Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение биосинтеза L-глутаминовой кислоты в условиях интенсивного массообмена

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение биосинтеза L-глутаминовой кислоты в условиях интенсивного массообмена"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОЕКТНО-КОНСТРУКТОРСКИЙ ИНСТИТУТ ПРИКЛАДНОЙ БИОХИМИИ

(ВНИИбиохиммашпроект)

На правах рукописи

ЕНИКЕЕВ Эдуард Шамилевич

ИЗУЧЕНИЕ БИОСИНТЕЗА Ь -ГЛ УТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ В УСЛОВИЯХ ИНТЕНСИВЮГО МАССООБМЕНА

03.00. 23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1991

РасЗота выполнена во Всесоюзном научно - исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов Министерства медицинской и микробиологической промышленности СССР. Экспериментальная часть выполнялась в Казанском филиале ВНИИбиотехнология.

Научный руководитель : д. б.н. , чл.-корр. АН СССР В.Г.Дебабов.

Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор И.М.Грачева; кандидат биологических наук В. Г.Ясиновский.

Ведущая организация : Московский химика - технологический институт им.Д.И.Менделеева, кафедра промышленной биотехнологии.

Защита состоится "-//" 1992 г. в /¿7 ''""час

на заседании Специализированного Совета Д 098.09.01 во Всесоюзном научно - исследовательском проектно - конструкторском институте прикладной биохимии.

Адрес : 123 299, Москва, ул. Клары Цеткин, д. 4/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИбио-химмашпроект. Автореферат разослан "ЯУ' Л^ар/ 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

И.И.Гусева

Общая характеристика работы

,-ЭЛ

Актуальность темы, В настоящее время производство глутаминовой кислоты в мире превышает 350 тысяч тонн и является самым большим микробиологическим производством аминокислот. В связи с расширением сферы применения глутаминовой кислоты, гяутамата натрия и их производных потребность в них постоянно возрастает. Одними из крупнейших потребителей глутамата натрия являются пищевая промышленность и сельское хозяйство.

В СССР потребности в глутаминовой кислоте удовлетворяются за счет импорта..В настоящее время, в связи с недостатком валютных средств и экономическими трудностями, организация в СССР крупнотоннажного производства глутаминовой кислоты становится более актуальной задачей, чем в то время, когда решение проблемы предусматривалось КП НТП СЭВ СКП НТП СЭВ, проблема 3.2.2.1 "Разработка технологии, техники и создание производства глутамата натрия микробиологическим способом".программа "Унибиотех"). Современные зарубежные разработки технологии производства предусматривают выход глутаминовой кислоты 90 - 100 г/л за 24 - 48 часов, с использованием природных или мутантных штаммов микроорганизмов Вгеу1Ьас1ег1Ш1, СогупеЬас1ег1ит, АНЬгоЬас-{.ег, ШсгоЬас1ег1ит и др., выращиваемых на мелассных средах, уксусной' кислоте, углеводородах.

В СССР разработаны технологии производства глутаминовой кислоты с выходом до 55 - 72 г/л за 60 - 72 часа с использованием мутантных штаммов коринеформных бактерий, вы-

- г -

ращиваемых на мелассных средах. В частности, во ВНИИгене-тика направленной селекцией получен штамм СогупеЬас1егаига д1и1аш1с1ш ВНИИген - 3144, способный продуцировать глута-миновую кислоту с коэффициентом конверсии до 50% в условиях высокой концентрации биотина в питательной среде.

Планом развития народного хозяйства на XII пятилетку было предусмотрено создание в нашей стране промышленного производства мощностью 5 ООО тонн в год с ориентацией на ■дешевое сырье - мелассу, которая является крупнотоннажным

побочным продуктом производства сахара, За последние нес*

колько лет цены на мелассу возросли, поэтому для создания рентабельного производства в настоящее время необходима модернизация имеющихся технологий, предлагавшихся к внедрению, или, возможно, разработка новых.

Для увеличения эффективности имеющихся технологий необходимо снижение времени процесса, повышение выхода глутаминовой кислоты. В этой связи несомненна актуальность исследования возможностей биосинтеза глутаминовой кислоты в. условиях интенсивного массообмена.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена поиску путей интенсификации биосинтеза глутаминовой кислоты при культивировании мутантного штамма-продуцента Со-гупеЪасЬег1ит д1и1агл1сит ВНИИген-3144 и природного штамма СогупеЬас1ег1иш д!и1апйсш АТСС-13032.

В связи с поставленной целью в задачи настоящего исследования ВХОДИЛО: *

1. Исследовать возможность стимуляции роста продуцента и биосинтеза глутаминовой кислоты при помощи подпиток

солями фосфора.

2. Исследовать влияние аэрации и перемешивания на рост продуцента, биосинтез и секрецию глутаминовой кислоты в условиях биореактора интенсивного действия.

3. Изучить поведение природного штамма в аналогичных условиях.

Новизна результатов. Впервые при культивировании природного штамма СогупеЬас1ег1Шп д1и1аписит АТСС - 13032 на средах с мелассой без применения повбрхностно-активных веществ или антибиотиков для увеличения проницаемости клеточной мембраны была получена высокая концентрация глутаминовой кислоты в культуральной жидкости С45 - 50 г/л).

Обнаружено, что динамическая коррекция состава питательной среды по содержании фосфатов стимулирует биосинтез глутаминовой кислоты обоими исследуемыми штаммами.

Впервые изучена взаимосвязь концентрации солей фосфора в культуральной жидкости, скорости потребления кислорода культурой микроорганизмов, скорости выделения углекислого газа и весовой конверсией субстрата в биомассу и целевой продукт.

Предложен метод анализа экспериментальных данных, позволяющий количественно оценить совместное влияние концентрации фосфатов в среде и параметров, характеризующих дыхание микробной культуры на конверсию субстрата в биомассу и в целевой продукт.

Научно-практическая значимость работы. Динамическая коррекция содержания фосфатов в культуральной жидкости позволила в 2.5 раза повысить скорость биосинтеза глутамино-

вой кислоты в стадии роста продуцента Corynebacterium glu-tamicuni ВНЙИген - 3144 и получить концентрацию продукта в КЖ 60 г/л за 42 часа культивирования Спо регламенту ВНИИ-генетика ЛР 64-78-87 (1989 г.3 предусмотрено получение 6872 г/л глутаюшовой кислоты за 68-72 часа ферментации). Использование этого, технологического приема дает возможность стимулировать биосинтез целевого продукта природным штаммом настолько, что становится реальным использование Corynebacterium glutamicum ATGC - 13032 в качестве промышленного продуцента глутаминовой кислоты (46 -65 г/л за 45 часов ферментации).

Применение предложенного метода анализа данных, полученных в ходе экспериментов, Позволило выявить оптимальные Св пределах опытов) условия для культивирования Corynebacterium glutamicum АТСС - 13032 и Corynebacterium glutami-cum ВНШген - 3144 в фазе роста и фазе биосинтеза, обеспечивающие наибольшую конверсию субстрата в биомассу и в це-. левой продукт соответственно.

Это открывает возможности для разработки двухстадий-ного процесса с оптимальными условиями в каждой из стадий.

Апробация. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на межлабораторных семинарах института ВНИИгенетика.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения резу-

льтатов, выводов, заключения^ списка литературы и приложения. Список литературы включает 103 работы отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 21 таблицей и 26 рисунками.

Материалы и методы В экспериментальных работах использовались два штамма микроорганизмов: СогупеЬас1епит д1и1аписшп БНИИген - 3144 и СогупеЬас1ег1ит д1и1апйсии АТСС - 13032. Мутантный штамм ВНИИген- 3144 был получен в результате направленной селекции из природного штамма АТСС- 13032. Коринеформные бактерии С17 группа прокариот) характеризуются как грам-положи-тельные,булавоойразные или цилиндрические неподвижные аэробные палочки.

А. Состав питательных сред для культивирования СогупеЬас-1ег1ит д1и1ат!сия АТСС - 13032 и СогупеЬас1ег1ит д1и1али-сш ВНИИген - 3144.

1) Посевная средаС/О.Меласса - 8.0, КН2Р04 - 0.05, Мд204 -0.03, ИН4С1 - 0.3, Кукурузный экстракт - 0.3,рН 7.2 - 7.4, Мел -1.0. Режим стерилизации : 0.8 атм., 40 мин. Инокулят выращивался в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл с 30 мл посевной среды. 2)Ферментационная средаС%).Меласса - 20.0, КН2Р04 - 0.05, Мд504 - 0.03, Мел - 1.0, Мочевина - 1.0, рН естественный. Режим стерилизации : 0.8 атм,40 мин. Раствор мочевины (40%) стерилизуется отдельно при 0.5 атм.,20 мин. 3)Пёногасигель: эмульсия пропинола Б-400 в воде (1:45,сте-стерилизовался при 0.8 атм 20 минут.

Б. Подпитки. Подпитки источником углерода: 1) 50 % р-р мелассы. 2) 60% р-р сахарозы. Солевая подпитка производилась

0.1 % раствором Ш^РОд. Режим стерилизации подпиток аналогичен режиму стерилизации питательных сред. В. Методы. Опыты производились на ферментационной установке "Биотрон-2рс", начальный объем культуральной жидкости 1 литр Спит.среда и инокулят). Инокулят вносился в количестве 5 - 9 %. Величина рН и температура в аппарате поддерживались автоматически. В ходе работы концентрации глутами-новой кислоты в культуральной жидкости определяли методом бумажной хроматографии и при помощи аминокислотного анализатора. Изменение биомассы бактерий определялось турбиди-йетрически, углеводы определяли иодометрически, аммонийный азот - изотермической перегонкой. Подача подпитки во время культивирования проводилась имлульсно.

Результаты исследований.

Исходя из целей и задач экспериментальных работ, нами было определено два направления исследований . регистрация и изучение параметров ферментации в периодическом режиме с подпитками источниками углерода и азота (титрующий агент); изучение поведения мутантного и природного штаммов при изменении солевого состава питательной среды Сконцентрация солей фосфора) и некоторых характеристик, влияющих на мас-сообмен, таких как интенсивность аэрации и перемешивания. Полученные данные проходили статистическую обработку, которая включала анализ и удаление "шумовых" значений,а также сглаживание полученных графических зависимостей по методу "движущегося среднего". В результате был получен набор среднестатистических данных для каждого объекта исследований по всем регистрируемым и расчетным параметрам, ко-

торые использовались в дальнейшем при анализе процесса и построении математических моделей.

Параметры ферментации при культивировании в периодическом режиме с подпиткой. Некоторые регистрируемые и расчетные параметры, которые позволяют нам сравнить жизнедеятельность исследуемых штаммов при культивировании на ферментационной системе "Биотрон - 2рс", представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Штамм Скорость биосинтеза Сг/л*час) Концентрация глутаминовой кислоты, Сг/л)

С. д. 3144 С. д. 13032 Средняя Максимальная Средняя Максимальная

2.82 2.34 4.0 .4.957 60- %0 час 46Л45 час б9-657 час 65-245 час

Таблица 2

Штамм Конверсия субстрата в биомассу С г/г) Конверсия субстрата в глутаминовую кислоту С г/г)

Средняя Максимальная Средняя Максимальная

С. д. 3144 0.42 0.76 0.45 0.71

С.д.13032 0.31 0.51 0.24 0.32

Приведенные данные позволяют отметить следующее: 1, Конверсия субстрата С средняя и максимальная) как в биомассу, так и в глутаминовую кислоту у СогупеЬас1ег1иш

д1и1аш!сит ВНИИген - 3144 выше, чем. у природного штамма.

2. Максимальная, скорость биосинтеза глутаминовой кислоты у СогупеЬас1ег1ит д1 (Лат сит АТСС - 13032 выше, чем у СогупеЬас1егчшп д1и1аго1сиш ВНИИген - 3144. Благодаря этому максимальная концентрация глутаминовой кислоты в КЖ, почти одинаковая дл£ обоих штаммов, достигается при ферментации природного штамма на 12 часов раньше.

Скорость.биосинтеза продукта ыутантным штаммом обычно достигает максимума к 24 - 27 часам ферментации, что позволяет эа 42 часа получить концентрацию глутаминовой кислоты 60 г/л. При культивировании природного штамма максимальная скорость биосинтеза достигается на- 16 - 21 час процесса. Учитывая, что природный штамм выращивался без добавления ПАВ или антибиотиков для повышения выхода целевого продукта, а также тот факт, что обычно концентрация глутаминовой кислоты в таких условиях, согласно данным литературы, не превышает 8 - 12 г/л, можно заключить, что полученный нами результат представляет значительный интерес.

На протяжении всей ферментации оптическая плотность культуральной жидкости Спараметр, косвенно характеризующий количество клеток микроорганизмов) для С. д1и1аписит АТСС -13032 превышает аналогичный показатель для С.д1и1аписит ВНИИген - 3144. Время достижения максимальных коэффициентов конверсии в опытах с С. д!и1ага1сит АТСС - 13032 на 10 -15 часов больше. Подобным образом отличаются и интервалы времени между максимумом роста и биосинтеза. По сравнению с мутантным штаммом синтез биомассы и целевого продукта у СогупеЬас1ег1ит д1й1аписит АТСС - 13032 проходит менее ин-

тенсивно. Однако, как известно, медленно протекающие процессы легче поддаются регулированию.. Принимая во внимание интервал времени между максимальным значением коэффициентов конверсии субстрата в целевой продукт и биомассу, можно предположить, что при культивировании природного штамма будет легче разделить фазу роста и фазу биосинтеза.

Следующим шагом к пониманию закономерностей роста и биосинтеза для изучаемых штаммов являлось построение математических моделей для имеющихся расчетных характеристик. В качестве расчетных показателей использовалась удельная скорость выделения углекислого газа, удельная скорость потребления кислорода, и дыхательный коэффициент СРО). В наших расчетах эти данные функционально связаны с соответствующими коэффициентами конверсии субстрата.

Известно, что выражения, подобные уравнениям кинетики ферментативных реакций, применяются для описания динамики роста клеток и биосинтетических процессов. При этом выбор уравнения делается исходя из физического смысла изучаемого процесса, знаний о нем, и вида моделируемой графической зависимости. В результате анализа экспериментальных и ли-литературных данных можно заключить, что по виду зависимости и по физическому смыслу наиболее подходящими будут два уравнения: 1)уравнение Хилла, описывающее зависимость скорости реакции, катализируемой аллостерическим ферментом,от концентрации субстрата; 2) уравнение неконкурентного инги-бирования в случае, когда ингибитором является субстрат.

Параметрическая идентификация проводилась с. помощью статистической графической системы 5ТАТСКАРН1С8. Уровень

- 10 -

соответствия полученных моделей экспериментальным данным (коэффициент определения) не ниже 45 '/,.

Влияние подпиток солями фосфора на жизнедеятельность исследуемых штаммов. Скорость потребления фосфора зависит, кроме других факторов, от интенсивности массообмена. Мас-сообменные характеристики различных ферментационных систем значительно отличаются друг от друга, следовательно, время наступления лимита по фосфору и лимитирующая концентрация фосфатов в КЖ также различны. В нашем случае лимитирующая концентрация солей достигалась при одновременном повышении рОд и концентрации кислорода в выхлопе и снижении концентрации углекислого газа . на выходе газового тракта - характерная ситуация, указывающая, на уменьшение активности дыхания, и при отсутствии лимитирования источниками азота, углерода и растворенным кислородом ' с большой вероятностью свидетельствует о недостатке ионов фосфора." После внесения солей значения параметров снова устанавливаются в пределах рабочей области. По нашему мнению, полученные результаты могут быть действительны для любого ферментатора в случае использования при расчетах сверхлимитирующей концентрации, т.е.концентрации фосфатов,создающейся в культуральной жидкости после подпитки солями фосфора (лимитирующей концентрацией фосфатов пренебрегаем). Шея данные, характеризующие изменение конверсии субстрата, можно выделить области концентрации фосфатов в среде (без учета лимитирующей).соответствующие оптимальным условиям для биосинтеза глутами-новой кислоты и роста продуцента. Полученный результат необходимо связать с массообменными характеристиками исполь-

- И -

эуемого ферментатора, например объемным коэффициентом мас-массопередачи кислорода, рассчитать который можно по СПК. Если известны скорости потребления кислорода и выделения углекислого газа,соответствующие областям оптимальных концентраций фосфатов в среде,можно определить режимные параметры культивирования продуцента. Таким образом, результаты, полученные нами на ферментационной системе "Биотрон -2рс", могут быть использованы для дальнейших исследований на любой другой ферментационной системе. Эксперименты позволили выявить положительное влияние подпиток солями фосфора в обеих стадиях Срост и биосинтез) ферментации. Положительный эффект наблюдался при культивировании обоих исследуемых штаммов.

Наиболее показательны были предварительные результаты С статистически обработанные) в случае СогупеЬас1ег1шп д1и1аш1сит ВНИИген - 3144, хотя вид зависимости конверсии и скорости биосинтеза глутаминовой кислоты от времени для природного штамма аналогичен. Фаза роста при наличии солевой подпитки характеризуется более коротким лаг - периодом (3-4 часа), чем контрольный вариант без добавления солей Сб - 8 часов), высокой удельной скоростью роста, позволяющей достигать к 12 - 15 часам ферментации оптической плотности 40 - 45 ед. и скоростью биосинтеза глутаминовой кислоты, в 2 - 2.5 раза превышающей наблюдаемую в контрольном варианте. Наблюдаемый эффект можно объяснить тем,что повышение концентрации фосфат-иона в среде активирует субстратное фосфорилирование и дыхательные процессы, то есть синтез АТФ и других трифосфатов, делая таким образом метабо-

- 12 -

лизм субстрата более эффективным. Это. приводит к активации ростовых процессов и,за счет увеличения числа клеток,к повышение скорости биосинтеза глутаминовой кислоты.

В стадии биосинтеза наиболее интересный эффект наблюдается при разовой добавке солей фосфора. В этот период действие фосфатов можно разделить на два этапа. На первом этапе, почти сразу после подачи солей, концентрация глутаминовой кислоты в культуральной жидкости за короткое время (2 3 часа) увеличивается на 8-10 г/л при почти постоянной-скорости потребления сахара, что приводит к возрастанию весового коэффициента конверсии субстрата в продукт до 0.7 - 0.75 Ег/гЗ. Продолжительность переходного процесса, в течение которого конверсия уменьшается почти до прежнего уровня, составляет 2-3 часа. На втором этапе происходит постепенная активация дыхательных процессов С увеличение скорости потребления кислорода и скорости выделения углекислого газа), постепенное увеличение весового коэффициента конверсии до 0.6 [г/г3. Для природного штамма характерно меньшее колебание, коэффициента конверсии между первой и второй стадией. Подобная реакция штамма - проду-цента'при повышении концентрации фосфат-ионов в Ив фазе биосинтеза позволяет предположить, что транспорт глутаминовой кислоты из клетки может осуществляться специальными переносчиками в обмен на фосфат-ион С антипорт).

На втором этапе увеличение концентрации фосфатов в клетке, вероятно, вызывает активацию работы дыхательной цепи, окислительного и субстратного фосфорилирования. При этом, поскольку снимается ретроингибирование и/или катабо-

литная репрессия биосинтеза продукта, возрастает конверсия сахара в глутаминовую.кислоту. Активный транспорт глутами-новой кислоты с фосфатом может продолжаться до установления градиента концентрации фосфата между внешней средой и клеткой на прежнем уровне.

В случае С. glutamicum ВНШген - 3144 влияние солей фосфора на конверсии субстрата в глутаминовую кислоту наблюдается в узких пределах их концентрации (сверхлимитирую-щая .концентрация от 0 до 0.05 г/л); последующее увеличение концентрации КН2Р04 в культуральной жидкости не оказывает влияния на биосинтез продукта. Для природного штамма имеет место другой вид зависимости: чем больше концентрация фосфатов в среде, тем больше конверсия Св пределах данных эксперимента}, но'в области значений 0.005 - 0.092 г/л стимуляция биосинтеза солями менее выражена, чем у мутантного штамма.

Анализируя изменение весовых коэффициентов конверсии субстрата в биомассу при изменении содержания дигидрофос-фата калия в среде, можно заключить,что при одинаковом характере зависимостей (колоколообразные кривые) синтез биомассы у мутантного штамма сильнее зависит от концентрации фосфатов и, значит, от активности клеточного дыхания, чем у Corynehacteriira glutamicum АТСС-13032. Максимальный эффект для С.glutamicum ВНИИген -3Í44 наблюдается при сверх-лимитирующей концентрации КН^РО^ от 0 до 0.012 г/л, а для природного штамма - в пределах от 0 до 0.01 г/л..

Взаимосвязь удельной скорости выделения углекислого газа и конверсии субстрата в биомассу и в целевой продукт.

- 14 -

Анализируя взаимосвязь весовых коэффициентов конверсии субстрата и удельной скорости выделения С02, можно заключить, что ростовые (за исключением области 0.0065-0.015 моль/г*час) и биосинтетические процессы при культивировании мутантного штамма сильнее реагируют на изменение СВУ, чем в случае природного штамма. Для Corynebacterium glutamicum ВНИИген - 3144 кривая, характеризующая зависимость степени преобразования субстрата в биомассу от СВУ Св пределах экспериментальных данных, 0 -0.035 моль/г*час), не имеет максимума: чем больше СВУ с единицы клеточной массы, тем больше коэффициент конверсии. В случае С. glutamicum АТСС - 13032 максимальная конверсия субстрата достигается при значении СВУ 0.0125 моль/г*час. Для природного штамма вид зависимости конверсии субстрата в глутаминовую кислоту от СВУ аналогичен зависимости конверсии в .биомассу; удельная скорость выделения COg 0.0065 мояь/г*час соответствует максимальному коэффициенту конверсии. Кривая, отражающая зависимость степени преобразования субстрата в глутаминовую кислоту от СВУ в случае С. glutamicum ВНИИген-3144, имеет максимум в области значений удельной скорости выделения С02 0.006 - 0.007 моль/г*час.

Зависимость конверсии субстрата в глутаминовую кислоту и в биомассу от удельной скорости потребления кислорода клетками продуцента. Все характерные признаки, отмеченные при описании взаимосвязи конверсии и СВУ, имеет место и в данном случае для обоих исследуемых штаммов. Оптимальные значения скорости потребления кислорода в стадиях роста и биосинтеза целевого продукта приведены в таблицах 3-6.

Рис.1. Cor. glut. ATCC-13032. Ось Z: конверсия субстрата в биомас

-не. id. Uor.glut.ATCC-13032. Ось Z: коэффициент конверсии cydcTj га в гл.к-ту (г/г); ось X: KHgPO^ Сг/л); ось Y: СПК Смоль/г*ча<

- 15 -

Опрбделение области оптимальных значений параметров культивирования. Для определения оптимальных значений величин внешних воздействий на жизнедеятельность исследуемых продуцентов С в пределах экспериментальных характеристик ) воспользуемся разделом статистической графической системы "STATGRAF", который позволяет по известным уравнениям математических моделей создавать так называемые "поверхности отклика". Такой подход обеспечит нам возможность наблюдать изменение весовых коэффициентов конверсии субстрата при совместном действии двух факторов и позволит использовать полученные результаты для культивирования продуцентов на других ферментационных системах.

Взаимосвязь концентрации солей фосфора в культураль-ной жидкости.удельной скорости потребления кислорода и весовой конверсии субстрата в биомассу и целевой продукт при культивировании штамма С.glutamicurn АТСС - 13032. Рисунки 1 и 2 представляют собой поверхности отклика,характеризующие изменение соответствующих весовых коэффициентов конверсии сахара в зависимости от величины С1Ж и концентрации KHgPO^. Поверхность, изображенная на рис.1, имеет четко выраженный максимум при значении коэффициента конверсии 0.45,сверхлимитирующей концентрации солей фосфора 0.01 г/л и СПК, равном 0.016 моль/г*час. Анализ рисунка 2 позволяет сделать вывод, что конверсия субстрата в глутаминовую кислоту тем больше,чем больше концентрация фосфатов в КЖ. Оптимальное значение СПК составляет 0.008 моль/г*час. Максимальный коэффициент конверсии в пределах экспериментальных данных был равен 0.5.

- 17 -

Взаимосвязь концентрации солей фосфора в культураль-ной жидкости.удельной скорости потребления кислорода и весовой конверсией субстрата в биомассу и глутаминовую кислоту при культивировании C.qlutamlcum ВНИИген-3144. Рисунки 3 и 4 отражают реакцию коэффициентов конверсии сахара в биомассу и целевой продукт на изменение СПК и концентрации фосфатов. Очевидно, что на рост штамма наиболее сильно влияет скорость потребления кислорода. При оптимальной концентрации KHgPO^, равной 0.015 г/л, увеличение СПК приводит к возрастанию конверсии субстрата в биомассу Сем. рис.3). Анализируя рисунок 4, можно заключить, что степень преобразования сахара в целевой продукт при содержании фосфатов в среде выше 0.04 г/л не зависит от их концентрации и незначительно зависит от СПК. При оптимальной скорости потребления 0g, равной 0.026 моль/г*час,достигается максимальное значение коэффициента конверсии сахара в глутами-новую кислоту 0.75 г/г.

Взаимосвязь конверсии субстрата в глутаминовую кислоту и в биомассу, концентрации солей фосфора в культураль-ной жидкости и удельной скорости выделения углекислого газа при культивировании C.qlutamicum АТСС - 13032. Взаимосвязь концентрации фосфатов, скорости выделения углекислого газа и соответствующих коэффициентов конверсии сахара представлена на рисунках 5 и 6. Интересно, что закономерности, отмеченные для поверхностей отклика конверсия -концентрация KHgPO^ - СПК,действительны и в данном случае. Оптимальное значение скорости выделения углекислого газа составляет 0.018 моль/г*час,концентрация фосфатов, при ко-

Рис.3. Gor. glut.ВНШген-3144. Ось Z: конверсия субстрата в би биомассу Cr/TD; ось X: КН?Р0Л Сг/л); ось Y: СПК Смоль/г*час).

Рис.4. Cor.glut. ВНШген-3144. Ось Z: конверсия субстрата в гл к-ту Сг/г); ось X: КН?Р0, Сг/л); ось Y: СПК Смоль/г*час).

ис.5. Cor. glut. АТСС-13032. Ось Z: конверсия субстрата в биомас-у (г/г); ось X: KHpPOi (г/л); ось Y: СБУ (моль/г*час).

яс.6. Cor. glut. АТСС-13032. Ось Z: конверсия субстрата в гл. -ту С г/г); ось X: КН^РОд (г/л); ось Y: СВУ (моль/г*час).

- 20 -

торой достигается максимальная величина весового коэффициента конверсии субстрата в биомассу СО.45 г/г), -равна 0.01 г/л С см.рис.1). Наибольшее значение коэффициента конверсии сахара в глутаминовую кислоту СО. 5 г/г в пределах опытных данных) имеет место при скорости выделения углекислого газа 0. 008 моль/г*час.

Взаимосвязь конверсии субстрата в глутаминовую кислоту и в биомассу, концентрации солей фосфора в культураль-ной.жидкости и удельной скорости выделения углекислого газа при культивировании С. glutamicum ВНИИген - 3144. Характерные особенности поверхностей отклика,которые отража-' ют влияние СБУ и содержания фосфатов в КЖ на соответствующие весовые коэффициенты конверсии субстрата, аналогичны особенностям, отмеченным при анализе взаимосвязи конверсия - СПК - концентрация KHgPO^ С см.рис. 7 и 8). Оптимальное содержание солей,при котором достигается максимальная степень преобразования сахара в биомассу,составляет 0. 01 г/л. Удельная скорость выделения COg, обеспечивающая наибольший коэффициент конверсии субстрата в глутаминовую кислоту, равна 0.008 моль/г*час.

Оптимальные условия для роста продуцентов и биосинтеза глутаминовой кислоты при изменении численных значений - параметров в пределах экспериментальных данных. Результаты анализа поверхностей отклика коэффициентов конверсии на изменение СПК, СБУ и содержания фосфатов в КЖ, можно представить в виде таблиц.

'ис.7. Cor.g1ut.ВНИИген-3144. Ось Z: конверсия субстрата в биомассу (г/г); ось X: КН2Р04 (г/л); ось Y: СБУ Смоль/г*час).

ис.а. Cor. glut. ВНИИген-3144. Ось 2: конверсия субстрата в гл. -ту (г/г); ось X: КН2Р04 Сг/л); ось Y: СБУ (моль/гхчас).

1. Corynebacterium glutamicum ВНИИген - 3144.

Рост. Таблица 3

Коэффициент конверсии О/.) Концентрация КН2Р04 Сг/л) СБУ о единицы веса биомассы Смоль/гБ*час) СПК единицей веса биомассы Смоль/гБ*час) Дыхательш коэффицие] С МОЛЬ/МОЛ!

70 0.015 0.03 0.046 0. 652173!

Биосинтез. Таблица 4

Коэффициент конверсии С«) Концентрация КН2Р04 С г/л) СБУ с единицы веса биомассы С моль/гБ*час) СПК единицей веса биомассы С моль/гБ*час) Дыхательн коэффицие С моль/мол

75 0.04 0.015 0.026 0.576923

2. Corynebacterium glutamicum АТСС - 13032.

Рост. Таблица 5

Коэффициент Концентрация СВУ с единицы СПК единицей Дыхатель*

конверсии КН2Р04 (г/л) веса биомассы веса биомассы коэффицие

(50 (моль/гБ*час) (моль/гБ*час) (моль/мо;

45 0.01 0.018 0.016 1.125

Биосинтез. Таблица 6

коэффициент Концентрация СВУ с единицы СПК единицей Дыхательный

конверсии КН2Р04 (г/л) веса биомассы веса биомассы коэффициент

(.%) (моль/гЕ*час) (моль/гБ*час) (моль/моль)

50 0.05 0.008 0.008 1

Выводы

Динамическая коррекция состава питательной среды по со-■ржанию фосфатов стимулирует биосинтез глутаминовой кис->ты . обоими исследуемыми штаммами. Для мутантного штамма •от технический прием позволяет в 2.5 раза повысить ско-ють биосинтеза продукта в стадии роста, и дает возможно-ъ за 42 часа ферментации получить концентрацию глутами->вой кислоты в культуральной жидкости 60 г/л.

Установлено, что природный штамм СогупеЬас1ег1ит д11Л.а-сит АТСС - 13032 за 45 часов ферментации может синтези-вать 46 - 65 г/л глутаминовой кислоты без использования .В или антибиотиков для повышения проницаемости клеточной ■мбраны. Имеющиеся до сих пор технологии получения глута-:новой кислоты при помощи аналогичных природных штаммов -едусматривают использование специальных агентов, наруша-,их нормальную структуру мембраны и клеточной стенки, по-ольку в обычных условиях при росте на мелассных средах ксимальная концентрация глутаминовой кислоты в КЖ соста-:яет 8-12 г/л.

Обработка данных экспериментов позволила выявить значе-

ния удельных скоростей потребления кислорода,выделения углекислого газа, дыхательного коэффициента и сверхлимитиру-ющей концентрации фосфатов в среде, оптимальные для роста и биосинтеза целевого продукта. Полученные результаты дают возможность разработки двухстадийного процесса.

4. Предложен метод анализа экспериментальных данных, позволяющий количественно оценить совместное влияние концентрации фосфатов в среде и параметров, характеризующих дыхание микробной культуры на конверсию субстрата в биомассу и в целевой продукт.

5.^ Полученные результаты, касающиеся продукции глутамино-вой кмсйоты природным штаммом С. д1и1аписит АТСС - 13032, подтверждают гипотезу Мургова. и Балицкой о возможности компенсации кислородом негативного влияния биотина, содержащегося в мелассе.

Основные положения работы отражены в следующих публикациях

1.'Э.Ш.Еникеев. Влияние солей фосфора на биосинтез глута-миновой кислоты при культивировании СогупеЬас1ег1ит д1и1а-пЦсит ВНШген - 3144 на мелассных средах. Передовой производственный опыт медицинской промышленности, рекомендуемый для внедрения, 1991, N 11 - 12, -с. 1 - 5.

2. Э.Ш.Еникеев. Поиск оптимальных параметров культивирования продуцентов глутаминовой кислоты. Биотехнология С в печати) .