Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физическая и генная карта фрагмента генома Corynebactetium glutamicum ATCC 13032

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Боринская, Светлана Александровна, Москва

ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н.И.ВАВИЛОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

на правах рукописи

Боринская Светлана Александровна

ФИЗИЧЕСКАЯ И ГЕННАЯ КАРТА ФРАГМЕНТА ГЕНОМА СогупёЬасЪег±ит д1иЬат±сша АТСС 13032

Специальность 03.00.15 - Генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук профессор Н.К.Янковский

Москва, 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Словарь использованных терминов....................................................................................................4

Введение................................................................................................................................................7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структура прокариотических геномов............................................................Ю

1.1. Карты бактериальных геномов..........................................................................12

1.2. Размеры и топология геномов..........................................................................14

1.3. GC-состав геномов......................................................................................................19

1.4. Структуры, связанные с репликацией............ ................................20

1.5. Выявление ORF и определение функций белка................................23

1.6. Интроны и интеины..................... ............................................................27

1.7. Паралогичные и ортологичные гены..........................................................29

1.8. Сравнение геномов ....................................................................................................31

1.8.1. Кластеры ортологичных генов................................................................33

1.8.2. Минимальный набор генов..........................................................................37

1.9. Некоторые группы генов........................................................................................40

1.9.1. Гены экологической спцефичности........................................................40

1.9.2. Гены вирулентности. Островки патогенности................................42

1.9.3. Гены рестриктаз................................................................................................45

1.9.4. Мобильность..................................................................................................................46

1.9.5. Транспорт..........................................................................................................................47

1.10. Повторяющиеся последовательности ....................................................48

1.11. Оперонная организация генов бактерий ..........................................49

1.12. Изменение структуры бактериальных геномов в процессе функционирования и в эволюции.......................................51

2. Физическое картирование геномов бактерий..........................................60

2.1. Получение макрорестрикционных карт бактериальных 60

геномов................................................................

2.2. Конструирование энциклопедий генов....................................................62

2.2.1. Конструирование библиотек генов............................................................63

2.2.2. Формирование энциклопедий..........................................................................64

2.2.2.1. Построение физической карты генома на основе рестрикционного анализа клонов....................................................64

2.2.2.2. Построение физической карты на основе гибридизационного анализа клонов..................................................65

2.2.2.3. Картирование генов при помощи гибридизации с синтетическими олигонуклеотидами..............................................68

2.3. Секвенирование целых геномов........................................................................69

3. Коринебактерии как объект молекулярно- генетических исследований ..........................................................................................................................72

3.1. Размер генома коринебактерий........................................................................73

3.2. Плазмиды и фаги коринебактерий..............................................................75

3.3. Метилирование и рестрикция........................................................................76

3.4. Введение ДНК в клетки коринебактерий....................................................77

3.5. Клонирование и секвенирование генов коринебактерий..............77

3.6. Картирование генома С.фйатюит АТСС13032 ..............................79

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................................80

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ......................................................................93

5.1. Конструирование и анализ представительности

космидной библиотеки С. ^1и1ат\сит АТСС13032 ................93

5.1.1. Конструирование космидной библиотеки ..................................93

5.1.2. Рестрикционный анализ рекомбинантных космид и определение представительности библиотеки........................95

5.1.3. Гибридизационный анализ рекомбинантных космид... 100 5.1.3.1 .Описание панели клонов и схема учета результатов

гибридизции..................................................................................................108^

5.1.3.2. Контроль результатов гибридизации с помощью рестрикционного анализа космид............................................103

5.1.3.3. Выявление космид, соответствующих клонированным генам С.фйатХсит АТСС13032........................105

5.2. Гибридизационное картирование фрагмента хромосомы С^Матгсит АТСС 13032 с помощью панели клонов............106

5.2.1. Схема построения контига............................................................................106

5.2.2. Выявление групп космид, соответствующих уникальным генам коринебактерии ....................................................108

5.2.2Л. Выбор олигонуклеотидных зондов..............................................108

5.2.2.2. Гибридизация олигонуклеотидных зондов с панелью клонов..................................................................................................................109

5.2.2.3. Сравнение результатов картирования генов на

панели клонов и макрорестрикционной карте 113

5.2.3. «Шагание» по хромосоме С.%1Шатжит АТСС 13032..........116

5.3. Построение космидного контига области генома С^Шатгсит АТСС13032.........................................................121

5.4.Генная карта участка хромосомы С.%1гйат1сит АТСС13032.. 125

6. ВЫВОДЫ....................................................................................................................................127

Список литературы..................................................................................................................129

Приложение 1. Размеры рестрикционных фрагментов

240 рекомбинантных космид............................................................................................144

Приложение 2. Результаты гибридизации рибозондов с панелью

космидных клонов....................................................................................................................151

СЛОВАРЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ТЕРМИНОВ

Генетическая карта - графическое представление порядка следования мутаций и растояний между ними, определенных и указанных в единицах рекомбинации.

Физическая карта - графическое представление порядка следования маркеров, выявляемых на молекуле ДНК физическими методами. Физическими маркерами, например, являются участки молекулы ДНК, узнаваемые и расщепляемые рестриктазой; участки молекулы ДНК, гомлогичные фрагментам-зондам и выявляемые при гибридизации. Расстояние между физическими маркерами определяется в парах нуклеотидов.

Генная карта - карта, полученная при определении местоположения генов на физической карте.

Рестрикционная карта - вид физической карты, на которой указаны расстояния между соседними сайтами расщепления ДНК определенной рестриктазой. Маркерами этой карты являются рестрикционные фрагменты определенного размера (обычно до 20 т.п.н.). Рестрикционой картой является также карта, на которой указан порядок следования сайтов для разных рестриктаз.

Макрорестрикционная карта - рестрикционная карта, построенная при использовании крупнощепящих рестриктаз (узнающих участок 8 п.н.). Размер фрагментов в этом случае достигает десятков и сотен т.п.н.

Рестрикционный портрет - характеристика молекулы ДНК по набору рестрикционных фрагментов, размер которых определяют на электрофореграмме, не составляя рестрикционой карты.

PFGE (pulsed field gel eletrophoresis) - электрофорез в пульсирующем электрическом поле. Метод разделения крупных (до 10 млн.п.н.)

фрагментов ДНК, не разделяемых при использовании электрического поля постоянного направления.

Библиотека генома - набор клонированных фрагментов ДНК, представляющих весь геном или его часть.

Эквивалент генома - такое количество рекомбинантных клонов, суммарная длина вставок в которых равна длине генома исследуемого направления.

Представительная библиотека генома - такая библиотека, в которой представлен каж-дый участок генома организма с вероятностью не меньше заданной (обычно Р> 99%).

Справочная библиотека - библиотека, клоны которой хранятся упорядоченно и могут быть высеяны в воспроизводимом порядке. Обычно эти клоны хранят в иммунологических плашках и высевают специальным репликатором - щеткой с иглами, по числу и расположению соответствующим лункам иммунологической плашки.

Панель клонов - нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр, на который упорядочено высеяна библиотека клонов.

Контиг (от английского contiguous - непрерывный ) - набор клонированных фрагментов ДНК, непрерывно перекрывающих в известном порядке часть генома. Вид физической карты, в которой маркерами являются клонированные фрагменты.

Энциклопедия клонов - контиг, перекрывающий весь геном исследуемого организма.

Космида - плазмида, в которую встроен cos-еайт фага лямбда. Используют в качестве вектора для клонирования фрагментов ДНК размером ~ 40 т.п.н.

Зонд - меченая (флуоресцентно или радиоактивно) молекула ДНК или РНК, используемая для выявления комплементарных ей последовательностей непосредственно в геноме или в наборе

представляющих его фрагментов. Размер зонда может составлять от нескольких нуклеотидов (олигонуклеотидный зонд) до миллионов нуклеотидов (рекомбинантные молекулы YAC). Паралогичные гены -гомологичные гены внутри одного генома,

произошедшие путем дупликации предкового гена. Ортологичные гены - гомологичные гены в геномах разных организмов, являющиеся продуктом эволюции одного и того же гена в геноме общего предка этих организмов. COG (Cluster of Ortologous Genes) - кластер ортологичных генов, представляет собой группу уникальных генов-ортологов из геномов разных организмов или группу ортологов, каждый из которых представлен в геноме отдельных организмов несколькими генами-паралогами.

ORF (Open Reading Frame) - открытая рамка считывания. Представляет собой потенциальный белок-кодирующий участок и выявляется при анализе секвенированых фрагментов. Более или менее протяженный участок нуклеотидной последовательности, не содержащий стоп-кодонов в данной рамке считывания.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы диссертации.

СогупеЬаЛепит ^Ыаписит АТСС 13032 относится к группе глутамат-продуцирующих бактерий, широко используемых для промышленного получения аминокислот, среди которых в настоящее время наибольшее значение имеют имеют глутаминовая кислота, фенилаланин и лизин. Так, мировой объем производства лизина составляет 100 тысяч тонн в год.

Бактерия С^кйаписит безопасна в экологическом отношении. Значимость С^кйттсит для биотехнологического производства аминокислот вызывает рост числа публикаций, посвященных разработке систем клонирования и генетическому изучению объекта. В связи с этим актуальной задачей является обеспечение доступности всех генов, связанных с биосинтезом аминокислот. Источником таких генов могут являться фрагменты генома коринебактерии, клонированные в векторах большой емкости - космидах .

Важнейшей целью молекулярно-генетической характеристики коринебактерии является сиквенс генома этого организма. Один из этапов на пути к сиквенсу, выполнение которого актуально сейчас, это создание представительногй клонотеки генома С.^Шатгсит, и получение контига рекомбинантных молекул ДНК. Космиды, включенные в контиг, явятся оптимальным набором матриц для секвенирования генома С^Шаписит.

Данная работа проводилась в рамках ГНТП "Геном человека" и являлась модельной для освоения комплекса методов создания космидных контигов, перекрывающих фрагменты генома размеров в сотни тысяч пар нуклеотидов. Проведение пилотных экспериментов по созданию контигов и генной карты на геноме бактерии, который в 100 раз меньше генома человека, также определяло актуальность данной работы.

Целями работы явилось: 1) Выявление рекомбинантных космид, содержащих гены биосинтеза аминокислот С.^гйатгсит; 2) создание физической карты части генома С^Ыаппсит АТСС 13032 в виде контига рекомбинантных космид и тем самым проверка достижимости построения контига космид в рамках существующих и разработанных в процесе выполнения данной работы методов, оборудования и компьютерных программ; 3) построение генной карты С^Шстисит АТСС 13032 на основе полученного контига. Для этого было необходимо решить следующие задачи:

создать и охарактеризовать представительную библиотеку генов С.^1Шат1сит АТСС 13032;

выявить перекрывающиеся космидные клоны и сконструировать контиг на их основе;

установить в данном контиге локализацию генов, связанных с биосинтезом аминокислот.

Данная диссертационная работа по физическому картированию генома выполнялась в рамках ГНТП "Геном человека" и являлась пилотным проектом для перехода к картированию протяженных участков генома человека.

Научная новизна и практическая значимость работы

Получена и охарактеризована представительная космидная библиотека генов С^Шаткит АТСС 13032. Освоен комплекс методов и продемонстрирована пригодность использованного подхода для картирования фрагментов генома размером более полумиллиона пар нуклеотидов. Данный подход в дальнейшем был использован в лаборатории анализа генома ИОГен РАН для картирования протяженных участков генома человека.

Выявлены группы космид, соответствующие 8 генам, контролирующим различные этапы биосинтеза аминокислот, и генам рРНК. Характерная

для генома бактерий кластерная организация функционально родственных генов делает выявленные группы космид удобным источником генов, функционально связанных с локализованными генами. В частности, это создает основу для выявления новых генов, участвующих в процессах биосинтеза аминокислот.

Построен контиг рекомбинантных космид, перекрывающий -600 т.п.н. (20%) генома C.glutamicum АТСС 13032. На основе полученной физической карты построена генная карта данной области генома. Установлен порядок следования 6 генов и 3 кластеров генов рРНК: rrn, git A, ilvA, aecD,aceB, rrn, rrn, lysC, asd и оценены расстояния между ними. Разрешающая способность карты составляет 7 т.п.н.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введения; обзора литературы, посвященного строению бактериальных геномов и подходам к их изучению; описания методов и материалов; результатов и их обсуждения; выводов и двух приложений, включает 23 рисунка и 11 таблиц. Список цитированной литературы содержит 178 наименований.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на семинарах лаборатории анализа генома ИОГен РАН.

Основные результаты работы опубликованы в двух статьях.

1. Структура прокариотических геномов

Микроорганизмы составляют большую часть биомассы планеты, и их вклад в биологическое и генетическое разнообразие жизни на Земле превышает 90% . Они составляют основу жизни, являясь основными производдителми кислорода, плодородия почвы, находясь в основе пищевых цепей гетеротрофных организмов [Olsen С., WoeseC., 1996].

До конца 1970 гг. все живые организмы делили на две группы -прокариоты и эукариоты. Появление сиквенсов рРНК привело к делению мира живого на три царства [Woese C R., Fox G.E., 1977]. Прокариоты были разделены на две группы: истинные бактерии (Eubacteria) и архебактерии (Archaebacteria, Archaea). В связи с этим Карл Вуз предложил ввести таксон более высокий, чем царство, и назвал его домен (domain). Каждый домен содержит два и более царств: эукариоты - царства животных, растений, грибов, археи -царства Euiyarchaeota (включают метаногенные архебактерии) и Crenarchaeota (экстремальные термофилы, видимо, наиболее близкие к предковым формам) [Woese C.R., Kandier О., Wheelis M.L., 1990].

Предполагалось, что архебактерии ближе к эукариотам, чем к эубактериям. Однако, сравнение последовательностей геномов показало, что, вопреки ожиданиям, многие генные продукты архей оказались сходны с бактериальными, а не с эукариотическими. Учитывая, что некоторая часть архебактериальных белков, особенно относящиеся к транскрипции и трансляции, более близки к эукариотным формам, можно полагать, что эукариоты были результатом химерического слияния эубактерий и архебактерий [Koonin, 1997]. Предполагается, что последний общий предок бактерий и архей был также последним общим предком для всех

остальных форм жизни, хотя происхождение эукариот еще далеко от окончательного установления [Doolitlle, 1998 ].

В данном обзоре мы рассмотрим структуру геномов прокариот (эубактерий и архебактерий) на основе данных генетического и физического картирования, в том числе нуклеотидных последовательностей полных геномов.

Установление последовательности нуклеотидов является конечной целью структурного анализа генома. Сравнение полных нуклеотидных последовательностей геномов разных организмов позволяет ответить на ряд вопросов: Имеется ли общий для всех организмов базовый набор генов? Можно ли рассматривать какой-либо организм как модельный? Возникли ли геномы ныне живущих микроорганизмов за счет дарвиновской эволюции генетического материала от предков к потомкам и каков вклад горизонтального переноса этого матерала в эволюции? Каковы эволюционные отношения основных доменов жизни?

Разработанные методы анализа полных геномов позволяют теоретически реконструировать биохимические пути ^охарактеризованного организма по представленнос