Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Escherichia coli методом комбинаторного мутагенеза

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изменение аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Escherichia coli методом комбинаторного мутагенеза"

На правах рукописи

КОТЛЯРОВА Вероника Александровна

Изменение аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Escherichia со// методом комбинаторного мутагенеза.

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2006 г.

Работа выполнена в лаборатории №2 Научно-исследовательского института «Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»).

Научный руководитель:

кандидат химических наук

JI.P. Птицын

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор A.C. Миронов кандидат биологических наук М.А. Эльдаров

Ведущая организация:

Институт биомедиципской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук

заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИНгенетика».

Автореферат разослан « 70 » ноября 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

Защита диссертации состоится « Я »___2006 г. в \Ч 1

часов на

кандидат биологических наук

Г.Г. Заиграева

Актуальность проблемы

В настоящее время аминокислоты приобрели огромное промышленное значение. Область их применения необычайно широка, от использования в качестве компонентов пищевых добавок до создания на их основе лекарственных форм и разнообразной косметики. Современное производство аминокислот исчисляется миллионами тонн в год, а совокупный объем продаж — миллиардами долларов. Очевидно, что стремительно развивающийся рынок аминокислот и продуктов, созданных на их основе будет требовать адекватного увеличения их производства (Bongaerts J. et al., 2001). На сегодняшний день практически безальтернативным способом массового производства большинства аминокислот является их микробный синтез. Эффективность этого биотехнологического процесса во многом зависит от характеристик используемого бактериального штамма-продуцента. В процессе его конструирования необходимо решать множество задач, связанных с различными сторонами жизнедеятельности бактерий. К ним можно отнести оптимизацию экспрессии генов биосинтеза целевой аминокислоты, энергетическое обеспечение биосинтеза, повышение эффективности транспорта в клетку питательных веществ и экспорта целевой аминокислоты в культуральную жидкость, и т.д.

Одним из важнейших аспектов общей стратегии создания штаммов-продуцентов аминокислот и других биогенных молекул является модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов их биосинтеза. Частный случай аллостерической регуляции, ретроингибирование, является одним из основных способов контроля скорости биосинтеза аминокислот и других, биогенных молекул. Этот процесс основан на принципе отрицательной обратной связи, когда продукт биосинтетической цепи подавляет активность фермента, катализирующего первую стадию. Как правило, подобной регуляции подвержены ферменты, катализирующие практически необратимые биохимические реакции. Перераспределяя потоки ключевых молекул между клеточным метаболизмом и синтезом данного вещества (например — аминокислоты или нуклеотидов) в зависимости от его концентрации, эти белки выполняют функцию своеобразных "метаболических клапанов", обеспечивающих клеточный гомеостаз.

Очевидно, что для создания высокоэффективных штаммов-продуцентов аминокислот необходимо конструирование таких мутантных белков, аллостерическое ингибирование которых конечными продуктами реакций было бы нарушено (Jbr, feed back resistance фенотип). Как правило, Jbr фенотип фермента достигается как результат замены одного аминокислотного остатка на другой в одном или нескольких сайтах белковой последовательности.

Поиск и идентификация fbr мутантов всегда являлось достаточно трудоемкой задачей. Эти мутации обычно возникают спонтанно при благоприятных для этого условиях и соответствующей системе отбора (Vyas and Maas, 1963; Гаврилова и соавт., 1988; Di Girolamo et al., 1988). С другой стороны, основываясь на анализе трехмерной структуры белка, можно вводил» те или иные замены аминокислотных остатков, изменяя его кинетические характеристики. Однако, современный уровень понимания структурно-функциональных связей в белках пока еще недостаточен для проведения успешного рационального дизайна ферментов и полученные таким образом мутанты имеют существенно более низкую специфическую активность по сравнению с ферментом дикого типа (например, в случае мутантов фермента SAT, Nakamori et al., 1998; мутантов пантотенат киназы, Rock et al., 2003; мутантов префенат дегидратазы, Hsu et al., 2004).

Таким образом, получение ферментов со снятым ретроингибированием и одновременным сохранением его основных кинетических параметров во многом определяется экспериментальным везением. В этой связи, весьма актуальной представляется задача разработки новых методологических подходов к проблеме получения модифицированных аллостерических ферментов с заданными функциональными параметрами.

Цели и задачи работы

Целью данной работы являлось применение метода комбинаторного мутагенеза для модификации аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы (NAGS) и карбамоилфосфат синтетазы (CPSase) из клеток Escherichia coli.

В ходе работы были решены следующие задачи:

• разработка метода эффективного направленного мутагенеза, позволяющего получать "библиотеку" мутантных генов, кодирующих белки, которые различаются по нескольким аминокислотам в одном заданном участке аминокислотной последовательности;

• получение fbr мутантов NAGS, обладающих высоким уровнем специфической активности и исследование их основных кинетических параметров;

• получение fbr мутантов CPSase, нечувствительных к ингибированию UMP и обладающих высоким уровнем специфической активности;

• применение модифицированных ферментов в процессе создания штаммов-продуцентов аргинина и оротовой кислоты на основе К coli.

Научная новизна и практическая ценность работы

Разработана оригинальная методика эффективного направленного мутагенеза (метод комбинаторного мутагенеза), позволяющего получать библиотеку генов, кодирующих представительную выборку белков, различающихся по нескольким аминокислотам в одном специфическом участке.

Впервые была показана возможность применения данного метода для получения не подверженных ретроингибированию ферментов: HAGS и CPSase из Е. coli. В каждом случае из совокупности мутантных белков удалось отобрать ферменты с заданными свойствами без использования специальных методов селекции.

На примере NAGS показано, что предложенный подход позволяет получать серию мутантов с измененными в широком диапазоне основными кинетическими параметрами ферментов (К^, У max)- Полученная коллекция мутантных белков может быть использована для дальнейших экспериментов по изучению их структуры и функций.

Показано, что полученные с помощью метода комбинаторного мутагенеза мутанты могут быть эффективно использованы при конструировании штаммов-продуцентов аминокислот (нуклеотидов) на этапе оптимизации экспрессии генов аллостерических ферментов, что нашло отражение в соответствующем патенте.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 марта 2005) и на 30-м FEBS Конгрессе - 9-й IUBMB Конференции (30th FEBS Congress -9th IUBMB Conference, Венгрия, Будапешт, 2-7 июля 2005). Диссертационная работа была апробирована на межлабораторном семинаре ЗАО «АГРИ» 18 октября 2006г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы, из них одна в отечественном журнале, два тезисных сообщения в материалах научных конференций и одна патентная заявка.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов и обсуждения, Выводов и Списка литературы. Работа изложена на 103 .страницах, включая 16 рисунков и 12 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 149 источников, в том числе 5 на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы, плазмиды, среды. При выполнении работы использовались следующие штаммы E.coli: TGI, MG1655, В3083 (argA, metB), Вб969(сдг2?::Тп10), B8085 (arg/i::TnlO) которые были получены из музея ФГУП ГНИИгенетика. Штамм-продуцент арганина В7925 (ilvA::Tn5t argR) любезно предоставлен к.б.н. Гусятинером М.М.

В работе использованы следующие созданные ранее, а также коммерчески доступные плазмиды: pMW118 (GenBank/EMBL accession number AB005475), pKK233-2 (Pharmacia), pET22-b(+) (Novagen), pUC19-ArgA (предоставлена к.б.н. Ростовой ЮТ., АГРИ), pBScarAB-13 (предоставлена к.б.н. Ростовой Ю.Г., АГРИ).

В качестве полноценной среды использовали L-бульон или L-arap, в качестве минимальной - жидкую или агаризованную среду М9 с необходимыми добавками. Для обеспечения селективного давления в среду добавляли ампициллин (100 мкг/мл).

Все генно-инженерные манипуляции, проведение Са2+-зависимой трансформации клеток, а также электрофорез белков в ПААГ осуществляли в соответствии со стандартными методиками (Маниатис Т. и соавт., 1984; Laemmli, 1970 ).

Создание библиотек генов. Библиотеки мутантных генов были получены методом ПЦР, с использованием рандомизированных синтетических олигонуклеотидов в качестве праймеров и ДНК интактного гена в качестве матрицы.

Очистка белка. Очистка NAGS и ее производных проводилась согласно методике, одисанной (Marvil and Leisinger, 1977) с модификациями.

Определение активностей ферментов. Активность NAGS в грубых и частично очищенных клеточных лизатах определяли спектрофотометр ическим методом (Meth. Enzymol. 25, 457, 1972). Специфическую активность NAGS в препаратах очищенных белков оценивали по скорости синтеза N-ацетилглутамата из L-глутамата и ацетил-СоА. Абсолютную концентрацию N-ацетилглутамата в реакционной смеси определяли путем разделения ее компонентов с помощью капиллярного электрофореза. Аналогичный подход был использован для исследования активности модифицированных вариантов CPSase в частично очищенных клеточных лизатах. В этом случае, активность фермента определяли по скорости синтеза карбамоилфосфата.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Метод комбинаторного мутагенеза.

В основе метода комбинаторного мутагенеза лежит идея о возможности компенсировать негативное влияние одной аминокислотной замены на активность

фермента за счет одновременного изменения нескольких соседних аминокислотных остатков (Птицын Л. Р. и соавт., 1998). Количество варьируемых аминокислот зависит от конкретного белка и должно определяется опытным путем или на основе структурного анализа исследуемого белка (если это возможно).

С методической точки зрения, для реализации данного метода необходимо уметь эффективно вводить множественные мутации в заданный участок структурной части гена. При этом необходимо получить представительную библиотеку фрагментов ДНК с рандомизированным локусом (т.е. случайной последовательностью нуклеотидов на участке, кодирующем варьируемые аминокислотные остатки), удобную для последующего клонирования. Схема предложенного нами оригинального решения этой задачи представлена на рис. 1. ,

На первом этапе синтезируется специальный олигонуклеотидный праймер Р1 (точнее - библиотека праймеров, однако далее, для краткости, мы будем использовать выражение - праймер Р1), первичная структура которого состоит из трех элементов: 1— полностью (или частично) рандомизированный участок структурной части гена, кодирующий варьируемые аминокислотные остатки; 2 и 3 - 5' и 3' — фланкирующие олигонуклеотидные последовательности полностью гомологичные участкам гена, непосредственно примыкающим к варьируемому локусу. Например, структура типичного праймера для варьирования 5 аминокислотных остатков выглядит следующим образом (5'-15п1-15К-20м-3'). Используя библиотеку праймеров Р1 и

ген дикого типа

Р1 _ +

—» I стадия ПЦР

II стадия ПЦР

"V

1

Р3_ __♦ III стадия ПЦР

—V—

I

Р2

ген с рандомизированным участком

Рисунок 1. Схема практической реализации метода комбинаторного мутагенеза с помощью рандомизированных олиго-праймеров.

олигонуклеотид Р2, проводят синтез библиотеки фрагментов ДНК содержащих рандомизированный локус (рисунок 1, I стадия ПНР). Как правило, в структуру праймера Р2 вводится последовательность уникального сайта рестрикции с целью последующего клонирования полученных мутантных фрагментов ДНК в экспрессионный вектор. Начальные концентрации матричной ДНК и праймеров Р1, Р2 выбираются таким образом, чтобы к концу ПЦР практически все праймеры были израсходованы, а количество синтезированного фрагмента (в молях) превосходило количество матричной ДНК не менее чем в 10 раз. При этом, очевидно, должна быть обеспечена представительность синтезированной библиотеки ДНК фрагментов. Например, упомянутой выше библиотеке Р1 (5'-15пг-15И-20п1-3') соответствует степень вырождения - 415 =1,1х 109. Таким образом, в реакционной смеси должно присутствовать не менее (а реально существенно больше) 10® молекул матричной ДНК (0,002 пмоль) с тем, чтобы обеспечить равновероятный отжиг всех возможных вариантов олиго-праймера в каждом цикле ПЦР. Например, если в качестве матричной ДНК используется вектор размером 5 т.п.н, то в реакцию необходимо добавить как минимум 7 нг плазмидной ДНК.

На втором этапе, одна из цепей амплифицированного фрагмента используется в качестве праймера для амплификации библиотеки одноцепочечных молекул ДНК, содержащих структурную часть гена с рандомизированным участком (рисунок 1, П стадия ПЦР). Для амплификации используется реакционная смесь, полученная на предыдущей стадии. Как правило, проводят 10-20 дополнительных циклов, используя "холодный отжиг" (Т отжига = 37 °С). Время достройки выбирают таким образом, чтобы пролонгировать синтез одноцепочечной ДНК как минимум до 5'-конца структурной части гена или (если это возможно) - до ближайшего уникального сайта рестрикции.

На последнем этапе проводят амплификацию библиотеки ДНК- фрагментов, содержащих структурную часть гена с рандомизированным участком и фланкированных уникальными сайтами рестрикции (рисунок 1, Ш стадия ПЦР). Поскольку в этом случае происходит одновременное праймирование как модифицированной одноцепочечной ДНК, так и интактной матричной ДНК, то в результирующей реакционной смеси будут присутствовать ДНК фрагменты, соответствующие исходному гену. Именно поэтому, на первом этапе амплификации необходимо получать 10 и более - кратный избыток амплифицированного фрагмента по отношению к матричной ДНК. Это позволяет минимизировать представленность интактного гена в полученной библиотеке.

Наличие уникальных сайтов рестрикции позволяет легко клонировать полученную совокупность фрагментов ДНК в подходящий экспрессионный вектор. В результате

получают совокупность плазмид, кодирующих мутантные белки со случайными аминокислотными заменами в строго определенном участке, которые могут быть использованы для дальнейшего отбора функциональных мутантов."

Полная рандомизация нуклеотидного фрагмента гена кодирующего N аминокислотных остатков соответствует библиотеке из 43N генов кодирующих 20н различных вариантов белков. Простой подсчет показывает, что уже при N=4 общее число клонов, включающих в себя полный объем библиотеки рандомизированных белков, составляет около 1,6x103, что создает трудности при их анализе. С другой стороны, интуитивно понятно, что чем больше рандомизированный участок, тем больше вероятность добиться хорошего компенсаторного эффекта за счет увеличения вероятности "взаимогашения" негативных влияний варьируемых аминокислотных остатков. Таким образом, выбирая N достаточно большим, мы с одной стороны, увеличиваем вероятность создания комбинации аминокислотных остатков дающих компенсаторный эффект, а с другой - уменьшаем вероятность обнаружить эту комбинацию из-за возможности анализа только небольшой выборки рандомизированных генов. Однако достаточно большой опыт применения метода комбинаторного мутагенеза в нашей лаборатории показал, что при N=5 (3 200 ООО вариантов белка), достаточно лишь небольшой выборки "активных вариантов" модифицированного белка (порядка 102 -103), чтобы получить фермент с достаточно высоким уровнем специфической активности. Термин "активные варианты" в данном случае обозначает мутантные белки, продукция которых способна комплементировать делецию соответствующего интактного гена в штамме реципиенте.

2. Применение метода комбинаторного мутагенеза для изменения аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы из Е. coli.

В качестве первого объекта для модификации методом комбинаторного мутагенеза в данной работе был использован фермент NAGS из Е. coli, катализирующий первую реакцию в пути биосинтеза аргинина. Ретроингибирование этого фермента аргинином создает серьезные проблемы на пути создания высокоэффективного штамма-продуцента этой аминокислоты. Ранее были локализованы две fir мутации (Hisl5Tyr, Tyxl9Cys) NAGS, присутствие которых существенно снижало специфическую активность фермента (Rajagopal et al., 1998). Целью нашей работы было получение fir мутанта NAGS с высокой удельной активностью методом комбинаторного мутагенеза.

2.1. Конструирование рандомизированной библиотеки генов

argA.

Конструирование рандомизированной библиотеки генов argA проводили согласно методу, описанному выше (см. рис. 1). В качестве матрицы была использована плазмида pUC 19-ArgA, несущая инггактный ген argA, а в качестве праймеров олигонуклеотиды PI: 5 ,-cgagggattccgcNN№4M№,WN№^W^^ частично комплементарный последовательности гена argA; Р2, комплиментарный последовательности плазмидного вектора расположенной downstream относительно структурной части гена argA и РЗ: 5'-tgccatggtaaaggaacgtaaaacc-3гомологичный 5'-

Таким образом, нами был полностью рандомизирован 15-ти нуклеотидный фрагмент гена, кодирующий 5 аминокислотных остатков с 15 по 19 включительно. Фрагмент ДНК, кодирующий совокупность

мутантных вариантов

полноразмерного гена argA, был очищен электрофорезом в агарозном геле и обработан эндонуклеазами Ncol (сайт которой включает в себя ATG кодон гена argA) и HindQl. Данный фрагмент был лигирован с вектором рКК233-2, обработанный теми же эндонуклеазами (схема полученной плазмиды представлена на рис. 2). Примерно 150 нг лигазной смеси было использовано для трансформации реципиентных клеток Е. coli штамма TGI, что вело к образованию около 3x103 рекомбинантных клонов.

2.2. Селекция "активных вариантов" модифицированной N-ацетилглутамат синтетазы.

Среди всех клонов штамма TGI (pKKArgA-random) нами были обнаружены несколько более "прозрачных" колоний, имеющих также меньший размер по сравнению с колониями штамма TGl(pKKArgA-wt) (в среднем на 103 колоний нормального "типичного" размера приходилась одна мелкая). Мы предположили, что этот эффект может быть связан с суперэкспрессией гена, кодирующего высокоактивный ,/Ьг-фермент NAGS. В дальнейшем наши предположения подтвердились.

концу последовательности гена argA.

ыа

Рисунок 2. Структура рекомбинантной плазмиды pKK-argA-wt

Для оценку активности мутантных NAGS клеточные экстракты штамма rE.cpli B3083(argA"), несущего рекрмбинантные плазмиды} были обогащены осаждением в 80% растворе сульфата аммония. Активности NAGS оценивали в реакции биосинтеза N-ацетилглутамата в присутствии 5 мМ Ь?арганина и в его отсутствии. Было показано (табл. 1), что специфические активности мутантов NAGS-rlL и.NAGS-rl3 более чем в 2,5 раза превышают активность NAGS-wt при отсутствии его ингибирования. Плазмиды из этих клонов были выделены, и нуклеотидная последовательность гена argA была определена секвешфованием по методу ¡Сэнгера. Специфическая активность других мутантов NAGS-rN (колонии ^ которых имели одинаковый размер по сравнению с колониями штамма TGI (pKKArgA-wt)) была существенно ниже активности фермента дикого типа в неингибированном состоянии. Фермёнт NAGS-41 (содержащий; единственную» заме!1у: Туг 19Cys и описанный как наиболее активный вариант : (Rajagbpal et ¿I.i 1998)) был сконструирован нами посредством сайт-специфического Мутагенеза • и имел существенно более; низкую активность,чемферментДикого типа'.*г --ь . ■ •■••■

Таблица 1. Удельная активность мутантных NAGS в грубых клеточных лизатах. п .

№ клона Аминокислотная последовательность рандомизированного фрагмента NAGS Удельная активность (нмоль мг*1 мин*1) Относ, удельная активность (%)

wt -His-Ser-Val-Pro-Tyr- 1200±28 <10

4 -His-Ser-Val-Pro-Cys- 300±11 91

rll -Val-Val-Trp-Arg-Ala- 3390±75 •г- .....~ 103

г12 -Leu-Phe-Gly-Leu-His- 1220±34 -— 100'

г13 -Ser-Ala-Ala-Ser-Arg- 3120±82 ' 107

* Определялась как отношение удельных активностей фермента в гфйс|Н5гсч^|^ЙЙ.14аргинина и в его отсутствии. ... !§д Щ V"

В присутствии 5 мМ L-аргинина уровень активности - му^ЩлЩ ¿ферментов не изменялся, в то вре^я как фермент дикого типа существенно*? ингибировался аргинином (остаточная активность менее 1/10). Таким образом, применение метода комбинаторного мутагенеза позволило в данном случае отобрать fir варианты целевого белка путем анализ^менее чем 0,2% от числа теоретически возможных вариантов при заданном уровне рандомизации.

4 ' 2.3. Очистка и кинетические свойства мутантных NAGS.

Анализ профиля белков грубых клеточных лизатов полученных плазмидных штаммов выявил существенные различия в количестве синтезированных'рекомбинантных NAGS (рис. 3). Это явление могло быть следствием множества причин: разной

стабильностью мРНК при транскрипции мутантных вариантов гена или эффективностью трансляции этой мРНК (все мутащги находятся в 5'-области гена), а так же разной чувствительностью полученных вариантов NAGS к протеолитической деградации. Поэтому для корректного сравнения кинетических параметров сконструированных ферментов было необходимо провести их исследование с использованием высокоочищенных белковых препаратов!

Fbr варианты мутантной N-ацетилглутамат синтетазы NAGS-rll, NAGS-rl3, NAGS-4 и wt были очищены как описано в Материалах и методах. Чистота препаратов белка NAGS-4, как и NAGS-rll, составляла около 70%, а чистота NAGS-wt и NAGS-rl3 -около 90%.

На рис. 4 представлена электрофореграмма образцов очищенных препаратов модифицированных вариантов NAGS-rll и NAGS-rl3. Видно, что белок NAGS-rll представлен на электрофорезном геле двумя зонами (~50 кДа и -48 кДа), что может свидетельствовать о его большей чувствительности к протеолизу в клетках E.coli по сравнению с NAGS-rl3, представленного одной зоной (~50 кДа). Следовательно, можно предположить существование сайта расщепления протеазой (протеазами) на

94 ,

67 * •

NAGS-rll *-NAGS-rl3

43 »

30 ф 20

1 2 3

Рисунок 3. SDS-электрофорезный гель штаммов, рИСунок 4. SDS-электрофорезный гель содержащих мутантные белки NAGS: 2 очищенных препаратов белков: 2 -

pKKargA-wt, неиндуцированная „культура; 3 - . NAGS-rll; 3 - NAGS-rl3; 1 - белковый pKKargA-wt; 4 - pKKargA-rl 1; 5 - pKKargA-rl2; 6 . марКер. - pKKargA-r 13; 7 - pKKargA-r4; .v3-7 - культуры :

индуцировали 1мМ IPTG;1, 8 г-белковый маркер.

Ы-конце аминокислотной последовательности» (¡¡елка, сформированной в результате мутагенеза.' • •

Величины Км каж и Ущах каж для трех мутаптных ферментов и белка дикого типа были определены по кривым насыщения для Х-глутамата и ацетил-СоА, которые были приведены методом наименьших квадратов к уравнению Михаэлиса-Ментена. Разделение компонентов реакции и измерение количества синтезированного Ы-ацетилглутамата было осуществлено посредством капиллярного электрофореза, все измерения проводились независимо, не менее 4-х раз.

Таблица 2. Кинетические свойства вариантов фермента NAGS.

Белок Субстрат: L-глутамат Субстрат: ацетил-СоА

Glu Км каж мМ Vmax каж МКМОЛЬ мг"1 мин"1 х103, kcat/Км с1 М-' АсСоА Км каж мМ Vnuut каж МКМОЛЬ мг"1 мин'1 х103, кса/Км С1 М-1

NAGS-wt 3,0 ±0,6 37 ± 3 10,2 2,5 ± 0,5 47 ±5 15,6

NAGS-4 8,4 ±1,1 50 ± 3 4,9 0,70 ±0,08 35 ±3 41,5

NAGS-rll 3,7 ± 0,5 115 ± 5 25,8 * 0,32 ± 0,02 111±12 287,9

NAGS-rl3 9,5 ±1,3 139 ± 10 12,1 0,69-± 0,07 120 ± 10 ... 144,3

Из классической теории кинетики односубстратной реакции следует, что при низких концентрациях субстрата произведение : егоконцентрации , на ^величину kct/Км определяет удельную активность фермента. В случае рассматриваемой в данной работе двух-субстратной реакции, аналогичные отношения кажущихся констант для одного субстрата (например - ацетил-СоА) можно также рассматривать в качестве характеристики специфической активности. NAGS при низких концентрациях этого субстрата (ацетил-СоА) и насыщающих концентрациях второго субстрата (глутамата) и наоборот. Таким образом, сравнивая значения отношений к^/Км для разных ферментов и разных субстратов, можно приближенно оценить относительную эффективность работы мутантных белков в условиях недостатка каждого субстрата.

Из данных таблицы 2 следует, что в условиях низких концентраций глутамата вариант NAGS-4 в два раза менее эффективен, чем фермент дикого типа, который, в свою очередь, в два с половиной раза менее эффективен, чем вариант NAGS-rll. В случае ацетил-СоА, разница между значениями к^ц/Км для фермента NAGS дикого типа и его вариантами NAGS-rl3 и NAGS-rll еще более велика и составляет уже один порядок. Интересно отметить, что'существует определенная корреляция между изменениями кинетических параметров мутантных вариантов NAGS. Действительно, легко заметить, что все полученные модификации (включая единичную замену) приводят к увеличению величины KMGlu для глутамата с одновременным увеличением сродства к ацетил-СоА (уменьшение Кл/АсСрА) и > увеличению каталитической константы. Таким образом, можно предположить, что аминокислотные остатки 15 по

19 включительно приним^иот,непосредственное, участие, в;. формировании активного центра NAGS. Полученные результаты наглядно свидетельствуют об эвристической ценности комбинаторного метода.

f-itUa'O Ь..' . '.>- • 1' -it. • : .

БылQ исследовано влияние; L-аргинина на скорость синтеза N-ацсщлглутамата для четырех различных мутантов NAGS. Аргинин является . .сильным ингибитором (концентрация, необходимая для ингибирования активности, фермента на 50%

Относительная активность (%)

Arginine(|jM) Alanine (mM) CHniline (ттМ|

Рисунок 5» Ингибирование NAGS аргинином (А - NAGS-wt(t); В -: NAGS-4(*)j ^NAGS-rll(T), NAGS-rl3(«)> и цитруллином (С). Реакции были : ■ проведены в присутствии. 5мМ ацетил-СоА и 20 мМ глутамата.

составляет [Io.s]3 25 мкМ) для белка дикого типа (рис. 5,А). Для мутанта с единичной заменой NAGS-4 величина Io.j примерно на три порядка :выше (около 30 мМ) (рис. 5,В). У мутанта с пятью аминокислотными заменами NAGS-r 13 мы обнаружили увеличение активности в присутствии аргинина, как происходит в случае NAGS эукариотов (клетки мышей или человека (Caldovic et al., 2003)). В отличие (ут Е.соИ, где NAGS абсолютно необходим для обеспечения синтеза аргинина, в клетках млекопитающих единственная известная его функция - это снабжение митохондриальной карбамоилфосфат синтетазы необходимыми ей кофакторами. NAGS E.coli и млекопитающих, скорее всего, возникли независимо в процессе эволюции, так как имеют слабую гомологию (Caldovic et al., 2002), поэтому полученный результат показался нам довольно неожиданным.

В слузфедитруллина .для NAGS wt.составляетоколо 10 мМ, но этотицтермедиат биосинтеза аргинина вообще не влияет на активность мутантных ферментов NAGS (рис.5,С). , , ;

Таким образом, нами было показано, что: 1) введение случайных мутаций в область 15-19 а.о. фермента NAGS привело к образованию мутантов, кинетические параметры которых колеблются в широких пределах (Км для различных субстратов у полученных мутантов изменяется в 3 и более раза по сравнению с соответствующим параметром для фермента дикого типа); 2) мутанты в различной степени подвержены протеолизу, что позволяет сделать вывод о возможной локализации протеолитического сайта на N-конце фермента; 3) применение метода комбинаторного мутагенеза позволило получить высокоактивные мутанты NAGS, активность которых в присутствии аргинина не уменьшается, а в одном случае увеличивается в 2 раза.

2.4. Применение полученных fbr-мутантов NAGS в процессе создания штамма-продуцента аргинина.

Таблица 3. Синтез аргинина в штамме В7925, несущем рекомбинантные плазмиды.

Плазмида А550, o.e. Концентрация аргинина, г/л

PMW119 23 Д 4,7

pMADS4 22,4 8,7

pMADSll 19,0 10,0

pMADS12 18,5 7,6

pMADS13 18,1 9,1

Так как ацетилирование глутамата является ключевой стадией биосинтеза аргинина, мы использовали сконструированные fir мутанты фермента NAGS в штамме-продуценте арганина В7925 (/7v>4::Tn5, argR). Данный штамм содержит точечную мутацию в гене argR (GlyI23Asp), что приводит к его инактивации, и, следовательно, к активированию всего пути биосинтеза аргинина. Последовательности ДНК, содержащие мутантные гены NAGS-r4, 11, 12 и 13 под контролем trc промотора, были клонированы в малокопийный вектор pMW119, используя сайты расщепления рестриктаз ВатШ и Hindlll. Введение рекомбинантной плазмиды, содержащей ген мутантного фермента ArgA-rl3, позволило повысить уровень продукции аргинина в 2 раза по сравнению с родительским штаммом (табл. 3) и на 15% по сравнению со штаммом, экспрессирующим ген мутантного белка с единственной аминокислотной заменой.

3. Применение метода комбинаторного мутагенеза для изменения аллостерической регуляции карбамоилфосфат синтетазы из Е. coli.

Вторым объектом нашего исследования стала CPSase из Е. coli, являющаяся ключевым ферментом сразу для двух путей биосинтеза — аргинина и пиримидинов.

Этот фермент представляет собой гетеродимер, состоящий из малой (41270 Да) и большой (117710 Да) субъединиц, которые кодируются генами саг А и сагВ, соответственно. Малая субъединица фермента катализирует гидролиз глутамина и ответственна за перемещение NH3 к большой субъединице, где и происходит синтез карбамоилфосфата (CP). Большая субъединица содержит сайты связывания для иона бикарбоната, аммония, два различных сайта для Mg-ATP и карбокситерминальный участок (18 кДа), который представляет собой регуляторный домен. Этот домен (D домен) отвечает за связывание с аллостерическими регуляторами IMP, UMP и орнитином и расположен около CP-синтезирующего активного цетра и канала карбамата (Thoden et al., 1997). Ранее была определена единичная замена в аминокислотной последовательности большой субъединицы CPSase (Ser948Phe), которая приводила к появлению fir фенотипа, однако существенно снижала активность фермента (Delannay et al., 1999). Как и в случае с NAGS, целью нашей работы было получение высокоактивного fir мутанта CPSase методом комбинаторного мутагенеза.

3.1. Конструирование библиотеки мутантных генов сагВ.

Процесс конструирования библиотеки мутантных генов сагВ проходил аналогично конструированию совокупности мутантных генов argA. В качестве матрицы была использована плазмида pBScarAB-13, а в качестве праймеров - PI: 5'-ggtcgtgcgctgNN(T/C)N(T/C)CNN(T/C)NNN(G/A)NNggcgataaagaacgcgtggtg-3,> частично комплементарный последовательности гена carB, Р2 - прямой праймер М13 и РЗ: 5-ccacttcctcgatgacgcgg-З', гомологичный 5'-концу гена сагВ.

Частичная рандомизация 15-нуклеотидного фрагмента гена саг В, кодирующего регион от Leu947 до Glu951 аминокислотного остатка, дает набор 412 или около 1.5х107 различных последовательностей ДНК, которые могут кодировать 4х105 различных вариантов последовательностей аминокислотных остатков в 5-мерном пептиде, и, следовательно, приводит к образованию около 400 ООО вариантов мутантных CPSases.

Фрагмент ДНК, кодирующий совокупность мутантных вариантов 3'-концевого фрагмента гена саг В, был очищен электрофорезом в агарозном геле, обработан рестриктазами Л/7П и Sacl, и лигирован с вектором pEL-carAB-wt/Aflll-Sacl. Схема получения пилазмиды pEL-carAB-wt показана на рисунке б. Около 500 нг лигазной смеси pEL-carAB-NN использовали для трансформации клеток E.coli штамма TG1, что приводило к образованию около 104 рекомбинантных клонов.

3.2 Селекция fbr мутантов CPSase.

Для отбора клонов, продуцирующих активные варианты CPSase, совокупностью

рекомбинантных плазмид pEL-carAB-NN трансформировали клетки E.coli штамма

рВБсагАВ-13

Рисунок б. Схема конструирования плазмиды рЕЬ-сагАВ-л^.

В6969(саг2?::Тп10). На первом этапе селекции трансформационную смесь высевали на чашки с агаризованной средой М9. В результате была выявлена группа хорошо растущих рекомбинашных клонов, 50 из которых использовали для второго этапа селекции. Активность мутантных ферментов была оценена с использованием реакции биосинтеза цитруллина из орнитина, катализируемой совместно СРЭаэе и ОТСаэе (Аг§1) в соответствии со следующей схемой:

СРЗаве + ОТСаве

ИНз +НСО3" +2М£АТР + От -—-:-► Ск + 2МиАОР +

В качестве источника аммония в реакции использовали (N44)3804, ферментативную активность СРваве и их устойчивость к ретроингибированию ЦМР оценивали по уровню синтеза цитруллина, измеряемого с помощью тонкослойной хроматографии. Так как практически все полученные мутанты обладали высокой устойчивостью к ретроингибированию, для дальнейшего изучения были отобраны клоны, продуцирующие ферменты с наиболее высокой активностью. Фермент СРБаве-б (содержащий единственную замену Бег948РЬе и описанный как несущий /Ъг фенотип

фе1аппау & а1., 1999)) был сконструирован нами посредством сайт-специфического мутагенеза и имел существенно более низкую активность, чем фермент дикого типа.

На следующем этапе активности 10 мутантаых ферментов оценивали в реакции синтеза СР из глутамина или аммония в соответствии со следующими схемами реакций:

I. С1п + НСОз" + 2М$»АТР -*КН2С00Р032' + 2М^Р+01и+Р1 П. Ш3 + НС03" + 2МдАТР ЫН2С00Р032" + 2МеМ)Р+^ Для проведения реакций использовали клеточные экстракты, обогащенные осаждением в 80% растворе сульфата аммония. Измерение количеств синтезированного СР проводили с помощью капиллярного электрофореза (табл. 4). Серия реакций I была проведена также в присутствии 10 мМ 1ЛГР для определения уровня ретроингибирования ферментов. Из соответствующих клонов были выделены рекомбинантные плазмиды, последовательности генов сагВ определены секвенированием по методу Сэнгера.

Таблица 4. Активность мутантных белков CPSase.

Клон Последовательность рандомизированного участка белка СагВ (947—>951 а.о.) АКТИВНОСТЬ, КОЛ1 • мг-минв п ячество синтезированного СР, нмоль рисутствии различных субстратов

5 мМ Gin 5 мМ Gin; аллостерический регулятор:10 MMUMP 200 мМ (NH4)2S04

wt -Leu-Ser-Val-Arg-GIu- 4200 (100%) * 520 (12%)" 1390 (33%)*"

6 -Leu-Phe-Val-Arg-Glu- 930 (22%) 930 (100%) 640 (68%)

10 -Pro-Leu-Arg-Glu-Gly- 2160 (51%) 2160 (100%) 670 (31%)

12 -Ala-Val-Ala-Leu-Lys- 1710 (41%) 1710 (100%) 280 (16%)

13 -Gly-Val-Phe-Leu-Met- 1540 (37%) 1540 (100%) 180 (12%)

27 -Phe-Phe-Cys-Phe-Gly- 2350 (56%) 2350 (100%) 1260 (53%)

31 -Pro-Thr-Gly-Arg-Arg- 4550 (108%) 3300 (73%) 1480 (32%)

33 -Phe-Ala-Cys-Gly-Val- 2000 (48%) 2000 (100%) 820 (41%)

34 -Val-Phe-Gly-Ser-Ser- 2900 (69%) 2900 (100%) 1200 (42%)

36 -Ala-Ser-Gly-Val-Glu- 1170 (28%) 1170 (100%) 270 (23%)

37 -Ala-Phe-Cys-Gly-Val- 1700 (40%) 1700 (100%) 720 (43%)

В скобках приведена активность в % от активности wt CPSase. " В скобках приведена активность в % от активности фермента в отсутствие UMP. "* В скобках приведена активность в % от активности фермента в присутствии 5мМ Gin как субстрата.

Из представленных данных можно заключить, что: 1) фермент СРЗаБе, содержащий единичную мутацию Бег948РЬе, практически нечувствителен к ЦМР, но активность этого : фермента существенно ниже активности фермента дикого ■ типа (приблизительно в 4 раза с использованием в качестве источника аммония глутамина и в 2 раза с использованием (N114)2804); 2) мутанты СРБаве с множественными

заменами в регионе 947-951 а.о. обладают /Ьг-фенотипом и имеют различные уровни ферментативной активности, вплоть до уровня активности CPSase wt. Наиболее высокой активностью обладает мутант 31, содержащий три неконсервативные замены Leu947Pro, Val949Gly, Glu951Arg, одну консервативную замену Ser948Thr и сохранивший в положении 950 остаток Arg. Активность этого фермента составляет около 108% от активности фермента wt и уменьшается до 73% от первоначальной в присутствии 10 мМ UMP (при этих условиях активность CPSase wt составляет -12% от первоначальной (табл. 4)).

Другие полученные варианты CPSase были полностью нечувствительны к использованной концентрации UMP, но их специфическая активность была в 2 - 4 раза меньше, чем активность фермента дикого типа. Более того, введение различных мутаций в район 947-951 а.о. в определенной степени изменяло субстратную специфичность мутантных белков к источникам аммония. Уровень синтеза CP мутантными CPSase при замене 5 мМ Gin как источника аммония на 200 мМ (NHO2SO4 снижался в 2 - 7 раз в зависимости от последовательности аминокислотных остатков в участке 947-951 а.о. мутантного фермента. Эти данные также показывают, что несмотря на некоторое изменение сродства к свободному аммиаку у разных вариантов CPSase, ферменты используют его в качестве субстрата в среднем примерно на два порядка менее эффективно, чем глутамин.

Хотя присутствие мутаций может влиять на устойчивость белка к деградации клеточными протеазами (как произошло с мутантом NAGS-rИ), мутации в районе 947-951 а.о. в анализированных препаратах Саг В не приводят к существенному изменению концентрации этого белка в клеточных экстрактах (данные не представлены).

Селекция среди множества вариантов, несущих замены аминокислотных остатков в непосредственной близости от ранее идентифицированной мутации Ser948Phe, позволила отобрать варианты мутантных белков, обладающих высокой активностью и сохраняющих fbr фенотип. Кроме того, полученные результаты свидетельствуют, что фрагмент белка от 947 до 951-го аминокислотного остатка ответственен не только за ингибирование активности CPSase UMP и уровень ее каталитической активности, но мутации в этом регионе приводят также к определенному изменению субстратной специфичности белка (к глутамину или аммонию).

В данном случае, применение метода комбинаторного мутагенеза позволило отобрать, высокоактивные fbr мутанты целевого белка путем анализа около 2,5% от числа теоретически возможных вариантов при заданном уровне рандомизации. Полученные белки значительно превосходили по каталитическим свойствам известный ранее мутант Ser948Phe, были полностью нечувствительны к ингибированию UMP, а

уровень их специфической активности был близок к уровню активности СРБазе дикого типа.

3.3. Применение полученных Лг-мутантов СРЭаэе в процессе конструирования штамма-продуцента оротовой кислоты.

Синтез СР является ключевой стадией для биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов и аргинина. Для демонстрации возможности использования /Ьг-мутанта СР8азе-34, нами был выбран модельный штамм В8085. Данный штамм, устойчивый к аналогу пиримидиновых нуклеотидов, 6-азаурацилу (1 мг/мл), был получен методом мутагенеза нитрозогуанидином из штамма Е.соИ К12 аг^Л/ЛпЮ. Как правило, устойчивость к 6-азаурацилу приводит, с одной стороны, к появлению мутантов со снятым ретроингибированием ферментов пути биосинтеза пиримидинов, а с другой -к усилению транспорта этих веществ из клетки. В свою очередь, инактивация гена а^А дает возможность использовать весь синтезированный СР для их биосинтеза.

Таблица 5. Синтез оротовой кислоты в штамме В8085, несущем рекомбинантные плазмиды.

Плазмвда А550, о.е. Концентрация оротовой кислоты, г/л

PMW119 13,1 0,12

pMW-CarAB-wt 11,4 0,27

pMW-CarAB-34 12,6 0,66

Введение десенсибилизированного мутанта CPSase-34 привело к существенному повышению уровня продукции целевого вещества (табл. 5).

Так как оротовая кислота является прямым предшественником пиримидиновых нуклеотидов, входящих в состав нуклеиновых кислот, ее соли рассматриваются, как вещество анаболического действия и применяются в фармацевтике при нарушениях белкового обмена как общие стимуляторы обменных процессов (Степура и соавт., 2002; Classen, 2004). Обычно применяют калиевую или магниевую соли оротовой кислоты в сочетании с другими средствами (витаминами и др.) при заболеваниях печени, дистрофии миокарда, прогрессирующей мышечной дистрофии. Калия оротат применяют также для улучшения анаболических процессов при напряженных физических нагрузках.

В свете этих данных штамм-продуцент оротовой кислоты может использоваться не только как родительский штамм при создании продуцентов пиримидиновых нуклеотидов, но и иметь самостоятельное практическое значение для микробиологической промышленности.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что метод комбинаторного мутагенеза с использованием рандомизированных олигонуклеотидов позволяет решить задачу конструирования высокоактивных ферментов биосинтеза аминокислот, устойчивых к ретроингибированию.

2. Сконструированы устойчивые к ингибированию аргинином мутанты N-ацетилглутамат синтетазы (NAGS) Rcoli, характеризующиеся более высокой каталитической эффективностью по сравнению с исходным ферментом NAGS: для глутамата отношение к^/Км увеличено в 2 раза, для ацетил-СоА - в 15 раз.

3. Экспрессия мутантных генов NAGS в штамме-продуценте В7925 обеспечила увеличение биосинтеза аргинина в 2 раза по сравнению с родительским штаммом. Тем самым показана перспективность использования данных мутантов для конструирования промышленных штаммов-продуцентов аргинина.

4. Сконструированы мутанты карбамоилфосфат синтетазы (CPSase) E.coli устойчивые к ингибированию UMP, обладающие высокой удельной активностью, сравнимой с активностью исходного фермента.

5. Экспрессия мутантных генов CPSase в штамме-продуценте В8085 приводит к существенному увеличению синтеза оротовой кислоты, что может представлять практический интерес для микробиологического производства как самой оротовой кислоты, так и пиримидиновых нуклеотидов.

Результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

• Смирнов С.В., Котлярова В.А., Альтман И.Б., Птицын JI.P. «Получение мутантов карбамоилфосфат синтетазы Escherichia coli методом мутагенеза «рандомизированными» олигонуклеотидами». Биотехнология, 2006, №1,3-11.

• Смирнов С.В., Котлярова В.А., Альтман И.Б., Птицын JI.P. «Получение новых мутантов карбамоилфосфат сингетазы Escherichia coli методом мутагенеза «рандомизированными» олигонуклеотидами». Тезисы докладов III Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2005, с. 316-317.

• L. R. Ptitsyn, S. V. Smimov, V. A. Kotlyarova and I. В. Altman. «Random oligonucleotide mutagenesis of Escherichia coli argA gene and selection of high active n-acetylglutamate synthetase mutants». FEBS Journal, 2005, Vol. 272, p. 515.

• Птицын JI.P., Смирнов C.B., Альтман И.Б., Новикова А.Е., Котлярова В.А., Гусятинер М.М., Ростова ЮГ., Ямпольская Т.А. «Новая мутантная карбамоилфосфат синтетаза и способ получения соединений - производных карбамоилфосфата». Патентная заявка РФ №2001121697, дата приоритета 03.08.2001. (US2003129708, JP2003093083)

Принято к исполнению 16/11/2006 Исполнено 17/11/2006

Заказ № 945 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Котлярова, Вероника Александровна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 .Искусственная эволюция белков.

1.1.1. Цели и задачи искусственной эволюции белков.

1.1.2. Искусственная эволюция белков методами случайного мутагенеза.

1.1.2.1. Радиационный и химический мутагенез.

1.1.2.2. Метод подверженной ошибкам ПЦР.

1.1.3. Искусственная эволюция белков методами направленного мутагенеза.

1.1.3.1. Сайт-специфический мутагенез.

1.1.3.2. Сайт-сосредоточенный мутагенез.

1.1.3.3. Мутагенез рандомизированными олигонуклеотидами.

1.1.4. Искусственная эволюция белков, основанная на рекомбинационных методах мутагенеза.

1.1.4.1 .Метод перетасовки ДНК.

1.1.4.2. Метод геномной перетасовки.

1.1.4.3. Метод прерывистой элонгации.

1.1.4.4. Случайное образование химерных молекул на временной матрице.

1.1.4.5. Гетеродуплекс.

1.1.4.6. Сборка соответствующих олигонуклеотидов.

1.1.4.7. Мутагенная и однонаправленная повторная сборка.

1.1.4.8. Метод экзонной перетасовки.

1.1.4.9. Негомологичная рекомбинация.

1.2. Аллостеричесьсие ферменты.

1.2.1. Аллостерическая регуляция.

1.2.2. Ретроингибирование.

1.2.3. N-ацетилглутамат-синтетаза.

1.2.4. N-ацетилглутамат киназа.

1.2.5. Карбамоилфосфат синтетаза.

1.2.5.1. Механизм действия CPSase.

1.2.5.2. Аллостерическая регуляция CPSase.

1.2.5.3. Регуляция транскрипции оперона сагАВ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1.Бактериальные штаммы.

2.1.1. Конструирование штамма B7::argA-ml3::argGH.

2.2. Среды и условия культивирования штаммов.

2.2.1. Условия культивирования штаммов TGI, В16-4, В3083 и В6969.

2.2.2. Условия культивирования штаммов-продуцентов оротовой кислоты и аргинина.

2.3. Эксперименты с рекомбинантной ДНК.

2.3.1. Генно-инженерные методики.

2.3.2. Конструирование плазмиды pUC18-argI.

2.3.3. Конструирование плазмиды pKK-argA-wt.

2.3.4. Конструирование плазмиды pMIV-5-Pj-argA-ml3.

2.3.5. Конструирование плазмиды pMIV-5-Pj-argGH.

2.3.6. Конструирование плазмиды pET-Piac.

2.3.7. Конструирование плазмиды pEL-carAB-wt.

2.3.8. Конструирование малокопийных плазмид, содержащих гены сагАВ.

2.4. Создание библиотек мутантных генов.

2.4.1. Создание библиотеки мутантных argA генов.

2.4.2. Создание библиотеки мутантных сагВ генов.

2.5. Отбор активных мутантов.

2.5.1. Отбор вариантов, синтезирующих активную NAGS в клетках Е. coli штамма TG1.

2.5.2. Отбор вариантов, синтезирующих активную NAGS в клетках E.coli В16-4.

2.5.3. Отбор вариантов, синтезирующих активную CPSase.

2.6. Выделение и очистка белка NAGS.

2.7. Измерение ферментативных активностей.

2.7.1. Анализ ферментативной активности мутантных NAGS.

2.7.2. Анализ ферментативной активности мутантных CPSase.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Метод комбинаторного мутагенеза.

3.2. Получение мутантов N-ацетилглутамат синтетазы.

3.2.1. Конструирование рандомизированной библиотеки генов argA.

3.2.2. Селекция "активных вариантов" мутантных ферментов NAGS в клетках E.coli штамма TG1.

3.2.3. Селекция мутантных ферментов NAGS в клетках E.coli штамма В16-4.

3.2.4. Активности мутантных ферментов в клеточных экстрактах.

3.2.5. Очистка и кинетические свойства мутантных NAGS.

3.2.6. Применение полученных fbr-мутантов NAGS в процессе создания штамма-продуцента аргинина.

3.3. Применение метода комбинаторного мутагенеза для изменения аллостерической регуляции карбамоилфосфат синтетазы из Е. coli.

3.3.1. Конструирование библиотеки мутантных генов сагВ.

3.3.2. Селекция fbr мутантов CPSase.

3.3.3. Применение полученных fbr-мутантов CPSase в процессе конструирования штамма-продуцента оротовой кислоты.

3.3.4. Применение полученных fbr-мутантов CPSase в процессе конструирования штамма-продуцента аргинина.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменение аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Escherichia coli методом комбинаторного мутагенеза"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

В настоящее время аминокислоты приобрели огромное промышленное значение. Область их применения необычайно широка, от использования в качестве компонентов пищевых добавок до создания на их основе лекарственных форм и разнообразной косметики. Современное производство аминокислот исчисляется миллионами тонн в год, а совокупный объем продаж - миллиардами долларов. Очевидно, что стремительно развивающийся рынок аминокислот и продуктов, созданных на их основе будет требовать адекватного увеличения их производства (Bongaerts et al, 2001). На сегодняшний день практически безальтернативным способом массового производства большинства аминокислот является их микробный синтез. Эффективность этого биотехнологического процесса во многом зависит от характеристик используемого бактериального штамма-продуцента. В процессе его конструирования необходимо решать множество задач, связанных с различными сторонами жизнедеятельности бактерий. К ним можно отнести оптимизацию экспрессии генов биосинтеза целевой аминокислоты, энергетическое обеспечение биосинтеза, повышение эффективности транспорта в клетку питательных веществ и экспорта целевой аминокислоты в культуральную жидкость, и т.д.

Одним из важнейших аспектов общей стратегии создания штаммов-продуцентов аминокислот и других биогенных молекул является модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов их биосинтеза. Частный случай аллостерической регуляции, ретроингибирование, является одним из основных способов контроля скорости биосинтеза аминокислот и других биогенных молекул. Этот процесс основан на принципе отрицательной обратной связи, когда продукт биосинтетической цепи подавляет активность фермента, катализирующего первую стадию. Как правило, подобной регуляции подвержены ферменты, катализирующие практически необратимые биохимические реакции. Перераспределяя потоки ключевых молекул между клеточным метаболизмом и синтезом данного вещества (например - аминокислоты или нуклеотидов) в зависимости от его концентрации, эти белки выполняют функцию своеобразных "метаболических клапанов", обеспечивающих клеточный гомеостаз.

Очевидно, что для создания высокоэффективных штаммов-продуцентов аминокислот необходимо конструирование таких мутантных белков, аллостерическое ингибирование которых конечными продуктами реакций было бы нарушено {for, feed back resistance фенотип). Как правило, fbr фенотип фермента достигается как результат замены одного аминокислотного остатка на другой в одном или нескольких сайтах белковой последовательности.

Поиск и идентификация fbr мутантов всегда являлось достаточно трудоемкой задачей. Эти мутации обычно возникают спонтанно при благоприятных для этого условиях и соответствующей системе отбора (Vyas and Maas, 1963; Гаврилова и соавт., 1988; Di Girolamo et al, 1988). С другой стороны, основываясь на анализе трехмерной структуры белка, можно вводить те или иные замены аминокислотных остатков, изменяя его кинетические характеристики. Однако, современный уровень понимания структурно-функциональных связей в белках пока еще недостаточен для проведения успешного рационального дизайна ферментов и полученные таким образом мутанты имеют существенно более низкую удельную активность по сравнению с ферментом дикого типа (например, в случае мутантов фермента SAT, Nakamori et al, 1998; мутантов пантотенат киназы, Rocketal., 2003; мутантов префенат дегидротазы, Hsu et al., 2004).

Таким образом, получение ферментов со снятым ретроингибированием и одновременным сохранением его основных кинетических параметров во многом определяется экспериментальным везением. В этой связи, весьма актуальной представляется задача разработки новых методологических подходов к проблеме получения модифицированных аллостерических ферментов с заданными функциональными параметрами.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Целью данной работы являлись разработка метода комбинаторного мутагенеза и его применение для модификации аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы (NAGS) и карбамоилфосфат синтетазы (CPSase) из Е. coli.

В ходе работы были решены следующие задачи:

• разработка метода эффективного направленного мутагенеза, позволяющего получать "библиотеку" мутантных генов, кодирующих белки, которые различаются по нескольким аминокислотам в одном заданном участке аминокислотной последовательности;

• получение fbr мутантов NAGS, обладающих высоким уровнем удельной активности и исследование их основных кинетических параметров;

• получение fbr мутантов CPSase, нечувствительных к ингибированию UMP и обладающих высоким уровнем удельной активности;

• применение модифицированных ферментов в процессе создания штаммов-продуцентов аргинина и оротовой кислоты на основе Е. coli.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Разработана оригинальная методика эффективного направленного мутагенеза (метод комбинаторного мутагенеза), позволяющего получать библиотеку генов, кодирующих представительную выборку белков, различающихся по нескольким аминокислотам в одном специфическом участке.

Впервые была показана возможность применения данного метода для получения не подверженных ретроингибированию ферментов: NAGS и CPSase из Е. coli. В каждом случае из совокупности мутантных белков удалось отобрать ферменты с заданными свойствами без использования специальных методов селекции.

На примере NAGS показано, что предложенный подход позволяет получать серию мутантов с измененными в широком диапазоне основными кинетическими параметрами ферментов (Км, Vmax). Полученная коллекция мутантных белков может быть использована для дальнейших экспериментов по изучению их структуры и функций.

Впервые показано, что представленная методика может быть эффективно использована при конструировании штаммов-продуцентов аминокислот (нуклеотидов) на этапе оптимизации экспрессии генов аллостерических ферментов, что нашло отражение в соответствующем патенте.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Котлярова, Вероника Александровна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что метод комбинаторного мутагенеза с использованием рандомизированных олигонуклеотидов позволяет решить задачу конструирования высокоактивных ферментов биосинтеза аминокислот, устойчивых к ретроингибированию.

2. Сконструированы устойчивые к ингибированию аргинином мутанты N-ацетилглутамат синтетазы (NAGS) E.coli, характеризующиеся более высокой каталитической эффективностью по сравнению с исходным ферментом NAGS: для глутамата отношение kcat/KM увеличено в 2 раза, для ацетил-СоА -в 15 раз.

3. Экспрессия мутантных генов NAGS в штамме-продуценте В7925 обеспечила увеличение биосинтеза аргинина в 2 раза по сравнению с родительским штаммом. Тем самым показана перспективность использования данных мутантов для конструирования промышленных штаммов-продуцентов аргинина.

4. Сконструированы мутанты карбамоилфосфат синтетазы (CPSase) E.coli устойчивые к ингибированию UMP, обладающие высокой удельной активностью, сравнимой с активностью исходного фермента.

5. Экспрессия мутантных генов CPSase в штамме-продуценте В8085 приводит к существенному увеличению синтеза оротовой кислоты, что может представлять практический интерес для микробиологического производства как самой оротовой кислоты, так и пиримидиновых нуклеотидов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Котлярова, Вероника Александровна, Москва

1. Гаврилова О.Ф., Миронов А.С., Николаевская Е.Е., Родионов О.А., Хургес Е.М. 1988. Генетическое картирование мутации ilv7434, обеспечивающей устойчивость треониндезаминазы к ингибированию изолейцином у Escherichia coli. Генетика. 24,13-22.

2. Ларионов О.А., Никифоров В.Г. 1982. Направленный мутагенез. Генетика. 18, 349-359.

3. Птицын Л.Р., Альтман И.Б., Гуров М.В. 1998. Экспрессия синтетического гена интерлейкина-10 человека и его вариантов в клетках Escherichia coli. Биоорг. Химия. 24, 48-57.

4. Рапопорт И.А. 1946. Карбонильные соединения и химический механизм мутаций. ДАН СССР. 54,65.

5. Степура О. Б., Томаева Ф. Э., Зверева Т. В. 2002 Оротовая кислота как препарат метаболического действия. Вестник РАМН. 2, 39-41

6. Abdelal А.Т., Nainan 0. 1979. Regulation of N-acetylglutamate synthesis in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 137, 1040-1042.

7. Aguinaldo A.M. and Arnold F.H. 2003. Staggered extension process (StEP) in vitro recombination. Methods Mol. Biol. 231,105-110.

8. Airaksinen A., Hovi T. 1998. Modified base compositions at degenerate positions of a mutagenic oligonucleotide enhance randomness in site-saturation mutagenesis. Nucleic Acids Res. 26(2), 576-81.

9. An Y., Ji J., Wu W., Lv A., Huang R., Xiu Z. 2006. Молекулярная эволюция аденозилметионинсинтетазы на основе рекомбинации ДНК с помощью нового метода «раздельных реакций с последующим смешиванием». Молекулярная Биология. 40, 546-553.

10. Anderson P.M., Meister А. 1966. Control of Escherichia coli carbamoylphosphate synthetase by purine and pyrimidine nucleotides. Biochemistry. 5, 3164-3167.

11. Andrianantoandro E., Basu S., Karig D.K., Weiss R. 2006. Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline. Mol Syst Biol. 2:2006.0028.

12. Arnold F.H. and Georgiou G. 2003a. Directed enzyme evolution: screening and selection methods. Methods in molecular biology, vol. 230. Humana Press, Totowa, N.J.

13. Arnold F.H. and Georgiou G. 2003b. Directed enzyme evolution: screening and selection methods. Methods in molecular biology, vol. 231. Humana Press, Totowa, N.J.

14. Bittker J.A., Le B.V., Liu J.M., Liu D.R. 2004. Directed evolution of protein enzymes using nonhomologous random recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 7011-7016.

15. Bloom J.D., Meyer M.M., Meinhold P., Otey C.R., MacMillan D., Arnold F.H. 2005. Evolving strategies for enzyme engineering. Curr Opin Struct Biol. 15(4), 447-52.

16. Boettcher В., Meister A. 1981. Conversion of UMP, an allosteric inhibitor of carbamyl phosphate synthetase, to an activator by modification of the UMP ribose moiety. J Biol Chem. 256,5977-80.

17. Boettcher В., Meister A. 1982. Regulation of Escherichia coli carbamyl phosphate synthetase. Evidence for overlap of the allosteric nucleotide binding sites. J Biol Chem. 257,13971-6.

18. Bongaerts J., Kramer M., Muller U., Raeven L., Wubboltsl M. 2001. Metabolic engineering for microbial production of aromatic amino acids and derived compounds. Metabolic Engineering, 3,289-300.

19. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method of for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72, 248-254.

20. Braxton B.L., Mullins L.S., Raushel F.M., Reinhart G.D. 1999. Allosteric dominance in carbamoyl phosphate synthetase. Biochemistry. 38,1394-401.

21. Cadwell,R.C. and Joyce,G.F. 1994. Mutagenic PCR. PCR Methods Appl., 3,136140.

22. Caldovic L., Tuchman M. 2003. N-acetylglutamate and its changing role through evolution. Biochem J. 372,279-90.

23. Campbell J.H., Lengyel J.A., Langridge J. 1973. Evolution of a second gene for beta-galactosidase in Escherichia coli. Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 70,1841-1845.

24. Cerda-Olmedo E., Hanawalt P.C., Guerola N. 1968. Mutagenesis of the replication point by nitrosoguanidine: Map and pattern of replication of Escherichia coli chromosome. -J.Mol.Biol. 33, 705.

25. Cirino P.C., Mayer K.M., Umeno D. 2003. Generating mutant libraries using error-prone PCR. Methods Mol. Biol. 231, 3-9.

26. Classen H.G. 2004. Magnesium orotate-experimental and clinical evidence. Rom J Intern Med. 42,491-501.

27. Coco W.M., Levinson W.E., Crist M.J., Hektor H.J., Darzins A., Pienkos P.T., Squires C.H., Monticello D.J. 2001. DNA shuffling method for generating highly recombined genes and evolved enzymes. Nat. Biotechnol. 19, 354-359.

28. Coco W.M. 2003. RACHITT: Gene family shuffling by Random Chimeragenesis on Transient Templates. Methods Mol. Biol. 231,111-127.

29. Cohen N.S., Kyan F.S, Kyan S.S., Cheung C.W., Raijman L. 1985. The apparent Km of ammonia for carbamoyl phosphate synthetase (ammonia) in situ. Biochem J. 229, 205-11.

30. Croitoru V., Bucheli-Witschel M., Hagg P., Abdulkarim F., Isaksson L.A. 2004. Generation and characterization of functional mutants in the translation initiation factor IF1 of Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 271, 534-544.

31. Di Girolamo M., Busiello V., Di Girolamo A., Foppoli C., De Marco C. 1988. Aspartokinase III repression in a thialysine-resistant mutant of E. coli. Biochem Int. 17, 545-54.

32. Dupuy D., Duperat V.G., Arveiler B. 2002. SCAN domain-containing 2 gene (SCAND2) is a novel nuclear protein derived from the zinc finger family by exon shuffling. Gene. 289, 1-6.

33. Eckhardt Т., Leisinger T. 1975. Isolation and characterization of mutant with a feedback resistant N-acetylglutamate synthase in Escherichia coli К 12. Mol. Gen. Genet. 138,225-232.

34. Endelman J.B., Silberg J.J., Wang Z.G., Arnold F.H. 2004. Site-directed protein recombination as a shortest-path problem. Protein Eng Des Sel. 17(7), 589-94.

35. Fernandez-Murga M.L., Gil-Ortiz F., Llacer J.L., Rubio V. 2004. Arginine biosynthesis in Thermotoga maritima: characterization of the arginine-sensitive N-acetyl-L-glutamate kinase. JBacteriol. 186, 6142-9.

36. Fromknecht K., Vogel P. D., Wise J. G. 2003. Combinatorial Redesign of the DNA Binding Specificity of a Prokaryotic Helix-Turn-Helix Repressor. J. Bacteriol. 185, 475-481.

37. Fujii R., NakagawaY., Hiratake J., Sogabe A., Sakata K. 2005. Directed evolution of Pseudomonas aeruginosa lipase for improved amide-hydrolyzing activity. Protein Engineering, Design & Selection. 18, 93-101.

38. Geddie M.L., Matsumura I. 2004. Rapid evolution of beta-glucuronidase specificity by saturation mutagenesis of an active site loop. J Biol Chem. 279,26462-8.

39. Guardiola J., Cervone F., Lamberti A. 1978. Dual autogenous regulatory role of threonine deaminase in E.coli K-12. Mol. Gen. Genet. 159, 27-32.

40. Guerola N., Ingraham J.L., Cerda-Olmedo E. 1971. Induction of closely linked multiple mutations by nitrosoguanidine. Nature New Biol. 230,122.

41. Gunasekaran К., Ma В., Nussinov R. 2004. Is allostery an intrinsic property of all dynamic proteins? Proteins. 57,433-43.

42. Hall B.G. 1973. In vivo complementation between wild-type and mutant (3-galactosidase in Escherichia coli. J.Bacteriol. 114, 448-450.

43. Hall B.G. 1981. Changes in the substrate specificities of an enzyme during directed evolution of new functions. Biochemistry. 20, 4042-4049.

44. Hall B.G. 2002. Predicting evolution by in vitro evolution requires determining evolutionary pathways. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 3035-3038.

45. Hall B.G. 2003. The EBG system of E.coli: origin and evolution of a novel beta-galactosidase for the metabolism of lactose. Genetica. 118,143-156.

46. Hall B.G. and Hartl D.L. 1974. Regulation of newly evolved enzymes. I. Selection of a novel lactase regulated by lactose in Escherichia coli. Genetics. 76, 391400.

47. Han X., Turnbough C.L. Jr. 1998. Regulation of carAB expression in Escherichia coli occurs in part through UTP-sensitive reiterative transcription. J Bacteriol. 180, 705-13.

48. Hiraga K. and Arnold F.H. 2003. General method for sequence-independent site-directed chimeragenesis. J. Mol. Biol. 330,287-296.

49. HoldenH.M., Thoden J.B., Raushel F.M. 1998. Carbamoyl phosphate synthetase: a tunnel runs through it. Curr Opin Struct Biol. 8, 679-85.

50. Horwitz M.S., Loeb L.A. 1986. Promoters selected from random DNA sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83,7405-7409.

51. Hsu S.K., Lin L.L., Lo H.H., Hsu W.H. 2004. Mutational analysis of feedback inhibition and catalytic sites of prephenate dehydratase from Corynebacterium glutamicum. Arch Microbiol. 181, 237-44.

52. Huang X., Raushel F.M. 2000a. An engineered blockage within the ammonia tunnel of carbamoyl phosphate synthetase prevents the use of glutamine as a substrate but not ammonia. Biochemistry. 39, 3240-7.

53. Jensen R.A. 1976. Enzyme recruitment in evolution of new function. Annu. Rev. Microbiol. 30,409-425.

54. Kasprzak A.A., Villafranca J.J. 1988. Interactive binding between the substrate and allosteric sites of carbamoyl-phosphate synthetase. Biochemistry. 27, 8050-6.

55. Kern D., Zuiderweg E.R. 2003. The role of dynamics in allosteric regulation. Curr Opin Struct Biol. 13(6), 748-57.

56. Koga Y., Haruki M., Morikawa M., Kanaya S. 2001. Stabilities of chimeras of hyperthermophilic and mesophilic glycerol kinases constructed by DNA shuffling. J Biosci Bioeng. 91(6), 551-6.

57. Kolkman J.A., Stemmer W.P. 2001. Directed evolution of proteins by exon shuffling. Nat. Biotechnol. 19, 423-428.

58. Kholti A., Charlier D., Gigot D., Huysveld N., Roovers M., Glansdorff N. 1998. pyrH-Qncoded UMP-kinase directly participates in pyrimidine-specific modulation of promoter activity in Escherichia coli. J Mol Biol. 280, 571-82.

59. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685.

60. Landis D.M., Gerlach J.L., Adman E.T., Loeb L.A. 1999. Tolerance of 5-fluorodeoxyuridine resistant human thymidylate synthases to alterations in active site residues. Nucleic Acids Res. 27, 3702-3711.

61. Lee P.C., Petri R., Mijts B.N., Watts K.T., Schmidt-Dannert C. 2005. Directed evolution of Escherichia coli farnesyl diphosphate synthase (IspA) reveals novel structural determinants of chain length specificity. Metab Eng. 7, 18-26.

62. Leisinger Т., Haas D. 1975. N-acetylglutamate synthase of Escherichia coli: regulation of synthesis and activity by arginine. J. Biol. Chem. 250,1690-1693.

63. Lessie T.G., Neidhardt F.C. 1967. Formation and operation of the histidine-degrading pathway in Pseudomonas aeruginosa. JBacteriol. 93,1800-10.

64. Liberies J.S., Thorolfsson M., Martinez A. 2005. Allosteric mechanisms in ACT domain containing enzymes involved in amino acid metabolism. Amino Acids. 28, 1-12.

65. Lin Т., Goman M., Scaife J. 1979. Lambda transducing bacteriophage carrying deletions of the argECBH-rpoBC region of the Escherichia coli chromosome. J. Bacteriol. 140,479-489.

66. Lin H. and Cornish V.W. 2002. Screening and selection methods for large-scale analysis of protein function. Angew Chem. 41, 4402-4425.

67. Lutz S. and Ostermeier M. 2003. Preparation of SCRATCHY hybrid protein libraries: size- and in-frame selection of nucleic acid sequences. Methods Mol. Biol. 231, 143-151.

68. Lutz S., Ostermeier M., Benkovic S.J. 2001. Rapid generation of incremental truncation libraries for protein engineering using alpha-phosphothioate nucleotides. Nucleic Acids Res. 29, el6.

69. Maniatis Т., Fritsch E., Sambrook T. 1982. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory.

70. Marvil D.K., Leisinger T. 1977. N-acetylglutamate synthase of Escherichia coli: purification, characterization, and molecular properties. J Biol Chem. 252, 3295-303.

71. Meister A. 1989. Mechanism and regulation of the glutamine-dependent carbamoylphosphate synthetase of Escherichia coli. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 62,315-74.

72. Miller L.W. and Cornish V.W. 2005. Selective chemical labeling of proteins in living cells. Curr. Opin. Chem. Biol. 9, 56-61.

73. Miyazaki K., Takenouchi M., Kondo H., Noro N., Suzuki M., Tsuda S. 2006. Thermal stabilization of Bacillus subtilis family-11 xylanase by directed evolution. J Biol Chem. 281,10236-42.

74. Monroy-Lagos O., Soberon X., Gaytan P., Osuna J. 2006. Improvement of an unusual twin-arginine transporter leader peptide by a codon-based randomization approach. Appl Environ Microbiol. 72, 3797-801.

75. Nakamori S., Kobayashi S.I., Kobayashi C., Takagi H. 1998. Overproduction of L-cysteine and L-cystine by Escherichia coli strains with a genetically altered serine acetyltransferase. Appl Environ Microbiol. 64, 1607-11.

76. Olesky M., Hobbs M., Nicholas R.A. 2002. Identification and analysis of amino acid mutations in porin IB that mediate intermediate-level resistance to penicillin and tetracycline in Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob Agents Chemother. 46, 2811-20.

77. Ostermeier M., Nixon A.E., Benkovic S.J. 1999a. Incremental truncation as a strategy in the engineering of novel biocatalysts. Bioorg. Med. Chem. 7, 2139-2144.

78. Ostermeier M., Shim J.H., Benkovic S.J. 1999b. A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology. Nat. Biotechnol. 17, 1205-1209.

79. Palzkill Т., Le Q.Q., Wong A., Botstein D. 1994. Selection of functional signal peptide cleavage sites from a library of random sequences. JBacteriol. 176, 563-8.

80. Pardee A.B., Yates R.A. 1956. Control of pyrimidine biosynthesis in Escherichia coli by a feed-back mechanism. J Biol Chem. 221, 757-70.

81. Patel P.H., Loeb L.A. 2000. Multiple amino acid substitutions allow DNA polymerases to synthesize RNA. J Biol Chem. 275,40266-72.

82. Patnaik R., Louie S., Gavrilovic V., Perry K., Stemmer W.P., Ryan C.M., del Cardayre S. 2002. Genome shuffling of Lactobacillus for improved acid tolerance. Nat. Biotechnol. 20, 707-712.

83. Patrick W.M., Firth A.E. 2005. Strategies and computational tools for improving randomized protein libraries. Biomol Eng. 22(4), 105-12.

84. Pohnert G., Zhang S., Husain A., Wilson D.B., Ganem B. 1999. Regulation of phenylalanine biosynthesis. Studies on the mechanism of phenylalanine binding and feedback inhibition in the Escherichia coli P-protein. Biochemistry. 38, 12212-7.

85. Raushel F.M., Rawding C.J., Anderson P.M., Villafranca J.J. 1979. Paramagnetic probes for carbamoyl-phosphate synthetase: metal ion binding studies and preparation of nitroxide spin-labeled derivatives. Biochemistry. 18, 5562-6.

86. Raushel F.M., Mullins L.S., Gibson G.E. 1998a. A stringent test for the nucleotide switch mechanism of carbamoyl phosphate synthetase. Biochemistry. 37, 10272-8.

87. Raushel F.M., Thoden J.B, Reinhart G.D., Holden H.M. 1998b. Carbamoyl phosphate synthetase: a crooked path from substrates to products. Curr Opin Chem Biol. 2, 624-32.

88. Raushel F.M., Thoden J.B., Holden H.M. 1999. The amidotransferase family of enzymes: molecular machines for the production and delivery of ammonia. Biochemistry. 38, 7891-9.

89. Reidhaar-Olson J. F. and R. T. Sauer. 1988. Combinatorial cassette mutagenesis as a probe of the informational content of protein sequences. Science. 241, 53-57.

90. Roberts R.W. and Szostak J.W. 1997. RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 94,12297-12302.

91. Rock C.O., Park H.W., Jackowski S. 2003. Role of feedback regulation of pantothenate kinase (CoaA) in control of coenzyme A levels in Escherichia coli. J Bacteriol. 185, 3410-5.

92. Rubino S.D., Nyunoya H., Lusty C.J. 1986. Catalytic domains of carbamyl phosphate synthetase. Glutamine-hydrolyzing site of Escherichia coli carbamyl phosphate synthetase. J Biol Chem. 261,11320-7.

93. Saeed-Kothe A., Powers-Lee S.G. 2002. Specificity determining residues in ammonia- and glutamine-dependent carbamoyl phosphate synthetases. J Biol Chem. 277, 7231-8.

94. Samalikova M., Carey J., Grandori R. 2005. Assembly of the hexameric Escherichia coli arginine repressor investigated by nano-electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 19, 2549-52.

95. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Moleccular cloning: a laboratory manual., 2nd ed. edn. Cold Spring Harbor, N.Y.

96. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA, 74,5463-5467.

97. Schellekens H. 2002. Immunogenicity of therapeutic proteins: clinical implications and future prospects. Clin. Ther. 24,1720-1740.

98. Sengupta D., Lin H, Goldberg S.D., Mahal J.J, Cornish V.W. 2004. Correlation between catalytic efficiency and the transcription read-out in chemical complementation: a general assay for enzyme catalysis. Biochemistry. 43, 3570-3581.

99. Shen J.C. and Loeb L.A. 2003. Mutations in the a8 Loop of Human APE 1 Alter Binding and Cleavage of DNA Containing an Abasic Site. J Biol Chem. 278, 46994^17001.

100. Shibuya H., Kaneko S., Hayashi K. 2005. A single amino acid substitution enhances the catalytic activity of family 11 xylanase at alkaline pH. Biosci Biotechnol Biochem. 69, 1492-1497.

101. Shinkai A., Patel P.H., Loeb L.A. 2001. The conserved active site motif A of Escherichia coli DNA polymerase I is highly mutable. J Biol Chem. 276, 18836-42.

102. Shuman H.A., Silhavy T.J. 2003. The art and design of genetic screens: Escherichia coli. Nat Rev Genet. 4,419-31.

103. Sieber V., Martinez C.A., Arnold F.H. 2001. Libraries of hybrid proteins from distanty related sequences. Nat. Biotechnol. 19, 456-460.

104. Sneeden J.L., Loeb L.A. 2003. Random oligonucleotide mutagenesis. Methods Mol Biol. 231, 65-73.

105. Stemmer W.P. 1994a. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91,10747-10751.

106. Stemmer W.P. 1994b. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature. 370,389-391.

107. Suzuki M., Christians F.C., Kim В., Skandalis A., Black M.E., Loeb L.A. 1996. Tolerance of different proteins for amino acid diversity. Mol. Diver. 2,111-118.

108. Szwajkajzer D., Dai L., Fukayama J.W., Abramczyk В., Fairman R., Carey J. 2001. Quantitative analysis of DNA binding by the Escherichia coli arginine repressor. J Mol Biol. 312,949-62.

109. Thoden J.B., Holden H.M., Wesenberg G., Raushel F.M., Rayment I. 1997. Structure of carbamoyl phosphate synthetase: a journey of 96 A from substrate to product. Biochemistry. 36, 6305-16.

110. Thoden J.B., Raushel F.M., Benning M.M., Rayment I., Holden H.M. 1999a. The structure of carbamoyl phosphate synthetase determined to 2.1 A resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55, 8-24.

111. Thoden J.B., Raushel F.M., Wesenberg G., Holden H.M. 1999b. The binding of inosine monophosphate to Escherichia coli carbamoyl phosphate synthetase. J Biol Chem. 274, 22502-7.

112. UmbargerHLE. 1956. Evidence for a negative-feedback mechanism in the biosynthesis of isoleucine. Science., 123, 848.

113. Virnekas В., Liming G., Pluckhun A., Schneider К. C., Wellnhofer G., Moroney S. E. 1994. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22, 5600-5607.

114. Volkov A.A., Shao Z., Arnold F.N. 1999. Recombination and chimeragenesis by in vitro heteroduplex formation and in vivo repair. Nucleic Acids Res. 27, el8.

115. Voiles M.J. and Lansbury P.T. 2005. A computer program for the estimation of protein and nucleic acid sequence diversity in random point mutagenesis libraries. Nucleic Acids Research, 33, 3667-3677.

116. Vyas S., Maas W.K. 1963. Feedback inhibition of acetylglutamate synthetase by arginine in Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys. 100, 542-546.

117. Wang H., Glansdorff N., Charlier D. 1998. The arginine repressor of Escherichia coli K-12 makes direct contacts to minor and major groove determinants of the operators. J Mol Biol. 277, 805-24.

118. Wang T.T., Bishop S.H., Himoe A. 1972. Detection of carbamate as a product of the carbamate kinase-catalyzed reaction by stopped flow spectrophotometry. J Biol Chem. 247,4437-40.

119. Wilkinson A.J., Fersht A.R., Blow D.M., Carter P., Winter G. 1984. A large increase in enzyme-substrate affinity by protein engineering. Nature. 307,187-188.

120. Williams V.R., Lartigue D.J. 1967. Quaternary structure and certain allosteric properties of aspartase. J Biol Chem. 242, 2973-8.

121. Yano Т., Oue S., Kagamiyama H. 1998. Directed evolution of an aspartate aminotransferase with new substrate specificities. Pro с Natl Acad Sci USA. 95, 5511-5.

122. Yuan L., Kurek I., English J., Keenan R. 2005. Laboratory-directed protein evolution. Microbiol. And Mol. Biol. Rev. 69, 373-392.

123. Zaccolo M., Williams D.M., Brown D.M., Gheradi E. 1996. An approach to random mutagenesis of DNA using mixtures of triphosphate derivatives of nucleoside analogues. J. Mol. Biol. 255, 5890-603.

124. Zha D., Eipper A., Reetz M.T. 2003. Assembly of designed oligonucleotides as an efficient method for gene recombination: a new tool in directed evolution. Chembiochem. 4, 34-39.

125. Zhao H., Arnold F.H. 1997. Optimization of DNA shuffling for high fidelity recombination. Nucleic Acids Res. 25, 1307-1308.

126. Zhao H., Giver L., Shao Z., Affholter J. and Arnold F. 1998. Molecular evolution by staggered extension process (StEP) in vitro recombination. Nat. Biotechnol. 16, 258-261.

127. Zhang J.H., Dawes G., Stemmer W.P. 1997. Directed evolution of a fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening. Proc Natl Acad Sci USA. 94,4504-9.

128. Zhang Y.X., Perry K., Vinci V.A., Powell K., Stemmer W.P., del Cardayre S.B. 2002. Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria. Nature. 415, 644-646.