Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние стресса на мутагенную активность алкилирующих соединений и асбеста в микробных тест-системах и клетках млекопитающих

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние стресса на мутагенную активность алкилирующих соединений и асбеста в микробных тест-системах и клетках млекопитающих"

На правах рукописи

Голясная Надежда Викторовна

ВЛИЯНИЕ СТРЕССА НА МУТАГЕННУЮ АКТИВНОСТЬ АЛКИЛИРУЮЩИХ СОЕДИНЕНИИ И АСБЕСТА В МИКРОБНЫХ ТЕСТ - СИСТЕМАХ И КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 1995

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской Академии наук (г.Пермь) и в Нзпиер университете (г.Эдинбург, Шотландия)

Научные руководители: член-корреспондент РАН, доктор медицинских

наук, профессор В.А.Черешнев

кандидат медицинских наук, ст.н.с. В.А.Демаков

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Э.С.Горовиц доктор биологических наук, профессор В.А.Тарасов

Ведущая организация - Институт микробиологии РАН

Защита состоится _1995 г.

в_часов на заседании специализированного совета по присуждению

степени кандидата биологических наук при Пермской государственной медицинской академии Минздравмедпрома РФ по адресу: 614000, г.Пермь, ул. Куйбышева, 39

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной медицинской академии Минздравмедпрома РФ

Автореферат разослан_1995 г.

Ученый секретарь диссертационного специализированного совета, кандидат медицинских наук,- доцент

Р.С.Кузяев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В ответ «ние толшературы, pH и

осмотического ногдейстние ультрафиолетового света, ток-

i.i-iccwix лймии^сгег-: соединений, голодание индуцируется синтез специфических протеинов, важных для адаптации к новым условиям, а также для защиты органиэмов против дальнейшего потенциального воздействия стресса.

С другой стороны, известно, что факторы внешней среды модифицируют мутагенную активность химических соединений как в микробных тест-системах, так и в культурах клеток млекопитающих. Как было выяснено, одна из причин - это химическое разложение соединений под влиянием таких факторов, как температура, pH раствора. Деструкция веществ ведет к появлению продуктов со сниженной или повышенной мутагенной активностью. Итак, мутагенная и генотоксическая активность веществ до момента попадания в клетку или живой организм изменяется под влиянием физических факторов и зависит от физико-химических свойств соединений.

В клетке, или в живом организме химические соединения подвергаются биотрансформации. Метаболизм и продукты реакции конъюгации ксенобиотиков с биомолекулами способствуют усилению или снижению потенциальной генотоксической активности химических веществ.

Кроме того, исследования в области физиологии и биохимии свидетельствуют о влиянии условий культивирования на структуру и функции клеточной мембраны, что определяет транспорт химических веществ в клетку. При попадании в клетку химические вещества вмешиваются в критические для клетки события, синтез ДНК, протеинов ( Chu G.L. et al., 1987; Lenaire J. et al., 1986; Morgan R.W. et al., 1986; Reiner A. et al., 1990). Активность многих ферментативных систем в клетках зависит от значений цитоплазматического pH, от изменения направления протонной движущей силы, регуляция которой находится под контролем системы гомеостаза клетки (Doppler W. et al., 1987; Grinstein S. et, al., 1989; Ober S. et al., 1987).

Исследования по тестированию химических соединений на мута-

- г -

генную активность свидетельствуют, что даже в случае тщательного учета физико-химических характеристик соединений и идентификации продуктов их метаболизма, обладающих мутагенной активностью, возможно появление ложных позитивных и ложных негативных ответов. Причинами появления таких результатов являются сопутствующие факторы, специфические для используемых тест-систем (фаза роста или стадия клеточного цикла, функциональное состояние клеток, эффект взаимодействия тестируемого вещества с культуральной средой и условия культивирования) (Тарасов В.А., 1994). Вариабельность результатов тестирования ксенобиотиков в различных краткосрочных тест-системах является одним из препятствий для прогностической оценки их генотоксической активности. Выяснение причин вариабельности ответов при биотестировании химических соединений открывает путь для решения этой проблемы.

Данные, полученные как на бактериальных тест-системах, так и на культурах клеток зукариот, свидетельствуют об индукции геноток-сических эффектов физико-химическими факторами ( Керкис Ю.Я., 1939; Лобашев М.Е., 1976; Claes R., 1989).. Широко известные явления такие, как инсерции, рекомбиногенные события, непропорциональная репликация ДНК, амплификация различных групп генов, в том числе и онкогенов, а также изменение экспрессии генов через метилирование цитозина индуцируются стрессами, что в конечном итоге ведет либо к изменению уровня спонтанного мутирования, либо к потере контроля точности хромосомной сегрегации в митозе клеток эукариот (Ayres К. et al., 1982; Babich М. et al., 1986; Bonatti S. et al., 1989; Bradbury J. et al., 1983). Кроме того, существуют факты, дающие основание предполагать, что события,'развивающиеся при воздействии различных видов стрессов, могут быть обычными метаболическими ситуациями, связанными с фазами клеточного роста бактериальных культур, или стадиями клеточного цикла клеток млекопитающих (Bradbury J. et al., 1983; Doppler W. et al., 1987; Grinstein S. et al., 1989; Gross J.D., 1983).

Так как, в процессе деления клеток, клеточные системы находятся в состоянии периодически меняющегося ферментативного профиля, обеспечиваощего переход клеток на другой уровень метаболизма, то активное вмешательство в критические моменты клеточного цикла сопровождается нарушениями, которые могут проявиться в ингибирова-нии митозов, одно-двунитевых разрывах ДНК, снижении синтеза ДНК,

усилении репарационных процессов и ингибированш трансляции (Ing-ber D.E. et al., 1990-, IngrahamJ., 1987; Konings A.W., 1986; L'Allemain G. et al., 1984; Lugtenberg B. et al., 1976; Matters G.L. et al., 1986). Известно, что в ответ на изменение условий инкубирования как в бактериальных клетках, так и в клетках эукариот индуцируются несколько высококонсервативных совместно регулируй««, систем: гены теплового шока, и рн-гсыёйитаяя ( Rtnghaai

f?.J. cL Hi., 1330; Botsford J.L., 19УО; Csonka L.N., 1989; Gross C.A. et al., 1990).

С другой стороны, анализ литературы показал, что одной из общих точек, между ответом клетки на иаменение условий среды и процессом реализации повреждения наследственного материала клеток, является система метаболизма тиол-содержащих низкомолекулярных соединений,; в: частности глутатиона (GSH). Существуют доказательства об участии низкомолекулярных тиолов в снижении или усилении мутагенного потенциала химических соединений. В то же время, различные виды стресса регулируют содержание низкомолекулярных тиолов в клетке ( Alsicu P. et al., 1987; Bayer U. et al., 1981; Oktyabrsky O.N. et al., 1993a; Oktyabrsky O.N., et al 1993b).

В клеточном метаболизме как прокариот так и эукариот глутати-он выполняет важные функции: защита макрсмолекулярных веществ элиминированием патологических дисульфидных мостиков белковых молекул; участие в реакциях, катализируемых глутатион-Б-трансферазой; связывание реактивных интермедиатов, в результате чего формируются глутатион-кояъюгаты, которые могут взаимодействовать с клеточными макромолекулами; участие в синтезе дезоксирибонуклеотидов, предшественников ДНК и в синтезе эндогенных компонентов эукариотичес-ких клеток (Chan J.Y.H. et al., 1986; Cochrane Ch.G., 1991; Crystal R.G., 1991). Кроме того, сульфгидрил/дисульфидное соотношение определяет активность ряда ферментов, участвующих в транспорте аминокислот через мембрану клетки, ответ клеток на митогены, синтез ДНК, протеинов и т.д. (Cole S.P.C. et al., 1991; De Flora S. et al., 1989; De Flora S., et al., 1991; Hill K.E., et al., 1984).

Несмотря на общность физиологических функций глутатиона у микроорганизмов и эукариот, отличия в его содержании, зависимость кинетики метаболизма глутатиона от физиологического состояния клетки являются индивидуальными характеристиками не только различных видов, но и штаммов одного вида клеток. Например, уровень глу-

татиона, изменение его концентрации при воздействии стресса и период восстановления после снятия стресса различны у двух штаммов Escherichia coli - К12 и В/г (Oktyabrsky O.N. et al., 1993b) и культур клеток Chinese hamster ovary (CHO) и Chinese hamster ovary КГ (CHO Kl) (Griffith O.W. et al., 1979). Выяснение звеньев цепи: условия инкубирования —> содержание глутатиона —> генотокси-ческая активность, - по нашему мнению, могут дать полезную информацию для интерпретации генотоксической активности химических соединений в различных краткосрочных тест-системах.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось изучение влияния стресса на мутагенную активность алкилирующих соединений и асбеста, и определение роли низкомолекулярных тиолов в формировании генотоксических эффектов, вызванных различными типами стресса.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

- изучение влияния рН среды на частоту индуцированных мутаций в бактериальной тест-системе и в клетках Chinese hamster ovary (CHO);

- изучение влияния ацетат и метиламина на мутагенную активность ал-килирующего соединения (на микроорганизмах и клетках эукариот) и асбеста (на клетках эукариот);

- изучение влияния температурного шока на мутагенез;

- изучение модифицирующего действия гиперосмотического шока на частоту мутаций;

- изучение влияния содержания внутриклеточного глутатиона на мутагенез, пролиферативную активность и кариотипическую нестабильность клеток в условиях стресса.

Научная новизна и ценность работы.

. В работе впервые выявлена наиболее значимая в прогностическом отношении модификация мутагенной активности прямого и потенциального алкилирующих соединений и асбеста в ответ на изменение условий инкубирования. Дан сравнительный анализ мутагенной активности соединений в трех краткосрочных тест-системах, широко используемых в практике тестирования химических соединений. На основании анализа результатов установлено: чувствительность или резистентность тест-объектов к мутагенному действию химических соединений зависят от состояния репарационной системы и является видоспецифической. Впервые показано, что одним из звеньёв механизма видоспецифической

зависимости является активность глутатион-зависимых реакций и индивидуальная особенность регулирования содержания глутатиона в клетке. Снижение уровня восстановленного глутатиона под влиянием стрессов или в результате ингибирования глутатион-зависимых реакций снижает мутагенную активность алкилирующих соединений типа Ы-метил-М'-нитро-М-нитрозогуанидина (МННГ) или Проведено изучение зависимости ттрсг»1«р*гивнсЯ 'активности и карио-нист?.5;ишНисти кл^тск C5J0 с нормальным и истощенным со-дсрнанием редуцированного глутатиона.

Блок синтеза глутатиона активирует процессы ответственные за кариотипическую нестабильность культуры клеток СНО. Количество клеток с гетероплоидным набором хромосом, в культурах обработанных мутагенами, может быть снижено изменением условий культивирования и ингибированием глутатион-зависимых реакций.

Основные положения диссертации выносимые на защиту:

1. Экспериментальное обоснование модифицирующего воздействия различных видов стрессов на процесс мутагенеза в штаммах Esheric-hia coli B/r WP2, Salmonella typhimurium TA 1535 и в клетках Chinese hamster ovary.

2. Особенности развития мутагенеза в культурах клеток с нормальным и сниженным содержанием восстановленного глутатиона.

3. Доказательства, подтверждающие влияние различных видов стрессов на пролиферативную активность и кариотипическую стабильность культур в зависимости от уровня восстановленного глутатиона в клетке.

4. Экспериментальные данные, подтверждающие влияние стрессов на цитостатическую активность циклофосфамида и асбеста и их способность индуцировать количественные хромосомные изменения в культурах с нормальным и сниженным содержанием глутатиона.

Работа проведена согласно координационному плану РАН (регистрационный номер от шифр )"_" и выполнена в Институте экологии

и генетики микроорганизмов УрО РАН на базе лаборатории химического мутагенеза (руководитель - к.м.н. В.А. Демаков).

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на Координационном совещании по проблеме "Эколого-генетические последствия воздействия на окружающую среду антропогенных факторов", г.Сыктывкар, 1989; на Международной конференции "Мутагены и канцерогены", Прага, 1991; на Международной конференции "Загрязне-

ние окружающей среды", С.-Петербург, 1995.

По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, 3 глав, обсуждения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 128 страницах машинописного текста, включая 27 таблиц. Список литературы содержит 212 наименований работ на русском и английском языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы. Основные химические соединения, среды, ингредиенты питательных и физиологических сред, буферные растворы: D-биотин (Serva), L-гистидин (Reanal), триптофан, тиамин (Иика);М-метил-К-нитро-М'-нитрозогуанидин, циклофосфамид, бутио-нин сульфоксимин, колхицин, ацетат натрия, метиламин гидрохлорид, орсеин, пенициллин, стрептомицин (Sigma); промышленные образцы асбеста (длинные и короткие волокна амосайта) любезно предоставлены К.Дональдсоном (Нзпиер университет, Шотландия).

Отечественные химические реактивы использовали квалификации "х.ч.". Мясо-пептонный бульон pH 7.4-7.6, мясо-пептонный агар pH 7.4-7.6, изготовленный НПО "Биомед".

Питательная среда для культур клеток F10, фетальная сыворотка крупного рогатого скота, трипсин (Gibco).

В работе использовали следующие штаммы микроорганизмов: Escherichia coli B/r WP 2 trp (получен из Института общей генетики," Москва) и Salmonella typhimurium ТА 1535 his bio uvrB rfa (получен от В. Ames, США) и культуру клеток Chinese hamster ovary (СНО,диплоидный набор хромосом 20, получена из Европейской коллекции культур клеток, Прага, Чехия).

Частоту спонтанных и индуцированных мутаций в микроорганизмах определяли по соотношению количества ревертантов к количеству живых клеток в инокуляте (Ames,1971, 1975).

Спонтанный и индуцированный мутагенез в клетках СНО определяли по методу (Mather, 1984). Хромосомные аберрации анализировали в метафазах с набором хромосом 20. В каждом варианте эксперимента анализировали 100 метафаз и определяли процент метафаз с хромосомными аберрациями.

Пролиферативную активность культуры оценивали при помощи подсчета количества клеток вступивших в стадию метафазы из 1000 клеток культуры. Митотический индекс выражен в процентах.

Уровень гетеропловдных клеток (анеуплоидные клетки с набором хромосом выше или ниже псевдодиплоидного количества-20 и полиплоидные клетки с набором хромосом околотетраплпид?:сг- ¡¿лига; выуаж^н в процентах и представляв ^¿^нт мстаЬая с измененным количеством ".iwMcx^M 1С0 прсападиэированных метафаз.

Для получения культуры клеток с истощенным содержанием глута-тиона за два часа до начала эксперимента в суспензию клеток вносили бутионин сульфоксимин в концентрации 20 мкМ (Griffith et, al., 1979).

Статистический анализ экспериментальных данных проводили с помощью общепринятого стандартного метода вариационной статистики [ЛакинГ.Ф., 1990; Плохинский Н.А., 1980, Рокицкий А.П., 1973]. Достоверность различий (Р) оценивали по t-критерию Стьюдента (р<0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Комплекс выполненных нами экспериментальных исследований включает изучение влияния различных видов стрессов на спонтанный и индуцированный мутагенез и роль редуцированного глутатиона в этом процессе.

В результате проведенных исследований было установлено, что развитие мутагенеза в стрессовых условиях в клетках микроорганизмов E.coli B/r WP2 и S.typhimurium ТА1535 и в культуре клеток Chinese hamster ovary зависит как от природы химического мутагена, так и содержания редуцированного глутатиона в клетке.

Известно, что обработка клеток знтеробактерий редуцированным глутатионом снижает или повышает мутагенную активность МННГ. На основании этих результатов Owens (1986) и Jensen (1987) высказали предположение, что неэнзиматическая конъюгация МННГ с глутатионом вне клетки ведет к разложению его до немутагенных продуктов (вода и метанол), а внутри клетки образуются дериваты обладающие повышенным алкилирующим эффектом.

Физиологические процессы, индуцируемые стрессами, могут регулировать содержание глутатиона внутри клетки и на внешней стороне

клеточной мембраны. Как было показано ранее, закисление цитоплазмы клеток E.coli ацетатом натрия вызывает временное снижение содержания непротеиновых тиолов в клетке и повышение их концентрации во внешней среде (Oktyabrsky et al., 1993). Напротив, защелачивание цитоплазмы в результате осмотического шока, ведет к повышению содержания GSH внутри клетки (Working P.K., 1986).

Исходя из выше сказанного, мы сочли необходимым провести эксперименты по изучению влияния различных видов стрессов на мутагенез. Результаты представлены на рис. 1, 2, 3 4.

Результаты исследований показали, что развитие процесса мутагенеза в стрессовых условиях осуществляется по трем различным программам: отсутствие эффекта, усиление или ингибирование мутагенеза. Все три категории одинаково характерны для спонтанного и индуцированного мутагенеза.

Сравнительный анализ результатов, полученных в трех краткосрочных тест-системах, свидетельствует о видоспецифической зависимости ответа клеток на изменение условий культивирования. Так, например, изменение pH среды в кислую или щелочную область в штамме E.coli В/г WP2 стимулирует антимутагенные, а в штамме S.typhi-murium ТА 1535 - генотоксические процессы (рис. 1). В культуре клеток СНО щелочной шок ингибирует процесс образования хромосомных аберраций (рис. 2).

Экспериментальные данные по индуцированному мутагенезу в условиях стресса отражают чувствительность тест-объектов. Чувствительность клеток к мутагенному действию соединения можно изменить при помощи комбинирования условий культивирования. Инкубация клеток E.coli В/г WP2 и S.typhimurium ТА 1535 в среде с щелочным значением pH у первых повышает чувствительность, у вторых индуцирует резистентность к МННГ (рис. 3). Возникает вопрос, определяется ли это клеточными реакциями, химическим разложением или метаболизмом вещества в клетке.

Ранее проведенные исследования показали, что МННГ нестабилен в растворах с щелочным или нейтральным значением pH (Leonardo J.M.j,et al. 1982). В наших исследованиях уровень частоты мутаций индуцированных МННГ в культуре клеток E.coli В/г WP2 не зависел от . pH среды, а при гиперосмотическом и температурном стрессе частота мутаций зависела от продолжительности стресса. Таким образом, химическое разложение МННГ не играет существенной роли при кратков-

- 9 -

_____________ - lg числа ревертантов

1,0е-008 1,0е-007 1.0e-006 1,0е-005

Контроль pH = 5.5 pH » 8.2

Ацетат

Г= 42"С NaCl

Щ S.typhimurium ТА 1535 И E.coli В/г WP2

Рис.1. Влияние различных видов стрессов на частоту мутирования Escherichia coli В/г WP2 и Salmonella typhimurium ТА 1535.

О

Контроль pH = 5.5 pH = 8.2 Ацетат Метиламин t°= 42°С NaCl

Рис.2. Влияние различных видов стрессов на количество метафаз с аберрациями в культуре клеток Chinese hamster ovary.

Количество метафаз с аберрациями (в %) 3 6 9 12 15

■

S3*

....

................. """.............. ..............

* - Р < 0.05 по критерию Стьюдента.

ременном изменении pH, осмотического давления среды и температуры инкубирования.

Известно, что изменение pH среды сопровождается изменением интрацеллюлярного pH (Bakker Е.P. et al., 1983), Зачисление цитоплазмы клеток может вызвать присутствие ацетат в инкубационной среде. Как следствие закисления цитоплазмы уровень редуцированного глутатиона на внешней стороне клеточной мембраны повышается, внутри клетки - снижается (Oktyabrsky O.N. et al., 1993а).

Экспериментальные данные, полученные на тестерных штаммах микроорганизмов, обработанных ацетатом, подтвердили ранее высказанное предположение о том, что незнзиматическая реакция образования аддуктов прямого мутагена МННГ с GSH вне клетки элиминирует ДНК-повреждающую активность соединения и выполняет протективную функцию (Jensen D.E. et al., 1987). Ключевую роль в этом процессе играет экспорт редуцированного глутатиона из клетки при закислении цитоплазмы (Oktyabrsky O.N. et al., 1993a).

Напротив, защелачивание цитоплазмы, в результате осмотического шока (Oktyabrsky O.N. et al., 1993b), a также температурный шок, ведущий к повышению GSH внутри клетки (Konings A.W., 1986; Shrieve D.C. et al., 1986), стимулирует образование GSH-конъюгатов с повышенным алкилирующим потенциалом внутри клетки. Это объясняет повышение мутагенной активности МННГ при обработке клеток микроорганизмов метиламином, при инкубации клеток в гиперосмотических условиях или при повышенной температуре. ; - .

Отличие в ответе штаммов E.coli В/г WP2 и S.typhimurium ТА 1535 на мутагенное действие МННГ при гиперосмотическом шоке заключалось в том, что к концу осмотического шока частота мутаций е культуре первого штамма снижалась, а в культуре второго-постепенно возрастала (рис. 3). Противоречивость этих результатов может быть объяснена тем, что в клетках микроорганизмов защелачивание цитоплазмы "вызывает SOS репарационную функцию и активацию промотора uvrA (Suter W. et al., 1984; Goodson M. et al., 1990), что повлияло на частоту индуцированных мутаций у E.coli В/г WP2. Наличие мутации в системе эксцизионной репарации у S.typhimurium ТА 1535 определило ответ штамма на мутагенное действие МННГ.

В клетках эукариот значение интрацеллюлярного pH, является качественным маркером индукции синтеза ДНК. Снижение внутриклеточного pH, которое происходит при инкубации клеток в щелочной среде,

1,0e-007

lg числа ревертантов 1,0e-006 l,0e-005

Контроль pH « 5.5 pH « 8.2 Ацетат Метиламин

t°= 425C NaCt

1,0e-004

Рис.3. Мутагенная активность Н-мегил-Ы'-нитро-Н-нитрозо-гуанидина в культуре клеток Escherichia coli В/г WP2 и Salmonella typhimurium ТА 1535.

п ^ Г\

г-.

ингибирует синтез ДНК (Bruslck D., 1986; Ingber D.E. et al., 1990). Возможно, снижение количества метафаз с хромосомными аберрациями в культуре клеток СНО под влиянием щелочного шока является следствием этого процесса. Однако, данные, полученные на культуре с частичным ингибированием глутатион-зависимых реакций подтвердили необходимость присутствия глутатиона для ингибирования процесса образования хромосомных аберраций в культуре клеток СНО при щелочном рН среды (рис. 4).

Внесение ацетата в культуру клеток СНО стимулирует образование хромосомных аберраций в клетках. Мутагенное действие ацетата снижается в результате ингибирования глутатион-зависимых реакций.

Сравнительный анализ результатов, полученных на культурах клеток СНО с нормальным и с истощенным содержанием глутатиона, дает основание предположить, что незначительное снижение рН среды с 7.4 до 6.8 вызывает биохимические изменения. По-видимому, эти изменения оказывают влияние на пул редуцированного глутатиона. Нами было показано, что блок синтеза глутатиона в клетках СНО сопровождается повышением количества метафаз с аберрациями при нейтральном рН среды, но не влияет на мутагенез, продиферативную активность и кариотипическую стабильность при рН 6.8.

Если процесс регуляции интрацеллюлярного глутатиона в клетках СНО в основных чертах эквивалентен событиям происходящим в клетках E.coli, то за основу объяснения генотоксического или антимутагенного действия рН-шока можно взять следующие положения: 1. повышение содержания редуцированного глутатиона в клетке, высокая скорость его катаболизма, и как следствие - снижение соотношения GSH:GSSG при аащелачивании цитоплазмы метиламином, индуцирует антимутагенные процессы; 2. генотоксический эффект ацетата опосредован экспортом редуцированного глутатиона во внешнюю среду и репрессией репликации и репарации ДНК.

Высокая температура, как и высокая концентрация хлористого натрия супрессирует репарацию и репликацию в клетках различных организмов (Chu G.L. et al., 1987). Известно, что температурный шок изменяет аффинность ДНК-полимеразы а и а, участвующих в синтезе ДНК (Dikomey Е. et al., 1987).

Полученные в нашей работе результаты дают основание предполагать, что изменение содержания глутатиона под влиянием осмотического стресса стимулирует генотоксические процессы в клетках СНО, а

Рис.4. Количество метафаз с аберрациями в культуре клеток Chinese hamster ovary.с нормальным и сниженным содержанием глутатиона и при различных условиях культивирования.

антимутагенное действие температурного стресса полностью снимается ингибированием глутатион-зависимых реакций (рис. 4).

В связи с противоречивостью результатов по антимутагенному действию глутатиона, несомненный интерес представляет вопрос о природе двойственного эффекта глутатиона на процесс индуцированного мутагенеза. '

Данные по мутагенной активности циклофосфамида, дают основание полагать, что в основных чертах механизм детоксикации или активации мутагенов глутатионом эквивалентен как для прямого (МННГ), так и потенциального (циклофосфамид) апкилирующего соединения.

Мутагенная активность циклофосфамида, снижается лри внесении ацетата или при защелачивании среды (рис. 4).

Снижение мутагенной и цитостатической активности циклофосфамида наблюдается в клетках с высоким содержанием глутатиона. Это не противоречит с ранее полученными данными о защите фермента 0б-метилгуанин-ДНК-трансметилазы глутатионом в процессе мутагенеза индуцированного циклофосфамидом (Сох Р. е1 а1.,1988). Однако, не всегда отсутствие выраженного мутагенного действия циклофосфамида сопровождается снижением его цитотоксинеской активности. Так, в случае осмотического шока снижение частоты хромосомных аберраций и пролиферативной активности не зависит от содержания 0£Н в клетке. Хотя осмотический шок вызывает временное защелачивание цитоплазмы, генетические процессы, а возможно, и пути метаболизма циклофосфамида в условиях тургорного стресса отличны от процессов индуцируемых слабым проникающим основанием метиламином. " Поэтому, защелачивание цитоплазмы метиламином, когда концентрация 65Н внутри клетки выше, чем во внешней среде, усиливает мутагенную и цитостатическую активность циклофосфамида.

Экспериментальные данные, полученные на клетках, обработанных метиламином, альтернативны результатам подученным на клетках обработанных ацетатом. Однако, в обоих вариантах блок синтеза ББН нейтрализует влияние метиламина и ацетата на мутагенез индуцированный циклофосфамидом.

Таким образом, чувствительность клеток СНО к циклофосфамиду повышается в присутствии эндогенного редуцированного, глутатиона. Резистентность клеток к циклофосфамиду индуцируется ацетатом натрия.

Участие глутатиона в индукции и течении окислительного стрёс-

са, а также роль окислительного стресса в индукции мутаций и канцерогенезе хорошо аргументирована в многочисленных работах (De Flora S. et al., 1989a; De Flora S. et al., 1989b; De Flora S. et al., 1991). Трипептид-GSH участвует в различных системах, защищающих клетки от повреждения активными кислородными радикалами различной природы (Sies Н., 1991). Кроме тпгл ^"с;:::;: с^кинми - iAvxAf»"", мелет принять пгюокс^алтнуЕ активность при CÍU4ÜUX условиях.

Выбор асбеста в качестве ксенобиотика для исследования его мутагенной активности был основан на том, что он обладает редокс активностью, т.е. способен генерировать активные кислородные радикалы и индуцировать окислительный стресс.

Нами было показано, что мутагенная активность амосайта усиливается ингибированием GSH-зависимьк реакций (рис. 4). Возможно, повышение мутагенной активности амосайта является результатом двойного эффекта. Во-первых, образование активных свободных кислородных радикалов з среде. Во-вторых, в отсутствие глутатиона происходит ингибирование GSH-пероксидазы, участвующей в элиминировании гидроперекисей.

Мутагенная активность длинных волокон амосайта в культуре клеток при различных видах стрессов зависела от содержания глутатиона в клетке. Ингибирование глутатион-зависимых реакций изменяет мутагенную активность длинных волокон в культуре клеток СНО при изменении условий культивирования.

Так, ингибирование глутатион-зависимых реакций и внесение ацетата или температурный шок снижает мутагенную активность длинных волокон амосайта.

Тот факт, что в клетках СНО после истощения G5H, белки температурного шока не индуцируются высокой температурой, подтверждает, что защиту клеток от ДНК повреждающего действия окислительного стресса осуществляет система отличная от белков температурного шока.

В'присутствии глутатиона в культуре, перенесщей температурный шок, мутагенное действие длинных волокон амосайта усиливается. Возможно, эффект является результатом аддитивного действия как физического присутствия длинных волокон амосайта в клетке, активных кислородных радикалов, индуцируемых асбестом и ингибирование репликации и репарации ДНК. Таким образом, истощение GSH в клетке ин-

гибирует ДНК-повреждающее действие амосайта при кислотном pH-шоке и температурном стрессе (рис. 4).

Как было показано ранее, мутагенная и канцерогенная активности образцов асбеста одного вида с различными физическими, но не 'химическими характеристиками неравноценны (Kaplan Н. et al., 1990; Kelsey К.Т. et al., 1986).

; Отличие в ответе клеток на окислительный стресс, индуцированный короткими волокнами амосайта был менее выражен и имел качет-венно иные характеристики, когда синтез 6SH блокирован. Прежде всего это отразилось на индуцированном мутагенезе при временном закислении среды и после температурного шока. Усиление ДНК повреждающей активности, генерируемой короткими волокнами амосайта, связано с истощением GSH и изменениями, вызванными стрессами. Напротив, обработка ацетатом и осмотический стресс в GSH-истощенных клетках вызвали снижение мутагенной активности.

По-видимому, отсутствие высоких концентраций 6SH во внешней среде и внутри клетки снижает GSH-зависимую реакцию образования активных кислородных радикалов.Щелочной шок усиливал мутагенную активность кислородных радикалов, но эффект не зависел от содержания GSH в клетке.

Метиламин или температурный стресс ингибирует мутагенную активность коротких волокон, а ацетат и осмотический стресс активирует. Клетки подвергнутые шоку, вызванному закислением среды или повышением концентрации хлористого натрия, либо высокой температуры были менее устойчивы к повреждающему действию кислородных радикалов в том случае, если синтез глутатиона был блокирован. Частичное ингибирование синтеза глутатиона было ответственно за ингиби-рование индуцированного мутагенеза после внесения в среду ацетата или хлорида натрия, либо в усилении мутагенеза после внесения в среду метиламина или повышения температуры инкубирования.

Активность процесса клеточного деления меняется под влиянием стрессовых факторов. Пролиферативная активность'клеток в культуре СНО повышается после температурного стресса. Осмотический шок, напротив, ингибирует процесс деления клеток. Причем; как ингибирование так и активация деления зависят от присутствия GSH в клетках (рис. 5). Это является непременным условием и обработки клеток ацетатом или метиламином. Однако, если метиламин на фоне ингибиро-вания глутатион зависимых реакций стимулирует процесс клеточного

Рис.5. Значения митотического индекса в культуре клеток Chinese hamster ovary с нормальным и „сниженным содержанием глутатиона и при различных условиях культивирования.

деления, то ацетат и недостаток GSH усиливают задержку или ингиби-руют деление клеток.

Длинные волокна амосайта ингибируют деление клеток больше, чем короткие волокна.

Результаты экспериментов по влиянию длинных волокон амосайта на процесс деления клеток при кислом pH среды или температурном стрессе ясно доказывают, что дерепрессия клеточного деления является результатом истощения GSH. Именно эти два вида стресса защищают аппарат клеточного деления от ингибирования активными кислородными радикалами. Противоположный эффект связан с обработкой культуры метиламином (рис. 5).

Взаимодействуя с активными кислородными радикалами вне клетки GSH играет роль антиоксиданта (Burk R.F., 1983). Это может быть одной из причин обусловливающей зависимость мутагенной активности амосайта от размера его волокон. Мутагенная активность коротких волокон амосайта меньше, чем у длинных.

В результате реакции GSH с активными кислородными радикалами концентрация 6SSG во внешней среде может быть достаточно высокой, что, возможно, является одним из факторов позволяющим культуре клеток иметь достаточно высокий пролиферативный потенциал, даже при блоке синтеза GSH. Напротив истощение GSH в клетках при заще-лачивании цитоплазмы, осмотическом или температурном шоках послужило решающим фактором ингибирования, либо задержки деления клеток.

Присутствие в тканях живых организмов и культурах клеток популяции клеток с измененным кариотипом в ряде работ обосновано связано с процессами мутагенеза и канцерогенеза (Barrett J.C., 1989-, Bonatti S. et al., 1989).

Известно, что цитоплазматические онкогены и , по-крайней мере, два важных интрацеллюлярных процесса трансформации, одни посредством протеинкиназы С, а другой, включающий кальций и кальмоду-лин, активируются изменениями Na+/H+ и повышением интрацеллшярно-го pH (Doppler W. et al., 1987; Vicentinl L.M. et al., 1986). Ин-гибирование канала Na+/H+ вызывает супрессию защелачивания цитоплазмы и синтеза ДНК (Ingber D.E. etal., 1990; L'Allemain G. et al., 1984).

Клетки, имеющие кариотип с набором хромосом выше или ниже диплоидного набора получили название анеуплоидных, а клетки с ко-

личеством хромосом большим, но кратным диплоидному - полиплоидные.

Для того чтобы проверить существует ли связь между содержанием тиолсодержащих низкомолекулярных соединений и пулом гэтеропло-идных клеток в культуре, изучали влияние истощения редуцированного глутатиона на популяцию клеток с абнормаяьным содержанием хромосом.

Отмэтепс, "то в контрольных культурах з зависимости от того какой вид шока испытали клетки частичное ингибирование синтеза GSH может изменить уровень гетероплоидных клеток. После температурного шока, количество гетероплоидных клеток было минимальным в культуре с истощенным содержанием SSH (рис. 6). Однако, в данном случае это может быть связано с резким ингибированием деления клеток.

Вариабельность результатов по нестабильности кариотипа при нормальных условиях, обработке метиламином или ацетатом было следствием истощения интрацеллюлярного GSH и повышения содержания щстета в клетках. Для конвертирования клеток от стабильного кариотипа к нестабильному наиболее благоприятными были ситуации связанные с изменением кислотности среды.

Хорошо известно, что к агентам, способным индуцировать карио-типическую нестабильность, ведущую к трансформации клетки, относится циклофосфамид и разные виды асбеста (Barrett J.S. et al., 1990; Koberle В. et al., 1990). Если важным событием для клетки после обработки цкклсфссфамидом является СЕерхметилирование ДНК, то после воздействия асбеста, генерированные свободные радикалы окисляют основания ДНК.

Одним из показателей нарушения кариотипической стабильности, как считают многие авторы является нарушения в процессе постсинтетической модификации ДНК клеток. Для перманентных культур клеток, к которым относится линия СНО, характерен постоянный уровень метилированного цитозина, находящегося в клетке под сверхконтролем (Bonatti S. et al., 1989).

Если за основу объяснения двух параметров: пролиферативная активность культуры и кариотипическая' нестабильность взять гипотезу о метилировании ДНК, то при внесении ацетата в среду, кислотном и температурном стрессах индуцируются процессы,, которые активно вмешиваются в аппарат сверхконтроля метилирования цитозина. Это влечет за собой усиление клеточного деления и увеличение'популяции клеток с измененным кариотипом и, с другой стороны, нейтрализует

Контроль

Рис.6. Количество гетероплоидных клеток в культуре

Chinese hamster ovary с нормальным и сниженным содержанием глутатиона и при различных условиях культивирования.

цитостатическую и мутагенную активность циклофосфамида. Блок синтеза СЕН в вышеназванных условиях слабо ингибирует процессы дестабилизации кариотипа.

Трансформирующая активность минеральных волокон в ряде работ объясняется тем, . что индукция анеуплоидных (около диплоидный уровень) и полиплоидных клрт^к ? »ьжин фпс;: "СС1аШ присутствиям асбеста в клетки а стадии митоза, и мешает нормальной хромосомной сегрегации в процессе деления клеток (Неэ-1епЬег& Т. И. е1 а1., .1985).

Однако, экспериментальные данные показали, что содержание СЕН в клетке ответственно за регулирование кариотипической стабильности (рис. 6). Усиление дестабилизирующих событий коррелирует с истощением интрацеллюлярного (ЗБН уже при нормальных условиях культивирования .

Изменение условий инкубирования, как правило, усиливает процесс дестабилизации кариотипа, индуцированный амосайтом.По характеру распределения клеток с гетероплоидным набором в культурах можно заключить, что эффекты не являются результатом аддитивного воздействия стрессового фактора окружающей среды и амосайта.

Различия биологического эффекта длинных и коротких волокон проявились и в их способности индуцировать хромосомную нестабильность клеток. Максимальная активность принадлежала длинным волокнам асбеста. Истощение интрацеллюлярного С£Н и биохимические изменения, вызванные рН шоком ведут к повышен™ ¡сариотипической стабильности клеток подвергнутых воздействию длинных волокон амосайта.

• ГИСЯГ"

Если обработка клеток метиламином снижает пул гетероплойдных клеток в культуре, то осмотический шок повышает их уровень, однако, эти процессы не зависели от содержания вБН в клетке. Эффект коротких волокон амосайта при шоке также не зависел от содержания глутатиона. При обработке клеток ацетатом увеличивается количество гетероплоидных клеток в культуре.

Термальный стресс активирует каряотипические изменения, индуцированные обоими образцами асбеста, а истощение интрацеллюлярногр'г'°д'й.ед ЗБН ингибирует процесс-дестабилизации. Возможно, это связано с ин- , ... гибированием лролиферативной активности ОБН истощенных культур, однако, культуры имеющие значительно ниже митотический индекс в условиях щелочного шока отличались высоким уровнем пула гетеропло-

идных клеток (рис. 5, 6).

Таким образом, в трех краткосрочных тест-системах, широко используемых при изучении мутагенной и генотоксической активности соединений, были получены результаты дающие основание предполагать, что стабильность наследственного материала как прокариот, так и эукариот, процесс индуцированного мутагенеза, деление клеток и кариотипическая стабильности зависят от индивидуальных биохимических и физиологических характеристик клеток. Изменения ферментативного профиля клетки индуцируются изменениями условий культивирования. Одним из определяющих факторов развития мутагенеза при этих условиях является состояние системы синтеза глутатиона, или содержание редуцированного глутатиона в клетке.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что стресс, вызванный снижением pH среды, повышает мутагенную активность N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина в 4.5 раза в культуре клеток S. typhimurium ТА 1525 и в 1.2 раза в культуре Е. coli В/г WP2. Щелочной шок не меняет мутагенной активности вещества.

2. Установлено, что мембрана-проникающие соединения способны изменить ответ тестерных штаммов на мутагенное действие N-ме-тил-N"-нитро-М-нитрозогуанидина. Ацетат в культуре клеток Е. coli В/г WP2, а ацетат и метиламин в клетках S. typhimurium ТА 1535 снижают в 1.5 раза мутагенное действие химического соединения.

3. Впервые установлено, что мутагенная активность N-ме-тил-N'-нитро-М-нитрозогуанидина в условиях гиперосмотического и температурного стрессов в культурах тестерных штаммов микроорганизмов имеет временную динамическую зависимость. Повышение мутагенной активности соединения отмечается в первой половине гиперосмотического стресса и при температуре инкубации 42°С, а снижение при увеличении времени инкубации.

4. В клетках Chinese hamster ovary гиперосмотический стресс, ацетат, метиламин и снижение pH среды индуцируют генотоксические, а температурный и щелочной шок антимутагенные процессы.

5. Истощение глутатиона в клетках Chinese hamster ovary сопровождаются увеличением мутагенной активности циклофосфамида при внесении в инкубационную среду ацетата или при инкубировании клеток в щелочной среде. Метиламин индуцирует процессы, защищающие

- '¿'S -

клетки от мутагенного действия циклофосфамида.

6. Снижение pH среды до 6.8, температурный и гиперосмотический шок усиливают мутагенную активность асбеста, а блок синтеза глутатиона восстанавливает его мутагенную активность до контрольных значений.

7. Установлено, что истощение глутатиона влияет на пролифе-

üi>lfiöiiuuiii IVVrfll» J.' VisiJt iittciüri UliiiiCOC i ioiiiz>L.ci oVcU V . 11Й1 ULi~

татическая активность циклофосфамида усиливается при внесении ацетата и повышении температуры инкубирования на фоне блока глутати-он-зависимых реакций. Температурный шок и pH среды 6.8 усиливают ингибирующую активность асбеста на пролиферативную активность клеток со сниженным содержанием глутатиона.

8. Показано, что различные виды стрессов способствуют повышению кариотипической нестабильности культуры Chinese hamster ovary, обработанной циклофосфамидом или асбестом. Блок синтеза глутатиона снижает активность циклофосфамида и амосайта при температурном стрессе.

9. Для прогнозирования мутагенной активности химических соединений в условиях in vitro при использовании различных тест-объектов необходимо учитывать как условия инкубирования культур клеток, так и видоспецифичеасие особенности метаболизма глутатиона в клетках.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Демаков В.А., Голясная Н.В., Сайткулова Ф. Г., Лапкин И.И. Влияние р-кетона с изопропильной группой на колшество полиплоидных клеток // Тез. докл. научной конференции "Естественные науки- здравоохранению", г.Пермь, 1987.

2. Голясная Н.В., Плотникова Е.Г. Изучение мутагенной активности химических соединений на микробных тест-системах методом лимитирующих разведений // Сб. "Экология и генетика микроорганизмов", г.Свердловск, ИЭГМ УрО РАН. 1991.

3. Golyasnaya N.V., Smirnova G.V., Oktyabrskiy O.N. Cytoplasm acidofication in Escherichia coli B/r WP2 reduces the mutagenic effect MNNG // 21st An. meeting of EEMS on Envir. Mutag.-Carci-nog., Prague, aug., 25-31. -1991. -P. 1-17.

4. Oktyabrskiy O.N., Smirnova G.V., Golyasnaya N.V. Acidofi-

cation of Escherichia coli and Salmonella typhimurium cytoplasm reduces the mutagenic effec of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidi-ne // Mut.Res.-1993. -V 293. -P. 197-204.

5. Donaldson K., Golyasnaya N.V. Long and short amosite asbestos samples: comparison of chromosome-damaging effects to cells in culture with in vivo patogenicity //In: Cell, and Mol. Effects of Miner, and Synthetic Dust and Fibres, ed. Davis J.M.G. - 1994. - V. 85. - P. 221-225.

6. Golyasnaya N. Mutagenic effect of N'-methyl-N'-nitro-nit-rosoguanidin on Escherichia coli at osmotic shock // В сб.: Тез. докл. Междунар. ко-конф.Загрязн. окруж. среды. С.-Петерб. 1995.