Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологический синтез L-аргинина с использованием генно-инженерного штамма Escherichia coli LGE-28

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологический синтез L-аргинина с использованием генно-инженерного штамма Escherichia coli LGE-28"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК АРМЕНИИ _ _ „ , ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

РГь у я

На правах рукописи

СЕВОЯН Гарегин Геворгович

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ШТАММА ESCHERICHIA COLI LGE-28

Специальность - Биотехнология O^.oo.^v-

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Абовян - 1995

Работа выполнена в НИИ Биотехнологии Министерства промышленности РА.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник A.C. Зурабян

Официальные оппоненты:

член-корреспондент ИА Армении, доктор биологических наук, профессор Ж. И. Акопян

кандидат биологических наук JL С. Маркосян

Ведущая организация:

Ереванский государственный университет, кафедра физиологии растений и микробиологии биологического факультета

Защита диссертации состоится " 2.? " ОЕТ-Яс^З 1995 г.

в часов на заседании Специализированного Совета0! ^Институте

микробиологии HAH Армении по адресу: 378510, Республика Армения, г. Абовян, Арзнинское шоссе.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии HAH Армении.

Автореферат разослан " " Сви1995 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, л

кандидат биологических наук Л. А. Пивазян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность вопроса. Микробиологическое производство аминокислот является одной из ведущих отраслей современной биотехнологической промышленности. Дальнейшее ее развитие обусловлено уровнем знаний по получению и применению новых перспективных продуцентов аминокислот, разработкой эффективных путей управления их биосинтезом, а также выработкой новых препаративных форм.

Мировой уровень производства аминокислот е высокоразвитых странах высок. В Армении создана достаточно крупная микробиологическая промышленность аминокислот. В республике усилиями большого коллектива специалистов были созданы крупномасштабное производство кормового лизина и мелкомасштабные производства некоторых аминокислот: пролина, валина, гистидина, фенилаланина, аргинина и др.

Аргинин находит широкое применение в медицине, особенно в

составе инфуэионных растворов для лечения рака крови, до- и послеоперационного лечения больных, при лучевой болезни и как крово-заменитель, в пищевой промышленности и в сельском хозяйстве [Levere et а!.. 19913. Промышленное производство L-аргинина в мире преимущественно основано на микробиологическом синтезе. В СНГ крупномасштабное производство L-аргинина отсутствует, в то ж время потребность в этой аминокислоте все растет.

Дели я задачи исследования. Основной целью данной работы является изучение физиологических характеристик штамма-продуцента L-аргинина Escherichia coli LGE-28 СПетросян и др. ,19943, сконструированного в НШ Биотехнологии МП РА . и разработка оптимальных технологических параметров, обеспечивающих сверхсинтез L-аргинина в ферментаторе.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие конкретные задачи:

- разработка и оптимизация составов посевных и ферментационных сред для культивирования продуцента в лабораторных и опытно-промышленных условиях;

- разработка условий культивирования, применение и хранение посевного материала, обеспечивающих максимальный выход L-аргинина;

- оптимизация параметров стерилизации посевных и ферментационных сред, обеспечивающих рост биомассы и интенсивную продукцию L-аргинина;

- обоснование материально-энергетического баланса культуры Е. coli при биосинтезе L-аргинина, с определением путей, обеспечивающих наиболее высокий выход L-аргинина, с наименьшей затратой субстратов для повышения экономического коэффициента;

- изучение влияния различных технологических параметров (pH, температура, аэрация ) на биосинтез L-аргинина и разработка оптимальных условий для сверхсинтеза.

Научная новизна. Впервые разработан микробиологический способ получения L-аргинина с использованием генно-инженерного штамма-продуцента Е.coli LGE-28, сконструированного в НИИ Биотехнологии МП РА.

Разработаны оптимальные посевные и ферментационные среды, условия их стерилизации и культивирования, которые обеспечивают, как максимальный рост культуры, так и сверхсинтез L-аргинина.

Обоснован материально-энергетический баланс культуры Е. coli при биосинтезе L-аргинина и для кавдого пути биосинтеза вычислены некоторые коэффициенты оценки процесса.

Практическая значимость. На основе полученных данных разработаны лабораторный и опытно-промышленный регламенты получения L-аргинина, что дает возможность развернуть как опытное, так и крупномасштабное производство, с обеспечением выхода целевого продукта до 35 г/дм3, что находится на уровне современного производства в развитых странах.

Опытно-промышленный регламент используется для организации производства L-аргинина на Воронежском заводе кровезаменителей.

Основные положения, выносимые на защиту:

- генно-инженерный штамм Е.coli LGE-28 является высокопродуктивным продуцентом L-аргинина, обеспечивавшим в оптимальных условиях биосинтез целевого продукта в пределах 35 г/дм1 ;

- на процесс биосинтеза L-аргинина определяющее влияние оказывают сахароза, рыбный гидролизат и источники фосфорного питания;

- экономический коэффициент процесса биосинтеза L-аргинина находится в прямой зависимости от активности ШТ-карбоксилазы и/или "яблочного фермента" и в обратной - от активности изоцит-ратлиазы;

- режимы стерилизации, соответствующие значениям критерия стерилизации, равному 33-100, обеспечивают гарантированную стерильность, причем наиболее эффективной может считаться высокотемпературная стерилизация с кратковременной выдержкой;

- регуляция рН среды в процессе биосинтеза L-аргинина при помощи аммиачной воды снимает ингибирование по азоту и приводит к увеличению накопления целевого продукта в культуральной жидкости;

- биосинтез L-аргинина наиболее продуктивен при 31° С.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены

на Ученом совете НИИ Биотехнологии Г Ереван. 1S93] и производственном совещании лаборатории микробиологической технологии совместно с лабораторией селекции продуцентов биологически активных веществ НИИ Биотехнологии [Ереван, 1995].

Публикации. Основные результаты исследований изложены в 7 публикациях, в том числе 1 авторское свидетельство.

Структура и__объем работы. Диссертация состоит из введения,

обзора литературы, экспериментальной части, згислючении, выводов, практических предложений и списка литературы. Работа изложена на V" страницах машиннописного текста, иллюстрирована 25 рисунками и 15 таблицами. Список и^польосбоннсй литературы включает 101 наименование.

'"»с—' литературы обобщает современное состояние вопроса о биосинтезе L-аргинина, используемых штаммах-продуцентах и питательных средах с критическим рассмотрением влияния факторов внешней СРеДЫ И уЛПЛ1>т,Л ;

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований явился штамм-продуцент L-аргинина Е.coli LGE-28. Игамм требует для своего роста L-метионин и L-тре-онин, характеризуется устойчивостью к канамицину, обусловленной

орр 23

присутствием плазмиды Р . Отличительной особенностью штамма является его способность продуцировать L-аргинин на средах, содержащих сахарозу в качестве единственного источника углерода, что обусловлено присутствием плазмиды Р ^^ геном леваназы.

Культивирование штамма-продуцента проводили на разработанной нами питательной среде в колбах Эрленмейера емкостью 750 см^на качалке с числом оборотов 220-240 в минуту и в лабораторных ферментаторах марки АНКУМ-2М и АК-210 с рабочими объемами 7,0 дм3. Промышленные испытания проводили в ферментаторах емкостью 2,0 м3.

Содержание L-аргинина и сопутствующих аминокислот в культу-ральной жидкости (КЖ) определяли на автоматическом аминокислотном анализаторе AAA 339 (ЧССР), методами бумажной и тонкослойной хроматографии, для определения L-аргинина использовали также метод Сакагучи.

Содержание молочной кислоты в КЖ определяли спектрофотометри-ческим методом, содержание углеводов - методом Бертрана; содержание азота - методом Кьельдаля.

' О количестве биомассы судили по величине оптической плотности клеточной суспензии КЖ (ФЭК-56, кювета 5 мм, TV- 540 нм). Количество жизнеспособных клеток определяли высевом суспензии на мяео-пептонный агар в чашках Петри.

Объемный коэффициент массопередачи кислорода определяли методом статической дегазации.

Для оценки эффективности режимов стерилизации использовали аналитический метод расчета безразмерного критерия стерилизации.

Для определения состава ферментационной среды использовали план дробно-факторного эксперимента (Д39-26~5. Выделенные существенные факторы исследовались методом симплекс-решетчатого планирования (диаграммы "состав-свойства").

- -- - 7 -

:• :-;::-у.~ыл7г," исследований и обсуждение

Материально-энергетический баланс при биосинтезе Ь-аргинина. Перед физиологами, селекционерами и биотехнологами всегда встает вопрос - каковы максимальные возможности штамма-продуцента при продукции целевого продукта на грамм субстрата, потребности в АТФ, в кислороде и др. Перспективным направлением является рассмотрение баланса веществ и энергии с учетом конкретных метаболических реакций (Мишкевич, Ерошин, 1976; 31оии1апюг, 1977; Тома и др. 1980).

На рис. 1 приведены краткие пути биосинтеза аргинина.

Основным предшественником аргинина является глутамат, который может синтезироваться в результате функционирования цикла трикар-боновых кислот, глиоксилатного шунта и/или карбоксилировалия фос-фоэнолпирувата. Принимая во внимание несколько разумных предположений, для приведенных вариантов составлены уравнения баланса углерода, азота, кислорода и водорода.

На основании расчетов по полученным уравнениям составлена таблица 1.

Таблица 1

Основные коэффициенты теоретических уравнений баланса при биосинтезе аргинина

Путь биосинтеза

Субстрат Ур

Го

рг

Р02 ДК С: 0 Тепловыд. Тепловыд.

на моль на грамм

продукта субстрата Па-,г мольС0 мол^у.; ккал ккал

ГСу б. мольо^ МОЛЬр 2 МОЛЬ л 2 мол^рг Гсуб

А,В,С' глюкоза 0,90 180,87 0,48 1 0,89 103,90 0,54

А' 0,87 146,22 0,58 1 1,07 128,52 0,64

в' 0,87 151,57 0,56 1 1.04 123,98 0,62

с 0,93 237,07 0,32 1 0.71 79,27 0,42

D ацетат 0.73 69,60 0,80 1 0,63 270,00 1,13

D' 0.70 62,46 0,82 1 0,67 300,89 1,21

А глкзкоьа--2 ФЭП-

I

пирдат-

_ О А—г-—- ¿мтогл*—, глу——ь н—^арг

А глюкоза--2ФЭП-

Ь 1,5Глкжо1й-^Ьач-КоА

кетоглу_,т,череь пт ^

го-

2.0А->-Ймалггг«—сукчуют

Б 1,5 глижоза—2игочит

го-

ЯОА-— 2 палат*— сукчинат С Глюкоза-->■ ац-КоА-

малат-

'ОА-

>•<*-Кетоглу.—сГлу

»¿-кетоглу __п\у

череъ глн

чере$ НИ*

•арг

*арг

-эрг

с' глюкога---ацЛА-,—и-^тоглу-„глу-Л!1^—

гл&глт-

>-ОА-

Л Ъ ацетат-

•3 ачХА—зг-^Ячзодат— ¿-кетоглу —ГЛЬ) — рез

\ /г0~—I

У I

20А--2маш-«—су*иинат

чеРеь глн

Я0А-<--2 мают«— сукцииат

Рис. 1. Неполный материальный баланс разных путей биосинтеза аргинина. Сокращения: ФЗП - фосфоэнолпируват, ОА - ок-салоацетат, ац. КоА - ацетил КоА, кетоглу - сС- ке-лутарат, глу - глутамат, глн - глутамин, арг - аргинин, ГО - глиоксилат, изоцит - изоцитрат.

---- 9 - -----------

Из полученных результатов следует, что для синтеза аргинина глюкоза является более предпочтительным источником углерода и энергии, чем ацетат. Это выражается в более высоких коэффициентах продуктивности, меньших затратах кислорода и более низком тепловыделении.

При сравнении разных путей синтеза аргинина из глюкозы, можно заметить, что пути А, В, С, С* имеют определенное преимущество по сравнению с путями А', В'. Следовательно, для повышения эффективности биосинтеза Ь-аргинина из глюкозы, целесообразно генетическими или физиологическими приемами повышать активность.<ЮП-кар-боксилазы и/или декарбоксилирующей малатдегидрогеназы ("яблочного фермента"), либо уменьшить активность изоцитратлиазы.

Выращивание посевного материала для биосинтеза Ь-аргинина.

С целью приготовления посевного материала использовали питательные среды, содержащие различные источники углерода и ростовые факторы. В качестве источника углерода использовали разные концентрации сахарозы и мелассы, а в качестве ростовых факторов -разные концентрации белково-витаминного концентрата (БВК), дрожжевой экстракт, концентрированный рыбный гидролизат (РП). кукурузный экстракт.

В конечном виде выбранная посевная среда имеет следующий компонентный состав, (г/дм3): сахароза - 20,0 - 30,0: концентрированный рыбный гидролизат - 70,0 - 80,0; канамицин - 0,04 - 0,05; мел - 15.0 - 20,0.

При выращивании посевного материала на этой среде макеималь-

1 9

ная удельная скорость роста равна 0,77 час . титр клеток - 4,2'10

кл/см3, число генераций - 8,77, минимальное время генерации на 10

-ом часу 54,35 мин, экономический коэффициент - 2Д'1о"кл/час.

В промышленных условиях сахарозу заменяли более доступным сырьем - мелассой, в качестве единственного источника углерода, оптимальная концентрация которой составляет 40-60 г/дм3.

Результаты опытов по биосинтезу I-аргинина в зависимости от количества и возраста посевного материала показали, что максимальное накопление целевого продукта в КЖ наблюдается при засеве питательной среды посевным материалом, выращенным в течение 16-20 часов в количестве 2-10% от объема среды.

Изучено также влияние хранения посевного материала, что имеет особенно важное значение в опытно-промышленных условиях. Хранение проводили при температуре 5-8° С. Опыты показали, что выращенный посевной материал можно хранить до 3-х суток, при снижении выхода Ь- аргинина всего на 10%.

Оптимизация состава ферментационной среды для биосинтеза Ь-аргинина. Исходные данные о концентрации компонентов среды и диапазоны их варьирования получены при селекции штамма-продуцента. Содержание сернокислого аммония в ферментационной среде изначально больше 28 г/дм2* приводит к задержке роста и замедлению биосинтеза Ь-аргинина, а концентрация карбоната кальция в пределах 25-50 г/ди'не влияет на рост и биосинтез продуцента, так как карбонат кальция добавляется только для поддержания рН среды. Поэтому при разработке ферментационной среды концентрация аммония сернокислого составляла 28 г/дм1, а карбоната кальция - 25 г/дм3.

Для определения состава ферментационной среды была осуществлена следующая логическая последовательность исследований. На первом этапе выделялись факторы (компоненты) среды, существенно влияющие на выход целевого продукта. Выделенные существенные факторы исследовались методом симплекс-решетчатого планирования (диаграмма "состав-свойство"), на основании чего была реализована задача определения зависимости выхода целевого продукта от состава .ферментационной среды.

В наших исследованиях использовали план Концентрации

факторов варьировали в следующих интервалах (в г/дм5): сахароза -55,0 - 75,0; РП - 5,0 - 35,0; Ь-метшнин - 0,05 - 0,25; Ь-треонин - 0,05 - 0,25; КНаР04 - 1,0 -3,0; ^ЗО^Н^О - 0,5 - 2,5.

В качестве критерия оптимизации выбран выход Ь-аргинина (г/дм3) в КЖ (у).

Из полученных данных рассчитаны коэффициенты регрессивного уравнения:

у=11,17+0,53х4 -1,23ха- 0,01 х3 - 0,03х4 - 0,57х5 +0,03х6 (1)

Регрессионный анализ показал, что коэффициенты , вг и в5 значимо влияют на выход аргинина, а коэффициенты в3, в4 и ве -не значимы.

и

Для дальнейшего исследования выбрали компоненты (факторы) среды: сахароза, РП и КН2РО4, а остальные факторы (ввиду их незначимости) оставлены в средних значениях.

Для определения зависимости выхода целевого продукта от состава среды в настоящее время"наибольшее применение получили симплекс-решетчатые планы, предложенные Иеффе.

При планировании эксперимента для решения задач на диаграммах состав-свойство предполагается, что изучаемое свойство является непрерывной функцией аргументов и может быть с достаточной точностью представлено полиномом.

Из полученных результатов были рассчитаны коэффициенты полинома:

у=15,4x^+8,9x^+13,6х3-2,25х1 х2+7,2х1+0,45хах3 +6,Зх{ хг(х^- х^)--2.7Х{Х5(Х1- Х^)-10.,35Х^Х1(Х!1- х5)+4,5х1х^х^ (2)

Моделирование эксперимента по полученному полиному позволило построить изолинии выхода Ь-аргинина в зависимости от состава среды, представленные на рис. 2.

Рис. 2. Изолинии для полинома третьего порядка.

Цифрами написаны выход аргинина в г/дм^ . х^ - сахароза, х^- РП, х^- КН2.РО4.

Таким образом, разработанная нами питательная среда для биосинтеза L-аргинина имеет следующий состав (в г/дм3): сахароза -61,0 - 73,0; РП - 5,0 - 8,0; KHgPO^-l.S - 2,4; MgSO^HjO - 1,5; (NH^SO^- 28,0; L-'метионин - 0,15; L-треонин - 0,15; СаС03-25,0.

В целях удешевления ферментационной среды проверяли возможность биосинтеза L-аргинина на средах, содержащих мелассу, гидро-лизат БВК и кукурузный экстракт.

Опыты показали, что даже при частичной замене сахарозы на мелассу наблюдается снижение выхода L-аргинина. Это можно объяснить тем, что с увеличением концентрации мелассы, увеличивается и концентрация ингибиторов биосинтеза L-аргинина.

Использование гадролизата БВК и кукурузного экстракта (отдельно) в качестве источника факторов роста обеспечивает хороший рост культуры, однако ее биосинтетическая активность при последующей ферментации низка.

После оптимизации состава ферментационной среды нами было исследовано влияние биотина на активность продуцента, исходя из двух соображений. Во-первых, в присутствии биотина внутриклеточная концентрация глутаминовой кислоты повышается, но при этом плазматическая мембрана препятствует выходу этой аминокислоты из клетки , а глутаминовая кислота является предшественником аргинина. Во -вторых, как видно из материально-энергетического баланса (табл.1), наиболее эффективными путями для биосинтеза L-аргинина являются пути, включающие декарбоксилирующие стадии и биотин может положительно влиять на процесс.

Опыты показали, что при добавлении биотина в ферментационную среду от 300 до 700 мкг/дм^ выход L-аргинина повышается на 12%.

В процессе культивирования в лабораторных и опытно-промышленных условиях в ферментационную среду добавляется также пеногаси-тель пропинол Б-400, из расчета 0,3 - 0,5 г/дмг.

Стерилизация питательных сред при биосинтезе L-аргинина. Для выбора эффективного режима.тепловой обработки питательной среды были исследованы различные температурные режимы стерилизации. Температуру стерилизации меняли от 120 до 130°С с интервалом 5°. Продолжительность выдержки рассчитывали с учетом того, что значение суммарного критерия стерилизации должно соответствовать 80-100.

- В результате-проведенных исследований"показано, что" чем выше температура стерилизации и соответственно меньше продолжительность воздействия теплового поля на среду, тем в меньшем количестве образуются редуцирующие вещества, являющиеся продуктами термического разложения сахарозы.

На образование редуцирующих веществ большое влияние оказывает исходное значение рН среды,- с увеличением рН накопление редуцирующих веществ уменьшается. Так, при рН 7,0 - 8,0 и в режиме стерилизации 130° С без выдержки редуцирую®?« веврсгв практически не образуется.

При тех же режимах производили изучение влияния стерилизации на качество сред для роста и биосинтеза.

В результате исследований был подобран оптимальный режим стерилизации (130°С без выдержки, при этом критерий стерилизации -80 - 100, при исходном значении рН среды 6,5 - 7,5), позволяющий в дальнейшем эффективно проводить как выращивание культуры, так и процесс биосинтеза.

Влияние факторов внешней среды на биосинтез Ь-аргинина. Реакция среды. Использование для биосинтеза Ь-аргинина питательной среды, содержащей мел, нежелательно, так как на стадии выделения и химочистки возникают большие затруднения. Поэтому нами были проведены исследования по исключению из состава ферментационной среды мела.

При подборе титранта наш выбор был остановлен на аммиачной воде, исходя из двух соображений: первое - в процессе ферментации происходит зачисление среды, во-вторых - регулированием рН среды аммиачной водой постепенно увеличивается и содержание азота, что тоже очень важно в процессе ферментации.

Весь процесс был разделен на две стадии: стадии роста культуры и стадии биосинтеза. Критерием для подбора оптимального значения рН по фазам являлись время накопления максимального количества биомассы и удельная скорость биосинтеза (рис.3).

Как видно из рис.3, наименьшее время для накопления максимального количества биомассы наблюдается в довольно широких пределах рН среды - 5.5 - 8,0, а оптимум рН для максимального значения удельной скорости биосинтеза - 7,0.

Время g час г/дм.ч

25 % 0.5

20 1 Q4-

<5 g 0.3

S

о

ш X

о

5

О)

СС >>

5

?

8

3

рн

Рис. 3. Зависимость времени накопления максимального количества биомассы и удельной скорости биосинтеза от разных значений рН среды. 1-время, 2-удельная скорость биосинтеза

Так как в процессе ферментации добавляется аммиачная вода и тем самым увеличивается содержание азота, то необходимо снизить начальную концентрацию азота в питательной среде. Подбор начальной концентрации азота проводили экспериментально. Было установлено, что оптимальная начальная концентрация составляет 15 г/дм3 аммония сернокислого.

Влияние температуры. Наш были исследованы различные фиксированные значения температуры в течение всего процесса и установлено, что- максимальное накопление аргинина наблюдается при 31° С. Поскольку оптимальная температура для роста Е. col i 37° С, были проведены эксперименты с варьированием температуры на разных этапах процесса. Опыты показали, что варьирование температуры в течении процесса приводит к снижению уровня накопления L-аргинина по сравнению с процессами биосинтеза с фиксированным 31°С значением температуры. По-видимому, рост при более низкой температуре ведет к нарушению нормальной регуляции синтеза ферментной системы, участвующей в образовании L-аргинина и/или -транспорта через плазматическую мембрану.

Влияние кислорода.- На разработанной нами ~ питательной среде при температуре 31+1°С, рН 7,0+0,1. максимальный выход Ь-аргинина наблюдается при скорости растворения кислорода 3,7 г Ог л/ч. Отклонение изучаемого параметра как б сторону уменьшения, так и в сторону увеличения отрицательно влияет на процесс.

Далее для изучения влияния аэрации на биосинтез 1-аргинина на разных фазах процесса, исследовали потребление кислорода продуцентом в течении всего процесса и установили, что наиболее высокое потрр^ловиа ~ роста культуры, а ПО ходу проиессч бноеиктега истребление уменьшается.

По изменению потребности кислорода вычислялись значения коэффициента массопередачи (К^а). Максимальное значение К^а в точке, соответствующей наиболее высокому значению потребления кислорода по расчетам составлял 220 , а минимальное - 80 ч"1.

Предварительно были исследованы массообменные характеристики аппарата (К|_а) при помощи метода статической дегазации азотом при различных режимах аэрации"перемешивания.

Исхсля из вышесказанного были подобраны режимы, которые лри-

оначением KLa. 1 - Ktja, 2 - выход молочной кислоты,

3 - еыход L*аргинина по разработанным значениям Кца,

4 - выход I,-аргинина лркК^а ?Г0 ч_1в течении всего процесса.

Как видно из рис.4, по разработанным значениям К^а выход L-аргинина повышается до 35 г/дм3, что на 10-12% выше, чем при фиксированном значении К^а 220 ч"', а энергозатраты снижаются примерно на 15% (заштрихованная часть рис.4). При этом концентрация молочной кислоты не превышает 2,0 - 2,5 г/дм3.

Таким образом, в результате проведенных исследований были оптимизированы посевные и ферментационные среды, режимы их стерилизации, а также условия культивирования, обеспечивающие высокий выход L-аргинина. На основании этих исследований были разработаны лабораторный и опытно-промышленный регламенты по процессу биосинтеза.

ВЫВОДЫ

1. Впервые в странах СНГ разработан микробиологический, способ получения L-аргинина с использованием штамма-продуцента Е.coli L6E-28, который обеспечивает выход целевого продукта до 35 г/дм3 в культуральной жидкости.

2. Разработаны и оптимизированы составы посевных и ферментационных сред для культивирования штамма-продуцента L-аргинина. Установлено, что на процесс биосинтеза L-аргинина в исследованных пределах значимо влияют сахароза, концентрированный рыбный гидро-лизат и источники фосфатного питания.

3. Составлена теоретическая модель материально-энергетического баланса культуры Е. col i при биосинтезе L-аргинина и вычислены экономический, дыхательный и другие коэффициенты, характеризующие Процесс. Установлено, что для получения высоких значений экономического коэффициента надо повысить активность ФЭП-карбоксилазы и/ или "яблочного фермента", либо уменьшить активность изоцитратлиа-зы.

4. Оптимизированы условия стерилизации посевных и ферментационных сред и установлено, что режимы стерилизации, соответствующие значениям критерия стерилизации, равному 80-100, обеспечивают гарантированную стерильность, и наиболее эффективной может считаться высокотемпературная стерилизация с кратковременной выдержкой.

______ - - - 17 - ----

5. Разработан способ регуляции рН среды в процессе биосинтеза Ь-аргинина при помощи аммиачной воды, что приводит к увеличению накопления Ь-аргинина в культуральной жидкости в результате преодоления ингибирования по азоту, со значительным улучшением процессов выделения и очистки этой аминокислоты.

6. Оптимизированы условия культивирования штамма-продуцента и установлено, что для биосинтеза Ь-аргинина наиболее продуктивным является ведение процесса при 31° С. что обусловлено нарушением регуляции биосинтеза Ь-аргинина, возникшим в результате конструирования штамма и нарушением мембранного транспорта.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практической реализации на предприятиях микробиологической промышленности Республики Армения и стран СНГ для производства L-аргинина предлагаются:

- генно-инженерный штамм Е. cob LGE-28 с выходом целевого продукта в пределах 35 г/дм3;

- опытно-промышленный технологический регламент на производство L- аргинина.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Матвеев В. Е. , Акопян 3."М. , Аксеновская Е Е. , Петросян Л. Е. , Севоян Г. Г., Варданян А. А. Стерилизация питательной среды в производстве пролина. // Биотехнология. - 1986, - N6. - с. 52-55.

2. Лабораторный регламент на производство выеокоочищенного L-аргинина моногидрохлорида ( Руководители разработки Саканян В. А. и Асатрян Л. С. , исполнители Овсепян А. С. , Петросян П. К , Зурабян А. С., БрутянР. А. . Севоян Г. Г. и др. ) N 64-1761-03-88, Ер., НИТИА, утв. 29.06.83.

3. Опытно-промышленный регламент на производство L-аргинина гидрохлорида выеокоочищенного (Рук. разработки Севоян Г. Г.). Ер., НИТИА, N 23-93, утв. 10.12.93.

4. Патент РА. Рекомбинантная плазмидная ДНК Р , кодирующей синтез N-ацетилглутаматсинтетазы, способ ее конструирования и штаммпродудент L-аргинина Escherichia coli LGE-28/Петросян П. К. , Овсепян А. С. , Зурабян А. С. , Товмасян Г. Г, Севоян Г. Г. , Саканян В. А., Брутян Р. А. // Положительное решение 000192 от 06. 05. 94.

5. Оптимизация состава ферментационной среды для биосинтеза L -аргинина / Севоян Г. Г. , Зурабян А. С. , Марджанян Г. Г. , Деп. 03.04.95, N7. Арм. НИИНТИ, Ереван, 1995.

6. Материально-энергетический баланс при биосинтезе L-аргинина микробиологическим способом / Севоян Г. Г. , Зурабян А. С. Деп. 03.04.95, N8. Арм. НИИНТИ, Ереван, 1995.

7. Севоян Г. Г. , Зурабян А. С. , Брутян Р. А. Регулирование pH среды при ферментации L-аргинина для преодоления ингибиции синтеза азотом // Биолог, журн. Армении. - 1995. -Т. 48. -N2.

1ИГФПФЦЛФР

Ч-шрЬф'й 4-binpq}i Ubinjuft L-Uptjfiüfi'iifi йшйрЬшршйш^шй ufiüpbqp Escherichia coli LGE-28 цЬЬшйшрфшрик}[1фш[р1ш gqiunifi oqtpuiqnpötlunlp

Puiuunfi ршаЬр' Ь-шрц^й-фЬрйЬйфшд^ш-йшйрЬшршИрий ufiiipbq-uipbplnfiquigjiui

Ilpqfitifiiip [ицй Щ1[иштц»|П1Й nitifi pdg^nipjmti übg, hunplpjuujbu шщий ijinjinjupfitmn hbunüjübpfi ршг^ия^ш^шцйЬрпиЗ ipuippbp hfii(uriu}iupjni№hpfi pnirfduiü htuiiuip, ' fiüjqbu üuibi

uttöijuq^niftuipbpnipiniimul bi q[ninunptnpbunqjiuxti dbg:

UflK-ji bplflitibpruü uniuigfiti uüquiü U2tül[t(b[ t aipqfiü[it)[i шршдйшй йшйр{;шршйш1[шй Ьцшйих^р, aqipuiqnpöb[ni[ (^ЬйиилрЬ^йп^пфшф Ч-<Ь-пи> шршдфи& Escherichia coli LGEt28 ¿qiunip, npp ЬЬшрш1[пр1ир{тй fc (рш[|ш la фпрЯшршрш^щЬ, bi иЬ&ш&ш![ш[ u^iipunjpnipinttiiibp, иш;шЬп[{Ь|Г1![ йциярш^шфЬ ijLpgujtijnLpji 6{iüjbL 35 q/rjü3 b^p:

Мшфшр1[ш& mg)uuflfniftpiibp{i h|n5uiii ijpui ägurtj^fy t диЛриифй hi $bpi5büipuigfinti uiitirjiiiü[igan[m;pbp[i puir[uoipuil[mqüt;p(i ццрприлрпр bL фпрХш-ирршщшЛрий арщйшййЬрпи!: Smjg t qipijb|, np uqiqfiüfiiiji IjbüuujufiiiphqJi ijjiui numuiiiuiujiptjuiö üjiguilpujpbpnu5 tibö

tuqijhgnqäjniti bü pnqtmui uujjuuipnqp, ¿[piuqfiti hjiqpnifiqimpQ bi фпифпр{1 ия\Р1пФ0:

Он;ф[1Йшд1{Ь^ Ь дшТфишфй 1н фЬрйЬйфшфпй и№г]шгё}12[ш{ш[рЬ]ф ифЬр^цшдйий цицйшй'йЬрр. прр ши]шПт|пи1 !; шйц Ь1

шр^Тф^ф (ЛфЫпф^ шрфипртррЛр: 'ПшрцфЬ^ пр ифЬр^цшфиЛ

шцшЬт^фий Ь ¿шфийф;ф 80-100 шр1!Ьр}г цЬидниЛ. 1ш1]

шйЬйшршрКшршфр 1)пцфгнршф изб)! Ьа шрф'й^гёф и(ЛрЬц}1 Ьшйшр г)ш ршрХр ^Ьрйишф^бшйшфй пЫ}]йй I ¡ф^ [)ш1шЛш1ри| Ф^И ¡>Ьр|5илир}и5иЛти5 ириЬЬ^пф.

МищЛ!^ Ь шрфй{1й}1 [[ЬЬшпфйрЬгф й^трш-ЬйЬрцЬф^шЦшй ^«^¡Ь^гф Ьня^ияпнртйТЛрс 5.со11-|1 Ьпйшр фшррЬр. '¿1ЦЦйцЛЬ[ф

цЬщтй: ййфиЛпф шрфшЬш^т.рртЛйЬрр цтри Ьи рЬрг[Ь[ ^пМдоЬф ¿ЬфшргцЭД фп[ишр!|пи<\й!1р[1д (цЩцт]/. № ш]Ту шг^фйЬрр. прпйр

иш]щЬпфий Ьй шр(фй}Л[1 цтшЩ ршр£р Ьцэ> рф^ {цщйртцаЬр}! {гафш[\ qbnipni.il (фйф(шшч{11{1ш{{шй апрйий(д{1 ш1{Ь[ф ршр<5р шрёЬр), Ьй

фшрркр цлр&иЛфдйЬр, прпйр ийЬрииНггяр Ьй цдтдЬиф фЬршЬи1р1иЛ, Ь[[ф ршр^ршдйшй Ьа ишрр1т[прпи5йЬр[1 дйфртрций ЬиМшр:

Пшпи5йши{1р1[ш& Ь шр(ршр{1й гё^шфицф фшррЬр цпрдпййЬ^ф (рН. 2Ьрйщицфйий. рр([и1сфй) шодЬдтрртйц шрч{1?фй|1 ^ЫшидфйрЬц}» ({риг. 11шрф|ш& Ь пр ^ЬйиияфЬрЬсф Ьшйш]! ша1ш[Ь[ йнршфид^пр Ь 31 С.

¡1и1| рн-ф ЦшрчшфпрпиЗр циЦ^ Ц ¡1рш!{щйшдйЬ[ илМфшЦш^, пр>г йшЬ1

^ршдтд^ ищруир Ь ки шщиЛш{пи! Ь шрц^Ъ^й^ шаипДОг^ ршр^р

Соискатель