Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ S-ФРАГМЕНТА ДОМЕНА АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ У ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ИСПОЛЬЗОВАНИЕ S-ФРАГМЕНТА ДОМЕНА АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ У ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ"



На правах рукописи

Кааулнн Сергей Генншневнч

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ^-ФРАГМЕНТА ДОМЕНА АЛЬФА-ГЛОБИ-НОЗЫХ ГЕНОВ КУР ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ У ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

03.00.04 - Биохимия

03.00.23 - Биотехнология 9

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени канаиаата биологических наук

п. Дуброшпш .Моек оь с л ой области 1996

Работа выполнена во Всероссийской научно-исследоватеяьскс институте животноводства РАСХН.

Научные руководители: академик расхн

Л. £. ЭРНСТ ;

кандидат «едицинских наук И.'Л. Гольднан

Официальные оппонент«: доктор биологически наук.

профессор Н. И. Еловое, доктор биологически! вале, профессор Л И дьяконов

ведушее учреждение - ВНИИ Физиологии, биохимии и витания сельскохозяйственных животных

Зашита состоится 1996 г. в часов на

заседании Диссерташюнного совета Д ого. 16.02 при всероссийском научно-исследовательскок институте животноводства по адресу: 14201г. дубровиаы. подольский район, Носковская область,

С диссертапией «окно ознэ » >ся в библиотеке ВНИИ животно-

водства.

Автореферат ; оса

1996

Ученый-секретаь Дксс&ртаттсняого совета, доктор биологических наук

- i -

ОЯКЯ ХАРАКТЕРИСТИКА работ»

Актуальность та:? исследовали. В настойке время. на основа технологии рекомбинаятных ДНК. получили развитее методы. позволяйте целенаправленно изменять генотип сельскохозяйственных животных путем введения в их геном чужеродных генов, которые приводят к появление у животных новых, передающихся по наследству биологических признаков tHarner et ai.. 1985: Brem et al., 1965; Pursel et al., 1990; Rexrc-ai, 1992:.

Вместе с тен. работа по полтченж» трансгенных животных весь-иг трудоемка (Эрнст и др., 1995]. Более того, не во всех случаях интеграция чужеродных генов сопровождается их экспрессией [breie and Huiler. 1994». Отсутствие экспрессии чухерепных генов у трансгенных животных связывают с эффектом положения трансгена. место интеграции которого в геноме случайно и заранее ь^рекска-згемо [ClarK et al.. 1994). Всходя из функциональней организации генома предполагается, что при интеградии рекомбинантная ЯНУ может попасть либо е транскрипциокно-активный, либо в тракскрквпк-о::но неактивный хроматин. Экспрессия чужеродного гена возможна лишь в случае расположения его в составе транскриппионно активво-гс донека. При е-денке вероятности этого события следует учитывать. что более 90 г. генома высших зукариот составляет "нолча^ая* J3HS tïeeves, 1964].

Одним из возможных пгтей преодоления позипиенкего з<иекта яьляется создание генных конструкеий. Функиисннруших независимо ст окружазииз последовательностей хозяйской ДНК. предполагают, что решение данной проблемы следует искать на уровне структурно -функциональной организации генома высааи эукарист. эдекттйн-но-яикроскоигееские наблюдения показали, что большие >частки хро-мсссн. особенно районы зухро^аткна. ссг-:-Ржат области, образташе

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧЧЛЯ БИЗ/'МОТЕКА Моск. со. i,.. ■' i . . ' им. ... . . ,

- г -

петельные дскекы [Gasser et at., 1939; кагш and VassetzKY, 1992J. Нолекудярно-генетический анализ протяженных генонныл районов выявил соответствие мекду петекькжи доменами хронатиаа и ре-ггдяторньш единицами генной активности [Razir. and. VassetzKY, 19921. Установлено, что границы зтта аетель закреплены на скелетной структур? ядра - ядерном натриксе, причем специфичное взаимодействие дне с элементами ядерного скелета обеспечивается определенными нукдеотиднынн последовательностями, получившими название КАй (liat.ru auachma&t region! элементов tPhi-Van et at.. 19901. Показано также, что регуляторнке последовательности, находящиеся на граниздз структурных е sheik, опрегелжт транскркпзионнна статус зелого домена и делают его структурно и функционально независимым от oKpyxajasix участков днк [Kellua and ShedL 1991].

Использование для получений трансгенных животных геаниз конструкций, содержащих наряду со структурными генами, 20г?анич-иые участки геномных доменов, мохет способствовать образованию функционально актизного мини-домена, вне зависимости от интеграции трансгена в состав г/- или гетеро хроматина. поиску тэкке последовательностей в настоящее зрекя уделяется большое внимание. Имеются сообщения, указывающие на то, что вограничнке участки кластера 5?та-глобиновшс генов человека iGrosvtld et ai., 1957} и локуса лъзонимного гена кур (Phi-van et ah, 1990) обеспечивают позипножо-независимый эНект экспрессии, присоединенные к ним структурах генов.

¡1р?диологастся tsaim et ai.. 19933. ".то одним из возможных участи /ikS, еаесобспающи* позиииокно-независимой экспрессии трансгеаос. нолег являться регудяторный район длиной 1737 п.о., аатЕодяшйся на гранкзе 5' -оь/асти домена альфа-глобиновых генов кур 1г.гь-»рагмгнт> (Заявка Ша и ибг ран я 9300&57блз (005503) от оз. о^, 93 на изобретение "фрагмент донена альФа-глсбиноекг ге-ноб кур"] (рис. 1), у которого обнаружена участки прикрепления к

,1 Ь I 1 п , . 5

УЧАСТОК НДЧйЛД РЕПЛИКАЦИИ

--ШШЕ—

ЙТ-ЬОГЯТЫЕ гшсп.

МАВ- ЭЛЕМЕНТЫ

энхймсерй

К

ГЕНЫ И УЧАСТКИ

тг

ПРИКРЕПЛЕНИЙ К ^

мятриксу > п па

/ \ аЦ.-Фрагмент (1737 п.о.)

i1 ккаии ««сссск сяш-кс С1Ш1СТИ кттксе« ««гсстсе

«кискт кш«ш ккллсли 1сшстти {(снстссс с0*1ггс1с1 мениск ТС1ТДОП «етсстстсв ештесск скяыек селклсси ядасисс кшскес гггасилл ассеетв сссккслс жсссттсс есястсс« «смсскс «гтссес« асскксс нкессс« «КШКб «ссссоем матеккт екдисш кскс«тт сксксстс ссскктес б«сс1бск согссаш «ктнсс! исисстм «текссл сискстк пешее« тсссскш тспсспк исккит (аксст стеитс! «сашсс шелегта «сссессст ссс«нш ткните ктилк стсттскст тмтгг- шктсте» ссттксс ттепши атиисс лклитас ктевдас таштс кеште 1«лсгкл: огошсс смскна шк та ттессссс лясксск акшш тсштсстт шбттки «гсктш тептетеее емкпек сссевскст ашисссс дстсинст сттсксси смсспси стакссле ист иск

столик слстссскс лкл«сс1с т6ссссс1ст ссклтсот исктс!«

сгатесш »кскск» «кап« ксдстктт штсаш спасет« сслслиси ее«««« »««неге сссштск истаа« «сета»« Ж1ттссс1 «тетей аттаста ассссста ттггтнт нстс«ш стссггтсет асткшт ситскш текистсс шипси сстестекс

1«кш£? «с1сшст скжсссс 6и1итот с16к1нтт 1шти« кктса« кштсш «итак« ситник к»«««« ссигтттс киитт «стетдт итмат ттемт ктесгсее» ттса:и: гоитл тстсткпе »топтат тиютле ши» сисклш аштс»« 1ссси1Ет( лкктшт стесисисс 1ттстст«1 иеиюи тшистсл яссмблслк Есятаж ккшла (ггеггсек кмлттш «идти оиаш сш«тс мсеткссс «тест«« »«птет

штткссд стснтскс ттсшк1т шт1тссит тсттситт1 ншстк1

мшстс сатссле стстес«« тшттше сшегтетс ешестеи кстстсте» скститле итгште» ллштш; ссштт; лтпгг«

Рис. 1. Организация регулкторньгк посяедсватель^гстей ъ -кедаевой области домена альФа-глобинс-вш; геноЕ к:-'?: П. Г, А - Позшг.1 глобинових геноз; Н$£ - позиции участ;::? гипе?-чузстЕите ль кости к ЛККазб I (показании только в с' • ког-цеь-ск 'области доменоЕ; длинные и короткие стрелки ссст-

Бетственко независящее от типа ткани и эидкоспеси^-ческие ИЭЗ),

-¡даркону натриксу скагШ ег а!,. 1991]. участок начала репликации 1Ка2Ш ег а1.. 19в&1. несаениФичяыа в отношении типа ткани эи-хансер [Рагш ег а1., 1991], участок гшгерчувствительности к ДНКазе! [Уешгаиь ег а!.. 19611. а также ряд перманентно изогнутых и легкоплавких последовательностей ДНК [Краевский и др., 19921. На культуре соматических клеток показано, что этот фрагмент изолирует геномный домен от влияния Фланкирующих последовательностей Е8апа е* а1., 1991).

Цель я задачи исследования, в данной работе изучается воз-модность использования регудяторной последовательности из.5*- области докена аль+а-гдобнновых генов кур (аи-*рагнент) в генных конструкциях, предназначенных для получения траясгекных животных, с пелью повышения эффективности экспрессии чухеройных генов.

1СХОШ из поставюаиой юл режадись едедуши« задача:

- подучить первичные культуры клеток кролика, трансгенного по конструкции, аесушей в своем составе ген горнона роста крупного рогатого скота и аи-м>агмент (шьшаш;.

- исследовать особенности интеграции и эксспрессии гена гормона роста крупного рогатого скота в тканях и клеточных культурах тканей кролика, трансгенного но генной конструкции НПЬСНаи. в частности, исследовать ДШ£. ассоциированную с ядерный иатриксом траасгенных клеток:

- йровести сравнительное изучение частоты экспрессии гена бета-галактозидазы Е. соИ (1ас2) на культивируемых эмбрионах кроликов после никроиньекнин в мужской аронуклеус загот генной конструкции, не ииешей 8 своем составе аи-фрагмента (5?57-1ас21, н генных конструкций, вкличаших в свой состав фрагменты <аив51Мас2аи, аикгыасгаи и ЮУ-иег * аиктпхшаш.

научная новизна работ Установлена активная экспрессия со-матотропина крупного рогатого скота в тканях и культур*-клеток

кролика, трансгенного по реконбинантной генной конструкция KTlbGHatt, включающей г свой состав att-фрагмент. На культуре клеток соединительной ткани капсулы почки этого животного показа-; на Фиксация чужеродного гена на ядерном натриксе. Ке исключено, что & данной случае может иметь место независимая от иозташ интеграции экспрессия чужеродного гена, связанная с присутствием в интегрированном генном конструкте att-фрагмента.

В модельных экспериментах на культивируемых ранних эмбрионах кроликов Ьока&ана высокая частота экспрессии гена бета-гадактози-дазы Е. coll (lacZ) в составе генных конструкций,; содержащих au ♦фрагменты. , ^

Практическая значимость работ Показана принципиальная возможность использования в рекомбинавтных генных конструкциях, предназначенных для получения трансгенных животных, регуляторной последовательности из 5'^области домена альФа-глобнновых генов кур {ап-фрагмент) с целые увеличения эффективности экспрессия чужеродных генов, что кожет быть использовано в биотехнологии трансгенных сельскохозяйственных животных, получаеных с цель» улучшения хозяйственно-полезных признаков, обеспечения информационного иммунитета, создания животных-продуцентов биологически активных белков Фармакологического и технологического назначения.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на VI биотехнологической конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии". 24-26 ная 1994 года. г. Пшшо.

Объем работа. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования. обсуждения, выводов> практических рекомендаций, приложения и списка сокрашений. Работа изложена на 101 страницах, содержит 31 рисунок, 3 таблицы и 2 приложения, список литературы включает m цубликаний.

МАТЕРИАЛЫ H НЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Обший план исследовательской работа представлен на рисунке г.

Рис. 2. Принципиальная схема исследования ■

Использованные в работе генные конструкции были созданы s институте колекулярной биологии км. В. А. Энгельгарта ран и Институте биологии гена РАН под руководством академика ран г, п. геор-гиева, •

Для кикроиньекуии использовали линейные фрагменты ДНК, раст-

, *

БОРенные в ТЕ-буфере <10 НИ трис-HCL рН=7,5; О, t nîî ЗДТАК до концентрации г-з ккг/нл.

Генная конструкция RSV-LacZ, включает в себя репортерннй ген. кодирующий белок бета-галактозжазу Е, cou UacZ) под управлением' длинного концевого повтора (LTR> вируса саркомы Fayca (KSVt ЕЖаданов. 199П (РИС. 3. Ah

генные конструкции аи£5У-зас2аи и аимтыасгаи содержат ген 1ас! под управлением промотора К57 шш гена неталлотионеина I мнпк (1ГЛТМ. и дополнительно фланкированы аи-фрагментами (рис.. з. Е и В1.

Совместно с генной конструкцией в молярной соотно-

шении 1:1 использовалась конструкт:?, гека гормона роста крупного рог**-;"'; "кота сьсш под правлением промотора Ш71. -Фланкированная аи-Фрагментами (аин?1ьснаш (рис. 5. Г).

Оплодотворенные яйцеклетки кроликов на стадии пронуклеусов поп тли от половозрелых животных, гормонально обработанные с дел ые- вызывания - суперовулянии (Енутримкшечно се (Шег^опап. ФРГ) из расчета го НЕ/к? »ивой пассы, через 7£ часа внутривенно корионический гонадотропин (Штоп. ФРГ) из расчета 70 ИЕ/кг жи-еой массы). На 15-й час после 2-х кратного естественного осеменения доноров забивали и из отпрепарированных яйцеводов ФосФат-но-буферный раствором (ФБС) вымывали яйцеклетки. Собранные яйцеклетки отделяли от эпителия яйцеводов и помешали в камеру для ник-романипуляций.

Перенос чужеродного генетического материала осуществляли методом прямой микронньекшш реконбикантной ЛНК в мужской пронуклеус оплодотворенных яйцеклеток кроликов, используя стеклянную микропипетку с диаметром колшего конца 1.3-1.5 мкм. Данная наиипу-ляиия выполнялась на инвентированном микроскопе Ахю»ег:-??-! "Орюп" » ФРГ), оснааенвом оптикой Но каре ко г о, при помоги-мй:<р-"-манипуляторов КН-г ("Биоприбор", Россия» и микроинъектора ("КэпЕ'гаее". Япония).

культивирование иктакткых и шкрекнъеиироэаккай ?игот кроликов проводили в капляк кодифицированной среды КГ-Ю ("Зитл". схч. под слоем вазелинового масла, при температуре 38е с. влажности 93-96 у. в воздушной атмосфере, содержащей 5 к С0г в течение 1в-ии часов.

Bint lit tMB 1 C1* 1 »1С I i«»H ]

¡»..St | "

'* i" *tn i \ I ом ш i » I:

^ j Li iiiii ' ' ' ' 1 - ' |:

6sv-lte lac2 tr

I-- 600 o.e.

. s»»a t Il!

*•» » „I

tad 1

i>:

*vy It

t*«t

it»* i

;Рис. 3. Физические карты гешшя конструкций RSV-iacz (А). . attRSV-iacZatt (б), attHTl-laczau <bj и ашньснаи (Г!: : att - регуляторная последовательность из 5'-области донена альфа-глобиновыу геноЕ кур (alt-фрагмент. 1719 и.о.); :RSV-LTR - последовательность длинного кониевого повтора вируса саркомы Рауса (5М и.о. t; ИТ - последовательность промотора гена металлотионеина I мши <670 п. о. к lacZ - ген бета-галактозидазы из лзктоэного ояерона Е. coli (3600 п. о.); bGH - последовательность хромосомного гена гормона роста быка (2300 п, о.); tr - 3'-концевой участок гена гормона роста быка. 1 содержащий сигналы сплайсинга, полиаденилирования и -тернинаиии транскрипции <7ö& п. о.).

для получения клеточных культур использовали ткани легкого,; печени, почек к соединительной ткани капсулы почки крлолика. трансгенного по конструкций ЯТНйНаи. После дезагрегации тканей и отмывки клеточной суспензии, осадок клеток ресуспендировали в питательной среде экен гй1Ьсо"> с высоким содержание« глюкозы, обогащенной Ю *•■ эмбриональной сывороткой телят и 2 зй глгганина. плученные клетки культивировали в стерильных пластиковых 25 сн* Флаконах гвилу*), каждые тг часа проводя скену среды.

"р=д взятием проб культураяыш сред для определения концентраций сокатотгспина крупного рогатого скота, вырабатываемого клеткаки трансгенного кролика. культуралъную жидкость кондиционировали путем культивироьания клеточного нонослоя в свежей среде в течение 72-х часов.

ДНК. связанную с ядерным матриксом (хмДНК), выделяли из первичной культуры Фибробластов кролика, трансгенного по конструкции ШЬСНаи, ао модифицированной методике ЕЕаландадзе А. Г, и др.. 1989). Данная процедура включала в себя этапы выделения ядер, ядерных натриксов и непосредственно якДНК (рис. 41.

КЛЕТКА ЯДРО НУКЛЕОИД №>ТРИ«С (иЛМК

Рис. Схема выделения днк, ассоциированной с ядерным натриксом.

клеточные ядра -экстрагировали иутем гоногенизапии в буфере.

содемааем Ю ИН НаСЬ 3 мН Hgci¿. to ин Трис-HCi (pH--7,6). обо-гашеннон 1 кК CuSOv и неионши детергентом тритон Х-100 до концентрации 0. б у.. Выделение ядерных матриксов осуществляли, используя концентрированные растворы наС1 и обработку необходимым количеством никроккоковой нуклеазы,

генонну» ДНК из ткани и культуры клеток, а также янДНК из ядерных катриксов культуры клеток трансгенного кролика выделяли nö модифицированному методу Блина н Стаффорда tSlin et al.. 19761, ■ Анализ ДНК ткаяии культуральных клеток трансгепного кролика выполняли с помошь» полннеразной цепной реакпии (ПНР), используя две пары прайм еров: DGA. DGV и BG3. BG4, ограничивающие соответственно 650 п.о. вз att-Фрагмекта.' и 705 п..о. из гена bGH (Дворянчиков и др.. 19931, Реакция акплкФикадии проводилась в скеса: 1.5 мк КвС12; 67мй Трис-HCl (рй-8.S); 1б.б мк сульфат анония; O.Oi z твин-20; дезоксинлслеотидтрифосфаты CdKTP) по О,2 кк каждый; 0.2 нкг геномной ДНК; праймеры по 0,04 нкг и 2,5 ед активности днк-полимеразы ,тач ГБиокастер"}. Протяженность реакции составляла 30 диклоь в режиме: 94* С - 1.5 мин,; 60е С - г мин.; 72° с - 3 нии.

Экспрессию гена бета-галактозидазн Е. coli оценивали как у микроиньедированных реконбкнантной ДНК. так и у интактных эмбрионов кроликов, с аоношьк» Специфической цветной реакции обнаружения белка бета-галактозидазы на субстрате X-sai. обусловленной наличием нерастворимых в воде синих крксталов хронофора (Bonnerot et al.. 1990; Гоголевский и др.. 199U, . ■ „

Концентрацию сокатотропина крупного рогатого скота (ЕСТ) в крови трансгенного кролика, экстрактах тканей органов и культу-ральной- жидкости определяли с воношьзо твердофазного теста типа •сэндвича*- ELISA"ГИкнуноФерментный анализ. 1933]. количественна оценку ЕСТ проводили относительно контрольных образцов.

- и -

результаты И ОБСУХДШНЕ 1, исследование кролиеа. ТРАНСГШЮГО 00 ГОШ ЕОЮРУК- .

вди нпыжаи

на первом этапе работы в качестве объекта исследования был еыбран кролик, трансгенный по реконбинантной генной конструкции мпыжаи, в состав которой входит хроносонный ген горнояз Роста крупного рогатого скота (ЬСН) под управлением пронотора гена не-таллотионеина I кши (пйТ!) и изучаеный аи-ФрагнентПСадавов, 1991).

1.1. Нолекудяршй анализ хромосомной дне траве генного крошка

нолекулярный анализ (ПНР) показал присутствие в геномной ДНЕ ткани трансгенного кролика фрагмента длиной 650 п. о. и? 5'-об-

р

ласти домена альфа-глобиновых генов кур (аи-фрагмент*, отсутствовавшего у контрольного животного (рис. 51.

650 п. а

'Рис. 5. электроФоретический анализ продуктов амшжФикашш !геномной днк трансгенного кролика в горизонтальном 1.5 х-вом агарознон геле на присутсвие alt-фрагмента, выполненной с помошь» праймеров DGA, DGV (окраска бромистым этидиен>: 1 -рестрикированная Нае Ш ДНК плазмиды PBR322. г - ДНК контрольного кролика (отрицательный контроль): 3-5 - ДНК кролика. транс генного по конструкции HTIbGHatt; 6 - днк яыаленка (положительный контроль); ? - вода без ДНК.

1.2. яянуноФернентный анализ экспрессия гена ЬСН у траисгенного кролша

Исследование крови трансгенного кролика, выявило наличие г ее составе соматотрсаика крупного рогатого скота (ЕСТ), концентрация которого достигала 55 нг/ня. кроне того, было установлено, что при даче животному с водой о, £5 им сульфата 7п. уровень чужеродного гориона в крови в течение 5 дней повшался в 3, б раза, £ затеи, после исключения динка. приближался к начальному показателю (рис. б).

Рис. б. Эффект активации экспрессии гена гориона роста круэ-ного рогатого скота у кролика, трансгенного по контрукши' ЙИМНаи: 1 - концентрация ЕСТ в крови до введения цинка т питьевые зоду; 2-4 - во время введения; 5. б - после исклг-чения цинка.

Есследование экстрактов органов животного показало высок':1

содержание соматотроаина крупного рогатого скота so всех взятых для исследования образцах, уровень концентрата чтхерышого белка в которых был одного порядка <от 99.4 до 124.0 нг/нл). за «сличением ткав*! легкого, где зтот показатель составил 19.5 вг/нл. ■

Таким образон- приведенные данные подтверждают предположение о тон. что имеющиеся в att-фрагменте регулятор»» элемента, обеспечивав? высокий и не специфичный в отношение типа ткащуро-вень экспрессии чужеродных генов в клетках трансгекжых животных, не подавляя проявление функтиокаакиой активности кетадлотиоичшо-вого пронотора.

1.?. Получение к исследование клеточных кужьтгр tub транс генного дошка

8з взятых образцов тканей трансгенного кролика бшш оолуодн аервичные клеточные культуры ткани почки, легкого й соедиитяь-ной ткани капсулы почки, в результате культивирования клеток было установлено, что наибольшей нитотвческой активность» облмалв клетки соединительной ткани капсулы почки, представленные Фиброб-ластаки. которые остались жизнеспособными и при дальиейшк не* ресевах пересев и аетесев).

Исследование содержания сонатотрооияа кряшого рогатого сяо-та (иннуноФернентный анализ» в обраэдах культтльнои среж юл-ток трансгенного по конструкции HTIbGHatt кролюса показало способность клеток этого животного продуцировать чужеродный горной и s условиях m vitro (таблица 1).

концентрация SCT в культуральной среде клеток трансгениого кролика после первого пересева соответствовала уровне содержания ЕСТ в крови и экстрактах органов животного и была одного порядка сот 58,1 до 97.6 кг/кл!. после дальнейших пересевов клеток соединительной ткани капсулы почки зарегистрировано резкое повшеияе

- -

ими продукции бст (272.4 нг/мл).

Таблица 1.

Продукция сонатотрошша крупного рогатого скота клетками культуры ткани органов трансгенвого кролика

Первичная культура клеток Содержание БСТ (НГ/МЛ),

ранние пересевы¡поздние пересевы

Соединительная ткань капсулы почки * 69.4 : » 272*4

ткань легкого 58,1 : бб, 1

Ткань почки 97, б : - »

* - не исследовалось •

1.4. йолекулярное исследование ДНК культуральных клеток трансгенного кролика

Нетодои ПДР-амплификации в геномной ДНК. полученной из ткани уяа и культуры Фибробластов ткани капсулы почки трансгенного кролика, были обнаружены последовательности как гена гормона роста крупного рогатого скота (ьсн) (рис. 7, дорожки 1, 2). так и аи-фрагмента (рис, 7. дорожка 5). что позволило судить об интеграции реконбинантной генной конструкции НПЬСНаи в геном исследуемого животного с сохранением этих частей, а также об их структурной и сегрегационной стабильности.

Нолекулярный анализ якднк культуры Фибробластов транс генного кролика, показал, что полученная янДЖ содержит фрагмент длиной

705 П.О.

650 и.о.

и 2345678

¡Рас. т. электрс-Форетиче^кий анализ продуктов аншшФгасашш {геномной ДНК из уха и культуры клеток ткани трансгенного кролика на присутствие траксгена нпьснаи, выполненной с помощь» прайме ров всз. вс4 (дорожки 1-4) и ка. юу (дорожки 5-7); 1 - ДНК ткани уха трансгенного кролика: 2.5 - ДНК культуралышх клеток трансгенного кролика; з - днк контрольного кролика (отрицательный контроль); 4 - ДНК тинуса теленка (положительный контроль); 6 - вода; 7 - днк цыпленка (положительный контроль); в - Рэи-рестрикты днк фага лянда.

&50 п. о, из донена альфа-гясбиновкх генов курицы (рис. в.с дорожка 1) и фрагмент длиной 705 п. о. из гена bGH (рис. в. дорожка 5). что указывает на связь интегрированной генной конструкции HTlbGHatt с ядерным матриксон.

705 П. О.

650 а. а

|1 23456789

Рис. а, ЭлектроФоретический анализ продуктез ■ амплификации янднк из культуры клеток ткани трансгенного кролика на присутствие трансгена HTlfcGHatt, выполненной с поношью прай-меров BG3, веч (дорожки 1-1) и DGA, DGV (дорожки 5-8); 1,5 -ДНК культуралышх клеток трансгенного кролика, ассоциирован- : ная с ядерным катриксом (ямДНК); г.6 - ДНК контрольного кролика (отрицательный контроль); 3-7 - вода; 4 - ДНК тикуса теленка (положительный контроль); 6 - ДНК ашшенка (положительный контроль); 9 - Pstl-рестеикты ДНК фага дяида.

Вполне воэ«одно, что связь att-фрагмента с ядерным натриксом клеток трансгенного кролика не случайна, а вызвана присутствием s исследуемой последовательности как-элементов, прикрепление коте -рыз к ядерному нгтриксу обеспечило экспрессию гена bGH независимо от окружающих последовательностей хозяйской ДНК.

Однако, как известно- аомкно участка прикрепления к ядерному

матриксу, изучаемый au-фрагмент содержит и делый ряд других

1

Функциональных элементов. Следовательно, функциональная активность этого фрагмента может иметь комплексный характер,

В то же время, нельзя исключить и того, что высокий уровень экспрессии трансгена может быть такхе связан с наблюдаемой Фиксацией структурного гена ibGHi с ядерным натрикссн,

2. 8ССЛЕД0ВАНИЕ ВЛИЯНИЯ att-ФРАГМЕНТА НА ЧАСТОТУ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА В-ГАЛАКТ09ИМЗЫ Е. COll В РАННИХ ЭНКРИОНАХ КРОЛИКОВ

Обнаружений нами высокий уровень экспрессии чужеродного гена (bGH) у кролика, трансгенного по реконбинантной генной конструкции. нееяей в своем составе au-фрагмент, во служил импульсом для проведения модельных экспериментов на культивируемых эмбрионах кроликов с использованием гена бета-галактозидазм Е. coll. имевших зель дальнейшего изучения возможности использования данной регуляторной последовательности в составе генных конструкций с

целью увеличения эффективности экспрессии чужеродных генов. *

2.1. Получение оплодотворенных яйцеклеток кроликов

Используя выбранную методику подготовки кроликов-доноров, от 19-и крольчих было получено яйяеклетки. что в среднем составляет гв, б яйцеклеток на одно животное, из них Тб.г г были пригодны для микроикъекпии.

- 1Т -

г. Культивирование интакпшх и никроиньецированных реком-бинантной дне зигот кроликов

Выбранные условия культивирования обеспечивали нормальное развитие интактных эмбрионов, 61 х из которых достигали стадии норулы, после никроиньекцин генных конструкций жизнеспособность эмбрионов снижалась на 25 г (рис, 9).

Рис. 9. Результата 48-ни часового культивирования интактных ;Н микронньеиированных реконбинантной ДНК ранних оплодотворенных яйцеклеток кроликов: 1 - интактные яйцеклетки (п^бй); :£ - яйцеклетки после никроиньекцин реконбинантной ДНК !(п=213),

После никроиньекцин сходных генных конструкций, принципиально отличающихся между собой только наличием аи-Фрагмента (ЕЗУ-1асг к аиКБУ-исгаш, был проведен анализ выживаемости ш:кроикьеиированных эмбрионов, который показал, что присутствие аи-Фрагментов в составе генной конструкции не снижало выживаемости никроинъецированных эмбрионов (таблица 2),

1

ЭЫбрИО(Ш с зориазьЕьш рагэигЕк*

эмбриоиц. осте но-вввжяегл в развитей

- и -

Таблица 2.

Выживаемость эмбрионов кроликов, никроиньецированных генными конструкциями, отличавшимися между собой наличием а-фрагмента

Показатели

Генные конструкций

ЕЗУ- 1асг ;анку ■ -1асгаи

йспользовано яйцеклеток, всего, (Ю 46 (100) : 4$ 1 (1001

Яйцеклетки, остановившиеся в развитии, с/.) * 23 (50) 4 4 : 14 ' * (26, б)

Яйцеклетки с нормальным развитием, т « 23 (50) * * ; зэ (71,4!

» оаенка после 43 часов культивирования микроиньёдарованных зигот

1.3. Исследование экспрессии гена бета-галактозидазы Е. сои 7 никроиньецированных рекомбинантной ДНК эмбрионов кроликов

В результате гистохимического окраг^ваппн эмбриологического материала быпо обнаружено, что эмбрионы, который . была проведена микроиньекдия как отдельных генных конструкций, кесунш в своем составе ап-фрагменты (аШЗТМасгаи. аинп-1асгаП!, так я смеси генных конструкций, одна из которых вклк-чала в себя аи-фрагменты (83У-1ас2 ♦ аикПЬСНаШ. обладали высокой бе-та-галактозидазной активность» (соответственно 19,6 я, зч, V/. и 23.3 2 от никроиньецированных эмбрионов!. В группе же эмбрионов,

микроиньеаированных генной конструкцией, не содержащей в своем составе аи-фрагментов (83У-1ас2), уровень экспрессии гена 1ас2 был сушественно ниже <г, 1 У штактных эмбрионов бета-галакто-зидазной активности не обнаружено (рис, ю).

12 3 4 5

^^окрашенные ^ неокрашенные 'эибрионй ' вибрионы

Рис, 10. частота экспрессии гена бета-галактозидазы Е. coll ;у эмбрионов кроликов; 1 - янтактные эмбриовы (п=б&); 2 - эн-' брионы после микроинъекции генной конструкции RSV-iacZ ! (п=4б) ; з - эмбрионы после микроиньекции генной конструкции ¡aURSV-lacZatt (n--49i; 4 - эмбрионы после никроинъекпии генной конструкции attHTI-Iaczatt (п-51); 5 - эмбрионы после : коиньекдии генных конструкций RSV-lacz и aUHTIbGHaU : {Г.:57 К

Нужно отметить, что экспрессия гена бета-галактозиды была зафиксирована как у эмбрионов, которые остановились в своем делении на 1-з-х клеточной стадии, так и у тех. которые развивались до стадии морулы. окрашивание имело место в отдельных бластокерах (рис, 11).

Результаты модельного эксперимента позволили нам сделать

заключение. чТо присутствие аи-фрагментов в составе генных

'■¡Й5 '

С.

$Омкн

Рис. и, ЭНбряоны кролика. обладайте бета-галактозидазной активностью.

конструкций, введенных в мужской пронуклсус яйцеклеток кроликов, ве снижая процента выживаемости микроиньепированных зигот, повышает количество эмбрионов, экспрессдаямш чужеродный ген 1ас2,

Данная работа является пастыо комплексной программы изучения возможности использования а!фрагмента в генных конструкциях для повышения эффективности экспрессии чужеродных генов у трансгенных животных, которая проводится совместно Институтом молекулярной биологии РАН. Институтом биологии гена ран и Всероссийским нйй животноводства. Результаты выполненных эксяерикектов оказались иногообешаипики в плане дальнейижх исследований роли Ш-элемс-н тов и 5'- фрагмента домена альфа-глобиноЕых генов в обеспечен: позиционно-независиной экспрессии чужеродных генов у трансгенкы; сельскохозяйственных животных.

ВЫВОДИ

1. Нетодон полимеразной деоной реакции (ПНР! установлено, что в составе геномной ДНК ткани и первичной культуре клеток кролика, трансгенного по рекомбинантной генной конструкции НПЬСНаи, присутствует как ген гормона роста крупного рогатого скота (ыанк так и 5'-Фрагнент домена альфа-глобиновых генов кур (аи-Фрагмент).

2. в крови, экстрактах тканей органов и клеточных культурах тканей кролика, трансгенного по конструкции ¡шьсшаи. включавшей в свой состав аи-Фрагнент. зарегистрирован высокий уровень гормона роста крупного рогатого скота (в крови - 55 нг/мл, в органах - до 124.0 нг/мл. в культах клеток - до 272,4 нг/кл).

3. Экспрессия интегрированной в геном кролика, генной конструкции НПЬСНаи. несущей в своем составе аи-фрагмент, была нетканесаепиФитаа и активировалась ионами цинка (в 3.6 раза). Присутствие а»-фрагмента в генной конструкции не нарушало Функционального механизма НТ-промотора.

4. Ери исследовании янДНК культуральных клеток трансгенвого кролика показана фиксация на ядерном матриксе интегрированной в геном животного рекомбинантной генной конструкций нпьснаи. несушей в своем составе а»-фрагмент.

5. Включение аи-фрагмента в генную конструкцию, предназначенную для получения трансгенных животных, не снижает процента выживаемости кикроикьеанрованнык рекомбинантной ДНК эмбрионов кроликов.

6. В модельном эксперименте на культивируемых эмбрионах кроликов с использованием гена бета-галактозидазы Е. сои показано, что црисутствие аи-фрагментов в составе генных конструкций, введенных в мужской цронуклеус оплодотворенных яйцеклеток, повывает количество эмбрионов. зкспрессирушнх чужеродный ген (15,6-34,7 х

- гг -

- опыт и г. 1 У- - КОНТРОЛЬ*.

практические рексшшацйи

Исследованная регуляторная последовательность из 5'-обласи' домена альфа-глобиновых генов кур (аи-фрагмент) представляет интерес для генноинжеверных работ в целях повышения частоте экспрессии чужеродных генов у трансгенных животных.

По теме диссертации шли следукше публикации:

1. Эрнст Л, К., гольдман И, Л. ■ кадулин С. Г. Генная инженерия р животноводстве: трансгенные сельскохозяйственные животные, кормовые растения, микроорганизмы рубаа // Биотехнология. - 1993. - К 5. - с. а-14.

г. Гольдман а. Л.. Разин С. В., Эрнст А К.. Кадулин С. Г.. Грашук Н.А. йолекулярно-биологические аспекты дроблены позипионно-неза-висимой экспрессии чужеродных генов в клетках трансгенных животных // Биотехнология. - 1994. - Н 2. - С. 3-8,

3, Гольдман и. л., Разин с. В., Хаданов а. б., Семенова б, а.. Васевкий В. С., йитапипова Н.н.. Дворянчиков Г. А.. кадулин с, Г.. Афанасьев в, Н. Возможный пример позияионно-независимой экспрессии чужеродных генов, нолекулярно-биологда эе исследование культуры клеток ткани кролика, тралегенного по струкдни. содержащей ген горнона роста крупного рогатого скота АК-элемент//VI конференция Российской Федерации 'Новые направ, ж биотехнологии" 24-26 мая 1994 г., г. Пушино: -исы докладе Пушино. 1994. - С. 133. ■

4. Гольдман а,л.. эра Л.К., Гоголевский П,А.. Семенова В.А.. кадулин С. Г,, жат шов А. Б.. Дворянчиков г. а. , Разине. В.. Кузнецов А.В.. Афанасьев в.Я, Теоретические вопросы получения трансгенных животных, эксперименты на кроликах // Сборник "Трансгенные сельскохозяйственные животные". - 1995.- В. ■1. - С. 93-103.

Поааисано к печати 29.02,1996 г, Srixaa 869.

Тираж. 75 экз. Ог~\-ем 0,9 уч.-язо, л

П.МП В'.Кв ,