Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ключевые ферменты биосинтеза пуринов в сетчатке млекопитающих

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Киян, Юлия Александровна, Санкт-Петербург

/

' /) г, 7 / А/ ......

С лг

Р()сх:ийс4ля академия наук

/

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова

На правах рукописи

удк 576.8.851.155+577.123.383

КЛЮЧЕВЫЕ ФЕРМЕНТЫ БИОСИНТЕЗА ПУРИНОВ В СЕТЧАТКЕ МЛЕКОПИТАЮЩИХ; ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССА В РАЗЛИЧНЫХ КЛЕТКАХ

(03.00.04-биохимия)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение............................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы.....................................................................Ю

1.1. Многообразие функций пуринов.........................................................10

1.2. Реакции биосинтеза пуринов....................... .................................14

1.2.1. Фосфорибозилпирофосфат-синтетаза............................................1В

1.2.2. Амидофосфорибозилтрансфераза................................................20

1.2.3. Другие ферменты биосинтеза пуринов....................... ...................22

1.3. Особенности регуляции биосинтеза пуринов у Е. coli,

в печени и мозге позвоночных..........................................................30

1.3.1. Регуляция биосинтеза пуринов у Е. coli.........................................30

1.3.2. Особенности регуляции биосинтеза пуринов

в тканях позвоночных...............................................................33

1.3.3. Особенности биосинтеза пуринов в ткани мозга............ ..................36

1.4. Циркадианные ритмы в сетчатке.....................................................38

Глава 2. Материалы и методы исследования..............................................40

2.1. Материалы.................................. .................................................40

2.2. Методы получения исследуемых препаратов.........................................40

2.2.1. Получение препаратов амидофосфорибозилтрансферазы и фосфорибозилпирофосфат синтетазы из сетчаток крупного рогатого скота.......40

2.2.2. Получение препаратов наружных и внутренних

сегментов палочек...................................................................42

2.2.3. Получение субклеточных фракций..............................................43

2.3. Общие методы исследований............................................................43

2.3.1. Измерение активности амидофосфорибозилтрансферазы................................................43

2.3.2. Измерение активности фосфорибозилпирофосфат синтетазы.............44

2.3.3. Измерение активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы..................44

2.3.4. Измерение активности сукцинат дегидрогеназы..............................45

2.3.5 Измерение скорости поглощения [14С]-рибозы

клетками Е. coli........................................................................45

2.3.6. Определение содержания белка...................................................45

2.3.7. Определение содержания родопсина............................................46

2.3.8. Определение содержания неорганического фосфата.........................46

2.3.9. Определение содержания пирофосфата.........................................46

2.3.10. Электрофорез в ПААГ............................................................47

2.4. Генетические и молекулярно-биологические

методы исследований......................................................................47

2.4.1. Культивирование клеток............................................................47

2.4.2. Выделение ДНК плазмид из клеток Е. coli.....................................47

2.4.3. Получение компетентных клеток................................................48

2.4.4. Трансформация.......................................................................48

2.4.5. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами, электрофорез ДНК в агарозном геле, элюция ДНК из гелей...............49

2.4.6. Мутагенез М-метил-Ы'-нитро-К-нитрозогуанидином........................50

Глава 3. Результаты исследования........................ ....................................51

3.1. Изучение особенностей биосинтеза пуринов в сетчатке млекопитающих.....51

3.1.1. Изучение цикличности процесса биосинтеза пуринов в сетчатке крыс..51

3.1.2. Очистка и характеристика амидофосфорибозилтрансферазы

из сетчатки быка.....................................................................57

3.1.3. Очистка и характеристика фосфорибозилпирофосфат-синтетазы из сетчатки быка.........................................................................66

3.1.4. Изучение распределения ферментов биосинтеза пуринов

в различных субклеточных фракциях сетчатки быка........................74

3.2. Изучение роли рибозо-5-фосфата в регуляции биосинтеза пуринов

de novo у Е. coli.............................................................................77

3.2.1. Конструкция использованных в работе плазмид............ ..................78

3.2.2. Изучение влияния содержания RbsD белка в клетке на рост штаммов...80

3.2.3. Роль рибозо-5-фосфата в ингибировании роста клеток

в присутствии избыточного количества RbsD белка.........................85

3.2.4. Влияние RbsD белка на образование фосфорибозилпирофосфата........85

3.2.5. Измерение активности фосфорибозилпирофосфат-синтетазы в клетках,

содержащих избыточное количество RbsD белка..............................87

3.2.6. Влияние RbsD белка на биосинтез пуринов de novo..........................87

3.2.7. Измерение активности амидофосфорибозилтрансферазы в клетках, содержащих избыточное количество RbsD белка..............................90

3.2.8. Изучение внутриклетояной локализации RbsD белка........................90

Глава 4. Обсуждение результатов...........................................................97

Выводы............................................................................................106

Список цитируемой литературы............................................................107

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Р-5-Ф - рибозо-5-фосфат

ФРПФ - фосфорибозилпирофосфат

АФТФ - амидофосфорибозилтрансфераза

НСП - наружные сегменты палочек

ВСП - внутренние сегменты палочек

Г6ФДГ - Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

ПААГ - полиакриламидный гель

ДСН - додецилсульфат натрия

ИМФ - инозинмонофосфат

ФРГА - фосфорибозилглицинамид

АИР - аминоимидазолриботид

ФГАМ - формилглицинамидин - рибозил-5-фосфат

ФСКАИ - фосфорибозил (М-сукцинокарбоксамид)-5-аминоимидазол

ФКАИ - фосфорибозилкарбоксамид-аминоимидазол

АИКАР - амидоимидазолкарбоксиламид - рибозилфосфат

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Функции, выполняемые в клетке пуриновыми основаниями, чрезвычайно разнообразны. Объясняется это тем, что они входят в состав нуклеозидов и нуклеотидов - соединений, участвующих практически во всех жизненно важных процессах. А именно, они являются компонентами ДНК и РНК; макроэргических соединений - АТФ, ГТФ; участвуют в передаче регуляторных сигналов (цАМФ, цГМФ); входят в состав коферментов (ФАД, НАД, НАДФ) и др. В связи с этим изучение процесса биосинтеза пуринов и его регуляции вызывает большой научный и практический интерес.

Ранее полагали, что некоторые ткани, и в частности, нервная, не способны осуществлять биосинтез пуринов de novo и поэтому всецело зависят от функции печени. Однако впоследствии это положение было опровергнуто, и активность ключевых ферментов биосинтеза была обнаружена в различных отделах мозга (Watts, 1983). На этом основании мы предположили, что в сетчатке млекопитающих также происходит биосинтез пуринов de novo. Изучение данного процесса в сетчатке представляется особенно интересным, поскольку сетчатка, являясь вынесенным на периферию нервным центром и будучи одной из самых специализированных рецепторных систем организма, обладает рядом особенностей. Например, она характеризуется высокой активностью биосинтетических процессов, обусловленных постоянным обновлением наружных сегментов фоторецепторов. Причем скорость большинства процессов в сетчатке изменяется циклически в зависимости от условий освещенности (Этингоф, 1999). Это обстоятельство позволило нам полагать, что если в сетчатке происходит биосинтез пуринов, то этот процесс также может быть циклическим.

Критерием наличия в ткани биосинтеза пуринов de novo принято считать присутствие фермента амидофосфорибозилтрансферазы (АФТФ). Модуляция активности АФТФ в зависимости от содержания конечных продуктов биосинтеза - пуриновых нуклеотидов - является основным механизмом, определяющим скорость всего процесса. Однако другим важным путем регуляции активности АФТФ является изменение концентрации субстрата реакции -фосфорибозилпирофосфата (ФРПФ), который образуется в клетке из рибозо-5-фосфата (Р-5-Ф) при участии фермента ФРПФ-синтетазы. Считается, что

• 5

изменения активности ФРПФ-синтетазы играют существенную роль в регуляции скорости биосинтеза (Watts, 1983). Поэтому изучение свойств ФРПФ-синтетазы и АФТФ сетчатки может способствовать пониманию особенностей регуляции процесса в сетчатке.

Имеется ряд сообщений о том, что скорость биосинтеза пуринов в клетках печени зависит от содержания в них Р-5-Ф. Авторы полагают, что это происходит за счет изменения активности фермента ФРПФ-синтетазы (Boer et al., 1976), (Pilz et al., 1984). Однако эти данные не нашли подтверждения в других работах (Chikenji et al, 1988). Регуляторная роль Р-5-Ф могла быть выяснена более точно в экспериментах, когда его содержание в клетке можно было бы изменять искусственно. Постановка таких экспериментов на клетках сетчатки не представляется возможной, однако, эта цель может быть легко достигнута с использованием отдельных клеток, в частности, классического объекта изучения биохимических процессов — Е. coli. Учитывая консервативность процесса биосинтеза пуринов, присутствующего в практически неизменном виде у представителей различных таксономических групп от простейших до млекопитающих, выяснение механизма, который осуществляет его регуляцию в клетках Е. coli в зависимости от концентрации Р-5-Ф, может быть полезным для понимания способов изменений скорости биосинтеза пуринов в клетках млекопитающих.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цели настоящего исследования: 1) Обнаружение и выяснение особенностей ФРПФ-синтетазы и АФТФ -ключевых ферментов биосинтеза пуринов - в сетчатке млекопитающих; 2) Изучение возможного влияния Р-5-Ф на активность АФТФ и ФРПФ-синтетазы в клетках Е. coli.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1) Выяснить, присутствуют ли в клетках сетчатки активности АФТФ и ФРПФ-синтетазы.

2) Изучить, изменяются ли активности этих ферментов в сетчатке и в печени крыс циклически в зависимости от условий освещенности.

3) Произвести очистку АФТФ и ФРПФ-синтетазы из сетчаток быка, изучить их свойства и кинетические характеристики в сравнении со свойствами ферментов печени.

4) Попытаться установить, существует ли взаимосвязь между изменениями содержания Р-5-Ф в клетках сетчатки и уровнем активности АФТФ и ФРПФ-синтетазы.

5) Получить систему, позволяющую оценивать активности АФТФ и ФРПФ-синтетазы в клетках Е. coli при различном содержании Р-5-Ф.

6) Выяснить, существует ли взаимосвязь между содержанием Р-5-Ф и активностями АФТФ и ФРПФ-синтетазы в клетках Е. coli.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫДВИГАЕМЫЕ НА ЗАЩИТУ. 1. В клетках сетчатки млекопитающих присутствуют ключевые ферменты биосинтеза пуринов - АФТФ и ФРПФ-синтетаза.

2. Активность АФТФ в сетчатке крыс изменяется циклически. Максимальная активность наблюдается в темной фазе цикла свет-темнота, минимальная - в светлой. Причиной этого являются, по-видимому, изменения активности фермента ФРПФ-синтетазы, также обладающей максимальной активностью ночью. Эти изменения не связаны с увеличением скорости образования Р-5-Ф в клетке в темной фазе цикла.

3. По своим свойствам и кинетическим параметрам фермент АФТФ сетчатки подобен ферменту печени. Фермент ФРПФ-синтетаза сетчатки обладает рядом тканеспецифических особенностей, а именно, измененным количественным соотношением субъединиц в составе молекулы, иным оптимумом pH и меньшей чувствительностью к ингибированию адениновыми нуклеотидами, чем фермент печени.

4. В клетках Е. coli присутствует механизм, осуществляющий регуляцию скорости биосинтеза пуринов в зависимости от наличия рибозы в среде. Этот механизм функционирует с участием RbsD белка - компонента высокоаффинного транспортера рибозы. RbsD белок не участвует в поглощении и утилизации рибозы в клетках Е. coli.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В клетках сетчатки млекопитающих обнаружены АФТФ и ФРПФ-синтетаза - ферменты биосинтеза пуринов de novo Показано, что в клетках сетчатки, в отличие от клеток печени, активности АФТФ и ФРПФ-синтетазы изменяются циклически. Причем эти изменения не сопровождаются изменениями скорости образования Р-5-Ф. Ферменты АФТФ и ФРПФ-синтетаза очищены из сетчатки быка и охарактеризованы. Определены значения молекулярных масс субъединиц ферментов, а также оптимальные условия реакций, значения кажущихся Кт и соответствующих Vmax для субстратов реакций. Обнаружено, что фермент АфТФ сетчатки подобен ферменту печени, тогда как ФРПФ-синтетаза обладает рядом тканеспецифических особенностей -увеличенным содержанием ассоциированных с ферментом белков в составе молекулы и меньшей чувствительностью к ингибированию АДФ и АМФ. Показано наличие АФТФ и ФРПФ-синтетазы в наружных и внутренних сегментах фоторецепторов.

В клетках Е. coli обнаружен механизм, который, по-видимому, осуществляет регуляцию скорости процесса биосинтеза пуринов в зависимости от наличия рибозы в среде и содержания Р-5-Ф в клетке. Этот механизм функционирует без изменений активностей ферментов АФТФ и ФРПФ-синтетазы. Основным звеном данного механизма является белок RbsD - компонент высокоаффинного транспортера рибозы, который, как оказалось, не участвует в поглощении и утилизации рибозы.

Обнаружено, что увеличенное содержание в клетке белка RbsD приводит к остановке роста клеток в присутствии рибозы за счет торможения биосинтеза пуринов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Нарушение обмена пуринов, а именно, существенное увеличение содержания в крови и выведения из организма конечного продукта их распада - мочевой кислоты - является одним из ранних признаков тяжелого заболевания сетчатки - наследственной дистрофии. В связи с этим исследования биосинтеза пуринов в сетчатке представляют особый интерес, так как обнаружение изменений содержания продуктов распада пуринов в крови и моче может быть ранним диагностическим тестом.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей 3 главы (методы исследований, полученные результаты и обсуждение результатов) и выводов. Диссертация содержит 24 рисунка и 17 таблиц, библиографию из 147 наименований. Полный объем диссертации составляет 119 страниц.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Предзащита диссертации состоялась 24 марта 1999 года на заседании секции Молекулярных основ эволюции функций Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН. Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 5 печатных работах. Результаты проведенных исследований были представлены на II Съезде биохимического общества РАН, Москва, 19-23 мая 1997 г., а также на международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", Москва, 21-25 сентября 1998 г.

Работа поддержана грантами РФФИ № 96-04-56013 и № 99-04-49-861.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Многообразие функций пуринов.

Пуриновые и пиримидиновые основания образовались в процессе эволюции, по-видимому, очень рано, когда условия среды могли благоприятствовать конденсации HCN, СО, СО2, Н2, NH3 и СН4 и образованию пуриновых оснований - аденина и гуанина. Нуклеозиды в свою очередь могли образоваться путем конденсации оснований и aD-рибозы в ходе абиотического синтеза, как было продемонстрировано в экспериментах по симуляции условий, существовавших на первичной Земле, в работе (Calvin, 1969). Во всех живых клетках молекулы пуриновых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов присутствуют в неизменном виде, не подвергаясь дальнейшим изменениям в ходе эволюции. Поэтому метаболический путь биосинтеза пуринов в клетках из таких веществ, как аминокислоты глицин, глутамин, аспартат, а также формиловая кислота и СО2, сформировался, по-видимому, позже в процессе эволюции (Chagoya de Sánchez, 1995).

Функции, выполняемые в клетке пуриновыми основаниями, нуклеозидами и нуклеотидами, чрезвычайно разнообразны. Объясняется это тем, что они входят в состав соединений, участвующих практически во всех жизненно важных процессах. А именно, пуриновые основания, которые входят в состав нуклеотидов, являются мономерами - предшественниками при биосинтезе ДНК и РНК; выполняют функции универсальных источников энергии (АТФ, ГТФ); служат акцепторами при окислительном фосфорилировании (АДФ); участвуют в передаче регуляторных сигналов (цАМФ, цГМФ); входят в состав коферментов (ФАД, НАД, НАДФ); служат переносчиками метальных групп (S-аденозилметионин); являются аллостерическими регуляторами активности ряда ферментов (Родуэлл, 1993).

Следует также обратить внимание на многообразные регуляторные эффекты пуринового нуклеозида аденозина. Начиная с 1929 года, когда в работе (Drury, Szent-Gyôrgyi, 1929) появилось сообщение о влиянии аденозина на сердечную функцию, перистальтику кишечника, гипотермию и сон,

накапливались данные о разнообразных эффектах этого нуклеозида. В том числе

таких, как нейромодуляторное действие в центральной нервной системе (Snyder,

1985), регуляция кровотока в сердечно - сосудистой системе (Berne et al., 1974),

функции метаболического модулятора (Fredholm, 1978) а также модуляция

иммунного ответа (Zimmerman et al., 1983). Роль аденозина в клеточной

физиологии, а также основные пути его метаболизма схематически представлены

на рисунке 1. Очевидно, что аденозин обладает чрезвычайно разнообразными

функциями, которые можно рассматривать