS и эритроидспецифичный энхансер альфа-глобинового домена вовлечены в регуляцию экспрессии кТМЕМ8 в пролиферирующих (только -9 DHS) и дифференцированных (и -9 DHS, и эритроидспецифичный энхансер) клетках линии HD3. Мишени вышеописанных регуляторных элементов, по всей вероятности, локализуются внутри б т.п.н. Ват HI-Bgl II фрагмента, содержащего CpG островок, и 6 т.п.н. Ват HI фрагмента, располагающегося во внутренней части кТМЕМ8. Для проверки этого заключения якорь был помещён на каждый из двух фрагментов. Данные, представленные на Рисунках 6Д и Е, показывают, что в дифференцированных клетках линии HD3 интересующие нас фрагменты взаимодействуют друг с другом, с -9 DHS и с эритроидспецифичным энхансером. В соответствии с наблюдениями, сделанными для якоря, расположенного на -9 DHS (Рисунок 6В), в реципрокных экспериментах было показано, что частота ассоциации CpG островка с -9 DHS ниже в пролиферирующих клетках HD3, по сравнению с клетками HD3, индуцированных к терминальной эритроидной

дифференцировке (Рисунок 6Д). Частота лигирования средней части гена кТМЕМ8 с -9 DHS приблизительно одинакова для пролиферирующих и дифференцированных клеток HD3 (сравнение Рисунков 6В и Е). Таким образом, в пролиферирующих и в терминально дифференцированных клетках HD3 средняя часть гена кТМЕМ8 взаимодействует с -9 DHS. В то же время не наблюдалось взаимодействие ни одного из исследованных фрагментов с промоторами взрослых апьфа-глобиновых генов. Этот факт свидетельствует о том, что, по всей вероятности, существует две альтернативные пространственные конфигурации альфа-глобинового домена. -9 DHS и эритроидспецифичный энхансер могут активировать либо глобиновые гены, либо ген кТМЕМ8.

Для увеличения разрешения ЗС анализа эксперимент с якорем, расположенным на эритроидспецифичном энхансере, был повторён с использованием рестриктазы Mbol. Результаты ЗС анализа (см. диссертацию) позволили заключить, что энхансер домена альфа-глобиновых генов взаимодействует с CpG островком per se. Что касается самого гена кТМЕМ8, то сайты взаимодействия с эритроидспецифическим энхансером были картированы внутри 3 и 8 интронов этого гена.

Картирование участков гиперчувствительности к ДНКазе I в области гена кТМЕМН. Регуляторные элементы генома часто колокализуются с сайтами гиперчувствительности к ДНКазе I. Для картирования сайтов гиперчувствительности к ДНКазе I, в области, фланкирующей домен альфа-глобиновых генов справа, был использован метод непрямого мечения концов ДНК (Wu et. al., 1979). Схема эксперимента и полученные результаты представлены на Рисунке 7. Пермеабилизированные клетки (DT40 и пролиферирующие HD3) были обработаны увеличивающимися количествами ДНКазы I. После очистки ДНК обрабатывалась рестриктазами Hind III, либо Xba I и анализировалась посредством гибридизации по Саузерну с пробами, узнающими правые концы 14.8 т.п.н. Hind III фрагмента, содержащего в себе CpG островок, расположенный перед кТМЕМ8, и 9.1 т.п.н. Xba I фрагмента, включающего всю внутреннюю часть кТМЕМ8 (Рисунок 7А). Анализ результатов гибридизации позволил локализовать 3 сайта гиперчувствительности к ДНКазе I для линии клеток DT40 и 3 сайта гиперчувствительности к ДНКазе I для линии клеток HD3 (Рисунок 7Г). Только один из обнаруженных сайтов гиперчувствительности был общим для обеих линий клеток. Сильный эритроидспецифичный сайт гиперчувствительности к ДНКазе I был обнаружен в середине открытой рамки считывания кТМЕМ8 между 7 и 8 экзонами.

А Рисунок 7. Картирование сайтов

-9DHS CpG HEI нам НВА1 enh CpG ТМЕМ8 гиперчувствительности к ДНКазе I (DHS)

И l-Ц-И—И—Пг|-О-IUI I II I III»- внутри гена кТМЕМН и в регионе,

c,6orf35 hliii x'bai Hindiii Aal фланкирующем kTMEMS, в линиях клеток

I-Hi----j 9л _ | DT40 и HD3.

А. Схема расположения генов Б Hindi» В xbai (прямоугольники), CpG островков (круги) и

DNAse I DNAse I oNAse I DNAse I энхансера домена альфа-глобиновых генов

------- —----1 ——------- 1 (овал) в исследуемом регионе. DHS

DT4°__нрз D"1"40__нрз картировали в рестриктных фрагментах

' * « " ' I kb j . J kb HindIII и Xbai, показанных под картой. На

•-«•«и»», *<••*» . —14.8 B«MM>4iffM»pÎM *!_ g 1 рисунке отражен размер этих рестриктных » « * « ' 'i | фрагментов в т.п.н. Расположение

- " 5.5 гибридизационных проб, использованных для

40 > ";~42 непрямого мечения концов, показано

* • > . j ■ чёрными прямоугольниками.

Б, В. Результаты гибридизации с пробами, распознающими концы выбранных рестриктных фрагментов. ДНК из ядер, обработанных увеличивающимися количествами ДНКазы I, обрабатывали DT40 DHS DHS DHS рестриктазой (Б) Hind III или (В) Xbai и

[?) i "п д ¡i д| fo 'ulljjii hi*- гибридизовали с пробами, показанными на

панели «А».

Расположение полноразмерных рестриктных фрагментов и дополнительных полос, образованных в результате расщепления ДНКазой I сайтов гиперчувствительности, показаны стрелками с правой стороны фотографии. На рисунке указан размер фрагментов в т.п.н.

Г. Схема расположения идентифицированных сайтов гиперчувствительности к ДНКазе I. Позиции DHS показаны чёрными стрелками для клеточных линий IID3 и DT40. Обозначения такие же, как для секции «А».

Картирование энхансерного элемента в нитроне гена кТМЕМ8. Непосредственное взаимодействие эритроидспецифичного энхансера, расположенного за кластером альфа-глобиновых генов, с CpG островком и внутренним участком гена кТМЕМ8, свидетельствует о том, что партнёр регуляторного элемента может быть расположен внутри этих регионов. Для проверки этого предположения было проанализировано распределение потенциальных сайтов связывания транскрипционного фактора GATAI в рамках 20 т.п.н. фрагмента ДНК, включающего CpG островок и ген кТМЕМ8. GATAI- активатор транскрипции, играющий важную роль в гемопоэзе (Crispino, 2005). Ранее было показано, что кластер из трёх сайтов связывания GATAI, расположенный в эритроидспецифичном энхансере домена альфа-глобиновых генов кур, имеет важное значение для активации транскрипции с промоторов альфа-глобиновых генов (Knezetic & Felsenfeld, 1989). Анализ in silico геномного фрагмента с координатами 12,735-12,755 (см. карту на Рисунке 6) выявил кластер из трёх сайтов связывания GATAI (WGATAR) внутри 7 интрона гена кТМЕМ8 (Рисунок 8А). С тем чтобы определить, действительно ли GATAI связывается с найденными консенсусами, был поставлен эксперимент по задержке электрофоретической подвижности в геле (Fried & Crothers, 1981; Klochkov & Razin, 2006). В качестве зонда были использованы радиоактивно

HBZ НВА2 НВА

-111—И—№

нхансер CpG островок ТМЕМ8

tgagtttatccagccttgaggctgaggcaaagcactgtacctcctggtcc

tgctgcccttgcctcacataagcaaaaccaaatgcctcccactgtcatgc

____ J_______

cttctacttcaqqctcaatacatai7?!^»fcaataaaacactqactacaa

gcagcttgtctggtgctgacctgctgtgtctcacgctgactgcatgtggg

_____3__

tggcagagccîgctîggatgagctttcccagatgtgtgttgagg(nE3IS

attggiTgâgagcagtgttgtaagtcagaatgctgttacttcctcaagggg tctttgaaatgcacacagttgctctcatagtctagcagtttgccttcctg gtgattcatctgtgt

меченный фрагмент

специфический 0 k+ 1 2 3 k- 0 k+ 1 k-конкурент щ "

Ok+2 k- ok+3 k-

низ \Lucilerase\

Л ; 05 ш H-

1 HlsiM 1»!1 Luciterase]

1 DHSI IsAMfïMJSÏcà'ZiM 1 Lucrierase] H-

6 8 10 12 14 16 нормализованная активность люциферазы

Luciferase\ rmsi 13ШЯЯЯШ5! I Luc,¡era™ I

ПИ I— I Lualerasa

о i i è 8 10 12 14 16 нормализованная

Рисунок 8. Идентификация энхансерного элемента внутри тела гена кТМЕМ8

A. Схема, показывающая расположение и последовательность исследуемого фрагмента ДНК. Олигонуклеотиды, используемые для эксперимента по задержке электрофоретической подвижности в геле, показаны пунктирной линией. Предсказанные сайты связывания GATAI 1-3 выделены чёрными прямоугольниками.

Б. Результаты эксперимента по задержке электрофоретической подвижности в геле. Дорожки обозначены в следующем порядке: над линией - номер тестируемого фрагмента (к+ - контрольный фрагмент, содержащий bona fide сайт связывания GATA 1, 1 -3 - тест-фрагменты, обозначенные в секции «А»); под линией -тип специфического конкурента (к- -фрагмент, не связывающий GATAI; остальные обозначения расшифрованы выше). Каждый образец содержит также poly dl/dC. В последней дорожке содержится к+ фрагмент без инкубации с белковым экстрактом.

B. Результаты экспериментов по трансфекции. Конструкты схематически показаны в левой части рисунка. Диаграмма показывает нормализованную люциферазную активность, где за единицу принимается активность люциферазы под промотором НВА2 гена. Линии погрешностей соответствуют стандартному отклонению от величины среднего по 4 независимым экспериментам.

активность люциферазы

меченые 30 п.н. олигонуклеотиды, содержавший потенциальный участок связывания GATAI (Рисунок 8А), в качестве источника белковых факторов - экстракт ядерных белков, выделенный из ядер клеток HD3. Было продемонстрировано, что все три потенциальных сайтов связывания GATAI связываются с неким белковым фактором (Рисунок 8Б). В экспериментах по конкурентному связыванию немеченого («холодного») двуцепочечеого олигонуклеотида, содержащего известный участок связывания GATAI (Knezetic & Felsenfeld, 1989), было показано, что данный олигонуклеотид эффективно конкурировал с изучаемыми фрагментами ДНК за связываемый белковый фактор: уже при 10-кратном

молярном избытке конкурента сигнал, соответствовавший ДНК-белковому комплексу, практически полностью исчезал, так же, как при вытеснении меченого фрагмента гомологичным ему специфическим немеченым фрагментом (рисунок 8Б). На основании этих результатов было сделано заключение, что каждая из последовательностей WGATAR, присутствующих в вышеописанном кластере, действительно связывает GATAI, хотя сила связывания для трёх исследуемых фрагментов различается (Рисунок 8Б). Таким образом, появились основания полагать, что участок, содержащий 3 сайта связывания GATAI, может обладать энхансерной активностью. Для проверки этого предположения -400 п.н. фрагмент ДНК, включающий кластер сайтов связывания GATAI, был проверен на энхансерную активность в экспериментах по транзиторной трансфекции. С этой целью перед геном люциферазы светлячка под промотором гена НВА2 кур был клонирован исследуемый фрагмент. Этот конструкт, конструкт без исследуемого фрагмента, а также конструкт без тест-фрагмента и без промотора гена НВА2 были трансфецированы в клетки линии HD3. Проведенный анализ позволил заключить, что исследуемый фрагмент в б раз стимулирует активность промотора гена НВА2 (Рисунок 8В). Для проверки универсальности нового энхансерного элемента исследуемая последовательность была клонирована перед промотором ранних генов вируса SV40. Результаты этого эксперимента говорят о том, что энхансерный элемент не активирует промотор SV40 (Рисунок 8В). При трансфекции всех 5 конструкций в клетки эмбриональных фибробластов кур не наблюдалось активации энхансером промотора альфа-глобинового гена (Рисунок 8В). Следовательно, энхансерный элемент является эритроидспецифичным и избирательным в отношении промотора. В CpG островке не было обнаружено сайтов связывания GATAI; функциональная значимость этого фрагмента остаётся неясной.

Подводя итог, можно сказать, что в этой части работы было показано, что в гене кТМЕМ8 между 7 и 8 экзонами содержится сильный эритроидспецифичный сайт гиперчувствительности к ДНКазе I. С сайтом гиперчувствительности к ДНКазе I колокализуется эритроидспецифичный регуляторный элемент, обладающий энхансерной активностью и содержащий в своём составе 3 сайта связывания транскрипционного фактора GATAI. Исследование хромосомной конформации гена кТМЕМ8 показало, что в эритроидных клетках ген кТМЕМ8 непосредственно взаимодействует с эритроидспецифичным энхансером и с регуляторным элементом -9 DHS, но не с главным регуляторным элементом домена альфа-глобиновых генов. Однако кТМЕШ не привлекается в активный хроматиновый блок альфа-глобиновых генов. Для активации экспрессии ТМЕМ8 собирается альтернативный хроматиновый комплекс, использующий ряд регуляторных

элементов домена альфа-глобиновых генов. Видимо, эти регуляторные элементы перемещаются между двумя различными хроматиновыми блоками.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В течение последних 25 лет модели, описывающие регуляцию экспрессии альфа-глобиновых генов, становилась всё более и более сложными. Однако области, фланкирующие альфа-глобиновые гены, оставались мало исследованными. С целью изучения пространственной организации 220 т.п.н. сегмент хромосомы 14 кур, содержащий кластер альфа-глобиновых генов и окружающие его гены, были проведены эксперименты по FISH на препаратах ядерного гало. Результаты показали, что в эритроидных клетках исследуемая область коллапсирована на скелетных структурах ядра и визуализируется в виде точечного сигнала. В лимфоидных клетках исследуемая область выявляется в виде нескольких петель. В серии предшествующих работ было продемонстрировано, что активация транскрипции тканеспецифичных генов при клеточной дифференцировке коррелирует с пространственной реорганизацией геномных доменов, в границах которых расположены эти гены. Эта реорганизация заключается в перемещении всего домена, содержащего один или несколько активно транскрибирующихся генов, к ядерному матриксу (Ciejek et al., 1983; Iarovaia et al., 2005). С учётом этих результатов, было проведено более детальное исследование характера прикрепления к ядерному матриксу изучаемого фрагмента хромосомы 14 кур в эритроидных и лимфоидных клетках. Было показано, что в лимфоидных клетках участки прикрепления ДНК к ядерному матриксу распределены относительно регулярно в пределах всей исследуемой области и разделяются не связанными с ядерным матриксом фрагментами. В эритроидных клетках часть исследуемой геномной области, содержащая кластер альфа-глобиновых генов, а также ген кТМЕМ8, оказалась предпочтительно представлена в препаратах прилежащей к ядерному матриксу ДНК. Это позволило предположить, что кТМЕМ8 является частью функционального домена альфа-глобиновых генов. Данный ген вызывает особый интерес, так как в результате хромосомной перестройки произошла инверсия участка ДНК длинной около 200 т.п.н., в результате которой кТМЕМ8 оказался в непосредственной близости к кластеру альфа-глобиновых генов, чего не наблюдается у других позвоночных. Нами было показано, что у кур этот ген предпочтительно экспрессируется в эритроидных клетках, хотя у человека ТМЕМ8 вообще не экспрессируется в эритробластах. Уровни транскрипции других генов, фланкирующих кластер альфа-глобиновых генов (C.16orß5, MPRL28 nAXINl), и являющихся, по-видимому, генами домашнего хозяйства, были одинаковы в изученных эритроидных и неэритроидных

клетках кур. Анализ уровней экспрессии кТМЕМ8 в различных тканях взрослый курицы подтвердил предпочтительный характер экспрессии этого гена в эритроидных клетках.

Одной из характерных черт доменов альфа-глобиновых генов всех позвоночных является то, что эти домены проявляют предпочтительную чувствительность к ДНКазе I вне зависимости от типа клеточной дифференцировки (Craddock et. al., 1995; Klochkov et. al., 2009). В связи с этим, отдельной задачей становится установление границ таких хроматиновых доменов. Одним из методов определения границ доменов открытого типа является детекция тканеспецифичных сайтов гиперчувствительности к ДНКазе I (DHS) (Razin et. al., 1994). Проведенные ранее эксперименты показывали, что область, содержащая эритроидспецифические DHS, начинается рядом с MRE элементом и заканчивается на расстоянии нескольких т.п.н. после НВА1 гена (de Moura-Gallo et. al., 1992; Razin et. al., 1994). В данной работе были обнаружены несколько эритроидспецифичных DHS, расположенных правее уже установленных (рисунок 7): один в области между CpG островком и геном кТМЕМ и второй сильный DHS в самом гене кТМЕМ8. Таким образом было показано, что границы хроматинового альфа-глобинового домена кур шире, чем ранее предполагали, и что кТМЕМ входит в состав функционального домена альфа-глобиновых генов кур.

Ранее общепринятым считался тот факт, что эритроидспецифичный домен альфа-глобиновых генов содержит только гены, которые кодируют альфа-глобины. Результаты данной работы свидетельствуют о том, что у кур в состав этого домена входит также ген ТМЕМ8, кодирующий трансмембранный белок, функции которого не известны. Альфа-глобиновые гены высоко консервативны в эволюции. Долгое время считалось, что область синтении ограничивается расположенными в определённом порядке альфа-глобиновыми генами (Flint et. al., 2001). Позднее было обнаружено, что ген LUC7L, расположенный за кластером альфа-глобиновых генов (в направлении центромеры у человека), у многих позвоночных принадлежит к области синтении (Tufarelli et. al., 2001; 2004). Кроме того, перед кластером альфа-глобиновых генов была обнаружена мультивидовая консервативная последовательность (MCS), которая, как считается, содержит эритроидспецифичные регуляторные элементы (Hughes et. al, 2005). В геноме курицы ген LUC7L расположен на расстоянии 170 т.п.н. за кластером альфа-глобиновых генов. Вместо гена LUC7L после кластера альфа-глобиновых генов располагается ген ТМЕМ8. Несколько генов-ортологов, находящихся между LUC7L и ТМЕМ8: RGS1I, AXIN1, MRPL28 располагаются в инвертированном порядке у курицы, по сравнению с другими позвоночными. По всей видимости ~ 170 т.п.н. геномный фрагмент, расположенный после кластера альфа-глобиновых генов, претерпел инверсию в геноме курицы относительно генома других

позвоночных. На Рисунке 9 показана схема, иллюстрирующая положение инвертированного

геномного фрагмента в области, фланкирующей домен альфа-глобиновых генов у человека

* Рисунок 9. Схема, иллюстрирующая положение инвертированного геномного фрагмента в области, фланкирующей альфа-глобиновый домен

А. Расположение альфа-глобиновых генов и генов, фланкирующих альфа-глобиновый домен на 16 хромосоме человека. Шкала отражает реальные расстояния на хромосоме в т.п.н.

* Гены показаны чёрными прямоугольниками. Стрелки справа от названия гена показывают направление транскрипции. Гены, располагающиеся в инвертированном порядке по отношению к альфа-глобиновому кластеру на 16 хромосоме человека и 14 хромосоме кур, показаны серым прямоугольником. Названия генов обозначены в соответствии с Ensembl Genome Browser.

, Б. Расположение глобиновых генов и генов, фланкирующих альфа-глобиновый кластер на 14 хромосоме кур. Шкала отражает реальные расстояния на хромосоме. Все обозначения

* соответствуют описанным для секции «А».

и курицы. ТМЕМ8 (М83, ТМЕМ6) - высоко консервативный ген, кодирующий белок с 5 трансмембранными доменами (Motohashi et. al., 2000). Белковый продукт этого гена был охарактеризован только для человека (UniProtKB: Q9HCN3). Было высказано предположение о том, что его биологическая функция состоит в маркировании состояния покоя Т-лимфоцитов, так как при активации лимфоцитов уровень его экспрессии уменьшается (Motohashi et. al., 2000). Хотя уровень транскрипции чТМЕМ8, обнаруженный в образцах цельной крови, относительно высок (GNF Symatlas data; http://symatlas.gnf.org), скорее всего это связано с интенсивной транскрипцией чТМЕМ8 в покоящихся Т-лимфоцитах, присутствующих в цельной крови. РНК чТМЕМ8 не детектируется в циркулирующих ретикулоцитах человека (Goh et. al., 2007) (см. также N1DDK Hembase at http://hembase.niddk.nih.gov). В соответствии с этим в данной работе было показано, что экспрессия чТМЕШ не увеличивается при терминальной эритроидной дифференцировке культивируемых эритроидных клеток человека (линия К562). Однако экспрессия кТМЕМ8 возрастает в процессе терминальной эритроидной дифференцировки клеток линии HD3 кур.

А Человек

HBZ HBZP нвм НВАР1 НВА2 НВА1 HBQ1

Б Курица

* 12750 т.п.н

250 т.п.н

LOC10012947I i ,2800гпн

ITFG3

ARHGDIG PDIA2

AXIN1

350 т.п.н.

MRPL 28 ТМЕМВ

RPL23AP5 »

* 12850 т.п.н

HBZ

НВА2

НВА1

ТМЕМ8

AXIN1

RGS11 LOC416653 LUC7L

LOC416655 CLCN7

Более того, транскрипт кТМЕМ8 обнаруживался в циркулирующих эритроцитах, выделенных из крови взрослых птиц. Уровень мРНК кТМЕМ8 в циркулирующих эритроцитах был сравним с уровнем мРНК р-актина и составлял 0,4% от уровня мРНК НВА1. С другой стороны, кТМЕМ8 не экспрессировался в куриных лимфоцитах. В культуре куриных В-лимфоцитов (линия клеток DT40) уровень мРНК кТМЕМ8 также был очень низок. На основании этих наблюдений, было предположено, что после того, как кТМЕМ8 оказался в непосредственной близости к кластеру альфа-глобиновых генов, сложившийся ансамбль регуляторных элементов был разрушен, кТМЕМ8 попал под контроль регуляторных элементов альфа-глобинового домена и приобрел эритроидспецифичный профиль экспрессии. Гены MPRL28 и AXIN1, расположенные далее за геном кТМЕМ8, не показывают какого-либо значительного увеличения уровня экспрессии в HD3 (по сравнению с DT40 и КЭФ). Перенесение кТМЕМ8 к проксимальному концу домена альфа-глобиновых генов едва ли могло автоматически сделать этот ген эритроидспецифичным. Действительно, у человека в непосредственной близости к 3' концу домена альфа-глобиновых генов располагается ген LUC7, который экспрессируется в различных тканях и предположительно является геном домашнего хозяйства (Vyas et. al., 1995; Tufarelli et. al., 2001). Этот ген располагается на хромосоме 16 человека ближе к кластеру альфа-глобиновых генов (8.7 т.п.н между LUC7L и HBQ1), чем кТМЕМ8 в хромосоме 14 кур (12 т.п.н. между кТМЕМ8 и НВА1) и не является эритроидспецифичным. Таким образом, расположение гена в непосредственной близости к кластеру альфа-глобиновых генов не является круциальным для попадания гена под контроль регуляторных элементов глобиновых генов. Присутствие эритроидспецифичных сайтов гиперчувствительности к ДНКазе I внутри гена кТМЕМ8 и в районе между кТМЕМ8 и кластером альфа-глобиновых генов свидетельствует о том, что в процессе эволюции кТМЕМ8 приобрёл эритроидспецифичные регуляторные элементы, которые оказались критичными для включения кТМЕМ8 в регуляторную сеть домена альфа-глобиновых генов. Одним из таких регуляторных элементов является энхансер, обнаруженный в одном из интронов гена кТМЕМ8. Этот энхансер обладает рядом общих свойств с ранее охарактеризованным эритроидспецифичным энхансером домена альфа-глобиновых генов (Knezetic et. al., 1989) и, по всей видимости, функционально зависит от наличия сайтов связывания транскрипционного фактора GATAI. Внедрение гена кТМЕМ8 в регуляторную сеть альфа-глобинового домена является интересным примером экспансии функциональных геномных доменов. Дальнейшее изучение механизмов регуляции экспрессии кТМЕМ8 позволит глубже понять базовые принципы организации функциональных геномных доменов.

С использованием ЗС анализа было показано, что два ранее идентифицированных регуляторных элемента домена альфа-глобиновых генов кур взаимодействуют с кТМЕМ8 и вышележащим фланкирующим его регионом в терминально дифференцированных эритроидных клетках линии ЬГОЗ - это энхансер домена альфа-глобиновых генов (см. схему на Рисунке 6) и ещё не охарактеризованный регуляторный элемент, колокализующийся с эригроидспецифичным сайтом гиперчувствительности к ДНКазе I (-90Н8). Принимая во внимание стимуляцию экспрессии кТМЕМ8 при терминальной эритроидной дифференцировке клеток линии НОЗ, ожидалось увидеть, что экспрессия этого гена контролируется регуляторными элементами домена альфа-глобиновых генов. Неожиданным было то, что регуляция экспрессии взрослых альфа-глобиновых генов и кТМЕМ8 осуществляется посредством формирования двух различных хроматиновых блоков (Рисунок 10). Для обоих хроматиновых блоков характерно присутствие двух регуляторных элементов:

МНЕ -ЭйНЗ СрО островок енх СрО островок енх -о-д-0-[=1-га-ш-Ь-©-( тУ I-

HBZ НВА2 НВА1 ТМЕМ8

индуцированные HD3 активный хроматиновый блок глобинов

пролиферирующие HD3 "незрелый" хроматиновый блок

индуцированные HD3 активный хроматиновый блок ТМЕМ8

Рисунок 10. Схематическое представление пространственной организации альтернативных хроматиновых блоков. Схема в верхней части рисунка показывает позиции генов и регуляторных элементов: MRE - круг; -9 DHS - треугольник; CpG-островок, расположенный перед кластером альфа-глобиновых генов, - черный многоугольник; ген HBZ- белый прямоугольник; ген НВА2 -серый прямоугольник; ген HBAI - черный прямоугольник; энхансер, расположенный за кластером альфа-глобиновых генов, - белая звезда; CpG-островок, расположенный перед геном кТМЕМ8, -серый многоугольник; ген кТМЕМ8 - длинный белый прямоугольник со звездой внутри; энхансер, расположенный в теле гена кТМЕМ8, - серая звезда. В середине нижней части рисунка показан незрелый блок, собирающийся в пролиферирующих клетках линии HD3. Справа и слева от него — два альтернативных состояния активного хроматинового клока, собирающихся для активации транскрипции альфа-глобиновых генов или гена кТМЕМ8.

-9 DHS и энхансера, остальные участники различаются. Наконец, интересно, что ни -9 DHS, ни энхансер альфа-глобинового домена кур не входят в состав ранее установленных мультивидовых консервативных последовательностей (Hughes et. а!., 2005). Другими словами, эти регуляторные элементы характерны только для кур. Вероятно, особые свойства

регуляторной системы домена альфа-глобиновых генов кур, в частности, существование энхансера, расположенного за кластером альфа-глобиновых генов, обусловили возможность экспансии функционального домена. -9 DHS и энхансер не взаимодействуют с промотором гена HBAI в пролиферирующих клетках линии HD3. Они привлекаются в активный хроматиновый блок домена альфа-глобиновых генов только при индукции HD3 к терминальной эритроидной дифференцировке. В данной работе было показано, что те же самые элементы принимают участие в организации активаторного комплекса кТМЕШ. Таким образом -9 DHS и энхансер курсируют между двумя альтернативными хроматиновыми блоками, как предполагает предложенная ранее «flip-flop» модель (Wijgerde et. al., 1995; Gribnau et. a!., 1998). Эта модель была предложена для объяснения способности LCR бета-глобинового домена одновременно активировать транскрипцию нескольких генов. Хотя «flip-flop» модель никогда не опровергалась, она была практически забыта после открытия активных хроматиновых блоков (Zhou et. al., 2006; Kooren et. al., 2007; de Laat et. al., 2003; Tolhuis et. al., 2002; de Laat et. al., 2008), представляющих собой комплекс из энхансера и нескольких промоторов. Модель активных хроматиновых блоков предлагает более простое объяснение способности энхансера одновременно активировать несколько промоторов. Полученные данные говорят о том, что две модели не являются взаимоисключающими, а модель активных хроматиновых блоков более динамична.

Тот факт, что высокий уровень мРНК кТМЕМ8 наблюдается в циркулирующих эритроцитах и дифференцированных клетках линии HD3 может свидетельствовать о том, что белковый продукт кТМЕМ8 функционально активен. Одно из предположений состоит в том, что он может служить маркером стадии покоя терминально дифференцированных красных клеток крови. Характеристика функциональной роли продукта гена кТМЕМ8 представляется интересной перспективой для исследовательской работы.

ВЫВОДЫ

1. Охарактеризована пространственная организация 220 т.п.н. сегмента хромосомы 14 кур, содержащего кластер альфа-глобиновых генов и фланкирующие его гены домашнего хозяйства.

2. Показано, что не кодирующий глобины ген ТМЕМ8, расположенный в 3' фланкирующей области кластера альфа-глобиновых генов кур, предпочтительно экспрессируется в эритроидных клетках, и экспрессия этого гена стимулируется при терминальной эритроидной дифференцировке культивируемых эритробластов кур.

3. Продемонстрировано, что в интроне 7 гена кТМЕМ8 содержится эритроидспецифичный участок гиперчувствительности к ДНКазе I, колокализующийся с эритроидспецифичным энхансером, в границах которого присутствуют три сайта связывания транскрипционного фактора GATAI.

4. Изучена хромосомная конформация гена кТМЕМ8. Показано, что в эритроидных клетках ген кТМЕМ8 непосредственно взаимодействует с эритроидспецифичным энхансером и регуляторным элементом -9 DHS, но не с главным регуляторным элементом домена альфа-глобиновых генов. Продемонстрировано, что кТМЕМ8 не привлекается в активный хроматиновый блок альфа-глобиновых генов. Для активации экспрессии кТМЕМ8 собирается альтернативный хроматиновый комплекс.

Список печатных работ. опубликованных по теме диссертации

1. Филоненко Е. С.. Гаврилов А. А., Разин С. В., Яровая О. В. (2009) В эритроидных клетках кур протяженный фрагмент хромосомы 14, включающий кластер альфа-глобиновых генов, организован в микропетли. Живые системы 1:105-108.

2. larovaia OV, Borounova VV, Philonenko ES. Kantidze OL, Vassetzky YS, Razin SV. (2009) In embryonic chicken erythrocytes actively transcribed alpha globin genes are not associated with the nuclear matrix. J Cell Biochem. 106(1): 170-8.

3. Philonenko ES. Klochkov DB, Borunova VV, Gavrilov AA, Razin SV, larovaia OV. (2009) TMEM8 - a non-globin gene entrapped in the globin web. Nucleic Acids Research PM1D:

1. Филоненко E.C.. Борунова В.В., Яровая О.В. Пространственная организации домена а-глобиновых генов кур . XVI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "ЛОМОНОСОВ-2008". Москва, Россия, 14-19 апреля 2008, сборник тезисов, секция «Биология», подсекция «молекулярная биология» с. 19.

2. Филоненко Е.С.. Яровая О.В. Пространственная организация локуса 14 хромосомы кур. XVI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "ЛОМОНОСОВ-2009". Москва, Россия, 13-17 апреля 2009, сборник тезисов, с. 195.

Статьи:

19820109.

Тезисы конференций:

Заказ № 135-a/l0/09 Подписано в печать 23.10.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 )j www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Филоненко, Елена Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Структурно-функциональная организация генома.

1. Хроматиновые домены.

2. Функциональные домены.

3. Домены открытого типа.

4. Транскрипционные домены и скелетные структуры ядра.

И. Домен альфа-глобиновых генов кур.

1. Функциональный домен альфа-глобиновых генов.

2. Структура домена альфа-глобиновых генов в контексте ближайшего геномного окружения.

3. Организация и хроматиновая конфигурация домена альфа-глобиновых генов кур.

4. Хроматиновый домен альфа-глобиновых генов кур.

III. Эволюция домена альфа-глобиновых генов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Расширение функционального домена альфа-глобиновых генов кур как следствие хромосомной перестройки"

Изучение механизмов, контролирующих экспрессию генов высших эукариот, является одной из центральных задач молекулярной биологии. Согласно современным представлениям, активация транскрипции тканеспецифичных генов является многоэтапным процессом, начинающимся с изменения конфигурации соответствующего геномного домена и заканчивающимся сборкой пре-инициаторного комплекса комплексов) на промоторе (промоторах). Геномными доменами в течение многих лет называли протяженные участки хромосом, характеризующиеся различной (зависящей от типа клеточной дифференцировки) чувствительностью к ДНКазе I. В качестве типичных моделей изучались домены бета-глобиновых генов позвоночных животных, домен гена лизоцима кур, домен гена аполипопротеина человека. Во всех этих доменах активации расположенных в них тканеспецифичных генов предшествует изменение хроматинового статуса домена (переход из ДНКазо-устойчивой в ДНКазо-чувствительную конформацию, коррелирующий с повышением уровня ацетилирования гистонов). В течение ряда лет господствовало мнение, что весь геном построен из сходно организованных структурнофункциональных блоков, подобных домену бета-глобиновых генов. Расширение спектра изучаемых геномных моделей продемонстрировало, что эта точка зрения является упрощенной. Были открыты так называемые домены «открытого типа», которые содержат перемежающиеся, а иногда и перекрывающиеся, тканеспецифичные гены и гены домашнего хозяйства». Эта группа доменов достаточно широко представлена в геноме, и изучение принципов регуляции работы генов, расположенных в доменах «открытого типа», представляется крайне важным. Типичным примером доменов открытого типа является домен альфа-глобиновых генов. Сравнительный анализ геномов 22 видов позвоночных показал, что этот домен высоко консервативен в эволюции и включает кластер собственно альфа-глобиновых генов, расположенных в определённом порядке, и ген домашнего хозяйства C16orf35, в котором находится главный регуляторный элемент, контролирующий работу альфа-глобиновых генов. Характерной чертой доменов «открытого типа», в том числе и доменов альфа-глобиновых генов, является независимая от транскрипционного статуса тканеспецифичных генов, входящих в состав домена, высокая чувствительность хроматина к нуклеазному гидролизу. Тем не менее, активации экспрессии глобиновых генов в эритроидных клетках также предшествуют определенные регуляторные события, осуществляющиеся на уровне всего домена и заключающиеся в изменении пространственной конформации домена и спектра сайтспецифических модификаций гистонов. Значение этих изменений в настоящее время мало изучено. То же можно сказать о принципах функциональной изоляции различных генов в доменах «открытого» типа. Не изученными являются и механизмы разграничения доменов «открытого типа», которые, как правило, не содержат инсуляторных элементов.

Сравнительный геномный анализ окружения домена альфа-глобиновых генов у различных видов показал, что участок, непосредственно соседствующий с альфа-глобиновыми генами, у кур претерпел хромосомную перестройку. Несколько генов-ортологов, граничащих с кластером альфа-глобиновых генов, расположены в инвертированном порядке у курицы по сравнению с человеком и рядом других позвоночных. В результате этого на одной из границ альфа-глобинового домена произошло нарушение консервативного расположения генов и перераспределение установившихся взаимодействий удалённых регуляторных элементов, при этом у кур ген ТМЕМ8 оказался в непосредственной близости к кластеру альфа-глобиновых генов, тогда как у человека он расположен на расстоянии 170 т.п.н. от него. В настоящей работе показано, что у кур регуляторные элементы гена ТМЕМ8 вовлечены в регуляторную сеть альфа-глобиновых генов, результатом чего является приобретение геном ТМЕМ8 эритроидспецифического характера экспрессии. Таким образом, следствием эволюционной перестройки явилось расширение функциональных границ альфаглобинового домена. Данное наблюдение расширяет наши представления как о принципах работы регуляторных систем доменов «открытого» типа, так и о путях эволюции этих доменов. Именно этим и определяется актуальность темы настоящей работы.

2. Изучить экспрессию, структуру и хроматиновую конформацию гена ТМЕМ8, расположенного в непосредственной близости к кластеру альфа-глобиновых генов кур.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Структурно-функциональная организация генома

Согласно доменной гипотезе, геном состоит из структурно-функциональных единиц, которые устроены и функционируют сходным образом (Goldman, 1988; Razin & Vassetzky, 1991; Razin et al., 1993; Razin, 1996; Geyer et al., 1997; Gerasimova & Corces, 1998; Dillon & Sabbattini, 2000). Функциональной единицей является геномная область, включающая ген или группу связанных генов со всем комплексом цис-регуляторных последовательностей. Структурной же единицей можно считать хроматиновый домен, который можно определить как достаточно протяженный участок генома, в рамках которого могут происходить изменения способа упаковки хроматиновой фибриллы, не распространяющиеся на фланкирующие области (Razin et al., 2003; Разин, 2007). Разделение эукариотического генома на домены отчётливо детектируется на уровне его структурной организации: домены-петли (длиной 50-100 т.п.н.) закрепленны на ядерном матриксе - особой многокомпонентной скелетной структуре, обеспечивающей поддержание хроматиновых петель и компартментализацию различных функциональных процессов внутри ядра (Razin, 1987, 1996, 1997, 1999, 2001; Razin et al., 1995; Razin & Gromova, 1995). Участки закрепления петель на ядерном матриксе, так называемые LAR-элементы (LAR - Loop Attachement), могут обозначать границу геномного домена и содержать инсуляторы, которые ограничивают область действия позитивных регуляторных элементов (функциональная граница) и препятствуют распространению репрессивных хроматиновых структур (структурная граница). Такая точка зрения подкреплялась результатами изучения многочисленных доменов тканеспецифичных генов, для которых характерна полная колокализация доменов, картированных по функциональному и структурному принципам. Согласно доменной гипотезе организации эукариотического генома, оба типа доменов - хроматиновый (определенный по структурному принципу) и геномный (определенный по функциональному принципу) полностью колокализуются. Связь между геномными доменами (как функциональными единицами генома, находящимися под контролем определённых механизмов) и хроматиновыми доменами была чётко продемонстрирована на примере кластера бета-глобиновых генов. Было показано, что делеция 5'-концевой регуляторной области приводит к одновременному прекращению транскрипции и переходу в компактную (устойчивую к ДНКазе I) конфигурацию протяженного хроматинового домена, включающего весь кластер бета-глобиновых генов и фланкирующие последовательности ДНК.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Филоненко, Елена Сергеевна

выводы

2. Показано, что не кодирующий глобины ген кТМЕМ8, расположенный в 3' фланкирующей области кластера альфа-глобиновых генов кур, предпочтительно экспрессируется в эритроидных клетках, и экспрессия этого гена стимулируется при терминальной эритроидной дифференцировке культивируемых эритробластов.

3. Продемонстрировано, что в интроне 7 гена кТМЕМ8 содержится эритроидспецифичный участок гиперчувствительности к ДНКазе 1, колокализующийся с эритроидспецифичным энхансером, в границах которого присутствуют три сайта связывания эритроидспецифичного транскрипционного фактора GATA1.

4. Изучена хромосомная конформация гена кТМЕМ8. Показано, что в эритроидных клетках ген кТМЕМ8 непосредственно взаимодействует с эритроидспецифичным энхансером и регуляторным элементом DHS-9, но не с главным регуляторным элементом домена альфа-глобиновых генов. Продемонстрировано, что К.ТМЕМ8 не привлекается в активный хроматиновый блок альфа-глобиновых генов. Для активации экспрессии кТМЕМ8 собирается альтернативный хроматиновый комплекс.

Заключение

Домен альфа-глобиновых генов является традиционной моделью для изучения механизмов регуляции экспрессии эукариотических генов. На протяжении 25 лет изучения домена наши представления о его структуре и функционировании становились всё более и более сложными. Современные методы молекулярной и клеточной биологии позволили подробно изучить структуру транскрипционных единиц, найти и охарактеризовать группы позитивных и негативных регуляторных элементов. Активно развивающаяся методология ЗС расширила представления о хромосомной конформации домена и о пространственном взаимодействии регуляторных элементов между собой. Сравнительный геномный анализ окружения домена альфа-глобиновых генов у различных видов позвоночных показал, что участок, непосредственно соседствующий с альфа-глобиновыми генами, у кур претерпел хромосомную перестройку. Несколько генов-ортологов, граничащих с кластером альфа-глобиновых генов, расположены в инвертированном порядке у курицы по сравнению с человеком и рядом других позвоночных. Таким образом, у кур ген ТМЕМ8 оказался в непосредственной близости к кластеру альфа-глобиновых генов, тогда как у человека он расположен на расстоянии 170 т.п.н. от него. Результатом этого могло стать перераспределение установившихся взаимодействий удалённых регуляторных элементов. Целью данной работы было подтверждение этого предположения, а также характеристика экспрессии, структуры и хроматиновой конфигурации гена ТМЕМ8.

Домены открытого типа, к которым принадлежит домен альфа-глобиновых генов кур, широко представлены в эукариотическом геноме и, по всей видимости, составляют его основную часть. Изучение структурно-функциональных особенностей этих доменов и понимание механизмов, регулирующих транскрипцию в таких доменах, позволит лучше понять общие принципы организации эукариотического генома.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Работа с культурами клеток

Куриные преэритробласты HD3 (клон А6 линии LSCC) культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 8% фетальной бычьей сыворотки, 2% куриной сыворотки. Куриные лимфоидные клетки линии DT40 (CRL-2111, АТСС) культивировали в той же среде с добавлением 50 мкМ Р-меркаптоэтанола. Клетки линии К562 культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Куриные эмбриональные фибробласты (КЭФ) выделяли из 9-ти дневных эмбрионов согласно стандартному протоколу (Silim et. al., 1982) и культивировали в DMEM, содержащей 8% фетальной бычьей сыворотки, 2% куриной сыворотки. Все среды содержали 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Культивирование<; проводили при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СОг. Индукцию дифференцировки клеток линии HD3 по эритроидному пути проводили по ранее описанной методике5 (Nicolas et al., 1991): клетки в концентрации 1 млн/мл инкубировали в присутствии 10 мМ HEPES (рН 8.0) и 20 мкМ индуктора iso-H-7 (l-(5-Isoquinolinylsulfonyl)-3-methylpiperazinei' dihydrochloride, Fluka) при 42°C в воздушной атмосфере. Для экспериментов использовали клетки после 12 часов дифференцировки. Для индукции терминальной эритроидной дифференцировки клетки линии К562 инкубировали в присутствии 10 мМ бутирата натрия (Sigma) в течение 20 часов (Lozzio et al, 1979).

2. Источники тканей и органов

Желудок, мышцы, селезёнка, мозг, жировая ткань, лёгкие, сердце, печень и кровь были выделены из 5 месячной курицы. Для выделения фракций лимфоцитов периферической крови (ЛПК) и эритроцитов к 2 мл цельной крови, содержащей гепарин, добавляли равный объём физиологического раствора (GE Healthcare) и наслаивали на 4 мл

Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare). После центрифугирования при 4°C в течение 30 мин. на 400g ЛПК оставались в интерфазе, в то время как эритроциты и гранулоциты образовывали осадок на дне центрифужной пробирки. Фракцию ЛПК и осадок, содержащий главным образом эритроциты, собирали и промывали 3 раза физиологическим раствором. Примеси других типов клеток в образцах ЛПК, полученных таким методом, составили: эритроцитов ~ 5%, гранулоцитов ~3% и тромбоцитов менее 1%.

3. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) на препаратах развёрнутого хроматина (ядерного гало)

Для выделения ядер клетки осаждали на 200g 5 мин и пермобилизировали в буфере, содержащем 10 мМ PIPES рН 6,8; 100 мМ NaCl; 300 мМ сахарозы, 3 мМ MgCl2, 0,5% Triton Х-100; ОД мМ c11so4; 1 мМ PMSF 15 мин на льду. Затем полученную суспензию осаждали на силиконовые предметные стёкла. Для получения ядерного гало препараты инкубировали в буфере, содержащем 10 мМ PIPES рН 6,8; 2 М NaCl; 10 мМ EDTA; 0,1% дигитонина; 0,05 мМ спермина, 0,125 мМ спермидина 4 мин, последовательно проводили через 10х, 5х, 2х, lx PBS и затем через 30%, 50%, 70% и 96% растворы этанола, высушивали на воздухе и фиксировали на 70°С 2 часа.

Для приготовления гибридизационных проб ДНК ВАС клона СН261-75С12 (АС 172304, GeneBank) биотинилировали, используя Biotin-Nick Translation Mix (Roche, Penzberg, Germany), согласно прилагаемому протоколу.

Препараты ядерных гало последовательно обрабатывали РНКазой А (100 мкг/мл в 2х SSC) и пепсином (0,01% в 10 mM НС1), постфиксировали 1% формальдегидом и проводили через 70, 80 и 96% этанол. Чтобы денатурировать ДНК, слайды инкубировали в 70% формамиде в 2х SSC 5 мин на 74°С и затем проводили через 70, 80 и 96% этанола и высушивали на воздухе.

Буфер для гибридизации (объём 10 мкл) содержал 60% формамида, 2х SSC, 10% декстран сульфата, 0,1% Tween-20, 10 мкг ДНК спермы лосося, 2 мкг тРНК, 0,1-1 мг геномной ДНК кур и 25-50 нг меченой биотином пробы. Перед гибридизацией буфер инкубировали 10 мин на 74°С, чтобы денатурировать ДНК. Гибридизацию проводили ночь на 37-40°С. После гибридизации образцы промывали дважды в 50% формамиде в 2х SSC на 40-42°С 20 мин.

Для выявления гибридизационных сигналов были использованы антитела мыши против биотина, конъюгированные с AlexaFluor 488 (Molecular Probes - Invitrogen, Eugene, OR, United States), и набор для амплификации сигнала (Molecular Probes - Invitrogen, Eugene, OR, United States). ДНК визуализировали, используя DAPI (0,5 мг/мл) (Vector Laboratories, USA). Препараты анализировали на флуоресцентном микроскопе DMR/HC5 (Leica, Wetzlar, Germany), оснащённом HCX PZ Fluotar 100/1.3 объективом и протоколировались с использованием камеры CCD DC 350 F (Leica, Wetzlar, Germany).

4. Картирование участков прикрепления к ядерному матриксу о

Для приготовления фракции ДНК, прикреплённой к ядерному матриксу, 3x10 клеток линий HD3 и DT40 центрифугировали и промывали 2 раза PBS. Затем клетки инкубировали 10 мин на льду в пермеабилизирующем буфере (10 мМ PIPES, (рН 7,8), 0,5% Triton Х-100, 100 мМ NaCl, 0,3 М сахарозы, 0,2 мМ PMSF и 3 мМ MgCl2). После пермеабилизации клетки отмывали 3 раза буфером для ДНКазы I (50 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 3 мМ MgCb) и обрабатывали ДНКазой I (Sigma, St. Louis, МО, United States) на льду в 200 мкл в том же буфере 10 мин. Количество ДНКазы I подбирали таким образом, чтобы средний размер фрагментов ДНК после обработки составлял 5 т.п.н. Реакцию останавливали добавлением 0,1 М EDTA. Далее добавляли NaCI до конечной концентрации 2 М и инкубировали на льду 20 мин, чтобы экстрагировать отщепившийся хроматин. Полученные таким образом препараты отмывали от отщепившейся ДНК 3 раза буфером для ДНКазы I, растворяли в буфере, содержащем 50 мМ EDTA, 0.5% SDS и 500 мкг/мл протеиназы К. Затем образцы инкубировали ночь на 55°С и выделяли ДНК методом экстракции фенол-хлороформом.

Образцы контрольной геномной ДНК получали параллельно таким же образом, однако не отмывали от отщепившейся ДНК, а осаждали 50% изопропанолом и далее депротеинизировали и выделяли суммарную фракцию ДНК.

В исследуемой области были выбраны короткие тест-фрагменты, находящиеся на расстоянии 5 т.п.н. друг от друга. Для каждого фрагмент были выбраны праймеры и методом полуколичественного ПЦР-анализа оценивалась количество этих фрагментов в препаратах прикреплённой к матриксу ДНК и суммарной геномной ДНК, где все исследуемые фрагменты представлены в одинаковой степени. Последовательности праймеров, использованных для ПЦР-анализа, представлены в Таблице 1. Полученные результаты представляли как отношение содержания исследуемых фрагментов в препаратах геномной ДНК к содержанию этих фрагментов в препаратах прилежащей к ядерному матриксу ДНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Филоненко, Елена Сергеевна, Москва

1. Разин, С.В. (2007) Хроматин и регуляция транскрипции. Мол. Бгюл. 41(3), 387-394.

2. Разин, С.В. и Юдинкова Е.С. (2007) Механизмы, контролирующие активацию домена альфа-глобиновых генов в эритроидных клетках кур. Биохимия 72(5), 581-585.

3. Юдинкова, Е.С. и Разин, С.В. (1999) Участок связывания ДНК с ядерным матриксом (MAR элемент) локализован в кластере сайтов гиперчувствительности к ДНКазе I в 5'-концевой области домена альфа-глобиновых генов кур. Мол. Биол. 34(5), 821-827.

4. Юдинкова, Е.С. и Разин, С.В. (2003) Регуляторные системы геномных доменов с размытыми границами. Генетика 39, 182-186.

5. Abbott, D.; Ivanova, V., Wang, X., Bonner, W., and Ausio, J. (2001) Characterization of the stability and folding of H2A.Z chromatin particles: implications for transcriptional activation. J Biol Chem 276, 41945-41949.

6. Anguita, E., Johnson, C.A., Wood, W.G., Turner, B.M. and Higgs, D.R. (2001) Identification of a conserved erythroid specific domain of histone acetylation across the alpha-globin gene cluster. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12114-12119.

7. Ashe, H., Monks, J., Wijgerde, M., Eraser, P., and Proudfoot, N. (1997) Intergenic transcription and transinduction of the human beta-globin locus. Genes Dev 11, 2494-2509.

8. Barbour, V.M., Tufarelli, C., Sharpe, J.A. et al. (2000) Alphathalassemia resulting from a negative chromosomal position effect. Blood 96, 800-807.

9. Bazett-Jones, D., Mendez, E., Czarnota, G., Ottensmeyer, F. and Allfrey V. (1996) Visualization and analysis of unfolded nucleosomes associated with transcribing chromatin. Nucleic Acids Res 24, 321-329.

10. Bell, A. and Felsenfeld, G. (2000) Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene. Nature 405, 482-485.

11. Bell, A.C., West, A.G. and Felsenfeld, G. (1999) The protein CTCF is required for the enhancer-blocking activity of vertebrate insulators. Cell 98, 387-396.

12. Bell, A.C., West, A.G. and Felsenfeld, G. (2001) Insulators and boundaries: versatile regulatory elements in the eukaryotic genome. Science 291, 447-450.

13. Belozerov, V.E., Majumder, P., Shen, P. and Cai, H.N. (2003) A novel boundary element may facilitate independent gene regulation in the Antennapedia complex of Drosophila. EMBO J. 22,3113-3121.

14. Berezney, R. and Coffey, D.S. (1974) Identification of a nuclear protein matrix. Biochem Biophys Res Commun 60(4), 1410-7.

15. Berezney, R. and Coffey, D.S. (1976) The nuclear protein matrix: isolation, structure, and functions. Adv Enzyme Regul. 14: 63-100.

16. Berezney, R., Mortillaro, M.J., Ma, H., Wei, X. and Samarabandu, J. (1995) The nuclear matrix: a structural milieu for genomic function. Int Rev Cytol 162A, 1-65.

17. Bi, X. and Broach, J.R. (2001) Chromosomal boundaries in S. cerevisiae. Curr. Opin. Genet. Dev. 11, 199-204.

18. Bininda-Emonds, O.R., Cardillo, M., Jones, K.E., MacPhee, R.D., Beck, R.M., Grenyer, R., Price, S.A., Vos, R.A., Gittleman, J.L. and Purvis, A. (2007) The delayed rise of present-day mammals. Nature 446, 507-512.

19. Borunova, V., Iarovaia, O., Vassetzky, Y. and Razin, S. (2005) The upstream area of the chicken alpha-globin gene domain is transcribed in both directions in the same cells. FEBS Lett. 579, 4746-4750.

20. Broders, F., and Scherrer, K. (1987) Transcription of the a-globin gene domain in normal and AEV-transformed chicken erythroblasts: mapping of giant globin-specific RNA including embryonic and adult gene. Mol Gen Genet 209, 210-220.

21. Broders, F., Zahraoui, A., and Scherrer, K. (1990) The chicken a-globin gene domain is transcribed into a 17-kilobase polycistronic RNA. Proc Natl Acad Sci USA 87, 503-507.

22. Brown, J.L., and Ingram, V.M. (1974) Structural studies on chick embryonic hemoglobins. J. Biol. Chem. 249: 3960-3972.

23. Casolari, J.M., Brown, C.R., Komili, S., West, J., Hieronymus, H. and Silver, P.A. (2004) Genome-wide localization of the nuclear transport machinery couples transcriptional status and nuclear organization. Cell 117, 427^39.

24. Chen, S. and Corces, V. (2001) The gypsy insulator of Drosophila affects chromatin structure in a directional manner. Genetics 159, 1649-1658.

25. Chiu, Y.H., Yu, Q., Sandmeier, J.J. and Bi, X. (2003) A targeted histone acetyltransferase can create a sizable region of hyperacetylated chromatin and counteract the propagation of transcriptionally silent chromatin. Genetics 165, 115—125.

26. Ciejek, E.M., Tsai, M.J. and O'Malley, B.W. (1983) Actively transcribed genes are associated with the nuclear matrix. Nature 306, 607-609.

27. Cockerill, P.N. and Garrard, W.T. (1986) Chromosomal loop anchorage of the kappa immunoglobulin gene occurs next to the enhancer in a region containing topoisomerase II sites. Cell 44(2): 273-82.

28. Cook, P.R. and Brazell, I.A. (1978). Spectrofluorometric measurement of the binding of ethidium to superhelical DNA from cell nuclei. Eur JBiochem 84(2), 465-77.

29. Cook, P.R. and Brazell, I.A. (1980) Mapping sequences in loops of nuclear DNA by their progressive detachment from the nuclear cage. Nucleic Acids Res 8(13), 2895-906.

30. Cook, P.R., Lang, J., Hayday, A., Lania, L., Fried, M., Chiswell, D.J. and Wyke, J.A. (1982) Active viral genes in transformed cells lie close to the nuclear cage. EMBOJ. 1(4), 447-52.

31. Cooper, S.J. and Hope, R.M. (1993) Evolution and expression of a beta-like globin gene of the Australian marsupial Sminthopsis crassicaudata. Proc Natl Acad Sci USA 90, 11777 11781.

32. Cooper, S.J., Murphy, R., Dolman, G., Hussey, D. and Hope, R.M. (1996) A molecular and evolutionary study of the beta-globin gene family of the Australian marsupial Sminthopsis crassicaudata. Mol Biol Evol 13, 1012-1022.

33. Crispino, J.D. (2005) GATA1 in normal and malignant hematopoiesis. Semin. Cell Dev. Biol. 16, 137-147.

34. Dillon, N. and Sabbattini, P. (2000) Functional gene expression domains: defining the functional unit of eukaryotic gene regulation. Bioessays 22, 657-665.

35. Dodgson, J.B., and Engel, J.D. (1983) The nucleotide sequence of the adult chicken alpha-globin genes. J. Biol. Chem. 258, 4623-4629.

36. Dodgson, J.B., McCune, K.C., Rusling, D.J., Krust, A. and Engel, J.D. (1981) Adult chicken alpha-globin genes alpha A and alpha D: no anemic shock alpha-globin exists in domestic chickens. Proc Natl Acad Sci USA 78, 5998-6002.

37. Donze, D. and Kamakaka, R.T. (2002) Braking the silence: how heterochromatic gene repression is stopped in its tracks. Bioessays 24, 344—349.

38. Engel, J.D. and Dodgson, J.B. (1978) Analysis of the adult and embryonic chicken globin genes in chromosomal DNA. J Biol Chem. 253, 8239-8246.

39. Engel, J.D. and Dodgson, J.B. (1980) Analysis of the closely linked adult chicken alpha-globin genes in recombinant DNAs. Proc Natl Acad Sci USA 77, 2596-2600.

40. Evans, Т., Reitman, M. and Felsenfeld, G. (1988) An erythrosyte-specific DNA-binding factor recognized sequence common to all chicken globin genes. Proc Natl Acad Sci USA 85, 59765980.

41. Faurholm, В., Millar, R. and Katz, A. (2001) The genes encoding the type II gonadotropin-releasing hormone receptor and the ribonucleoprotein RBM8A in humans overlap in two genomic loci. Genomics 78, 15-18.

42. Ferrari, S., Carmine-Simmen, K., Dusserre, Y., Muller, K., Fourel, G., Gilson, E. and Mermod, N. (2004) Chromatin domain boundaries delimited by a histone-binding protein in yeast. J. Biol. Chem. 279, 55520-55530.

43. Filippova, G., Thienes, C., Penn, В., Cho, D., Hu, Y., Moore, J., Klesert, Т., Lobanenkov, V. arid Tapscott, S. (2001) CTCF-binding sites flank CTG/CAG repeats and form a methylation-sensitive insulator at the DM1 locus. Nat Genet 28, 335-343.

44. Flint, J., Tufarelli, C., Peden, J., Clark, K., Daniels, R., Hardison, R., Miller, W., Philipsen, S., Tan-Un K., McMorrow, Т., Frampton, J., Alter, В., Frischauf, A. and Higgs, D. (2001)

45. Comparative genome analysis delimits a chromosomal domain and identifies key regulatory elements in the alpha globin cluster. Hum Mol Genet 10, 371-382.

46. Forrester W., Thompson C., Elder J. and Groudine M. (1986) A developmental^ stable chromatin structure in the p-globin gene cluster. Proc Natl Acad Sci USA 83, 1359-1363.

47. Forsberg, E. and Bresnick, E. (2001) Histone acetylation beyond promoters: long-range acetylation patterns in the chromatin world. Bioessays 23, 820-30.

48. Fried, M. and Crothers, D.M. (1981). Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nulceic Acids Res. 9, 6505-6524.

49. Fuchs, C., Burmester, T. and Hankeln, T. (2006) The amphibian globin gene repertoire as revealed by the Xenopus genome. Cytogenet Genome Res. 112, 296-306.

50. Gavrilov, A.A. and Razin, S.V. (2008) Spatial configuration of the chicken {alpha}-globin gene domain: immature and active chromatin hubs. Nucleic Acids Res. 36, 4629-4640.

51. Gerasimova, T.I. and Corces, V.G. (1998) Polycomb and trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator. Cell 92(4), 511-21.

52. Geyer, P. (1997) The role of insulator elements in defining domains of gene expression. Curr Opin genet Dev 7, 242-248.

53. Geyer, P. and Corces, V. (1992) DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev 6, 1865-1873.

54. Goh, S.H., Josleyn, ML, Lee, Y.T., Danner, R.L., Gherman, R.B., Cam, M.C.,and Miller, J.L. (2007). The human reticulocyte transcriptome. Physiol. Genomics, 30, 172-178.

55. Goh, S.H., Lee, Y.T., Bhanu, N.V., Cam, M.C., Desper, R., Martin, B.M., Moharram, R., Gherman, R.B. and Miller, J.L. (2005) A newly discovered human alphaglobin gene. Blood 106, 1466-1472.

56. Goldman, M. (1988) The chromatin domain as a unit of gene regulation. BioEssays 9, 50-55.

57. Gourdon, G., Sharp, J., Higgs, D. and Wood, W. (1995) The mouse alpha-globin locus regulatory element. Blood 86, 766-775.

58. Grewal, S.I. and Moazed, D. (2003) Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science 301, 798-802.

59. Gribnau, G., Diderich, K., Pruzina, S., Calzolari, R. and Frazer, P. (2000) Intergenic transcription and developmental remodelling of chromatin subdomains in the human p-globin locus. Mol Cell Biol 5, 377-386.

60. Gribnau, J., de Boer, E., Trimborn, Т., Wijgerde, M., Milot, E., Grosveld, F. and Fraser, P. (1998) Chromatin interaction mechanism of transcriptional control in vivo. EMBOJ. 17: 60206027.

61. Grosveld, F., Dillon, N. and Higgs, D. (1993) The regulation of human globin gene expression. Baillieres Clin Haematol. 6(1), 31-55.

62. Grosveld, F., van Assendelft, G.B., Greaves, D.R. and Kollias, G. (1987) Position-independent, high-level expression of the human beta-globin gene in transgenic mice. Cell 51(6), 975-85.

63. Grunstein, M. (1997) Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature 389, 349-352.

64. Hagege, H., Klous, P., Braem, C., Splinter, E., Dekker, J., Cathala, G., de Laat, W. and Forne, T. (2007) Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nat. Protoc. 2, 1722-1733.

65. Hardison, R. (1998) Hemoglobins from bacteria to man: evolution of different patterns of gene expression. J Exp Biol. 201(Pt 8), 1099-117.

66. Hardison, R.C. (2001) New views of evolution and regulation of vertebrate beta-like globin gene clusters from an orphaned gene in marsupials. Pro с Natl Acad Sci U SA 98(4), 1327-9.

67. Hardison, R.C., Sawada, I., Cheng, J.F., Shen, C.K. and Schmid, C.W. (1986) A previously undetected pseudogene in the human alpha globin gene cluster. Nucleic Acids Res. 14, 19031911.

68. Harendza, S., Pollock, A., Mertens, P. and Lovett, H. (1995) Tissue-specific enhancer-promoter interactions regulate high level constitutive expression of matrix metalloproteinase 2 by glomerular mesangial cells. J Biol Chem 270, 18786-18796.

69. Hendzel, M.J., Delcuve, G.P. and Davie, J.R. (1991) Histone deacetylase is a component of the internal nuclear matrix. J Biol Chem 266(32), 21936-42.

70. Hendzel, M.J., Sun, J.M., Chen, H.Y., Rattner, J.B. and Davie, J.R. (1994) Histone acetyltransferase is associated with the nuclear matrix. J Biol Chem 269(36), 22894-901.

71. Ho, Y., Elefant, F., Cooke, N., and Liebhaber, S. (2002) A defined locus control region determinant links chromatin domain acetylation with long-range gene activation. Mol. Cell 9, 291-302.

72. Ho, Y., Liebhaber, S.A., and Cooke, N.E. (2004) Activation of the human GH gene cluster: roles for targeted chromatin modification. Trends Endocrinol. Metab 15, 40-45.

73. Hoffmann, F.G. and Storz, J.F. (2007) The alphaD-globin gene originated via duplication of an embryonic alpha-like globin gene in the ancestor of tetrapod vertebrates. Mol Biol Evol. 24, 1982-1990.

74. Holland, R.A. and Gooley, A.A. 2nd. (1997) Characterization of the embryonic globin chains of the marsupial Tammar wallaby, Macropus eugenii. Eur J Biochem. 248, 864-871.

75. Holmgren, C., Kanduri, C., Dell, G., Ward, A., Mukhopadhya, R., Kanduri, M., Lobanenkov, V. and Ohlsson, R. (2001) CpG methylation regulates the Igf2/H19 insulator. Curr Biol 11, 1128-1130.

76. Igarashi, K., Kataoka, K., Itoh, K., Hayashi, N., Nishizawa, M. and Yamamoto, M. (1994) Regulation of transcription by dimerization of erythroid factor NF-E2 p45 with small Maf proteins. Nature 367, 568-572.

77. Igarashi, K., Kataoka, K., Itoh, K., Motobashi, H., Hayashi, N., Matuzaki, Y., Nakauchi, H., Nishizawa, M. and Yamamoto, M. (1995) Activity and expression of murine small maf family protein mafiC. J Biol Chem 270, 7615-7624.

78. Imaizumi, M.T., Diggelmann, H., Scherrer, K. (1973) Demonstration of Globin Messenger Sequences in Giant Nuclear Precursors of Messenger RNA of Avian Erythroblasts. Proc Natl Acad Sci USA 70, 1122-1126.

79. Imhof, A. (2003) Histone modifications: an assembly line for active chromatin? Curr Biol 13, 22-24.

80. Ishii, K., Arib, G., Lin, C., Van Houwe, G. and Laemmli, U.K. (2002) Chromatin boundaries in budding yeast: the nuclear pore connection. Cell 109, 551-562.

81. Jackson, D.A., Bartlett, J., and Cook, P.R. (1996) Sequences attaching loops of nuclear and mitochondrial DNA to underlying structures in human cells: the role of transcription units. Nucleic Acids Res. 24,1212-1219.

82. Jackson, D.A., McCready, S.J., Cook and P.R. Replication and transcription depend on attachment of DNA to the nuclear cage. J Cell Sci Suppl. (1984) 1, 59-79.

83. Jantzen, K., Fritton. H. and Igo-Klemenes, T. (1986) The DNase I sensitive domain of the chicken lysozyme gene spans 24kb. Nucl Acids Res 14, 6085-99.

84. Jarman, A., Wood, W., Sharpe, J., Gourdon, G., Ayyub, H. and Higgs, D. (1991) Characterization of the major regulatory element upstream of the human alpha-globin gene cluster. Mol Cell Biol 11, 4679-4689.

85. Jeffreys, A.J., Wilson, V., Wood, D., Simons, J.P., Kay, R.M. and Williams, J.G. (1980) Linkage of adult alpha- and beta-globin genes in X. laevis and gene duplication by tetraploidization. Cell 21, 555-564.

86. Jost, J.P. and Seldran, M. (1984) Association of transcriptionally active vitellogenin II gene with the nuclear matrix of chicken liver. EMBOJ. 3(9), 2005-8.

87. Kay, R.M., Harris, R., Patient, R.K. and Williams, J.G. (1980) Molecular cloning of cDNA sequences coding for the major alpha- and betaglobin polypeptides of adult Xenopus laevis. Nucleic Acids Res 8, 2691-2707.

88. Keplinger, В., Guo, X., Quine, J., Feng, Y., and Cavener, D. (2001) Complex organization of promoter and enhancer elements regulate the tissue-and developmental stage-specific expression of the Drosophila melanogaster Gld gene. Genetics 157, 699-716.

89. Kielman, M., Smits, R., Bernini, L. (1994) Localisation and characterization of the mouse a -globin gene locus control region. Genomics 21, 431-433.

90. Kielman, M., Smits, R., Devi, Т., Fodde, R. and Bernini, L. (1993) Homology of a 130-kb region enclosing the a -globin gene cluster, the a-locus controling region, the two non-globin genes in human and mouse. Mammalian Genome 4, 314-323.

91. Klochkov, D.B., Gavrilov, A.A., Vassetzky, Y.S. and Razin,S.V. (2009) Early replication timing of the chicken alpha-globin gene domain correlates with its open chromatin state in cells of different lineages. Genomics 93, 481—486.

92. Knezetic, J. and Felsenfeld, G. (1989) Identification and characterization of a chicken a-globin enhancer. Mol. Cell Biol. 9, 5 893-901.

93. Knezetic, J. and Felsenfeld, G. (1993) Mechanism of developmental regulation of a", the chicken embryonic a-globin gene. Mol Cell Biol 13, 4632-4639.

94. Koop, B.F. and Goodman, M. (1988) Evolutionary and developmental aspects of two hemoglobin beta-chain genes (epsilon M and beta M) of opossum. Proc Natl Acad Sci USA 85(11), 3893-3897.

95. Kooren, J., Palstra, R.J., Klous, P., Splinter, E., von Lindern, M., Grosveld, F. and de Laat, W. (2007) Beta-globin active chromatin Hub formation in differentiating erythroid cells and in p45 NF-E2 knock-out mice. J. Biol. Chem. 282, 16544-16552.

96. Krajewski, W. and Becker, P. (1998) Reconstitution of hyperacetylated, DNase I-sensitive chromatin characterized by high conformational flexibility of nucleosomal DNA. Proc Natl Acad Sci USA 95, 1540-1545.

97. Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. (2002) Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the Enhancer of Zeste protein. Genes Dev. 16, 2893-2905.

98. Lauer, J., Shen, C.K. and Maniatis, T. (1980) The chromosomal arrangement of human alphalike globin genes: sequence homology and alpha-globin gene deletions. Cell, 20, 119-130.

99. Lee, M.H., Shroff, R., Cooper, S.J.and Hope, R. (1999)Evolution and molecular characterization of a beta-globin gene from the Australian Echidna Tachyglossus aculeatus (.Monotremata). Mol Phylogenet Evol. 12, 205-214.

100. Levy-Wilson, В., Kuehl, L. and Dixon, G. (1980) The release of high mobility group protein H6 and protamin gene sequences upon selective DNase I degradation of trout testis chromatin. Nucleic Acids Res 8, 2859-69.

101. Lewis, W., Lee, J.D., and Dodgson, J.B. (1991) Adult chicken alpha-globin gene expression in transfected QT6 quail cells: evidence for a negative regulatory element in the alpha D globin region. Nucleic Acids Res. 19, 5321-5329.

102. Li, X., and Noll, M. (1994) Compatibility between enhancers and promoters determines the transcriptional specificity of gooseberry and gooseberry neuro in the Drosophila embryo. EMBOJ13, 400-406.

103. Litt, M.D., Simpson, M., Gaszner, M., Allis, C.D. and Felsenfeld, G. (2001) Correlation between histone lysine methylation and developmental changes at the chicken beta-globin locus. Science 293, 2453-2455.

104. Lozzio, C.B., Lozzio, B.B., Machado, E.A., Fuhr, J.E., Lair, S.V. and Bamberger, E.G. (1979) Effects of sodium butyrate on human chronic myelogenous leukaemia cell line K562. Nature, 281, 709-710.

105. Maniatis, Т., Fritsch, E. and Sambrook, J. (1982) Molecular cloning : A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

106. McCready, S.J., Akrigg, A., and Cook, P.R. (1979) Electron-microscopy of intact nuclear DNA from human cells. J Cell Sci 39, 53-62.

107. Merli, C., Bergstrom, D., Cygan, J. and Blackman, R. (1996) Promoter specificity mediates the independent regulation of neighbouring genes. Genes Dev 10, 1260-1270.

108. Mirkovitch, J., Mirault, M.E., and Laemmli, U.K. (1984) Organization of the higher-order chromatin loop: specific DNA attachment sites on nuclear scaffold. Cell 39(1), 223-32.

109. Mito, Y., Henikoff, J. and Henikoff, S. (2005) Genome-scale profiling of histone H3.3 replacement patterns. Nat Genet 37, 1090-1097.

110. Moss, В. and Tompson, E. (1969) Adult fowl haemoglobin and its acetylation. Biochem BiophisActa 188, 348-350.

111. Motohashi, H., Shavit, A., Igarashi, K., Yamamoto, M. and Engel, D. (1997) The world according to Maf. Nucl Acids Res 25, 2953-2959.

112. Muller, M., Gerster, T. and Schaffner. W. (1988) Enhancer sequences and the regulation of gene transcription. Eur J Biochem 176, 485-495.

113. Noma, K., Allis, C.D. and Grewal, S.I. (2001) Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science 293, 1150—1155.

114. Oki, M., Valenzuela, L., Chiba, Т., Ito, T. and Kamakaka, R.T. (2004) Barrier proteins remodel and modify chromatin to restrict silenced domains. Mo I. Cell. Biol. 24, 1956-1967.

115. Orkin, S.H. (1978) The duplicated human alpha globin genes lie close together in cellular DNA. Proc Natl Acad Sci USA 75, 5950-5954.

116. Palstra, R.J., Tolhuis, В., Splinter, E., Nijmeijer, R., Grosveld, F., and de Laat, W. (2003) The beta-globin nuclear compartment in development and erythroid differentiation. Nat. Genet. 35: 190-194.

117. Pasini, D., Bracken, A.P., Jensen, M.R., Lazzerini Denchi, E., Helin, K. (2004) Suzl2 is essential for mouse development and for EZH2 histone methyltransferase activity. Embo J. 23, 4061-4071.

118. Pisano, E., Cocca, E., Mazzei, F., Ghigliotti, L., di Prisco, G., Detrich, H.W. and Ozouf-Costaz, C. (2003) Mapping of alpha- and beta-globin genes on Antarctic fish chromosomes by fluorescence in situ hybridization. Chromosome Res 11, 633-640.

119. Plant, K., Routledge, S., Proudfoot, N. (2001) Intergenic transcription in the human beta-globin cluster. Mol Cell Biol 21, 6507-6514.

120. Proudfoot, N.J. and Maniatis, T. (1980)The structure of a human alphaglobin pseudogene and its relationship to alpha-globin gene duplication. Cell 21, 537-544.

121. Raisner, R. and Madhani, H. (2006) Patterning chromatin: form and function for H2A.Z variant nucleosomes. Curr Opin Genet Dev 16, 119-124.

122. Razin, S. (1987) DNA interaction with the nuclear matrix and spatial organization of replication and transcription. BioEssays 6, 19-23.

123. Razin, S. (1996) Functional architecture of chromosomal DNA domain. Crit Rev Enkaryot Gene Expr 6, 247-269.

124. Razin, S. (1997) The nuclear matrix and spatial organization of chromosomal DNA domains. "Landes Biosciences".

125. Razin, S., De Moura Gallo, C. and Scherrer, K. (1994) Characterization of the chromatin structure in the upstream area of the chicken a-globin gene domain. Mol Gen Genet, 242, 649652.

126. Razin, S., Farrell, C. and Recillas-Targa, F. (2003) Genomic domains and regulatory elements operating at the domain level. Int. Rev. Cytol 226, 63-125.

127. Razin, S., Hancock, R., larovaia O., Westergaard, O., Gromova, I. and Georgiev, G. (1993) Structural-functional organization of chromosomal DNA domain. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 58, 25-35.

128. Razin, S., Rynditch, A., Borunova, V., Ioudinkova, E., Smalko, V. and Scherrer, K. (2004) The 33 kb transcript of the chicken alpha-globin gene domain is part of the nuclear matrix. J Cell Biochem 92, 445-57.

129. Razin, S., Vassetsky, J., Kvartskhava, A., Grinenko, N. and Georgiev, G. (1991) Transcriptional enhancer in the vicinity of replication origin within 5' region of the chicken alpha-globin gene domain. J Mol Biol 217, 595-598.

130. Razin, S.V. (1999) Chromosomal DNA loops may constitute basic units of the eukaryotic genome organization and evolution. Crit Rev Eukaryotic Gene Expression 9, 279-283.

131. Razin, S.V. (2001) The nuclear matrix and chromosomal DNA loops: is their any correlation between partitioning of the genome into loops and functional domains? Cell Mol Biol Lett. 6(1), 59-69.

132. Razin, S.V. and Gromova, I.I. (1995) The channels model of nuclear matrix structure. Bioessays 17(5). 443-50.

133. Razin, S.V. and Yarovaya, O.V. (1985) Initiated complexes of RNA polymerase II are concentrated in the nuclear skeleton associated DNA. Exp Cell Res. 158(1), 273-5.

134. Razin, S.V., Farrell, C.M. and Recillas-Targa F. (2003) Genomic domains and regulatory elements operating at the domain level. Int. Rev. Cytol. 226, 63-125.

135. Razin, S.V., Gromova, I.I. and Iarovaia, O.V. (1995) Specificity and functional significance of DNA interaction with the nuclear matrix: new approaches to clarify the old questions. Int Rev Cytol. 162B, 405-48.

136. Razin, S.V., Kekelidze, M.G., Lukanidin, E.M. Scherrer, К and Georgiev G.P. (1986) Replication origins are attached to the nuclear skeleton. Nucleic Acids Res. 14(20), 8189-8207.

137. Recillas-Targa, F. (2000) The chicken a- and p- globin gene domains and their chromatin organization. Cell Mol Biol Lett 5,451-467.

138. Recillas-Targa, F. and Razin, S.V. (2001) Chromatin domains and regulation of gene expression: familiar and enigmatic clusters of chicken globin genes. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression 11, 227-242.

139. Recillas-Targa, F., De Moura Gallo, С. V., Huesca, M., Scherrer, K., and Marcaud, L. (1993) Silencer and enhancer elements located at the З'-side of the chicken and duck a-globin-encoding gene domain. Gene 129, 229-ТЫ.

140. Recillas-Targa, F., Valadez-Graham, V. and Farrell, C.M. (2004) Prospects and implications of using chromatin insulators in gene therapy and transgenesis. Bioessays 26, 796-807.

141. Rincon-Arano, H., Valadez-Graham, V., Guerrero, G., Escamilla-Del-Arenal, M. and Recillas-Targa, F. (2005) YY1 and GATA-1 interaction modulate the chicken З'-side alpha-globin enhancer activity. J Mol Biol. 24;349(5), 961-75.

142. Robinson, S.I., Nelkin, B.D. and Vogelstein, B. (1982) The ovalbumin gene is associated with the nuclear matrix of chicken oviduct cells. Cell. 28(1), 99-106.

143. Saitoh, N., Bell, A.C., Recillas-Targa, F„ West, A.G., Simpson, M., Pikaart, M. and Felsenfeld, G. (2000) Structural and functional conservation at the boundaries of the chicken beta-globin domain. EMBOJ. 19(10), 2315-22.

144. Sharpe, J., Chan-Thomas, P., Lida, J., Ayyub, H., Wood ,W. and Higgs, D. (1992) Analysis of the human alpha globin upstream regulatory element (HS-40) in transgenic mice. EMBO J 11, 4565-4572.

145. Shewchuk, B. and Hardison. R. (1997) CpG islands from the alpha-globin gene cluster increase gene expression in an integration-dependent manner. Mol Cell Biol 17, 5856-5866.

146. Silim, A., El Azhary, M.A. and Roy, R.S. (1982) A simple technique for preparation of chicken-embryo-skin cell cultures. Avian Dis. 26, 182-185.

147. Sjakste, N., Iarovaia, O., Razin, S., Sjakste, Т., Le Gac, V., Zhao, Z. and Scherrer, K. (2000) A novel gene is transcribed in the chicken a-globin gene domain in the direction opposite to the globin genes. Mol Gen Genet 262, 1012-1021.

148. Small, D., Nelkin, В., and Vogelstein, B. (1985) The association of transcribed genes with the nuclear matrix of Drosophila cells during heat shock. Nucleic Acids Res 13(7), 2413-31

149. Sparmann, A. and van Lohuizen, M. (2006) Polycomb silencers control cell fate, development and cancer. Nat Rev Cancer 6, 846-856.

150. Stalder, J., Larsen, A., Engel, J.D., Dolan, M., Groudine, M. and Weintraub, H. (1980) Tissue-specific DNA cleavages in the globin chromatin domain introduced by DNAase I. Cell 20, 451460.

151. Tata, G., Baker, B. and Deeley, J. (1980) Vitellogenin as a multigene family. Not all Xenopus vitellogenin genes may be in an "expressible" configuration. J Biol Chem 255, 6721-27.

152. Tolhuis, В., Palstra, R.J., Splinter, E., Grosveld, F. and de Laat,W. (2002) Looping and interaction between hypersensitive sites in the active beta-globin locus. Mol. Cell, 10, 1453— 1465.

153. Travers, A. (1999) Chromatin modification by DNA tracking. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 13634-13637.

154. Tuan, D., Solomon, W., Li, Q. and London, T. (1985) The "p-like-globin" gene domain in human erythroid cells. Proc Natl Acad Sci USA 82, 6384-6388.

155. Tufarelli, C., Frischauf, A.M., Hardison, R., Flint, J. and Higgs, D.R. (2001) Characterization of a widely expressed gene (LUC7-LIKE; LUC7L) defining the centromeric boundary of the human alpha- 60 globin domain. Genomics 71, 307-314.

156. Verbovaia, L. and Razin, S. (1995) Analisis of the replication direction through the domain of alpha-globin encoding genes. Gene 166, 255-259.

157. Verheijen, R, Kuijpers, H, Vooijs, P, van Venrooij, W and Ramaekers, F. (1986) Protein composition of nuclear matrix preparations from HeLa cells: an immunochemical approach. J Cell Sci. 80, 103-22.

158. Verheijen, R., van Venrooij, W. and Ramaekers, F. (1988) The nuclear matrix: structure and composition. J Cell Sci. 90 ( Pt 1), 11-36.

159. Vernimmen, D., De Gobbi, M., Sloane-Stanley, J.A., Wood, W.G., and Higgs, D.R. (2007) Long-range chromosomal interactions regulate the timing of the transition between poised and active gene expression. EMBO J. 26, 2041—2051.

160. Vire', E., Brenner, С., Deplus, R., et al. (2006) The Polycomb group protein EZH2 directly controls DNA methylation. Nature 439, 871-874.

161. Vyas, P., Vickers, M., Picketts, D. and Higgs, D. (1995) Conservation of position and sequence of a novel, widely expressed gene containing the major human alpha-globin regulatory element. Genomics 29, 679-689.

162. Wasylyk, B. (1988) Enhancers and transcription factors in the control of gene expression. Biochim Biophys Acta 951, 17-35.

163. Wei, X., Somanathan. S., Samarabandu, J., and Berezney, R. (1999) Three-dimensional visualization of transcription sites and their association with splicing factor-rich nuclear speckles./. Cell Biol. 146, 543-558.

164. Weintraub, H. and Groudine, M. (1976) Chromosomal subunits in active genes have an altered conformation. Science 193(4256), 848-56.

165. Weintraub, H., Larscn, A., and Groudine, M. (1981) Alpha-Globin-gene switching during the development of chicken embryos: expression and chromosome structure. Cell 24, 333-344.

166. West, A.G., Huang, S., Gaszner, M., Litt, M.D. and Felsenfeld, G. (2004) Recruitment of histone modifications by USF proteins at a vertebrate barrier element. Mol Cell. 16(3), 453-63.

167. Wheeler, D., Hope, R„ Cooper, S.B., Dolman, G., Webb, G.C., Bottema, C.D., Gooley, A.A., Goodman, M. and Holland, R.A. (2001) An orphaned mammalian beta-globin gene of ancient evolutionary origin. Pro с Natl Acad Sci USA. 98, 1101-1106.

168. Wong, G., Passey, D. and Yu, J. (2001) Most of the human genome is transcribed. Genome Res 11, 1975-1977.

169. Wu, С. anil Gilbert, W. (1981) Tissue specific exposure of chromatin structure of the 5'terminus of the rat preproinsulin II gene. Proc Natl Acad Sci USA 78, 1577-1580.

170. Wu, C., Bingham, P.M., Livak, K.J., Holmgren, R. and Elgin,S.C. (1979) The chromatin structure of specific genes: I. Evidence for higher order domains of defined DNA sequence. Cell 16, 797-806.

171. Yagi, M., Gelinas, R., Elder, J.T. et al. (1986) Chromatin structure and developmental expression of the human alpha-globin cluster. Mol Cell Biol. 6, 1108-1116.

172. Yusufzai, T. and Felsenfeld, G. (2004) The 5' HS4 chicken beta - globin insulator is a CTCF — dependent nuclear matrix-accociated element. Proc Natl Acad Sci USA 101, 8620-8624.

173. Zeng, L. and Zhou, M. (2002) Bromodomain: an acetyl-lysine binding domain. FEBS Lett 513, 124-128.

174. Zhang, Y. and Rcinberg, D. (2001) Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalcnt modifications of the core histone tails. Genes Dev 15, 2343-2360.

175. Отдельно хочется поблагодарить дирекцию и администрацию Института биологии гена РАН за обсснечстшс олагоприятных условий для научных исследований.

Информация о работе

Филоненко, Елена Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Расширение функционального домена альфа-глобиновых генов кур как следствие хромосомной перестройки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы