Мутагенез, индуцированный N-метил-N,-нитро-N-нитрозогуанидином, в культурах делящихся и неделящихся клеток Escherichia Coli

Цветкова, Наталья Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Мутагенез, индуцированный N-метил-N,-нитро-N-нитрозогуанидином, в культурах делящихся и неделящихся клеток Escherichia Coli
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Мутагенез, индуцированный N-метил-N,-нитро-N-нитрозогуанидином, в культурах делящихся и неделящихся клеток Escherichia Coli"

На правах рукописи

ЦВЕТКОВА Наталья Александровна

МУТАГЕНЕЗ, ИНДУЦИРОВАННЫЙ N-MET1LJ1-N'-HHTP0-N-НИТРОЗОГУАНИДИНОМ, В КУЛЬТУРАХ ДЕЛЯЩИХСЯ И НЕДЕЛЯЩИХСЯ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 2005

Работа выполнена в лаборатории химического мутагенеза Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Голясная Надежда Викторовна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кузяев Рафаэль Зиафутдинович доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович

Ведущая организация: Казанский государственный университет, кафедра микробиологии

Защита состоится " $ " УивЛ«-* 2005 г. в / в часов на заседании

Диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, Пермь, ул. Голева, 13. Факс: (3422) 44 67 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан " 8 " ЦЫ&НЛ 2005 г.

Ученый секретарь диссерта! гй,

чл.-корр РАН

Лвшина Ирина Борисовна

lM>t-4 Wl

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Интенсивное развитие промышленного производства значительно увеличило антропогенный прессинг на объекты окружающей среды. К наиболее опасным компонентам загрязнения окружающей среды относятся химические соединения и физические факторы, вызывающие повреждения наследственного материала живых организмов (Pollard et al, 1981; Singer et al., 1982; Cooper et al., 1990; Causton et al., 2001). В ответ на повреждения ДНК в клетке активируются процессы точного восстановления первоначальной структуры ДНК и механизм мутагенеза, обеспечивающий жизнеспособность клеток с потенциально летальными повреждениями генома.

Актуальность исследований репарации повреждений ДНК определяется фактами существования связи между дефектами систем восстановления предмутационных ошибок в геноме и нарушением регуляции экспрессии генов, снижением скорости роста и жизнеспособности клеток прокариот (Bohr et ed., 1981; Lin et ed., 1997; Balajee et al., 2000). Несмотря на значительные успехи в изучении процесса репарации ДНК, по-прежнему основное количество исследований сфокусировано на изучении причин нестабильности генома и механизмов резистентности бактериальной клетки к действию химических соединений или физических факторов (Moolenaar et al., 2000; Wani et al., 2000; Sutton et al., 2001). Альтернативные, на первый взгляд, исследования направлены на решение актуальной задачи -сохранение многообразия живых форм на Земле и решение более узких практических задач -роль аккумуляции мутаций в формировании пагогенности сапрофитных микроорганизмов, разработка новых подходов получения микроорганизмов-продуцентов или -деструкторов химических соединений. С точки зрения здоровья человека актуальность исследований заключается в определении клеточных механизмов мишеней, чувствительных к действию антибактериальных препаратов, с целью создания более эффективных терапевтических средств (Ferguson, 1999).

et ей., 2003). Изменение физиологического состоят и (ЕМиНДДОМПЮЫЮде «я факторов

БИБЛИОТЕКА

СП 09

внешней среды и нарушение баланса внутриклеточных механизмов ведет к формированию пшермутабельных субпопуляций микроорганизмов или каскаду мутационных процессов в клетках эукариот (Zambrano et al, 1993; Berwick et al., 2000; Rosche, et al., 2000; Mohrenweiser et ed., 2003). Одна из современных гипотетических моделей мутагенеза объясняет появление пшермутабельных субпопуляций клеток как результат переключения с механизма точной репарации повреждения ДНК на потенциально мутагенную репликацию с сохранением повреждения. Контекст нуклеотядной последовательности, окружающий предмутагенное повреждение, и его химическая структура оказывают влияние на частоту и тип индуцированных мутаций (Batty et al., 2000; Bhamre et al., 2001). Процессы мутагенеза и репарации ДНК интегрируются в механизм регуляции деления клетки и, как самостоятельные явления, необходимы для регуляции экспрессии генов (Memisoglu et ей., 2000; Murli et al., 2000; Causton et cd., 2001). В контексте этой гипотезы актуальной задачей является изучение процессов, ведущих к высокому уровню спонтанного мутагенеза, и понимание природы резистентности к мутагенным факторам клеток, испытывающих физиологический стресс.

Цель настоящего исследования - изучение влияния дефектов систем репарации и дефицита глобального регулятора генов стационарной фазы роста на мутагенез, индуцированный К-метил-Книтро-К-нитрозогуанидином, в культурах делящихся и неделящихся клеток Escherichia coli в условиях ингибирования процессов транскрипции и трансляции.

Конкретные задачи исследования:

1. Сравнить частоту мутаций, индуцированных N-Meran-N'mrrpo-N-нитрозогуанидином, в культурах делящихся и неделящихся клеток штаммов Е. coli, дефектных по системам репарации.

2. Исследовать процесс индуцированного мутагенеза в условиях ингибирования процессов транскрипции или трансляции.

3. Оценить влияние ингибиторов транскрипции или трансляции на процесс индуцированного мутагенеза в адаптированных к N-Menm-N'mnpo-N-нитрозогуанидину клетках Е. coli.

4. Изучить индукцию ЬехА-контролируемого промотора гена cda в ответ на обработку клеток Е. coli N-Memn-N' нитро-1Ч-нитрозогуанидином,

закисленяю среды, а также неделящихся (стационарная фаза роста и клетки, деление которых временно блокировано осмотическим стрессом) Е coli дикого типа, Е. coli uvrA, Е. coli rpoS, Е. coli ada. Установлено, что необходимым условием переключения с SOS-зависимого на SOS-независимый механизм репарации является белок RpoS.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о процессах репарации и мутагенеза, индуцированного монофункциональными алкялирующими соединениями. Установлено, что в неделящихся клетках или клетках, толерантных к закислению, индуцируется SOS-зависимая резистентность к N-Meran-N1 шпро-М-нитрозогуанидину. Выявлено, что в резистентных к N-Memn-№nnpo-N-нитрозогуанидину клетках период, характеризующийся слабой экспрессией LexA-коэтролируемого промотора гена cda и активацией процесса точной репарации ДНК, сменяется на период высокой экспресии и индукции мутагенеза Показано, что белок RpoS в неделящихся и толерантных к закислению клетках необходим для механизма переключения с процесса точной репарации на механизм SOS-зависимого индуцированного мутагенеза.

В результате проведенных исследований получен рекомбинантный штамм Е coli B/r WP2s uvrA, trpE65 с плазмидой pPLS-1, несущей ЬехА-контролируемую транскрипционную сшивку pcda::luxCDABE, обладающий высокой чувствительностью к генотоксическому действию химических соединений. Сочетание экспрессного биолюминесцентного анализа и классического подсчета реверсий от ауксотрофности к прототрофности по триптофану позволяет повысить качество оценки потенциального и прямого мутагенного действия химических соединений.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В культурах неделящихся клеток стационарной фазы роста, подвергнутых действию осмотического стресса, и в культурах клеток, толерантных к закислению среды, уровень частоты мутаций, индуцированных N-Memn-N,Hmpo-N-нитрозогуанидином, ниже, чем в культурах клеток логарифмической фазы роста.

2. Ингибирование процесса транскрипции повышает, а процесса трансляции снижает уровень частоты мутаций, индуцированных N-Mercui-N'HHTpo-N-нитрозогуанидином, в клетках Е. coli дикого типа, Е coli ada, Е. coli rpoS, но не Е. coli uvrA.

3. Экспрессия LexA-контролируемой транскрипционной сшивки pcda::luxCDABE в клетках Е coli стационарной фазы роста; клетках, толерантных к закислению, и в клетках, подвергнутых действию осмотического стресса, более выражена, чем в клетках логарифмической фазы роста, растущих при оптимальных условиях среды.

4 Точная репарация ДНК происходит в период слабой экспрессии LexA-контролируемой транскрипционной сшивки рcdav.luxCDABE в клетках Е coli дикого типа, Е coli ada, Е coli rpoS, но не в клетках Е. coli uvrA, обработанных N-Memn-N' нитро-!Ч-нитрозогуанидином или подвергнутых действию осмотического стресса.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Конференциях молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии", Пермь, 1999; "Студент и научно-технический прогресс", Новосибирск, 2000; "Актуальные проблемы биологии и экологии", Сыктывкар, 2000; Международной научно-практической конференции "Загрязнение окружающей среды и здоровье населения", Смоленск, 1999; I Всероссийской научной конференции с международным участием "Влияние загрязнения окружающей среды на здоровье человека", Новосибирск, 2002.

Всего по теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков и 9 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 216 литературных источников, из них 9 отечественных и 207 зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме "Изучение процессов спонтанного и индуцированного мутагенеза в условиях экспериментальной и реальной химической нагрузки" (номер государственной регистрации 01.9.00017990). Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 00-04-96096 и молодежного научного гранта РАН № 285.

Список принятых сокращений: МННГ - К-метил-МГ-нитро-Н-нитрозогуанидин; УФ - ультрафиолетовое излучение; КФБ - калий фосфатный буфер; Р - рифампицин; X -хлорамфеникол; F, - фактор индукции биолюминесценции; os - сигма S субъединица РНК - полимеразы; aD - сигма D субъединица РНК - полимеразы; ""Ada - метилированный белок Ada.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы Е. coli и плазмида. В работе использовали два штамма Е. coli B/r WP2 trpE65 и B/r WP2s uvrA, trpE65, полученные из Института общей генетики имени академика Н И Вавилова РАН, Москва, а также четыре штамма K12s hisGA, АВ2421 thr-1,

агаСН, 1еиЫ, lacYX, gaIK2, uvrAb, argE3(0c), AwG4(0c), PJ2 thr-\, araCU, feuB6, lacY\, galK2, addl, orgE3(0c), /iwG4(0c) и JC7623 /Ar-Л апгСН, leuBÓ, lacYl, galK2, rpoS396(Am), argE3(Oc), A/íG4(0c), полученные из E. coli центра (Е. coli Genetic Stock Center, Yale University, США). Плазмиду pPLS-1 p«fc:.7taCDABE, AmR (Птицын, 1996) выделяли из клеток Е coli С600 F,thi-l,thr-l, leuBó, lacYl, tonA21,supE44.

Инкубационные среды, антибиотики, химические вещества. Для выращивания Е coli использовали жидкие и агаризованные среды: LB (Luria Bertani) и глюкозо-минеральная среда М9. Для оценки частоты реверсий от ауксотрофности к прототрофности по триптофану Е. coli B/r trpE или по гисщдину Е. coli К12 hisG4 в глюкозо-минеральную агаризованную среду М9, соответственно, добавляли тиамин и триптофан (0,5 мкг/мл и 1 мкг/мл) юга аргинин, лейцин (по 200 мкг/мл) и гистидин (80 мкг/мл). Клетки ресуспендировали в КФБ с pH 7,4 или 6,5. В работе использовали антибиотики (Sigma): ампициллин (50 мкг/мл), рифампицин (10 мкг/мл), хлорамфеникол (40 мкг/мл). В качестве мутагена использовали К-метил-К'-нитро-К-нитрозогуанидин (МННГ) (2 и 10 мкг/мл, Sigma).

Оценка частоты индуцированных мутаций. Адаптированные к МННГ клетки Е. coli были получены при инкубации в течение 60 мин суспензии 2*10® клеток/мл (логарифмическая фаза роста) или 10|2-1013 клеток/мл (стационарная фаза роста) в LB-бульоне с добавлением МННГ до конечной концентрации 2 мкг/мл. pH инкубационной среды доводили до 7,4, для получения культур клеток логарифмической (растущих в оптимальных условиях) и стационарной фаз роста, или до pH 6,5, для получения культур клеток, толерантных к закислению. Осмотический стресс вызван инкубацией клеток в течение 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин в LB-бульоне с добавлением NaCl (500 мМ). Контрольные варианты субкультур инкубировали в LB-бульоне в течение 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин на шейкере. После инкубации в LB-бульоне без или с добавлением NaCl (500 мМ) субкультуры центрифугировали 15 мин при 5000 об/мин, клетки ресуспендировали в КФБ и добавляли МННГ до конечной концентрации 10 мкг/мл. Обработанные мутагеном клетки инкубировали в течение 60 мин при 37° С на шейкере. Оценку частоты индуцированных мутаций проводили согласно методу количественного учета частоты индуцированных мутаций (Ames et al, 1975; Mortelmans et al, 2000). Частоту индуцированных мутаций рассчитывали по соотношению разности количества индуцированных и спонтанных ревертантов к количеству живых клеток в 1 мл культуры Е. coli, обработанной МННГ (Sedgwick et al, 1972; Скавронская и др., 1974).

Определение ß - галактозидазы проводили по методу Д. Миллера (1976).

Определение белка. Количество белка в пробе определяли по микрометоду О.Н Lowry (1951), с использованием Diagnostic Kit "Protein, total, Lowry micro method" (Sigma).

Определение РНК в клетках проводили по методу Д. Миллера (1976), рассчитывая концентрацию РНК, ДНК и коэффициент молярной экстинкции в пакетном режиме обработки данных (Integrated DNA Technologies (http://www.idtdna.com/program/techbulletins, [14.09.1998]) Technical Bulletins).

Выделение плазмидной ДНК. Плазмиду pPLS-1 (AmR) из клеток Е. coli С600 выделяли по методу Т. Маниатиса (1984).

Трансформация. Трансформацию клеток Е. coli плазмидной ДНК проводили по методу Т. Маниатиса (1984). Рекомбинантные клетки отбирали на LB-arape с добавлением ампицилина.

Биолюминесцентиый анализ проводили по методу, предложенному JI.P. Птициным (1996). Измерение биолюминесценции проведено на приборе "Биотокс-6".

Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли с использованием компьютерной программы Excel 1998 (Microsoft Inc., 1998), рассчитывая среднее арифметическое, доверительный интервал, стандартное отклонение. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Все эксперименты были выполнены в трех - пяти повторностях. Для решения отдельных задач применяли двухфакторный дисперсионный анализ Р. Фишера (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка частоты индуцированных мутаций в культурах делящихся н неделящихся клеток Е. coli. При изучении процесса мутагенеза, индуцированного алкилирующим соединением, выбраны делящиеся и неделящиеся клетки, как две модельные системы для оценки частоты реверсий охр мутации в генах trpE или hisG. Культура клеток середины логарифмической фазы роста состоит из растущих и активно делящихся клеток в среде с рН 7,4 и клеток, толерантных к закислению среды и растущих при рН 6,5. Неделящиеся клетки представлены культурами клеток стационарной фазы роста и клетками, в которых процесс деления временно и обратимо блокировав высоким осмотическим давлением. На рис. 1 представлены результаты, свидетельствующие о том, что в культурах неделящихся клеток и клеток, толерантных к закислению, штаммов дикого типа Е coli группы В (trpE) и К12 (hisG) частота индуцированных мутаций меньше, чем в культуре делящихся клеток.

2.Е-06

- I-i-i-i-i-i-i

l.E-06

O.E+OO

hiñ

WP2

C=31

K!2s 12ЕШЗ -*-4

JC7623

Рис. 1. Частота индуцированных мутаций в культуре клеток Е. coli стационарной фазы роста (1); толерантных к закислеиию (2); подвергнутых действию осмотического стресса (3).

В качестве контроля представлена частота индуцированных мутаций в культурах клеток Е coli WP2 (4) и Е coli Kl 2s (5) логарифмической фазы роста, pH 7,4. * - Достоверно при уровне значимости Р<0,05.

Проведенный двухфакторяый дисперсионный анализ свидетельствует о статистически достоверном влиянии изменения физиологического состояния, вызванного pH среды 6,5, или переходом в стационарную фазу роста, на процесс индуцированного мутагенеза в культурах клеток штаммов Е. coli WP2 дикого тала, Е coli WP2s uvrA и Е. coli PJ2 ada (табл. 1). Выявленное уменьшение частоты индуцированных мутаций в культурах клеток логарифмической фазы роста при pH 6,5 Е coli WP2 дикого типа, Е. coli WP2s uvrA и Е. coli PJ2 ada может быть объяснено изменением физиологического состояния клеток, основной характеристикой которого является индуцибельная толерантность к закислению и экспрессия генов RpoS регулона (Arnold et al., 2000). В связи с тем, что экспрессия гена rpoS+ является характерным признаком, как клеток стационарной фазы роста, так и инкубируемых в среде с кислым значением pH или с высоким осмотическим давлением, была проведена оценка частоты индуцированных мутаций в культурах клеток штамма, мутантного по rpoS гену (рис. 1). В работе установлено, что факторы, блокирующие деление клеток, не влияют на процесс индуцированного мутагенеза, а частота индуцированных мутаций не зависит от фазы роста культуры клеток штамма, мутантного по rpoS гену. Таким образом, установлено, что процесс индуцированного мутагенеза в культурах клеток Е. coli стационарной фазы роста или делящихся, но толерантных к закислеиию среды, зависит от белка RpoS или продуктов генов, регулируемых белком RpoS.

Таблица 1.

Оценка влияния закисления среды на частоту индуцированных мутаций в культуре клеток С. coli логарифмической фазы роста

Номер Статистические показатели

штамма Fa* ¥Ъ** Fab Л2а n2b H2ab F<pa Fcpb F<pab

WP2 trpE65, 55,3 8,1 5,3 76% 10% 14% 12,7 0,4 0,65

WP2s uvrA, ftpE65, 200,4 47,9 38,1 70% 17% 13% 9,3 0,85 0,65

jcm гройЩ teG4(Oc) 1796 1481 1275 39% 33% 28% 2,6 1,9 1,6

PJ2, add2, ШЩХ) 310 32,4 30,3 83% 9% 8% 13,9 0,4 0,4

Примечание. * а - pH инкубационной среды; ** - фактор b - возраст культуры; т] -сила влияния фактора на результативность признака; F - критерий достоверности Фишера для фактических данных; F<p - критерий достоверности Фишера силы влияния фактора, при уровне значимости Р<0,05 Fst=7,7.

Индуцированный мутагенез в культурах клеток штаммов Е. coli, мутантных по эксцизионной репарации нуклеотидов или системе адаптивной репарации.

Генетическими исследованиями доказано, что в Е coli SOS-зависимый и SOS-независимый механизмы репарации восстанавливают повреждения ДНК, индуцированные МННГ (Rebeck et al, 1989; Aebi et al., 1997; Begley et al, 2003). В SOS-зависимом механизме участвует эксцизионная репарация нуклеотидов. По крайней мере, две системы репарации участвуют в SOS-независимом механизме; адаптивная репарация, в том числе, 06-метилтуанин-ДНК метилтрансфераза II (Rebeck et al, 1989), и эксцизионная репарация оснований (Bjelland et al, 1993). Предполагается, что конкурентное функционирование SOS-системы и адаптивной репарации влияет на процесс индуцированного мутагенеза в Е. coli, и механизм одной системы репарации препятствует индукции сигнала, активирующего вторую систему (Courcell et al, 1999). По нашим данным, на фоне дефекта SOS-независимого механизма репарации (штамм Е coli add) чувствительность к мутагенному действию МННГ неделящихся клеток или клеток, толерантных к закислению, статистически достоверно меньше, чем клеток, растущих при оптимальных условиях среды (рис. 2 А). Более того, адаптация к МННГ не влияет на снижение мутагенеза в

культурах неделящихся клеток шш клеток Е coli PJ2 ada, толерантных к закислению среды (рис. 2 Б).

2.0Е-05 г

1.8Е-05 ::-i-i-i-$ t=31

« I.6E-05 i i-1-1-$-1

23-05

I I I I I

С=Э1

l,E-05

ES203

ь- j-ы-г4

03+00

T12 WP2s

PJ2 WP2s

Рис. 2. Частота индуцированных мутаций в клетках неадаптированных (А) н адаптированных к МННГ (Б).

Культуры клеток: толерантных к закислению (1); стационарной фазы роста (2); подвергнутых действию осмотического стресса (3). В качестве контроля представлена частота индуцированных мутаций в культурах клеток штаммов £ coli PJ2 ada (4) и Е coli WP2s uvrA (5), логарифмической фазы роста, pH 7,4. * - Достоверно при уровне значимости Р<0,05.

Результаты позволили предположить, что в культурах неделящихся клеток тенденция снижения частоты индуцированных мутаций связана с активностью SOS-зависимого механизма репарации. Более высокая чувствительность неделящихся клеток штамма Е. coli WP2s uvrA, по сравнению с Е. coli PJ2 ada, к мутагенному действию МННГ подгвервдает предположение об участии SOS-зависимого механизма репарации (рис. 2 А). Наличие адаптивного ответа к МННГ (2мкг/мл) в Е. coli WP2s uvrA (рис. 2 Б) свидетельствует о функционировании системы адаптивной репарации. Так как в клетках Е coli JC7623 rpoS на индуцированный мутагенез не влияют pH, осмотическое давление среды или возраст культуры клеток (см. рис. 1), то результаты свидетельствуют о том, что ключевым моментом перехода от SOS-зависимого к SOS-независимому механизму репарации является белок RpoS или продукты генов, регулируемых белком RpoS.

Влияние ингибиторов транскрипции или трансляции на процесс индуцированного мутагенеза в культурах клеток Е. coli. Кроме глобальной эксцизионной репарации нуклеотидов в механизме восстановления повреждений ДНК в делящихся и неделящихся клетках участвует модель эксцизионной репарации

нуклеотидов, сопряженная с транскрипцией (Selby et al., 1994; Selby et al., 1997). В отличие от глобальной эксцизионной репарации нуклеотидов ключевым моментом инициации транскрипционно-зависимой модели эксцизионной репарации является остановка РНК-полимеразы возле поврежденного сайта. Ингибирование процесса транскрипции рифампицином вызывает увеличение, а ингибирование процесса трансляции хлорамфениколом уменьшение частоты индуцированных мутаций (Crowley et al., 1998; Selby et al., 1993.). Субстратами эксцизионной репарации нуклеотидов, сопряженной с транскрипцией, являются циклобутановые пиримидиновые димеры и (6-4)-фотопродукты, индуцируемые УФ излучением в ДНК Е. coli. В литературе отсутствуют факты, подтверждающие участие транскрипционно-зависимой модели репарации в удалении продуктов метилирования оснований ДНК в клетках прокариот. На рис. 3 представлены результаты экспериментов по индуцированному мутагенезу в делящихся и неделящихся клетках штаммов Е coli дикого типа и мутантного по ada гену. Установлено, что частота индуцированных мутаций статистически достоверно (Р<0,05) увеличивается в результате ингибирования процесса транскрипции и уменьшается при ингибировании процесса трансляции (рис. 3).

4.Е-05

23-05

О Í-H»

i h

j=l

жп

■

Жа

г:

■i 4

ЕЗЭ2

-í- 6

♦ 5

WP2(I) WP2(D) PJ2 (I) PJ2 (П) Рис. 3. Частота индуцированных мутаций при ингибировании процессов транскрипции (1) и трансляции (2) в культурах клеток логарифмической (I) и стационарной фаз роста (П) Е. coli B/r WP2 дикого типа и Е. coli PJ2 ada. В качестве контроля представлена частота индуцированных мутаций в культурах клеток Е coli B/r WP2 логарифмической (3) и стационарной (4) фаз роста; в культурах клеток Е. coli PJ2 ada логарифмической (5) и стационарной (6) фаз роста. *- Достоверность отличий между частотой мутаций, индуцированных МННГ и МННГ в условиях ингибирования

процесса транскрипции, а

достоверность отличий между частотой мутаций,

индуцированных МННГ и МННГ в условиях ингибирования процесса трансляции, при уровне значимости Р<0,05.

Отсутствие альтернативного влияния рифампицина и хлорамфеникола на индуцированный мутагенез и увеличение частоты индуцированных мутаций при ингибировании процесса транскрипции или процесса трансляции в Е. coli uvrA подтверждает участие транскрипционно-зависимой модели репарации повреждений ДНК в клетках Е. coli дикого тала (рис. 4 А).

4.Е-06 З.Е-06 2.Е-06 1.Е-06

0,Е+00

Рис. 4. Частота индуцированных мутаций при ингибировании процессов транскрипции (1) и трансляции (2) в культурах клеток штаммов £. соИ \VP2s ю/гА (А) и £ сои .1С7623 /улУ (Б).

Культуры клеток логарифмической (I), стационарной фаз роста (П), толерантных к закислению (ПГ), подвергнутых действию осмотического стресса (IV). В качестве контроля представлена частота индуцированных мутаций в культурах клеток: логарифмической (3) и стационарной (4) фаз роста; толерантных к закислению (5); подвергнутых действию осмотического стресса (6). * - Достоверность отличий между частотой мутаций, индуцированных МННГ и МННГ при ингибировании процесса транскрипции, а ** - достоверность отличий между частотой

транскрипции, а ** - достоверность отличий между частотой мутаций, индуцированных МННГ и МННГ при ингибировании процесса трансляции, при уровне значимости Р < 0,05.

Установлено, что в культурах делящихся и неделящихся клеток Е. coli JC7623 rpoS, ингибирование транскрипции увеличивает, а ингибирование трансляции уменьшает частоту индуцированных мутаций (рис. 4 Б). Результаты, полученные в экспериментах с Е coli JC7623 rpoS, свидетельствуют об участии транскрипционно-зависимой репарации в защите клеток от мутагенного действия МННГ. Таким образом, в работе было показано участие транскрипционно-зависимой репарации в восстановлении повреждений ДНК, индуцированных МННГ в клетках Е coli. Транскрипционно-зависимая модель репарации не зависит от RpoS белка.

Влияние ингибиторов процессов транскрипции или трансляции на процесс индуцированного мутагенеза в адаптированных к МННГ культурах клеток Е. coli В клетках стационарной фазы роста модель регуляции Ada оперона отличается от модели регуляции в клетках логарифмической фазы роста тем, что в неделящихся клетках в индукции адаптивного ответа участвует с^-факгор, продукт гена rpoS. Необходимо отметить, что гены адаптивного ответа транскрибируются в клетках стационарной фазы роста более эффективно субъединицей о8, чем о70, даже в отсутствии ""Ada. Например, экспрессия гена aidB+ в неделящихся клетках выше, чем в делящихся клетках (Landini et al., 2000). Сравнительный анализ экспериментальных данных показал, что уровень резистентности к мутагенному действию МННГ делящихся и неделящихся адаптированных к алкилирующему соединению клеток штамма дикого типа приблизительно одинаковый (табл. 2).

Таблица 2.

Частота индуцированных мутаций в клетках Е. соИ В/г \УР2, адаптированных к МННГ

Частота индуцированных мутаций в культурах клеток

Вариант Логарифмической Толерантных к Стационарной При осмотическом

фазы роста закислению фазы роста стрессе

Контроль" (2,4 ± 0,002) хЮ"6 (4,7 ±0,09) хЮ"7 (2,2 ±0,02) *10'7 (4,5 ± 0,5) х10"7

МННГ (3,5 ±0,5) хЮ'8* (2,8±0,04)*10"7* (3,9 ± 0,03) х 10"®* (2,4 ± 0,02) хЮ"7*

МННГ+Р (1,4±0,02) хЮ"7** (4,7±0,3)х10"6** (1,4 ±0,2) хЮ"7** (8,7 ± 0,9) хЮ"4**

МННГ+Х (4,8 ± 0,6) х Ю'7** (9,8±0,2)х10'6** (1,1 ±0,01) хЮ"7** (2,1 ± 0,7) хЮ***

Примечание. " - частота индуцированных мутаций в культурах клеток неадаптированных к МННГ; * - статистически достоверные отличия частоты мутаций,

индуцированных МННГ, от контрольных' значений при уровне значимости Р<0,05; ** - статистически достоверные отличия частоты мутаций, индуцированных МННГ, от частоты мутаций, индуцированных МННГ в комбинации с рифампицином (Р) или хлорамфениколом (X), при уровне значимости Р<0,05.

Ингибирование транскрипции или трансляции вызывает повышение частоты индуцированных мутаций во всех экспериментальных вариантах культур клеток штаммов Е. coli WP2 дикого типа (табл. 2) и Е. coli WP2s uvrA (рис. 5).

1.0Е-04

5.0Е-05

0,ОЕ+00

BS2

1 II III

Рис. 4. Частота индуцированных мутаций при ингибировании процессов транскрипции (1) и трансляции (2) в культурах адаптированные! клеток Е. coli WP2s uvrA.

Культуры клеток логарифмической (I) и стационарной (II) фаз роста, толерантных к закислению и подвергнутых действию осмотического стресса (HI). В качестве контроля представлена частота индуцированных мутаций в культурах клеток' логарифмической (3) и стационарной (4) фаз роста, pH 7,4; толерантных к закислению (5); подвергнутых действию осмотического стресса (6). * - Достоверность отличий между частотой мутаций, индуцированных МННГ и МННГ при ингибировании процесса транскрипции, а ** -достоверность отличий между частотой мутаций, индуцированных МННГ и МННГ при ингибировании процесса трансляции, при уровне значимости Р<0,05.

Полученные результаты согласуются с известным фактом отсутствия адаптивного ответа в условиях ингибирования синтеза белка в клетке, так как Ada оперон регулируется на транскрипционном уровне (Demple et al, 1990; Landini et al., 2000). Эксперименты с адаптированными к МННГ клетками дополнительно подтвердили предположение, что в условиях дефекта адаптивной репарации в клетках штамма Е coli PJ2 ada или механизма регуляции генов адаптивной репарации в Е. coli JC7623 rpoS в восстановлении

повреждений ДНК, индуцированных МННГ, участвует модель транскрипционно-зависимой репарации.

Оценка индукции ЬехА-контролируемой транскрипционной сшивки pcdav.luxCDABE в штаммах Е. coli. Инициация экспрессии генов SOS-ответа возникает в результате Ree А* опосредованного авторасщепления белка LexA. Продукты LexA-контролируемых генов участвуют в процессах репарации ДНК, индуцированного мутагенеза и в регуляции деления клетки (Brent et al., 1981). Несмотря на простую схему SOS-ответа, координация индукции SOS-генов является наиболее сложным этапом этого процесса. В работе F. Taddei с соавторами (1995) было установлено, что в клетках Е. coli происходит цАМФ - и фо5-зависимая индукция SOS регулона в условиях недостатка питательных веществ в среде. С целью изучения индукции SOS-зависимого ответа в работе использовали рекомбинантные штаммы с плазмидой pPLS-1. При конструировании плазмиды pPLS-1 в сшивке промотора гена eda и генов-репортеров lux оперона, клонированного из Photobacterium leiognathi, воспроизведен принцип регуляции генов SOS-ответа (Птицын, 1996). Гены ¡их оперона находятся под контролем LexA-регулируемого промотора гена cda+, кодирующего колицин ColD Е. coli. При обработке мутагенами рекомбинантных штаммов Е. coli экспрессия pcda::luxCDABE прямо пропорциональна количеству синтезированной люциферазы, интенсивности биолюминесценции (Rettberg et al, 1999) и коррелирует с активностью люциферазы (Gu et al., 2000).

По данным биолюминесцентного анализа, штаммы Е coli отличаются по уровню экспрессии pcda::luxCDABE, индуцированной МННГ. В культурах клеток штаммов группы В и К12, как дикого типа, так и мутантных по эксцизионной репарации нуклеотидов, значения фактора индукции биолюминесценции (F,) в неделящихся клетках выше, чем в делящихся клетках (рис. 6). Обработка нитрозогуанидином в течение 60 мин культуры клеток логарифмической фазы роста Е coli PJ2 ada вызывает fte только максимальную экспрессию lux оперона (рис. 6), но и высокую частоту мутаций, а

(1,8±0,06)х10'5 (см.

рис. 2 Б). По сравнению с культурой клеток логарифмической фазы роста, обработка нитрозогуанидином неделящихся клеток Е coli PJ2 ada вызывает снижение как фактора индукции биолюминесценции (F,) в 90 раз (рис. 6), так и частоты индуцированных мутаций в 20 раз (см рис. 2 Б).

О i!

WP2 WP2s AB2421 PJ2 JC7623 —»

Рис. 6. Фактор ицдукции биолюминесценции в культурах клеток стационарной, pH 6,5 (Г), логарифмической, pH 6,5 <11) фаз роста, подвергнутых действию осмотического стресса (П1).

В качестве контроля представлен фактор индукции биолюминесценции в культурах клеток логарифмической фазы роста, pH 7,4, Е coli WP2 дикого типа (1), Е. coli WP2s uvrA (2), Е. coli AB242J uvrA" (3), E. coli PJ2 ada (4), E. coli JC7623 rpoS (5). » - Достоверно при P<0,05.

Уровень F, МННГ в культуре клеток стационарной фазы роста штамма Е. coli rpoS не отличается от уровня F, МННГ в культуре клеток логарифмической фазы роста. Однако высокое осмотическое давление среды вызывает статистически достоверное (при Р<0,05) снижение F, в культуре клеток Е coli rpoS. Изучение функциональной зависимости F, от продолжительности нелетального селективного действия высокого осмотического давления среды, блокирующего деление клеток, позволило установить, что осмотический стресс в течение 10 мин и последующая обработка МННГ вызывают повышение F, в клетках штаммов дикого типа и мутантного по эксцизионной репарации нуклеотидов (рис. 7 А). Известно, что SOS-ответ индуцируется через 22,5 мин после обработки клеток Е coli веществами, повреждающими ДНК (Relan et al., 1996). Если в клетках, мутантных по эксцизионной репарации нуклеотидов, экспрессия lux оперона достигает максимума после 10 мин осмотического стресса, а затем выходит на плато, то в клетках Е. coli дикого типа два пика повышения F, Второй пик повышения F, вызван осмотическим стрессом продолжительностью 50 мин. .

0 10 —■wra

--O--WP2s"

20 30 40 50 60 '» WP2* —« WHi

»1 «. 2

190 ;; i 6

-Ü-- 5- — 3

10 20 30 40

_.«_. 4

-JC7623

PJ2*

Рис. 7. Фактор индукции биолюминесценции МННГ в культурах клеток штаммов Е. coli WP2 дикого типа и Е. coli WP2s uvrA (А); Е. coli JC7623 /уо5 и К coli PJ2 ada (Б), подвергнутых действию осмотического стресса.

В качестве контроля представлен фактор индукции биолюминесценции МННГ в неадаптированных к МННГ культурах клеток при оптимальном осмотическом давлении среды и pH 7,4: Е. coli WP2 дикого типа (1), Е coli WP2s uvrA (2), Е. coli PJ2 ada (3), E. coli JC7623 rpoS (4). * - Адаптированные к МННГ клетки Е. coli.

Анализ динамики выживаемости и частоты индуцированных мутаций в культуре клеток штамма дикого типа показал, что осмотический стресс в течение 30 мин и последующая обработка клеток МННГ вызывают уменьшение количества живых клеток в 1,2 раза. Воздействие алкилирующего соединения вызывает уменьшение (в 1,5 раза) количества живых клеток, подвергнутых осмотическому стрессу в течение 40 или 50 мин. Частота индуцированных мутаций в культурах клеток, подвергнутых осмотическому стрессу продолжительностью 10, 30 и 40 мин, одинаковая, и статистически достоверно в 5,8 раза меньше, чем в контроле-(2,7±0,01)><10'6. Ингибирование процессов транскрипции или трансляции, соответственно повышает или снижает частоту индуцированных мутаций в культуре клеток штамма дикого типа, инкубированной в течение 50 мин в среде с высоким осмотическим давлением. Двухфазный характер изменения F, наблюдается как в неадаптированных, так и адаптированных к МННГ клетках Е coli дикого типа. Характерными особенностями клеток Е. coli дикого типа, адаптированных к МННГ, являются выход F, на плато после 40 мин осмотического стресса; фактор индукции

биолюминесценции приблизительно в 3 раза больше, чем в неадаптированных клетках. Ингибирование процесса транскрипции увеличивает, а ингибирование процесса трансляции уменьшает частоту индуцированных мутаций в культурах клеток, подвергнутых действию осмотического стресса в течение 10,20 и 30 мин. Осмотический стресс в течение 40 мин снижает частоту индуцированных мутаций с (5,4±0,04)хЮ"6 до (6,3±0,03)х10"8. Ингибиторы процессов транскрипции и трансляции увеличивают частоту индуцированных мутаций соответственно до (4,2±0,02)х10'6 и (1,1±0,001)*10'7 при отсутствии бактерицидного действия после 40 мин осмотического стресса или при снижении выживаемости в 3 раза после 50 и 60 мин осмотического стресса. Последняя характеристика свидетельствует о функционировании адаптивной репарации. Аналогичное влияние ингибиторов процессов транскрипции и трансляции на индуцированный мутагенез зарегистрировано в адаптированных к МННГ культурах клеток Е coli wrA, подвергнутых действию осмотического стресса в течение 10-60 мин.

Как в культурах клеток Е. coli дикого типа, так и в культурах клеток Е. coli ada, неадаптированных и адаптированных к МННГ, осмотический стресс продолжительностью от 10 до 40 или 50 мин вызывает уменьшение экспрессии pcdaduxCDABE. Увеличение F, характерно для клеток, обработанных МННГ и подвергнутых действию осмотического стресса в течение 40, 50 мин (рис. 7 Б). Появление пиков F, не коррелирует с изменением количества живых клеток в культуре. Осмотический стресс продолжительностью 10 мин вызывает ингибирование экспрессии рcdav.luxCDABE не только в клетках Е. coli ada, но и в клетках Е. coli rpoS. Линейная зависимость увеличения F, от продолжительности осмотического стресса в течение 20-40 мин зарегистрирована в неадаптированных и адаптированных к МННГ клетках Е. coli rpoS. Выход на плато фактора индукции биолюминесценции в субкультурах клеток Е. coli rpoS при 40-50 мин осмотического стресса (рис. 7 Б) сопровождается незначительным увеличением количества живых клеток и уменьшением частоты индуцированных мутаций при ингибировании процессов TpaHCKpfflnum-(6,4±0,02)xl0"* или трансляции-(2,6±0,01 )* 10"8. Частота индуцированных мутаций в культуре логарифмической фазы роста при физиологических условиях инкубаци-(5,1±0,001)*10~7. Динамика экспрессии рcdav.luxCDABE в клетках Е. coli дикого типа, Е. coli ada и Е. coli rpoS, подвергнутых действию осмотического стресса и обработанных МННГ, имеет общую для разных штаммов характеристику: двадцати-тридцати минутный период слабой экспрессии транскрипционной сшивки. В двадцати-тридцати минутный период слабого SOS-индуцирующего сигнала восстановление повреждений ДНК осуществляют глобальная и транскрипционно-зависимая эксцизионная репарация нуклеотидов. После окончания двадцати-тридцати минутного периода слабого

SOS-индуцирующего сигнала увеличение частоты индуцированных мутаций свидетельствуют о переключении с механизмов точного восстановления повреждений ДНК на механизм SOS-мутагенеза в субкультурах Е coli дикого типа, Е. coli oda и Е coli rpoS. Для объяснения полученных результатов необходимо отметить, что рестарт репликации на поврежденной матрице или индуцибельная реактивация реплисомы начинается через 30-45 мин после временной остановки репликации, зависит от синтеза белка и находится под SOS-контролем (Bhamre et al, 2001; Sutton et al, 2001). Делящиеся клетки отличаются от неделящихся клеток не только высокой чувствительностью к бактерицидному действию МННГ и высокой частотой индуцированных мутаций, но и отсутствием периода слабого SOS-индуцирующего сигнала, что свидетельствует об одновременном функционировании механизмов точной репарации, индуцированных повреждений ДНК, и потенциально мутагенном возобновлении инициации репликации на некотором расстоянии вниз по течению от сайта, блокирующего синтез ДНК. Предположение, сделанное на основании полученных в работе результатов, подтверждается фактом увеличения синтеза ДНК в клетках логарифмической фазы роста, обработанных МННГ (Фрадкин, 1974).

Таким образом, в отличие от делящихся клеток, в клетках Е. coli дикого типа, обработанных мутагеном, и находящихся в условиях, блокирующих репликацию ДНК, функционирует система точной репарации, которая, в том числе, осуществляет предпочтительное восстановление повреждений на транскрибируемой нити ДНК в период слабого SOS-индуцирующего сигнала. Переключение механизма эксцизионной репарации на механизм SOS-мутагенеза происходит в неделящихся клетках при повышении SOS-индуцирующего сигнала. Дефицит или дефект белка RpoS в клетках сокращает период переключения с процесса точной репарации на механизм SOS-мутагенеза. Полученные в работе результаты не противоречат факту существования примитивного механизма контроля клеточного цикла деления Е. coli, регулируемого димером UmuDC (Murli et al, 2000; Sutton et al., 2001). Баланс SOS-зависимого и SOS-независимого механизмов восстановления, «mwD+umuC+-зависимого и umuD+umuC+-независимого процессов мутагенеза поврежденной ДНК определяет чувствительность к мутагенному действию алкилирующих соединений при нарушении гомеостаза клеток Е coli.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что частота мутаций, индуцированных N-Memn-N'-Hmpo-N-нитрозогуанилином, в делящихся клетках Е coli дикого типа, мутантных по uvrA или ada генам, больше, чем в клетках, толерантных к закисленшо среды, клетках культуры стационарной фазы роста или подвергнутых действию осмотического стресса. Процесс индуцированного мутагенеза в клетках Е. coli зависит от присутствия RpoS белка дикого типа.

2. Показано, что в делящихся клетках Е. coli потенциально мутагенные повреждения, индуцированные К-метил-Ы'-нитро-Ы-нитрозогуанидином, восстанавливаются эксцизионной репарацией нуклеотидов, репарацией сопряженной с транскрипцией и адаптивной репарацией.

3. Выявлено, что потенциально мутагенные повреждения ДНК, индуцированные М-метил-М'-нитро-К-нитрозогуанидином, вызывают экспрессию ЬехА-контролируемой транскрипционной сшивки рcda::luxCDABE как в делящихся, так и неделящихся клетках Е coli. Экспрессия транскрипционной сшивки pcda::IuxCDABE в неделящихся или толерантных к закислению клетках Е. coli выше, чем в клетках растущих при оптимальных условиях среды.

4. Установлено, что в неделящихся клетках Е. coli существует период низкой экспрессии LexA-контролируемой транскрипционной сшивки pcda.JuxCDABE, в течение которого функционирует точная репарация и репарация, восстанавливающая повреждения на транскрибируемой нити ДНК. Окончание периода низкой экспрессии транскрипционной сшивки рcdcrduxCDABE сопровождается повышением экспрессии pcda. JuxCDABE и повышением частоты индуцированных мутаций в неделящихся клетках Е coli.

5. Обосновано, что отсутствие RpoS белка дикого типа в клетках Е. coli rpoS вызывает нарушение баланса механизмов точной репарации и индуцированного мутагенеза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Тюрина Н.А., Овечкина Г.В., Голясная Н.В. Стабильность генома на разных стадиях роста культуры клеток Escherichia coli, обработанных МННГУ/Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии- Матер. Регион. Конф. молодых ученых - Пермь, 1999. - С. 106 - 108.

2. Голясная Н.В., Тюрина Н.А. Хромосомные аберрации у детей при загрязнении объектов окружающей среды фосфоорганическими соединениями// Загрязнение окружающей среды и здоровье населения: Матер. Междунар. научно практ. конф. - Смоленск, 1999. - С. 14-15.

3. Тюрина Н.А. Мутагенная активность стрептомицина, канамицина, рифампицина и фенотип антибиотикорезистентности Escherichia coli B/r WP2s//CTyfleHT и научно-технический прогресс: Матер. XXXVIII Междунар. научн. студенческой конф.- Новосибирск, 2000. - С. 102.

4. Тюрина Н.А., Голясная Н.В. К вопросу о восстановлении предмутационных повреждений в клетках Escherichia coli и лимфоцитах периферической крови человека//Актуальные проблемы биологии и экологии: Матер. VII Молодежи, научн. конф. - Сыктывкар, 2000. - С. 120-121.

5. Цветкова Н.А., Шмырина ИЛ. Штамм Escherichia coli В/г WP2s для работ по экологическому биотестированию// Тезисы в региональном сборнике "Научно-технический прогресс и агропромышленный комплекс", г. Пермь, 2000. - С. 131-132.

6. Голясная Н.В., Тюрина Н.А. Возраст культуры клеток Escherichia coli и частота мутаций, индуцированных Ы-метил-К'нитро-Ы-нитрозогуанидином// Микробиология. - 2000. - Т. 69, № 6. - С. 805-809.

7. Голясная Н.В., Масленникова И.Л., Цветкова Н.А., Соколова О.В. Проблемы и перспективы оценки загрязнения окружающей среды химическими мутагенами и здоровье человека// Влияние загрязнения окружающей хгреды на здоровье человека: Матер. I Всероссийск. Научн. конф. с международным участием. -Новосибирск, 2002. - С. 67.

ЦВЕТКОВЛ Наталья Александровна

МУТАГЕНЕЗ, ИНДУЦИРОВАННЫЙ 1Ч-МЕТИЛ-1Ч'-НИТРО-1Ч-НИТРОЗОГУАНИДИНОМ, В КУЛЬТУРАХ ДЕЛЯЩИХСЯ И НЕДЕЛЯЩИХСЯ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLJ

АВТОРЕФЕРАТ

*f3489

РНБ Русский фонд

2006-4 9841

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Цветкова, Наталья Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Спектр мутаций, индуцированных алкилирующими веществами.

1.2. Эксцизионная репарация оснований.

1.2.1. 3-метиладенин-ДНК гликозилазы.

1.3. Адаптивная репарация.

1.3.1. Репарация 06-алкилгуанина.

1.3.2. 06-метилгуанин-ДНК метилтрансферазы Е. coli.

1.3.3. Роль сигма-факторов РНК-полимеразы в механизме регуляции экспрессии генов адаптивного ответа.

1.3.4. Терминация адаптивного ответа.

1.4. SOS-зависимый механизм, индуцированный МННГ, в клетках Е. coli.

1.5. Современная модель SOS-ответа Е. coli.

1.6. Связь между адаптивной репарацией и SOS-системой.

1.7. Эксцизионная репарация нуклеотидов.

1.7.1. UvrABC эндонуклеаза Е. coli.

1.7.2. Взаимодействие между UvrA и UvrB белками - феномен узнавания повреждения ДНК.

1.7.3. Эксцизионная репарация нуклеотидов, сопряженная с транскрипцией.

1.8. Предпочтительная репарация 06-метилгуанина на транскрибируемой нити ДНК.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Штаммы Е. coli.

2.2. Инкубационные среды, антибиотики, химические вещества.

2.3. Ингибирование транскрипции и трансляции в клетках Е. coli.

2.4. Определение ß-галактозидазы.

2.5. Определение РНК в клетках.

2.6. Выделение плазмидной ДНК.

2.7. Электрофорез в агарозном геле.

2.8. Трансформация.

2.9. Биолюминесцентный анализ - SOS-Lux тест.

2.10. Оценка частоты индуцированных мутаций.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Сравнительный анализ ответов клеток штаммов Е. coli группы В и К12 на мутагенное, бактерицидное и генотоксическое действие МННГ и МННГ в комбинации с рифампицином и хлорамфениколом.

3.2. Индуцированный мутагенез в делящихся и неделящихся клетках Е. coli.

3.2.1. Влияние pH инкубационной среды на индуцированный мутагенез в культурах клеток логарифмической и стационарной фаз роста Е. coli.

3.2.2. Ингибирование синтеза ß-галактозидазы хлорамфениколом и ингибирование синтеза

РНК рифампицином.

3.2.3. Влияние ингибиторов процессов транскрипции или трансляции на мутагенное и бактерицидное действие МННГ.

3.2.4. Влияние pH инкубационной среды на индуцированный мутагенез в адаптированных к МННГ клетках культур логарифмической и стационарной фаз роста Е. coli.

3.2.5. Влияние ингибиторов процесса транскрипции или трансляции на индуцированный мутагенез и бактерицидное действие МННГ в адаптированных к МННГ клетках Е. coli.

3.3. Влияние осмотического стресса и ингибирования процессов транскрипции или трансляции на индуцированный мутагенез в Е. coli.

3.4. Влияние осмотического стресса и ингибирования процессов транскрипции или трансляции на индуцированный мутагенез в адаптированных к МННГ клетках Е. coli.

3.5. Экспрессия ЬехА-контролируемой транскрипционной сшивки рcda::lnxCDABE в делящихся и неделящихся клетках Е. coli.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мутагенез, индуцированный N-метил-N,-нитро-N-нитрозогуанидином, в культурах делящихся и неделящихся клеток Escherichia Coli"

Актуальность проблемы.

Интенсивное развитие промышленного производства значительно увеличило антропогенный прессинг на объекты окружающей среды. К наиболее опасным компонентам загрязнения окружающей среды относятся химические соединения и физические факторы, которые вызывают повреждения наследственного материала живых организмов [29, 30, 128, 170]. В ответ на повреждения ДНК в клетке активируются процессы точного восстановления первоначальной структуры ДНК и механизм мутагенеза, обеспечивающий жизнеспособность клеток с потенциально летальными повреждениями генома.

Экспериментальный материал, полученный за последние 30 лет исследований в области мутагенеза, свидетельствует о консерватизме формирования, как повреждений ДНК, так и мутаций, и об отсутствии принципиальных отличий процесса восстановления повреждений ДНК в клетках прокариот и эукариот, в том числе и в клетках человека [175, 196, 197]. Анализ репарации ДНК в клетках организмов с различным уровнем организации привел к существенному прогрессу в понимании молекулярных, биохимических и генетических основ многокомпонентной и мультивариантной системы защиты клеток от ДНК - повреждающего действия мутагенных факторов.

Актуальность исследований репарации повреждений ДНК, определяется фактами существования связи между дефектами систем восстановления предмутационных ошибок в геноме и нарушением регуляции экспрессии генов, снижением скорости роста и жизнеспособности клеток прокариот [125, 127], или развитием патологических состояний в организме человека [40, 85, 95, 144]. Установлено, что процесс репарации ДНК играет ключевую роль в развитии нервной системы человека [60, 144], а нарушение механизма контроля геномной реорганизации в процессе V(D)J рекомбинации ведет к развитию иммунодефицитов [50, 98].

В настоящее время у человека известно несколько фенотипов высокой чувствительности к мутагенному действию физических факторов и химических соединений, обусловленных врожденной недостаточностью репарационного синтеза ДНК [22, 36, 50, 102]. Например, отличающиеся по фенотипическим признакам синдромы Кокейна, Блума, Вернера, Фалькони, пигментной ксеродермы вызваны мутациями в генах, которые кодируют белки, необходимые как для эксцизионной репарации нуклеотидов, так и для эксцизионной репарации нуклеотидов, сопряженной с транскрипцией [49, 63, 75, 118, 175, 195]. Детальное изучение и систематизация механизмов репарации позволили установить, что для соматических клеток с дефектами систем репарации ДНК характерны такие признаки, как повышенный уровень индуцированных мутаций, разная чувствительность к цитотоксическому действию мутагенных факторов, остановка деления клеток на определенных стадиях клеточного цикла деления в результате действия мутагенов.

Несмотря на значительные успехи в изучении процесса репарации ДНК, по-прежнему основное количество исследований сфокусировано на изучении, во-первых, причин нестабильности генома и, во-вторых, механизмов резистентности бактериальной и эукариотической клетки к действию химических соединений или физических факторов [117, 118, 205]. Альтернативные, на первый взгляд, исследования направлены на решение актуальной в настоящее время задачи — сохранение многообразия живых форм на Земле и решение более узких практических задач — роль аккумуляции мутаций в формировании патогенности сапрофитных микроорганизмов, разработка новых подходов получения микроорганизмов — продуцентов или деструкторов химических соединений. С точки зрения здоровья человека актуальность исследований заключается в расшифровке механизмов трансформации клеток и метастазирования [197] и в определении мишеней, чувствительных к действию лекарственных препаратов, с целью создания более эффективных терапевтических средств [53].

В комплексе актуальных проблем особый интерес вызывает вопрос влияния физиологического состояния клетки на процессы спонтанного и индуцированного мутагенеза. Суть проблемы заключается в том, что существенные отличия физиологического состояния делящихся и неделящихся клеток живых организмов, и клеток испытывающих влияние различных факторов среды, вносят коррективы в процесс спонтанного и индуцированного мутагенеза [18, 23, 27, 122, 130]. В природе бактериальные клетки, как правило, находятся в условиях стресса. Не менее редко стрессовые факторы оказывают влияние и на клетки организма человека. Общей характеристикой неделящихся клеток и клеток, находящихся в условиях нелетального селективного давления факторов среды, является блокирование процесса репликации [41, 76, 86]. Изменение физиологического состояния клетки в результате давления фактора внешней среды и нарушение баланса внутриклеточных механизмов ведет к формированию гипермутабельных субпопуляций микроорганизмов или к каскаду мутационных процессов в клетках эукариот [107, 110].

Одна из современных гипотетических моделей мутагенеза объясняет появление гипермутабельных субпопуляций клеток, как результат переключения с механизма точной репарации повреждения ДНК на потенциально мутагенную репликацию с сохранением повреждения, химическая структура которого и контекст нуклеотидной последовательности, окружающей предмутагенное повреждение, влияют на частоту и тип индуцированных мутаций [15, 21, 71, 89, 105, 215]. В этом сложном процессе мутагенез и репарация ДНК включаются в механизм регуляции деления клетки и необходимы для регуляции экспрессии генов [27, 115, 119]. В контексте этой гипотезы актуальной задачей является изучение процессов, ведущих к высокому уровню спонтанного мутагенеза, и природы резистентности к мутагенным факторам клеток прокариот и эукариот, испытывающих физиологический стресс.

В настоящее время основные представления репарации ДНК эффективно интегрируются в области научных исследований молекулярных основ наследственных заболеваний человека, предрасположенности к возникновению онкологических заболеваний и учитываются при разработке нового поколения профилактических и терапевтических лекарственных препаратов. Знания, полученные при изучении механизмов репарации и сопряженных механизмов защиты клеток от ДНК - повреждающего действия эндогенных и экзогенных факторов, служат основой современной стратегии создания лекарственных препаратов, более эффективных, чем фенольные антиоксиданты, изотиоцианаты, флавоноиды и кумарины, которые способны стимулировать множественные регуляторные пути защиты клеток от повреждений ДНК и могут использоваться для предупреждения инициации канцерогенеза [134]. Вторым направлением в области разработки новых терапевтических средств, является создание антибактериальных препаратов, обладающих электрофильной активностью. Мишенью антибактериальных электрофильных препаратов является комплексный механизм защиты грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, в том числе и система репарации ДНК [53].

Состояние вопроса. Среди химических веществ, обладающих мутагенной и канцерогенной активностью, особое внимание уделяется электрофильным соединениям и оксидантам, которые не только входят в состав антропогенных загрязнений окружающей среды, но и образуются в результате метаболизма или генерируются в процессе жизнедеятельности клеток живых организмов. Эти две группы химических соединений индуцируют различные потенциально мутагенные повреждения и специфические мутационные спектры [46, 58, 59, 108, 157].

В восстановлении повреждений ДНК, индуцируемых такими электрофильными соединениями, как монофункциональный М-метил-Ынитро->1-нитрозогуанидин (МННГ) или бифункциональный 3,4 — эпоксициклопента[с,£/]пирен участвуют SOS-независимая [209, 211] и SOS-зависимая модели репарации [205, 213]. К SOS-независимой относится эксцизионная репарация оснований и адаптивная репарация. SOS-зависимую репарацию выполняют ферменты, контролируемые белками RecA иЬехА[28,198].

Инициирующим событием активации той или иной модели репарации является образование различных типов повреждений ДНК. Модифицированные основания, образованные в результате реакции алкилирования ДНК, восстанавливаются участниками процесса SOS-независимой репарации: алкил-ДНК гликозилазами, ДНК-метилтрансферазами и белками адаптивного ответа. Появление в ДНК таких субстратов, как апуринновые\апиримидиновые сайты (АП-сайты) служит сигналом для активации SOS - зависимой модели репарации. АП-сайты в ДНК являются продуктом реакции взаимодействия ДНК гликозилаз с модифицированными основаниями ДНК [24, 25, 26, 209].

Было показано, что в клетках штамма Escherichia coli, мутантного по гену xthA, кодирующему АП эндонуклеазу, частота мутаций, индуцированных МННГ, выше, чем в клетках штамма дикого типа [58]. Снижение частоты индуцированных мутаций наблюдается в клетках штамма, мутантного по генам xthA и alkA. Ген alkA, кодирует 3-метиладенин-ДНК гликозилазу, фермент адаптивной репарации, который регулируется транскрипционным активатором а^а-оперона [123]. Экспериментальные данные, во-первых, дали основание предположить, что в процессе восстановления повреждений, индуцированных МННГ, участвует SOS-зависимая модель репарации. Во-вторых, между SOS-зависимой и SOS-независимой моделями существует связь. В настоящее время получены косвенные доказательства связи между SOS-репарацией и адаптивным ответом [33]. Механизм переключения систем репарации неизвестен.

Предполагая, что АП-сайты являются потенциально мутагенными повреждениями и формируются в сайтах ДНК, поврежденных соединениями с канцерогенной активностью, был предложен второй гипотетический механизм индукции SOS - зависимой модели репарации [89, 209]. Основанием для гипотезы стали данные о том, что модифицированные N-метил-М'-нитро-М-нитрозогуанидином основания ДНК в клетках Е. coli, преимущественно образуются в районе репликативной вилки [78]. Многочисленные повреждения ДНК в районе репликативной вилки вызывают SOS - мутаторный эффект, который является следствием снижения экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы I, или активации SOS-системы. Не исключается и вариант совместного вклада ошибок репликативного и репарационного синтеза ДНК в процесс мутагенеза [119, 203].

Результатом SOS-мутаторного эффекта являются Г:Ц—>Т:А и А:Т-»Т:А трансверсии, образование которых зависит от контекста нуклеотидной последовательности ДНК. Трансверсии входят в мутационный спектр, индуцируемый алкилирующими соединениями, но не являются доминирующим типом мутаций.

Исследования показали, что АП-сайты и Об-метилгуанин, образованные в результате обработки Е. coli алкилирующими соединениями, являются субстратами UvrABC-эндонуклеазы, которая участвует в модели эксцизионной репарации нуклеотидов и эксцизионной репарации нуклеотидов, сопряженной с транскрипцией [99]. В настоящее время отсутствуют данные, подтверждающие участие модели предпочтительной репарации в восстановлении повреждений, индуцированных МННГ на транскрибируемой нити ДНК. Более того, были получены противоречивые результаты о связи процессов репарации и синтеза белка в клетках E.coli. Было показано, что ингибирование трансляции может либо снижать [6], либо повышать [172] мутагенную активность МННГ.

Таким образом, на современном этапе развития теории мутагенеза и репарации ДНК не решены вопросы механизма переключения между моделями репарации и взаимосвязи процессов репарации и транскрипции при восстановлении повреждений, индуцированных электрофильными соединениями.

Цель настоящего исследования - изучение влияния дефектов систем репарации и дефицита глобального регулятора генов стационарной фазы роста на мутагенез, индуцированный Ы-метил-Ы'-нитро-Н-нитрозогуанидином, в культурах делящихся и неделящихся клеток Е. coli в условиях ингибирования процессов транскрипции и трансляции.

Основные задачи исследования:

1. Сравнить частоту мутаций, индуцированных N-метил-N'-hитро-N-нитрозогуанидином, в культурах делящихся и неделящихся клеток штаммов Е. coli, дефектных по системам репарации.

3. Оценить влияние ингибиторов транскрипции или трансляции на процесс индуцированного мутагенеза в адаптированных к N-метил-М'-нитро-N-нитрозогуанидину клетках Е. coli.

4. Изучить индукцию ЬехА-контролируемого промотора гена cda в ответ на обработку клеток Е. coli М-метил-Ы'-нитро-Ы-нитрозогуанидином.

Научная новизна. Впервые установлено участие механизма предпочтительной эксцизионной репарации нуклеотидов в восстановлении ДНК Е. coli, поврежденной монофункциональным алкилирующим соединением N-мети л-Ы'-нитро-К-нитрозогу анид и ном. Проведен сравнительный анализ частоты индуцированных мутаций в культурах делящихся (логарифмическая фаза роста); делящихся, но толерантных к закислению среды; а также неделящихся (стационарная фаза роста и клетки, деление которых временно блокировано осмотическим стрессом) Е. coli дикого типа, Е. coli uvrA, Е. coli rpoS, Е. coli ada. Установлено, что необходимым условием переключения с SOS-зависимого на SOS-независимый механизм репарации является присутствие белка RpoS.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о процессах репарации и мутагенеза, индуцированного монофункциональными алкилирующими соединениями. Результаты свидетельствуют о том, что факторы, блокирующие деление или активирующие механизмы толерантности клеток Е. coli к закислению, индуцируют SOS-зависимую резистентность к МННГ. Резистентность к МННГ неделящихся или растущих, но толерантных к закислению, клеток Е. coli зависит от белка RpoS. В резистентных к МННГ клетках Е. coli существует период низкой экспрессии транскрипционной сшивки pcdawluxCDABE. В период низкой экспрессии транскрипционной сшивки pcdawliaCDABE восстановление потенциально мутагенных повреждений осуществляют SOS-зависимая, в том числе, сопряженная с транскрипцией и SOS-независимая репарация. В этот период незначительное, но линейное увеличение экспрессии транскрипционной сшивки pcdawluxCDABE в неделящихся клетках Е. coli rpoS, свидетельствует о том, что мутация rpoS396 вызывает нарушение баланса механизмов точной репарации и индуцированного мутагенеза. Заключение сделано на основании ингибирования индуцированной резистентности при блокировании синтеза белка.

Переключение механизма эксцизионной репарации на механизм SOS-мутагенеза в неделящихся клетках сопровождается повышением экспрессии ЬехА-регулируемой транскрипционной сшивки pcdawluxCDABE. Присутствие мутантного белка RpoS в неделящихся клетках сокращает продолжительность периода переключения с процесса точной репарации на механизм SOS-зависимого индуцированного мутагенеза.

Установлено, что клетки Е. coli, растущие при оптимальных условиях среды, отличаются от растущих, но толерантных к закислению или неделящихся клеток не только отсутствием периода низкой экспрессии транскрипционной сшивки pcda::lwcCDABE, но и более высокой чувствительностью к бактерицидному и мутагенному действию МННГ.

Баланс SOS-зависимого, SOS-независимого механизмов восстановления и SOS-зависимого индуцированного мутагенеза определяют резистентность клеток Е. coli к МННГ.

При выполнении работы были получены рекомбинантные штаммы Е. coli высоко чувствительные к генотоксическому действию химических соединений. Сочетание высокочувствительного биолюминесцентного анализа и классического подсчета реверсий по триптофановому оперону позволяет получить экспресс-оценку потенциального и прямого генотоксического и мутагенного действия комплекса соединений или индивидуальных мутагенов в объектах окружающей среды. Штамм Е. coli WP2s с плазмидой pPLS-1, несущей ЬехА-контролируемую транскрипционную сшивку рcdav.lwcCDABE, был использован при проведении исследований по проекту РФФИ № 00-0496096 эколого-генетического мониторинга морской экосистемы.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В культурах неделящихся клеток стационарной фазы роста, подвергнутых действию осмотического стресса, и в культурах клеток, толерантных к закислению среды, уровень частоты мутаций, индуцированных М-метил-Ы'-нитро-М-нитрозогуанидином, ниже, чем в культурах клеток логарифмической фазы роста.

2. Ингибирование процесса транскрипции повышает, а процесса трансляции снижает уровень частоты мутаций, индуцированных Ы-метил->Г-нитро-М-нитрозогуанидином, в клетках Е. coli дикого типа, Е. coli ada, Е. coli rpoS, но не Е. coli nvrA.

3. Экспрессия ЬехА-контролируемой транскрипционной сшивки pcda::luxCDABE в клетках Е. coli стационарной фазы роста; клетках, толерантных к закислению, и в клетках, подвергнутых действию осмотического стресса, более выражена, чем в клетках логарифмической фазы роста, растущих при оптимальных условиях среды.

4. Точная репарация ДНК происходит в период слабой экспрессии ЬехА-контролируемой транскрипционной сшивки pcda: iluxCDABE в клетках Е. coli дикого типа, Е. coli ada, Е. coli rpoS, но не Е. coli uvrA, обработанных Nметил-Ы'-нитро-Ы-нитрозогуанидином и подвергнутых действию осмотического стресса.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации были представлены на региональной конференции молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии" (г. Пермь, 1999), XXXVIII международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" (г. Новосибирск, 2000), VII молодежной научной конференции "Актуальные проблемы биологии и экологии" (г. Сыктывкар, 2000). По теме диссертации были опубликованы тезисы в региональном сборнике "Научно-технический прогресс и агропромышленный комплекс" (г. Пермь, 2000), в материалах I Всероссийской научной конференции с международным участием "Влияние загрязнения окружающей среды на здоровье человека" (г. Новосибирск, 2002) и в материалах Международной научно-практической конференции "Загрязнение окружающей среды и здоровье населения" (г. Смоленск, 1999).

Всего по теме диссертации было опубликовано 7 работ, в том числе статья в журнале Микробиология (2000. № 6. С. 805 - 809).

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме "Изучение процессов спонтанного и индуцированного мутагенеза в условиях экспериментальной и реальной химической нагрузки" (номер государственной регистрации 01.9.00017990). Работа выполнена при финансовой поддержке Комиссии РАН по работе с молодежью, научный проект № 285 (1999 - 2001 гг.) и РФФИ, проект № 00-04-96096 (2000 - 2002 гг.).

Список принятых сокращений: МННГ - М-метил-Ы'-нитро-КГ-нитрозогуанидин; УФ - ультрафиолетовое излучение; а — сигма S субъединица РНК-полимеразы; о° - сигма D субъединица РНК-полимеразы; meAda — метилированный белок Ada, АП сайты - апуриновые или апиримидиновые сайты, ЭРО - эксцизионная репарация оснований, 06-МГТ 1-метил-гуанин ДНК трансфераза I, днДНК - двунитевая ДНК, онДНК - однонитевая ДНК.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Цветкова, Наталья Александровна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что частота мутаций, индуцированных М-метил-N'-нитро-Ы-нитрозогуанидином, в делящихся клетках Е. coli дикого типа, мутантных по uvrA или ada генам, больше, чем в клетках, толерантных к закислению среды, клетках культуры стационарной фазы роста или подвергнутых действию осмотического стресса. Процесс индуцированного мутагенеза в клетках Е. coli зависит от присутствия RpoS белка дикого типа.

2. Показано, что в делящихся клетках Е. coli потенциально мутагенные повреждения, индуцированные ^метил-К-нитро-Ы-нитрозогуанидином, восстанавливаются эксцизионной репарацией нуклеотидов, репарацией сопряженной с транскрипцией и адаптивной репарацией.

3. Выявлено, что потенциально мутагенные повреждения ДНК, индуцированные Ы-метил-Ы'-нитро-Ы-нитрозогуанидином, вызывают экспрессию ЬехА-контролируемой транскрипционной сшивки рcdawluxCDABE как в делящихся, так и неделящихся клетках Е. coli. Экспрессия транскрипционной сшивки рcdav.luxCDABE в неделящихся или толерантных к закислению клетках Е. coli выше, чем в клетках растущих при оптимальных условиях среды.

4. Установлено, что в неделящихся клетках Е. coli существует период низкой экспрессии LexA- контролируемой транскрипционной сшивки pcdav.lwcCDABE, в течение которого функционирует точная репарация и репарация, восстанавливающая повреждения на транскрибируемой нити ДНК. Окончание периода низкой экспрессии транскрипционной сшивки pcda:iluxCDABE сопровождается повышением экспрессии рcdawluxCDABE и повышением частоты индуцированных мутаций в неделящихся клетках Е. coli.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цветкова, Наталья Александровна, Пермь

1. Лакин Г.Ф. Биометрия/ Г.Ф. Лакин М.: Высшая школа, 1990. - 344 с.

2. Маииатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование/ Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук М.: Мир, 1984. -480 с.

3. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике/ Д. Миллер М.: Мир, 1976.-436 с.

4. Птицын Л.Р. Биолюминесцентный анализ SOS — ответа клеток Escherichia coli/ Л.Р. Птицын// Генетика. 1996. - Т. 32, № 3. - С. 354358.

5. Скавронская А.Г. УФ-индуцированный мутагенез в poJA-I и uvrE502-мутантах Escherichia coli, дефектных по ресинтетическому этапу эксцизионной репарации ДНК/ А.Г. Скавронская, Г.Б. Смирнов// Генетика. 1974. - Т. 10, № 6. - С. 102-107.

6. Фрадкин Г.Е. Зависимость жизнеспособности и мутабильности клеток Escherichia coli К-12 от баланса синтезов ДНК и белка/ Г.Е. Фрадкин, М.В. Торосян, О.В. Шишкова// Генетика. 1980. - Т. 16, № 9. - С.1570 -1575.

7. Aas P.A. Human and bacterial oxidative demethylases repair alkylation damage in both RNA and DNA/ P.A. Aas// Nature. 2003. - V. 421. - P. 859- 863.

8. Aebi S. Resistance to cytotoxic drugs in DNA mismatch repair-deficient cells/ S. Aebi, D. Fink, R. Gordon, et al.// Clin Cancer Res. 1997. - V. 3, № 10.-P. 1763-1767.

9. Ames B.N., Detection of carcinogens as mutagens: bacterial tester strains with R factor plasmids/ B.N. Ames, J. McCann, N.E. Spingarn, J. Kobori// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. - V.72. - P. - 979-983.

10. Amundson S.A. A nucleotide excision repair master-switch: p53 regulated coordinate induction of global genomic repair genes/ S.A. Amundson, A. Patterson, K.T. Do, et al.// Cancer Biol. Ther. 2002. - V. 1. - P. 145-149.

11. Aoki H. Molecular characterization of the prokaryotic efp gene product involved in a peptidyltransferase reaction/ H. Aoki, S.L. Adams, M.A. Turner, et al.// Biochem. 1997. - V. 79, № 1. - P. 7-11.

12. Arnold C.N. Global analysis of Escherichia coli gene expression during the acetate-induced acid tolerance response/ C.N. Arnold, J. McElhanon, A. Lee, et al.// J. Bacterid. 2001. - V. 183, № 7. - P. - 2178-2186.

13. Balajee A.S. Genomic heterogeneity of nucleotide excision repair/ A.S. Balajee, V.A. Bohr// Gene. 2000. - V. 250. - P. 125-128.

14. Basu A.K. Site — specific alkylated oligodeoxynucleotides: probes for mutagenesis, DNA repair and the structural effects of DNA damage/ A.K. Basu, J.M. Essigmann// Mutat. Res. 1990. - V. 233. - P. 189 - 201.

15. Bates H. Mutagenic DNA repair in Escherichia coli. XIX. On the roles of RecA protein in ultraviolet light mutagenesis/ H.Bates, B.A. Bridges// Biochim. 1991. - V. 73. - P. 485 - 489.

16. Batty D.P., Damage recognition in nucleotide excision repair of DNA/ D.P. Batty, R.D. Wood// Gene. 2000. - V. 241. - P. 193-204.

17. Bearson S.M. Acid shock induction of RpoS is mediated by the mouse virulence gene mviA of Salmonella typhimurium/S.M.BQSLTSon, W.H. Benjamin, W.E. Swords, et al.//J. Bacteriol. 1996. - V. 178, № 9. - P. 25722579.

18. Bedford C.T. Structural-activity considerations of alkylating agents as mutagens/ C.T. Bedford// Mutat. Res. 1979. - V. 29, № 2. - P. 195 - 196.

19. Begley T.J. AlkB mystery solved: oxidative demethylation of N1-methyladenine and N3- methylcytosine adducts by a direct reversal mechanism/ TJ. Begley, L.D. Samson// Biochemical Sciences. 2003. -V.28. -№1.-P. 2-5.

20. Beletski A. Transcription-induced mutation: increase in C to T mutations in the nontranscribed strand during transcription in Escherichia coli! A. Beletski, A.S. Bhagwat// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996. - V. 93. - P. 13919-13924.

21. Berwick M. Markers of DNA repair and susceptibility to cancer in humans: an epidemiologic review/ M. Berwick, P. Vineis// J. Natl. Cancer Inst. -2000.-V. 92.-P. 874-897.

22. Bhamre S. Anaerobic recAwmwC-dependent pathway of spontaneous base-pair substitution mutagenesis in Escherichia coli/ S. Bhamre, B.B. Gadea, C.A. Koyama, et al.// Mutat. Res. 2001. - V. 473. - P. 229-247.

23. Bjellaks S. Excision of 3-methylguanine from alkylated DNA by 3-methyladenine DNA glicosilase I of Escherichia coliI S. Bjellaks, M. Bjoras, E. Seeberg//Nucleic. Acids Res. -1993. V. 21. - P. 2045 - 2049.

24. Bjelland S. DNA glycosylase activities for thymine residues oxidized in the methyl group are functions of the AlkA enzyme in Escherichia coliI S. Bjelland, N.-K. Birkeland, T. Benneche, et al.// J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 30489-30495.

25. Bjelland S. Excision of 3-methylguanine from alkylated DNA by 3-methyladenine DNA glycosylase I of Escherichia coli! S. Bjelland, M. Bjoras, E. Seeberg// Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21. - P. 2045-2049.

26. Bohr V.A. Gene specific DNA repair: characteristics and relations to genomic instability// DNA Repair Mechanisms / Bohr V.A., Wassermann K., Kraemer H.R. - Munksgaard, Copenhagen. - 1981. - P. 217-227.

27. Brent R. Mechanism of action of the lexA gene product/ R. Brent, M. Ptashne// Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1981. - V. 78. - P. 4204 - 4208.

28. Causton H.C. Remodeling of yeast genome expression in response to environmental change/ C.H. Causton, B. Ren, S.S. Koh, et al.// Mol. Biol. Cell. 2001. - V. 12. - P. 323-337.

29. Cooper C.S. Chemical carcinogenesis and mutagenesis/ C.S. Cooper, P.L. Crover// Springer Verlag, KC, Berlin. - 1990.

30. Cora E. Expression of the tumor suppressor gene p53 during the development of murine malignant mesotheliomas induced by asbestos fibres/ E. Cora, A. Kana// FASEB J.- 1991. V. 5.-P. 1442- 1443.

31. Corthier G. Use of luciferase genes as biosensors to study bacterial physiology in the digestive tract/ G. Corthier, C. Delorme, S.D. Ehrlich, et al.// Appl. Environ. Microbiol. 1998, - V. 64, № 7. - P. 2721-2722.

32. Courcelle J. recY and recR are required for the resumption of replication at DNA replication forks in Escherichia coli/ J. Courcelle, C. Carswell-Crumpton, P.C. Hanawalt // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. - V. 94, № 3.-P. 3714-3719.

33. Courcelle J. Recovery of DNA replication in UV-irradiated Escherichia coli requires both excision repair and RecF protein function/ J. Courcelle, D.J. Crowley, P.C. Hanawalt// J. Bacteriol. 1999. - V. 181, № 3. - P. 916-922.

34. Cui X. The XRCC2 and XRCC3 repair genes are required for chromosome stability in mammalian cells/ X. Cui, M. Brenneman, J. Meyne, et al.// Mutat. Res. 1999. - V. 434. - P.75-88.

35. Czy A. Genetically modified Vibrio harveyi strains as potential bioindicators of mutagenic pollution of marine environments/ A. Czy, J. Jasiecki, A. Bogdan, et al.//Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66, № 2. - P. 599-605.

36. Czyzl A. Vibrio harveyi bioluminescence plays a role in stimulation of DNA repair/ A. Czyzl, B. Wrdoacute, G. Wegrzyn// Microbiology. 2000. - V. 146.-P. 283-288.

37. Dagert M. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells/ M. Dagert, S.D. Ehrlich// Gene. 1979. - V. 6. - P. 23 - 28.

38. Demple B. Self-methylation by suicide DNA repair enzymes // Protein Methylation/ Paik W.K., Kim S.(ed.) CRC Prress, Inc., Boa Raton, Fla., 1990.-V. 2.-P. 285-304.

39. Doi R.H. Multiple prokaryotic ribonucleic acid polymerase sigma factors/ R.H. Doi, L.F. Wang//Microbiol. Rev. 1986. - V. 50, № 3. - P. 227-247.

40. Dolittle R.F. Domainal evolution of prokaryotic DNA repair protein and its relationship to active-transport proteins/ R.F. Dolittle, M.S. JonSon, L. Husain, et al.//Nature (London). 1986. - V. 323. - P. 451-453.

41. Dosanjh M.K. Comparative mutagenesis of 05-methylguanine and O4-methylthymine in Escherichia coliI M.K. Dosanjh, B. Singer, J.M. Essigmann//Biochem.- 1991.-V. 16,№30.-P. 7027-7033.

42. Dri A.M. Control of LexA regulon by pH: evidence for a reversible inactivation of the LexA repressor during the growth cycle of Escherichiacoli/ A.M. Dri, P.L. Moreau// Mol. Microbiol. 1994. - V. 12, № 4. - P. 621 - 629.

43. Eisenstadt E. Carcinogenic epoxides of benzo(a)pyrene and cyclopenta(<%f)pyrene induce base substitutions via specific transversions/ E. Eisenstadt, A.J. Warren, D. Porter, et al.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1982. -V. 79.-P. 1945- 1949.

44. Elis N.A. The Bloom's syndrome gene product is homologous to RecQ helicases/ N.A. Elis, J. Groden, T.Z. Ye, et al.// Cell. 1995. - V. 17, № 83. -P. 655-666.

45. Fairhurst R.M. A DNA repair abnormality specific for rearranged immunoglobulin variable genes in germinal center В cells/ R.M. Fairhurst, Y. Valles-Ayoub, M. Neshat, et al.// Mol. Immunol. 1996. - V. 33 - P. 231244.

46. Farrell M.J. The growth advantage in stationary-phase phenotype conferred by rpoS mutations is dependent on the pH and nutrient environment/ M.J. Farrell, S.E. Finkel// J. Bacteriol. 2003. - V. 185, № 24. - P. 7044-7052.

47. Felkner I.C. DNA-damaging and mutagenic effects of 1,2-dimethylhydrazine on Bacillus subtilis repair-deficient mutants/ I.C. Felkner, K.M. Hoffman, B.C. Wells// Mutat. Res. 1979. - V. 68, № 1. - P. 31 - 40.

48. Ferguson G.P. A. Protective mechanisms against toxic electrophiles in Escherichia coli! G.P. Ferguson// Trends in Microbiology. 1999. - № 7. - P. 242-247.

49. Fiscor G. Mammalian host and fluid mediated mutagenicity assays of captan and streptozotocin in Streptomyces achromogenesl G. Fiscor, S. Bordas, S.M. Wade, et al.//Mutat. Res. - 1977. - V. 48, № 1. - P. 1 - 16.

50. Fogliano M. Evidence for the inducibility of the uvrB operon/ M. Fogliano, P.F. Schendel//Nature (London). 1981. - V. 289. - P. 196-198.

51. Foster P.L. Induction of transversion mutations in Escherichia coli by N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine is SOS dependent/ P.L. Foster, E. Eisenstadt//J. Bacteriol. 1985. -V. 163, № 1. - P. 213-220.

52. Foster P.L. Loss of an apurinic/apyrimidinic site endonuclease increases mutagenicity of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine to Escherichia coli/ P.L. Foster, E.F. Davis// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1987. - V. 84, № 5. -P. 92891-92895.

53. Friedberg E.C. DNA repair and mutagenesis/ E.C. Friedberg, G.C. Walker, W. Siede. ASM Press, Washington, DC, 1995. - P. 698.

54. Gail P. Protective mechanisms against toxic electrophiles in Escherichia coli/ P. Gail, A. Ferguson// Trends in Microbiology. 1999. - №7. - P. 242-247.

55. Gao Y. A critical role for DNA end-joining proteins in both lymphogenesis and neurogenesis/ Y. Gao// Cell. 1998. - V. 95. - P. 891-902.

56. Gilmour P.S. Free radical activity of industrial fibers: role of iron in oxidative stress and activation of transcription factors/ P.S. Gilmour, D.M. Brown, P.H Beswick, et al./ Environ. Health. Perspect. 1997. - V. 105, № 5. - P. 13131317.

57. Gordon A.J. N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine-induced mutation in a RecA strain of Escherichia coli/ A.J. Gordon, P.A. Burns, B.W. Glickman// Mutat. Res. 1988. - V. 201, № 9. p. 1219 - 1228.

58. Gray M.D. The Werner syndrom protein is a DNA helicase/ M.D. Gray, J.C. Shen, A.S. Loeb, etal.//Nat. Genet.- 1997. V. 17, № l.-P. 100- 103.

59. Grigg G.W. The origins of the back-mutation assay method: a personal recollection/ G.W. Grigg// Mutat. Res. 2000. - V. 463, №1. - P. 1-12.

60. Gu M.B. Bacterial bioluminescent emission from recombinant Escherichia coli harboring a recAv.luxCDAB fusion/ M.B.Gu, J. Min, R.A. LaRossa// J. Biochem. Biophys. Methods. 2000. - V.45. - P. 45 - 56.

61. Hanna M. Topography of transcription: path of leading end of nascent RNA through the Escherichia coli transcription complex/ M. Hanna, C. Meareas// Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1983. - V. 80. - P. 4238-4242.

62. Hanna M.N. uvrA is an acid-inducible gene involved in the adaptive response to low pH in Streptococcus mutans/ M.N. Hanna, R.J. Ferguson, Y.H. Li, et al.// J. Bacteriol. 2001. - V. 183, № 20. - P. 5964-5973.

63. Hengge-Aronis R. Interplay of global regulators and cell physiology in the general stress response of Escherichia coli/ R. Hengge-Aronis// Current Opin. Microbiol. 1999. - V. 2. - P. 148-152.

64. Hengge-Aronis R. The general stress response in Escherichia coli! R. Hengge-Aronis// In G. Storz, and R. Hengge-Aronis (ed.), Bacterial stress responses. ASM, Washington, D.C. 2000. - P. 161-177.

65. Hollis R.P. Design and application of a biosensor for monitoring toxicity of compounds to eukaryotes/ R.P. Hollis, K.Killham, L.A. Glover// Appl. Environm. Microbiol. 2000. - V. 66, № 4. - P. 1676 - 1679.

66. Huang W. The mus206 gene of Drosophila melanogaster is required in the excision repair of alkylation-induced DNA lesions/ W. Huang, A.P.D. Smith// Mutat. Res. 1997. - V. 384. - P. 81-88.

67. Ibanez-Ruiz M. Identification of RpoS (gs) regulated genes in Salmonella enterica serovar Typhimurium/ M. Ibanez-Ruiz, V. Robbe-Saule, D. Hermant, et al.//J. Bacteriol. 2000. - V. 182, № 20. - P. 5749-5756.

68. Ishihama A. Adaptation of gene expression in stationary phase bacteria/ A. Ishihama// Cur. Opin. Genet. Develop. 1997. -V.l.- P. 582-588.

69. Ishii Y. Comparative analysis of deletion and base-change mutabilities of Escherichia coli B strains differing in DNA repair capacity (wild-type, uvrA-, polA-, recA-) by various mutagens/ Y. Ishii, S. Kondo// Mutat. Res. 1975. -V. 27, № l.-P. 27-44.

70. Itoh T. UVs syndrome, a new general categoiy of photosensitive disorder with defective DNA repair, is distinct from xeroderma pigmentosum variant and rodent complementation group 1/ T. ItohI I Am. J. Hum. Genet. 1995. -V. 56.-P. 1267-1276.

71. Jackson S.P. The recognition of DNA damage/ S.P. Jackson// Cur. Opin. Genet. Develop. 1996. - V.6. - P. 19-25.

72. Jeggo P. An adaptive response of Escherichia coli to low levels of alkylating agent: comparison with previously characterized DNA repair pathways/ P. Jeggo, T.M. Defais, L. Samson, et al.// Mol. Gen. Genet. 1977. - V. 157. -P. 1-9.

73. Jimenez-Sanchez A. Mutation and DNA replication in Escherichia coli treated with low concentrations of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine/ A. Jimenez-Sanchez, E. Cerda-Olmedo// Mutat. Res. 1975. - V. 28. - P. 337345.

74. Jirichy J. DNA repair: bioinformatics helps reverse methylation damage/ J. Jirichy// Current Biology. 2002. - V.12, № 24. - P. 846- 848.

75. Jishage M. Regulation of RNA polymerase sigma subunit synthesis in Escherichia coli: Intracellular levels of a and o / M. Jishage, A. Ishihama// J. Bacteriol. 1995. - V. 177, № 23. - P. 6832-6835.

76. Josephy P.D.The Escherichia coli lacZ reversion mutagenicity assay/ P.D. Josephy// Mutat. Res. 2000. - V. 455. - P. 71-80.

77. Kaina B. Contribution 06-alkylguanine and N-alkylpurines to the formation of sister Chromatide exchanges, chromosomal aberrations, and gene mutations/ B. Kaina, G. Fritz, T. Coquerelle// Environ. Mol. Mutagen. -1993.-V. 22.-P. 283-292.

78. Kornberg A. DNA Replication/ A. Kornberg, T. Baker// W.H. Freeman E.Co., New York, 1992.

79. Krasin F. Repair of DNA double strand breaks in Escherichia coli, which requires RecA function and the presence of a duplicate genome/ F. Krasin, F. Hutchinson// J. Mol. Biol. - 1977. - V. 116. - P. 81-98.

80. Labahn J. Structural basis for the excision repair of alkylation-damaged DNA/ J. Labahn, O. D. Scharer, A. Long, et al.// Cell. 1996. - V. 86. - P. 321-329.

81. Landini P. Regulatory responses of the adaptive response to alkylation damage: a simple regulon with complex regulatory features/ P. Landini, M.R. Volkert// J. Bacteriol. 2000. - V. 182, № 23. - P. 6543-6549.

82. Landini P. Structure and transcriptional regulation of the Escherichia coli adaptive response gene aidBI P. Landini, L.I. Hajec, M.R. Volkert// J. Bacteriol. 1994. - V. 176, № 21. - P. 6583-6589.

83. Lange R. The cellular concentration of the o subunit of RNA polymerase in Escherichia coli is controlled at the level of transcription, translation, and protein stability/ R. Lange, R. Hengge-Aronis// Genes Dev. 1994. - V. 8. -P. 1600-1612.

84. Lavery P.E. A postsynaptic role for single stranded DNA - binding protein in RecA protein - promoted DNA strand exchange/ P.E. Lavery, S.C. Kowalczykowski// J Biol Chem. - 1992. - V. 267, № 13. - P. 9315-9320.

85. Leadon S.A. Transcription-coupled repair of DNA damage: unanticipated players, unexpected complexities/ S.A. Leadon// American J. of Human Genetics. 1999. - V. 64, № 5. - P. 1259-1263.

86. Lee S.Y. Simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA/ S.Y. Lee, S.A. Rasheed// Biotechniques. 1990. - V. 9, № 6. - P. 676-679.

87. Lenski P.E. Direction mutation/ P.E. Lenski, J.E. Mittler// Science. 1993. -V. 260.-P. 1222- 1223.

88. Liao M.J. Critical role for Atm in suppressing V(D)J recombination-driven thymic lymphoma/ M. J. Liao, T. Van Dyke// Genes Dev. 1999. - V. 13. - P. 1246-1250.

89. Lin C.G. DNA damage dependent recruitment of nucleotide excision repair and transcription proteins to the Escherichia coli inner membranes/ C.G. Lin, O. Kovalsky, L. Grossman//Nucl. Acids Res. - 1997. - V. 25, № 3. - P. 3151 -3158.

90. Lin J.J. Active site of (A)BC exinuclease. I. Evidence for 5' incision by UvrC through a catalytic site involving Asp399, Asp438, Asp 466, and His538 residues/ J.J. Lin, A. Sancar// J. Biol. Chem. 1992. - V. 267. - P. 1768817692.

91. Lindahl T. DNA excision repair pathways/ T. Lindahl, P. Karran, R.D. Wood// Current Opin. Gen. Develop. 1997. - V. 7. - P. 158-169.

92. Link C.J. Gene specific DNA repair of damage induced in familial Alzheimer disease cells by ultraviolet irradiation or by nitrogen mustard/ C.J. Link, J.H. Robbins, V.A. Bohr// Mutat. Res. 1995. - Mar. 336. - P. 115-121.

93. Little J.W. The SOS regulatory system of Escherichia coli/ J.W. Little, D.W. Mount// Cell. 1983. - V. 29 - P. 11-22.

94. Liu S.-K. Error prone SOS repair can be error - free/ S.-K. Liu, I. Tessman// J. Mol. Biol. - 1990. - V. 216. - P. 803 - 807.

95. Loewen P.C. The role of the sigma factor g (katF) in bacterial global regulation/ P.C. Loewen, R. Hengge-Aronis// Annu. Rev. Microbiol. 1994. -№.21.-P. 6583-6589.

96. Lowry O.H. Protein measurement with the folin phenol reagent/ O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall// J. Biol. Chem. 1951. - V.193. -P. 265-275.

97. Lutz W.K. Endogenouse genotoxic agents and processes as a basis of spontaneous carcinogenesis/ W.K. LutzII Mutat. Res. 1990. - V. 238. - P. 287-295.

98. Macintyre G. Lowering S-adenosylmethionine levels in Escherichia coli modulates C-to-T transition mutations/ G. Macintyre, C.V. Atwood, C.G. Cupples// J. Bacteriol. 2001. - V. 183, № 3. - P. 921-927.

99. Mackay W.J. DNA alkylation repair limits spontaneous base substitution mutations in Escherichia coli! W.J. Mackay, S. Han, L.D. Samson// J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 3224-3230.

100. Martin L. p53-mediated DNA repair responses to UV-radiation: studies of mouse cells lacking p53, p21, and/or gadd45/ L. Martin, J. Smith, M. Ford, et al.// Gen. Mol. Cel. Biol. -2000. V. 20, №10. - P. 3705-3714.

101. McCarthy N.V. Methylphosphotriesters in alkylated DNA are repaired by the Ada regulatory protein of Escherichia coli! N.V. McCarthy, T. Lindahl// Nucleic Acids Res. 1985. - V. 13. - P. 2683 - 2688.

102. McKenzie G.J. The dinB operon and spontaneous mutation in Escherichia coli/ G.J. McKenzie, D.B. Magner, P.L. Lee, et al.// J. Bacteriol. 2003. - V. 185,№ 13.-P. 3972-3977.

103. Meighen E.A. Molecular biology of bacterial bioluminescence/ E.A. Meighen// Microbiol. Rev. 1991. - V. 55. - P. 123-142.

104. Mellon I. Induction of the Escherichia coli lactose operon selectively increases repair of its transcribed DNA strand/ I. Mellon, P.C. Hanawalt// Nature (London). 1989. - V. 342. - P. 95-98.

105. Mellon I. Transcription-coupled repair deficiency and mutations in human mismatch repair genes/ I. Mellon, D.K. Rajpal, M. Koi, et al.// Science -1996.-V. 272.-P.557-560.

106. Memisoglu A. Contribution of base excision repair, nucleotide excision repair, and DNA recombination to alkylation resistance of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe/ A. Memisoglu, L. Samson// J. Bacteriol. -2000.-V. 182,№8.-P. 2104-2112.

107. Moolenaar G.F. Role of the Escherichia coli nucleotide excision repair proteins in DNA replication/ G.F. Moolenaar, C. Moorman, N. Goosen// J. Bacteriol. 2000. - V. 182, № 20. - P. 5706-5714.

108. Morse M.L. N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine-induced resistance to ionizing radiation/ M.L. Morse, D.S. Smith// Mol. Gen. Genet. 1987. - V. 206, №2.-P. 220-225.

109. Mortelmans K. The bacterial tryptophan reverse mutation assay with Escherichia coli WP2/ K. Mortelmans, E.S. Riccio// Mutat. Res. Fundam. Mol. Mechanisms Mutagenesis. - 2000. - V. 455, №. 1-2. - P. 61-69.

110. Nakabeppu Y. Regulatory mechanisms for induction of synthesis of repair enzymes in response to alkylating agents: Ada protein acts as transcriptional regulator/ Y. Nakabeppu, M. Sekiguchi// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. -V. 83,№17.-P. 6297-6301.

111. Oktyabrskiy O.N. Acidification of Escherichia coli and Salmonella typhimurium cytoplasm reduces the mutagenic effect of N-methyl-N'-nitro

112. N-nitrosoguanidine/ O.N. Oktyabrskiy, G.V. Smirnova, N.V. Golyasnaya, et al.// Mut. Res. 1993. - V. 293. - P. 197-204.

113. Oliver A. The mismatch repair system (mutS, mutL and uvrD genes) in Pseudomonas aeruginosa: molecular characterization of naturally occurring mutants/ A. Oliver, F. Baquero, J. Blaezquez// Mol. Microbiol. 2002. — V. 43.-P. 1641-1650.

114. Pala M. DNA damage in liver of mice treated with N-nitrodimethylamine/ M. Pala, P. Russo, G. Nicolo, et al.// Mutat. Res. 1982. - V. 103, № 3 -6. -P.207 -211.

115. Parikh S.S. Envisioning the molecular choreography of DNA base excision repair/ S.S. Parikh, C.D. Mol, DJ. Hosfield, et al.// Curr. Opin. Struct. Biol. -1999. -№ 9. -P. 37-43.

116. Pfeifer G.P. Involvement of DNA damage and repair in mutational spectra/ G.P. Pfeifer// Mutat. Res. 2000. - V. 450. - P. 1-3.

117. Pollard E.C. Induced radioresistance: an aspect of induced repair/ E.C. Pollard, DJ. Fluke, D. Kazanis// Mol. Gen. Genet. 1981. - V. 184. - P. 421 -429.

118. Posnick L.M. Imbalanced base excision repair increases spontaneous mutation and alkylation sensitivity in Escherichia coli/ L.M. Posnick, L.D. Samson//J. Bacteriol. 1999. - V. 181, № 21. - P. 6763-6771.

119. Potter P.M. Characterization and nucleotide sequence of ogt the O6 -alkylguanine DNA - alkyltransferase of Escherichia coliI P.M. Potter, M.C. Wilkinson, J. Fitton, et al.// Nucleic Acids Res. - 1987. - V. 15. - P. 9177-9193.

120. Powell S.C. Different characteristics distinguish early versus late arising adaptive mutations in Escherichia coli FC40/ S.C. Powell, R. M. Wartell// Mutat. Res. -2001. -V. 473. P. 219-228.

121. Primianoa T.A. Redox regulation of genes that protect against carcinogens/ T.A. Primianoa, T.R. Suttera, T.W. Kenslera// Comp. Biochem. Physiol. -Part B: Biochem. Mol. Biol. 1997. - V. 118. - P. 487-497.

122. Rasmussen L.J. The Escherichia coli MutS DNA mismatch binding protein specifically binds 06-methylguanine DNA lesions/ L.J. Rasmussen, L. Samson// Carcinogen. 1996. - V. 17. - P. 2085-2088.

123. Reddy M.K. Assembly of a functional replication complex without ATP hydrolysis a direct interaction of bacteriophage T4, gp45 with T4 DNA polimerase/ M.K. Reddy, S.E. Weitsei, P.H. von Hippel// Procl. Natl. Sei. USA. 1993. - V. 90. - P. 3211 - 3215.

124. Relan N.K. Preferential interaction of the Escherichia coli LexA repressor with anions and protons are coupled to binding the RecA operator/ N.K. Relan, E.S. Jenuwine, O.H. Gumbs, et al.// Biochemistry. 1996. — V. 36, № 5.-P. 1077-1084.

125. Rettberg P. Microscale application of the SOS-LUX-TEST as biosensor for genotoxic agents/ P. Rettberg, Ch. Baumstark-Khan, K. Bändel, et al.// Analyt. Chimica Act. 1999. - V. 1, № 1. - P. 289-296.

126. Ripp S. Bioluminescent most probable - number monitoring of a genetically engineered bacterium during a long - term contained field release/ S. Ripp, D.E. Nivens, C. Werner, et al.// Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2000. - V. 53. - P. 736 - 741.

127. Rolig R.L. Linking DNA damage and neurodegeneration/ R.L. Rolig, P.J. McKinnon// Tren. Neuroscience. 2000. - V. 23. - P. 417-424.

128. Rosche W.A. Mutation under stress: adaptive mutation in Escherichia coli/ W.A. Rosche, P. L. Foster// In G. Storz and R. Hengge-Aronis (ed.), Bacterial stress responses. ASM, Washington, D.C. 2000. P. 239-248.

129. Rupani S.P. Characterization of the stress response of a bioluminescent biological sensor in batch and continuous cultures/ S.P. Rupani, M.B. Gu, K.B. Konstantinov, et al.// Biotechnol. Prog. 1996. - № 12. - P. 387-392.

130. SaiSree L. Ion incompatibility associated with mutations causing SOS induction: null uvrD alleles induce an SOS response in Escherichia coli! L. SaiSree, M. Reddy, et al.// J. Bacteriol. 2000. - V. 182, № 11. - P. 31513157.

131. Salles B. Mutation of the promotor and LexA binding sites of cea, the gene encoding colicin El/ B. Salles, G.M. Weinstock// Mol. Cen. Genet. 1989. -V. 215.-P. 483-489.

132. Samson I. The suicidal DNA repair methyltransferases of microbes/ I. Samson// Mol. Microbiol. 1992. - V. 6. - P. 825-831.

133. Sancar A. A novel repair enzyme: UvrABC excision nuclease of Escherichia coli cuts a DNA strand on both sides of the damaged region/ A. Sancar, W.D. Rupp// Cell. 1983. - V. 33. - P. 249-260.

134. Sancar A. DNA excision repair/ A. Sancar// Annu. Rev. Biochem. 1996. -V. 65.-P. 43-81.

135. Sancar A. DNA repair enzymes/ A. Sancar, G.B. Sancar// Annu. Rev. Biochem. 1988. - V. 57. - P. 29-67.

136. Sancar A. LexA protein inhibits transcription of the Escherichia coli uvrA gene in vitro/ A. Sancar, G.B. Sancar, W.D. Rupp, et al.// Nature (London). -1982.-V. 298.-P. 96-98.

137. Saparbaev M.K. Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, rat and human 3-methyladenine DNA glycosylases repair 1 ,N6-ethenoadenine when present in DNA/ M.K. Saparbaev, K. Kleibl, J. Laval// Nucleic Acids Res. 1995. -V. 23.-P. 3750-3755.

138. Schnarr M. DNA binding properties of the LexA repressor/ M. Schnarr, P. Oertel Bucnheit, M. Kazmaier, et al.// Biochem. - 1991. - V. 73. - P. 423 -431.

139. Sedgwick B.A Common mechanism for repair of O6 — methylguanine in DNA/ B. Sedgwick, T. Lindahl// J. Mol. Biol. 1982. - V. 154. - P. 169 -175.

140. Sedgwick S.G. Survival mutation and capacity to repair single-strand DNA breaks after gamma-irradiation in different exr strains of Escherichia coli/ S.G. Sedgwick, B.A. Bridges// Mol. Gen. Genet. 1972. - V. 119, № 2. - P. 93-102.

141. Seeberg E. Multiprotein interaction in the strand cleavege of DNA damaged by UV and chemicals/ E. Seeberg// Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. -1981.-V. 26.-P. 217-226.

142. Selby C.P. Mechanisms of transcription-repair coupling and mutation frequency decline/ C.P. Selby, A. Sancar// Microbiol. Rev. 1994. - V. 58, №3.-P. 317-329.

143. Selby C.P. Molecular mechanism of transcription-repair coupling/ C.P. Selby, A. Sancar// Science. 1993. - V. 260. - P. 53-58.

144. Selby C.P. Structure and function of transcription-repair coupling factor. Catalytic properties/ C.P. Selby, A. Sancar// JBC Online. 1995. - V. 270, № 9. - P. 4890-4895.

145. Selby C.P. Transcription preferentially inhibits nucleotide exision repair of the template DNA strand in vitro/ C.P. Selby, A. Sancar// J. Biol. Chem. -1990.-V. 265.-P. 21330-21336.

146. Severinov K. RNA polymerase structure-function: insights into points of transcriptional regulation/ K. Severinov// Current Opin. Microbiology. -2000.-V.3.-P.118-125.

147. Sharer O.D. Chemical approaches toward understanding base excision DNA repair/ O.D. Sharer, L. Dena, G.L. Verdine// Current Opin. Chem. Biol. -1997, №1.- P. 526-531.

148. Sharma S. Multiple control elements for the uvrC gene unit of Escherichia coli! S. Sharma, T.F. Stark, W.G. Beattie, et al.// Nucleic Acids Res. 1986. -V. 14.-P. 2301-2318.

149. Shevell D.E. A region of the Ada DNA-repair protein for the activation of ada transcription or not necessary for activation of alkAi D.E. Shevell, G.C. Walker// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. - V. 88. - P. 9001- 9005.

150. Shevell D.E. Resistance to alkylation damage in Escherichia coli: role of the Ada protein in induction of the adaptive response/ D.E. Shevell, B.M. Friedman, G.C. Walker// Mutat. Res.- 1990. V. 233. - P. 53-57.

151. Singer B. Chemical mutagenesis/ B. Singer, J.T. Kusmierek// Annu. Rev. Biochem. 1982. -V. 51.-P. 655-693.

152. Singer B. Site directed mutagenesis for quantitation of base - base interaction at defined sites/ B. Singer, E. Dosanjh// Mutat. Res. - 1990. - V. 233. — P. 45-51.

153. Sklar R.J. Enhancement of nitrosoguanidine mutagenesis by chloramphenicol in Escherichia coli K-12/ R.J. Sklar// Bacteriol. 1978. - V. 136, № 1. - P. 460-462.

154. Smirnova G.V. Induction of the alkylation-inducible aidB gene of Escherichia coli by cytoplasmic acidification and N-ethylmaleimide/ G. V. Smirnova, O.N. Oktyabsky, E.V. Moshonkina, et al.// Mutat. Res. 1994. -V. 314.-P. 51-56.

155. Smith B.T. Localization of UvrA and effect of DNA damage on the chromosome of Bacillus subtilis! B.T. Smith, A.D. Grossman, G.C. Walker// J. Bacteriol. 2002. - V. 184, № 2. - P. 488-493

156. Snow E.T. The role of DNA repair in development/ E.T. Snow// Reprod. Toxicol.-1997.-V. 11.-P. 353-365.

157. Strauss B.S. Role of the dinB gene product in spontaneous mutation in Escherichia coli with an impaired replicative polymerase/ B.S. Strauss, R. Roberts, L. Francis, et al.// J. Bacteriol. 2000. - V.182, № 23. - P. 67426750.

158. Sullivan D.T. DNA excision repair and transcription: implications for genome evolution/ D.T. Sullivan// Current Opin. Gen. Develop. 1995. - V. 5.-P. 786-791.

159. Sutton M.D. Managing DNA polymerases: coordinating DNA replication, DNA repair, and DNA recombination/ M.D. Sutton, G.C. Walker// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98. - P. 8342-8349.

160. Sutton M.D. umuDC- mediated cold sensitivity is a manifestation of functions of the UmuD2C complex involved in a DNA damage checkpoint control/ M.D. Sutton G.C. Walker// J. Bacteriol. 2001. - V. 183,№ 4. - P. 1215-1224.

161. Sutton M.D. umuDC-dnaQ interaction and its implications for cell cycle regulation and SOS mutagenesis in Escherichia coli/ M.D. Sutton, S. Murli, T. Opperman, et al.// J. Bacteriol. 2001. - V. 183, № 3. - P. 1085-1089.

162. Sweasy J.B. RecA protein of Escherichia coli has a third essential role in SOS mutator activity/ J.B. Sweasy, E.M. Witkin, N. Sinha, et al.// J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 3030-3036.

163. Taddei F. cAMP-dependent SOS induction and mutagenesis in resting bacterial populations/ F. Taddei, I. Matic, M. Radman// Proc. Natl. Acad. Sei. USA.-1995.-V. 92.-P. 11736-11740.

164. Talukder A.A. RpoS-dependent regulation of genes expressed at late stationary-phase in Escherichia coli! A.A.Talukder, S. Yanai, T. Nitta, et al.// FEBS Lett. 1996. -V. 386. - P. 177-180.

165. Taverna P. Generation of an endogenous DNA-methylating agent by nitrosation in Escherichia coli/ P. Taverna, B. Sedgwick// J. Bacteriol. —1996. -V.178.-P. 5105-5111.

166. Teo I.A. Proteolytic processing of the Ada protein that repairs DNA O6-methylguanine residues in E. coli! I.A. Teo// Mutat. Res. 1987. - V. 183. -P. 123-127.

167. Thomas L. Two DNA glycosylases in Escherichia coli which release primarily 3-methyladenine/ L. Thomas, C.H. Yang, D.A. Coldthwait// Biochem. 1982. - V. 23. - P. 1162 - 1169.

168. Tsaneva I.R. ATP dependent branch migration of Holliday junctions promoted by the RuvA and RuvB proteins of Escherichia coli! I.R. Tsaneva, B. Muller, S.L. West// Cell. - 1992. - V. 66. - P. 1171 - 1180.

169. Van de Putte H. The location of genes controlling radiation sensitivity in Escherichia coliI H. Van de Putte, C.A. Van Sluis, J. Van Dillewijn, et al.// Mutat. Res. 1965. - V. 2. - P. 97-110.

170. Van den Berg E.A. Analysis of regulatory sequences upstream of the Escherichia coli uvrB gene: involvement of the DnaA protein/ E.A. Van den

171. Berg, R.H. Geerse, J. Memelink, et al.// Nucleic Acids Res. -1985. V. 13. -P. 1829-1840.

172. Van den Berg E.A. In vivo transcription of the Escherichia coli uvrB gene: both promoters are inducible by UV/ E.A. Van den Berg, R.H. Geerse, H. Pannekoek, et al.//Nucleic Acids Res. 1983. - V. 11. - P. 4355-4363.

173. Van Dyk T.K. Lux-array, a high-density, genomewide transcription analysis of Escherichia coli using bioluminescent reporter strains/ T.K. Van Dyk, E.J. DeRose, G.E. Gonye// J. Bacteriol. 2001. - V. 183, № 19. - P. 5496-5505.

174. Van Houten B. Repair of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine-induced DNA damage by ABC excinuclease/ B. Van Houten, A. Sancar// J. Bacteriol. 1987. - V. 169, № 2. - P. 540-545.

175. Vassylyev D.G. DNA-repair enzymes/ D.G. Vassylyev, K. Morikawa// Curr. Opin. In Struct. Biol. 1997. - № 7. - P. 103-109.

176. Vinson R.K. DNA repair during organogenesis/ R.K. Vinson, B.F. Hales// Mutat. Res. 2002. - V. 509. - P. 79-91.

177. Voight J.M. Repair of O6 methylguanine by ABC exinuclease of Escherichia coli! J.M. Voight, B. Van Houten, A. Sancar, et al.// J. Biol. Chem. -1989. - V. 264. - P. 5172-5176.

178. Volkert M.R. Altered induction of the adaptive response to alkylation damage in Escherichia coli recF mutant/ M.R. Volkert// J. Bacteriol. 1989. -V. 171.-P. 99-103.

179. Volkert M.R. Transcriptional responses to DNA damage/ M.R. Volkert, P. Landini// Current Opinion in Microbiol. 2001. - V. 4. - P. 178 - 185.

180. Wagner J. Escherichia coli DNA polymerase IV mutator activity: genetic requirements and mutational specificity/ J.Wagner, T. Nohmi// J. Bacteriol. — 2000.-V. 182, № 16.-P. 4587-4595.

181. Walker G.C. Mutagenesis and inducible responses to deoxyribonucleic acid damage in Escherichia coli/ Walker G.C.// Microbiol. Rev. 1984. - V. 4. -P. 60-93.

182. Wang X. Mutagenic specificity of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine in the tonB gene on the chromosome of Escherichia coli recA+ and recA- cells/ X. Wang, K. Kitamura, K. Yamamoto// Biochem. Biophys. Res. Commun. -1996. V. 227, № 2. - P. 334-339.

183. Weber A. Profiling early osmostress-dependent gene expression in Escherichia coli using DNA macroarrays/ A. Weber, K. Jung// J. Bacteriol. -2002. V. 184, № 19. - P. 5502-5507.

184. Willardson B.M. Development and testing of a bacterial biosensor for toluene-based environmental contaminants/ B.M. Willardson, J.F. Wilkins, T.A. Rand, et al.// Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64, № 3. - P. 10061012.

185. Wösten M.S. Eubacterial sigma factors/ M.S. Wösten// FEMS Microbiol. Rev. - 1998. - № 22. - P. 127 - 150.

186. Wyatt M.D. 3-Methyladenine DNA glycosylases: structure, function, and biological importance/ M.D. Wyatt, J.M. Allan, A.Y. Lau, et al.// Bioessays. 1999.-V. 21.-P. 668-676.

187. Wyllie A.H. The genetic regulation of apoptosis/ A.H. Wyllie// Curren. Opin. Gen. Develop. 1995. - V. 5. - P. 97-104.

188. Xiao W. Synergism between yeast nucleotide and base excision repair pathways in the protection against DNA methylation damage/ W. Xiao, B.L. Chow// Curr. Genet. 1998. - V. 33, № 2. - P. 92-99.

189. Yamada M. Construction and characterization of mutants of Salmonella typhimurium deficient in DNA repair of 06-methylguanine/ M. Yamada, B. Sedgwick, T. Sofiini, et al.// J. Bacteriol. 1995. - V. 177, № 6. - P. 15111519.

190. Yamamoto K. Induction of prophage lambda in Escherichia coli recA- strain by N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine/ K. Yamamoto, H. Shinagawa, S. Kondo// Mutat. Res. 1983. - V. 107, № 1. - P. 33-40.

191. Yanofsky C. Amino acid replacements and the genetic code/ C. Yanofsky, J. Ito, V.Horn// Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1966. - V. 31. - P. 151-152.

192. Zambrano M.M. Microbial competition: Escherichia coli mutants that take over stationary phase cultures/ M.M. Zambrano, Dd.Aa. Siegele, A. Marta, et al.//Science.-1993.-V. 259.-P. 1757- 1760.

193. Zijlstra J.A. Mutagenicity of 7,12-dimethyl-benz(a)anthracene and some other aromatic mutagens in Drosophila melanogaster/ J.A. Zijlstra, E.W. Vogel// Mutat. Res. 1984. - V. 125, № 2. - P. 243 - 261.

Информация о работе

Цветкова, Наталья Александровна
кандидата биологических наук
Пермь, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Мутагенез, индуцированный N-метил-N,-нитро-N-нитрозогуанидином, в культурах делящихся и неделящихся клеток Escherichia Coli - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы